Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Plodnost ptáků závisí na jejich schopnosti ukládat dostatek životaschopných spermií po delší dobu v zásobních tubulech spermií (SST). Přesný mechanismus, kterým spermie vstupují do SST, se v něm nacházejí a opouštějí ho, zůstává kontroverzní. Spermie slepic šarkasi vykazovaly vysoký sklon k aglutinaci, přičemž vytvářely mobilní vláknité svazky obsahující mnoho buněk. Vzhledem k obtížnosti pozorování pohyblivosti a chování spermií v neprůhledném vejcovodu jsme ke studiu aglutinace a pohyblivosti spermií použili mikrofluidní zařízení s průřezem mikrokanálu podobným průřezu spermií. Tato studie se zabývá tím, jak se svazky spermií tvoří, jak se pohybují a jejich možnou rolí v prodlužování pobytu spermií v SST. Zkoumali jsme rychlost spermií a reologické chování, když byl tok tekutiny generován v mikrofluidním kanálu hydrostatickým tlakem (průtoková rychlost = 33 µm/s). Spermie mají tendenci plavat proti proudu (pozitivní reologie) a rychlost svazku spermií je ve srovnání s jednotlivými spermiemi výrazně snížena. Bylo pozorováno, že svazky spermií se pohybují spirálovitě a zvětšují svou délku a tloušťku s tím, jak se do nich přidává více jednotlivých spermií. Bylo pozorováno, jak se svazky spermií přibližují a ulpívají na bočních stěnách mikrofluidních kanálků, aby se zabránilo jejich strhávání rychlostí proudění tekutiny > 33 µm/s. Bylo pozorováno, jak se svazky spermií přibližují a ulpívají na bočních stěnách mikrofluidních kanálků, aby se zabránilo jejich strhávání rychlostí proudění tekutiny > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к бостовынм микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости > 3сти> Bylo pozorováno, že svazky spermií se přibližují a přilnou k bočním stěnám mikrofluidních kanálků, aby se zabránilo jejich smetení při rychlostech průtoku tekutiny >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流佫流速> 33 怫流速> 33 怂33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к бостовынм микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скорост3ь/ Bylo pozorováno, že svazky spermií se přibližují a přilnou k bočním stěnám mikrofluidního kanálu, aby se vyhnuly tomu, aby byly strženy proudem tekutiny rychlostí >33 µm/s.Skenovací a transmisní elektronová mikroskopie odhalila, že svazky spermií byly podepřeny hojným hustým materiálem. Získaná data prokazují jedinečnou mobilitu spermií kuřete Sharkazi, stejně jako schopnost spermií aglutinovat a tvořit mobilní svazky, což přispívá k lepšímu pochopení dlouhodobého skladování spermií v SMT.
Aby u lidí a většiny zvířat došlo k oplodnění, musí spermie a vajíčka dorazit na místo oplodnění ve správný čas. Proto musí k páření dojít před ovulací nebo v jejím průběhu. Na druhou stranu někteří savci, jako jsou psi, a také nesavčí druhy, jako je hmyz, ryby, plazi a ptáci, uchovávají spermie ve svých reprodukčních orgánech po delší dobu, dokud jejich vajíčka nejsou připravena k oplodnění (asynchronní oplodnění 1 ). Ptáci si dokáží udržet životaschopnost spermií schopných oplodnit vajíčka po dobu 2–10 týdnů2.
Toto je jedinečný rys, který odlišuje ptáky od ostatních zvířat, protože poskytuje vysokou pravděpodobnost oplodnění po jediné inseminaci po dobu několika týdnů bez současného páření a ovulace. Hlavní orgán pro ukládání spermií, nazývaný spermatozoidní tubul (SST), se nachází ve vnitřních slizničních záhybech v uterovaginálním spojení. Dosud nejsou mechanismy, kterými spermie vstupují do spermabanky, zůstávají v ní a opouštějí ji, plně pochopeny. Na základě předchozích studií bylo předloženo mnoho hypotéz, ale žádná z nich nebyla potvrzena.
Forman4 vyslovil hypotézu, že spermie si udržují své místo v dutině SST prostřednictvím neustálého oscilačního pohybu proti směru proudění tekutiny proteinovými kanály umístěnými na epiteliálních buňkách SST (reologie). ATP se vyčerpává v důsledku neustálé bičíkové aktivity potřebné k udržení spermií v lumen SST a motilita nakonec klesá, dokud nejsou spermie proudem tekutiny vyneseny ze spermabanky a nezačnou novou cestu vzestupným vejcovodem, aby oplodnily spermii. Vajíčko (Forman4). Tento model ukládání spermií je podpořen detekcí akvaporinů 2, 3 a 9 přítomných v epiteliálních buňkách SST pomocí imunocytochemie. Dosud chybí studie o reologii kuřecího spermatu a její roli v ukládání SST, vaginálním výběru spermií a konkurenci spermií. U kuřat vstupují spermie do pochvy po přirozeném páření, ale více než 80 % spermií je z pochvy vypuzeno krátce po páření. To naznačuje, že pochva je primárním místem pro výběr spermií u ptáků. Kromě toho bylo hlášeno, že méně než 1 % spermií oplodněných ve vagíně končí v SST2. Při umělém oplodnění kuřat ve vagíně má počet spermií dosahujících SST tendenci se 24 hodin po inseminaci zvyšovat. Mechanismus selekce spermií během tohoto procesu není dosud jasný a pohyblivost spermií může hrát důležitou roli v příjmu spermií v SST. Vzhledem k silným a neprůhledným stěnám vejcovodů je obtížné přímo monitorovat pohyblivost spermií ve vejcovodech ptáků. Proto nám chybí základní znalosti o tom, jak spermie po oplodnění přecházejí do SST.
