Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Lupinus angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) je luštěnina používaná k produkci potravin a ke zlepšení půdy. Globální expanze NLL jako plodiny přilákala mnoho patogenních hub, včetně antraknózy lupiny, která způsobuje ničivou antraknózu. Při šlechtění NLL byly použity dvě alely, Lanr1 a AnMan, které propůjčují zvýšenou rezistenci, ale základní molekulární mechanismy zůstávají neznámé. V této studii byly markery Lanr1 a AnMan použity ke screeningu evropských vzorků NLL. Testování vakcíny v kontrolovaném prostředí potvrdilo účinnost obou rezistentních dárců. Bylo provedeno diferenciální profilování genové exprese na reprezentativních rezistentních a citlivých liniích. Rezistence na antraknózu byla spojena s nadměrnou expresí genových ontologických termínů „GO:0006952 Defense Response“, „GO:0055114 Redox Process“ a „GO:0015979 Photosynthesis“. Linie Lanr1(83A:476) navíc vykazovala významné reprogramování transkriptomu rychle po inokulaci, zatímco ostatní linie vykazovaly zpoždění v této reakci přibližně o 42 hodin. Obranné reakce jsou spojeny s geny TIR-NBS, CC-NBS-LRR a NBS-LRR, 10 proteiny zapojenými do patogeneze, proteiny pro přenos lipidů, endoglukan-1,3-β-glukosidázou, proteiny buněčné stěny bohatými na glycin a geny z reaktivní dráhy kyslíku. První reakce na 83A:476, včetně pečlivého potlačení genů spojených s fotosyntézou, se shodovaly s úspěšnou ochranou během vegetativní růstové fáze houbové biologie, což naznačuje, že efektor spouští imunitu. Mandeloopova reakce je zpomalena, stejně jako celkový horizontální odpor.
Lupina úzkolistá (NLL, Lupinus angustifolius L.) je obilovina s vysokým obsahem bílkovin pocházející ze západního Středomoří1,2. V současné době se pěstuje jako potravinářská plodina pro zvířata i lidi. V systémech střídání plodin je také považována za zelené hnojení díky fixaci dusíku symbiotickými bakteriemi fixujícími dusík a celkovému zlepšení struktury půdy. NLL prošla v minulém století rychlým procesem domestikace a stále je pod vysokým šlechtitelským tlakem3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. S rozsáhlým pěstováním NLL si sukcese patogenních hub vytvořila nové zemědělské niky a způsobila nové choroby ničící úrodu. Pro pěstitele a šlechtitele lupiny byl nejpozoruhodnější výskyt antraknózy, kterou způsobuje patogenní houba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Pro pěstitele a šlechtitele lupiny byl nejpozoruhodnější výskyt antraknózy, kterou způsobuje patogenní houba Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров a селекционеров примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появленковознозновантрание патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Pro pěstitele a šlechtitele lupiny byl nejvýznamnější výskyt antraknózy způsobené patogenní houbou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它明矔煗Clupina (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它明矔煗Clupina (Bondar)嵵Vlasy。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является поянтся появление вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Pro pěstitele a šlechtitele lupiny je nejvýraznější výskyt antraknózy způsobené patogenní houbou Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Nejstarší zprávy o onemocnění pocházejí z Brazílie a Spojených států, přičemž typické příznaky se objevily v letech 1912 a 1929. Po zhruba 30 letech byl však patogen označen jako Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld v Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .a H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。a H. Schlenk, .Předběžné fenotypování onemocnění provedené v polovině 20. století ukázalo určitou rezistenci u generací NLL a lupiny žluté (L. luteus L.), ale všechny testované generace lupiny bílé (L. albus L.) byly vysoce náchylné15,16. Studie ukázaly, že vývoj antraknózy je spojen se zvýšenými srážkami (vlhkostí vzduchu) a teplotou (v rozmezí 12–28 °C), což vede k narušení rezistence při vyšších teplotách17,18. Ve skutečnosti byla doba potřebná k vyklíčení konidií a zahájení onemocnění při 24 °C (4 hodiny) čtyřikrát kratší než při 12 °C (16 hodin) za podmínek vysoké vlhkosti19. Probíhající globální oteplování tak vedlo k šíření antraknózy. Nemoc však byla pozorována ve Francii (1982) a na Ukrajině (1983) jako předzvěst hrozící hrozby, ale v té době ji zjevně ignoroval průmysl pěstování lupiny20,21. O několik let později se tato ničivá nemoc rozšířila po celém světě a postihla také hlavní země produkující lupinu, jako je Austrálie, Polsko a Německo22,23,24. Po vypuknutí antraknózy v polovině 90. let 20. století vedl rozsáhlý screening k identifikaci několika rezistentních dárců ve vzorcích NLL19. Rezistence NLL k antraknóze je kontrolována dvěma samostatnými dominantními alelami, které se nacházejí v různých zdrojích zárodečné plazmy: Lanr1 u kultivaru Tanjil a Wonga a AnMan u kultivaru Mandalay25,26. Tyto alely doplňují molekulární markery, které podporují selekci rezistentní zárodečné plazmy ve šlechtitelských programech25,26,27,28,29,30. Rezistentní šlechtěná linie 83A:476 nesoucí alelu Lanr1 byla křížena s vnímavou divokou linií P27255 za účelem získání populace RIL segregující pro rezistenci vůči antraknóze, což umožnilo přiřadit lokus Lanr1 k chromozomu NLL-1131, 32, 33. Zarovnáním markerů vazebné mapy z lemujících lokusů rezistence k antraknóze s genomovým rámcem NLL odhalila umístění všech tří alel na stejném chromozomu (NLL-11), ale v různých pozicích29,34,35. Vzhledem k malému počtu RIL a velké genetické vzdálenosti mezi markery a odpovídajícími alelami však nelze vyvodit žádné spolehlivé závěry o jejich základních genech. Na druhou stranu je použití reverzní genetiky u lupin obtížné kvůli jejich velmi nízkému regeneračnímu potenciálu, což ztěžuje genetickou manipulaci37.
Vývoj domestikované zárodečné plazmy nesoucí požadovanou alelu v homozygotním stavu, jako například 83A:476 (Lanr1) a Mandelup (AnMan), otevřel dveře ke studiu rezistence na antraknózu tváří v tvář přítomnosti opačných kombinací alel v divokých populacích. Možnosti molekulárních mechanismů. Porovnání obranných reakcí generovaných specifickými genotypy. Tato studie hodnotila časnou transkriptomovou odpověď NLL na očkování C. lupini. Nejprve byl evropský panel zárodečné plazmy NLL obsahující 215 linií screenován pomocí molekulárních markerů, které označují alely Lanr1 a AnMan. Poté byl proveden fenotyp antraknózy na 50 liniích NLL, dříve selektovaných pro molekulární markery, za kontrolovaných podmínek. Na základě těchto experimentů byly pro profilování diferenciální obranné genové exprese vybrány čtyři linie lišící se rezistencí na antraknózu a alelickým složením Lanr1/AnMan s použitím dvou komplementárních přístupů: vysokokapacitního sekvenování RNA a kvantifikace PCR v reálném čase.
Screening sady zárodečné plazmy NLL (N = 215) s markery Lanr1 (Anseq3 a Anseq4) a AnMan (Anseq4) a AnMan (AnManM1) ukázal, že pouze jedna linie (95726, poblíž Salamanca-b) amplifikuje alelu „rezistenci“ pro všechny markery, zatímco „přítomnost 'citlivých' alel“ zjistila podíl všech markerů u 158 (~73,5 %) linií. Třináct linií produkovalo dvě „rezistentní“ alely markeru Lanr1 a 8 linií produkovalo „rezistentní“ alely markeru Lanr1. Alela „rezistenci“ markeru AnMan (doplňková tabulka S1). Dvě linie byly heterozygotní pro marker Anseq3 a jedna heterozygotní pro marker AnManM1. 42 linií (19,5 %) neslo opačné fáze alel Anseq3 a Anseq4, což naznačuje vysokou frekvenci rekombinace mezi těmito dvěma lokusy. Fenotypy antraknózy za kontrolovaných podmínek (doplňková tabulka S2) vykazovaly variabilitu v rezistenci testovaných genotypů, což se odrazilo v závažnosti antraknózy. Rozdíly v průměrném skóre se pohybovaly od 1,8 (středně rezistentní) do 6,9 (náchylné) a rozdíly v hmotnosti rostlin se pohybovaly od 0,62 (náchylné) do 4,45 g (rezistentní). Mezi hodnotami pozorovanými ve dvou opakováních experimentu (0,51 pro skóre závažnosti onemocnění, P = 0,00017 a 0,61 pro hmotnost rostliny, P < 0,0001) a také mezi těmito dvěma parametry (−0,59 a −0,77, P < 0,0001) byla zjištěna významná korelace. Mezi hodnotami pozorovanými ve dvou opakováních experimentu (0,51 pro skóre závažnosti onemocnění, P = 0,00017 a 0,61 pro hmotnost rostliny, P < 0,0001) a také mezi těmito dvěma parametry (−0,59 a −0,77, P < 0,0001) byla zjištěna významná korelace. Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми вявтух пововтовторновий эксперимента (0,51 для баллов тяжести болезни, P = 0,00017 a 0,61 для массы <1,00 растения, P = 0,0017) между этими двумя параметрами (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Byla zjištěna významná korelace mezi hodnotami pozorovanými ve dvou opakováních experimentu (0,51 pro skóre závažnosti onemocnění, P = 0,00017 a 0,61 pro hmotnost rostliny, P < 0,0001), stejně jako mezi těmito dvěma parametry (-0,59 a -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1似0,00017，植物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77,001P < 0,77,000 P在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p < 0,0001） 以及 两 个 参数 乌–闼-9 0,59 和 – 0,59 和 – 0,59 和 – 0,77, P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемымисотов дурниция (оценка тяжести заболевания 0,51, P = 0,00017 a масса растения 0,61, P <0,0001), a между э параметрами (-0,59 a -0,0001) 0,77, P <0,0001. Mezi hodnotami pozorovanými v duplikátu (skóre závažnosti onemocnění 0,51, P = 0,00017 a hmotnost rostliny 0,61, P < 0,0001) a mezi těmito dvěma parametry (-0,59 a -0,0001) byla zjištěna významná korelace 0,77, P < 0,0001. ).Mezi typické příznaky pozorované u náchylných rostlin patří zalomení a kroucení stonku připomínající strukturu „pastýřského luku“, následované oválnými lézemi s oranžovými/růžovými sporozoity (doplňkový obrázek 1). Australské generace nesoucí geny Lanr1 (83A:476 a Tanjil) a AnMan (Mandelup) jsou středně rezistentní, 0,0331 a 0,0036). Některé linie, které také nesou „rezistentní“ alely Lanr1 a/nebo AnMan, vykazují příznaky onemocnění.
Je zajímavé, že několik linií NLL postrádajících jakoukoli „rezistentní“ markerovou alelu vykazovalo vysokou úroveň rezistence vůči antraknóze (srovnatelnou nebo vyšší než u genotypů Lanr1 nebo AnMan), jako například Boregine (hodnota P < 0,0001 pro oba parametry), Bojar (hodnota P < 0,0001 pro skóre a 0,001 pro hmotnost rostliny) a populace B-549/79b (hodnota P < 0,0001 pro skóre a nevýznamná pro hmotnost). Je zajímavé, že několik linií NLL postrádajících jakoukoli „rezistentní“ markerovou alelu vykazovalo vysokou úroveň rezistence vůči antraknóze (srovnatelnou nebo vyšší než u genotypů Lanr1 nebo AnMan), jako například Boregine (hodnota P < 0,0001 pro oba parametry), Bojar (hodnota P < 0,0001 pro skóre a 0,001 pro hmotnost rostliny) a populace B-549/79b (hodnota P < 0,0001 pro skóre a nevýznamná pro hmotnost). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерногио алкаркерного алибо высокий уровень устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем диловит Lanr1 tak как Boregine (значение P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оиценкис оиценкис растения) a популяции B-549/79b (значение P <0,0001 для оценки и незначимо для массы). Je zajímavé, že několik linií NLL postrádajících jakoukoli „rezistentní“ markerovou alelu vykazovalo vysokou úroveň rezistence vůči antraknóze (srovnatelnou nebo vyšší než u genotypů Lanr1 nebo AnMan), jako například Boregine (hodnota P < 0,0001 pro oba parametry), Bojar (hodnota P < 0,0001 pro hodnocení a 0,001 pro hmotnost rostliny) a populace B-549/79b (hodnota P < 0,0001 pro hodnocení a nevýznamná pro hmotnost).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水Lan怼的炭怊平的炭性或AnMan 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分为0,0001，植物重量为0,001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，釘怏丼㝍怏丼㝍怏丸 Je zajímavé, že některé NLL systémy, které nemají žádné „antigenní“ markery, vykazují vysokou horizontální rezistenci (ekvivalentní genům Lanr1 nebo AnMan nebo vyšší), jako například Boregine (oba parametry P < 0,0001), Bojar (hodnota P < 0,0001, hmotnost rostliny 0,001) a kmen B-549/79b (hodnota P < 0,0001, hmotnost není statisticky významná). Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллеклей «резистенитносто» уровни устойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такиеземые как Bor обоих параметров <0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) a популяцкия B-549/7 P-значение <0,0001, масса незначительна). Je zajímavé, že některé NLL linie postrádající jakékoli alely „rezistentních“ markerů vykazovaly vysokou úroveň rezistence vůči antraknóze (srovnatelnou s genotypy Lanr1 nebo AnMan nebo vyšší), jako například Boregine (hodnota P pro oba parametry <0,0001), Bojar (hodnota P < 0,0001, hmotnost rostliny 0,001) a populace B-549/79b (hodnota P < 0,0001, hmotnost není statisticky významná).Tento jev naznačuje možnost nového genetického zdroje rezistence, což vysvětluje pozorovaný nedostatek korelace mezi markerovými genotypy a fenotypy onemocnění (hodnoty P od ~0,42 do ~0,98). Kolmogorovův-Smirnovův test tedy ukázal, že data o rezistenci vůči antraknóze byla přibližně normálně rozdělena pro skóre (hodnoty P 0,25 a 0,11) a hmotnost rostliny (hodnoty P 0,47 a 0,55), což naznačuje hypotézu, že je zapojeno více alel než Lanr1 a AnMan.
Na základě výsledků screeningu rezistence na antraknózu byly pro analýzu transkriptomu vybrány 4 linie: 83A:476, Boregine, Mandelup a populace 22660. Tyto linie byly znovu testovány na rezistenci na antrax v inokulačních experimentech pomocí sekvenování RNA, za předpokladu, že byly stejné jako v předchozím testu. Hodnoty skóre byly následující: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A:476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) a populace 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 dosáhl průměrně 40,5 párů Mread na vzorek (29,7 až 54,4 Mread) (doplňková tabulka S3). Skóre zarovnání v referenční sekvenci se pohybovalo od 75,5 % do 88,6 %. Průměrná korelace dat počtu čtení mezi experimentálními variantami mezi biologickými replikáty se pohybovala od 0,812 do 0,997 (průměr 0,959). Z 35 170 analyzovaných genů 2917 nevykazovalo žádnou expresi a zbývajících 4785 genů bylo exprimováno na zanedbatelné úrovni (základní průměr < 5). Z 35 170 analyzovaných genů 2917 nevykazovalo žádnou expresi a zbývajících 4785 genů bylo exprimováno na zanedbatelné úrovni (základní průměr < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли эksпрессии, остальные 4785 Из экспрессировались на незначительном уровне (базовое среднее <5). Z 35 170 analyzovaných genů 2917 nevykazovalo žádnou expresi a zbývajících 4785 genů bylo exprimováno na zanedbatelné úrovni (průměrná hodnota <5).在分析的35 170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785个基因的表达可以忽略不计（基本平均值< 5）。35 170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, остальные 4785 игенов незначительную экспрессию (базовое среднее значение <5). Z 35 170 analyzovaných genů nebylo 2917 exprimováno a zbývajících 4785 genů mělo zanedbatelnou expresi (průměrná hodnota <5).Počet genů považovaných za exprimované (základní průměr ≥ 5) během experimentu byl tedy 27 468 (78,1 %) (doplňková tabulka S4).
Od prvního časového bodu reagovaly všechny linie NLL na inokulaci C. lupini (kmen Col-08) přeprogramováním transkriptomu (tabulka 1), nicméně mezi liniemi byly pozorovány významné rozdíly. Rezistenční linie 83A:476 (nesoucí gen Lanr1) tak vykazovala v prvním časovém bodě (6 hpi) významné přeprogramování transkriptomu s 31–69násobným nárůstem počtu izolovaných up- a down-genů ve srovnání s jinými časovými body v tomto časovém bodě. Navíc byl tento vrchol krátkodobý, protože exprese pouze několika genů zůstala v druhém časovém bodě (12 hpi) významně změněna. Je zajímavé, že Boregine, který také vykazoval vysokou úroveň rezistence v roubovaném testu, neprošel během experimentu tak masivním transkripčním přeprogramováním. Počet diferencovaně exprimovaných genů (DEG) byl však u Boregine a 83A:476 při 12 HPI stejný. Jak Mandelup, tak populace 22660 vykazovaly v posledním časovém bodě vrcholy DEG (48 l/s), což naznačuje relativní zpoždění obranných reakcí.
Protože linie 83A:476 prodělala v reakci na C. lupini v 6. HPI masivní reprogramování transkriptomu ve srovnání se všemi ostatními liniemi, bylo ~91 % pozorovaných diferenčně exprimovaných genů (DEG) v tomto časovém bodě specifických pro danou linii (obr. 1). Mezi studovanými liniemi se však do jisté míry překrývaly rané reakce, jelikož 68,5 %, 50,9 % a 52,6 % DEG u Boregine, Mandelup a populace 22660 se v určitých časových okamžicích překrývalo s geny zjištěnými u linie 83A:476. Tyto DEG však představovaly pouze malý zlomek (0,97–1,70 %) všech DEG v současnosti detekovaných pomocí linie 83A:476. Kromě toho bylo v tomto okamžiku koherentních 11 diferenčně exprimovaných genů (DEG) ze všech linií (doplňkové tabulky S4-S6), včetně společných složek obranných reakcí rostlin: protein pro přenos lipidů (TanjilG_32225), enzym endoglukan-1,3-β-glukosid (TanjilG_23384), dva stresem indukovatelné proteiny, jako je SAM22 (TanjilG_31528 a TanjilG_31531), bazický latexový protein (TanjilG_32352) a dva na glycin bohaté strukturální proteiny buněčné stěny (TanjilG_19701 a TanjilG_19702). Také došlo k relativně vysokému překrytí v transkriptomových reakcích mezi 83A:476 a Boregine při 24 HPI (celkem 16-38 % DEG) a mezi Mandelup a populací 22660 při 48 HPI (celkem 14-20 % DEG).
Vennův diagram znázorňující počet diferencovaně exprimovaných genů (DEG) v liniích lupiny úzkolisté (NLL) inokulovaných Colletotrichum lupini (kmen Col-08 získaný z lupinových polí ve Wierzhenicech, Polsko, 1999). Analyzované linie NLL byly: 83A:476 (rezistentní, nesoucí alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí alelu AnMan) a populace 22660 (velmi citlivá). Zkratka hpi znamená hodiny po vakcinaci. Pro zjednodušení grafu byly odstraněny nulové hodnoty.
Sada genů s nadměrnou expresí v čase 6 hpi byla analyzována na přítomnost kanonických domén R genu (doplňková tabulka S7). Tato studie odhalila transkriptomovou indukci klasických genů rezistence vůči chorobám pouze s doménami NBS-LRR v pozici 83A:476. Tato sada se skládala z jednoho genu TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), pěti genů CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 a tanjilg_16162) a čtyř genů NBS-LR (Tanjilg_16162) a čtyř genů NBS-LRRE (tanjilg_16162), stejně jako čtyř genů NBS-Lrr (tanjilg_16162) a čtyř genů NBS-LRR (TANJILG_16162). Všechny tyto geny mají kanonické domény uspořádané v konzervovaných sekvencích. Kromě genů domény NBS-LRR bylo v 6 hpi aktivováno několik RLL kináz, konkrétně jedna u Boregine (TanjilG_19877), dvě u Mandelup (TanjilG_07141 a TanjilG_19877) a v populaci 22660 (TanjilG_09014 a TanjilG_10361) a dvě u 83A 27:476.
Geny s významně změněnou expresí v reakci na inokulaci C. lupini (kmen Col-08) byly podrobeny analýze obohacení Gene Ontology (GO) (doplňková tabulka S8). Nejčastěji nadreprezentovaným termínem biologického procesu byl „obranná reakce GO:0006952“, který se objevil v 6 z 16 (čas × linie) kombinací s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2). Nejčastěji nadreprezentovaným termínem biologického procesu byl „obranná reakce GO:0006952“, který se objevil v 6 z 16 (čas × linie) kombinací s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса б006 «GO 2006 защитный ответ», который появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинацэй с вытьяноЎйстьяной вытьянойо (значение P <0,001) (рис. 2). Nejčastěji nadreprezentovaným termínem biologického procesu byl „obranná reakce GO:0006952“, který se objevil v 6 z 16 kombinací (čas × linie) s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个（时间×线）组合中的6 个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）。 Nejreprezentativnějším termínem biologického procesu je „obranná reakce GO:0006952“, který se objevuje v 6 z 16 kombinací (时间×线) s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического чрезмерно представленным термином биологического процеского процесса, 500 GO «Odpověď: 0006 GO который появлялся v 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значий значимостьченмостьченорнстьче (мостьче мостью 2). Nejčastěji nadreprezentovaným termínem biologického procesu byl „GO:0006952 Obranná reakce“, který se objevil v 6 z 16 kombinací (čas × linie) s vysokou významností (hodnota P < 0,001) (obr. 2).Tento termín byl nadměrně zastoupen ve dvou časových bodech u populace 83A: 476 a Boregine (6 a 24 hpi) a v jednom časovém bodě u Mandelup a populace 22660 (12 a 6 hpi). Jedná se o očekávaný výsledek, který zdůrazňuje antifungální reakci rezistentních linií. Kromě toho linie 83A:476 reagovala na C. lupini rychlou indukcí genů souvisejících s oxidačním vzplanutím reprezentovaným termínem „redoxní proces GO:0055114“, což naznačuje specifickou obrannou reakci, zatímco Boregine vykazovala specifické obranné reakce související s termínem „GO“. :0006950 Stresová reakce“. Populace 22660 aktivovala horizontální rezistenční reakci zahrnující sekundární metabolity, což zdůrazňuje nadměrný počet termínů „GO:0016104 Proces biosyntézy triterpenů“ a „GO:0006722 Proces metabolismu triterpenů“ (oba termíny patří do stejné sady genů). S přihlédnutím k výsledkům analýzy obohacení GO termínů byla stabilita Mandelupovy reakce mezi Boregine a populací 22660. Kromě toho časná reakce 83A:476 (6 hpi) a opožděná reakce Mandelup a populace 22660 zahrnují termín GO:0015979 „fotosyntéza“ a další související biologické procesy.
