Revoluční nový inline statický míchač byl vyvinut speciálně pro splnění přísných požadavků systémů vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC) a ultravysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC a UHPLC). Špatné míchání dvou nebo více mobilních fází může vést k vyššímu poměru signálu k šumu, což snižuje citlivost. Homogenní statické míchání dvou nebo více kapalin s minimálním vnitřním objemem a fyzikálními rozměry statického míchače představuje nejvyšší standard ideálního statického míchače. Nový statický míchač toho dosahuje použitím nové technologie 3D tisku k vytvoření unikátní 3D struktury, která poskytuje vylepšené hydrodynamické statické míchání s nejvyšším procentuálním snížením základní sinusové vlny na jednotku vnitřního objemu směsi. Použití 1/3 vnitřního objemu konvenčního míchače snižuje základní sinusovou vlnu o 98 %. Míchač se skládá z propojených 3D průtokových kanálů s různými plochami průřezu a délkami dráhy, když kapalina prochází složitými 3D geometriemi. Míchání podél několika klikatých drah proudění v kombinaci s lokální turbulencí a víry vede k míchání na mikro, mezo a makro úrovni. Tento unikátní mixér je navržen s využitím simulací výpočetní dynamiky tekutin (CFD). Prezentovaná testovací data ukazují, že vynikajícího míchání je dosaženo s minimálním vnitřním objemem.
Kapalinová chromatografie se již více než 30 let používá v mnoha odvětvích, včetně farmaceutického průmyslu, pesticidů, ochrany životního prostředí, forenzní vědy a chemické analýzy. Schopnost měřit s přesností na ppm nebo méně je klíčová pro technologický rozvoj v jakémkoli odvětví. Nízká účinnost míchání vede ke špatnému poměru signálu k šumu, což je pro chromatografickou komunitu nepříjemné z hlediska detekčních limitů a citlivosti. Při míchání dvou HPLC rozpouštědel je někdy nutné vynutit míchání externími prostředky, aby se obě rozpouštědla homogenizovala, protože některá rozpouštědla se dobře nemíchají. Pokud nejsou rozpouštědla důkladně promíchána, může dojít k degradaci HPLC chromatogramu, která se projeví nadměrným základním šumem a/nebo špatným tvarem píku. Při špatném míchání se základní šum v průběhu času jeví jako sinusová vlna (stoupající a klesající) signálu detektoru. Zároveň může špatné míchání vést k rozšíření a asymetrickým píkům, což snižuje analytický výkon, tvar píku a rozlišení píku. Průmysl si uvědomuje, že in-line a T-dílné statické míchačky jsou prostředkem ke zlepšení těchto limitů a umožňují uživatelům dosáhnout nižších detekčních limitů (citlivosti). Ideální statický míchač kombinuje výhody vysoké účinnosti míchání, nízkého mrtvého objemu a nízké tlakové ztráty s minimálním objemem a maximální propustností systému. Kromě toho, s rostoucí složitostí analýzy musí analytici běžně používat polárnější a obtížně mísitelné rozpouštědla. To znamená, že lepší míchání je pro budoucí testování nezbytné, což dále zvyšuje potřebu lepšího designu a výkonu míchače.
Společnost Mott nedávno vyvinula novou řadu patentovaných inline statických míchaček PerfectPeak™ se třemi vnitřními objemy: 30 µl, 60 µl a 90 µl. Tyto velikosti pokrývají rozsah objemů a charakteristik míchání potřebných pro většinu HPLC testů, kde je vyžadováno lepší míchání a nízká disperze. Všechny tři modely mají průměr 0,5″ a poskytují špičkový výkon v kompaktním provedení. Jsou vyrobeny z nerezové oceli 316L, pasivované pro inertnost, ale k dispozici je také titan a další korozivzdorné a chemicky inertní kovové slitiny. Tyto míchačky mají maximální provozní tlak až 20 000 psi. Na obr. 1a je fotografie statického míchače Mott o objemu 60 µl, který je navržen tak, aby poskytoval maximální účinnost míchání při použití menšího vnitřního objemu než standardní míchačky tohoto typu. Tato nová konstrukce statického míchače využívá novou technologii aditivní výroby k vytvoření unikátní 3D struktury, která využívá menší vnitřní tok než jakýkoli míchač v současnosti používaný v chromatografickém průmyslu k dosažení statického míchání. Takové míchačky se skládají z propojených trojrozměrných průtokových kanálů s různými plochami průřezu a různými délkami dráhy, jak kapalina prochází složitými geometrickými bariérami uvnitř. Na obr. 1b je znázorněno schéma nového míchačky, která využívá standardní průmyslové kompresní fitinky HPLC se závitem 10-32 pro vstup a výstup a má modré okraje patentovaného vnitřního míchacího portu. Různé plochy průřezů vnitřních průtokových drah a změny směru proudění ve vnitřním objemu proudění vytvářejí oblasti turbulentního a laminárního proudění, což způsobuje míchání na mikro, mezo a makro úrovni. Konstrukce této unikátní míchačky využívala simulace výpočetní dynamiky tekutin (CFD) k analýze vzorců proudění a zdokonalení návrhu před vytvořením prototypu pro interní analytické testování a hodnocení zákazníkem v terénu. Aditivní výroba je proces tisku 3D geometrických komponentů přímo z CAD výkresů bez nutnosti tradičního obrábění (frézky, soustruhy atd.). Tyto nové statické míchačky jsou navrženy pro výrobu pomocí tohoto procesu, kdy je těleso míchačky vytvořeno z CAD výkresů a díly jsou vyráběny (tištěny) vrstvu po vrstvě pomocí aditivní výroby. Zde se nanese vrstva kovového prášku o tloušťce asi 20 mikronů a počítačem řízený laser selektivně roztaví a spojí prášek do pevné formy. Na tuto vrstvu se nanese další vrstva a provede se laserové spékání. Tento postup se opakuje, dokud není díl zcela hotový. Prášek se poté z dílu, který není spojen laserem, odstraní, čímž vznikne 3D tištěný díl, který odpovídá původnímu CAD výkresu. Konečný produkt je do jisté míry podobný mikrofluidnímu procesu, s hlavním rozdílem v tom, že mikrofluidní komponenty jsou obvykle dvourozměrné (ploché), zatímco pomocí aditivní výroby lze vytvářet složité vzory proudění v trojrozměrné geometrii. Tyto kohoutky jsou v současné době k dispozici jako 3D tištěné díly z nerezové oceli 316L a titanu. Většinu kovových slitin, polymerů a některých keramických materiálů lze použít k výrobě komponentů touto metodou a budou zvažovány v budoucích návrzích/produktech.
Rýže. 1. Fotografie (a) a diagram (b) 90μl Mottova statického mixéru znázorňující průřez dráhou proudění kapaliny mixéru, vyznačený modře.
Spuštění výpočetních simulací dynamiky tekutin (CFD) výkonu statického míchače během fáze návrhu pomůže vyvinout efektivní návrhy a snížit časově náročné a nákladné experimenty metodou pokus-omyl. CFD simulace statických míchačů a standardního potrubí (simulace bez míchače) pomocí softwarového balíčku COMSOL Multiphysics. Modelování pomocí tlakově řízené laminární mechaniky tekutin pro pochopení rychlosti a tlaku tekutiny v součásti. Tato dynamika tekutin v kombinaci s chemickým transportem sloučenin mobilní fáze pomáhá pochopit míchání dvou různých koncentrovaných kapalin. Model je studován jako funkce času, rovnající se 10 sekundám, pro snazší výpočet při hledání srovnatelných řešení. Teoretická data byla získána v časově korelované studii s použitím nástroje pro projekci bodové sondy, kde byl pro sběr dat vybrán bod uprostřed výstupu. CFD model a experimentální testy používaly dvě různá rozpouštědla prostřednictvím proporcionálního vzorkovacího ventilu a čerpacího systému, což vedlo k náhradní zátce pro každé rozpouštědlo ve vzorkovacím potrubí. Tato rozpouštědla se poté smíchají ve statickém míchači. Obrázky 2 a 3 znázorňují simulace proudění standardním potrubím (bez míchače) a statickým míchačem Mott. Simulace byla provedena na rovné trubce o délce 5 cm a vnitřním průměru 0,25 mm, aby se demonstroval koncept střídavého vpouštění vody a čistého acetonitrilu do trubek bez statického míchadla, jak je znázorněno na obrázku 2. Simulace použila přesné rozměry trubek a míchadel a průtok 0,3 ml/min.
Rýže. 2. Simulace proudění CFD v 5cm zkumavce s vnitřním průměrem 0,25 mm pro znázornění děje v HPLC zkumavce, tj. bez míchadla. Plně červená barva představuje hmotnostní podíl vody. Modrá představuje absenci vody, tj. čistý acetonitril. Mezi střídavými zátkami dvou různých kapalin lze pozorovat difuzní oblasti.
Rýže. 3. Statický mixér o objemu 30 ml, modelovaný v softwarovém balíku COMSOL CFD. Legenda představuje hmotnostní podíl vody v mixéru. Čistá voda je zobrazena červeně a čistý acetonitril modře. Změna hmotnostního podílu simulované vody je znázorněna změnou barvy směsi dvou kapalin.
Na obr. 4 je znázorněna validační studie korelačního modelu mezi účinností míchání a objemem míchání. S rostoucím objemem míchání se zvyšuje i účinnost míchání. Podle znalostí autorů nelze v tomto CFD modelu zohlednit další komplexní fyzikální síly působící uvnitř míchačky, což má za následek vyšší účinnost míchání v experimentálních testech. Experimentální účinnost míchání byla měřena jako procentuální snížení základní sinusoidy. Zvýšený protitlak navíc obvykle vede k vyšším úrovním míchání, které se v simulaci nezohledňují.
Následující podmínky HPLC a testovací nastavení byly použity k měření surových sinusových vln za účelem porovnání relativního výkonu různých statických míchačů. Diagram na obrázku 5 znázorňuje typické uspořádání systému HPLC/UHPLC. Statický míchač byl testován umístěním míchače přímo za pumpu a před injektor a separační kolonu. Většina měření sinusového pozadí se provádí obcházením injektoru a kapilární kolony mezi statickým míchačem a UV detektorem. Při vyhodnocování poměru signálu k šumu a/nebo analýze tvaru píku je konfigurace systému znázorněna na obrázku 5.
Obrázek 4. Graf účinnosti míchání v závislosti na objemu míchání pro řadu statických míchaček. Teoretické nečistoty sledují stejný trend jako experimentální data o nečistotách, což potvrzuje platnost CFD simulací.
Pro tento test byl použit HPLC systém Agilent řady 1100 s UV detektorem řízeným počítačem se softwarem Chemstation. Tabulka 1 ukazuje typické podmínky ladění pro měření účinnosti míchačky monitorováním základních sinusoid ve dvou případových studiích. Experimentální testy byly provedeny na dvou různých příkladech rozpouštědel. Dvě rozpouštědla smíchaná v případě 1 byla rozpouštědlo A (20 mM octan amonný v deionizované vodě) a rozpouštědlo B (80 % acetonitril (ACN) / 20 % deionizovaná voda). V případě 2 bylo rozpouštědlem A roztok 0,05 % acetonu (označení) v deionizované vodě. Rozpouštědlo B je směs 80/20 % methanolu a vody. V případě 1 bylo čerpadlo nastaveno na průtok 0,25 ml/min až 1,0 ml/min a v případě 2 bylo čerpadlo nastaveno na konstantní průtok 1 ml/min. V obou případech byl poměr směsi rozpouštědel A a B 20 % A/80 % B. Detektor byl v případě 1 nastaven na 220 nm a maximální absorpce acetonu v případě 2 byla nastavena na vlnovou délku 265 nm.
Tabulka 1. Konfigurace HPLC pro případy 1 a 2 Případ 1 Případ 2 Rychlost čerpadla ​​0,25 ml/min až 1,0 ml/min 1,0 ml/min Rozpouštědlo A 20 mM octan amonný v deionizované vodě 0,05 % aceton v deionizované vodě Rozpouštědlo B 80 % acetonitril (ACN) / 20 % deionizovaná voda 80 % methanol / 20 % deionizovaná voda Poměr rozpouštědel 20 % A / 80 % B 20 % A / 80 % B Detektor 220 nm 265 nm
Rýže. 6. Grafy smíšených sinusových vln naměřených před a po aplikaci dolnopropustného filtru k odstranění složek driftu základní linie signálu.
Obrázek 6 je typickým příkladem smíšeného základního šumu v Případě 1, znázorněného jako opakující se sinusový vzor superponovaný na drift základní linie. Drift základní linie je pomalé zvyšování nebo snižování signálu pozadí. Pokud se systému neponechá dostatečně dlouho k vyrovnání, obvykle klesne, ale bude se driftovat nepravidelně, i když je systém zcela stabilní. Tento drift základní linie má tendenci se zvyšovat, když systém pracuje ve strmém gradientu nebo podmínkách vysokého protitlaku. Pokud je tento drift základní linie přítomen, může být obtížné porovnávat výsledky mezi vzorky, což lze překonat aplikací dolnoprůchodového filtru na nezpracovaná data, který tyto nízkofrekvenční variace odfiltruje, čímž se získá graf oscilace s plochou základní linií. Na obr. Obrázek 6 také ukazuje graf základního šumu směšovače po aplikaci dolnoprůchodového filtru.
Po dokončení CFD simulací a počátečního experimentálního testování byly následně vyvinuty tři samostatné statické míchačky s použitím výše popsaných vnitřních komponent se třemi vnitřními objemy: 30 µl, 60 µl a 90 µl. Tento rozsah pokrývá rozsah objemů a výkonu míchání požadovaný pro aplikace HPLC s nízkým obsahem analytu, kde je vyžadováno vylepšené míchání a nízká disperze pro dosažení základních linií s nízkou amplitudou. Na obr. 7 jsou znázorněna základní měření sinusových vln získaná na testovacím systému z příkladu 1 (acetonitril a octan amonný jako stopovače) se třemi objemy statických míchaček a bez instalovaných míchaček. Experimentální testovací podmínky pro výsledky uvedené na obrázku 7 byly udržovány konstantní po celou dobu všech 4 testů podle postupu popsaného v tabulce 1 při průtoku rozpouštědla 0,5 ml/min. Na datové sady se aplikuje hodnota offsetu tak, aby mohly být zobrazeny vedle sebe bez překrývání signálů. Offset neovlivňuje amplitudu signálu použitého k posouzení úrovně výkonu míchačky. Průměrná sinusová amplituda bez směšovače byla 0,221 mAi, zatímco amplitudy statických Mottových směšovačů při 30 µl, 60 µl a 90 µl klesly na 0,077, 0,017 a 0,004 mAi.
Obrázek 7. Offset signálu HPLC UV detektoru vs. čas pro případ 1 (acetonitril s indikátorem octanem amonným) ukazující míchání rozpouštědla bez míchačky, 30 µl, 60 µl a 90 µl Mott míchačky vykazující zlepšené míchání (nižší amplituda signálu) se zvyšujícím se objemem statického míchačky. (offsety skutečných dat: 0,13 (bez míchačky), 0,32, 0,4, 0,45 mA pro lepší zobrazení).
Data uvedená na obr. 8 jsou stejná jako na obr. 7, ale tentokrát zahrnují výsledky tří běžně používaných statických míchaček HPLC s vnitřními objemy 50 µl, 150 µl a 250 µl. Obrázek 8. Graf závislosti posunu signálu UV detektoru HPLC na čase pro případ 1 (acetonitril a octan amonný jako indikátory) znázorňující míchání rozpouštědla bez statického míchače, nové řady statických míchaček Mott a tří konvenčních míchaček (skutečný posun dat je 0,1 (bez míchačky), 0,32, 0,48, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 mA pro lepší efekt zobrazení). Procentuální snížení základní sinusové vlny se vypočítá jako poměr amplitudy sinusové vlny k amplitudě bez instalovaného míchače. Naměřená procenta útlumu sinusové vlny pro případy 1 a 2 jsou uvedena v tabulce 2 spolu s vnitřními objemy nového statického míchače a sedmi standardních míchaček běžně používaných v průmyslu. Data na obrázcích 8 a 9, stejně jako výpočty uvedené v tabulce 2, ukazují, že statický mixér Mott dokáže zajistit útlum sinusové vlny až 98,1 %, což za těchto testovacích podmínek výrazně překračuje výkon konvenčního HPLC mixéru. Obrázek 9. Graf offsetu signálu HPLC UV detektoru v závislosti na čase pro případ 2 (methanol a aceton jako stopovače) zobrazující žádný statický mixér (kombinovaný), novou řadu statických mixérů Mott a dva konvenční mixéry (skutečné offsety dat jsou 0, 11 (bez mixéru), 0,22, 0,3, 0,35 mA a pro lepší zobrazení). Bylo také hodnoceno sedm mixérů běžně používaných v průmyslu. Patří mezi ně mixéry se třemi různými vnitřními objemy od společnosti A (označené jako mixér A1, A2 a A3) a společnosti B (označené jako mixér B1, B2 a B3). Společnost C jmenovitě hodnotila pouze jednu velikost.
Tabulka 2. Charakteristiky míchání statického míchače a vnitřní objem Případ 1 statického míchače Sinusová výtěžnost: Test s acetonitrilem (účinnost) Případ 2 Sinusová výtěžnost: Test s methanolem a vodou (účinnost) Vnitřní objem (µl) Bez míchače – - 0 Mott 30 65 % 67,2 % 30 Mott 60 92,2 % 91,3 % 60 Mott 90 98,1 % 97,5 % 90 Míchač A1 66,4 % 73,7 % 50 Míchač A2 89,8 % 91,6 % 150 Míchač A3 92,2 % 94,5 % 250 Míchač B1 44,8 % 45,7 % 9 35 Míchač B2 845 % 96,2 % 370 Míchač C 97,2 % 97,4 % 250
Analýza výsledků na obrázku 8 a v tabulce 2 ukazuje, že 30 µl Mottův statický mixér má stejnou účinnost míchání jako mixér A1, tj. 50 µl, nicméně 30 µl Mott má o 30 % menší vnitřní objem. Při porovnání 60 µl Mottova mixéru s 150 µl vnitřním objemem A2 došlo k mírnému zlepšení účinnosti míchání o 92 % oproti 89 %, ale co je důležitější, této vyšší úrovně míchání bylo dosaženo při 1/3 objemu mixéru. Výkon 90 µl Mottova mixéru sledoval stejný trend jako mixér A3 s vnitřním objemem 250 µl. Zlepšení výkonu míchání o 98 % a 92 % bylo pozorováno také při 3násobném snížení vnitřního objemu. Podobné výsledky a srovnání byly získány pro míchačky B a C. Výsledkem je, že nová řada statických míchaček Mott PerfectPeak™ poskytuje vyšší účinnost míchání než srovnatelné konkurenční míchačky, ale s menším vnitřním objemem, což poskytuje lepší šum pozadí a lepší poměr signálu k šumu, lepší citlivost analytu, tvar píku a rozlišení píku. Podobné trendy v účinnosti míchání byly pozorovány v obou studiích, Případ 1 i Případ 2. V Případ 2 byly provedeny testy s použitím (methanolu a acetonu jako indikátorů) k porovnání účinnosti míchání 60ml míchačky Mott, srovnatelného míchačky A1 (vnitřní objem 50 µl) a srovnatelného míchačky B1 (vnitřní objem 35 µl). Výkon bez instalované míchačky byl slabý, ale byla použita pro základní analýzu. 60ml míchačka Mott se ukázala jako nejlepší míchačka v testované skupině a poskytla 90% zvýšení účinnosti míchání. Srovnatelná míchačka A1 zaznamenala 75% zlepšení účinnosti míchání, následované 45% zlepšením srovnatelné míchačky B1. Základní test redukce sinusové vlny s průtokem byl proveden na sérii míchaček za stejných podmínek jako test sinusové křivky v případě 1, přičemž se měnil pouze průtok. Data ukázala, že v rozsahu průtoků od 0,25 do 1 ml/min zůstal počáteční pokles sinusové vlny relativně konstantní pro všechny tři objemy míchaček. U dvou míchaček s menším objemem dochází k mírnému nárůstu sinusové kontrakce s klesajícím průtokem, což se očekává v důsledku prodloužené doby zdržení rozpouštědla v míchačce, což umožňuje zvýšené difuzní míchání. Očekává se, že odečet sinusové vlny se bude s dalším snižováním průtoku zvyšovat. U největšího objemu míchačky s nejvyšším základním útlumem sinusové vlny však základní útlum sinusové vlny zůstal prakticky nezměněn (v rozsahu experimentální nejistoty) s hodnotami v rozmezí od 95 % do 98 %. 10. Základní útlum sinusové vlny v závislosti na průtoku v případě 1. Test byl proveden za podmínek podobných sinusovému testu s proměnným průtokem, vstřikováním 80 % směsi acetonitrilu a vody v poměru 80/20 a 20 % 20 mM octanu amonného.
Nově vyvinutá řada patentovaných inline statických míchaček PerfectPeak™ se třemi vnitřními objemy: 30 µl, 60 µl a 90 µl pokrývá rozsah objemu a výkonu míchání požadovaný pro většinu HPLC analýz vyžadujících vylepšené míchání a nízké disperzní podlahy. Nový statický míchač toho dosahuje využitím nové technologie 3D tisku, která vytváří unikátní 3D strukturu, jež poskytuje vylepšené hydrodynamické statické míchání s nejvyšším procentuálním snížením základního šumu na jednotku objemu vnitřní směsi. Použití 1/3 vnitřního objemu konvenčního míchače snižuje základní šum o 98 %. Takové míchačky se skládají z propojených trojrozměrných průtokových kanálů s různými plochami průřezu a různými délkami dráhy, kdy kapalina prochází složitými geometrickými bariérami uvnitř. Nová řada statických míchaček poskytuje oproti konkurenčním míchačům lepší výkon, ale s menším vnitřním objemem, což má za následek lepší poměr signálu k šumu a nižší kvantifikační limity, stejně jako vylepšený tvar píku, účinnost a rozlišení pro vyšší citlivost.
V tomto vydání Chromatografie – Ekologicky šetrná RP-HPLC – Využití chromatografie s jádrem a pláštěm k nahrazení acetonitrilu isopropanolem v analýze a čištění – Nový plynový chromatograf pro…
Business Center International Labmate Limited Oak Court Sandridge Park, Porters Wood St Albans Hertfordshire AL3 6PH Spojené království