Reologie byla nedávno uznána jako důležitý faktor řídící transport spermií v savčích genitáliích. Na základě schopnosti pohyblivých spermií migrovat v protiproudu použili Zaferani a kol.8 mikrofluidní systém Corra k pasivní izolaci pohyblivých spermií ze vzorků spermatu. Tento typ třídění spermatu je nezbytný pro léčbu neplodnosti a klinický výzkum a je upřednostňován před tradičními metodami, které jsou časově a pracné a mohou ohrozit morfologii a strukturální integritu spermií. Dosud však nebyly provedeny žádné studie o vlivu sekretů z genitálií kuřat na pohyblivost spermií.
Bez ohledu na mechanismus, který udržuje spermie uložené v SST, mnoho výzkumníků pozorovalo, že rezidentní spermie se v SST kuřat 9, 10, křepelek 2 a krůt 11 aglutinují hlava na hlavu za vzniku aglutinovaných svazků spermií. Autoři naznačují, že existuje souvislost mezi touto aglutinací a dlouhodobým skladováním spermií v SST.
Tingari a Lake12 zaznamenali silnou souvislost mezi spermiemi v žláze přijímající spermie u kuřete a zpochybnili, zda ptačí spermie aglutinují stejným způsobem jako savčí spermie. Domnívají se, že hluboké spojení mezi spermiemi ve chámovodu může být způsobeno stresem způsobeným přítomností velkého počtu spermií v malém prostoru.
Při hodnocení chování spermií na čerstvě zavěšených podložních sklíčkách lze pozorovat přechodné známky aglutinace, zejména na okrajích kapiček spermatu. Aglutinace však byla často narušena rotačním procesem spojeným s neustálým pohybem, což vysvětluje přechodnou povahu tohoto jevu. Vědci si také všimli, že když bylo do spermatu přidáno ředidlo, objevily se protáhlé „vláknité“ buněčné agregáty.
První pokusy o napodobení spermie byly provedeny odstraněním tenkého drátu z visící kapky, což vedlo k protáhlému váčku podobnému spermiím vyčnívajícímu z kapky spermatu. Spermie se ve váčku okamžitě seřadily paralelně, ale celá jednotka rychle zmizela kvůli 3D omezení. Pro studium aglutinace spermií je proto nutné pozorovat pohyblivost a chování spermií přímo v izolovaných zásobních tubulech spermií, což je obtížné dosáhnout. Proto je nutné vyvinout přístroj, který napodobuje spermie, aby podpořil studium pohyblivosti a aglutinačního chování spermií. Brillard a kol.13 uvádějí, že průměrná délka zásobních tubulů spermií u dospělých kuřat je 400–600 µm, ale některé SST mohou být dlouhé až 2000 µm. Mero a Ogasawara14 rozdělili semenné žlázy na zvětšené a nezvětšené semenné kanálky pro ukládání spermií, které měly stejnou délku (~500 µm) a šířku krčku (~38 µm), ale průměrný průměr lumen kanálků byl 56,6 a 56,6 µm, respektive 11,2 μm. V této studii jsme použili mikrofluidní zařízení s velikostí kanálku 200 µm × 20 µm (Š × V), jehož průřez je poněkud blízký průřezu amplifikovaného SST. Kromě toho jsme zkoumali pohyblivost spermií a jejich aglutinační chování v proudící tekutině, což je v souladu s Foremanovou hypotézou, že tekutina produkovaná epitelovými buňkami SST udržuje spermie v lumenu v protiproudém (reologickém) směru.
Cílem této studie bylo překonat problémy s pozorováním pohyblivosti spermií ve vejcovodu a vyhnout se obtížím spojeným se studiem reologie a chování spermií v dynamickém prostředí. Bylo použito mikrofluidní zařízení, které vytváří hydrostatický tlak k simulaci pohyblivosti spermií v genitáliích kuřete.
Když byla do mikrokanálového zařízení vložena kapka zředěného vzorku spermií (1:40), bylo možné identifikovat dva typy pohyblivosti spermií (izolované spermie a vázané spermie). Kromě toho měly spermie tendenci plavat proti proudu (pozitivní reologie; video 1, 2). Přestože svazky spermií měly nižší rychlost než osamělé spermie (p < 0,001), zvýšily procento spermií vykazujících pozitivní reotaxi (p < 0,001; tabulka 2). Přestože svazky spermií měly nižší rychlost než osamělé spermie (p < 0,001), zvýšily procento spermií vykazujících pozitivní reotaxi (p < 0,001; tabulka 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных стоперм 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительныйк1с ре, 0,001 TAблица 2). Přestože svazky spermií měly nižší rychlost než rychlost jednotlivých spermií (p < 0,001), zvýšily procento spermií vykazujících pozitivní reotaxi (p < 0,001; tabulka 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 增加 了 显态 昳显社 昳显社昀百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматовозоидов, <0,010, сперматовозоидов увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Přestože rychlost svazků spermií byla nižší než u jednotlivých spermií (p < 0,001), zvýšily procento spermií s pozitivní reologií (p < 0,001; tabulka 2).Pozitivní reologie pro jednotlivé spermie a chomáčky se odhaduje na přibližně 53 %, respektive 85 %.
