Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) je luštěnina používaná k produkci potravin a ke zlepšení půdy.Globální rozšíření NLL jako plodiny přilákalo mnoho patogenních hub, včetně antraknózy vlčího bobu, která způsobuje ničivé antraknózové onemocnění.Při šlechtění NLL byly použity dvě alely, Lanr1 a AnMan, které propůjčují zvýšenou rezistenci, ale základní molekulární mechanismy zůstávají neznámé.V této studii byly markery Lanr1 a AnMan použity ke screeningu evropských vzorků NLL.Testování vakcíny v kontrolovaném prostředí potvrdilo účinnost obou rezistentních dárců.Na reprezentativních rezistentních a citlivých liniích bylo provedeno profilování diferenciální genové exprese.Rezistence na antraknózu byla spojena s nadměrnou expresí termínů genové ontologie „GO:0006952 obranná reakce“, „GO:0055114 Redox Process“ a „GO:0015979 Fotosyntéza“.Kromě toho linie Lanr1(83A:476) vykazovala významné přeprogramování transkriptomu rychle po inokulaci, zatímco ostatní linie vykazovaly zpoždění v této odpovědi asi o 42 hodin.Obranné reakce jsou spojeny s geny TIR-NBS, CC-NBS-LRR a NBS-LRR, 10 proteiny zapojenými do patogeneze, proteiny přenosu lipidů, endoglukan-1,3-β-glukosidázou, proteiny buněčné stěny bohaté na glycin a geny z reaktivní dráhy kyslíku.Časné reakce na 83A:476, včetně pečlivého potlačení genů spojených s fotosyntézou, se shodovaly s úspěšnou ochranou během vegetativní růstové fáze houbové biologie, což naznačuje, že efektor spouští imunitu.Mandeloopova reakce je zpomalena, stejně jako celkový horizontální odpor.
Lupina úzkolistá (NLL, Lupinus angustifolius L.) je obilnina s vysokým obsahem bílkovin pocházející z oblasti západního Středomoří1,2.V současnosti se pěstuje jako potravina pro zvířata i lidi.Je také považováno za zelené hnojení v systémech střídání plodin kvůli fixaci dusíku symbiotickými bakteriemi fixujícími dusík a celkovému zlepšení struktury půdy.NLL prošla v minulém století rychlým procesem domestikace a je stále pod vysokým chovatelským tlakem3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.S rozšířeným pěstováním NLL, posloupnost patogenních hub vytvořila nové zemědělské výklenky a způsobila nové choroby ničící plodiny. Nejpozoruhodnější pro chovatele a chovatele lupiny byl výskyt antraknózy způsobené patogenní houbou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Nejpozoruhodnější pro chovatele a chovatele lupiny byl výskyt antraknózy způsobené patogenní houbou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров a селекционеров примечательным для фермеров a селекционеров люпина было появленкованопонтантрание огенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Nejpozoruhodnější pro chovatele a chovatele lupiny byl výskyt antraknózy způsobené patogenní houbou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是rich矔煗嘟Bon) enberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是rich矔煗嘟Bondar嵵Vlasy。1 Наиболее поразительным для фермеров a селекционеров люпина является зоявенониова патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Nejpozoruhodnější pro chovatele a chovatele lupiny je výskyt antraknózy způsobený patogenní houbou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Nejčasnější zprávy o nemoci pocházejí z Brazílie a Spojených států, typické příznaky se objevily v roce 1912 a 1929.Po asi 30 letech však byl patogen označen jako Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v cílené morfologii. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .a H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。a H. Schlenk, .Předběžná fenotypizace onemocnění provedená v polovině 20. století ukázala určitou rezistenci u přírůstků NLL a žluté lupiny (L. luteus L.), ale všechny testované přírůstky bílé lupiny (L. albus L.) byly vysoce citlivé15,16.Studie ukázaly, že rozvoj antraknózy je spojen se zvýšenými srážkami (vlhkost vzduchu) a teplotou (v rozmezí 12-28°C), což vede k narušení odolnosti při vyšších teplotách17, 18. Ve skutečnosti byla doba potřebná pro vyklíčení konidií a propuknutí nemoci čtyřikrát kratší při 24°C (4 hodiny) než při 16 hodinách (12°C).Pokračující globální oteplování tedy vedlo k šíření antraknózy.Toto onemocnění však bylo pozorováno ve Francii (1982) a na Ukrajině (1983) jako předzvěst blížící se hrozby, ale bylo zjevně ignorováno tehdejším průmyslem lupiny20,21.O několik let později se tato ničivá nemoc rozšířila do celého světa a zasáhla také hlavní země produkující lupinu, jako je Austrálie, Polsko a Německo22,23,24.Po vypuknutí antraknózy v polovině 90. let vedl rozsáhlý screening k identifikaci několika rezistentních dárců ve vzorcích NLL19.NLL odolnost vůči antraknóze je kontrolována dvěma samostatnými dominantními alelami nacházejícími se v různých zdrojích zárodečné plazmy: Lanr1 v kultivaru Tanjil a Wonga a AnMan v kultivaru.Mandalay 25, 26. Tyto alely doplňují molekulární markery, které podporují selekci rezistentní zárodečné plazmy ve šlechtitelských programech25,26,27,28,29,30.Rezistentní šlechtitelská linie 83A:476 nesoucí alelu Lanr1 byla zkřížena s citlivou divokou linií P27255, aby se získala populace RIL segregující na rezistenci na antraknózu, což umožnilo přiřadit lokus Lanr1 k chromozomu NLL-1131, 32, 33. Zarovnání genů rezistence z mapového rámce na vazbu alinkoracthnos odhalili umístění všech tří alel na stejném chromozomu (NLL-11), ale v různých pozicích29,34,35.Vzhledem k malému počtu RIL a velké genetické vzdálenosti mezi markery a odpovídajícími alelami však nelze vyvodit žádné spolehlivé závěry o jejich základních genech.Na druhou stranu je použití reverzní genetiky u lupiny obtížné kvůli jejich velmi nízkému regeneračnímu potenciálu, což činí genetickou manipulaci těžkopádnou37.
Vývoj domestikované zárodečné plazmy nesoucí požadovanou alelu v homozygotním stavu, jako je 83A:476 (Lanr1) a Mandelup (AnMan), otevřel dveře ke studiu rezistence na antraknózu tváří v tvář přítomnosti protichůdných kombinací alel v divokých populacích.Možnosti molekulárních mechanismů.Porovnejte obranné reakce generované specifickými genotypy.Tato studie hodnotila časnou transkriptomovou odpověď NLL na očkování proti C. lupini.Nejprve byl testován evropský panel zárodečné plazmy NLL obsahující 215 linií pomocí molekulárních markerů, které označují alely Lanr1 a AnMan.Fenotypizace antraknózy pak byla provedena na 50 liniích NLL, předem vybraných pro molekulární markery, za kontrolovaných podmínek.Na základě těchto experimentů byly vybrány čtyři linie lišící se rezistencí na antraknózu a alelickým složením Lanr1/AnMan pro profilování diferenciální obranné genové exprese pomocí dvou komplementárních přístupů: vysoce výkonné sekvenování RNA a kvantifikace PCR v reálném čase.