Termíny bioprocesní genové ontologie vybrané v anotaci diferencovaně exprimovaných genů během transkriptomových odpovědí lupiny úzkolisté (NLL) inokulované antraxovým lupinem (kmen Col-08 získaný z lupinových polí ve Wierzhenicech v Polsku v roce 1999) jsou značně přehnané. Analyzované linie NLL byly: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, neznámé genetické pozadí), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a populace 22660 (náchylná).
Protože cílem této studie bylo identifikovat geny, které přispívají k rezistenci vůči antraknóze, byly geny přiřazené k termínům GO „GO: 0006952 Obranné reakce“ a „GO: 0055114 Redoxní procesy“ analyzovány s hraničními hodnotami od výchozích průměrů ≥ 30 s alespoň jednou linií. × časový bod kombinující statisticky významné hodnoty log2 (násobná změna). Počet genů splňujících tato kritéria byl 65 pro GO:0006952 a 524 pro GO:0055114.
Studie 83A:476 odhalila dva píky DEG označené termínem GO:0006952, první při 6 genech na palec (64 genů, regulace nahoru a dolů) a druhý při 24 genech na palec (15 genů, pouze regulace nahoru). Boregine také ukázal, že GO:0006952 vrcholil ve stejném časovém bodě, ale s menším DEG (11 a 8) a preferenční aktivací. Mandeloop vykazoval dva píky GO:0006952 při 12 a 48 HPI, oba nesoucí 12 genů (první s aktivačními geny a druhý pouze s supresivními geny), zatímco populace 22660 při 6 HPI (13 genů) měla větší převahu píku se zvyšující se regulací. Je třeba poznamenat, že 96,4 % píků GO:0006952 DEG v těchto pících mělo stejný typ reakce (nahoru nebo dolů), což naznačuje významné překrývání obranných reakcí navzdory rozdílům v počtu zapojených genů. Největší skupina sekvencí souvisejících s termínem GO:0006952 kóduje protein podobný SAM22 (Starvation Stress-Associated Message Protein 22), který patří do proteinové skupiny PR-10 (třídy 10) a do latexového proteinu podobného MLP (MLP-like protein) (obr. 3). Tyto dvě skupiny se lišily povahou exprese a směrem odpovědi. Geny kódující proteiny podobné SAM22 vykazovaly konzistentní a významnou indukci v časných časových bodech (6 nebo 12 hpi) a na konci experimentu (48 hpi) obecně nereagovaly, zatímco proteiny podobné MLP vykazovaly koordinaci při 6 hpi. 83A:476 a Mandelup při 48 hp/in, téměř všechny ostatní datové body nereagovaly. Rozdíly v expresních profilech genů proteinů podobných SAM22 navíc sledovaly pozorovanou variabilitu v rezistenci na antraknózu, protože rezistentnější linie měly více časových bodů, které tyto geny významně indukovaly, než citlivější geny. Další gen PR-10 podobný LlR18A/B vykazoval velmi podobný expresní vzorec jako gen proteinu podobného SAM22.
Byly identifikovány hlavní složky biologického procesního termínu „GO:0006952 Defense Response“ a vzorce exprese kandidátních genů alel Lanr1 a AnMan. Log2 stupnice představuje log2 hodnoty (násobek změny) mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z lupinových polí, Wizhenica, Polsko, 1999) a kontrolními (falešně inokulovanými) rostlinami ve stejném časovém bodě. Byly analyzovány následující linie lupiny úzkolisté: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a Populace 22660 (náchylná).
Dále byly vyhodnoceny expresní profily kandidátních genů RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) a AnMan (TanjilG_12861) (obr. 3). Gen TanjilG_05042 vykazoval významnou odpověď (aktivaci) v čase 83A:476 pouze v prvním časovém bodě (6 hpi), zatímco TanjilG_12861 byl v Mandeloopu významný pouze ve dvou časových bodech: 6 hpi (snížená regulace) a 24 hpi (6 hpi). S možností nastavení.).
Nejvíce nadměrně exprimované geny v termínu GO:0055114 „redox process“ byly geny kódující proteiny cytochromu P450 a peroxidázu (obr. 4). U vzorků izolovaných z 83A:476 při 6 HPI byly obecně pozorovány maximální nebo minimální hodnoty log2 (násobná změna) (pro 86,6 % genů) mezi inokulovanými a kontrolními rostlinami, což zdůrazňuje vysokou reakci tohoto genotypu na inokulované pohlaví. 83A:476 vykazoval nejvýznamnější GO:0055114 DEG při 6 hpi (503 genů), zatímco zbytek linií při 48 hpi (Boregine, 31 genů; Mandelup, 85 genů; a Populace 22660, 78 genů)). U většiny genů rodiny GO:0055114 byly pozorovány dva typy reakcí na vakcinaci (aktivace a inhibice). Je zajímavé, že až 97,6 % diferenčně exprimovaných genů (DEG) bylo identifikovaných pro termín GO: 0055114 u kmene Mandelupe při 48 hp. Tato pozorování naznačují, že navzdory výrazně menšímu rozsahu (tj. počtu mutovaných redoxních genů 85 oproti 503) je vzorec opožděných transkriptomových odpovědí kmene Mandelupe na antraknózu podobný časné odpovědi kmene 83A:476. U kmene Boregine a populace 22660 je tato konvergence nižší, a to 51,6 %, respektive 75,6 %.
Byly odhaleny vzorce exprese hlavních složek termínu biologického procesu „GO:0055114 Redox process“. Log2 stupnice představuje log2 hodnoty (násobek změny) mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z lupinových polí, Wizhenica, Polsko, 1999) a kontrolními (falešně inokulovanými) rostlinami ve stejném časovém bodě. Byly analyzovány následující linie lupiny úzkolisté: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a populace 22660 (náchylná).
83A:476 Transkriptomické reakce na inokulaci C. lupini (kmen Col-08) zahrnovaly také koordinované umlčení genů připisovaných termínu GO:0015979 „fotosyntéza“ a dalším souvisejícím biologickým procesům (obr. 5). Tato sada DEG GO:0015979 obsahovala 105 genů, které byly významně potlačeny v 6 hpi v 83A:476. V této podskupině bylo 37 genů také downregulováno v Mandelupově populaci v 48 HPI a 35 ve stejném časovém bodě v populaci 22660, včetně 19 DEG společných pro oba genotypy. Žádné DEG související s termínem GO: 0015979 nebyly významně aktivovány v žádné kombinaci (řádek x čas).
Byly odhaleny vzorce exprese hlavních složek termínu biologického procesu „GO:0015979 Fotosyntéza“. Log2 stupnice představuje log2 hodnoty (násobek změny) mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z lupinových polí, Wizhenica, Polsko, 1999) a kontrolními (falešně inokulovanými) rostlinami ve stejném časovém bodě. Byly analyzovány následující linie lupiny úzkolisté: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan) a populace 22660 (náchylná).
Na základě výsledků analýzy diferenciální exprese a pravděpodobně zapojené do obranných reakcí proti patogenním houbám byla tato sada sedmi genů vybrána pro kvantifikaci expresních profilů pomocí PCR v reálném čase (doplňková tabulka S9).
Předpokládaný proteinový gen TanjilG_10657 byl významně indukován ve všech studovaných liniích a časových bodech ve srovnání s kontrolními (mimickými) rostlinami (doplňkové tabulky S10, S11). Kromě toho profil exprese TanjilG_10657 vykazoval v průběhu experimentu rostoucí trend u všech linií. Populace 22660 vykazovala nejvyšší citlivost TanjilG_10657 na inokulaci se 114násobnou aktivací a nejvyšší relativní hladinou exprese (4,4 ± 0,4) při 24 HPI (obr. 6a). Gen proteinu PR10 LlR18A TanjilG_27015 také vykazoval aktivaci napříč všemi liniemi a časovými body se statistickou významností ve většině datových bodů (obr. 6b). Podobně jako u TanjilG_10657 byla nejvyšší relativní hladina exprese TanjilG_27015 pozorována u inokulované populace 22660 při 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen kyselé endochitinázy TanjilG_04706 byl významně upregulován ve všech liniích a ve všech časových bodech s výjimkou Boregine 6 hpi (obr. 6c). V prvním časovém bodě (6 HPI) v čase 83A:476 byl silně indukován (10,5krát) a v ostatních liniích mírně zvýšen (6,6–7,5krát). Během experimentu zůstala exprese TanjilG_04706 na podobných úrovních u linií 83A:476 a Boregine, zatímco u linií Mandelup a populace 22660 se významně zvýšila a dosáhla relativně vysokých hodnot (5,9 ± 1,5 a 6,2 ± 1,5). Gen podobný endoglukan-1,3-β-glukosidáze TanjilG_23384 vykazoval vysokou aktivaci v prvních dvou časových bodech (6 a 12 hpi) ve všech liniích s výjimkou populace 22660 (obr. 6d). Nejvyšší relativní hladiny exprese TanjilG_23384 byly pozorovány ve druhém časovém bodě (12 hpi) u linií Mandelup (2,7 ± 0,3) a 83A:476 (1,5 ± 0,1). Při 24 HPI byla exprese TanjilG_23384 relativně nízká u všech studovaných linií (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profily exprese vybraných genů (ag) zjištěné kvantitativní PCR. Čísla 6, 12 a 24 představují hodiny po vakcinaci. Geny LanDExH7 a LanTUB6 byly použity pro normalizaci a LanTUB6 pro kalibraci mezi sériemi. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku na základě tří biologických replikátů, z nichž každý je průměrem tří technických replikátů. Statistická významnost rozdílů v hladinách exprese mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný v roce 1999 z lupinového pole ve Wierzenici v Polsku) a kontrolními (falešně inokulovanými) rostlinami je vyznačena nad datovými body (*hodnota P < 0,05, **hodnota P ≤ 0,01, ***hodnota P ≤ 0,001). Statistická významnost rozdílů v hladinách exprese mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný v roce 1999 z lupinového pole ve Wierzenici v Polsku) a kontrolními (falešně inokulovanými) rostlinami je vyznačena nad datovými body (*hodnota P < 0,05, **hodnota P ≤ 0,01, ***hodnota P ≤ 0,001). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулалировантными Col-08, Polsko v roce 1999 г. растениями отмечена над точками данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***0иенач)). Statisticky významné rozdíly v hladinách exprese mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný v roce 1999 z lupinového pole ve Wierzhenicech v Polsku) a kontrolními (fiktivně inokulovanými) rostlinami jsou uvedeny nad datovými body (*P-hodnota < 0,05, **P-hodnota ≤ 0,01, ***P-hodnota ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在*数捼0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001).接种 （colletotrichum lupini ， barva-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 寈照 空 株 －之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ ら01, 0,01, ***P Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrich,lup) полученный с полей люпина в Верженице, Польша, v roce 1999 г.) a контрольлными (лиожнинова растениями отмечены над точками данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-1значене ***P-1). Statisticky významné rozdíly v hladinách exprese mezi inokulovanými (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z lupinových polí ve Verzhenicech v Polsku v roce 1999) a kontrolními (fiktivně inokulovanými) rostlinami jsou uvedeny nad datovými body (*hodnota P < 0,05, **hodnota P ≤ 0,01, ***hodnota P ≤ 0,001).Analyzované linie NLL byly: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan), Boregine (rezistentní, neznámé genetické pozadí) a populace 22660 (náchylná).
Kandidátský gen TanjilG_05042 v lokusu Lanr1 vykazoval výrazně odlišný vzorec exprese od profilů získaných ze studií RNA-seq (obr. 6e). V populaci Mandelup a 22660 byla pozorována významná aktivace tohoto genu (až 39,7krát, respektive 11,7krát), což vedlo k relativně vysokým hladinám exprese (až 1,4 ± 0,14krát, respektive 7,2 ± 1,3krát). Studie 83A:476 také odhalila určitou zvýšenou regulaci genu TanjilG_05042 (až 3,8krát), avšak dosažené relativní hladiny exprese (0,044 ± 0,002) byly více než 30krát nižší než ty pozorované v populaci Mandelup a 22660. Analýza pomocí qPCR ukázala významné rozdíly v hladinách exprese mezi genotypy u kontrolních variant s dosažením 58násobného rozdílu mezi populacemi 22660 a 83A:476, stejně jako mezi populacemi 22660 a 22660. Mezi Boregine a Mandalup byl dosažen dvojnásobný rozdíl.
Kandidátský gen v lokusu AnMan, TanjilG_12861, byl aktivován v reakci na vakcinaci u kmenů 83A:476 a Mandelup, v populaci 22660 byl neutrální a u populace Boregine byl downregulován (obr. 6f). Relativní exprese genu TanjilG_12861 byla nejvyšší u inokulovaného kmenu 83A:476 (0,14 ± 0,01). Gen TanjilG_05080 HSP17.4 pro protein tepelného šoku třídy I o molekulové hmotnosti 17,4 kDa vykazoval nižší relativní hladiny exprese u všech studovaných kmenů a časových bodů (obr. 6g). Nejvyšší hodnota byla pozorována při 24 HPI u populace 22660 (0,14 ± 0,02, což představuje osminásobné zvýšení reakce na vakcinaci).
Porovnání profilů genové exprese (obr. 7) odhalilo vysokou korelaci mezi genem TanjilG_10657 a čtyřmi dalšími geny: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) a TanjilG_04706 (r = 0,79). Takové výsledky mohou naznačovat koregulaci těchto genů během obranných reakcí. Geny TanjilG_12861 a TanjilG_23384 vykazovaly odlišné profily exprese s nižšími hodnotami Pearsonova korelačního koeficientu (od 0,08 do 0,43, respektive -0,19 do 0,28) ve srovnání s jinými geny.
Korelace mezi profily genové exprese byly detekovány pomocí kvantitativní PCR. Byly analyzovány následující linie lupiny úzkolisté: 83A:476 (rezistentní, nesoucí homozygotní alelu Lanr1), Mandelup (středně rezistentní, nesoucí homozygotní alelu AnMan), Boregine (rezistentní, genetické pozadí neznámé) a populace 22660 (náchylná). Byly vypočítány tři časové body (6, 12 a 24 hodin po inokulaci), zahrnující inokulované (Colletotrichum lupini, kmen Col-08, získaný z lupinových polí ve Wierzhenicech v Polsku v roce 1999) a kontrolní (fiktivně inokulované) rostliny. Stupnice ukazuje hodnotu Pearsonova korelačního koeficientu.
Na základě dat získaných při výkonu 6 koňských sil na palec (6 koňských sil na palec) byla provedena WGCNA na 9981 DEG identifikovaných porovnáním inokulovaných a kontrolních rostlin se zaměřením na časné obranné reakce (doplňková tabulka S12). Bylo nalezeno dvacet dva genových modulů (shluků) s korelovanými (pozitivními nebo negativními) expresními profily mezi genotypy a experimentálními variantami. Hladiny genové exprese byly v průměru klesající v pořadí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (v obou variantách byl však tento trend silnější u kontrolních rostlin). Hladiny genové exprese byly v průměru klesající v pořadí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (v obou variantách byl však tento trend silnější u kontrolních rostlin). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (в овортаиханбатих однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Hladiny genové exprese se v průměru snižovaly v pořadí 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (v obou variantách byl však tento trend silnější u kontrolních rostlin).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660的顺序下降（然而，在两种变体中，这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populace 22 660 的 顺序 下降 （Ｇ 在 缈－ 在 缈Ｇ在 在 植物 中 更）。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (однатовахв эта тенденция была сильнее у контрольныh растений). Hladiny genové exprese se v průměru snížily v sérii 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populace 22660 (nicméně v obou variantách byl tento trend silnější u kontrolních rostlin).Vakcinace vedla ke zvýšení exprese genů, zejména v modulech 18, 19, 14, 6 a 1 (v sestupném pořadí podle účinku), k negativní regulaci (např. moduly 9 a 20) nebo k neutrálním účinkům (např. moduly 11, 22, 8 a 13). Analýza obohacení GO termínů (doplňková tabulka S13) odhalila „GO: 0006952 Protective Responses“ pro inokulovaný modul (18) s maximální aktivací, včetně genů analyzovaných pomocí qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 a TanjilG_27015), stejně jako mnoho inokulovaných nejvíce potlačených modulů fotosyntézy (9). Koncentrátor modulu 18 (obr. 8) byl identifikován jako gen TanjilG_26536 kódující protein LlR18B podobný PR-10 a koncentrátor modulu 9 byl identifikován jako gen TanjilG_28955 kódující protein fotosystému II PsbQ. Kandidátní gen rezistence na antraknózu Lanr1, TanjilG_05042, byl nalezen v modulu 22 (obr. 9) a je asociován s termíny „GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes“ a „GO:0006355 Transkripční regulace, DNA templating“ nesoucími hub TanjilG_01212. Gen kóduje transkripční faktor tepelného stresu A-4a (HSFA4a).
Vážená síťová analýza koexprese genů modulů s nadměrně zastoupenými termíny biologických procesů „GO: 0006952 Defense responses“. Ligace byla zjednodušena, aby se zvýraznily čtyři geny analyzované pomocí qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 a TanjilG_27015).
Vážená síťová analýza genové koexprese modulu s nadměrně zastoupeným termínem biologického procesu „GO: 0006355: Transkripční regulace, DNA templating“ a nesoucí kandidátní gen rezistence na antraknózu Lanr1 TanjilG_05042. Ligace byla zjednodušena pro izolaci genu TanjilG_05042 a centrálního genu TanjilG_01212.
Screening rezistence na antraknózu shromážděný v Austrálii ukázal, že většina časně vydaných kultivarů byla náchylná; Kalya, Coromup a Mandelup byly popsány jako středně rezistentní, zatímco Wonga, Tanjil a 83A:476 byly popsány jako vysoce rezistentní26,27,31. měly stejnou alelu rezistence, označenou Lanr1, a Coromup a Mandelup měly jinou alelu, označenou AnMan10, 26, 39, zatímco Kalya přenesla jinou alelu, Lanr2. Screening rezistence na antraknózu v Německu vedl k identifikaci rezistentní linie Bo7212 s kandidátní alelou jinou než Lanr1, označené LanrBo36.
Naše studie odhalila velmi nízkou frekvenci (přibližně 6 %) alely Lanr1 v testované zárodečné plazmě. Toto pozorování je v souladu s výsledky screeningu východoevropské zárodečné plazmy s použitím markerů Anseq3 a Anseq4, které ukázaly, že alela Lanr1 je přítomna pouze ve dvou běloruských liniích. To naznačuje, že alela Lanr1 není zatím široce využívána místními šlechtitelskými programy, na rozdíl od Austrálie, kde je jednou z klíčových alel pro šlechtění s asistencí markerů. To může být způsobeno nižší úrovní rezistence poskytované alelou Lanr1 v evropských polních podmínkách ve srovnání s australskou zprávou. Studie antraknózy v oblastech s vysokými srážkami v Austrálii navíc ukázaly, že reakce rezistence zprostředkované alelou Lanr1 nemusí být účinné v povětrnostních podmínkách, které podporují růst a rychlý rozvoj patogenu19,42. V této studii byly některé příznaky antraknózy pozorovány také u genotypů nesoucích alelu Lanr1, což naznačuje, že rezistence může za optimálních podmínek pro vývoj C. lupini vymizet. Kromě toho jsou možné falešně pozitivní interpretace přítomnosti markerů Anseq3 a Anseq4, které se nacházejí přibližně 1 cM od lokusu Lanr1, 28,30,43.
Naše studie ukázala, že 83A:476, nesoucí alelu Lanr1, reagoval na inokulaci C. lupini rozsáhlým přeprogramováním transkriptomu v prvním analyzovaném časovém bodě (6 hpi), zatímco u Mandelupa, nesoucího alelu AnMan, byly transkriptomické reakce pozorovány mnohem později (od 24 do 48 hp). Tyto časové variace v obranných reakcích jsou spojeny s rozdíly v příznacích onemocnění, což zdůrazňuje důležitost včasného rozpoznání patogenu pro úspěšnou reakci na rezistenci. Aby spory antraxu infikovaly rostlinnou tkáň, musí projít několika vývojovými stádii na povrchu hostitele, včetně klíčení, buněčného dělení a tvorby apresoria. Přívěsek je infekční struktura, která se připojuje k povrchu hostitele a usnadňuje pronikání do hostitelských tkání. Spory C. gloeosporioides v extraktu z hrachu tak vykazovaly první dělení jádra po 75–90 minutách inkubace, tvorbu zárodečné trubice po 90–120 minutách a potlačení po 4 hodinách 45. Mangový druh C. gloeosporioides vykazoval po 3 hodinách inkubace více než 40% klíčení konidií a po 4 hodinách tvorbu přibližně 20% apresorů. S virulencí asociovaný gen CAP20 z C. gloeosporioides vykazoval transkripční aktivitu v konidiích tvořících epifyty po 3,5 hodinách inkubace v povrchovém vosku avokáda s vysokými koncentracemi proteinu CAP20 po 4 hodinách 46 minutách. Podobně byla aktivita genů biosyntézy melaninu u C. trifolii indukována během 2hodinové inkubace s následnou tvorbou apresoria po 1 hodině. Studie listových tkání ukázaly, že jahody inokulované C. acutatum vykazují první potlačení po 8 hodinách po infekci, zatímco rajčata inokulovaná C. coccodes vykazují první potlačení po 4 hodinách po infekci48,49, což do značné míry odpovídá časovému měřítku infekčního procesu u druhu Colletotrichum. Rychlé obranné reakce na 83A:476 naznačují zapojení genů rostlinné rezistence a efektorem spouštěné imunity (ETI) v této linii, zatímco Mandelupovy opožděné reakce podporují hypotézu mikro-asociované molekulární strukturou spouštěné imunity (MTI) 50. Rané reakce na 83A: 476 a Mandelupa. Částečný překryv mezi up- nebo down-regulovanými geny v opožděné reakci také podporuje tento koncept, protože ETI je často považována za zrychlenou a zesílenou MTI reakci, která vrcholí programovanou buněčnou smrtí v místě infekce, známou jako anafylaktický šok 51,52.
Většina genů připisovaných nadměrně zastoupenému termínu Gene Ontology GO:0006952 „Obranná reakce“ je 11 homologů proteinu stresem indukovaného hladovění 22 (podobného SAM22) a sedmi hlavních proteinů podobných latexovým proteinům (MLP) 31, 34, 43 a 423 vykazovaly sekvenční podobnost. Geny podobné SAM22 vykazovaly významnou aktivaci, která trvala déle, a vykazovaly zvýšené hladiny rezistence na antraknózu (83A:476 a Boregine). Geny podobné MLP však byly downregulovány pouze v liniích nesoucích kandidátní alelu rezistence (83A:476/Lanr1 po 6 hpi a Mandelup/AnMan po 24 hpi). Je třeba poznamenat, že všechny identifikované homology podobné SAM22 pocházejí z genového shluku o délce přibližně 105 kb, zatímco geny podobné MLP pocházejí ze samostatných oblastí genomu. Koordinovaná aktivace takových genů podobných SAM22 byla také zjištěna v naší předchozí studii rezistence NLL k inokulaci Diaporthetoxica, což naznačuje, že se podílejí na horizontálních složkách obranné reakce. Tento závěr je také podpořen zprávami o pozitivní reakci genů podobných SAM22 na poškození nebo léčbu kyselinou salicylovou, induktory fungicidů nebo peroxidem vodíku.
Bylo prokázáno, že geny podobné MLP reagují na různé abiotické a biotické stresy, včetně bakteriálních, virových a patogenních plísňových infekcí u mnoha rostlinných druhů55. Směry reakce na určité interakce mezi rostlinami a patogeny se pohybovaly od silně rostoucího (tj. během napadení bavlny Verticillium dahliae) až po významně klesající (tj. po infekci jabloně druhem Alternaria)56,57. Významné snížení exprese genu podobného MLP 423 bylo pozorováno během obranyschopnosti avokáda vůči infekci F. niger a během infekce jabloně. Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola a Alternaria alternata jsou patotypy jabloní58,59. Kromě toho měly kalusy jabloně s nadměrnou expresí genu podobného MLP 423 nižší expresi genů asociovaných s rezistencí a byly náchylnější k plísňové infekci59. Po infekci Fusarium oxysporum f byl gen podobný MLP 423 potlačen také v rezistentní zárodečné plazmě fazolu obecného. cn. Fazolová infekce 60.
Dalšími členy rodiny PR-10 identifikovanými v naší studii RNA-seq byly geny LlR18A a LlR18B v reakci na upregulaci, stejně jako upregulovaný (1 gen) nebo downregulovaný (3 geny) gen pro protein pro přenos lipidů DIR1. WGCNA dále zdůrazňuje gen LlR18B jako centrum v tomto modulu, který je vysoce citlivý na vakcinaci a nese několik genů ochranné reakce. Geny LlR18A a LlR18B byly indukovány v listech žlutého lupinu v reakci na patogenní bakterie, stejně jako v stoncích NLL po inokulaci D. toxica, zatímco rýžový homolog těchto genů, RSOsPR10, byl rychle indukován houbovou infekcí pravděpodobně zapojenou do signální dráhy kyseliny jasmonové53,61,62. Gen DIR1 kóduje nespecifické proteiny pro transport lipidů, které jsou nezbytné pro nástup systémové získané rezistence (SAR). S rozvojem ochranných reakcí je protein DIR1 transportován z ložiska infekce přes floém a indukuje SAR ve vzdálených orgánech. Je zajímavé, že gen DIR1 TanjilG_02313 byl významně indukován v prvním časovém bodě v liniích 84A:476 a populaci 22660, ale rezistence na antraknózu se úspěšně vyvinula pouze v linii 84A:476. To může naznačovat určitou subfunkcionalizaci genu DIR1 u NLL, protože zbývající tři homology reagovaly na inokulaci pouze v linii 83A:476 v 6 hpi a tato reakce byla směrována směrem dolů.
V naší studii byly nejběžnějšími složkami odpovídajícími biologickému procesu nazývanému „GO:0055114 Redox process“ protein cytochromu P450, peroxidáza, 9S-/13S-lipoxygenáza kyseliny linolové a oxidáza kyseliny 1-aminocyklopropan-1-karboxylové. Naše WGCNA dále definuje homolog HSFA4a jako centrum nesoucí moduly, jako je například kandidátní gen rezistence Lanr1 TanjilG_05042. HSFA4a je součástí redoxně dependentní regulace jaderné transkripce v rostlinách.
Proteiny cytochromu P450 jsou oxidoreduktázy, které katalyzují NADPH a/nebo O2-dependentní hydroxylační reakce v primárním a sekundárním metabolismu, včetně metabolismu xenobiotik, stejně jako hormonů, mastných kyselin, sterolů, složek buněčné stěny, biopolymerů a biosyntézy ochranných sloučenin 69. V naší studii byla variabilita funkce rostlinného cytochromu P450 snížena z -10,6 log2 (násobná změna) na 5,7 v důsledku velkého počtu změněných homologů (37) a rozdílů ve vzorcích odpovědí mezi specifickými geny, což odráží revizi směrem nahoru. Použití pouze dat RNA-seq k objasnění předpokládané biologické funkce genů NLL v tak velké proteinové superrodině by bylo vysoce spekulativní. Stojí však za zmínku, že některé geny cytochromu P450 jsou spojeny se zvýšenou rezistencí vůči patogenním houbám nebo bakteriím, včetně příspěvku k alergickým reakcím 69,70,71.
Peroxidázy třídy III jsou multifunkční rostlinné enzymy zapojené do široké škály metabolických procesů během růstu a vývoje rostlin, stejně jako v reakci na environmentální stresy, jako je slanost, sucho, vysoká intenzita světla a napadení patogeny72. Peroxidázy se podílejí na interakci několika rostlinných druhů s anthracis, včetně Stylosanthes humilis a C. gloeosporioides, Lens culinaris a C. truncatum, Phaseolus vulgaris a C. lindemuthianum, Cucumis sativus a C. lagenarium73,74,75,76. Reakce je velmi rychlá, někdy dokonce již při 4 HPI, než houba pronikne do rostlinné tkáně73. Gen peroxidázy také reagoval na inokulaci D. toxica NLL. Kromě svých typických funkcí, kterými jsou regulace oxidačního vzplanutí nebo eliminace oxidačního stresu, mohou peroxidázy interferovat s růstem patogenů vytvářením fyzikálních bariér založených na zesílení buněčné stěny během lignifikace, podjednotek nebo zesíťování specifických sloučenin. Tuto funkci lze in silico připsat genu TanjilG_03329 kódujícímu předpokládanou lignin tvořící aniontovou peroxidázu, která byla v naší studii významně upregulována u rezistentní linie 83A:476 při 6 HPI, ale ne u jiných kmenů a časových bodů, které nereagovaly.
9S-/13S-lipoxygenáza kyseliny linolové je prvním krokem v oxidační dráze biosyntézy lipidů78. Produkty této dráhy mají v obraně rostlin mnoho funkcí, včetně posilování buněčné stěny tvorbou usazenin kalózy a pektinu a regulace oxidačního stresu produkcí reaktivních forem kyslíku79,80,81,82,83. V této studii byla exprese 9S-/13S-lipoxygenázy kyseliny linolové změněna u všech kmenů, ale u vnímavé populace 22660 převládala v různých časových bodech zvýšená regulace, zatímco u kmenů nesoucích rezistentní gen Lanr1 a alelu AnMan zdůrazňuje diverzifikaci oxylipinové vrstvy v ochranných reakcích antraxu mezi těmito genotypy.
Homolog 1-aminocyklopropan-1-karboxylátoxidázy (ACO) byl významně upregulován (9 genů) nebo downregulován (2 geny) při inokulaci lupinou. S dvěma výjimkami se všechny tyto reakce vyskytly při 6 hp v čase 83A:476. Enzymatická reakce zprostředkovaná proteiny ACO je krokem limitujícím rychlost produkce ethylenu, a proto je vysoce regulovaná84. Ethylen je rostlinný hormon, který hraje řadu rolí v regulaci vývoje rostlin a reakce na abiotické a biotické stresové podmínky. Indukce transkripce ACO a aktivace signální dráhy ethylenu se podílejí na zvýšení rezistence rýže vůči hemibiotrofní houbě oryzae oryzae regulací produkce reaktivních forem kyslíku a fytoalexinů. Velmi podobný proces infekce listů zjištěný u M. oryzae a C. lupini88,89, na pozadí významné zvýšené exprese homologů ACO v linii 83A:476 popsané v této studii, posouvá možnost udělení rezistence vůči NLL antraknóze ethylenu jakožto centrálního signálního kroku v molekulárních drahách.
V předkládané studii bylo u populace 83A:476 pozorováno rozsáhlé potlačení mnoha genů spojených s fotosyntézou v době 6 hpi a u populace Mandeloop a 22660 v době 48 hpi. Rozsah a progrese těchto změn je úměrná úrovni. V tomto experimentu byla pozorována rezistence na antraknózu. Nedávno byla u několika modelů interakcí rostlin a patogenů, včetně patogenních bakterií a hub, hlášena silná a časná represe transkriptů souvisejících s fotosyntézou. Spěch (od 2 HPI v některých interakcích) a globální potlačení genů spojených s fotosyntézou v reakci na infekci může spustit imunitu rostlin na základě nasazení reaktivních forem kyslíku a jejich interakce s dráhou kyseliny salicylové za účelem zprostředkování alergických reakcí 90,94.
Závěrem lze říci, že mechanismy obranné reakce navržené pro nejodolnější linii (83A:476) zahrnují rychlé rozpoznání patogenu genem R (pravděpodobně TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) a signalizaci kyseliny salicylové a ethylenu zprostředkovanou alergickou reakcí, následovanou zavedením dlouhodobé SAR. Účinek je podporován proteinem DIR-1. Je třeba poznamenat, že biotrofické období infekce C. lupini je velmi krátké (přibližně 2 dny), následované nekrotickým růstem95. Přechod mezi těmito fázemi může být spojen s nekrózou a expresí ethylenem indukovatelných proteinů, které působí jako spouštěče hypersenzitivních reakcí v hostitelských rostlinách. Časové okno pro úspěšné zachycení C. lupini v biotrofickém stádiu je proto velmi úzké. Přeprogramování genů spojených s redoxem a fotosyntézou pozorované v 83A:476 po 6 hodinách po zániku je v souladu s progresí houbových hyf a předznamenává rozvoj úspěšné ochranné reakce v biotrofickém stádiu. Transkriptomické reakce Mandelupovy populace a populace 22660 mohou být příliš zpožděné na to, aby zachytily houbu před přechodem k nekrotickému růstu, nicméně Mandelup může být účinnější než populace 22660, protože relativně rychlá regulace proteinu PR-10 podporuje horizontální rezistenci.
ETI, řízená kanonickým genem R, se zdá být běžným mechanismem rezistence fazolí vůči antraknóze. U modelové luštěniny Medicago truncatula je tedy rezistence vůči antraknóze propůjčena genem RCT1, který patří do třídy rostlinných genů R TIR-NBS-LRR97. Tento gen také propůjčuje širokospektrální rezistenci vůči antraknóze u vojtěšky, pokud je přenesen na náchylné rostliny. U fazole obecné (P. vulgaris) bylo dosud identifikováno více než dvacet genů rezistence vůči antraknóze. Některé z těchto genů se nacházejí v oblastech, které postrádají jakékoli kanonické geny R, nicméně mnoho dalších se nachází na okrajích chromozomů nesoucích genový shluk NBS-LRR, včetně TIR-NBS-LRRs99. Studie SSR v celém genomu také potvrdila asociaci genu NBS-LRR s rezistencí vůči antraknóze u fazole obecné. Kanonický gen R byl také nalezen v genomové oblasti nesoucí hlavní lokus rezistence vůči antraknóze u bílé lupiny 101.
Naše práce ukazuje, že okamžitá rezistence, aktivovaná v rané fázi infekce rostlin (nejlépe nejpozději do 12 hodin po infekci), účinně chrání lupinu úzkolistou před antraknózou způsobenou patogenní houbou Collelotrichum lupini. Pomocí vysokorychlostního sekvenování jsme demonstrovali diferenciální expresní profily genů rezistence na antraknózu u rostlin s novorozeneckou linií (NLL), zprostředkované geny rezistence Lanr1 a AnMan. Úspěšná obrana zahrnuje pečlivé navržení genů pro proteiny zapojené do redoxu, fotosyntézy a patogeneze během několika hodin od prvního kontaktu rostliny s patogenem. Podobné ochranné reakce, ale časově zpožděné, jsou mnohem méně účinné při ochraně rostlin před chorobami. Rezistence na antrax zprostředkovaná genem Lanr1 se podobá typické rychlé reakci genu R (efektorem spouštěná imunita), zatímco gen AnMan s největší pravděpodobností poskytuje horizontální reakci (imunita spouštěná molekulárním vzorcem asociovaným s mikrobem) a poskytuje tak střední úroveň udržitelnosti.
215 linií NLL použitých ke screeningu markerů antraknózy se skládalo ze 74 kultivarů, 60 linií získaných křížením nebo šlechtěním, 5 mutantů a 76 divokých nebo původních zárodečných plazm. Linie pocházely ze 17 zemí, zejména z Polska (58), Španělska (47), Německa (27), Austrálie (26), Ruska (19), Běloruska (7), Itálie (5) a další linie z 10 zemí. Soubor také zahrnuje referenční rezistentní linie: 83A:476, Tanjil, Wonga nesoucí alelu Lanr1 a Mandelup nesoucí alelu AnMan. Linie byly získány z Evropské databáze genetických zdrojů lupiny, kterou spravuje společnost Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polsko (doplňková tabulka S1).
Rostliny byly pěstovány za kontrolovaných podmínek (fotoperioda 16 hodin, teplota 25 °C přes den a 18 °C v noci). Byly analyzovány dva biologické replikáty. DNA byla izolována z tři týdny starých listů pomocí sady DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) dle protokolu. Kvalita a koncentrace izolované DNA byla hodnocena spektrofotometrickými metodami (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Byl analyzován marker AnManM1 označující gen rezistence na antraknózu AnMan (odvozený z odrůdy Mandelup) a markery Anseq3 a Anseq4 lemující gen Lanr1 (odvozený z odrůdy Tanjil) 11,26,28. Homozygoti pro rezistentní alelu byli hodnoceni jako „1“, náchylní jako „0“ a heterozygoti jako 0,5.
Na základě výsledků screeningu markerů AnManM1, AnSeq3 a AnSeq4 a dostupnosti semen pro závěrečné následné experimenty bylo vybráno 50 linií NLL pro fenotypizaci rezistence na antraknózu. Analýza byla provedena duplicitně v počítačem řízeném skleníku se 14hodinovou fotoperiodou s teplotním rozmezím 22 °C během dne a 19 °C v noci. Semena jsou před setím seškrábána (odříznutí semenného obalu na opačné straně embrya ostrou čepelí), aby se zabránilo dormanci semen v důsledku příliš tvrdého semenného obalu a aby se zajistilo rovnoměrné klíčení. Rostliny byly pěstovány v květináčích (11 × 11 × 21 cm) se sterilní zeminou (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Polsko). Inokulace byla provedena kmenem Colletotrichum lupini Col-08, vypěstovaným v roce 1999 ze stonků úzkolistých rostlin lupiny pěstovaných na poli ve Verženici ve Velkopolsku (52° 27′ 42″ s. š. 17° 04′ 05″ v. d.). Vybraná oblast. Izoláty byly kultivovány v médiu SNA při 20 °C za černého světla po dobu 21 dnů k indukci sporulace. Čtyři týdny po setí, když rostliny dosáhly stádia 4-6 listů, byla provedena inokulace postřikem suspenzí konidií v koncentraci 0,5 x 10⁶ konidií na ml. Po inokulaci byly rostliny uchovávány 24 hodin ve tmě při vlhkosti asi 98 % a teplotě 25 °C, aby se usnadnilo klíčení konidií a proces infekce. Rostliny byly poté pěstovány za 14hodinové fotoperiody při teplotě 22 °C ve dne a 19 °C v noci a 70% vlhkosti. Skóre onemocnění bylo stanoveno 22 dní po inokulaci a pohybovalo se od 0 (imunní) do 9 (velmi náchylné) v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti nekrotických lézí na stoncích a listech. Kromě toho byla po zaznamenání změřena hmotnost rostlin. Vztahy mezi genotypy markerů a fenotypy onemocnění byly vypočítány jako bodové dvousekvenční korelace (absence heterozygotních markerů v sadě linií pro analýzu fenotypu rezistence na antraknózu).