Bylo pozorováno, že spermie kuřat Sharkashi bezprostředně po ejakulaci tvoří lineární svazky, sestávající z desítek jedinců. Tyto chomáčky se časem zvětšují na délce a tloušťce a mohou zůstat in vitro několik hodin, než se rozptýlí (video 3). Tyto vláknité svazky mají tvar spermií echidny, které se tvoří na konci nadvarlete. Bylo zjištěno, že spermie slepic Sharkashi mají vysokou tendenci k aglutinaci a tvorbě síťovaného svazku za méně než jednu minutu po odběru. Tyto paprsky jsou dynamické a schopné se přichytit k jakýmkoli blízkým stěnám nebo statickým předmětům. Ačkoli svazky spermií snižují rychlost spermií, je zřejmé, že makroskopicky zvyšují jejich linearitu. Délka svazků se liší v závislosti na počtu spermií shromážděných ve svazcích. Byly izolovány dvě části svazku: počáteční část, včetně volné hlavy aglutinované spermie, a terminální část, včetně ocasu a celého distálního konce spermie. Pomocí vysokorychlostní kamery (950 fps) byly v počáteční části svazku pozorovány volné hlavičky aglutinovaných spermií, které svým oscilačním pohybem udržovaly svazek v pohybu a zbývající spermie spirálovitým pohybem vtahovaly do svazku (Video 4). U dlouhých chomáčků však bylo pozorováno, že některé volné hlavičky spermií přilnuly k tělu a koncová část chomáčku fungovala jako lopatky, které pomáhaly chomáč pohánět.
V pomalém proudění tekutiny se svazky spermií pohybují rovnoběžně vedle sebe, nicméně se začnou překrývat a lepit se na vše, co je v klidu, aby je s rostoucí rychlostí proudění neodplavil proud. Svazky se vytvoří, když se k sobě přiblíží hrstka spermií, začnou se pohybovat synchronně a ovíjejí se kolem sebe a poté se přilepí na lepkavou látku. Obrázky 1 a 2 ukazují, jak se spermie k sobě přibližují a vytvářejí spojení, když se jejich ocasy ovíjejí kolem sebe.
Vědci aplikovali hydrostatický tlak k vytvoření proudění tekutiny v mikrokanálu za účelem studia reologie spermií. Byl použit mikrokanál o velikosti 200 µm × 20 µm (Š × V) a délce 3,6 µm. Mezi nádobami byly použity mikrokanály s injekčními stříkačkami na koncích. Pro zviditelnění kanálků bylo použito potravinářské barvivo.
Připevněte propojovací kabely a příslušenství ke zdi. Video bylo pořízeno fázově kontrastním mikroskopem. U každého snímku jsou prezentovány snímky z fázově kontrastní mikroskopie a mapování. (A) Spojení mezi dvěma proudy klade odpor proudění v důsledku spirálového pohybu (červená šipka). (B) Spojení mezi svazkem trubic a stěnou kanálu (červené šipky), zároveň jsou spojeny se dvěma dalšími svazky (žluté šipky). (C) Svazky spermií v mikrofluidním kanálu se začínají vzájemně spojovat (červené šipky) a tvoří síť svazků spermií. (D) Vznik sítě svazků spermií.
Když byla do mikrofluidního zařízení vložena kapka zředěných spermií a vznikl proud, bylo pozorováno, že se paprsek spermií pohybuje proti směru proudění. Svazky těsně přiléhají ke stěnám mikrokanálků a volné hlavičky v počáteční části svazků těsně přiléhají k nim (video 5). Také se drží jakýchkoli stacionárních částic v cestě, jako jsou nečistoty, aby odolaly stržení proudem. Postupem času se tyto chomáčky stanou dlouhými vlákny zachycujícími další jednotlivé spermie a kratšími chomáčky (video 6). Jak se proudění začíná zpomalovat, dlouhé linie spermií začnou tvořit síť linií spermií (video 7; obrázek 2).
Při vysoké rychlosti proudění (V > 33 µm/s) se spirálové pohyby vláken zesilují ve snaze zachytit mnoho jednotlivých svazků spermií, které lépe odolávají unášecí síle proudění. Při vysoké rychlosti proudění (V > 33 µm/s) se spirálové pohyby vláken zesilují ve snaze zachytit mnoho jednotlivých svazků spermií, které lépe odolávají unášecí síle proudění. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиьливаютоско, пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучорые коуторые противостоят дрейфующей силе потока. Při vysokých průtocích (V > 33 µm/s) se spirálovité pohyby vláken zvyšují, protože se snaží zachytit mnoho jednotlivých spermií a vytvářejí svazky, které lépe odolávají unášecí síle proudění.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形刐 杸丟 单从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увелитычиваетсоя захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобры лусочтобры силам дрейфа потока. Při vysokých průtocích (V > 33 µm/s) se spirálovitý pohyb vláken zvyšuje ve snaze zachytit mnoho jednotlivých spermií, které tvoří svazky, aby lépe odolávaly driftovým silám proudění.Také se pokusili připevnit mikrokanály k bočním stěnám.
Svazky spermií byly identifikovány jako shluky hlaviček spermií a stočených ocasů pomocí světelné mikroskopie (LM). Svazky spermií s různými agregáty byly také identifikovány jako zkroucené hlavičky a bičíkové agregáty, více srostlých ocasů spermií, hlavičky spermií připojené k ocasu a hlavičky spermií s ohnutými jádry jako více srostlých jader. Transmisní elektronová mikroskopie (TEM). Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) ukázala, že svazky spermií byly obalené agregáty hlaviček spermií a agregáty spermií vykazovaly připojenou síť ovinutých ocasů.
Morfologie a ultrastruktura spermií, tvorba svazků spermií, byly studovány pomocí světelné mikroskopie (poloviční řez), rastrovací elektronové mikroskopie (SEM) a transmisní elektronové mikroskopie (TEM), nátěry spermií byly obarveny akridinovou oranží a vyšetřeny epifluorescenční mikroskopií.
Barvení spermií akridinovou oranží (obr. 3B) ukázalo, že hlavičky spermií byly slepené a pokryté sekrečním materiálem, což vedlo k tvorbě velkých chomáčků (obr. 3D). Svazky spermií se skládaly z agregátů spermií se sítí připojených ocásků (obr. 4A-C). Svazky spermií se skládají z ocásků mnoha spermií slepených k sobě (obr. 4D). Sekrety (obr. 4E,F) pokrývaly hlavičky svazků spermií.
Tvorba svazku spermií Použití fázově kontrastní mikroskopie a nátěrů spermií obarvených akridinovou oranžoví ukázalo, že hlavičky spermií slepují pohromadě. (A) Raná tvorba chomáčků spermií začíná jednou spermií (bílý kruh) a třemi spermiemi (žlutý kruh), přičemž spirála začíná u ocasu a končí u hlavičky. (B) Mikrofotografie nátěru spermií obarveného akridinovou oranžoví zobrazující přilnuté hlavičky spermií (šipky). Výboj pokrývá hlavičku(y). Zvětšení × 1000. (C) Vývoj velkého paprsku transportovaného prouděním v mikrofluidním kanálu (s použitím vysokorychlostní kamery při 950 fps). (D) Mikrofotografie nátěru spermií obarveného akridinovou oranžoví zobrazující velké chomáčky (šipky). Zvětšení: ×200.
Snímek svazku spermií a nátěr spermií obarvený akridinovou oranžoví pořízený skenovacím elektronovým mikroskopem. (A, B, D, E) jsou digitální barevné skenovací elektronové mikroskopy spermií a C a F jsou mikroskopie nátěrů spermií obarvených akridinovou oranžoví, které ukazují přichycení více spermií obalujících kaudální membránu. (AC) Agregáty spermií jsou zobrazeny jako síť připojených ocasů (šipky). (D) Adheze několika spermií (s adhezivní látkou, růžový obrys, šipka) ovíjejících se kolem ocasu. (E a ​​F) Agregáty hlaviček spermií (ukazatele) pokryté adhezivním materiálem (ukazatele). Spermie tvořily svazky s několika vírovitými strukturami (F). (C) Zvětšení ×400 a (F) ×200.
Pomocí transmisní elektronové mikroskopie jsme zjistili, že svazky spermií měly připojené ocasy (obr. 6A, C), hlavičky připojené k ocasům (obr. 6B) nebo hlavičky připojené k ocasům (obr. 6D). Hlavičky spermií ve svazku jsou zakřivené a v řezu představují dvě jaderné oblasti (obr. 6D). V incizním svazku měly spermie zkroucenou hlavičku se dvěma jadernými oblastmi a několika bičíkovými oblastmi (obr. 5A).
Digitální barevný elektronový mikrosnímek zobrazující spojovací ocasy ve svazku spermií a aglutinační materiál spojující hlavičky spermií. (A) Připojený ocas velkého počtu spermií. Všimněte si, jak ocas vypadá v projekci na výšku (šipka) i na šířku (šipka). (B) Hlava (šipka) spermie je spojena s ocasem (šipka). (C) Je připojeno několik ocasů spermií (šipky). (D) Aglutinační materiál (AS, modrý) spojuje čtyři hlavičky spermií (fialová).
K detekci hlaviček spermií ve svazcích spermií pokrytých sekrety nebo membránami (obrázek 6B) byla použita skenovací elektronová mikroskopie, což naznačuje, že svazky spermií byly ukotveny extracelulárním materiálem. Aglutinovaný materiál byl koncentrován v hlavičce spermie (sestava podobná hlavě medúzy; obr. 5B) a distálně expandován, což pod fluorescenční mikroskopií při barvení akridinovou oranží (obr. 6C) poskytlo zářivě žlutý vzhled. Tato látka je jasně viditelná pod skenovacím mikroskopem a je považována za pojivo. Polotenké řezy (obr. 5C) a nátěry spermií obarvené akridinovou oranží ukázaly svazky spermií obsahující hustě uspořádané hlavičky a stočené ocasy (obr. 5D).
Různé mikrofotografie zobrazující agregaci hlaviček a složených ocásků spermií pomocí různých metod. (A) Průřezová digitální barevná transmisní elektronová mikroskopie svazku spermií zobrazující spirálovitou hlavičku spermie s dvoudílným jádrem (modrá) a několika bičíkovými částmi (zelená). (B) Digitální barevná rastrovací elektronová mikroskopie zobrazující shluk hlaviček spermií podobných medúzám (šipky), které se zdají být zakryté. (C) Polotenký řez zobrazující agregované hlavičky spermií (šipky) a stočené ocásky (šipky). (D) Mikrofotografie nátěru spermií obarveného akridinovou oranžoví zobrazující agregáty hlaviček spermií (šipky) a stočené přilnuté ocásky (šipky). Všimněte si, že hlavičku spermie pokrývá lepkavá látka (S). (D) Zvětšení × 1000.
Pomocí transmisní elektronové mikroskopie (obr. 7A) bylo také zaznamenáno, že hlavičky spermií byly zkroucené a jádra měla spirálovitý tvar, což potvrdily nátěry spermií obarvené akridinovou oranží a vyšetřené fluorescenční mikroskopií (obr. 7B).
(A) Digitální barevná transmisní elektronová mikroskopie a (B) nátěr spermií obarvený akridinovou oranžoví, zobrazující stočené hlavičky a připojení hlaviček a ocásků spermií (šipky). (B) 1000násobné zvětšení.
Zajímavým zjištěním je, že Sharkaziho spermie se agregují a vytvářejí mobilní vláknité svazky. Vlastnosti těchto svazků nám umožňují pochopit jejich možnou roli v absorpci a ukládání spermií v SST.
Po páření spermie vstupují do pochvy a procházejí intenzivním selekčním procesem, výsledkem čehož je pouze omezený počet spermií vstupujících do SST15,16. Mechanismy, kterými spermie vstupují a vystupují z SST, dosud nejsou jasné. U drůbeže jsou spermie uloženy v SST po delší dobu 2 až 10 týdnů, v závislosti na druhu6. O stavu spermatu během skladování v SST přetrvává kontroverze. Jsou v pohybu, nebo v klidu? Jinými slovy, jak si spermie udržují svou polohu v SST tak dlouho?
Forman4 navrhl, že pobyt a vypuzování SST by mohlo být vysvětleno z hlediska pohyblivosti spermií. Autoři předpokládají, že spermie si udržují svou polohu plavením proti proudu tekutiny vytvořenému epitelem SST a že spermie jsou z SST vypuzovány, když jejich rychlost klesne pod bod, ve kterém se začnou pohybovat zpět kvůli nedostatku energie. Zaniboni5 potvrdil přítomnost akvaporinů 2, 3 a 9 v apikální části epiteliálních buněk SST, což může nepřímo podporovat Foremanův model ukládání spermií. V současné studii jsme zjistili, že téměř polovina Sharkashiho spermií vykazuje pozitivní reologii v proudící tekutině a že aglutinované svazky spermií zvyšují počet spermií vykazujících pozitivní reologii, i když aglutinace je zpomaluje. Způsob, jakým spermie cestují vejcovodem ptáka do místa oplodnění, není zcela objasněn. U savců folikulární tekutina chemoatraktuje spermie. Předpokládá se však, že chemoatraktanty směrují spermie k přiblížení na velké vzdálenosti7. Za transport spermií jsou proto zodpovědné jiné mechanismy. Schopnost spermií orientovat se a proudit proti tekutině z vejcovodů uvolněné po páření je považována za hlavní faktor pro cílení spermií u myší. Parker 17 navrhl, že spermie u ptáků a plazů procházejí vejcovody plaváním proti proudu řasinek. Ačkoli to u ptáků nebylo experimentálně prokázáno, Adolphi 18 jako první zjistil, že ptačí spermie dávají pozitivní výsledky, když se pomocí proužku filtračního papíru vytvoří tenká vrstva tekutiny mezi krycím sklíčkem a podložním sklíčkem. Reologie. Hino a Yanagimachi [19] umístili myší komplex vaječník-vajíčkovod-děloha do perfuzního kruhu a vstříkli 1 µl inkoustu do šíje, aby vizualizovali tok tekutiny ve vejcovodech. Všimli si velmi aktivního pohybu kontrakce a relaxace ve vejcovodu, při kterém se všechny kuličky inkoustu stabilně pohybovaly směrem k ampule vejcovodu. Autoři zdůrazňují důležitost toku tekutiny z dolních do horních vejcovodů pro vzestup a oplodnění spermií. Brillard20 uvádí, že u kuřat a krůt migrují spermie aktivním pohybem z poševního vchodu, kde jsou uloženy, do uterovaginálního spojení, kde jsou uloženy. Tento pohyb však není nutný mezi uterovaginálním spojením a infundibulem, protože spermie jsou transportovány pasivním posunem. S vědomím těchto předchozích doporučení a výsledků získaných v této studii lze předpokládat, že schopnost spermií pohybovat se proti proudu (reologie) je jednou z vlastností, na kterých je založen proces selekčního procesu. To určuje průchod spermií pochvou a jejich vstup do CCT pro uskladnění. Jak navrhl Forman4, může to také usnadnit proces vstupu spermií do SST a jeho prostředí na určitou dobu a jejich následného výstupu, když se jejich rychlost začne zpomalovat.
Na druhou stranu Matsuzaki a Sasanami21 naznačili, že ptačí spermie procházejí změnami motility z dormance do motility v samčích i samičích reprodukčních traktech. Inhibice motility rezidentních spermií v SST byla navržena jako vysvětlení dlouhé doby skladování spermií a následné omlazení po opuštění SST. Za hypoxických podmínek Matsuzaki a kol.1 zaznamenali vysokou produkci a uvolňování laktátu v SST, což může vést k inhibici motility rezidentních spermií. V tomto případě se význam reologie spermií odráží v selekci a absorpci spermií, nikoli v jejich skladování.
Vzorec aglutinace spermií je považován za věrohodné vysvětlení dlouhé doby skladování spermií v SST, protože se jedná o běžný vzorec zadržování spermií u drůbeže2,22,23. Bakst a kol.2 pozorovali, že většina spermií k sobě přilnula a vytvořila svazkovité agregáty, přičemž jednotlivé spermie byly u křepelčích CCM nalezeny jen zřídka. Na druhou stranu Wen a kol.24 pozorovali v lumen SST u kuřat více rozptýlených spermií a méně chomáčků spermií. Na základě těchto pozorování lze předpokládat, že sklon k aglutinaci spermií se liší mezi ptáky a mezi spermiemi ve stejném ejakulátu. Van Krey a kol.9 dále naznačili, že za postupné pronikání spermií do lumen vejcovodu je zodpovědná náhodná disociace aglutinovaných spermií. Podle této hypotézy by měly být z SST nejprve vypuzeny spermie s nižší aglutinační kapacitou. V této souvislosti může být schopnost spermií aglutinovat faktorem ovlivňujícím výsledek soutěže spermií u špinavých ptáků. Čím déle se aglutinované spermie disociují, tím déle se zachovává plodnost.