Screening sady zárodečné plazmy NLL (N = 215) s markery Lanr1 (Anseq3 a Anseq4) a AnMan (Anseq4) a AnMan (AnManM1) ukázal, že pouze jedna linie (95726, poblíž Salamanca-b) amplifikuje alelu „rezistence“ pro všechny nalezené markery u všech markerů 1 všech 8 „Preceptuálních“ markerů 1 . (~73,5 %) řádků.Třináct linií produkovalo dvě „odolné“ alely markeru Lanr1 a 8 linií produkovalo „odolné“ alely Lanr1.popisovač.Alela „rezistence“ markeru AnMan (doplňková tabulka S1).Dvě linie byly heterozygotní pro marker Anseq3 a jedna heterozygotní pro marker AnManM1.42 linií (19,5 %) neslo opačné fáze alel Anseq3 a Anseq4, což ukazuje na vysokou frekvenci rekombinací mezi těmito dvěma lokusy.Fenotypy antraknózy za kontrolovaných podmínek (doplňková tabulka S2) odhalily variabilitu v rezistenci testovaných genotypů, která se odrazila v závažnosti antraknózy.Rozdíly v průměrném skóre se pohybovaly od 1,8 (středně rezistentní) do 6,9 (citlivé) a rozdíly v hmotnosti rostlin se pohybovaly od 0,62 (citlivé) do 4,45 g (rezistentní). Mezi hodnotami pozorovanými ve dvou opakováních experimentu byla signifikantní korelace (0,51 pro skóre závažnosti onemocnění, P = 0,00017 a 0,61 pro hmotnost rostliny, P < 0,0001) a také mezi těmito dvěma parametry (− 0,59 a – 0,77, P < 0,0001). Mezi hodnotami pozorovanými ve dvou opakováních experimentu byla signifikantní korelace (0,51 pro skóre závažnosti onemocnění, P = 0,00017 a 0,61 pro hmotnost rostliny, P < 0,0001) a také mezi těmito dvěma parametry (− 0,59 a – 0,77, P < 0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двутроярновеми а (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 a 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а тудута мя параметрами (-0,59 a -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Významná korelace byla nalezena mezi hodnotami pozorovanými ve dvou opakováních experimentu (0,51 pro skóre závažnosti onemocnění, P = 0,00017 a 0,61 pro hmotnost rostliny, P < 0,0001), jakož i mezi těmito dvěma parametry (- 0,59 a -0,77, P < 0,0001) 1 ).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评 01.01.2017 丼P.物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P < 0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 识 严重 程度 识1 ， p = 0,00017 ， 植 物 为 为 0,61 ， p < 0,0001 ） 以及 两 个 参数 之间 （，0.5.5.5和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемымия в Іотоятвыми ка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 a масса растения 0,61, P <0,0001, 9рамежду этивемия a -0,0001) 0,77, P <0,0001. Mezi hodnotami pozorovanými ve dvojím provedení (skóre závažnosti onemocnění 0,51, P = 0,00017 a hmotnost rostliny 0,61, P < 0,0001) a mezi těmito dvěma parametry (-0,59 a -0,0001) 0,77, P<0,0001 byla signifikantní korelace. ).Typické příznaky pozorované u náchylných rostlin zahrnují zalomení a zkroucení stonku připomínající strukturu „pastýřského luku“, následované oválnými lézemi s oranžovými/růžovými sporozoity (doplňkový obrázek 1).Australské přírůstky nesoucí geny Lanr1 (83A:476 a Tanjil) a AnMan (Mandelup) jsou středně odolné, 0,0331 a 0,0036).Některé linie, které také nesou „odolné“ alely Lanr1 a/nebo AnMan, vykazují příznaky onemocnění.
Je zajímavé, že několik linií NLL, které postrádaly jakoukoli „rezistentní“ markerovou alelu, odhalilo vysokou úroveň rezistence na antraknózu (srovnatelnou nebo vyšší než u genotypů Lanr1 nebo AnMan), jako je Boregine (hodnota P < 0,0001 pro oba parametry), Bojar (hodnota P < 0,0001 pro skóre a 0,001 pro skóre rostliny < 04b/01 hodnota pro hmotnost rostlin) a populaci <09/07. důležité pro váhu). Je zajímavé, že několik linií NLL, které postrádaly jakoukoli „rezistentní“ markerovou alelu, odhalilo vysokou úroveň rezistence na antraknózu (srovnatelnou nebo vyšší než u genotypů Lanr1 nebo AnMan), jako je Boregine (hodnota P < 0,0001 pro oba parametry), Bojar (hodnota P < 0,0001 pro skóre a 0,001 pro skóre rostliny < 04b/01 hodnota pro hmotnost rostlin) a populaci <09/07. důležité pro váhu). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерногого аркерного алибо уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для гвенакикипопования для для генакикипой значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 параметров параметров) яции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Zajímavé je, že několik linií NLL postrádajících jakoukoli „rezistentní“ markerovou alelu vykazovalo vysokou úroveň rezistence vůči antraknóze (srovnatelnou nebo vyšší než u genotypů Lanr1 nebo AnMan), jako je Boregine (hodnota P < 0,0001 pro oba parametry), Bojar (hodnota P < 0,0001 pro hodnocení a 0,001 pro hodnocení hmotnosti rostlin <0b a 0,001 B-5 a 0909). významné pro váhu).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭怊平的炭性平的炭性基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）鉈倁Bojar（P 值<得分为挏驩驩两0. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Je zajímavé, že některé systémy NLL, které nemají žádné „antigenní“ markery, vykazují vysokou horizontální rezistenci (ekvivalentní genům Lanr1 nebo AnMan nebo vyšší), např. Boregine (oba parametry P < 0,0001), Bojar (hodnota P < 0,0001, hmotnost rostliny 0,001) a kmen B-549/709b, hmotnost P < nevýznamná. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллеклей «резистенитностова» ни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие какахене (золхене (золчене) араметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) a популяция B-549/79b (оцаченка1, оцаченка1 незначительна). Je zajímavé, že některé linie NLL, které postrádaly jakékoli markerové alely „rezistence“, vykazovaly vysoké úrovně rezistence na antraknózu (srovnatelné nebo vyšší než genotypy Lanr1 nebo AnMan), jako například Boregine (hodnota P pro oba parametry <0,0001), Bojar (hodnota P < 0,0001, hmotnost rostliny 0,07/059) a populace 0,01 B-04P9 hmotnost není podstatná).Tento fenomén naznačuje možnost nového genetického zdroje rezistence, což vysvětluje pozorovaný nedostatek korelace mezi markerovými genotypy a fenotypy onemocnění (hodnoty P od ~0,42 do ~0,98).Kolmogorov-Smirnovův test tedy ukázal, že údaje o odolnosti proti antraknóze byly přibližně normálně rozděleny pro skóre (P-hodnoty 0,25 a 0,11) a rostlinnou hmotu (P-hodnoty 0,47 a 0,55), což naznačuje, že předpokládám, že se jedná o více alel než Lanr1 a AnMan.
Na základě výsledků screeningu rezistence na antraknózu byly pro analýzu transkriptomu vybrány 4 linie: 83A:476, Boregine, Mandelup a populace 22660. Tyto linie byly znovu testovány na odolnost proti antraxu v inokulačních experimentech pomocí sekvenování RNA za předpokladu, že byly stejné jako v předchozím testu.Hodnoty skóre byly následující: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) a populace 22 660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 dosáhl v průměru 40,5 párů Mread na vzorek (29,7 až 54,4 Mreadů) (doplňková tabulka S3).Skóre zarovnání v referenční sekvenci se pohybovalo od 75,5 % do 88,6 %.Průměrná korelace načtených dat počtu mezi experimentálními variantami mezi biologickými replikáty se pohybovala od 0,812 do 0,997 (průměr 0,959). Z 35 170 analyzovaných genů 2 917 neodhalilo žádnou expresi a dalších 4 785 genů bylo exprimováno na zanedbatelné úrovni (základní průměr < 5). Z 35 170 analyzovaných genů 2 917 neodhalilo žádnou expresi a dalších 4 785 genů bylo exprimováno na zanedbatelné úrovni (základní průměr < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, остальные 4785 проявляли на незначительном уровне (базовое среднее <5). Z 35 170 analyzovaných genů nevykazovalo 2917 žádnou expresi a zbývajících 4785 genů bylo exprimováno na zanedbatelné úrovni (základní průměr <5).在分析的35 170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表表表塬刳以懼表可以忽表达，其他4785值<5）.35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, остальные 4785 игелиненова экспрессию (базовое среднее значение <5). Z 35 170 analyzovaných genů nebylo 2917 exprimováno a zbývajících 4785 genů mělo zanedbatelnou expresi (základní průměr <5).Počet genů považovaných za exprimované (základní průměr ≥ 5) během experimentu byl tedy 27 468 (78,1 %) (doplňková tabulka S4).
Od prvního časového bodu všechny linie NLL reagovaly na inokulaci C. lupini (kmen Col-08) přeprogramováním transkriptomu (tabulka 1), mezi liniemi však byly pozorovány významné rozdíly.Linie rezistence 83A:476 (nesoucí gen Lanr1) tedy vykazovala významné přeprogramování transkriptomu v prvním časovém bodě (6 hpi) s 31-69násobným zvýšením počtu izolovaných up- a down-genů ve srovnání s jinými časovými body v tomto časovém bodě.Kromě toho byl tento vrchol krátkodobý, protože exprese pouze několika genů zůstala významně změněna ve druhém časovém bodě (12 hpi).Zajímavé je, že Boregine, který také v testu štěpu vykazoval vysokou úroveň rezistence, neprošel během experimentu tak masivním transkripčním přeprogramováním.Počet odlišně exprimovaných genů (DEG) byl však stejný pro Boregine a 83A:476 při 12 HPI.Jak Mandelup, tak populace 22660 vykazovaly vrcholy DEG v posledním časovém bodě (48 l/s), což ukazuje na relativní zpoždění v obranných reakcích.
Protože 83A:476 prošla masivním přeprogramováním transkriptomu v reakci na C. lupini při 6 HPI ve srovnání se všemi ostatními liniemi, ~91 % DEG pozorovaných v tomto časovém bodě bylo liniově specifických (obr. 1).Mezi linií studie však došlo k určitému překrývání časných odpovědí, protože 68,5 %, 50,9 % a 52,6 % DEG v Boregine, Mandelup a populaci 22660, v daném pořadí, se v určitých časových bodech překrývalo s těmi, které byly nalezeny v 83A:476.Tyto stupně však tvořily pouze malý zlomek (0,97–1,70 %) všech stupňů aktuálně detekovaných pomocí 83A:476.Kromě toho bylo v tuto chvíli 11 stupňů ze všech linií koherentních (doplňkové tabulky S4-S6), včetně společných složek obranných odpovědí rostlin: protein přenosu lipidů (TanjilG_32225), endoglukan-1,3-β-glukosidový enzym (TanjilG_23384), dva proteiny indukující stres (TanjilG_23384) a proteiny podobné stresu S31AM52215T 31), základní latexový protein (TanjilG_32352) a dva proteiny strukturální buněčné stěny bohaté na glycin (TanjilG_19701 a TanjilG_19702).Došlo také k relativně vysokému překrytí v transkriptomových odpovědích mezi 83A:476 a Boregine při 24 HPI (celkem 16-38 % DEG) a mezi Mandelupem a populací 22660 při 48 HPI (celkem 14-20 % DEG).
Vennův diagram ukazující počet odlišně exprimovaných genů (DEG) v liniích úzkolisté lupiny (NLL) inokulovaných Colletotrichum lupini (kmen Col-08 získaný z lupinových polí ve Wierzhenicích, Polsko, 1999).Analyzované linie NLL byly: 83A:476 (rezistentní, nesoucí alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí alelu AnMan) a populace 22660 (velmi citlivá).Zkratka hpi znamená hodiny po očkování.Pro zjednodušení grafu byly odstraněny nulové hodnoty.
Sada nadměrně exprimovaných genů při 6 hpi byla analyzována na přítomnost kanonických R genových domén (doplňková tabulka S7).Tato studie odhalila transkriptomovou indukci klasických genů rezistence vůči onemocnění s doménami NBS-LRR pouze v 83A:476.Tato sada se skládala z jednoho genu TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), pěti genů CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 a tanjilg_161BS-LR), a Tanjilg_161BS-LR, a Tan61BS-LR, a 161BS-LR jilg_16162) stejně jako čtyři NBS-Lrr (tanjilg_16162) a čtyři NBS-LRR (TANJILG_16162).Všechny tyto geny mají kanonické domény uspořádané v konzervovaných sekvencích.Kromě genů domény NBS-LRR bylo aktivováno několik RLL kináz při 6 hpi, konkrétně jedna v Boregine (TanjilG_19877), dvě v Mandelup (TanjilG_07141 a TanjilG_19877) a v populaci 22 660 (TanjilG_079014 a dvě 238014 a Tan26016 .
Geny s významně změněnou expresí v reakci na inokulaci C. lupini (kmen Col-08) byly podrobeny analýze obohacení genové ontologie (GO) (doplňková tabulka S8). Nejčastěji nadměrně zastoupeným termínem biologického procesu byl „GO:0006952 obranná odpověď“, který se vyskytoval v 6 ze 16 kombinací (čas × linie) s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2). Nejčastěji nadměrně zastoupeným termínem biologického procesu byl „GO:0006952 obranná odpověď“, který se vyskytoval v 6 ze 16 kombinací (čas × linie) s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического проценный «броцесса б0096 ет», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значиморзернчначимост. 2). Nejčastěji nadměrně zastoupeným termínem biologického procesu byl „GO:0006952 obranná odpověď“, který se objevil v 6 ze 16 kombinací (čas × linie) s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Nejreprezentativnějším termínem biologického procesu je „GO:0006952 obranná reakce“, který se objevuje v 6 ze 16 (时间×线) kombinací s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процестроческого процестроческого процестроческого процестроце б009 «Obrana: Odpověď: 0006 появлялся в 6 из 16 комбинаций (время × линия) s высокой значий значимостью (значение 1 P. Nejčastěji nadměrně zastoupeným termínem biologického procesu byl „GO:0006952 Defense Response“, který se vyskytoval v 6 ze 16 kombinací (čas × linie) s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2).Tento termín byl nadměrně zastoupen ve dvou časových bodech v 83A: 476 a Boregine (6 a 24 hpi) a v jednom časovém bodě v Mandelup a populaci 22660 (12 a 6 hpi, v tomto pořadí).Toto je očekávaný výsledek, který zdůrazňuje antifungální odpověď rezistentních linií.Kromě toho 83A:476 reagoval na C. lupini rychlou indukcí genů souvisejících s oxidačním vzplanutím reprezentovaným termínem „GO:0055114 redox proces“, což naznačuje specifickou obrannou reakci, zatímco Boregine odhalil specifické obranné reakce související s termínem „GO“.:0006950 Stresová reakce“.Populace 22660 aktivovala odpověď horizontální rezistence zahrnující sekundární metabolity, zdůrazňující nadměrný počet termínů „GO:0016104 Proces biosyntézy triterpenů“ a „GO:0006722 Proces metabolismu triterpenů“ (oba termíny patří do stejné sady genů), s přihlédnutím k výsledkům reakce GO termínu, 226 reakce na přídavek a časné obohacování reakce mezi Boregem8, Mandel Indel. 3A:476 (6 hpi) a zpožděná reakce Mandelup a populace 22660 zahrnují termín GO:0015979 'fotosyntéza' a další související biologické procesy.
Termíny bioprocesní genové ontologie vybrané v anotaci odlišně exprimovaných genů během transkriptomových odpovědí lupiny úzkolisté (NLL) inokulované lupinou antraxovou (kmen Col-08 získaný z lupinových polí ve Wierzhenicích v Polsku v roce 1999) jsou značně přehnané.Analyzované linie NLL byly: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, neznámé genetické pozadí), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a populace 22660 (citlivá).
Protože tato studie měla za cíl identifikovat geny, které přispívají k rezistenci na antraknózu, byly geny přiřazené k výrazům GO „GO: 0006952 obranné reakce“ a „GO: 0055114 Redoxní procesy“ analyzovány s hraničními hodnotami, protože výchozí hodnota znamená ≥ 30 s alespoň jednou linií.× bod v čase kombinující statisticky významné hodnoty log2 (násobná změna).Počet genů splňujících tato kritéria byl 65 pro GO:0006952 a 524 pro GO:0055114.
83A:476 odhalila dva DEG píky označené termínem GO:0006952, první při 6 genech na palec (64 genů, regulace nahoru a dolů) a druhý na 24 genů na palec (15 genů, pouze regulace nahoru).Boregine také ukázal, že GO:0006952 dosáhl vrcholu ve stejném časovém bodě, ale s menším stupněm (11 a 8) a preferenční aktivací.Mandeloop ukázal dva vrcholy GO:0006952 při 12 a 48 HPI, oba nesly 12 genů (první s aktivačními geny a druhý s pouze supresivními geny), zatímco populace 22660 při 6 HPI (13 genů) měla větší převahu vrcholu zvýšení.nařízení.Je třeba poznamenat, že 96,4 % GO:0006952 DEG v těchto vrcholech mělo stejný typ odpovědi (nahoru nebo dolů), což ukazuje na významné překrývání obranných odpovědí navzdory rozdílům v počtu zapojených genů.Největší skupina sekvencí souvisejících s termínem GO:0006952 kóduje Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), který patří do proteinového kladu proteinu spojeného s patogenezí (PR-10) třídy 10 a latexu jádrového proteinu.podobný (MLP-like) protein) protein (obr. 3).Obě skupiny se lišily povahou výrazu a směrem reakce.Geny kódující proteiny podobné SAM22 vykazovaly konzistentní a významnou indukci v časných bodech (6 nebo 12 hpi) a na konci experimentu obecně nereagovaly (48 hpi), zatímco proteiny podobné MLP vykazovaly koordinaci při 6 hpi.hpi.83A:476 a Mandelup při 48 hp/in, téměř všechny ostatní datové body nereagovaly.Kromě toho rozdíly v profilech exprese genů pro proteiny podobné SAM22 sledovaly pozorovanou variabilitu v rezistenci na antraknózu, protože odolnější linie měly více časových bodů významně indukujících tyto geny než více náchylné geny.Další gen PR-10 podobný L1R18A/B vykazoval velmi podobný vzor exprese jako gen pro protein podobný SAM22.
Byly identifikovány hlavní složky termínu biologického procesu „GO:0006952 Defense Response“ a expresní vzory kandidátních genů alel Lanr1 a AnMan.Stupnice Log2 představuje hodnoty log2 (násobek změny) mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z polí s lupinou, Wizhenica, Polsko, 1999) a kontrolními (falešně naočkovanými) rostlinami ve stejném časovém bodě.Byly analyzovány následující úzkolisté linie lupiny: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a populace 22660 (citlivá).
Kromě toho byly hodnoceny expresní profily RNA-seq kandidátních genů Lanr1 (TanjilG_05042) a AnMan (TanjilG_12861) (obr. 3).Gen TanjilG_05042 vykazoval významnou odezvu (aktivaci) na 83A:476 pouze v prvním časovém bodě (6 hpi), zatímco TanjilG_12861 byl významný v Mandeloop pouze ve dvou časových bodech: 6 hpi (dolní regulace) a 24 hpi (6 hpi).S.).nastavitelné)).
Nejvíce overexprimovanými geny v termínu GO:0055114 „redox proces“ byly geny kódující proteiny cytochromu P450 a peroxidázu (obr. 4).U vzorků izolovaných z 83A:476 při 6 HPI byly obecně pozorovány maximální nebo minimální hodnoty log2 (násobná změna) (pro 86,6 % genů) mezi inokulovanými a kontrolními rostlinami, což zvýrazňuje vysokou reakci tohoto genotypu na inokulované pohlaví.83A:476 ukázaly nejvýznamnější GO: 0055114° při 6 hpi (503 genů), zatímco zbytek linií při 48 hpi (Boregine, 31 genů; Mandelup, 85 genů; a populace 22660, 78 genů)).U většiny genů rodiny GO:0055114 byly pozorovány dva typy odpovědí na očkování (aktivace a inhibice).Zajímavé je, že až 97,6 % DEG identifikovaných pro termín GO: 0055114 v Mandelupe při 48 hp Tato pozorování naznačují, že navzdory výrazně menšímu měřítku (tj. počet mutovaných redoxních genů, 85 oproti 503) je vzorec opožděných transkriptomových odpovědí mandelupe:37 podobný anthracu 6.8.V Boregine a populaci 22660 je tato konvergence nižší na 51,6 % a 75,6 %.
Byly odhaleny vzorce exprese hlavních složek termínu biologického procesu „GO:0055114 Redox proces“.Stupnice Log2 představuje hodnoty log2 (násobek změny) mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z polí s lupinou, Wizhenica, Polsko, 1999) a kontrolními (falešně naočkovanými) rostlinami ve stejném časovém bodě.Byly analyzovány následující úzkolisté linie lupiny: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a populace 22660 (citlivá).
83A:476 Transkriptomické reakce na inokulaci C. lupini (kmen Col-08) také zahrnovaly koordinované umlčení genů přisuzovaných termínu GO:0015979 „fotosyntéza“ a další související biologické procesy (OBR. 5).Tato sada GO:0015979 DEG obsahovala 105 genů, které byly významně potlačeny při 6 hpi při 83A:476.V této podskupině bylo 37 genů také downregulováno v Mandelup při 48 HPI a 35 ve stejném časovém bodě v populaci 22 660, včetně 19 stupňů společných pro oba genotypy.Žádné stupně související s termínem GO: 0015979 nebyly významně aktivovány v jakékoli kombinaci (řádek x čas).
Byly odhaleny vzorce exprese hlavních složek termínu biologického procesu „GO:0015979 Fotosyntéza“.Stupnice Log2 představuje hodnoty log2 (násobek změny) mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z polí s lupinou, Wizhenica, Polsko, 1999) a kontrolními (falešně naočkovanými) rostlinami ve stejném časovém bodě.Byly analyzovány následující úzkolisté linie lupiny: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a populace 22660 (citlivá).
Na základě výsledků analýzy diferenciální exprese a pravděpodobně zapojených do obranných odpovědí proti patogenním houbám byla tato sada sedmi genů vybrána pro kvantifikaci profilů exprese pomocí PCR v reálném čase (doplňková tabulka S9).
Předpokládaný proteinový gen TanjilG_10657 byl významně indukován ve všech studovaných liniích a časových bodech ve srovnání s kontrolními (mimickými) rostlinami (doplňkové tabulky S10, S11).Kromě toho expresní profil TanjilG_10657 vykazoval rostoucí trend v průběhu experimentu pro všechny linie.Populace 22660 vykazovala nejvyšší citlivost TanjilG_10657 k inokulaci se 114násobnou aktivací a nejvyšší relativní hladinou exprese (4,4 ± 0,4) při 24 HPI (obr. 6a).Gen proteinu PR10 L1R18A TanjilG_27015 také vykazoval aktivaci napříč všemi liniemi a časovými body, se statistickou významností ve většině datových bodů (obr. 6b).Podobně jako u TanjilG_10657 byla nejvyšší relativní hladina exprese TanjilG_27015 pozorována u 22660 naočkované populace při 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gen kyselé endochitinázy TanjilG_04706 byl významně upregulován ve všech liniích a ve všech časových bodech kromě Boregine 6 hpi (obr. 6c).Byl silně indukován v prvním časovém bodě (6 HPI) při 83A:476 (10,5krát) a mírně zvýšený v ostatních liniích (6,6-7,5krát).Během experimentu zůstala exprese TanjilG_04706 na podobných úrovních u 83A:476 a Boregine, zatímco u Mandelup a populace 22660 se výrazně zvýšila a dosáhla relativně vysokých hodnot (5,9 ± 1,5 a 6,2 ± 1,5).Endoglukan-1,3-β-glukosidase-like gen TanjilG_23384 vykazoval vysokou aktivaci v prvních dvou časových bodech (6 a 12 hpi) ve všech liniích kromě populace 22660 (obr. 6d).Nejvyšší relativní hladiny exprese TanjilG_23384 byly pozorovány ve druhém časovém bodě (12 hpi) v Mandelup (2,7 ± 0,3) a 83A:476 (1,5 ± 0,1).Při 24 HPI byla exprese TanjilG_23384 relativně nízká ve všech studovaných liniích (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Expresní profily vybraných genů (ag) odhalené pomocí kvantitativní PCR.Čísla 6, 12 a 24 představují hodiny po očkování.Geny LanDExH7 a LanTUB6 byly použity pro normalizaci a LanTUB6 byl použit pro mezisériovou kalibraci.Chybové úsečky představují standardní odchylku na základě tří biologických replikátů, z nichž každý je průměrem tří technických replikátů. Statistická významnost rozdílů v hladinách exprese mezi naočkovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný v roce 1999 z pole s lupinou ve Wierzenici, Polsko) a kontrolními (falešně naočkovanými) rostlinami jsou vyznačeny nad datovými body (*P hodnota < 0,05, **P hodnota ≤ 0,01, ***0,01, ***P hodnota). Statistická významnost rozdílů v hladinách exprese mezi naočkovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný v roce 1999 z pole s lupinou ve Wierzenici, Polsko) a kontrolními (falešně naočkovanými) rostlinami jsou vyznačeny nad datovými body (*P hodnota < 0,05, **P hodnota ≤ 0,01, ***0,01, ***P hodnota). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулалировантнымим получен v roce 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) a контрольными (ложно ирововенуки) мечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,00). Statisticky významné rozdíly v hladinách exprese mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný v roce 1999 z pole s lupinou ve Wierzhenice, Polsko) a kontrolními (falešně naočkovanými) rostlinami jsou zaznamenány nad datovými body (*P hodnota < 0,05, **P-hodnota ≤ 0.*** P≤ 0,01,01,01).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）璌对照．败模拾扼日模拾扼水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 000.₉)P 000.₉接种 （colletotrichum lupini ， barva-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 之 紉 橍 紸水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤1)も. Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrich,мполтотричими) ченный с полей люпина в Верженице, Польша, v roce 1999 г.) a контрольлными (ложно) иронтиронокуне тмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение,001 ≤). Statisticky významné rozdíly v hladinách exprese mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získanými z polí vlčího bobu ve Verzhenicích, Polsko, v roce 1999) a kontrolními (falešně naočkovanými) rostlinami jsou zaznamenány nad datovými body (*P hodnota < 0,05, **P-hodnota ≤ 0.*** P≤ 0,01,01,01).Analyzované linie NLL byly: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan), Boregine (rezistentní, neznámé genetické pozadí) a populace 22660 (citlivá).
Kandidátní gen TanjilG_05042 v lokusu Lanr1 vykazoval výrazně odlišný expresní profil od profilů získaných ze studií RNA-seq (obr. 6e).Významná aktivace tohoto genu byla pozorována u Mandelup a populace 22660 (až 39,7krát, respektive 11,7krát), což vedlo k relativně vysokým hladinám exprese (až 1,4 ± 0,14 a 7,2 ± 1,3, v tomto pořadí).83A:476 také odhalila určitou upregulaci genu TanjilG_05042 (až 3,8krát), avšak dosažené relativní úrovně exprese (0,044 ± 0,002) byly více než 30krát nižší než ty pozorované u Mandelup a populace 22660.analyzované pomocí qPCR prokázaly významné rozdíly v hladinách exprese mezi genotypy u falešně vakcinovaných (kontrolních) variant, dosáhly 58násobného rozdílu mezi populacemi 22660 a 83A:476, stejně jako mezi populacemi 22660 a 22660. Mezi Boregine a Mandalup bylo dosaženo dvojnásobného rozdílu.
Kandidátní gen v lokusu AnMan, TanjilG_12861, byl aktivován v reakci na vakcinaci v 83A:476 a Mandelup, byl neutrální v populaci 22660 a byl downregulován v Boregine (obr. 6f).Relativní exprese genu TanjilG_12861 byla nejvyšší u inokulovaných 83A: 476 (0,14±0,01).Gen proteinu tepelného šoku třídy I o velikosti 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 vykazoval nižší relativní hladiny exprese ve všech studovaných kmenech a časových bodech (obr. 6g).Nejvyšší hodnota byla pozorována při 24 HPI v populaci 22 660 (0,14 ± 0,02, osminásobné zvýšení v reakci na očkování).
Srovnání profilů genové exprese (obr. 7) odhalilo vysokou korelaci mezi TanjilG_10657 a čtyřmi dalšími geny: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,809) a TanjilG_05042 (r = 0,809) a TanjilG_0507 (r = 0,809).Takové výsledky mohou naznačovat koregulaci těchto genů během obranných reakcí.Geny TanjilG_12861 a TanjilG_23384 vykazovaly odlišné profily exprese s nižšími hodnotami Pearsonova korelačního koeficientu (od 0,08 do 0,43 a -0,19 až 0,28) ve srovnání s jinými geny.
Korelace mezi profily genové exprese byly detekovány pomocí kvantitativní PCR.Byly analyzovány následující úzkolisté linie lupiny: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé) a populace 22660 (citlivá).Byly vypočteny tři časové body (6, 12 a 24 hodin po inokulaci), včetně inokulovaných (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z lupinových polí ve Wierzhenice, Polsko, v roce 1999) a kontrolních (falešně inokulovaných) rostlin.Stupnice ukazuje hodnotu Pearsonova korelačního koeficientu.
Na základě údajů získaných při 6 koňských silách na palec byla WGCNA provedena na 9981° identifikovaných porovnáním naočkovaných a kontrolních rostlin se zaměřením na včasné obranné reakce (doplňková tabulka S12).Bylo nalezeno 22 genových modulů (shluků) s korelovanými (pozitivními nebo negativními) expresními profily mezi genotypy a experimentálními variantami. V průměru hladiny genové exprese klesaly v pořadí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (u obou variant byl však tento trend silnější u kontrolních rostlin). V průměru hladiny genové exprese klesaly v pořadí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (u obou variant byl však tento trend silnější u kontrolních rostlin). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (в ововатиа, овобатиа, ововата эта тенденция была сильнее у контрольныh растений). V průměru hladiny genové exprese klesaly v pořadí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (u obou variant byl však tento trend silnější u kontrolních rostlin).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 的顺序下降（然而，在两缌在两缌在两缌在两缌在两缌在两缌在两缌在两缌在两缧在两缧在两秧在两秧在两缧在两缧在两稧平按83A:476在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populace 22 660 的 顺序 下降 （Ｇ 在 缈， 在 缈Ｇ在 植物 中 更）。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (однатовахва енденция была сильнее у контрольных растений). V průměru se hladiny genové exprese snížily v sérii 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (avšak u obou variant byl tento trend silnější u kontrolních rostlin).Očkování mělo za následek upregulaci genové exprese, zejména v modulech 18, 19, 14, 6 a 1 (v sestupném pořadí účinku), negativní regulaci (např. moduly 9 a 20) nebo s neutrálními účinky (např. moduly 11, 22, 8 a 13).Analýza obohacení Go Termín (doplňková tabulka S13) odhalila „GO: 0006952 Ochranné odpovědi“ pro inokulovaný modul (18) s maximální aktivací, včetně genů analyzovaných qPCR (tanjilg_04706, tanjilg_23384, tanjilg_10657 a nejvíce inokulací (nejvíce inokulací), a také inoculated fhotosym. .Koncentrátor modulu 18 (obr. 8) byl identifikován jako gen TanjilG_26536 kódující protein L1R18B podobný PR-10 a koncentrátor modulu 9 byl identifikován jako gen TanjilG_28955 kódující protein PsbQ fotosystému II.Kandidátní gen rezistence na anthraknózu Lanr1, TanjilG_05042, byl nalezen v modulu 22 (obr. 9) a je spojen s termíny „GO:0044260 Buněčné makromolekulární metabolické procesy“ a „GO:0006355 Transkripční regulace, šablona DNA“ nesoucí TanjilG_01212 hub.gen kóduje transkripční faktor tepelného stresu A-4a (HSFA4a).
Vážená síťová analýza genové koexprese modulů s nadměrně zastoupenými termíny biologického procesu „GO: 0006952 obranné reakce“.Ligace byla zjednodušena, aby se zvýraznily čtyři geny analyzované pomocí qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 a TanjilG_27015).
Vážená síťová analýza genové koexprese modulu s nadměrně zastoupeným termínem biologického procesu „GO: 0006355: Regulace transkripce, DNA templátování“ a nesoucí kandidátní gen rezistence na anthraknózu Lanr1 TanjilG_05042.Ligace byla zjednodušena, aby se izoloval gen TanjilG_05042 a centrální gen TanjilG_01212.
Screening rezistence na antraknózu shromážděný v Austrálii ukázal, že většina dříve uvolněných kultivarů byla citlivá;Kalya, Coromup a Mandelup byly popsány jako středně odolné, zatímco Wonga, Tanjil a 83A:476 byly popsány jako vysoce odolné26,27,31.měl stejnou alelu odolnosti, označenou Lanr1, a Coromup a Mandelup měli jinou alelu, označenou AnMan10, 26, 39, zatímco Kalya předala jinou alelu., Lanr2.Screening rezistence na antraknózu v Německu vedl k identifikaci rezistentní linie Bo7212 s kandidátskou alelou jinou než Lanr1, označenou LanrBo36.
Naše studie odhalila velmi nízkou frekvenci (asi 6 %) alely Lanr1 v testované zárodečné plazmě.Toto pozorování je v souladu s výsledky screeningu východoevropské zárodečné plazmy pomocí markerů Anseq3 a Anseq4, které ukázaly, že alela Lanr1 je přítomna pouze ve dvou běloruských liniích.To naznačuje, že alela Lanr1 zatím není široce využívána místními šlechtitelskými programy, na rozdíl od Austrálie, kde je jednou z klíčových alel pro šlechtění za pomoci markerů.To může být způsobeno nižší úrovní rezistence, kterou poskytuje alela Lanr1 v evropských polních podmínkách ve srovnání s australskou zprávou.Kromě toho studie antraknózy v oblastech s vysokými srážkami v Austrálii ukázaly, že reakce rezistence zprostředkované alelou Lanr1 nemusí být účinné za povětrnostních podmínek, které podporují růst a rychlý vývoj patogenu19,42.Ve skutečnosti byly v této studii některé příznaky antraknózy také pozorovány u genotypů nesoucích alelu Lanr1, což naznačuje, že rezistence může vymizet za optimálních podmínek pro vývoj C. lupini.Kromě toho jsou možné falešně pozitivní interpretace přítomnosti markerů Anseq3 a Anseq4, které jsou přibližně 1 cM od lokusu Lanr128,30,43.
Naše studie ukázala, že 83A:476 nesoucí alelu Lanr1 reagoval na inokulaci C. lupini rozsáhlým přeprogramováním transkriptomu v prvním analyzovaném časovém bodě (6 hpi), zatímco u Mandelup, nesoucího alelu AnMan, byly transkriptomické reakce pozorovány mnohem později.(od 24 do 48 hp).Tyto časové variace v obranných reakcích jsou spojeny s rozdíly v příznacích onemocnění, což zdůrazňuje důležitost včasného rozpoznání patogenu pro úspěšnou reakci na rezistenci.K infikování rostlinné tkáně musí spóry antraxu projít několika vývojovými fázemi na povrchu hostitele, včetně klíčení, buněčného dělení a tvorby apresoria.Přívěsek je infekční struktura, která se přichytí k povrchu hostitele a usnadňuje pronikání do tkání hostitele.Spory C. gloeosporioides v extraktu hrachu tedy vykazovaly první dělení jádra po 75-90 minutách inkubace, vytvoření zárodečné trubice po 90-120 minutách a potlačení po 4 hodinách45.Mango C. gloeosporioides vykazovalo více než 40% klíčivost konídií po 3 hodinách inkubace a asi 20% tvorbu apresorů po 4 hodinách.Gen CAP20 asociovaný s virulencí C. gloeosporioides vykazoval transkripční aktivitu v konidiích tvořících epifyty po 3,5 hodinách inkubace v povrchovém vosku avokáda s vysokými koncentracemi proteinu CAP20 po 4 h 46 min.Podobně aktivita genů biosyntézy melaninu v C. trifolii byla indukována během 2hodinové inkubace s následným vytvořením apresoria po 1 hodině.Studie tkání listů ukázaly, že jahody naočkované C. acutatum mají první potlačení při 8 hpi, zatímco rajčata naočkovaná C. coccodes mají první potlačení při 4 hpi48,49.do značné míry v souladu s časovým měřítkem Colletotrichum spp.infekční proces.Rychlé obranné reakce na 83A:476 naznačují zapojení genů rostlinné rezistence a efektorem spouštěné imunity (ETI) v této linii, zatímco Mandelupovy opožděné reakce podporují hypotézu mikro-asociované imunity spouštěné molekulárním vzorem (MTI) 50. Časné reakce na 83A: 476 a Mandelup.Částečné překrývání mezi up- a down-regulovanými geny v opožděné odpovědi také podporuje tento koncept, protože ETI je často považována za zrychlenou a zesílenou MTI odpověď, která kulminuje v programované buněčné smrti v místě infekce, známé jako anafylaktický šok51,52.
Většina genů připisovaných nadměrně zastoupenému termínu Gene Ontology GO:0006952 „Obranná odezva“ je 11 homologů proteinu stresem indukovaného půstu 22 (podobného SAM22) a sedmi hlavních latexových proteinů podobných (MLP).-podobné proteiny 31, 34, 43 a 423 vykazovaly sekvenční podobnost.Geny podobné SAM22 vykazovaly významnou aktivaci, která trvala déle a vykazovala zvýšené úrovně rezistence na antraknózu (83A:476 a Boregine).Nicméně geny podobné MLP byly downregulovány pouze v liniích nesoucích kandidátní alelu rezistence (83A:476/Lanr1 při 6 hpi a Mandelup/AnMan při 24 hpi).Je třeba poznamenat, že všechny identifikované homology podobné SAM22 pocházejí z genového shluku o velikosti přibližně 105 kb, zatímco geny podobné MLP pocházejí z oddělených oblastí genomu.Koordinovaná aktivace takových genů podobných SAM22 byla také nalezena v naší předchozí studii rezistence NLL vůči inokulaci Diaporthetoxica, což naznačuje, že jsou zapojeny do horizontálních složek obranné reakce.Tento závěr podporují také zprávy o pozitivní odpovědi genů podobných SAM22 na poškození nebo léčbu kyselinou salicylovou, induktory plísní nebo peroxidem vodíku.
Bylo prokázáno, že geny podobné MLP reagují na různé abiotické a biotické stresy, včetně bakteriálních, virových a patogenních plísňových infekcí u mnoha druhů rostlin55.Směry odezvy na určité interakce mezi rostlinami a patogeny se pohybovaly od silně rostoucích (tj. během napadení bavlníku Verticillium dahliae) po významně klesající (tj. po infekci jabloní Alternaria spp.)56,57.Významná downregulace genu 423 podobného MLP byla pozorována během obrany avokáda vůči infekci F. niger a během infekce jabloně Botryosphaeria benergeriana f.cn.piricola a Alternaria alternata jsou patotypy jabloní58,59.Kromě toho kalus jablečný nadměrně exprimující gen 423 podobný MLP měl nižší expresi genů spojených s rezistencí a byl náchylnější k houbové infekci59.Po Fusarium oxysporum f byl gen 423 podobný MLP také suprimován v rezistentní zárodečné plazmě fazolu obecného.cn.Infekce fazolemi 60.
Dalšími členy rodiny PR-10 identifikovanými v naší studii RNA-seq byly geny LlR18A a LlR18B v reakci na upregulaci, stejně jako upregulovaný (1 gen) nebo downregulovaný (3 geny) gen pro protein přenosu lipidů DIR1..Kromě toho WGCNA zdůrazňuje gen LlR18B jako centrum v tomto modulu, který je vysoce citlivý na očkování a nese několik genů ochranné reakce.Geny LlR18A a LlR18B byly indukovány ve žlutých listech vlčího bobu jako odpověď na patogenní bakterie, stejně jako ve stoncích NLL po inokulaci D. toxica, zatímco rýžový homolog těchto genů, RSOsPR10, byl rychle indukován plísňovou infekcí pravděpodobně zapojenou do signální dráhy proteinu jasmonové kyseliny, která je vyžadována pro transportní protein DIR1, nespecifický pro transport genu DIR63, enkóduje 52.6. počátek systémové získané rezistence (SAR).S rozvojem ochranných reakcí je protein DIR1 transportován z ohniska infekce přes floém, aby vyvolal SAR ve vzdálených orgánech.Je zajímavé, že gen TanjilG_02313 DIR1 byl významně indukován v prvním časovém bodě v liniích 84A:476 a populaci 22660, ale rezistence na antraknózu se úspěšně rozvinula pouze v linii 84A:476.To může ukazovat na určitou subfunkcionalizaci genu DIR1 u NLL, protože zbývající tři homology reagovaly na inokulaci pouze v linii 83A:476 při 6 hpi a tato reakce směřovala dolů.
V naší studii byly nejběžnějšími složkami odpovídajícími biologickému procesu zvanému „GO:0055114 Redox process“ protein cytochromu P450, peroxidáza, 9S-/13S-lipoxygenáza kyseliny linolové a oxidáza kyseliny 1-aminocyklopropan-1-karboxylové.Naše WGCNA navíc definuje homolog HSFA4a jako náboj nesoucí moduly, jako je kandidát genu rezistence Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a je součástí redox-dependentní regulace jaderné transkripce v rostlinách.
Proteiny cytochromu P450 jsou oxidoreduktázy, které katalyzují NADPH a/nebo O2 dependentní hydroxylační reakce v primárním a sekundárním metabolismu, včetně metabolismu xenobiotik, stejně jako hormonů, mastných kyselin, sterolů, složek buněčných stěn, biopolymerů a biosyntézy ochranných sloučenin 69. V naší studii byla variabilita (ve studii) snížena variabilita v rostlinné funkci cytochromu na 10-násobek P4 na P4 log207. velký počet pozměněných homologů (37) a rozdíly ve vzorcích odpovědí mezi specifickými geny, což odráží revizi směrem nahoru..Použití pouze dat RNA-seq k objasnění domnělé biologické funkce genů NLL v tak velké proteinové superrodině by bylo vysoce spekulativní.Je však třeba poznamenat, že některé geny cytochromu P450 jsou spojeny se zvýšenou odolností vůči patogenním houbám nebo bakteriím, včetně přispění k alergickým reakcím69,70,71.
Peroxidázy třídy III jsou multifunkční rostlinné enzymy, které se účastní široké škály metabolických procesů během růstu a vývoje rostlin, jakož i v reakci na environmentální stresy, jako je slanost, sucho, vysoká intenzita světla a napadení patogeny72.Peroxidázy se účastní interakce několika rostlinných druhů s Anthracis, včetně Stylosanthes humilis a C. gloeosporioides, Lens culinaris a C. truncatum, Phaseolus vulgaris a C. lindemuthianum, Cucumis sativus a C. lagenarium73,74,75,766.Odezva je velmi rychlá, někdy i při 4 HPI, než houba pronikne do rostlinného pletiva73.Gen peroxidázy také reagoval na inokulaci D. toxica NLL.Kromě svých typických funkcí regulovat oxidační vzplanutí nebo eliminovat oxidační stres mohou peroxidázy interferovat s růstem patogenů vytvářením fyzických bariér založených na zesílení buněčné stěny během lignifikace, podjednotky nebo zesíťování specifických sloučenin.Tuto funkci lze in silico přisoudit genu TanjilG_03329 kódujícímu předpokládanou lignin tvořící anion peroxidázu, která byla v naší studii významně upregulována u rezistentní linie 83A:476 při 6 HPI, ale ne v jiných kmenech a časových bodech, které nereagovaly.
9S-/13S-lipoxygenáza kyseliny linolové je prvním krokem v oxidační dráze biosyntézy lipidů78.Produkty této dráhy mají více funkcí v obraně rostlin, včetně posilování buněčné stěny tvorbou kalózových a pektinových usazenin a regulace oxidačního stresu prostřednictvím produkce reaktivních forem kyslíku79,80,81,82,83.V této studii byla exprese 9S-/13S-lipoxygenázy kyseliny linolové změněna u všech kmenů, ale u vnímavé populace 22660 převládala upregulace v různých časových bodech, zatímco u kmenů nesoucích rezistentní Lanr1 a alelu AnMan zdůrazňuje diverzifikaci oxylipinové vrstvy mezi těmito ochrannými reakcemi genotypu antraxu.
Homolog 1-aminocyklopropan-1-karboxylátoxidázy (ACO) byl významně upregulován (9 genů) nebo downregulován (2 geny), když byl inokulován lupinou.Až na dvě výjimky se všechny tyto reakce vyskytly při 6 hp.v 83A:476.Enzymatická reakce zprostředkovaná proteiny ACO je krokem omezujícím rychlost při výrobě ethylenu, a je proto vysoce regulována84.Ethylen je rostlinný hormon, který hraje různé role při regulaci vývoje rostlin a reakci na abiotické a biotické stresové podmínky.Indukce transkripce ACO a aktivace ethylenové signální dráhy se podílejí na zvýšení odolnosti rýže vůči hemibiotrofní houbě oryzae oryzae regulací produkce reaktivních forem kyslíku a fytoalexinů.Velmi podobný proces infekce listů nalezený mezi M. oryzae a C. lupini88,89, na pozadí významné upregulace homologů ACO v linii 83A:476 uváděné v této studii, posouvá možnost udělení rezistence vůči NLL antraknóze Ethylen jako signální centrální krok v molekulárních drahách.
V této studii byla pozorována rozsáhlá suprese mnoha genů spojených s fotosyntézou při 6 hpi v 83A:476 a při 48 hpi v Mandeloop a populaci 22660.Rozsah a průběh těchto změn je úměrný úrovni.V tomto experimentu byla pozorována rezistence na antraknózu.Nedávno byla hlášena silná a časná represe transkriptů souvisejících s fotosyntézou v několika modelech interakcí rostlina-patogen, včetně patogenních bakterií a hub.Spěch (od 2 HPI v některých interakcích) a globální potlačení genů spojených s fotosyntézou v reakci na infekci může spustit imunitu rostlin založenou na nasazení reaktivních forem kyslíku a jejich interakci s cestou kyseliny salicylové ke zprostředkování alergických reakcí 90,94.
Závěrem lze říci, že mechanismy obranné reakce navrhované pro nejodolnější linii (83A:476) zahrnují rychlé rozpoznání patogenu genem R (pravděpodobně TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) a signalizaci kyseliny salicylové a etylenu zprostředkovanou alergickou odpovědí, po níž následuje vytvoření SAR s dlouhým dosahem.působení je podporováno proteinem DIR-1.Je třeba poznamenat, že biotrofní období pro infekci C. lupini je velmi krátké (přibližně 2 dny), po němž následuje nekrotický růst95.Přechod mezi těmito stádii může být spojen s nekrózou a expresí ethylenem indukovatelných proteinů, které působí jako spouštěče hypersenzitivních reakcí v hostitelských rostlinách.Proto je časové okno pro úspěšný záchyt C. lupini v biotrofním stádiu velmi úzké.Přeprogramování genů spojených s redox a fotosyntézou pozorované v 83A:476 při 6 hpi je v souladu s progresí houbových hyf a předznamenává vývoj úspěšné ochranné reakce v biotrofickém stádiu.Transkriptomické reakce Mandelupu a populace 22660 mohou být příliš opožděné na to, aby zachytily houbu před přechodem na nekrotický růst, nicméně Mandelup může být účinnější než populace 22660, protože relativně rychlá regulace proteinu PR-10 podporuje horizontální rezistenci.
ETI, řízený kanonickým genem R, se zdá být běžným mechanismem rezistence fazolí vůči antraknóze.V modelové luštěnině Medicago truncatula je tedy odolnost vůči antraknóze propůjčována genem RCT1, členem rostlinné genové třídy R TIR-NBS-LRR97.Tento gen také uděluje širokospektrální antraknózovou rezistenci u vojtěšky, když je přenesen do citlivých rostlin.U fazole obecného (P. vulgaris) byly dosud identifikovány více než dvě desítky genů rezistence na antraknózu.Některé z těchto genů se nacházejí v oblastech bez jakýchkoli kanonických R genů, avšak mnoho dalších se nachází na okrajích chromozomů nesoucích shluk genů NBS-LRR, včetně TIR-NBS-LRR99.Celogenomová studie SSR také potvrdila asociaci genu NBS-LRR s rezistencí na antraknózu u fazolu obecného.Kanonický gen R byl také nalezen v genomové oblasti nesoucí hlavní lokus rezistence na antraknózu u bílé lupiny 101.
Naše práce ukazuje, že okamžitá rezistentní reakce, aktivovaná v rané fázi infekce rostlin (nejlépe nejpozději do 12 hpi), účinně chrání lupinu úzkolistou před antraknózou způsobenou patogenní houbou Collelotrichum lupini.Pomocí vysoce výkonného sekvenování jsme prokázali rozdílné profily exprese genů rezistence na antraknózu v rostlinách NLL zprostředkované geny rezistence Lanr1 a AnMan.Úspěšná obrana zahrnuje pečlivé navržení genů pro proteiny zapojené do redoxu, fotosyntézy a patogeneze během několika hodin od prvního kontaktu rostliny s patogenem.Podobné ochranné reakce, ale opožděné v čase, jsou mnohem méně účinné při ochraně rostlin před chorobami.Antraxová rezistence zprostředkovaná genem Lanr1 se podobá typické rychlé reakci genu R (imunita spouštěná efektorem), zatímco gen AnMan s největší pravděpodobností poskytuje horizontální odpověď (imunita spouštěná molekulárním vzorem spojeným s mikroby), poskytující střední úroveň udržitelnosti.
215 linií NLL použitých ke screeningu antraknózových markerů sestávalo ze 74 kultivarů, 60 linií získaných křížením nebo šlechtěním, 5 mutantů a 76 divokých nebo původních zárodečných plazmat.Linky pocházely ze 17 zemí, především z Polska (58), Španělska (47), Německa (27), Austrálie (26), Ruska (19), Běloruska (7), Itálie (5) a dalších linek.z 10 zemí.Sada také obsahuje referenční odolné linie: 83A:476, Tanjil, Wonga nesoucí alelu Lanr1 a Mandelup nesoucí alelu AnMan.Linie byly získány z European Lupine Genetic Resource Database spravované Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polsko (doplňková tabulka S1).
Rostliny byly pěstovány za kontrolovaných podmínek (fotoperioda 16 hodin, teplota 25°C přes den a 18°C ​​v noci).Byly analyzovány dva biologické replikáty.DNA byla izolována ze tří týdnů starých listů pomocí DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) podle protokolu.Kvalita a koncentrace izolované DNA byla hodnocena spektrofotometrickými metodami (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Byl analyzován marker AnManM1 označující gen rezistence na anthracnózu AnMan (odvozený od kultivaru Mandelup) a markery Anseq3 a Anseq4 lemující gen Lanr1 (odvozený od kultu Tanjil) 11,26,28.Homozygoti pro rezistentní alelu byli hodnoceni jako „1“, citliví – jako „0“ a heterozygoti – jako 0,5.
Na základě výsledků screeningu na markery AnManM1, AnSeq3 a AnSeq4 a dostupnosti semen pro konečné následné experimenty bylo vybráno 50 linií NLL pro fenotypizaci rezistence na antraknózu.Analýza byla provedena v duplikátech v počítačem řízeném skleníku se 14hodinovou fotoperiodou s teplotním rozsahem 22 °C ve dne a 19 °C v noci.Semena se před výsevem seškrábou (odříznutím obalu semen na opačné straně embrya ostrou čepelí), aby se zabránilo dormanci semen v důsledku příliš tvrdého obalu semen a zajistilo se rovnoměrné klíčení.Rostliny byly pěstovány v květináčích (11 × 11 × 21 cm) se sterilní půdou (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Polsko).Inokulace byla provedena kmenem Colletotrichum lupini Col-08, vypěstovaným v roce 1999 ze stonků úzkolistých rostlin lupiny pěstovaných na poli ve Verzhenitsa, Velkopolsko (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Získejte oblast.Izoláty byly kultivovány v médiu SNA při 20 °C pod černým světlem po dobu 21 dnů k indukci sporulace.Čtyři týdny po vysetí, když rostliny dosáhly stádia 4-6 listů, byla provedena inokulace postřikem suspenzí konidií v koncentraci 0,5 x 106 konidií na ml.Po inokulaci byly rostliny udržovány ve tmě po dobu 24 hodin při vlhkosti asi 98 % a teplotě 25 °C, aby se usnadnilo klíčení konidií a proces infekce.Rostliny pak byly pěstovány za 14hodinové fotoperiody při 22 °C ve dne/19 °C v noci a 70% vlhkosti.Skóre onemocnění bylo provedeno 22 dní po inokulaci a pohybovalo se od 0 (imunitní) do 9 (velmi vnímavé) v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti nekrotických lézí na stoncích a listech.Po bodování byla navíc změřena hmotnost rostlin.Vztahy mezi genotypy markerů a fenotypy onemocnění byly vypočteny jako bodové dvousekvenční korelace (absence heterozygotních markerů v souboru linií pro analýzu fenotypu rezistence k antraknóze).