Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Plodnost ptáků závisí na jejich schopnosti uchovat dostatek životaschopných spermií po delší dobu v tubulech pro ukládání spermií (SST).Přesný mechanismus, kterým spermie vstupují, přebývají a opouštějí SST, zůstává kontroverzní.Sperma slepic sharkasi vykazovala vysokou tendenci k aglutinaci a tvořila pohyblivé vláknité svazky obsahující mnoho buněk.Vzhledem k obtížnosti pozorování motility a chování spermií v neprůhledném vejcovodu jsme ke studiu aglutinace a motility spermií použili mikrofluidní zařízení s mikrokanálovým průřezem podobným průřezu spermií.Tato studie pojednává o tom, jak se tvoří svazky spermií, jak se pohybují a jejich možnou roli při prodlužování pobytu spermií v SST.Zkoumali jsme rychlost spermií a reologické chování, když byl průtok tekutiny generován v mikrofluidním kanálku hydrostatickým tlakem (průtok = 33 µm/s).Spermie mají tendenci plavat proti proudu (pozitivní reologie) a rychlost svazku spermií je výrazně snížena ve srovnání s jednotlivými spermiemi.Bylo pozorováno, že svazky spermií se pohybují ve spirále a zvětšují se na délku a tloušťku, jak se získá více jednotlivých spermií. Bylo pozorováno, že svazky spermií se přibližují k bočním stěnám mikrofluidních kanálků a ulpívají na nich, aby nedošlo k jejich zametání s rychlostí proudění tekutiny > 33 µm/s. Bylo pozorováno, že svazky spermií se přibližují k bočním stěnám mikrofluidních kanálků a ulpívají na nich, aby nedošlo k jejich zametání s rychlostí proudění tekutiny > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к бостиковынм х каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Bylo pozorováno, že svazky spermií se přibližují a ulpívají na bočních stěnách mikrofluidních kanálků, aby se zabránilo jejich smetení pryč při průtoku tekutiny > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流佫流µm/s怟流速> 33 怂33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются a прилипают к бостововынм ого канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Bylo pozorováno, že svazky spermií se přibližují a ulpívají na bočních stěnách mikrofluidního kanálu, aby se zabránilo jejich smetení proudem tekutiny při >33 µm/s.Skenovací a transmisní elektronová mikroskopie odhalila, že svazky spermií byly podporovány bohatým hustým materiálem.Získaná data prokazují jedinečnou mobilitu kuřecích spermií Sharkazi a také schopnost spermií aglutinovat a vytvářet pohyblivé svazky, což přispívá k lepšímu pochopení dlouhodobého skladování spermií v SMT.
K dosažení oplodnění u lidí a většiny zvířat musí spermie a vajíčka dorazit na místo oplodnění ve správný čas.Proto musí k páření dojít před ovulací nebo v době ovulace.Na druhé straně někteří savci, jako jsou psi, stejně jako jiné než savčí druhy, jako je hmyz, ryby, plazi a ptáci, uchovávají spermie ve svých reprodukčních orgánech po delší dobu, dokud nejsou jejich vajíčka připravena k oplodnění (asynchronní oplodnění 1 ).Ptáci jsou schopni udržet životaschopnost spermií schopných oplodnit vajíčka po dobu 2-10 týdnů2.
Jedná se o unikátní vlastnost, která odlišuje ptáky od ostatních zvířat, protože poskytuje vysokou pravděpodobnost oplodnění po jedné inseminaci po dobu několika týdnů bez současného páření a ovulace.Hlavní zásobní orgán spermatu, nazývaný tubul pro zásobování spermií (SST), se nachází ve vnitřních slizničních záhybech na uterovaginálním spojení.Dosud nejsou zcela pochopeny mechanismy, kterými spermie vstupují, přebývají a opouštějí spermabanku.Na základě předchozích studií bylo předloženo mnoho hypotéz, ale žádná z nich nebyla potvrzena.
Forman4 předpokládal, že spermie si udržují své bydliště v dutině SST prostřednictvím nepřetržitého oscilačního pohybu proti směru toku tekutiny proteinovými kanály umístěnými na epiteliálních buňkách SST (reologie).ATP je vyčerpán kvůli neustálé bičíkové aktivitě potřebné k udržení spermií v lumen SST a motilita nakonec klesá, dokud nejsou spermie vyneseny ze spermatu proudem tekutiny a nezačnou novou cestu dolů vzestupným vejcovodem, aby spermie oplodnily.Vejce (Forman4).Tento model skladování spermií je podporován detekcí akvaporinů 2, 3 a 9 přítomných v epiteliálních buňkách SST pomocí imunocytochemie.Dosud chybí studie o reologii kuřecího spermatu a jeho roli při skladování SST, vaginální selekci spermatu a konkurenci spermií.U kuřat se spermie dostávají do pochvy po přirozeném páření, ale více než 80 % spermií je z pochvy vyvrženo krátce po páření.To naznačuje, že vagina je primárním místem pro výběr spermií u ptáků.Kromě toho bylo hlášeno, že méně než 1 % spermií oplodněných ve vagíně končí v SST2.Při umělé inseminaci kuřat ve vagíně má počet spermií dosahujících SST tendenci se zvyšovat 24 hodin po inseminaci.Mechanismus selekce spermií během tohoto procesu je zatím nejasný a motilita spermií může hrát důležitou roli v příjmu spermií SST.Kvůli tlustým a neprůhledným stěnám vejcovodů je obtížné přímo monitorovat motilitu spermií ve vejcovodech ptáků.Chybí nám proto základní znalosti o tom, jak spermie po oplodnění přecházejí na SST.