Ačkoli byla v několika studiích2,22,24 pozorována agregace spermií a jejich shlukování do svazků, nebyly podrobně popsány kvůli složitosti jejich kinematického pozorování v rámci SST. Bylo učiněno několik pokusů o studium aglutinace spermií in vitro. Po odstranění tenkého drátu z visící kapky semena byla pozorována rozsáhlá, ale přechodná aglutinace. To vede ke skutečnosti, že z kapky vyčnívá protáhlá bublina, která napodobuje semennou žlázu. Kvůli 3D omezením a krátkým dobám schnutí kapkou se celý blok rychle rozpadl9. V současné studii jsme s použitím kuřat Sharkashi a mikrofluidních čipů byli schopni popsat, jak se tyto chomáčky tvoří a jak se pohybují. Svazky spermií se vytvořily bezprostředně po odběru spermatu a bylo zjištěno, že se pohybují spirálovitě, což vykazuje pozitivní reologii, pokud jsou přítomny v proudu. Kromě toho bylo při makroskopickém pohledu pozorováno, že svazky spermií zvyšují linearitu motility ve srovnání s izolovanými spermiemi. To naznačuje, že k aglutinaci spermií může dojít před penetrací SST a že produkce spermií není omezena na malou oblast v důsledku stresu, jak bylo dříve navrženo (Tingari a Lake12). Během tvorby chomáčků spermie plavou synchronně, dokud nevytvoří spojení, poté se jejich ocasy omotají kolem sebe a hlavička spermie zůstává volná, ale ocas a distální část spermie se slepí lepkavou látkou. Volná hlavička vazu je proto zodpovědná za pohyb a táhne zbytek vazu. Skenovací elektronová mikroskopie svazků spermií ukázala připojené hlavičky spermií pokryté velkým množstvím lepkavého materiálu, což naznačuje, že hlavičky spermií byly připojeny v klidových svazcích, k čemuž mohlo dojít po dosažení úložného místa (SST).
Když je nátěr spermií obarven akridinovou oranžoví, lze pod fluorescenčním mikroskopem vidět extracelulární adhezivní materiál kolem spermií. Tato látka umožňuje svazkům spermií přilnout k okolním povrchům nebo částicím, aby nebyly unášeny okolním proudem. Naše pozorování tak ukazují roli adheze spermií ve formě mobilních svazků. Jejich schopnost plavat proti proudu a přilnout k blízkým povrchům umožňuje spermiím zůstat déle v tělesném těle (SST).
Rothschild25 použil hemocytometrickou kameru ke studiu plovoucí distribuce bovinního spermatu v kapce suspenze a pořídil mikrofotografie kamerou s vertikální i horizontální optickou osou mikroskopu. Výsledky ukázaly, že spermie byly přitahovány k povrchu komory. Autoři naznačují, že mezi spermiemi a povrchem mohou existovat hydrodynamické interakce. Vzhledem k této skutečnosti a schopnosti spermatu kuřete Sharkashi tvořit lepkavé chomáčky se může zvýšit pravděpodobnost, že sperma přilne ke stěně SST a bude skladováno po dlouhou dobu.
Bccetti a Afzeliu26 uvádějí, že glykokalyx spermií je nezbytný pro rozpoznávání a aglutinaci gamet. Forman10 pozoroval, že hydrolýza α-glykosidických vazeb v glykoprotein-glykolipidových povlakech ošetřením ptačího spermatu neuraminidázou vedla ke snížené plodnosti bez ovlivnění pohyblivosti spermií. Autoři naznačují, že účinek neuraminidázy na glykokalyx zhoršuje sekvestraci spermií na utero-vaginálním spojení, a tím snižuje plodnost. Jejich pozorování nemohou ignorovat možnost, že léčba neuraminidázou může snížit rozpoznávání spermií a oocytů. Forman a Engel10 zjistili, že plodnost byla snížena, když byly slepice intravaginálně inseminovány spermatem ošetřeným neuraminidázou. IVF se spermiemi ošetřenými neuraminidázou však neovlivnilo plodnost ve srovnání s kontrolní skupinou kuřat. Autoři dospěli k závěru, že změny v glykoprotein-glykolipidovém povlaku kolem membrány spermií snižují schopnost spermií k oplodnění zhoršením sekvestrace spermií v utero-vaginálním spojení, což následně zvyšuje ztrátu spermií v důsledku rychlosti utero-vaginálního spojení, ale neovlivňuje rozpoznávání spermií a vajíček.
U krůt Bakst a Bauchan 11 nalezli v lumen SST malé vezikuly a fragmenty membrán a pozorovali, že některé z těchto granulí srostly s membránou spermií. Autoři naznačují, že tyto vztahy mohou přispívat k dlouhodobému ukládání spermií v SST. Výzkumníci však neupřesnili zdroj těchto částic, zda jsou vylučovány epiteliálními buňkami CCT, produkovány a vylučovány samčím reprodukčním systémem, nebo produkovány samotnými spermiemi. Tyto částice jsou také zodpovědné za aglutinaci. Grützner a kol. 27 uvedli, že epiteliální buňky nadvarlete produkují a vylučují specifický protein, který je nezbytný pro tvorbu semenných cest s jedním pórem. Autoři také uvádějí, že disperze těchto svazků závisí na interakci proteinů nadvarlete. Nixon a kol. 28 zjistili, že adnexa vylučují protein, kyselý osteonektin bohatý na cystein; SPARC se podílí na tvorbě chomáčků spermií u ježnohlav a ptakopyšů s krátkým zobákem. Rozptyl těchto paprsků je spojen se ztrátou tohoto proteinu.
V současné studii ultrastrukturální analýza pomocí elektronové mikroskopie ukázala, že spermie přilnuly k velkému množství hustého materiálu. Předpokládá se, že tyto látky jsou zodpovědné za aglutinaci, která kondenzuje mezi a kolem přilnutých hlaviček, ale v nižších koncentracích v oblasti ocasu. Předpokládáme, že tato aglutinační látka je vylučována ze samčího reprodukčního systému (nadvarlete nebo chámovodu) spolu se spermatem, protože během ejakulace často pozorujeme oddělování spermatu od lymfy a semenné plazmy. Bylo hlášeno, že když ptačí spermie procházejí nadvarletem a chámovodem, procházejí změnami souvisejícími s zráním, které podporují jejich schopnost vázat proteiny a získávat glykoproteiny asociované s plazmatickým lemmatem. Perzistence těchto proteinů na rezidentních membránách spermií v SST naznačuje, že tyto proteiny mohou ovlivňovat získání stability membrány spermií 30 a určovat jejich fertilitu 31. Ahammad a kol.32 uvádějí, že spermie získané z různých částí samčího reprodukčního systému (od varlat až po distální chámovod) vykazovaly progresivní nárůst životaschopnosti za tekutých podmínek skladování bez ohledu na teplotu skladování a životaschopnost u kuřat se také zvyšuje ve vejcovodech po umělé inseminaci.
Chomáčky spermií kuřat Sharkashi mají odlišné vlastnosti a funkce než jiné druhy, jako jsou ježury, ptakopysky, myši lesní, jelení krysy a morčata. U kuřat Sharkasi tvorba svazků spermií snížila jejich rychlost plavání ve srovnání s jednotlivými spermiemi. Tyto svazky však zvýšily procento reologicky pozitivních spermií a zvýšily schopnost spermií stabilizovat se v dynamickém prostředí. Naše výsledky tak potvrzují předchozí domněnku, že aglutinace spermií v SST je spojena s dlouhodobým skladováním spermií. Také předpokládáme, že sklon spermií k tvorbě chomáčků může řídit rychlost ztráty spermií v SST, což může ovlivnit výsledek kompetice spermií. Podle tohoto předpokladu spermie s nízkou aglutinační kapacitou uvolňují SST jako první, zatímco spermie s vysokou aglutinační kapacitou produkují většinu potomků. Tvorba svazků spermií s jedním pórem je prospěšná a ovlivňuje poměr rodičů a dětí, ale používá jiný mechanismus. U echidn a ptakopysků jsou spermie uspořádány rovnoběžně vedle sebe, aby se zvýšila rychlost pohybu paprsku. Svazky echidn se pohybují přibližně třikrát rychleji než jednotlivé spermie. Předpokládá se, že tvorba takových chomáčků spermií u echidn je evoluční adaptací k udržení dominance, protože samice jsou promiskuitní a obvykle se páří s několika samci. Spermie z různých ejakulátů proto ostře soupeří o oplodnění vajíčka.
Aglutinované spermie kuřat sharkasi lze snadno vizualizovat pomocí fázově kontrastní mikroskopie, což je považováno za výhodné, protože umožňuje snadné studium chování spermií in vitro. Mechanismus, kterým tvorba spermiových chomáčků podporuje reprodukci u kuřat sharkasi, se také liší od mechanismu pozorovaného u některých placentárních savců, kteří představují kooperativní chování spermií, jako jsou například myši lesní, kde některé spermie dosáhnou vajíček a pomáhají tak jiným příbuzným jedincům dosáhnout jejich vajíček a poškodit je. prokázat se. altruistické chování. Samooplodnění 34. Další příklad kooperativního chování u spermií byl nalezen u myší jeleních, kde spermie byly schopny identifikovat a kombinovat se s geneticky nejvíce příbuznými spermiemi a vytvářet kooperativní skupiny, čímž se zvýšila jejich rychlost ve srovnání s nepříbuznými spermiemi35.
Výsledky získané v této studii nejsou v rozporu s Fomanovou teorií dlouhodobého skladování spermií v SST. Vědci uvádějí, že spermie se po delší dobu pohybují v proudu epiteliálních buněk vystýlajících SST a po určité době se zásoby energie spermií vyčerpají, což vede ke snížení rychlosti, což umožňuje vypuzování látek s nízkou molekulovou hmotností. V této studii jsme pozorovali, že polovina jednotlivých spermií vykazovala schopnost plavat proti proudícím tekutinám a jejich adheze ve svazku zvýšila jejich schopnost vykazovat pozitivní reologii. Naše data jsou navíc v souladu s daty Matsuzakiho a kol., kteří uvádějí, že zvýšená sekrece laktátu v SST může inhibovat pohyblivost rezidentních spermií. Naše výsledky však popisují tvorbu pohyblivých vazů spermií a jejich reologické chování v přítomnosti dynamického prostředí v mikrokanálu ve snaze objasnit jejich chování v SST. Budoucí výzkum se může zaměřit na určení chemického složení a původu aglutinačního činidla, což nepochybně pomůže vědcům vyvinout nové způsoby skladování tekutého spermatu a prodloužit dobu plodnosti.
Patnáct 30týdenních samců sharkasi bez krku (homozygotní dominantní; Na-Na) bylo vybráno jako dárci spermatu pro tuto studii. Ptáci byli chováni na Výzkumné drůbežářské farmě Zemědělské fakulty Univerzity Ashit v guvernorátu Ashit v Egyptě. Ptáci byli chováni v jednotlivých klecích (30 x 40 x 40 cm), podrobeni světelnému programu (16 hodin světla a 8 hodin tmy) a krmeni dietou obsahující 160 g hrubého proteinu, 2800 kcal metabolické energie, 35 g vápníku na osobu a 5 gramů dostupného fosforu na kilogram diety.
Podle údajů 36, ​​37 bylo sperma odebráno od mužů pomocí masáže břicha. Celkem bylo odebráno 45 vzorků spermatu od 15 mužů během 3 dnů. Sperma (n = 15/den) bylo okamžitě zředěno v poměru 1:1 (v:v) ředidlem pro drůbeží sperma Belsville, které obsahuje difosforečnan draselný (1,27 g), monohydrát glutamanu sodného (0,867 g), fruktózu (0,5 d), bezvodý octan sodný (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethan (0,195 g), monohydrát citrátu draselného (0,064 g), monofosforečnan draselný (0,065 g), chlorid hořečnatý (0,034 g) a H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarita 333 mOsm/kg38. Zředěné vzorky spermatu byly nejprve vyšetřeny pod světelným mikroskopem, aby se zajistila dobrá kvalita spermatu (vlhkost), a poté byly uloženy ve vodní lázni při 37 °C do použití do půl hodiny po odběru.
Kinematika a reologie spermií jsou popsány pomocí systému mikrofluidních zařízení. Vzorky spermatu byly dále zředěny na 1:40 v ředidle Beltsville Avian Semen Diluent, vloženy do mikrofluidního zařízení (viz níže) a kinetické parametry byly stanoveny pomocí systému počítačové analýzy spermatu (CASA), který byl dříve vyvinut pro mikrofluidní charakterizaci. Plugin byl měřen na mobilitu spermií v kapalných médiích (Katedra strojního inženýrství, Fakulta inženýrství, Univerzita Assiut, Egypt). Plugin lze stáhnout na adrese: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Byla měřena rychlost křivky (VCL, μm/s), lineární rychlost (VSL, μm/s) a průměrná trajektorová rychlost (VAP, μm/s). Videa spermií byla pořízena pomocí invertovaného fázového kontrastního mikroskopu Optika XDS-3 (s objektivem 40x) připojeného ke kameře Tucson ISH1000 při 30 fps po dobu 3 s. Pomocí softwaru CASA studujte alespoň tři oblasti a 500 trajektorií spermií na vzorek. Nahrané video bylo zpracováno pomocí domácího softwaru CASA. Definice motility v pluginu CASA je založena na rychlosti plavání spermií ve srovnání s průtokem a nezahrnuje další parametry, jako je pohyb ze strany na stranu, protože se ukázalo, že je spolehlivější v proudění tekutiny. Reologický pohyb je popsán jako pohyb spermií proti směru proudění tekutiny. Spermie s reologickými vlastnostmi byly děleny počtem pohyblivých spermií; spermie, které byly v klidu, a spermie pohybující se konvektivně byly z počítání vyloučeny.
Všechny použité chemikálie byly získány od společnosti Elgomhoria Pharmaceuticals (Káhira, Egypt), pokud není uvedeno jinak. Zařízení bylo vyrobeno dle popisu El-sherryho a kol. 40 s určitými úpravami. Mezi materiály použité k výrobě mikrokanálů patřily skleněné desky (Howard Glass, Worcester, MA), negativní rezist SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), diacetonový alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Německo) a polyaceton .-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanály byly vyrobeny pomocí měkké litografie. Nejprve byla na tiskárně s vysokým rozlišením (Prismatic, Káhira, Egypt a Pacific Arts and Design, Markham, ON) vytištěna průhledná ochranná maska ​​s požadovaným designem mikrokanálů. Předlohy byly vyrobeny s použitím skleněných desek jako substrátů. Desky byly vyčištěny v acetonu, isopropanolu a deionizované vodě a poté potaženy 20 µm vrstvou SU8-25 odstředivým nanášením (3000 ot/min, 1 minuta). Vrstvy SU-8 byly poté jemně vysušeny (65 °C, 2 min a 95 °C, 10 min) a vystaveny UV záření po dobu 50 s. Po expozici byly provedeny pečení při 65 °C a 95 °C po dobu 1 minuty a 4 minut pro zesíťování exponovaných vrstev SU-8, následovalo vyvíjení v diacetonalkoholu po dobu 6,5 minuty. Vafle byly vypáleny natvrdo (200 °C po dobu 15 minut) pro další zpevnění vrstvy SU-8.
PDMS byl připraven smícháním monomeru a tvrdidla v hmotnostním poměru 10:1, poté odplyněn ve vakuovém exsikátoru a nalit na hlavní rám SU-8. PDMS byl vytvrzen v peci (120 °C, 30 min), poté byly kanály vyříznuty, odděleny od předlohy a perforovány, aby bylo možné připevnit trubičky na vstupu a výstupu mikrokanálu. Nakonec byly mikrokanály PDMS trvale připevněny k mikroskopickým sklíčkům pomocí přenosného koronového procesoru (Electro-Technic Products, Chicago, IL), jak je popsáno jinde. Mikrokanál použitý v této studii měří 200 µm × 20 µm (Š × V) a je dlouhý 3,6 cm.
Proudění kapaliny vyvolané hydrostatickým tlakem uvnitř mikrokanálu je dosaženo udržováním hladiny kapaliny ve vstupní nádrži nad výškovým rozdílem Δh39 ve výstupní nádrži (obr. 1).
kde f je koeficient tření, definovaný jako f = C/Re pro laminární proudění v obdélníkovém kanálu, kde C je konstanta závislá na poměru stran kanálu, L je délka mikrokanálu, Vav je průměrná rychlost uvnitř mikrokanálu, Dh je hydraulický průměr kanálu, g – gravitační zrychlení. Pomocí této rovnice lze vypočítat průměrnou rychlost kanálu pomocí následující rovnice: