Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Mezitím budeme web zobrazovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Porézní částice oxidu křemičitého byly připraveny sol-gelovou metodou s určitými modifikacemi pro získání makroporézních částic. Tyto částice byly derivatizovány reverzibilní adiční fragmentační přenosem řetězce (RAFT) s N-fenylmaleimid-methylvinylisokyanátem (PMI) a styrenem za účelem přípravy stacionární fáze interkalace N-fenylmaleimidu s polystyrenem (PMP). Kolony z nerezové oceli s úzkým otvorem (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) byly plněny suspenzní náplní. Byla vyhodnocena separace směsi peptidů sestávající z pěti peptidů (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) na PMP koloně (chromatografický výkon) a štěpení lidského sérového albuminu (HAS) trypsinem. Za optimálních elučních podmínek je teoretický počet paprsků peptidové směsi až 280 000 paprsků/m². Porovnání separačního výkonu vyvinuté kolony s komerční kolonou Ascentis Express. Na koloně RP-Amide bylo pozorováno, že separační výkon kolony PMP byl lepší než u komerční kolony z hlediska separační účinnosti a rozlišení.
V posledních letech se biofarmaceutický průmysl stal expandujícím globálním trhem s podstatným nárůstem podílu na trhu. S explozivním růstem biofarmaceutického průmyslu1,2,3 je analýza peptidů a proteinů velmi žádaná. Kromě cílového peptidu vzniká během syntézy peptidů několik nečistot, což vyžaduje chromatografické čištění k získání peptidů požadované čistoty. Analýza a charakterizace proteinů v tělních tekutinách, tkáních a buňkách je extrémně náročný úkol kvůli velkému počtu potenciálně detekovatelných druhů v jednom vzorku. Ačkoli je hmotnostní spektrometrie účinným nástrojem pro sekvenování peptidů a proteinů, pokud jsou takové vzorky vstříknuty do hmotnostního spektrometru v jednom průchodu, separace nebude ideální. Tento problém lze zmírnit implementací separací kapalinovou chromatografií (LC) před MS analýzou, což sníží počet analytů vstupujících do hmotnostního spektrometru v daném čase4,5,6. Kromě toho lze během separace v kapalné fázi analyty zaostřit v úzkých oblastech, čímž se tyto analyty koncentrují a zlepšuje se citlivost MS detekce. Kapalinová chromatografie (LC) se v posledním desetiletí výrazně posunula a stala se populární technikou v... proteomická analýza7,8,9,10.
Reverzní fázová kapalinová chromatografie (RP-LC) se široce používá k čištění a separaci peptidových směsí za použití oktadecylem modifikovaného oxidu křemičitého (ODS) jako stacionární fáze11,12,13. Stacionární fáze RP však neposkytují uspokojivou separaci peptidů a proteinů kvůli své komplexní struktuře a amfifilní povaze14,15. Proto jsou pro analýzu peptidů a proteinů s polárními a nepolárními skupinami nutné speciálně navržené stacionární fáze, které interagují s těmito analyty a zadržují je16. Smíšená chromatografie, která poskytuje multimodální interakce, může být alternativou k RP-LC pro separaci peptidů, proteinů a dalších komplexních směsí. Bylo připraveno několik smíšených stacionárních fází a kolony naplněné těmito fázemi byly použity pro separaci peptidů a proteinů17,18,19,20,21. Smíšené stacionární fáze (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polární interkalace/RPLC) jsou vhodné pro separaci peptidů a proteinů díky přítomnosti polárních i nepolárních fází. skupiny22,23,24,25,26,27,28. Podobně polární interkalační stacionární fáze s kovalentně vázanými polárními skupinami vykazují dobrou separační sílu a jedinečnou selektivitu pro polární a nepolární analyty, protože separace závisí na interakci mezi analytem a stacionární fází. Multimodální interakce 29, 30, 31, 32. Nedávno Zhang a kol. 30 připravili dodecyl-terminovanou polyaminovou stacionární fázi a úspěšně separovali uhlovodíky, antidepresiva, flavonoidy, nukleosidy, estrogeny a několik dalších analytů. Polární interkalátor má polární i nepolární skupiny, takže jej lze použít k separaci peptidů a proteinů, které mají hydrofobní i hydrofilní části. Polárně zalité kolony (např. amidově zalité kolony C18) jsou komerčně dostupné pod obchodním názvem Ascentis Express RP-Amide columns, ale tyto kolony se používají pouze pro analýzu aminu 33.
V této studii byla připravena a vyhodnocena polární stacionární fáze (polystyren zalitý v N-fenylmaleimidu) pro separaci peptidů a trypsinových digescí HSA. Stacionární fáze byla připravena pomocí následující strategie. Porézní částice oxidu křemičitého byly připraveny podle postupu uvedeného v naší předchozí publikaci s určitými úpravami protokolu přípravy. Poměr močoviny, polyethylenglykolu (PEG), TMOS, vody a kyseliny octové byl upraven pro přípravu částic oxidu křemičitého s velkou velikostí pórů. Za druhé byl syntetizován nový ligand, fenylmaleimid-methylvinyl isokyanát, a použit k derivatizaci částic oxidu křemičitého za účelem přípravy polární zalité stacionární fáze. Výsledná stacionární fáze byla naplněna do kolony z nerezové oceli (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) s použitím optimalizovaného schématu plnění. Plnění kolony je podporováno mechanickými vibracemi, aby se zajistilo vytvoření homogenního lože v koloně. Vyhodnoťte separaci směsí peptidů sestávajících z pěti peptidů na naplněné koloně; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) a trypsinový digest lidského sérového albuminu (HAS). Bylo pozorováno, že směs peptidů a trypsinový digest HSA se separují s dobrým rozlišením a účinností. Separační výkon kolony PMP byl porovnán s výkonem kolony Ascentis Express RP-Amide. Bylo pozorováno, že jak peptidy, tak proteiny jsou na koloně PMP dobře rozlišeny a účinné, a byla účinnější než kolona Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyethylenglykol), močovina, kyselina octová, trimethoxyorthosilikát (TMOS), trimethylchlorsilan (TMCS), trypsin, lidský sérový albumin (HSA), chlorid amonný, močovina, hexan, methyldisilazan (HMDS), methakryloylchlorid (MC), styren, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxid (BPO), acetonitril (ACN) kvality pro HPLC, methanol, 2-propanol a aceton. Zakoupeno od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Směs močoviny (8 g), polyethylenglykolu (8 g) a 8 ml 0,01N kyseliny octové se míchá 10 minut a poté se k ní za ledového chladu přidá 24 ml TMOS. Reakční směs se zahřívá 6 hodin při 40 °C a poté 8 hodin při 120 °C v autoklávu z nerezové oceli. Voda se slije a zbývající materiál se suší 12 hodin při 70 °C. Vysušená měkká hmota se hladce rozemele v peci a kalcinuje se 12 hodin při 550 °C. Byly připraveny a charakterizovány tři šarže za účelem zkoumání reprodukovatelnosti velikosti částic, velikosti pórů a povrchové plochy.
Modifikací povrchu částic oxidu křemičitého předem syntetizovaným ligandem fenylmaleimid-methylvinylisokyanátem (PCMP) a následnou radiální polymerací se styrenem byla připravena sloučenina obsahující polární skupiny. Stacionární fáze pro agregáty a polystyrenové řetězce. Postup přípravy je popsán níže.
N-fenylmaleimid (200 mg) a methylvinylisokyanát (100 mg) byly rozpuštěny v suchém toluenu a do reakční baňky bylo přidáno 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitrilu (AIBN) za účelem přípravy kopolymeru fenylmaleimid-methylvinylisokyanát (PMCP). Směs byla zahřívána při 60 °C po dobu 3 hodin, filtrována a sušena v peci při 40 °C po dobu 3 hodin.
Sušené částice oxidu křemičitého (2 g) byly dispergovány v suchém toluenu (100 ml), míchány a sonikovány v 500ml baňce s kulatým dnem po dobu 10 minut. PMCP (10 mg) byl rozpuštěn v toluenu a po kapkách přidáván do reakční baňky pomocí kapací nálevky. Směs byla zahřívána pod zpětným chladičem při 100 °C po dobu 8 hodin, přefiltrována, promyta acetonem a sušena při 60 °C po dobu 3 hodin. Poté byly částice oxidu křemičitého vázané na PMCP (100 g) rozpuštěny v toluenu (200 ml) a byl přidán 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) za přítomnosti 100 µl dibutylcíndilaurátu jako katalyzátoru. Směs byla míchána při 50 °C po dobu 8 hodin, přefiltrována a sušena při 50 °C po dobu 3 hodin.
Styren (1 ml), benzoylperoxid BPO (0,5 ml) a částice oxidu křemičitého vázané na TEMPO-PMCP (1,5 g) byly dispergovány v toluenu a propláchnuty dusíkem. Polymerace styrenu byla provedena při 100 °C po dobu 12 hodin. Výsledný produkt byl promyt methanolem a sušen při 60 °C přes noc. Celkové reakční schéma je znázorněno na obrázku 1.
Vzorky byly odplyňovány při teplotě 393 K po dobu 1 hodiny, aby se dosáhlo zbytkového tlaku menšího než 10-3 Torr. Množství N2 adsorbovaného při relativním tlaku P/P0 = 0,99 bylo použito k určení celkového objemu pórů. Morfologie holých a ligandem vázaných částic oxidu křemičitého byla zkoumána pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonsko). Vysušené vzorky (holý oxid křemičitý a ligandem vázané částice oxidu křemičitého) byly umístěny na hliníkovou kolonu pomocí lepicí uhlíkové pásky. Na vzorky bylo naneseno zlato pomocí naprašovacího zařízení Q150T a na vzorky byla nanesena 5nm vrstva Au. To zlepšuje účinnost procesu při nízkých napětích a zajišťuje jemnozrnné naprašování za studena. Pro elementární analýzu byl použit elementární analyzátor Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Pro získání distribuce velikosti částic byl použit analyzátor velikosti částic Malvern (Worcestershire, Spojené království) Mastersizer 2000. Holé částice oxidu křemičitého a ligandem vázané částice oxidu křemičitého (5 mg (každá) byly dispergovány v 5 ml isopropanolu, sonikovány po dobu 10 minut, vortexovány po dobu 5 minut a umístěny na optický stůl Mastersizeru. Termogravimetrická analýza byla prováděna rychlostí 5 °C za minutu v teplotním rozsahu 30 až 800 °C.
Kolony z nerezové oceli s úzkým otvorem a skelnou výstelkou o rozměrech (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) byly plněny metodou plnění suspenzí, přičemž byl použit stejný postup jako v Ref. 31. Kolona z nerezové oceli (s vystlaným sklem, vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) s výstupním armaturou obsahující fritu o velikosti 1 µm byla připojena k suspenznímu náplně (Alltech Deerfield, IL, USA). Připravte suspenzi stacionární fáze suspendováním 150 mg stacionární fáze v 1,2 ml methanolu a odešlete ji do skladovací kolony. Jako rozpouštědlo suspenze i jako hnací rozpouštědlo byl použit methanol. Kolonu postupně plňte tlakem 100 MP po dobu 10 minut, 80 MP po dobu 15 minut a 60 MP po dobu 30 minut. Během plnění byly pomocí dvou GC třepaček aplikovány mechanické vibrace, aby se zajistilo rovnoměrné plnění kolony. Uzavřete suspenzní náplně a pomalu uvolňujte tlak, aby nedošlo k poškození kolony. Odpojte kolonu od suspenzní náplně a připojte další armaturu ke vstupu a k LC systému, abyste zkontrolovali její výkon.
Byla zkonstruována LC pumpa (10AD Shimadzu, Japonsko), injektor (Valco (USA) C14 W.05) s 50nL injekční smyčkou, membránový odplyňovač (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilární okno, speciální µLC detektor (UV-2075) a mikrokolony se skleněnou výstelkou. Použity byly velmi úzké a krátké spojovací hadičky, aby se minimalizoval vliv rozšíření pásu kolony. Po zabalení byly na výstup 1/16″ redukční spojky instalovány kapiláry (50 μm vnitřek 365) a kapiláry redukční spojky (50 μm). Sběr dat a chromatografické zpracování byly provedeny pomocí softwaru Multichro 2000. Monitorování při 254 nm. Analyty byly testovány na UV absorbanci. Chromatografická data byla analyzována pomocí OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin z lidského séra, lyofilizovaný prášek, ≥ 96 % (elektroforéza na agarózovém gelu) 3 mg smíchaný s trypsinem (1,5 mg), 4,0 M močovinou (1 ml) a 0,2 M hydrogenuhličitanem amonným (1 ml). Roztok byl míchán 10 minut a udržován ve vodní lázni při 37 °C po dobu 6 hodin, poté byl reakce ukončena 1 ml 0,1% TFA. Roztok byl přefiltrován a skladován při teplotě do 4 °C.
Separace peptidových směsí a trypsinových štěpů HSA byla hodnocena samostatně na PMP kolonách. Zkontrolujte separaci peptidové směsi a trypsinového štěpení HSA pomocí PMP kolony a porovnejte výsledky s kolonou Ascentis Express RP-Amide. Teoretický počet plotn se vypočítá následovně:
SEM snímky holých částic oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého s vázanými ligandy jsou znázorněny na obr. 2. SEM snímky holých částic oxidu křemičitého (A, B) ukazují, že na rozdíl od našich předchozích studií jsou tyto částice sférické, tj. protáhlé nebo mají nepravidelnou symetrii. Povrch částic oxidu křemičitého s vázanými ligandy (C, D) je hladší než povrch holých částic oxidu křemičitého, což může být způsobeno povlakem polystyrenových řetězců na povrchu částic oxidu křemičitého.
Snímky holých částic oxidu křemičitého (A, B) a částic oxidu křemičitého s vázanými ligandy (C, D) pořízené rastrovacím elektronovým mikroskopem.
Distribuce velikosti částic holých částic oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého vázaných ligandy je znázorněna na obrázku 3(A). Křivky distribuce velikosti částic na základě objemu ukázaly, že velikost částic oxidu křemičitého se po chemické modifikaci zvětšila (obr. 3A). Data o distribuci velikosti částic oxidu křemičitého ze současné studie a předchozí studie jsou porovnána v tabulce 1(A). Objemová velikost částic PMP, d(0,5), je 3,36 μm, ve srovnání s naší předchozí studií s hodnotou ad(0,5) 3,05 μm (částice oxidu křemičitého vázané na polystyren)34. Tato várka měla užší distribuci velikosti částic ve srovnání s naší předchozí studií kvůli různým poměrům PEG, močoviny, TMOS a kyseliny octové v reakční směsi. Velikost částic fáze PMP je o něco větší než velikost částic fáze oxidu křemičitého vázaného na polystyren, kterou jsme dříve studovali. To znamená, že povrchová funkcionalizace částic oxidu křemičitého styrenem nanesla na povrch oxidu křemičitého pouze vrstvu polystyrenu (0,97 µm), zatímco ve fázi PMP byla tloušťka vrstvy... 1,38 µm.
Distribuce velikosti částic (A) a distribuce velikosti pórů (B) holých částic oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého vázaných na ligandy.
Velikost pórů, objem pórů a povrchová plocha částic oxidu křemičitého v aktuální studii jsou uvedeny v tabulce 1(B). Profily PSD holých částic oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého s vázanými ligandy jsou znázorněny na obrázku 3(B). Výsledky jsou srovnatelné s naší předchozí studií. Velikosti pórů holých a ligandem vázaných částic oxidu křemičitého jsou 310 a 241, což naznačuje, že velikost pórů se po chemické modifikaci zmenšuje o 69, jak je znázorněno v tabulce 1(B), a změna křivky je znázorněna na obr. 3(B). Podobně se objem pórů částic oxidu křemičitého po chemické modifikaci snížil z 0,67 na 0,58 cm3/g. Měrný povrch aktuálně studovaných částic oxidu křemičitého je 116 m2/g, což je srovnatelné s naší předchozí studií (124 m2/g). Jak je znázorněno v tabulce 1(B), povrchová plocha (m2/g) částic oxidu křemičitého se po chemické modifikaci také snížila ze 116 m2/g na 105 m2/g. modifikace.
Výsledky elementární analýzy stacionární fáze jsou uvedeny v tabulce 2. Obsah uhlíku v současné stacionární fázi je 6,35 %, což je méně než obsah uhlíku v naší předchozí studii (částice oxidu křemičitého vázané polystyrenem, 7,93 %35 a 10,21 %)42. Obsah uhlíku v současné stacionární fázi je nízký, protože při přípravě současného SP byly kromě styrenu použity i některé polární ligandy, jako je fenylmaleimid-methylvinylisokyanát (PCMP) a 4-hydroxy-TEMPO. Hmotnostní procento dusíku v současné stacionární fázi je 2,21 %, ve srovnání s 0,1735 a 0,85 hmotnostními % dusíku v předchozích studiích. To znamená, že hmotnostní procento dusíku je v současné stacionární fázi vyšší kvůli fenylmaleimidu. Podobně obsah uhlíku v produktech (4) a (5) byl 2,7 % a 2,9 %, zatímco obsah uhlíku v konečném produktu (6) byl 6,35 %, jak je uvedeno v tabulce 2. Úbytek hmotnosti byl kontrolován pomocí stacionární fáze PMP a křivka TGA je znázorněna na obrázku 4. Křivka TGA ukazuje úbytek hmotnosti 8,6 %, což je v dobré shodě s obsahem uhlíku (6,35 %), protože ligandy obsahují nejen C, ale také N, O a H.
Pro modifikaci povrchu částic oxidu křemičitého byl zvolen ligand fenylmaleimid-methylvinylisokyanát, protože má polární fenylmaleimidové skupiny a vinylisokyanátové skupiny. Vinylisokyanátové skupiny mohou dále reagovat se styrenem živou radikálovou polymerací. Druhým důvodem je vložení skupiny, která má mírnou interakci s analytem a žádnou silnou elektrostatickou interakci mezi analytem a stacionární fází, protože fenylmaleimidová skupina nemá při normálním pH žádný virtuální náboj. Polaritu stacionární fáze lze řídit optimálním množstvím styrenu a reakční dobou radikálové polymerace. Poslední krok reakce (radikálová polymerace) je kritický a může změnit polaritu stacionární fáze. Byla provedena elementární analýza za účelem kontroly obsahu uhlíku v těchto stacionárních fázích. Bylo pozorováno, že zvýšení množství styrenu a reakční doby zvyšuje obsah uhlíku ve stacionární fázi a naopak. SP připravené s různými koncentracemi styrenu mají různý obsah uhlíku. Opět se tyto stacionární fáze naplní do kolon z nerezové oceli a zkontroluje se jejich chromatografický výkon (selektivita, rozlišení, hodnota N, atd.). Na základě těchto experimentů byla vybrána optimalizovaná formulace pro přípravu stacionární fáze PMP, aby byla zajištěna kontrolovaná polarita a dobrá retence analytu.
Pět peptidových směsí (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) bylo také hodnoceno za použití PMP kolony s mobilní fází; 60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1% TFA) při průtoku 80 μl/min. Za optimálních elučních podmínek je teoretický počet pater (N) na kolonu (100 × 1,8 mm vnitřek) 20 000 ± 100 (200 000 pater/m²). Tabulka 3 uvádí hodnoty N pro tři PMP kolony a chromatogramy jsou znázorněny na obrázku 5A. Rychlá analýza na PMP koloně při vysokém průtoku (700 μl/min) ukázala, že během jedné minuty bylo eluováno pět peptidů, hodnoty N byly velmi dobré, 13 500 ± 330 na kolonu (100 × 1,8 mm vnitřek), což odpovídá 135 000 pater/m² (obrázek 5B). Tři identicky velké kolony (100 × 1,8 mm vnitřek) byly naplněny třemi různými šaržemi stacionární fáze PMP pro kontrolu reprodukovatelnosti. Koncentrace analytu pro každou kolonu byla zaznamenána za použití optimálních elučních podmínek a počtu teoretických pater N a retenčního času pro oddělení stejné testované směsi na každé koloně. Data reprodukovatelnosti pro PMP kolony jsou uvedena v tabulce 4. Reprodukovatelnost PMP kolony dobře koreluje s velmi nízkými hodnotami %RSD, jak je uvedeno v tabulce 3.
Separace směsi peptidů na koloně PMP (B) a koloně Ascentis Express RP-Amide (A); mobilní fáze 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), rozměry kolony PMP (100 × 1,8 mm vnitřní průměr); analytické složení. Eluční pořadí sloučenin: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (leucin) kyselina enkefalin).
Kolona PMP (100 × 1,8 mm vnitřek) byla vyhodnocena pro separaci tryptických digescí lidského sérového albuminu ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii. Chromatogram na obrázku 6 ukazuje, že vzorek je dobře separován a rozlišení je velmi dobré. Digesce HSA byly analyzovány s použitím průtoku 100 µl/min, mobilní fáze 70/30 acetonitril/voda a 0,1% TFA. Jak je znázorněno na chromatogramu (obrázek 6), digesce HSA byla rozdělena do 17 píků odpovídajících 17 peptidům. Byla vypočtena separační účinnost každého píku v digesci HSA a hodnoty jsou uvedeny v tabulce 5.
Tryptický digesční produkt HSA (100 × 1,8 mm vnitřek) byl separován na PMP koloně; průtoková rychlost (100 µl/min), mobilní fáze acetonitril/voda 60/40 s 0,1% TFA.
kde L je délka kolony, η je viskozita mobilní fáze, ΔP je protitlak v koloně a u je lineární rychlost mobilní fáze. Permeabilita PMP kolony byla 2,5 × 10⁻¹⁴ m², průtok byl 25 μl/min a byl použit ACN/voda v poměru 60/40 obj./obj. Permeabilita PMP kolony (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) byla podobná permeabilitě z naší předchozí studie Ref. 34. Permeabilita kolony naplněné povrchově porézními částicemi je: 1,7 × 10⁻¹⁴ pro částice o velikosti 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁴ pro částice o velikosti 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁴ a 2,5 × 10⁻¹⁴ m² pro částice o velikosti 2,6 μm pro částice o velikosti 5 μm 43. Permeabilita PMP fáze je proto podobná permeabilitě 5 μm částic s jádrem a obalem.
kde Wx je hmotnost kolony naplněné chloroformem, Wy je hmotnost kolony naplněné methanolem a ρ je hustota rozpouštědla. Hustoty methanolu (ρ = 0,7866) a chloroformu (ρ = 1,484). Celková poréznost kolon SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm vnitřek) 34 a kolon C18-Urea 31, které jsme dříve studovali, byla 0,63 a 0,55. To znamená, že přítomnost ligandů močoviny snižuje propustnost stacionární fáze. Na druhou stranu celková poréznost kolony PMP (100 × 1,8 mm vnitřek) je 0,60. Propustnost kolon PMP je nižší než u kolon naplněných částicemi oxidu křemičitého vázanými C18, protože ve stacionárních fázích typu C18 jsou ligandy C18 připojeny k částicím oxidu křemičitého jako lineární řetězce, zatímco ve stacionárních fázích typu polystyrenu se kolem ní tvoří relativně silná polymerní vrstva. V V typickém experimentu se pórovitost kolony vypočítá jako:
Obrázek 7A,B ukazuje kolonu PMP (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) a kolonu Ascentis Express RP-Amide (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) za stejných elučních podmínek (tj. 60/40 ACN/H2O a 0,1% TFA) van Deemterova diagramu. Vybrané směsi peptidů (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) byly připraveny v objemu 20 µL/min. Minimální průtok pro obě kolony je 800 µL/min. Minimální hodnoty HETP při optimálním průtoku (80 µL/min) pro kolonu PMP a kolonu Ascentis Express RP-Amide byly 2,6 µm a 3,9 µm. Hodnoty HETP naznačují, že separační účinnost kolony PMP (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) je mnohem lepší než u komerčně dostupné kolony Ascentis Express RP-Amide (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm). Van Deemterův graf na obr. 7(A) ukazuje, že pokles hodnoty N se zvyšujícím se průtokem není ve srovnání s naší předchozí studií významný. Vyšší separační účinnost kolony PMP (100 × 1,8 mm)... id) ve srovnání s kolonou Ascentis Express RP-Amide je založen na vylepšeních tvaru a velikosti částic a komplexních postupech plnění kolony použitých v aktuální práci34.
(A) van Deemterův graf (HETP versus lineární rychlost mobilní fáze) získaný za použití kolony PMP (100 × 1,8 mm vnitřek) v 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA. (B) van Deemterův graf (HETP versus lineární rychlost mobilní fáze) získaný za použití kolony Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm vnitřek) v 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA.
Byla připravena a vyhodnocena polární polystyrenová stacionární fáze pro separaci syntetických peptidových směsí a trypsinových štěpení lidského sérového albuminu (HAS) ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii. Chromatografický výkon PMP kolon pro peptidové směsi je vynikající v separační účinnosti a rozlišení. Zlepšený separační výkon PMP kolon je způsoben řadou důvodů, jako je velikost částic a velikost pórů částic oxidu křemičitého, řízená syntéza stacionární fáze a komplexní náplň kolony. Kromě vysoké separační účinnosti je další výhodou této stacionární fáze nízký protitlak v koloně při vysokých průtocích. PMP kolony vykazují dobrou reprodukovatelnost a lze je použít pro analýzu peptidových směsí a trypsinové štěpení různých proteinů. Tuto kolonu máme v úmyslu použít pro separaci přírodních produktů, bioaktivních sloučenin z léčivých rostlin a houbových extraktů v kapalinové chromatografii. V budoucnu budou PMP kolony hodnoceny také pro separaci proteinů a monoklonálních protilátek.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Výzkum systémů pro separaci peptidů pomocí chromatografie s reverzní fází, část I: Vývoj protokolu pro charakterizaci kolony. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. a kol. Vylepšené aktivní peptidy určené pro léčbu infekčních onemocnění. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Syntetické terapeutické peptidy: věda a trh. Objevování léčiv. 15 (1-2) dnes, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Pokročilá proteomická kapalinová chromatografie. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. a kol. Pokročilá kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií umožňuje začlenění široce cílené metabolomiky a proteomiky. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM a Salisbury, JJ Úloha UHPLC ve vývoji léčiv. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Základní a praktické aspekty ultravysokotlaké kapalinové chromatografie pro rychlé separace. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA a Tchelitcheff, P. Aplikace ultravysokoúčinné kapalinové chromatografie ve vývoji léčiv. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. a kol. Monolitické makroporézní hydrogely připravené z emulzí olej ve vodě s vysokým obsahem vnitřní fáze pro účinnou purifikaci enterovirů. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA. Úloha kapalinové chromatografie v proteomice. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. a Guillarme, D. Nové trendy v separaci terapeutických peptidů a proteinů pomocí kapalinové chromatografie s reverzní fází: teorie a aplikace. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvourozměrná separace peptidů za použití systému RP-RP-HPLC s různými hodnotami pH v prvním a druhém separačním rozměru. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. a kol. Byly zkoumány charakteristiky přenosu hmoty a kinetický výkon vysoce účinných chromatografických kolon naplněných plně a povrchově porézními částicemi C18 o velikosti menší než 2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. a kol. Nedávné trendy a analytické výzvy v izolaci, identifikaci a validaci rostlinných bioaktivních peptidů. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB a kol. Proteomická krajina říše života. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. a kol. Následné zpracování terapeutických peptidů preparativní kapalinovou chromatografií. Molecule (Basilej, Švýcarsko) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. a Geng, X. Smíšená chromatografie a její aplikace na biopolymery. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. a Sun, Y. Ligandy pro proteinovou chromatografii ve smíšeném režimu: princip, charakterizace a návrh. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).