Reologie byla nedávno uznána jako důležitý faktor řídící transport spermií v genitáliích savců.Na základě schopnosti pohyblivých spermií migrovat protiproudně, Zaferani et al8 použili mikrofluidní systém corra k pasivní izolaci pohyblivých spermií ze vzorků spermatu.Tento typ třídění spermatu je nezbytný pro lékařskou léčbu neplodnosti a klinický výzkum a je preferován před tradičními metodami, které jsou náročné na čas a práci a mohou ohrozit morfologii spermií a strukturální integritu.Dosud však nebyly provedeny žádné studie o vlivu sekretů z pohlavních orgánů kuřat na motilitu spermií.
Bez ohledu na mechanismus, který udržuje spermie uložené v SST, mnoho výzkumníků pozorovalo, že rezidentní spermie aglutinují hlava-nehlava v SST kuřat 9, 10, křepelek 2 a krůt 11 za vzniku aglutinovaných svazků spermií.Autoři naznačují, že existuje souvislost mezi touto aglutinací a dlouhodobým skladováním spermií v SST.
Tingari a Lake12 uvedli silnou souvislost mezi spermiemi ve žláze přijímající spermie kuřete a zpochybnili, zda ptačí spermie aglutinují stejným způsobem jako spermie savců.Věří, že hluboké spojení mezi spermiemi v chámovodu může být způsobeno stresem způsobeným přítomností velkého počtu spermií v malém prostoru.
Při hodnocení chování spermií na čerstvých podložních sklech lze pozorovat přechodné známky aglutinace, zejména na okrajích kapiček semene.Aglutinace však byla často narušena rotačním působením spojeným s nepřetržitým pohybem, což vysvětluje přechodnou povahu tohoto jevu.Vědci si také všimli, že když bylo do spermatu přidáno ředidlo, objevily se podlouhlé „vláknité“ buněčné agregáty.
Rané pokusy napodobit spermie byly provedeny odstraněním tenkého drátu ze visící kapky, což vedlo k vyčnívajícímu prodlouženému spermatu podobnému vezikulu z kapky semene.Spermie se okamžitě seřadily paralelním způsobem ve váčku, ale celá jednotka rychle zmizela kvůli 3D omezení.Pro studium aglutinace spermií je proto nutné sledovat motilitu a chování spermií přímo v izolovaných tubulech pro zásobování spermií, čehož je obtížné dosáhnout.Proto je nutné vyvinout nástroj, který napodobuje spermie na podporu studií motility spermií a aglutinačního chování.Brillard et al13 uvedli, že průměrná délka tubulů pro ukládání spermií u dospělých kuřat je 400–600 µm, ale některé SST mohou být dlouhé až 2000 µm.Mero a Ogasawara14 rozdělili semenotvorné žlázy na zvětšené a nezvětšené tubuly pro ukládání spermií, přičemž oba měly stejnou délku (~500 µm) a šířku krku (~38 µm), ale střední průměr lumen tubulů byl 56,6 a 56,6 µm.., respektive 11,2 μm, resp.V současné studii jsme použili mikrofluidní zařízení s velikostí kanálu 200 µm × 20 µm (Š × V), jehož průřez je poněkud blízký průřezu amplifikovaného SST.Kromě toho jsme zkoumali motilitu spermií a aglutinační chování v proudící tekutině, což je v souladu s Foremanovou hypotézou, že tekutina produkovaná epiteliálními buňkami SST udržuje spermie v lumen v protiproudém (reologickém) směru.
Cílem této studie bylo překonat problémy s pozorováním motility spermií ve vejcovodu a vyhnout se potížím se studiem reologie a chování spermií v dynamickém prostředí.Bylo použito mikrofluidní zařízení, které vytváří hydrostatický tlak pro simulaci motility spermií v genitáliích kuřete.
Když byla kapka naředěného vzorku spermatu (1:40) vložena do mikrokanálového zařízení, mohly být identifikovány dva typy pohyblivosti spermií (izolované spermie a vázané spermie).Navíc spermie měly tendenci plavat proti proudu (pozitivní reologie; video 1, 2). Přestože svazky spermií měly nižší rychlost než osamělé spermie (p < 0,001), zvýšily procento spermií vykazujících pozitivní reotaxi (p < 0,001; tabulka 2). Přestože svazky spermií měly nižší rychlost než osamělé spermie (p < 0,001), zvýšily procento spermií vykazujících pozitivní reotaxi (p < 0,001; tabulka 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных стоперм), <br>0,00 увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реаотаксит (p < 0). Přestože svazky spermií měly nižší rychlost než u jednotlivých spermií (p < 0,001), zvýšily procento spermií vykazujících pozitivní rheotaxi (p < 0,001; tabulka 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加们增加了搚秤怾精子的速度（p < 0,001分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 罆 增加 了 显癀 昳显社昳显社昀分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов, 0,010, 0,010 али процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Přestože rychlost svazků spermií byla nižší než rychlost jednotlivých spermií (p < 0,001), zvýšily procento spermií s pozitivní reologií (p < 0,001; tabulka 2).Pozitivní reologie jednotlivých spermií a trsů se odhaduje na přibližně 53 % a 85 %.
Bylo pozorováno, že spermie kuřat sharkasi bezprostředně po ejakulaci tvoří lineární svazky, skládající se z desítek jedinců.Tyto chomáče se v průběhu času zvětšují na délku a tloušťku a mohou zůstat in vitro několik hodin, než se rozptýlí (video 3).Tyto vláknité svazky mají tvar spermií echidna, které se tvoří na konci nadvarlete.Bylo zjištěno, že sperma slepice žraloka má vysokou tendenci k aglutinaci a tvorbě síťovaného svazku za méně než jednu minutu po odběru.Tyto paprsky jsou dynamické a mohou se přilepit na jakékoli blízké stěny nebo statické objekty.Přestože svazky spermií snižují rychlost spermií, je jasné, že makroskopicky zvyšují jejich linearitu.Délka svazků se liší v závislosti na počtu spermií odebraných ve svazcích.Byly izolovány dvě části svazku: počáteční část včetně volné hlavičky aglutinované spermie a terminální část včetně ocasu a celého distálního konce spermie.Pomocí vysokorychlostní kamery (950 fps) byly v počáteční části svazku pozorovány volné hlavičky aglutinovaných spermií, které jsou zodpovědné za pohyb svazku díky jejich oscilačnímu pohybu, přičemž ty zbývající do svazku vtahují šroubovitým pohybem (Video 4).U dlouhých chomáčů však bylo pozorováno, že některé volné hlavičky spermií přilnuly k tělu a koncová část chomáčů působí jako lopatky, které pomáhají chomáč pohánět.
Svazky spermií se sice při pomalém proudění tekutiny pohybují paralelně k sobě, ale začnou se překrývat a lepit na vše, co je v klidu, aby nebyly smývány proudem proudu se zvyšující se rychlostí proudění.Svazky se vytvoří, když se hrstka spermií přiblíží k sobě, začnou se synchronně pohybovat a omotávat se kolem sebe a pak se přilepí na lepkavou látku.Obrázky 1 a 2 ukazují, jak se spermie k sobě přibližují a vytvářejí spojení, když se ocasy obtáčí kolem sebe.
Výzkumníci aplikovali hydrostatický tlak, aby vytvořili proudění tekutiny v mikrokanálu ke studiu reologie spermií.Byl použit mikrokanál o velikosti 200 um × 20 um (Š × V) a délce 3,6 um.Použijte mikrokanálky mezi nádobami s injekčními stříkačkami nasazenými na koncích.Pro zviditelnění kanálů bylo použito potravinářské barvivo.
Připevněte propojovací kabely a příslušenství ke zdi.Video bylo pořízeno mikroskopem s fázovým kontrastem.U každého snímku jsou prezentovány snímky z mikroskopie s fázovým kontrastem a mapování.(A) Spojení mezi dvěma proudy brání proudění v důsledku spirálového pohybu (červená šipka).(B) Spojení mezi svazkem trubek a stěnou kanálu (červené šipky), současně jsou spojeny se dvěma dalšími svazky (žluté šipky).(C) Svazky spermií v mikrofluidním kanálu se začnou vzájemně spojovat (červené šipky) a vytvářejí síť svazků spermií.(D) Vytvoření sítě svazků spermií.
Když byla kapka zředěného spermatu vložena do mikrofluidního zařízení a byl vytvořen tok, bylo pozorováno, že se paprsek spermií pohybuje proti směru toku.Svazky těsně přiléhají ke stěnám mikrokanálů a volné hlavy v počáteční části svazků k nim těsně přiléhají (video 5).Také se přilepí na jakékoli stacionární částice ve své cestě, jako jsou trosky, aby odolávaly unášení proudem.Časem se z těchto chomáčů stanou dlouhá vlákna zachycující další jednotlivá spermie a kratší chomáče (Video 6).Jakmile se tok začne zpomalovat, dlouhé linie spermií začnou tvořit síť linií spermií (Video 7; Obrázek 2).
Při vysoké rychlosti proudění (V > 33 µm/s) jsou spirálovité pohyby vláken zvýšeny jako pokus zachytit mnoho jednotlivých svazků tvořících spermie, které lépe odolávají driftovací síle proudění. Při vysoké rychlosti proudění (V > 33 µm/s) jsou spirálovité pohyby vláken zvýšeny jako pokus zachytit mnoho jednotlivých svazků tvořících spermie, které lépe odolávají driftovací síle proudění. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаютосико, я поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, котворьные луферстох ющей силе потока. Při vysokých rychlostech průtoku (V > 33 µm/s) se spirálové pohyby vláken zvyšují, protože se snaží zachytit mnoho jednotlivých spermií tvořících svazky, které jsou schopny lépe odolávat driftovací síle toku.在高流速 (V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成杌祚仢子杌举仪孻的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成杌祚岢的螺旋运动增加地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 譐 杌伟 卻卻 杀伟 卻华 杀伟 卻更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увелитычиваетсхева множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучшепсопротивор tak. Při vysokých rychlostech průtoku (V > 33 µm/s) se šroubovitý pohyb filamentů zvyšuje ve snaze zachytit mnoho jednotlivých svazků tvořících spermie, aby lépe odolávaly driftovým silám toku.Pokusili se také připevnit mikrokanály na boční stěny.
Svazky spermií byly identifikovány jako shluky hlav spermií a stočených ocasů pomocí světelné mikroskopie (LM).Svazky spermií s různými agregáty byly také identifikovány jako zkroucené hlavy a bičíkové agregáty, mnohočetné srostlé ocasy spermií, hlavy spermií připojené k ocasu a hlavy spermií s ohnutými jádry jako mnohočetná srostlá jádra.transmisní elektronová mikroskopie (TEM).Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) ukázala, že svazky spermií byly obalenými agregáty hlav spermií a agregáty spermií vykazovaly připojenou síť obalených ocasů.
Morfologie a ultrastruktura spermií, tvorba svazků spermií byla studována pomocí světelné mikroskopie (poloviční řez), rastrovací elektronové mikroskopie (SEM) a transmisní elektronové mikroskopie (TEM), spermie byly obarveny akridinovou oranží a vyšetřeny pomocí epifluorescenční mikroskopie.
Barvení spermatu akridinovou oranží (obr. 3B) ukázalo, že hlavičky spermií byly slepené k sobě a pokryty sekrečním materiálem, což vedlo k tvorbě velkých chuchvalců (obr. 3D).Svazky spermií sestávaly z agregátů spermií se sítí připojených ocasů (obr. 4A-C).Svazky spermií se skládají z ocasů mnoha spermií slepených k sobě (obr. 4D).Tajemství (obr. 4E,F) pokrývalo hlavy svazků spermií.
Tvorba svazku spermií Pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem a stěrů spermií obarvených akridinovou oranží se ukázalo, že se hlavičky spermií slepí k sobě.(A) Časná tvorba chomáčů spermií začíná spermií (bílý kruh) a třemi spermiemi (žlutý kruh), přičemž spirála začíná u ocasu a končí u hlavy.(B) Mikrofotografie stěru spermatu obarveného akridinovou oranží ukazující přilnavé hlavičky spermií (šipky).Výboj pokrývá hlavu (hlavy).Zvětšení × 1000. (C) Vývoj velkého paprsku transportovaného prouděním v mikrofluidním kanálu (pomocí vysokorychlostní kamery při 950 fps).(D) Mikrofotografie spermatu obarveného akridinovou oranží ukazující velké chomáče (šipky).Zvětšení: × 200.
Skenovací elektronová mikrofotografie paprsku spermií a spermatu obarveného akridinovou oranží.(A, B, D, E) jsou digitální barevné skenovací elektronové mikrofotografie spermií a C a F jsou mikrofotografie spermií obarvených akridinovou oranží, které ukazují připojení mnoha spermií obalujících kaudální síť.(AC) Agregáty spermií jsou znázorněny jako síť připojených ocasů (šipky).(D) Přilnutí několika spermií (s adhezivní látkou, růžový obrys, šipka) ovíjejících ocas.(E a F) Agregáty hlav spermií (ukazatele) pokryté adhezivním materiálem (ukazatele).Spermie tvořily svazky s několika vírovitými strukturami (F).(C) × 400 a (F) × 200 zvětšení.
Pomocí transmisní elektronové mikroskopie jsme zjistili, že svazky spermií měly připevněné ocasy (obr. 6A, C), hlavy připojené k ocasům (obr. 6B) nebo hlavy připojené k ocasům (obr. 6D).Hlavičky spermií ve svazku jsou zakřivené a v řezu představují dvě jaderné oblasti (obr. 6D).Ve svazku řezu měla spermie zkroucenou hlavu se dvěma jadernými oblastmi a více bičíkovými oblastmi (obr. 5A).
Digitální barevný elektronový mikrosnímek zobrazující spojovací ocásky ve svazku spermií a aglutinační materiál spojující hlavičky spermií.(A) Připojený ocas velkého počtu spermií.Všimněte si, jak ocas vypadá v projekci na výšku (šipka) i na šířku (šipka).(B) Hlava (šipka) spermie je spojena s ocasem (šipka).(C) Je připojeno několik ocasů spermií (šipky).(D) Aglutinační materiál (AS, modrý) spojuje čtyři hlavičky spermií (fialové).
Skenovací elektronová mikroskopie byla použita k detekci hlaviček spermií ve svazcích spermií pokrytých sekrety nebo membránami (obrázek 6B), což ukazuje, že svazky spermií byly ukotveny extracelulárním materiálem.Aglutinovaný materiál byl koncentrován v hlavičce spermatu (sestava podobná hlavě medúzy; obr. 5B) a expandoval distálně, čímž se získal zářivě žlutý vzhled pod fluorescenční mikroskopií, když byl obarven akridinovou oranží (obr. 6C).Tato látka je jasně viditelná pod skenovacím mikroskopem a je považována za pojivo.Polotenké řezy (obr. 5C) a roztěry spermií obarvené akridinovou oranží ukázaly svazky spermií obsahující hustě sbalené hlavy a stočené ocasy (obr. 5D).
Různé mikrofotografie ukazující agregaci hlav spermií a složených ocasů pomocí různých metod.(A) Průřezová digitální barevná transmisní elektronová mikrofotografie svazku spermií zobrazující stočenou hlavičku spermie s dvoudílným jádrem (modrá) a několika bičíkovými částmi (zelená).(B) Digitální barevný rastrovací elektronový mikrofotografie ukazující shluk hlaviček spermií podobných medúzám (šipky), které se zdají být zakryté.(C) Polotenký řez ukazující agregované hlavičky spermií (šipky) a stočené ocasy (šipky).(D) Mikrofotografie spermatu obarveného akridinovou oranží ukazující agregáty hlaviček spermií (šipky) a stočené přilnavé ocasy (šipky).Všimněte si, že lepkavá látka (S) pokrývá hlavičku spermie.(D) × 1000-násobné zvětšení.
Použitím transmisní elektronové mikroskopie (obr. 7A) bylo také zaznamenáno, že hlavičky spermií byly zkroucené a jádra měla spirálovitý tvar, jak potvrdily roztěry spermií obarvené akridinovou oranží a zkoumané pomocí fluorescenční mikroskopie (obr. 7B).
(A) Digitální barevný transmisní elektronový mikrosnímek a (B) Stěr spermií obarvený akridinovou oranží ukazující stočené hlavy a připojení hlav a ocasů spermií (šipky).(B) × 1000-násobné zvětšení.
Zajímavým zjištěním je, že Sharkaziho spermie se shlukují a vytvářejí pohyblivé vláknité svazky.Vlastnosti těchto svazků nám umožňují pochopit jejich možnou roli při absorpci a ukládání spermií v SST.
Po páření spermie vstoupí do pochvy a podstoupí intenzivní selekční proces, jehož výsledkem je pouze omezený počet spermií, které vstoupí do SST15,16.Mechanismy, kterými spermie vstupují a vystupují z SST, jsou dosud nejasné.U drůbeže jsou spermie skladovány v SST po delší dobu 2 až 10 týdnů, v závislosti na druhu6.Kontroverze zůstává o stavu spermatu během skladování v SST.Jsou v pohybu nebo v klidu?Jinými slovy, jak si spermie udrží svou pozici v SST tak dlouho?
Forman4 navrhl, že pobyt a ejekce SST lze vysvětlit pomocí motility spermií.Autoři předpokládají, že spermie si udržují svou pozici plaváním proti proudu tekutiny vytvořenému epitelem SST a že spermie jsou z SST vyvrženy, když jejich rychlost klesne pod bod, ve kterém se začnou pohybovat zpět kvůli nedostatku energie.Zaniboni5 potvrdila přítomnost akvaporinů 2, 3 a 9 v apikální části epiteliálních buněk SST, což může nepřímo podporovat Foremanův model ukládání spermatu.V současné studii jsme zjistili, že téměř polovina Sharkashiho spermií vykazuje pozitivní reologii v proudící tekutině a že aglutinované svazky spermií zvyšují počet spermií vykazujících pozitivní reologii, ačkoli je aglutinace zpomaluje.Jak spermie putují ptačím vejcovodem k místu oplodnění, není zcela jasné.U savců folikulární tekutina chemopřitahuje spermie.Předpokládá se však, že chemoatraktanty nasměrují spermie na velké vzdálenosti7.Proto jsou za transport spermií zodpovědné jiné mechanismy.Schopnost spermií orientovat se a proudit proti tekutině vejcovodů uvolněné po páření byla hlášena jako hlavní faktor při zacílení spermií u myší.Parker 17 navrhl, že spermie procházejí vejcovody plaváním proti ciliárnímu proudu u ptáků a plazů.Ačkoli to nebylo experimentálně prokázáno u ptáků, Adolphi18 byl první, kdo zjistil, že ptačí spermie dává pozitivní výsledky, když je mezi krycím sklíčkem a sklíčkem vytvořena tenká vrstva tekutiny pomocí proužku filtračního papíru.Reologie.Hino a Yanagimachi [19] umístili komplex myších vaječníků, vejcovodů a dělohy do perfuzního kroužku a vstříkli 1 µl inkoustu do isthmu, aby vizualizovali proudění tekutiny ve vejcovodech.Zaznamenali velmi aktivní pohyb kontrakce a relaxace ve vejcovodu, ve kterém se všechny inkoustové kuličky neustále pohybovaly směrem k ampulce vejcovodu.Autoři zdůrazňují význam průtoku tubární tekutiny z dolních do horních vejcovodů pro uplift spermií a fertilizaci.Brillard20 uvedl, že u kuřat a krůt spermie migrují aktivním pohybem z poševního vchodu, kde jsou uloženy, do uterovaginálního spojení, kde jsou uloženy.Tento pohyb však mezi uterovaginální junkcí a infundibulem není nutný, protože spermie jsou transportovány pasivním posunem.Se znalostí těchto předchozích doporučení a výsledků získaných v současné studii lze předpokládat, že schopnost spermií pohybovat se proti proudu (reologie) je jednou z vlastností, na kterých je založen proces výběru.To určuje průchod spermií vagínou a jejich vstup do CCT ke skladování.Jak navrhl Forman4, může to také usnadnit proces vstupu spermií do SST a jeho prostředí po určitou dobu a poté opuštění, když se jejich rychlost začne zpomalovat.
Na druhé straně Matsuzaki a Sasanami 21 navrhli, že ptačí spermie podléhají změnám motility od dormance k motilitě v samčích a samičích reprodukčních traktech.Inhibice rezidentní motility spermií v SST byla navržena pro vysvětlení dlouhé doby skladování spermií a poté omlazení po opuštění SST.Za hypoxických podmínek Matsuzaki et al.1 uvádí vysokou produkci a uvolňování laktátu v SST, což může vést k inhibici rezidentní motility spermií.V tomto případě se význam reologie spermií odráží ve výběru a absorpci spermií, nikoli v jejich skladování.
Vzor aglutinace spermií je považován za přijatelné vysvětlení dlouhé doby skladování spermatu v SST, protože jde o běžný vzorec retence spermatu u drůbeže2,22,23.Bakst a kol.2 pozorovali, že většina spermií k sobě přilnula a vytvořila fascikulární agregáty a jednotlivé spermie byly v CCM křepelek nalezeny jen zřídka.Na druhé straně Wen a kol.24 pozorovali více rozptýlených spermií a méně chomáčů spermií v lumen SST u kuřat.Na základě těchto pozorování lze předpokládat, že sklon k aglutinaci spermií se liší mezi ptáky a mezi spermiemi ve stejném ejakulátu.Kromě toho Van Krey a spol.9 naznačil, že náhodná disociace aglutinovaných spermií je zodpovědná za postupné pronikání spermií do lumen vejcovodu.Podle této hypotézy by měla být z SST nejprve vyloučena spermie s nižší aglutinační kapacitou.V této souvislosti může být schopnost spermií aglutinovat faktorem ovlivňujícím výsledek konkurence spermií u špinavých ptáků.Navíc, čím déle aglutinované spermie disociují, tím déle je zachována plodnost.
Ačkoli agregace spermií a agregace do svazků byly pozorovány v několika studiích2,22,24, nebyly podrobně popsány kvůli složitosti jejich kinematického pozorování v rámci SST.Bylo učiněno několik pokusů studovat aglutinaci spermií in vitro.Když byl tenký drátek odstraněn z visící kapky semen, byla pozorována rozsáhlá, ale přechodná agregace.To vede k tomu, že z kapky vyčnívá podlouhlá bublina napodobující semennou žlázu.Kvůli 3D omezením a krátkým dobám odkapávání celý blok rychle chátral9.V současné studii s použitím kuřat Sharkashi a mikrofluidních čipů jsme byli schopni popsat, jak se tyto chomáče tvoří a jak se pohybují.Svazky spermatu se vytvořily ihned po odběru spermatu a bylo zjištěno, že se pohybují ve spirále a vykazují pozitivní reologii, pokud jsou přítomny v toku.Navíc při makroskopickém pohledu bylo pozorováno, že svazky spermií zvyšují linearitu motility ve srovnání s izolovanými spermiemi.To naznačuje, že k aglutinaci spermií může dojít před penetrací SST a že produkce spermií není omezena na malou oblast kvůli stresu, jak bylo dříve navrženo (Tingari a Lake12).Během tvorby chomáčů spermie synchronně plavou, dokud nevytvoří spojení, pak se jejich ocásky ovinou kolem sebe a hlavička spermie zůstane volná, ale ocásek a distální část spermie se slepí lepivou látkou.Proto je za pohyb zodpovědná volná hlava vazu, která táhne zbytek vazu.Skenovací elektronová mikroskopie svazků spermií ukázala připojené hlavičky spermií pokryté množstvím lepkavého materiálu, což naznačuje, že hlavičky spermií byly připevněny v klidových svazcích, k čemuž mohlo dojít po dosažení místa uložení (SST).
Když je roztěr spermií obarven akridinovou oranží, lze pod fluorescenčním mikroskopem vidět extracelulární adhezivní materiál kolem spermií.Tato látka umožňuje svazkům spermií přilnout a přilnout k okolním povrchům nebo částicím tak, aby se neunášely s okolním tokem.Naše pozorování tedy ukazují roli adheze spermií ve formě pohyblivých svazků.Jejich schopnost plavat proti proudu a držet se blízkých povrchů umožňuje spermiím zůstat déle v SST.
Rothschild25 použil hemocytometrickou kameru ke studiu plovoucí distribuce hovězího semene v kapce suspenze, přičemž pořizoval mikrofotografie přes kameru s vertikální i horizontální optickou osou mikroskopu.Výsledky ukázaly, že spermie byly přitahovány k povrchu komůrky.Autoři naznačují, že mezi spermií a povrchem mohou být hydrodynamické interakce.Vezmeme-li toto v úvahu, spolu se schopností spermatu kuřat Sharkashi tvořit lepkavé chomáče, může to zvýšit pravděpodobnost, že sperma přilne ke stěně SST a bude skladováno po dlouhou dobu.
Bccetti a Afzeliu26 uvedli, že glykokalyx spermie je nezbytný pro rozpoznání gamet a aglutinaci.Forman10 pozoroval, že hydrolýza α-glykosidických vazeb v glykoprotein-glykolipidových potahech ošetřením ptačího spermatu neuraminidázou vedla ke snížení plodnosti bez ovlivnění motility spermií.Autoři předpokládají, že účinek neuraminidázy na glykokalyx narušuje sekvestraci spermií na uterovaginálním spojení, a tím snižuje plodnost.Jejich pozorování nemůže ignorovat možnost, že léčba neuraminidázou může snížit rozpoznávání spermií a oocytů.Forman a Engel10 zjistili, že plodnost byla snížena, když byly slepice intravaginálně inseminovány spermatem ošetřeným neuraminidázou.IVF se spermiemi ošetřenými neuraminidázou však neovlivnilo fertilitu ve srovnání s kontrolními kuřaty.Autoři dospěli k závěru, že změny v glykoprotein-glykolipidovém povlaku kolem membrány spermií snižují schopnost spermií oplodnit se zhoršením sekvestrace spermií na uterovaginálním spojení, což zase zvyšuje ztrátu spermií v důsledku rychlosti uterovaginálního spojení, ale neovlivňuje rozpoznávání spermií a vajíček.
U krůt Bakst a Bauchan 11 našli malé vezikuly a fragmenty membrány v lumen SST a pozorovali, že některé z těchto granulí se spojily s membránou spermií.Autoři naznačují, že tyto vztahy mohou přispívat k dlouhodobému ukládání spermií při SST.Vědci však neupřesnili zdroj těchto částic, zda jsou vylučovány epiteliálními buňkami CCT, produkovány a vylučovány mužským reprodukčním systémem, nebo produkovány samotnými spermiemi.Tyto částice jsou také zodpovědné za aglutinaci.Grützner et al27 uvedli, že epididymální epiteliální buňky produkují a vylučují specifický protein, který je nutný pro tvorbu jednopórových semenných traktů.Autoři také uvádějí, že disperze těchto svazků závisí na interakci epididymálních proteinů.Nixon et al28 zjistili, že adnexa vylučují protein, kyselý osteonektin bohatý na cystein;SPARC se podílí na tvorbě chomáčů spermií u krátkozobých echidnas a ptakopysků.Rozptyl těchto paprsků je spojen se ztrátou tohoto proteinu.
V současné studii ultrastrukturální analýza pomocí elektronové mikroskopie ukázala, že spermie přilnuly k velkému množství hustého materiálu.Předpokládá se, že tyto látky jsou zodpovědné za aglutinaci, která kondenzuje mezi a kolem přilnavých hlav, ale v nižších koncentracích v oblasti ocasu.Předpokládáme, že tato aglutinační látka je vylučována z mužského reprodukčního systému (epididymis nebo vas deferens) spolu se spermatem, protože často pozorujeme separaci spermatu od lymfy a semenné plazmy během ejakulace.Bylo hlášeno, že když ptačí spermie procházejí nadvarletami a chámovodem, podléhají změnám souvisejícím s maturací, které podporují jejich schopnost vázat proteiny a získávat plazmatické glykoproteiny spojené s lemma.Perzistence těchto proteinů na rezidentních membránách spermií v SST naznačuje, že tyto proteiny mohou ovlivnit získání stability membrány spermií30 a určovat jejich plodnost31.Ahammad et al32 uvedli, že spermie získaná z různých částí samčího reprodukčního systému (od varlat po distální vas deferens) vykazovala progresivní nárůst životaschopnosti za podmínek skladování v kapalině, bez ohledu na skladovací teplotu, a životaschopnost u kuřat se také zvyšuje ve vejcovodech po umělé inseminaci.
Trsy kuřecích spermií Sharkashi mají odlišné vlastnosti a funkce než jiné druhy, jako jsou echidnas, ptakopysk, myšice lesní, jeleni krysy a morčata.U kuřat sharkasi tvorba svazků spermií snížila rychlost jejich plavání ve srovnání s jednotlivými spermiemi.Tyto svazky však zvýšily procento reologicky pozitivních spermií a zvýšily schopnost spermií stabilizovat se v dynamickém prostředí.Naše výsledky tedy potvrzují předchozí domněnku, že aglutinace spermií u SST je spojena s dlouhodobým skladováním spermií.Také předpokládáme, že sklon spermií k tvorbě chomáčů může řídit rychlost ztráty spermií při SST, což může změnit výsledek konkurence spermií.Podle tohoto předpokladu spermie s nízkou aglutinační kapacitou uvolňují nejprve SST, zatímco spermie s vysokou aglutinační kapacitou produkují většinu potomků.Tvorba jednopórových svazků spermií je prospěšná a ovlivňuje poměr rodič-dítě, ale využívá jiný mechanismus.U echidnas a platypuses, spermatozoa jsou uspořádány paralelně ke každému jiný zvětšit dopřednou rychlost paprsku.Svazky echidnas se pohybují asi třikrát rychleji než jednotlivé spermie.Předpokládá se, že tvorba takových chomáčů spermií u echidnas je evoluční adaptace k udržení dominance, protože samice jsou promiskuitní a obvykle se páří s několika samci.Proto spermie z různých ejakulátů silně soutěží o oplodnění vajíčka.
Aglutinované spermie kuřat sharkasi lze snadno vizualizovat pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem, což je považováno za výhodné, protože umožňuje snadné studium chování spermií in vitro.Mechanismus, kterým tvorba chomáčů spermií podporuje reprodukci u kuřat sharkasi, se také liší od mechanismu pozorovaného u některých placentárních savců, kteří představují kooperativní chování spermií, jako jsou lesní myši, kde se některé spermie dostanou k vajíčkům a pomáhají dalším příbuzným jedincům dosáhnout a poškodit jejich vajíčka.dokázat se.altruistické chování.Samooplodnění 34. Další příklad kooperativního chování u spermií byl nalezen u jelenovitých myší, kde spermie byly schopny identifikovat a kombinovat s geneticky nejvíce příbuznými spermiemi a vytvářet kooperativní skupiny, aby se zvýšila jejich rychlost ve srovnání s nepříbuznými spermiemi35.
Výsledky získané v této studii nejsou v rozporu s Fomanovou teorií dlouhodobého skladování spermií v SWS.Výzkumníci uvádějí, že spermie pokračují v pohybu v toku epiteliálních buněk lemujících SST po delší dobu a po určité době jsou zásoby energie spermií vyčerpány, což má za následek snížení rychlosti, což umožňuje vypuzení látek s nízkou molekulovou hmotností.energie spermií s prouděním tekutiny z lumen SST Dutina vejcovodu.V současné studii jsme pozorovali, že polovina jednotlivých spermií vykazovala schopnost plavat proti proudícím tekutinám a jejich adheze ve svazku zvýšila jejich schopnost vykazovat pozitivní reologii.Kromě toho jsou naše údaje v souladu s údaji Matsuzaki et al.1, který uvedl, že zvýšená sekrece laktátu při SST může inhibovat rezidentní motilitu spermií.Naše výsledky však popisují tvorbu pohyblivých vazů spermií a jejich reologické chování v přítomnosti dynamického prostředí v mikrokanálu ve snaze objasnit jejich chování v SST.Budoucí výzkum se může zaměřit na určení chemického složení a původu aglutinačního činidla, což nepochybně pomůže výzkumníkům vyvinout nové způsoby skladování tekutého spermatu a prodloužení doby plodnosti.
Jako dárci spermatu ve studii bylo vybráno 15 30týdenních samců sharkasi s holým krkem (homozygotní dominantní; Na Na).Ptáci byli chováni na Výzkumné drůbežářské farmě Zemědělské fakulty, Ashit University, Ashit Governorate, Egypt.Ptáci byli umístěni v samostatných klecích (30 x 40 x 40 cm), podrobeni světelnému programu (16 hodin světla a 8 hodin tmy) a krmeni potravou obsahující 160 g hrubého proteinu, 2800 kcal metabolizovatelné energie, 35 g vápníku každý.5 gramů dostupného fosforu na kilogram stravy.
Podle údajů 36, 37 bylo sperma odebráno samcům masáží břicha.Během 3 dnů bylo odebráno celkem 45 vzorků spermatu od 15 mužů.Sperma (n = 15/den) bylo okamžitě zředěno 1:1 (v:v) roztokem Belsville Poultry Semen Diluent, který obsahuje difosforečnan draselný (1,27 g), monohydrát glutamátu sodného (0,867 g), fruktózu (0,5 d) bezvodý sodík.acetát (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethan (0,195 g), monohydrát citrátu draselného (0,064 g), monofosfát draselný (0,065 g), chlorid hořečnatý (0,034 g) a H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarita 333 mOsm/kg38.Zředěné vzorky spermatu byly nejprve vyšetřeny pod světelným mikroskopem, aby byla zajištěna dobrá kvalita spermatu (vlhkost), a poté uloženy ve vodní lázni při 37 °C do použití do půl hodiny po odběru.
Kinematika a reologie spermií je popsána pomocí systému mikrofluidních zařízení.Vzorky spermatu byly dále zředěny na 1:40 v Beltsville Avian Semen Diluent, vloženy do mikrofluidního zařízení (viz níže) a kinetické parametry byly stanoveny pomocí systému Computerized Semen Analysis (CASA) dříve vyvinutého pro mikrofluidní charakterizaci.o mobilitě spermií v kapalných médiích (Katedra strojního inženýrství, Technická fakulta, Assiut University, Egypt).Plugin lze stáhnout na adrese: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Byla měřena rychlost křivky (VCL, μm/s), lineární rychlost (VSL, μm/s) a průměrná rychlost trajektorie (VAP, μm/s).Videa spermií byla pořízena pomocí invertovaného mikroskopu Optika XDS-3 s fázovým kontrastem (s objektivem 40x) připojeného ke kameře Tucson ISH1000 při 30 fps po dobu 3 s.Pomocí softwaru CASA prostudujte alespoň tři oblasti a 500 trajektorií spermií na vzorek.Nahrané video bylo zpracováno pomocí domácí CASA.Definice motility v zásuvném modulu CASA je založena na rychlosti plavání spermií ve srovnání s rychlostí průtoku a nezahrnuje další parametry, jako je pohyb ze strany na stranu, protože bylo zjištěno, že je spolehlivější v proudění tekutiny.Reologický pohyb je popsán jako pohyb spermií proti směru toku tekutiny.Spermie s reologickými vlastnostmi byly vyděleny počtem pohyblivých spermií;spermie, které byly v klidu a konvekčně se pohybující spermie byly vyloučeny z počítání.
Všechny použité chemikálie byly získány od Elgomhoria Pharmaceuticals (Káhira, Egypt), pokud není uvedeno jinak.Zařízení bylo vyrobeno podle popisu El-sherry et al.40 s několika úpravami.Materiály použité k výrobě mikrokanálů zahrnovaly skleněné desky (Howard Glass, Worcester, MA), negativní rezist SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Německo) a polyaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanály jsou vyráběny pomocí měkké litografie.Nejprve byla na tiskárně s vysokým rozlišením (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) vytištěna čirá ochranná maska ​​na obličej s požadovaným designem mikrokanálů.Předlohy byly vyrobeny pomocí skleněných desek jako substrátů.Destičky byly vyčištěny v acetonu, isopropanolu a deionizované vodě a poté potaženy 20 um vrstvou SU8-25 rotačním nanášením (3000 ot./min, 1 min).Vrstvy SU-8 byly poté jemně vysušeny (65 °C, 2 minuty a 95 °C, 10 minut) a vystaveny UV záření po dobu 50 sekund.Postexpoziční vypalování při 65 °C a 95 °C po dobu 1 min a 4 min pro zesíťování exponovaných SU-8 vrstev, následované vyvoláním v diacetonalkoholu po dobu 6,5 min.Vafle pečte natvrdo (200 °C po dobu 15 minut), aby vrstva SU-8 dále ztuhla.
PDMS byl připraven smícháním monomeru a tvrdidla v hmotnostním poměru 10:1, poté odplyněn ve vakuovém exsikátoru a nalit na hlavní rám SU-8.PDMS byl vytvrzen v peci (120 °C, 30 min), poté byly kanály vyříznuty, odděleny od matrice a perforovány, aby bylo možné připojit zkumavky na vstupu a výstupu mikrokanálu.Nakonec byly mikrokanály PDMS trvale připojeny k mikroskopickým sklíčkům pomocí přenosného koronového procesoru (Electro-Technic Products, Chicago, IL), jak je popsáno jinde.Mikrokanál použitý v této studii měří 200 µm × 20 µm (Š × V) a je 3,6 cm dlouhý.
Proudění tekutiny vyvolané hydrostatickým tlakem uvnitř mikrokanálu je dosaženo udržováním hladiny tekutiny ve vstupním zásobníku nad výškovým rozdílem Δh39 ve výstupním zásobníku (obr. 1).
kde f je koeficient tření definovaný jako f = C/Re pro laminární proudění v obdélníkovém kanálu, kde C je konstanta v závislosti na poměru stran kanálu, L je délka mikrokanálu, Vav je průměrná rychlost uvnitř mikrokanálu, Dh je hydraulický průměr kanálu, g – gravitační zrychlení.Pomocí této rovnice lze vypočítat průměrnou rychlost kanálu pomocí následující rovnice: