Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v prohlížeči Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Abychom zajistili neustálou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel se třemi snímky najednou. Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet tři snímky najednou nebo pomocí posuvníků na konci můžete procházet tři snímky najednou.
Porézní částice oxidu křemičitého byly připraveny sol-gelovou metodou s určitými modifikacemi pro získání částic se širokými póry. Tyto částice byly derivatizovány N-fenylmaleimid-methylvinylisokyanátem (PMI) a styrenem pomocí polymerace s reverzním přenosem řetězce a fragmentací (RAFT) za vzniku polyamidů interkalovaných N-fenylmaleimidem. Stacionární fáze styren (PMP). Úzké kolony z nerezové oceli (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) byly plněny suspenzní náplní. Chromatografický výkon PMP kolony byl hodnocen za účelem separace směsi syntetických peptidů sestávajících z pěti peptidů (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokyselina enkefalin) a tryptického hydrolyzátu lidského sérového albuminu (HAS). Za optimálních elučních podmínek dosáhl teoretický počet destiček se směsí peptidů 280 000 destiček/m². Při porovnání separačního výkonu vyvinuté kolony s komerční kolonou Ascentis Express RP-Amide bylo pozorováno, že separační účinnost kolony PMP byla z hlediska separační účinnosti a rozlišení lepší než u komerční kolony.
Biofarmaceutický průmysl se v posledních letech stal expandujícím globálním trhem s výrazným nárůstem tržního podílu. S explozivním růstem biofarmaceutického průmyslu1,2,3 existuje velká potřeba analýzy peptidů a proteinů. Kromě cílového peptidu se během syntézy peptidů tvoří různé nečistoty, takže k dosažení požadované čistoty peptidu je nutné chromatografické čištění. Analýza a charakterizace proteinů v tělních tekutinách, tkáních a buňkách je extrémně náročný úkol kvůli velkému počtu potenciálně detekovatelných druhů přítomných v jednom vzorku. Ačkoli je hmotnostní spektrometrie účinným nástrojem pro sekvenování peptidů a proteinů, pokud jsou takové vzorky přímo zavedeny do hmotnostního spektrometru, separace bude neuspokojivá. Tento problém lze vyřešit provedením kapalinové chromatografie (LC) před MS analýzou, což sníží množství analytů vstupujících do hmotnostního spektrometru v daném čase4,5,6. Kromě toho se analyty mohou během separace v kapalné fázi koncentrovat v úzké oblasti, čímž se tyto analyty koncentrují a zvyšuje se citlivost MS detekce. Kapalinová chromatografie (LC) se v posledním desetiletí významně vyvinula a stala se široce používanou metodou proteomické analýzy7,8,9,10.
Reverzní fázová kapalinová chromatografie (RP-LC) se široce používá k čištění a separaci směsí peptidů za použití oktadecylem modifikovaného oxidu křemičitého (ODS) jako stacionární fáze11,12,13. Vzhledem ke své komplexní struktuře a amfoterní povaze14,15 však stacionární fáze RP nemohou poskytnout uspokojivou separaci peptidů a proteinů. Analýza peptidů a proteinů s polárními a nepolárními fragmenty proto vyžaduje speciálně navržené stacionární fáze, které by mohly tyto analyty interagovat a zadržet16. Smíšená chromatografie, která nabízí multimodální interakce, může být alternativou k RP-LC pro separaci peptidů, proteinů a dalších komplexních směsí. Bylo připraveno několik stacionárních fází smíšeného typu a kolony naplněné těmito stacionárními fázemi byly použity k separaci peptidů a proteinů17,18,19,20,21. Vzhledem k přítomnosti polárních a nepolárních skupin jsou pro separaci peptidů a proteinů vhodné stacionární fáze smíšeného typu (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polární interkalace/RPLC)22,23,24,25,26,27,28. Polární interkalované stacionární fáze s kovalentně vázanými polárními skupinami vykazují dobré separační schopnosti a jedinečnou selektivitu pro polární a nepolární analyty, protože separace závisí na interakci mezi analytem a stacionární fází. Multimodální interakce 29,30,31,32. Nedávno Zhang a kol. 30 získali behenyl-terminované stacionární fáze polyaminů a úspěšně separovali uhlovodíky, antidepresiva, flavonoidy, nukleosidy, estrogeny a některé další analyty. Polární vložený stacionární materiál má polární i nepolární skupiny, takže jej lze použít k separaci peptidů a proteinů na hydrofobní a hydrofilní části. Polární inline kolony (např. kolony C18 s inline amidovou skupinou) jsou dostupné pod obchodním názvem Ascentis Express RP-Amide columns, ale tyto kolony byly použity pouze pro analýzu aminu 33.
V této studii byla připravena polární zabudovaná stacionární fáze (N-fenylmaleimid, zabudovaný polystyren) a vyhodnocena pro separaci peptidů a tryptické štěpení HSA. Pro přípravu stacionární fáze byla použita následující strategie. Porézní částice oxidu křemičitého byly připraveny podle postupů popsaných v našich předchozích publikacích, s určitými změnami ve schématech přípravy 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Poměry močoviny, polyethylenglykolu (PEG), TMOS a vodného roztoku kyseliny octové byly upraveny tak, aby se získaly částice oxidu křemičitého s velkými póry. Za druhé, byl syntetizován nový ligand fenylmaleimid-methylvinylisokyanátu a jeho derivatizované částice oxidu křemičitého byly použity k přípravě polárně zabudovaných stacionárních fází. Získaná stacionární fáze byla plněna do kolony z nerezové oceli (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) podle optimalizovaného schématu plnění. Plnění kolony je podporováno mechanickými vibracemi, aby byla zajištěna rovnoměrná vrstva uvnitř kolony. Náplňová kolona byla vyhodnocena z hlediska separace směsi peptidů sestávající z pěti peptidů (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalinový peptid) a tryptických hydrolyzátů lidského sérového albuminu (HSA). Bylo pozorováno, že směs peptidů a tryptický štěp HSA se separovaly s dobrým rozlišením a účinností. Separační účinnost kolony PMP byla porovnána s účinností kolony Ascentis Express RP-Amide. Bylo pozorováno, že peptidy a proteiny mají na koloně PMP dobré rozlišení a vysokou separační účinnost a separační účinnost kolony PMP je vyšší než účinnost kolony Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyethylenglykol), močovina, kyselina octová, trimethoxyorthosilikát (TMOS), trimethylchlorsilan (TMCS), trypsin, lidský sérový albumin (HSA), chlorid amonný, močovina, hexamethylmethakryloyldisilazan (HMDS), methakryloylchlorid (MC), styren, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxid (BPO), acetonitril (ACN) pro HPLC, methanol, 2-propanol a aceton. Společnost Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Směs močoviny (8 g), polyethylenglykolu (8 g) a 8 ml 0,01 N kyseliny octové se míchá 10 minut a za chlazení ledem se přidá 24 ml TMOS. Reakční směs se zahřívá 6 hodin při 40 °C a poté 8 hodin při 120 °C v autoklávu z nerezové oceli. Voda se dekantuje a zbytek se suší 12 hodin při 70 °C. Vysušené měkké bloky se hladce rozemele a kalcinují v peci při 550 °C po dobu 12 hodin. Byly připraveny a charakterizovány tři šarže za účelem testování reprodukovatelnosti velikostí částic, velikosti pórů a povrchové plochy.
Polární skupina a stacionární fáze pro polystyrenové řetězce. Postup přípravy je popsán níže.
N-fenylmaleimid (200 mg) a methylvinylisokyanát (100 mg) byly rozpuštěny v bezvodém toluenu a poté bylo do reakční baňky přidáno 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitrilu (AIBN) za účelem získání kopolymeru fenylmaleimidu a methylvinylisokyanátu (PMCP). Směs byla zahřívána při 60 °C po dobu 3 hodin, filtrována a sušena v peci při 40 °C po dobu 3 hodin.
Sušené částice oxidu křemičitého (2 g) byly dispergovány v suchém toluenu (100 ml), míchány a sonikovány po dobu 10 minut v 500ml baňce s kulatým dnem. PMCP (10 mg) byl rozpuštěn v toluenu a po kapkách přidán do reakční baňky pomocí přikapávací nálevky. Směs byla zahřívána pod zpětným chladičem při 100 °C po dobu 8 hodin, zfiltrována, promyta acetonem a sušena při 60 °C po dobu 3 hodin. Poté byly částice oxidu křemičitého spojené s PMCP (100 g) rozpuštěny v toluenu (200 ml) a k tomuto roztoku byl přidán 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) za přítomnosti 100 μl dibutylcíndilaurátu jako katalyzátoru. Směs byla míchána při 50 °C po dobu 8 hodin, zfiltrována a sušena při 50 °C po dobu 3 hodin.
Styren (1 ml), benzoylperoxid BPO (0,5 ml) a částice oxidu křemičitého připojené k TEMPO-PMCP (1,5 g) byly dispergovány v toluenu a propláchnuty dusíkem. Polymerace styrenu byla provedena při 100 °C po dobu 12 hodin. Výsledný produkt byl promyt methanolem a sušen přes noc při 60 °C. Obecné schéma reakce je znázorněno na obr. jedna.
Vzorky byly odplyňovány při teplotě 393 K po dobu 1 hodiny, dokud nebyl dosažen zbytkový tlak nižší než 10–3 Torr. Množství adsorbovaného N2 při relativním tlaku P/P0 = 0,99 bylo použito k určení celkového objemu pórů. Morfologie čistých a ligandem vázaných částic oxidu křemičitého byla zkoumána pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonsko). Suché vzorky (čistý oxid křemičitý a částice oxidu křemičitého vázaného na ligandy) byly umístěny na hliníkové tyče pomocí uhlíkové pásky. Zlato bylo naneseno na vzorek pomocí naprašovacího zařízení Q150T a na vzorek byla nanesena 5 nm silná vrstva Au. To zlepšuje účinnost nízkonapěťového procesu a umožňuje jemné stříkání za studena. Elementární analýza byla provedena pomocí analyzátoru elementárního složení Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Pro získání distribuce velikosti částic byl použit analyzátor velikosti částic Malvern (Worcestershire, Spojené království) Mastersizer 2000. Nepotažené částice oxidu křemičitého a částice oxidu křemičitého vázané na ligandy (každá 5 mg) byly dispergovány v 5 ml isopropanolu, sonikovány po dobu 10 minut, míchány po dobu 5 minut a umístěny na optický stůl Mastersizer. Termogravimetrická analýza se provádí rychlostí 5 °C za minutu v teplotním rozsahu od 30 do 800 °C.
Nerezové kolony s úzkým otvorem a vystlané skelnými vlákny o rozměrech (ID 100 × 1,8 mm) byly plněny metodou plnění suspenzí stejným postupem jako v odkazu 31. Nerezová kolona (s vystlanou skelnými vlákny, ID 100 × 1,8 mm) a výstup obsahující fritu o velikosti 1 µm byly připojeny k balicímu stroji pro suspenzi (Alltech Deerfield, IL, USA). Suspenze stacionární fáze se připraví suspendováním 150 mg stacionární fáze v 1,2 ml methanolu a jejím přivedením do rezervoárové kolony. Jako rozpouštědlo pro suspenzi a kontrolní rozpouštědlo byl použit methanol. Kolonu se naplní tlakovou sekvencí 100 MP po dobu 10 minut, 80 MP po dobu 15 minut a 60 MP po dobu 30 minut. Proces plnění používal dva vibrátory plynové chromatografie (Alltech, Deerfield, IL, USA) pro mechanické vibrace, aby se zajistilo rovnoměrné plnění kolony. Uzavřete balicí zařízení pro suspenzi a pomalu uvolňujte tlak, aby nedošlo k poškození kolony. Kolona byla odpojena od trysky suspenze a k vstupu byla připojena další armatura a připojena k systému LC, aby se otestovala její činnost.
Zakázková MLC byla zkonstruována s použitím LC pumpy (10AD Shimadzu, Japonsko), vzorkovače s 50nL injekční smyčkou (Valco (USA) C14 W.05), membránového odplyňovače (Shimadzu DGU-14A) a UV-VIS kapilárního okénka. Detektorové zařízení (UV-2075) a smaltovaná mikrokolony. Použijte velmi úzké a krátké spojovací trubice, abyste minimalizovali vliv dodatečného rozpínání kolony. Po naplnění kolony nainstalujte kapiláru (50 µm vnitřek 365) na výstup z redukčního spoje 1/16″ a nainstalujte kapiláru (50 µm) redukčního spoje. Sběr dat a zpracování chromatogramu se provádí pomocí softwaru Multichro 2000. Při 254 nm byla UV absorbance analytů sledována na 0. Chromatografická data byla analyzována pomocí OriginPro8 (Northampton, MA).
Lidský sérový albumin, lyofilizovaný prášek, ≥ 96 % (elektroforéza na agarózovém gelu) 3 mg smíchaný s trypsinem (1,5 mg), 4,0 M močovinou (1 ml) a 0,2 M hydrogenuhličitanem amonným (1 ml). Roztok byl míchán po dobu 10 minut a udržován ve vodní lázni při 37 °C po dobu 6 hodin, poté byl rozložen 1 ml 0,1% TFA. Roztok byl přefiltrován a skladován při teplotě do 4 °C.
Separace směsi peptidů a trypticky štěpeného HSA na PMP koloně byla hodnocena samostatně. Zkontrolujte tryptickou hydrolýzu směsi peptidů a HSA oddělených PMP kolonou a porovnejte výsledky s kolonou Ascentis Express RP-Amide. Počet teoretických pater se vypočítá pomocí následující rovnice:
SEM snímky čistých částic oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého vázaných ligandem jsou znázorněny na obrázku 2. SEM snímky čistých částic oxidu křemičitého (A, B) vykazují ve srovnání s našimi předchozími studiemi kulovitý tvar, ve kterém jsou částice protáhlé nebo mají nepravidelnou symetrii. Povrch částic oxidu křemičitého vázaných ligandem (C, D) je hladší než povrch čistých částic oxidu křemičitého, což může být způsobeno polystyrenovými řetězci pokrývajícími povrch částic oxidu křemičitého.
Skenovací elektronové mikrofotografie čistých částic oxidu křemičitého (A, B) a částic oxidu křemičitého vázaných na ligandy (C, D).
Distribuce velikosti částic čistého oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého vázaného na ligandy je znázorněna na obr. 2.3(A). Křivky objemového rozdělení velikosti částic ukázaly, že velikost částic oxidu křemičitého se po chemické modifikaci zvětšila (obr. 3A). Data o rozdělení velikosti částic oxidu křemičitého ze současné studie a předchozí studie jsou porovnána v tabulce 1(A). Objemová velikost částic d(0,5) PMP byla 3,36 µm, ve srovnání s hodnotou ad(0,5) 3,05 µm v naší předchozí studii (částice oxidu křemičitého vázaného na polystyren)34. Vzhledem ke změně poměru PEG, močoviny, TMOS a kyseliny octové v reakční směsi byla distribuce velikosti částic této šarže užší ve srovnání s naší předchozí studií. Velikost částic fáze PMP je o něco větší než velikost částic fáze oxidu křemičitého vázaného na polystyren, kterou jsme studovali dříve. To znamená, že povrchová funkcionalizace částic oxidu křemičitého styrenem vedla k usazení pouze vrstvy polystyrenu (0,97 µm) na povrchu oxidu křemičitého, zatímco ve fázi PMP byla tloušťka vrstvy 1,38 µm.
Distribuce velikosti částic (A) a distribuce velikosti pórů (B) čistých částic oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého s vázanými ligandy.
Velikost pórů, objem pórů a povrchová plocha částic oxidu křemičitého použitých v této studii jsou uvedeny v tabulce 1 (B). Profily PSD čistých částic oxidu křemičitého a částic oxidu křemičitého vázaných ligandy jsou znázorněny na obr. 3 (B). Výsledky byly srovnatelné s naší předchozí studií34. Velikosti pórů čistých a ligandem vázaných částic oxidu křemičitého byly 310 Å a 241 Å, což naznačuje, že po chemické modifikaci se velikost pórů zmenšila o 69 Å, jak je znázorněno v tabulce 1 (B), a křivka posunu je znázorněna na obr. Měrný povrch částic oxidu křemičitého v aktuální studii je 116 m²/g, což je srovnatelné s naší předchozí studií (124 m²/g). Jak je znázorněno v tabulce 1 (B), povrchová plocha (m²/g) částic oxidu křemičitého se po chemické modifikaci také snížila ze 116 m²/g na 105 m²/g.
Výsledky elementární analýzy stacionární fáze jsou uvedeny v tabulce 2. Obsah uhlíku v současné stacionární fázi je 6,35 %, což je méně než v naší předchozí studii (částice oxidu křemičitého spojené s polystyrenem, 7,93 %35 a 10,21 %)42. Obsah uhlíku v současné stacionární fázi je nižší, protože při přípravě SP byly kromě styrenu použity některé polární ligandy, jako je fenylmaleimid-methylvinyl-isokyanát (PCMP) a 4-hydroxy-TEMPO. Hmotnostní procento dusíku v současné stacionární fázi je 2,21 % ve srovnání s 0,1735 a 0,85 % v předchozích studiích42. To znamená, že současná stacionární fáze má vysoké hmotnostní procento dusíku v důsledku fenylmaleimidu. Podobně produkty (4) a (5) mají obsah uhlíku 2,7 %, respektive 2,9 %, zatímco konečný produkt (6) má obsah uhlíku 6,35 %, jak je uvedeno v tabulce 2. Termogravimetrická analýza (TGA) byla použita na stacionární fázi PMP k testování úbytku hmotnosti a křivka TGA je znázorněna na obrázku 4. Křivka TGA ukazuje úbytek hmotnosti 8,6 %, což je v dobré shodě s obsahem uhlíku (6,35 %), protože ligandy obsahují nejen C, ale také N, O a H.
Pro modifikaci povrchu částic oxidu křemičitého byl zvolen ligand fenylmaleimid-methylvinylisokyanát kvůli jeho polárním fenylmaleimidovým a vinylisokyanátovým skupinám. Vinylmaleimidové skupiny mohou dále reagovat se styrenem pomocí živé radikálové polymerace. Druhým důvodem je vložení skupiny, která má mírné interakce s analytem a žádné silné elektrostatické interakce mezi analytem a stacionární fází, protože fenylmaleimidová část nemá při normálním pH žádný virtuální náboj. Polaritu stacionární fáze lze řídit optimálním množstvím styrenu a reakční dobou radikálové polymerace. Poslední krok reakce (radikálová polymerace) je kritický, protože mění polaritu stacionární fáze. Byla provedena elementární analýza za účelem kontroly obsahu uhlíku v těchto stacionárních fázích. Bylo pozorováno, že zvyšování množství styrenu a reakční doby zvyšuje obsah uhlíku ve stacionární fázi a naopak. SP připravené s různými koncentracemi styrenu mají různé množství uhlíku. Podobně byly tyto stacionární fáze umístěny na kolony z nerezové oceli a byly kontrolovány jejich chromatografické vlastnosti (selektivita, rozlišení, hodnota N atd.). Na základě těchto experimentů bylo zvoleno optimalizované složení pro přípravu stacionární fáze PMP, které zajistí kontrolovanou polaritu a dobrou retenci analytu.
Kolona PMP byla také vyhodnocena pro analýzu pěti směsí peptidů (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) s využitím kapacity mobilní fáze 60/40 (v/v) ACN/voda (0,1% TFA) při průtoku 80 µl/min. Za optimálních elučních podmínek (200 000 pater/m²) je počet teoretických pater (N) na kolonu (100 × 1,8 mm) 20 000 ± 100. Hodnoty N pro tři kolony PMP jsou uvedeny v tabulce 3 a chromatogramy jsou znázorněny na obrázku 5A. Rychlá analýza při vysokém průtoku (700 µl/min) na koloně PMP, pět peptidů eluováno během jedné minuty, vynikající hodnota N 13 500 ± 330 na kolonu (průměr 100 x 1,8 mm), což odpovídá 135 000 plotnám/m² (obr. 5B). Tři kolony stejné velikosti (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm) byly naplněny třemi různými šaržemi stacionární fáze PMP pro testování reprodukovatelnosti. Analyty byly pro každou kolonu zaznamenány separací stejné testované směsi na každé koloně za použití optimálních elučních podmínek, počtu teoretických plotn N a retenčního času. Data reprodukovatelnosti pro kolony PMP jsou uvedena v tabulce 4. Reprodukovatelnost kolony PMP dobře korelovala s velmi nízkými hodnotami %RSD, jak je uvedeno v tabulce 3.
Separace směsí peptidů na koloně PMP (B) a koloně Ascentis Express RP-Amide (A), mobilní fáze 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), rozměry kolony PMP (100 x 1,8 mm vnitřní průměr), analýza. Eluční pořadí sloučenin: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (enkefalin kyseliny leukové).
Pro separaci tryptického hydrolyzátu lidského sérového albuminu pomocí HPLC byla vyhodnocena PMP kolona (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm). Chromatogram na obrázku 6 ukazuje, že vzorky jsou dobře separovány s velmi dobrým rozlišením. Roztoky HSA byly analyzovány s průtokem 100 μl/min, mobilní fází acetonitril/voda 70/30 a 0,1% TFA. Štěpení HSA bylo rozděleno do 17 píků, jak je znázorněno na chromatogramu (obr. 6), což odpovídá 17 peptidům. Byly vypočteny separační účinnosti jednotlivých píků z hydrolyzátu HSA a hodnoty jsou uvedeny v tabulce 5.
Tryptické hydrolyzáty HSA byly separovány na koloně PMP (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm), průtok (100 μl/min), mobilní fáze acetonitril/voda 60/40 a 0,1% TFA.
kde L je délka kolony, η je viskozita mobilní fáze, ΔP je protitlak kolony a u je lineární rychlost mobilní fáze. Permeabilita PMP kolony byla 2,5 × 10–14 m2, průtok byl 25 µl/min, byl použit systém ACN/voda v poměru 60/40 obj./obj. Permeabilita PMP kolony (ID 100 × 1,8 mm) byla podobná permeabilitě z naší předchozí studie Ref.34. Permeabilita kolony naplněné povrchově porézními částicemi je 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 pro částice o velikosti 5 µm43. Permeabilita PMP fáze je proto podobná permeabilitě částic s jádrem a obalem o velikosti 5 μm.
kde Wx je hmotnost kolony naplněné chloroformem, Wy je hmotnost kolony naplněné methanolem a ρ je hustota rozpouštědla. Hustota methanolu (ρ = 0,7866) a chloroformu (ρ = 1,484). Celková pórovitost kolony s částicemi oxidu křemičitého-C18 (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm)34 a naší dříve studované kolony C18-močovina31 byla 0,63, respektive 0,55. To znamená, že přítomnost ligandů močoviny snižuje propustnost stacionární fáze. Na druhou stranu celková pórovitost kolony PMP (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) je 0,60. Kolony PMP jsou méně propustné než kolony naplněné částicemi oxidu křemičitého vázanými na C18, protože ve stacionárních fázích typu C18 jsou ligandy C18 připojeny k částicím oxidu křemičitého v lineárních řetězcích, zatímco ve stacionárních fázích typu polystyrenu se kolem částic tvoří relativně silný polymer. vrstva A. V typickém experimentu se pórovitost kolony vypočítá následovně:
Na obr. 7A a B jsou znázorněny Van Deemterovy diagramy pro kolonu PMP (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm) a kolonu Ascentis Express RP-Amide (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm) za stejných elučních podmínek, 60/40 ACN/H2O a 0,1% TFA 20 µl/min až 800 µl/min na obou kolonách. Minimální hodnoty HETP při optimální průtokové rychlosti (80 µl/min) byly 2,6 µm pro kolonu PMP a 3,9 µm pro kolonu Ascentis Express RP-Amide. Hodnoty HETP ukazují, že separační účinnost kolony PMP (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm) je mnohem vyšší než u komerčně dostupné kolony Ascentis Express RP-Amide (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm). Van Deemterův graf na obr. 7(A) ukazuje, že pokles hodnoty N není s rostoucím průtokem významně vyšší ve srovnání s naší předchozí studií. Vyšší separační účinnost kolony PMP (vnitřní průměr 100 × 1,8 mm) ve srovnání s kolonou Ascentis Express RP-Amide je založena na vylepšeném tvaru a velikosti částic a sofistikovaném postupu plnění kolony použitém v současné práci34.
(A) Van Deemterův graf (HETP vs. lineární rychlost mobilní fáze) získaný na koloně PMP (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm) v 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA. (B) Van Deemterův graf (HETP vs. lineární rychlost mobilní fáze) získaný na koloně Ascentis Express RP-Amide (vnitřní průměr 100 x 1,8 mm) v 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA.
Byla připravena a vyhodnocena polární stacionární fáze interkalovaného polystyrenu pro separaci směsi syntetických peptidů a tryptického hydrolyzátu lidského sérového albuminu (HSA) ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii. Chromatografický výkon PMP kolon pro směsi peptidů je vynikající z hlediska separační účinnosti a rozlišení. Zlepšená separační účinnost PMP kolon je způsobena několika důvody, jako je velikost částic oxidu křemičitého a velikost pórů, řízená syntéza stacionárních fází a komplexní výplňové materiály kolony. Kromě vysoké separační účinnosti je další výhodou této stacionární fáze nízký protitlak v koloně při vysokých průtocích. PMP kolony jsou vysoce reprodukovatelné a lze je použít k analýze směsí peptidů a tryptickému štěpení různých proteinů. Tuto kolonu hodláme použít pro separaci bioaktivních sloučenin z přírodních produktů, extraktů léčivých rostlin a hub v kapalinové chromatografii. V budoucnu budou PMP kolony vyhodnoceny také pro separaci proteinů a monoklonálních protilátek.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Zkoumání systémů pro separaci peptidů s reverzní fázovou chromatografií, část I: Vývoj protokolu pro charakterizaci kolony. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Zkoumání systémů pro separaci peptidů s reverzní fázovou chromatografií, část I: Vývoj protokolu pro charakterizaci kolony.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. a Petersson, P. Zkoumání systémů pro separaci peptidů pomocí reverzní fázové chromatografie, část I: Vývoj protokolu pro charakterizaci kolony. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Zkoumání systémů pro separaci peptidů pomocí chromatografie s reverzní fází, část I: Vývoj protokolu pro charakteristiky kolony. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Zkoumání systémů pro separaci peptidů pomocí chromatografie s reverzní fází, část I: Vývoj protokolu pro charakteristiky kolony.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. a Petersson, P. Zkoumání systémů pro separaci peptidů pomocí reverzní fázové chromatografie, část I: Vývoj protokolu pro charakterizaci kolony.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. a kol. Metody pro tvorbu vylepšených aktivních peptidů pro léčbu infekčních onemocnění. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Syntetické terapeutické peptidy: Věda a trh. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Syntetické terapeutické peptidy: Věda a trh.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Chreschatyski M. Syntetické terapeutické peptidy: věda a trh.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Khreschatsky M. Syntetické terapeutické peptidy: věda a trh. Objevování léčiv. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Pokročilá proteomická kapalinová chromatografie. Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Pokročilá proteomická kapalinová chromatografie.Viz F., Smith RD a Shen Yu. Pokročilá proteomická kapalinová chromatografie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Pokročilé složení proteinů 液相色谱。Viz F., Smith RD a Shen Yu. Pokročilá proteomická kapalinová chromatografie.J. Chromatografie. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. a kol. Pokročilá kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií je schopna kombinovat širokou metabolomiku a proteomiku. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM a Salisbury, JJ. Úloha UHPLC ve farmaceutickém vývoji. Chesnut, SM a Salisbury, JJ. Úloha UHPLC ve farmaceutickém vývoji.Chesnut, SM a Salisbury, JJ Úloha UHPLC ve farmaceutickém vývoji.Chesnut, SM a Salisbury, JJ. Úloha UHPLC ve vývoji léčiv. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Základní a praktické aspekty ultravysokotlaké kapalinové chromatografie pro rychlé separace. Wu, N. & Clausen, AM Základní a praktické aspekty ultravysokotlaké kapalinové chromatografie pro rychlé separace.Wu, N. a Clausen, AM Základní a praktické aspekty vysokotlaké kapalinové chromatografie pro rychlou separaci. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Základní a praktické aspekty ultravysokotlaké kapalinové chromatografie pro rychlou separaci.Wu, N. a Clausen, AM Základní a praktické aspekty vysokotlaké kapalinové chromatografie pro rychlou separaci.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Využití ultravýkonné kapalinové chromatografie ve farmaceutickém vývoji. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Využití ultravýkonné kapalinové chromatografie ve farmaceutickém vývoji.Ren, SA a Chelischeff, P. Využití ultravysokoúčinné kapalinové chromatografie ve farmaceutickém vývoji. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA a Tchelitcheff, P.Ren, SA a Chelischeff, P. Aplikace ultravýkonné kapalinové chromatografie ve vývoji léčiv.J. Chromatografie. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. a kol. Monolitický makroporézní hydrogel odvozený z emulze olej ve vodě s vysokým obsahem vnitřní fáze pro účinnou purifikaci enteroviru 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA. Úloha kapalinové chromatografie v proteomice. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA. Úloha kapalinové chromatografie v proteomice.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA. Úloha kapalinové chromatografie v proteomice. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA. Úloha kapalinové chromatografie v proteomice.J. Chromatografie. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nové trendy v separaci terapeutických peptidů a proteinů pomocí kapalinové chromatografie s reverzní fází: Teorie a aplikace. & Guillarme, D. Nové trendy v separaci terapeutických peptidů a proteinů pomocí kapalinové chromatografie s reverzní fází: Teorie a aplikace. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощиоью хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nové trendy v separaci terapeutických peptidů a proteinů pomocí kapalinové chromatografie s reverzní fází: teorie a aplikace. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.a Guillarmé, D. Nové trendy v separaci terapeutických peptidů a proteinů pomocí kapalinové chromatografie s reverzní fází: teorie a aplikace.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvourozměrná separace peptidů za použití systému RP-RP-HPLC s různým pH v prvním a druhém separačním rozměru. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvourozměrná separace peptidů za použití systému RP-RP-HPLC s různým pH v prvním a druhém separačním rozměru.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Dvourozměrná separace peptidů za použití systému RP-RP-HPLC s různým pH v prvním a druhém separačním rozměru.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Dvourozměrná separace peptidů s použitím různých hodnot pH v prvním a druhém separačním rozměru s využitím systému RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. a kol. Studium přenosu hmoty a kinetických charakteristik vysokoúčinných chromatografických kolon naplněných plně porézními a povrchově porézními částicemi C18 menšími než 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. a kol. Nedávné trendy a analytické výzvy v izolaci, identifikaci a validaci rostlinných bioaktivních peptidů. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB a kol. Proteomická krajina říše života. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. a kol. Následná úprava terapeutických peptidů preparativní kapalinovou chromatografií. Molecules (Basilej, Švýcarsko) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. a Geng, X. Smíšená chromatografie a její aplikace na biopolymery. Yang, Y. a Geng, X. Smíšená chromatografie a její aplikace na biopolymery.Yang, Yu. a Geng, X. Smíšená chromatografie a její aplikace na biopolymery. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. a Geng, X. Smíšená chromatografie a její aplikace v biopolymerech.Yang, Yu. a Gene, X. Smíšená chromatografie a její aplikace na biopolymery.J. Chromatografie. A 1218(49), 8813–8825 (2011).