Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig ar gyfer CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n diffodd y modd cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae morffogenesis perfedd dynol yn sefydlu nodweddion crypt-filws o ficrobensaernïaeth epithelaidd 3D a threfniadaeth ofodol. Mae angen y strwythur unigryw hwn i gynnal homeostasis y perfedd trwy amddiffyn y gilfach celloedd bonyn yn y crypt gwaelodol rhag antigenau microbaidd alldarddol a'u metabolion. Yn ogystal, mae fili berfeddol a mwcws secretiedig yn cyflwyno celloedd epithelaidd gwahaniaethol swyddogaethol gyda rhwystr amddiffynnol ar wyneb mwcosaidd y berfeddol. Felly, mae ail-greu strwythurau epithelaidd 3D yn hanfodol ar gyfer adeiladu modelau perfedd in vitro. Yn nodedig, gall y perfedd mimetig organig ar sglodion ysgogi morffogenesis 3D digymell o'r epitheliwm berfeddol gyda swyddogaethau ffisiolegol a biomecaneg gwell. Yma, rydym yn darparu protocol atgynhyrchadwy i ysgogi morffogenesis berfeddol yn gadarn yn y perfedd ar sglodion microfluidig ​​yn ogystal ag mewn sglodion hybrid wedi'i fewnosod yn Transwell. Rydym yn disgrifio dulliau manwl ar gyfer cynhyrchu dyfeisiau, meithrin celloedd epithelaidd organoid Caco-2 neu berfeddol mewn lleoliadau confensiynol yn ogystal ag ar blatfform microfluidig, ysgogi morffogenesis 3D, a nodweddu. o epithelia 3D sefydledig gan ddefnyddio dulliau delweddu lluosog. Mae'r protocol hwn yn cyflawni adfywio microbensaernïaeth y coluddyn swyddogaethol trwy reoli llif hylif basolateral am 5 diwrnod. Mae ein dull morffogenesis in vitro yn defnyddio straen cneifio a symudiad mecanyddol perthnasol yn ffisiolegol ac nid oes angen peirianneg na thrin celloedd cymhleth, a allai ragori ar dechnegau eraill sy'n bodoli eisoes. Rydym yn rhagweld y gallai ein protocol arfaethedig gael goblygiadau eang i'r gymuned ymchwil biofeddygol, gan ddarparu dull i adfywio haenau epitheliwm berfeddol 3D in vitro ar gyfer cymwysiadau biofeddygol, clinigol a fferyllol.
Mae arbrofion yn dangos y gall celloedd Caco-2 epithelaidd berfeddol sy'n cael eu meithrin mewn dyfeisiau microfluidig ​​perfedd-ar-sglodion1,2,3,4,5 neu ddwyhaen6,7 fynd trwy forffogenesis 3D digymell in vitro heb ddealltwriaeth glir o'r mecanwaith sylfaenol. Yn ein hastudiaeth ddiweddar, gwelsom fod tynnu gwrthwynebwyr morffogen a secretir yn basolateral o ddyfeisiau diwylliant yn angenrheidiol ac yn ddigonol i ysgogi morffogenesis epithelaidd 3D in vitro, a ddangoswyd gan Caco-2 ac organoidau berfeddol sy'n deillio o gleifion. Dilyswyd celloedd epithelaidd. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ganolbwyntio'n benodol ar gynhyrchu celloedd a dosbarthiad crynodiad gwrthwynebydd Wnt cryf, Dickkopf-1 (DKK-1), mewn dyfeisiau perfedd-ar-sglodion a dyfeisiau microfluidig ​​wedi'u haddasu sy'n cynnwys mewnosodiadau Transwell, o'r enw "Sglodion Hybrid". Rydym yn dangos bod ychwanegu gwrthwynebwyr Wnt alldarddol (megis DKK-1, atalydd Wnt 1, protein cysylltiedig â frizzled secretedig 1, neu Soggy-1) i'r perfedd ar y sglodion yn atal morffogenesis neu'n tarfu ar yr haen epithelaidd 3D wedi'i rhagstrwythuro, gan awgrymu mai straen gwrthwynebol yn ystod diwylliant sy'n gyfrifol am forffogenesis berfeddol in vitro. Felly, dull ymarferol o gyflawni morffogenesis cadarn ar y rhyngwyneb epithelaidd yw tynnu neu gynnal lefelau gwrthwynebwyr Wnt yn yr adran basolateral i'r lleiafswm trwy fflysio gweithredol (e.e., mewn llwyfannau perfedd-ar-sglodion neu hybrid-ar-sglodion) neu drylediad. Cyfryngau basolateral (e.e., o fewnosodiadau Transwell i gronfeydd basolateral mawr yn ffynhonnau).
Yn y protocol hwn, rydym yn darparu dull manwl ar gyfer cynhyrchu microddyfeisiau perfedd-ar-sglodion a sglodion hybrid y gellir eu mewnosod yn Transwell (camau 1-5) i feithrin celloedd epithelaidd berfeddol ar bilenni mandyllog sy'n seiliedig ar polydimethylsiloxane (PDMS) (camau 6A, 7A, 8, 9) neu bilenni polyester o fewnosodiadau Transwell (camau 6B, 7B, 8, 9) ac ysgogi morffogenesis 3D in vitro (cam 10). Fe wnaethom hefyd nodi nodweddion cellog a moleciwlaidd sy'n dynodi histogenesis penodol i feinwe a gwahaniaethu cellog sy'n ddibynnol ar linach trwy gymhwyso dulliau delweddu lluosog (camau 11-24). Rydym yn ysgogi morffogenesis gan ddefnyddio celloedd epithelaidd berfeddol dynol, fel Caco-2 neu organoidau berfeddol, mewn dau fformat diwylliant gyda manylion technegol gan gynnwys addasu arwyneb bilenni mandyllog, creu monolayers 2D, ac atgynhyrchu biocemegol berfeddol ac atgynhyrchu'r microamgylchedd biofecanyddol in vitro. I ysgogi morffogenesis 3D o monolayers epithelaidd 2D, fe wnaethom dynnu morffogen. gwrthwynebwyr yn y ddau ffurf ddiwylliedig trwy lifo'r cyfrwng i mewn i adran basolateral y diwylliant. Yn olaf, rydym yn darparu cynrychiolaeth o ddefnyddioldeb haen epithelaidd 3D y gellir ei hadfywio y gellir ei defnyddio i fodelu twf epithelaidd sy'n ddibynnol ar forffoneg, cyd-ddiwylliannau microbiom gwesteiwr hydredol, haint pathogen, anaf llidiol, camweithrediad rhwystr epithelaidd, a therapïau sy'n seiliedig ar brobiotigau Enghraifft.dylanwadau.
Gall ein protocol fod yn ddefnyddiol i ystod eang o wyddonwyr mewn ymchwil sylfaenol (e.e. bioleg mwcosaidd y berfedd, bioleg celloedd bonyn, a bioleg ddatblygiadol) ac ymchwil gymhwysol (e.e. profi cyffuriau cyn-glinigol, modelu clefydau, peirianneg meinwe, a gastroenteroleg) effaith eang. Oherwydd atgynhyrchadwyedd a chadernid ein protocol i ysgogi morffogenesis 3D yr epitheliwm berfeddol in vitro, rydym yn rhagweld y gellir lledaenu ein strategaeth dechnegol i gynulleidfaoedd sy'n astudio dynameg signalau celloedd yn ystod datblygiad, adfywio neu homeostasis y berfedd. Yn ogystal, mae ein protocol yn ddefnyddiol ar gyfer holi haint o dan amrywiol asiantau heintus fel Norovirus 8, Coronafeirws Syndrom Anadlol Acíwt Difrifol 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 neu Vibrio cholerae. Mae cynulleidfaoedd patholeg a pathogenesis clefydau hefyd yn ddefnyddiol. Gall defnyddio system microffisioleg perfedd ar sglodion ganiatáu cyd-ddiwylliant hydredol 10 ac asesiad dilynol o amddiffyniad y gwesteiwr, ymatebion imiwnedd ac atgyweirio anafiadau sy'n gysylltiedig â phathogenau yn y llwybr gastroberfeddol (GI) 11. Gellir efelychu anhwylderau GI eraill sy'n gysylltiedig â syndrom perfedd gollyngol, clefyd coeliag, clefyd Crohn, colitis briwiol, pouchitis, neu syndrom coluddyn llidus pan baratoir haenau epithelaidd berfeddol 3D gan ddefnyddio haenau epithelaidd berfeddol 3D y claf, mae'r clefydau hyn yn cynnwys atroffi filws, byrhau'r crypt, difrod mwcosaidd, neu rwystr epithelaidd amhariad. Organoidau berfeddol sy'n deillio o gelloedd bonyn neu biopsi 12,13. Er mwyn modelu cymhlethdod uwch amgylchedd y clefyd yn well, gall darllenwyr ystyried ychwanegu mathau o gelloedd sy'n berthnasol i'r clefyd, fel celloedd mononiwclear gwaed ymylol cleifion (PBMCs), at fodelau sy'n cynnwys microbenseiri filws-crypt berfeddol 3D. celloedd imiwnedd penodol i feinwe, 5.
Gan y gellir gosod a delweddu microstrwythur epithelaidd 3D heb y broses adrannu, efallai y bydd gwylwyr sy'n gweithio ar drawsgrifiadeg gofodol a delweddu cydraniad uchel neu uwch-gydraniad â diddordeb yn ein mapio o ddeinameg gofod-amserol genynnau a phroteinau ar gilfachau epithelaidd. Â diddordeb mewn technoleg. Ymateb i ysgogiadau microbaidd neu imiwnedd. Ar ben hynny, gellir sefydlu croestalk hydredol gwesteiwr-microbiom 10, 14 sy'n cydlynu homeostasis y coluddyn yn yr haen mwcosaidd berfeddol 3D trwy gyd-ddiwyllio amrywiol rywogaethau microbaidd, cymunedau microbaidd neu ficrobiota fecal, yn enwedig yn y coluddyn-ar-sglodion. yn y platfform. Mae'r dull hwn yn arbennig o ddeniadol i gynulleidfaoedd sy'n astudio imiwnoleg mwcosaidd, gastroenteroleg, microbiom dynol, culturomeg a microbioleg glinigol sy'n ceisio meithrin microbiota perfedd nas diwylliwyd o'r blaen yn y labordy. Os gellir addasu ein protocol morffogenesis in vitro i fformatau diwylliant graddadwy, fel mewnosodiadau aml-ffynnon mewn platiau 24, 96 neu 384 ffynnon sy'n ailgyflenwi adrannau basolateral yn barhaus, gellir lledaenu'r protocol hefyd i'r rhai sy'n datblygu llwyfannau sgrinio neu ddilysu fferyllol, biofeddygol neu drwybwn uchel ar gyfer y diwydiant bwyd. Fel prawf-o-egwyddor, dangoswyd yn ddiweddar hyfywedd system morffogenesis trwybwn uchel amlblecs y gellir ei graddio i fformat plât 24-ffynnon. Yn ogystal, mae cynhyrchion organ-ar-sglodion lluosog wedi'u masnacheiddio16,17,18. Felly, gellir cyflymu dilysu ein dull morffogenesis in vitro a'i fabwysiadu o bosibl gan lawer o labordai ymchwil, diwydiant neu asiantaethau llywodraeth a rheoleiddio i ddeall ailraglennu cellog morffogenesis perfedd in vitro ar y lefel drawsgrifiadomig i brofi cyffuriau neu fiotherapiwteg. Yr amsugno a aseswyd cludo ymgeiswyr cyffuriau gan ddefnyddio dirprwyon perfedd 3D neu ddefnyddio modelau organ-ar-sglodion wedi'u teilwra neu fasnachol i asesu atgynhyrchadwyedd y broses morffogenesis perfedd.
Defnyddiwyd nifer gyfyngedig o fodelau arbrofol perthnasol i bobl i astudio morffogenesis epithelaidd berfeddol, yn bennaf oherwydd diffyg protocolau y gellir eu gweithredu i ysgogi morffogenesis 3D in vitro. Mewn gwirionedd, mae llawer o'r wybodaeth gyfredol am forffogenesis perfeddol yn seiliedig ar astudiaethau anifeiliaid (e.e., pysgod sebra20, llygod21 neu ieir22). Fodd bynnag, maent yn llafur-ddwys a chost-ddwys, gallant fod yn amheus yn foesegol, ac yn bwysicaf oll, nid ydynt yn pennu prosesau datblygiadol dynol yn union. Mae'r modelau hyn hefyd yn gyfyngedig iawn yn eu gallu i gael eu profi mewn modd graddadwy aml-ffordd. Felly, mae ein protocol ar gyfer adfywio strwythurau meinwe 3D in vitro yn perfformio'n well na modelau anifeiliaid in vivo yn ogystal â modelau diwylliant celloedd 2D statig traddodiadol eraill. Fel y disgrifiwyd yn flaenorol, roedd defnyddio strwythurau epithelaidd 3D yn caniatáu inni archwilio lleoliad gofodol celloedd gwahaniaethol yn echelin y crypt-filws mewn ymateb i amrywiol ysgogiadau mwcosaidd neu imiwnedd. Gall haenau epithelaidd 3D ddarparu lle i astudio sut mae celloedd microbaidd yn cystadlu i ffurfio cilfachau gofodol ac esblygiad ecolegol mewn ymateb i ffactorau gwesteiwr (e.e., haenau mwcws mewnol yn erbyn haenau allanol, secretiad o IgA a pheptidau gwrthficrobaidd). Ar ben hynny, gall morffoleg epithelaidd 3D ein galluogi i ddeall sut mae microbiota'r perfedd yn strwythuro ei gymunedau ac yn cynhyrchu metabolion microbaidd yn synergaidd (e.e., asidau brasterog cadwyn fer) sy'n siapio trefniadaeth gellog a chilfachau celloedd bonyn yn y cryptau gwaelodol. Dim ond pan sefydlir haenau epithelaidd 3D in vitro y gellir dangos y nodweddion hyn.
Yn ogystal â'n dull ni o greu strwythurau epithelaidd berfeddol 3D, mae yna sawl dull in vitro. Mae diwylliant organoid berfeddol yn dechneg peirianneg meinwe o'r radd flaenaf sy'n seiliedig ar feithrin celloedd bonyn berfeddol o dan amodau morffogen penodol23,24,25.Fodd bynnag, mae defnyddio modelau organoid 3D ar gyfer dadansoddi cludiant neu gyd-ddiwylliannau microbiom gwesteiwr yn aml yn heriol oherwydd bod lumen y berfeddol wedi'i amgáu o fewn yr organoid ac, felly, mae cyflwyno cydrannau luminal fel celloedd microbaidd neu antigenau alldarddol yn gyfyngedig. Gellir gwella mynediad at lumenau organoid gan ddefnyddio microchwistrellwr,26,27 ond mae'r dull hwn yn ymledol ac yn llafurddwys ac mae angen gwybodaeth arbenigol i'w berfformio.Ar ben hynny, nid yw diwylliannau organoid traddodiadol a gynhelir mewn sgaffaldiau hydrogel o dan amodau statig yn adlewyrchu biomecaneg weithredol in vivo yn gywir.
Mae dulliau eraill a ddefnyddir gan sawl grŵp ymchwil yn defnyddio sgaffaldiau hydrogel 3D wedi'u strwythuro ymlaen llaw i efelychu strwythur epithelaidd y coluddyn trwy feithrin celloedd berfeddol dynol ynysig ar wyneb y gel. Creu sgaffaldiau hydrogel gan ddefnyddio mowldiau wedi'u hargraffu'n 3D, wedi'u micro-felino, neu wedi'u cynhyrchu'n lithograffig. Mae'r dull hwn yn dangos y trefniant hunan-drefnus o gelloedd epithelaidd ynysig in vitro gyda graddiannau morffogen perthnasol yn ffisiolegol, gan sefydlu strwythur epithelaidd cymhareb agwedd uchel a chroestalc stroma-epitheliaidd trwy gynnwys celloedd stromal yn y sgaffald. Fodd bynnag, gall natur sgaffaldiau wedi'u strwythuro ymlaen llaw atal arddangos y broses morffogenetig ddigymell ei hun. Nid yw'r modelau hyn chwaith yn darparu llif luminal na rhyngrstitial deinamig, gan fod heb y straen cneifio hylif sydd ei angen ar gelloedd berfeddol i gael morffogenesis ac ennill swyddogaeth ffisiolegol. Defnyddiodd astudiaeth ddiweddar arall sgaffaldiau hydrogel mewn platfform microfluidig ​​a strwythurau epithelaidd berfeddol patrymog gan ddefnyddio technegau ysgythru laser. Mae organoidau berfeddol llygoden yn dilyn patrymau wedi'u hysgythru i ffurfio strwythurau tiwbaidd berfeddol, a gellir ailadrodd llif hylif intraluminal gan ddefnyddio a modiwl microfluideg. Fodd bynnag, nid yw'r model hwn yn arddangos prosesau morffogenetig digymell nac yn cynnwys symudiadau mecanobiolegol y coluddyn. Roedd technegau argraffu 3D o'r un grŵp yn gallu creu tiwbiau coluddyn bach gyda phrosesau morffogenetig digymell. Er gwaethaf y gwaith cymhleth o wneuthuriad gwahanol segmentau coluddyn o fewn y tiwb, mae'r model hwn hefyd yn brin o lif hylif luminal ac anffurfiad mecanyddol. Yn ogystal, gall gweithrediad y model fod yn gyfyngedig, yn enwedig ar ôl i'r broses bioargraffu gael ei chwblhau, gan aflonyddu ar amodau arbrofol neu ryngweithiadau cell-i-gell. Yn lle hynny, mae ein protocol arfaethedig yn darparu morffogenesis coluddyn digymell, straen cneifio sy'n berthnasol yn ffisiolegol, biomecaneg sy'n dynwared symudedd y coluddyn, hygyrchedd adrannau apical a basolateral annibynnol, ac ail-greu microamgylcheddau biolegol cymhleth o fodiwlaredd. Felly, gall ein protocol morffogenesis 3D in vitro ddarparu dull cyflenwol i oresgyn heriau dulliau presennol.
Mae ein protocol yn canolbwyntio'n llwyr ar forffogenesis epithelaidd 3D, gyda chelloedd epithelaidd yn unig mewn diwylliant a dim mathau eraill o gelloedd cyfagos fel celloedd mesenchymal, celloedd endothelaidd, a chelloedd imiwnedd. Fel y disgrifiwyd yn flaenorol, craidd ein protocol yw ysgogi morffogenesis epithelaidd trwy gael gwared ar atalyddion morphogen sy'n cael eu secretu ar ochr basolateral y cyfrwng a gyflwynwyd. Er bod modiwlaiddrwydd cadarn ein perfedd-ar-sglodion a'n hybrid-ar-sglodion yn caniatáu inni ail-greu'r haen epithelaidd 3D tonnog, mae cymhlethdodau biolegol ychwanegol fel rhyngweithiadau epithelaidd-mesenchymal33,34, dyddodiad Matrics allgellog (ECM)35 ac, yn ein model, nodweddion crypt-filus sy'n cyfleu cilfachau celloedd bonyn mewn cryptau gwaelodol yn parhau i gael eu hystyried ymhellach. Mae celloedd stromal (e.e., ffibroblastau) yn y mesenchym yn chwarae rhan allweddol wrth gynhyrchu proteinau ECM a rheoleiddio morffogenesis berfeddol in vivo35,37,38. Ychwanegu celloedd mesenchymal i'n model ni wella'r broses forffogenetig ac effeithlonrwydd ymlyniad celloedd. Mae'r haen endothelaidd (h.y., capilarïau neu lymffatigau) yn chwarae rhan bwysig wrth reoleiddio cludiant moleciwlaidd39 a recriwtio celloedd imiwnedd40 yn y microamgylchedd perfedd. Ar ben hynny, mae cydrannau fasgwlaidd y gellir eu cysylltu rhwng modelau meinwe yn rhagofyniad pan fydd modelau meinwe wedi'u cynllunio i ddangos rhyngweithiadau aml-organ. Felly, efallai y bydd angen cynnwys celloedd endothelaidd i fodelu nodweddion ffisiolegol mwy cywir gyda datrysiad ar lefel organ. Mae celloedd imiwnedd sy'n deillio o gleifion hefyd yn hanfodol ar gyfer arddangos ymatebion imiwnedd cynhenid, cyflwyniad antigen, croestalk imiwnedd addasol cynhenid, ac imiwnedd penodol i feinwe yng nghyd-destun dynwared clefyd berfeddol.
Mae defnyddio sglodion hybrid yn symlach na choluddion-ar-sglodyn oherwydd bod gosod y ddyfais yn symlach ac mae defnyddio mewnosodiadau Transwell yn caniatáu diwylliant graddadwy o epitheliwm y coluddyn. Fodd bynnag, nid yw mewnosodiadau Transwell sydd ar gael yn fasnachol gyda philenni polyester yn elastig ac ni allant efelychu symudiadau tebyg i beristaltig. Ar ben hynny, arhosodd adran apical y mewnosodiad Transwell a osodwyd yn y sglodion hybrid yn llonydd heb unrhyw straen cneifio ar yr ochr apical. Yn amlwg, anaml y mae'r priodweddau statig yn yr adran apical yn galluogi cyd-ddiwylliant bacteriol hirdymor mewn sglodion hybrid. Er y gallwn ysgogi morffogenesis 3D yn gadarn mewn mewnosodiadau Transwell wrth ddefnyddio sglodion hybrid, gall y prinder biomecaneg sy'n berthnasol yn ffisiolegol a llif hylif apical gyfyngu ar hyfywedd llwyfannau sglodion hybrid ar gyfer cymwysiadau posibl.
Nid yw adluniadau graddfa lawn o echelin y crypt-filws dynol mewn diwylliannau perfedd-ar-sglodion a hybrid-ar-sglodion wedi'u sefydlu'n llawn. Gan fod morffogenesis yn dechrau o monohaen epithelaidd, nid yw microbensaernïaeth 3D o reidrwydd yn darparu tebygrwydd morffolegol i cryptau in vivo. Er i ni nodweddu'r boblogaeth celloedd sy'n lluosogi ger parth y crypt sylfaenol yn yr epitheliwm 3D wedi'i ficro-beiriannu, nid oedd y rhanbarthau crypt a filws wedi'u diffinio'n glir. Er bod sianeli uchaf uwch ar y sglodion yn arwain at uchder cynyddol yr epitheliwm wedi'i ficro-beiriannu, mae'r uchder mwyaf yn dal i fod yn gyfyngedig i ~300–400 µm. Mae dyfnder gwirioneddol cryptau berfeddol dynol yn y coluddyn bach a mawr yn ~135 µm a ~400 µm, yn y drefn honno, ac uchder y fili berfeddol bach yw ~600 µm41.
O safbwynt delweddu, gall delweddu uwch-gydraniad in situ o ficrobensaernïaethau 3D fod yn gyfyngedig i'r coluddyn ar sglodion, gan fod y pellter gweithio gofynnol o'r lens amcan i'r haen epithelaidd tua ychydig filimetrau. I oresgyn y broblem hon, efallai y bydd angen amcan pell. Ar ben hynny, mae gwneud adrannau tenau ar gyfer paratoi sbesimen delweddu yn heriol oherwydd hydwythedd uchel PDMS. Ar ben hynny, gan fod microffabrigo haen wrth haen y coluddyn ar sglodion yn cynnwys adlyniad parhaol rhwng pob haen, mae'n hynod heriol agor neu dynnu'r haen uchaf i archwilio strwythur wyneb yr haen epithelaidd. Er enghraifft, trwy ddefnyddio microsgop electron sganio (SEM).
Mae hydroffobigrwydd PDMS wedi bod yn ffactor cyfyngol mewn astudiaethau microfluidig ​​sy'n delio â moleciwlau bach hydroffobig, gan y gall PDMS amsugno moleciwlau hydroffobig o'r fath yn anbenodol. Gellir ystyried dewisiadau amgen i PDMS gyda deunyddiau polymerig eraill. Fel arall, gellir ystyried addasu arwyneb PDMS (e.e., gorchuddio â deunyddiau lipoffilig 42 neu poly(ethylene glycol) 43) i leihau amsugno moleciwlau hydroffobig.
Yn olaf, nid yw ein dull wedi'i nodweddu'n dda o ran darparu sgrinio trwybwn uchel neu blatfform arbrofol "un maint i bawb" sy'n hawdd ei ddefnyddio. Mae'r protocol cyfredol yn gofyn am bwmp chwistrell fesul microdyfais, sy'n cymryd lle mewn deorydd CO2 ac yn atal arbrofion ar raddfa fawr. Gellir gwella'r cyfyngiad hwn yn sylweddol trwy raddadwyedd fformatau diwylliant arloesol (e.e., mewnosodiadau mandyllog 24-ffynnon, 96-ffynnon, neu 384-ffynnon sy'n caniatáu ailgyflenwi a chael gwared ar gyfryngau basolateral yn barhaus).
I ysgogi morffogenesis 3D epitheliwm berfeddol dynol in vitro, fe wnaethom ddefnyddio dyfais berfeddol sglodion microfluidig ​​sy'n cynnwys dau ficrosianel gyfochrog a philen mandyllog elastig rhyngddynt i greu rhyngwyneb lumen-capilari. Rydym hefyd yn dangos y defnydd o ddyfais microfluidig ​​un sianel (sglodion hybrid) sy'n darparu llif basolateral parhaus o dan haenau epitheliwm polaraidd a dyfir ar fewnosodiadau Transwell. Yn y ddau blatfform, gellir dangos morffogenesis amrywiol gelloedd epitheliwm berfeddol dynol trwy gymhwyso trin cyfeiriadol o lif i gael gwared ar wrthwynebwyr morphogen o'r adran basolateral. Mae'r weithdrefn arbrofol gyfan (Ffigur 1) yn cynnwys pum rhan: (i) microffabrigo'r sglodion perfedd neu'r sglodion hybrid mewnosodadwy Transwell (camau 1-5; Blwch 1), (ii) paratoi celloedd epitheliwm berfeddol (celloedd Caco-2) neu organoidau berfeddol dynol; blychau 2-5), (iii) diwylliant celloedd epithelaidd berfeddol ar sglodion berfeddol neu sglodion hybrid (camau 6-9), (iv) ysgogi morffogenesis 3D in vitro (cam 10) a (v)) i nodweddu'r microstrwythur epithelaidd 3D (camau 11-24). Yn olaf, cynlluniwyd grŵp rheoli priodol (a drafodir ymhellach isod) i ddilysu effeithiolrwydd morffogenesis in vitro trwy gymharu morffogenesis epithelaidd â rheolyddion gofodol, amserol, amodol, neu weithdrefnol.
Defnyddiwyd dau blatfform diwylliant gwahanol: perfedd-ar-sglodion gyda sianeli syth neu sianeli cymhleth anlinellol, neu sglodion hybrid sy'n cynnwys mewnosodiadau Transwell (TW) mewn dyfais microfluidig, wedi'i gynhyrchu fel y disgrifir ym Mlwch 1, a cham 1-5. Mae "Gwneud Dyfais" yn dangos y prif gamau wrth wneud sglodion sengl neu sglodion hybrid. Mae "Diwylliant Celloedd Epithelaidd Berfeddol Dynol" yn egluro ffynhonnell y gell (Caco-2 neu organoidau berfeddol dynol) a'r weithdrefn diwylliant a ddefnyddir yn y protocol hwn. Mae "Morffogenesis in vitro" yn dangos y camau cyffredinol lle mae celloedd epithelaidd sy'n deillio o Caco-2 neu organoidau yn cael eu meithrin ar sglodion berfeddol neu ar fewnosodiadau Transwell o sglodion hybrid, ac yna ysgogi morffogenesis 3D a ffurfio strwythur epithelaidd nodweddedig. Dangosir rhif cam y rhaglen neu rif y blwch o dan bob saeth. Mae'r rhaglen yn darparu enghreifftiau o sut y gellir defnyddio haenau epithelaidd berfeddol sefydledig, er enghraifft, mewn nodweddu gwahaniaethu celloedd, astudiaethau ffisioleg perfedd, sefydlu ecosystemau microbiom gwesteiwr, a modelu clefydau. Imiwnofflworoleuedd delweddau yn “Cell Differentiation” yn dangos niwclysau, F-actin a MUC2 wedi'u mynegi yn yr haen epithelaidd 3D Caco-2 a gynhyrchir ar y sglodion perfedd. Mae signalau MUC2 yn bresennol mewn celloedd gobled a mwcws sy'n cael ei ysgarthu o arwynebau mwcosaidd. Mae delweddau fflwroleuol yn Gut Physiology yn dangos mwcws a gynhyrchwyd trwy staenio am asid sialig a gweddillion N-asetylglucosamin gan ddefnyddio agglutinin germ gwenith fflwroleuol. Mae'r ddwy ddelwedd sy'n gorgyffwrdd yn “Host-Microbe Co-Cultures” yn dangos cyd-ddiwylliannau gwesteiwr-microbiom cynrychioliadol yn y perfedd ar sglodion. Mae'r panel chwith yn dangos cyd-ddiwylliant E. coli sy'n mynegi protein fflwroleuol gwyrdd (GFP) gyda chelloedd epithelaidd 3D Caco-2 wedi'u micro-beiriannu. Mae'r panel dde yn dangos lleoliad GFP E. coli wedi'i gyd-ddiwyllio â chelloedd epithelaidd 3D Caco-2, ac yna staenio imiwno-fflwroleuol gydag F-actin (coch) a niwclysau (glas). Mae modelu clefydau yn dangos perfedd iach yn erbyn perfedd gollyngol mewn sglodion llid perfedd o dan her ffisiolegol gydag antigenau bacteriol (e.e., lipopolysacarid, LPS) a chelloedd imiwnedd (e.e., PBMC; gwyrdd).Cafodd celloedd Caco-2 eu meithrin i sefydlu haen epithelaidd 3D.Bar graddfa, 50 µm.Delweddau yn y rhes waelod: “Gwahaniaethu celloedd” wedi'i addasu gyda chaniatâd o gyfeiriad.2. Gwasg Prifysgol Rhydychen; Atgynhyrchwyd gyda chaniatâd o Gyf.5. NAS; “Cyd-ddiwylliant Gwesteiwr-Microb” wedi'i addasu gyda chaniatâd o gyfeiriad.3. NAS; “Modelu Clefydau” wedi'i addasu gyda chaniatâd o gyfeiriad.5. NAS.
Cafodd sglodion perfedd-ar-sglodion a sglodion hybrid eu cynhyrchu gan ddefnyddio replicâu PDMS a gafodd eu dadfowldio o fowldiau silicon trwy lithograffeg feddal1,44 a'u patrymu â SU-8. Pennir dyluniad y microsianeli ym mhob sglodion trwy ystyried hydrodynameg fel straen cneifio a phwysau hydrodynamig1,4,12. Mae'r dyluniad perfedd-ar-sglodion gwreiddiol (Data Estynedig Ffig. 1a), a oedd yn cynnwys dau ficrosianel syth gyfochrog ochr yn ochr, wedi esblygu i fod yn berfedd-ar-sglodion cymhleth (Data Estynedig Ffig. 1b) sy'n cynnwys pâr o ficrosianeli crwm i ysgogi amser preswylio hylif cynyddol, patrymau llif anlinellol, ac anffurfiad aml-echelinol celloedd wedi'u meithrin (Ffig. 2a–f)12.Pan fydd angen ail-greu biomecaneg berfedd mwy cymhleth, gellir dewis perfedd-ar-sglodion cymhleth.Rydym wedi dangos bod y Perfedd-Sglodyn cymhleth hefyd yn ysgogi morffogenesis 3D yn gryf mewn ffrâm amser debyg gyda gradd debyg o dwf epithelaidd o'i gymharu â'r gwreiddiol. Sglodion Perfedd, waeth beth fo'r math o gell a ddiwyllir. Felly, i ysgogi morffogenesis 3D, mae dyluniadau perfedd llinol a chymhleth ar sglodion yn gyfnewidiol. Darparodd replicas PDMS a gafodd eu halltu ar fowldiau silicon gyda phatrymau SU-8 nodweddion negyddol ar ôl eu dadfowldio (Ffig. 2a). I greu'r perfedd ar sglodion, bondiwyd yr haen PDMS uchaf a baratowyd yn olynol i ffilm PDMS mandyllog ac yna ei halinio â'r haen PDMS isaf trwy fondio anadferadwy gan ddefnyddio trinydd corona (Ffig. 2b–f). I greu sglodion hybrid, bondiwyd replicas PDMS wedi'u halltu i sleidiau gwydr i greu dyfeisiau microfluidig ​​un sianel a allai ddarparu ar gyfer mewnosodiadau Transwell (Ffig. 2h a Data Estynedig Ffig. 2). Perfformir y broses fondio trwy drin arwynebau'r replica PDMS a'r gwydr gyda plasma ocsigen neu driniaeth corona. Ar ôl sterileiddio'r ddyfais ficroffabrigedig sydd ynghlwm wrth y tiwb silicon, roedd y ddyfais wedi'i gosod yn barod i berfformio morffogenesis 3D o'r epitheliwm berfeddol (Ffig. 2g).
a, Darlun sgematig o baratoi rhannau PDMS o fowldiau silicon patrymog SU-8. Tywalltwyd yr hydoddiant PDMS heb ei halltu ar fowld silicon (chwith), ei halltu ar 60 °C (canol) a'i ddadfowldio (dde). Torrwyd y PDMS wedi'i ddadfowldio yn ddarnau a'i lanhau i'w ddefnyddio ymhellach.b, Ffotograff o'r mowld silicon a ddefnyddiwyd i baratoi haen uchaf y PDMS.c, Ffotograff o'r mowld silicon a ddefnyddiwyd i gynhyrchu'r bilen mandyllog PDMS.d, Cyfres o ffotograffau o gydrannau uchaf ac isaf y PDMS a'r ddyfais berfeddol ar-sglodion wedi'i chydosod.e, Sgematig o aliniad y cydrannau PDMS uchaf, pilen ac isaf. Mae pob haen wedi'i bondio'n anghildroadwy gan driniaeth plasma neu gorona.f, Sgematig o'r ddyfais coluddyn-ar-sglodion a gynhyrchwyd gyda microsianeli cymhleth a siambrau gwactod wedi'u gosod ar ben ei gilydd.g, Gosod coluddyn-ar-sglodion ar gyfer diwylliant celloedd microfluidig. Gosodwyd y coluddyn ar sglodion a gynhyrchwyd wedi'i gydosod â thiwb silicon a chwistrell ar orchudd. Gosodwyd y ddyfais sglodion ar y caead dysgl Petri 150 mm ar gyfer prosesu. Defnyddir y rhwymwr i gau'r tiwb silicon.h, Cipluniau gweledol o weithgynhyrchu sglodion hybrid a morffogenesis 3D gan ddefnyddio sglodion hybrid. Mewnosodwyd mewnosodiadau Transwell a baratowyd yn annibynnol i feithrin monolayers 2D o gelloedd epithelaidd berfeddol i'r sglodion hybrid i ysgogi morffogenesis 3D berfeddol. Caiff y cyfrwng ei drwytho trwy ficrosianeli o dan yr haen gell a sefydlwyd ar fewnosodiad Transwell. Bar graddfa, 1 cm.h Ailargraffwyd gyda chaniatâd o gyfeiriad.4. Elsevier.
Yn y protocol hwn, defnyddiwyd y llinell gell Caco-2 ac organoidau berfeddol fel ffynonellau epithelaidd (Ffig. 3a). Cafodd y ddau fath o gelloedd eu meithrin yn annibynnol (Blwch 2 a Blwch 5) a'u defnyddio i hau'r microsianeli wedi'u gorchuddio ag ECM o fewnosodiadau perfedd neu Transwell ar-sglodion. Pan fydd celloedd yn gydlifol (gorchudd >95% mewn fflasgiau), caiff celloedd Caco-2 a feithrinir yn rheolaidd (rhwng darnau 10 a 50) mewn fflasgiau-T eu cynaeafu i baratoi ataliadau celloedd wedi'u daduno gan hylif trypsineiddio (blwch 2). Cafodd organoidau berfeddol dynol o fiopsïau berfeddol neu resections llawfeddygol eu meithrin mewn cromenni sgaffald Matrigel mewn platiau 24-ffynnon i gynnal y microamgylchedd strwythurol. Ychwanegwyd cyfrwng sy'n cynnwys morphogenau hanfodol (megis Wnt, R-spondin, a Noggin) a ffactorau twf a baratowyd fel y disgrifiwyd ym Mlwch 3 bob yn ail ddiwrnod nes bod yr organoidau wedi tyfu i ~500 µm mewn diamedr. Caiff organoidau wedi'u tyfu'n llawn eu cynaeafu a'u daduno'n gelloedd sengl ar gyfer hau ar fewnosodiadau perfedd neu Transwell ar sglodion (Blwch 5). Fel yr ydym wedi'i adrodd yn flaenorol, gellir ei wahaniaethu yn ôl math o glefyd12,13 (e.e. colitis briwiol, clefyd Crohn, canser y colon a'r rectwm, neu roddwr arferol), safle'r briw (e.e., briw yn erbyn ardal heb friw) a lleoliad gastroberfeddol yn y llwybr (e.e., dwodenwm, jejwnwm, ilewm, cecwm, colon, neu rectwm). Rydym yn darparu protocol wedi'i optimeiddio ym Mlwch 5 ar gyfer meithrin organoidau colonaidd (coloidau) sydd fel arfer angen crynodiadau uwch o forffogenau nag organoidau berfeddol bach.
a, Llif gwaith ar gyfer ysgogi morffogenesis y coluddyn yn y sglodion coluddyn. Defnyddir epitheliwm berfeddol dynol Caco-2 ac organoidau berfeddol yn y protocol hwn i ddangos morffogenesis 3D. Cafodd y celloedd epithelaidd ynysig eu hau yn y ddyfais perfedd-ar-sglodion a baratowyd (paratoi sglodion). Unwaith y bydd celloedd wedi'u hau (hau) a'u cysylltu (ymlynnu) â'r bilen mandyllog PDMS ar ddiwrnod 0 (D0), mae llif apical (AP) yn cael ei gychwyn a'i gynnal am y 2 ddiwrnod cyntaf (llif, AP, D0-D2). Mae llif basolateral (BL) hefyd yn cael ei gychwyn ynghyd â symudiadau ymestyn cylchol (ymestyn, llif, AP a BL) pan ffurfir monohaen 2D cyflawn. Digwyddodd morffogenesis 3D berfeddol yn ddigymell ar ôl 5 diwrnod o ddiwylliant microfluidig ​​(morffogenesis, D5). Mae delweddau cyferbyniad cyfnod yn dangos morffoleg gynrychioliadol celloedd Caco-2 ym mhob cam neu bwynt amser arbrofol (graff bar, 100 µm). Pedwar diagram sgematig yn darlunio'r rhaeadrau cyfatebol o forffogenesis y coluddyn (dde uchaf). Y toredig Mae saethau yn y sgematig yn cynrychioli cyfeiriad llif yr hylif.b, Delwedd SEM yn dangos topoleg arwyneb yr epitheliwm Caco-2 3D sefydledig (chwith). Mae'r mewnosodiad sy'n amlygu'r ardal wedi'i chwyddo (blwch gwyn toredig) yn dangos y microfili wedi'u hadfywio ar yr haen Caco-2 3D (dde).c, Golwg blaen llorweddol o Caco-2 3D sefydledig, claudin (ZO-1, coch) a philenni ffin brwsh parhaus wedi'u labelu F-actin (gwyrdd) a niwclysau (glas) Delweddu confocal imiwno-fflworoleuedd celloedd epithelaidd ar sglodion berfeddol. Mae saethau sy'n pwyntio at y sgematig canol yn nodi lleoliad yr awyren ffocal ar gyfer pob golwg confocal.d, Cwrs amser newidiadau morffolegol mewn organoidau a dyfir ar sglodion a gafwyd trwy ficrosgopeg cyferbyniad cyfnod ar ddiwrnodau 3, 7, 9, 11, a 13. Mae'r mewnosodiad (dde uchaf) yn dangos chwyddiad uchel y ddelwedd a ddarparwyd.e, Ffotomicrograff DIC o epitheliwm 3D organoid a sefydlwyd yn y perfedd ar sleisen a gymerwyd ar ddiwrnod 7.f, Delweddau imiwno-fflworoleuedd wedi'u gorchuddio yn dangos marcwyr ar gyfer celloedd bonyn (LGR5; magenta), celloedd gobled (MUC2; gwyrdd), F-actin (llwyd) a niwclysau (cyan) wedi'u tyfu ar sglodion perfedd am 3 diwrnod, yn y drefn honno (Chwith) ac organoidau 13 diwrnod (canol) ar yr haen epithelaidd. Gweler hefyd Data Estynedig Ffigur 3, sy'n tynnu sylw at signalau LGR5 heb signalau MUC2. Delweddau fflwroleuedd yn dangos microstrwythur epithelaidd (dde) epitheliwm organoid 3D a sefydlwyd yn y perfedd ar sglodion trwy staenio'r bilen plasma gyda llifyn CellMask (dde) ar ddiwrnod 13 o ddiwylliant. Mae'r bar graddfa yn 50 μm oni nodir yn wahanol. b Ailargraffwyd gyda chaniatâd o gyfeiriad. 2. Gwasg Prifysgol Rhydychen; c Addaswyd gyda chaniatâd o Gyfeirnod. 2. Gwasg Prifysgol Rhydychen; e ac f wedi'u haddasu gyda chaniatâd trwy gyfeiriad. 12 O dan Drwydded Creative Commons CC BY 4.0.
Yn y perfedd ar sglodion, mae angen addasu wyneb hydroffobig y bilen mandyllog PDMS ar gyfer cotio ECM llwyddiannus. Yn y protocol hwn, rydym yn defnyddio dau ddull gwahanol i addasu hydroffobigrwydd pilenni PDMS. Ar gyfer meithrin celloedd Caco-2, roedd actifadu wyneb trwy driniaeth UV/osôn yn unig yn ddigonol i leihau hydroffobigrwydd wyneb y PDMS, cotio'r ECM ac atodi celloedd Caco-2 i'r bilen PDMS. Fodd bynnag, mae diwylliant microfluidig ​​o epitheliwm organoid yn gofyn am swyddogaetholi wyneb yn seiliedig ar gemegau i gyflawni dyddodiad effeithlon o broteinau ECM trwy gymhwyso polyethyleneimine (PEI) a glutaraldehyde yn olynol i ficrosianeli PDMS. Ar ôl addasu wyneb, dyddodwyd proteinau ECM i orchuddio wyneb y PDMS swyddogaethol ac yna eu cyflwyno i'r epitheliwm organoid ynysig. Ar ôl i'r celloedd gael eu hatodi, mae'r diwylliant celloedd microfluidig ​​yn dechrau trwy berfusio'r cyfrwng yn unig i'r microsianel uchaf nes bod y celloedd yn ffurfio monohaen gyflawn, tra bod y microsianel isaf yn cynnal amodau statig. Mae'r dull optimeiddiedig hwn ar gyfer actifadu wyneb a chotio ECM yn galluogi atodiad organoid epitheliwm i ysgogi morffogenesis 3D ar wyneb y PDMS.
Mae angen cotio ECM ar ddiwylliannau Transwell hefyd cyn hau celloedd; fodd bynnag, nid oes angen camau cyn-driniaeth cymhleth ar ddiwylliannau Transwell i actifadu wyneb mewnosodiadau mandyllog. Ar gyfer tyfu celloedd Caco-2 ar fewnosodiadau Transwell, mae cotio ECM ar fewnosodiadau mandyllog yn cyflymu atodiad celloedd Caco-2 dadgysylltiedig (<1 awr) a ffurfio rhwystr cyffordd dynn (<1-2 diwrnod). I feithrin organoidau ar fewnosodiadau Transwell, caiff organoidau ynysig eu hau ar fewnosodiadau wedi'u gorchuddio ag ECM, eu cysylltu ag wyneb y bilen (<3 awr) a'u cynnal nes bod yr organoidau'n ffurfio monohaen gyflawn gyda chyfanrwydd rhwystr. Perfformir diwylliannau Transwell mewn platiau 24-ffynnon heb ddefnyddio sglodion hybrid.
Gellir cychwyn morffogenesis 3D in vitro trwy gymhwyso llif hylif i agwedd basolateral haen epithelaidd sefydledig. Yn y coluddyn ar sglodion, dechreuodd morffogenesis epithelaidd pan gafodd y cyfrwng ei drwytho i'r microsianeli uchaf ac isaf (Ffig. 3a). Fel y disgrifiwyd yn flaenorol, mae'n hanfodol cyflwyno llif hylif yn yr adran israddol (basolateral) ar gyfer tynnu atalyddion morffogen secretedig cyfeiriadol yn barhaus. Er mwyn darparu digon o faetholion a serwm i gelloedd sydd wedi'u rhwymo ar bilenni mandyllog a chynhyrchu straen cneifio luminal, rydym fel arfer yn cymhwyso llif deuol yn y coluddyn ar sglodion. Mewn sglodion hybrid, mewnosodwyd mewnosodiadau Transwell sy'n cynnwys monolayers epithelaidd i'r sglodion hybrid. Yna, cymhwyswyd y cyfrwng o dan ochr basolateral y mewnosodiad Transwell mandyllog trwy'r microsianel. Digwyddodd morffogenesis berfeddol 3-5 diwrnod ar ôl cychwyn llif basolateral yn y ddau blatfform diwylliant.
Gellir dadansoddi nodweddion morffolegol haenau epithelaidd 3D wedi'u micro-beiriannu trwy gymhwyso amrywiol ddulliau delweddu, gan gynnwys microsgopeg cyferbyniad cyfnod, microsgopeg cyferbyniad ymyrraeth wahaniaethol (DIC), SEM, neu ficrosgopeg gonffocal imiwno-fflworoleuedd (Ffigurau 3 a 4). Gellir perfformio delweddu cyferbyniad cyfnod neu DIC yn hawdd ar unrhyw adeg yn ystod diwylliant i fonitro siâp ac ymwthiad haenau epithelaidd 3D. Oherwydd tryloywder optegol ffilmiau PDMS a polyester, gall llwyfannau'r perfedd-ar-sglodion a'r sglodion hybrid ddarparu delweddu in situ amser real heb yr angen i rannu na dadosod y ddyfais. Wrth berfformio delweddu imiwno-fflworoleuedd (Ffigurau 1, 3c, f a 4b, c), mae celloedd fel arfer yn cael eu trwsio â 4% (pwysau/cyfaint) paraformaldehyd (PFA), ac yna Triton X-100 a 2% (pwysau/cyfaint) albwmin serwm buchol (BSA), yn eu trefn. Yn dibynnu ar y math o gell, gellir defnyddio gwahanol osodyddion, athreiddyddion, ac asiantau blocio. Targedu gwrthgyrff cynradd Defnyddir marcwyr celloedd neu ranbarth sy'n ddibynnol ar linach i amlygu celloedd sydd wedi'u sefydlogi in situ ar y sglodion, ac yna gwrthgyrff eilaidd ynghyd â llifyn gwrth-staen sy'n targedu naill ai niwclews (e.e., 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) neu F-actin (e.e., phalloidin wedi'i labelu'n fflwroleuol). Gellir hefyd perfformio delweddu byw yn seiliedig ar fflwroleuedd in situ i ganfod cynhyrchu mwcws (Ffig. 1, “Gwahaniaethu celloedd” a “Ffioleg y coluddyn”), gwladychu celloedd microbaidd ar hap (Ffig. 1, “Cyd-ddiwylliant gwesteiwr-microb”), recriwtio celloedd imiwnedd (Ffig. 1, 'Modelu Clefydau') neu amlinelliadau morffoleg epithelaidd 3D (Ffig. 3c,f a 4b,c). Wrth addasu'r coluddyn ar y sglodion i wahanu'r haen uchaf o'r haen microsianel isaf, fel y disgrifir yn y cyfeirnod. Fel y dangosir yn Ffig. 2, gellir delweddu'r morffoleg epithelaidd 3D yn ogystal â'r microfili ar y ffin brwsh apical gan SEM. (Ffig. 3b). Gellir asesu mynegiant marcwyr gwahaniaethu trwy gynnal PCR5 meintiol neu ddilyniannu RNA un gell. Yn yr achos hwn, caiff haenau 3D o gelloedd epithelaidd a dyfir mewn sglodion perfedd neu sglodion hybrid eu cynaeafu trwy trypsineiddio ac yna eu defnyddio ar gyfer dadansoddiad moleciwlaidd neu enetig.
a, Llif gwaith ar gyfer ysgogi morffogenesis berfeddol mewn sglodion hybrid. Defnyddir Caco-2 ac organoidau berfeddol yn y protocol hwn i ddangos morffogenesis 3D mewn platfform sglodion hybrid. Hadwyd celloedd epithelaidd wedi'u daduno mewn mewnosodiadau Transwell parod (paratoi TW; gweler y ffigur isod). Unwaith y cafodd celloedd eu hadu (eu hadu) a'u cysylltu â philenni polyester mewn mewnosodiadau Transwell, cafodd yr holl gelloedd eu meithrin o dan amodau statig (diwylliant TW). Ar ôl 7 diwrnod, integreiddiwyd un mewnosodiad Transwell yn cynnwys monohaen 2D o gelloedd epithelaidd i sglodion hybrid i gyflwyno llif basolateral (Llif, BL), a arweiniodd yn y pen draw at gynhyrchu haen epithelaidd 3D (morffogenesis). Micrograffau cyferbyniad cyfnod sy'n dangos nodweddion morffolegol celloedd epithelaidd organau dynol sy'n deillio o golon esgynnol rhoddwr arferol (llinell C103) ym mhob cam neu bwynt amser arbrofol. Mae'r sgematigau yn yr haenau uchaf yn dangos y cyfluniad arbrofol ar gyfer pob cam.b, Gall sglodion hybrid (sgematig chwith) arwain at forffogenesis 3D o gelloedd epithelaidd organoid gyda Golygfeydd microsgopeg gonffocal o'r brig i lawr a gymerwyd mewn gwahanol safleoedd Z (uchaf, canol, ac isaf; gweler y sgematig dde a'r llinellau dotiog cyfatebol). dangosodd nodweddion morffolegol amlwg. F-actin (cyan), niwclews (llwyd). c, Micrograffau gonffocal fflwroleuedd (golygfa onglog 3D) o gelloedd epithelaidd sy'n deillio o organoid a dyfwyd mewn Transwell statig (TW; mewnosodiad o fewn blwch gwyn toredig) yn erbyn sglodion hybrid (y llun llawn mwyaf) gan gymharu morffoleg 2D yn erbyn 3D, yn y drefn honno. Mae pâr o olygfeydd trawsdoriad fertigol 2D (mewnosodiad yn y gornel dde uchaf; “XZ”) hefyd yn dangos nodweddion 2D a 3D. Bar graddfa, 100 µm. c Ailargraffwyd gyda chaniatâd o gyfeiriad. 4. Elsevier.
Gellir paratoi rheolyddion trwy feithrin yr un celloedd (Caco-2 neu gelloedd epithelaidd organoid berfeddol) mewn monohaenau dau ddimensiwn o dan amodau diwylliant statig confensiynol. Yn arbennig, gall disbyddu maetholion ddeillio o gapasiti cyfaint cyfyngedig y microsianeli (h.y. ~4 µL yn y sianel uchaf ar y dyluniad sglodion perfedd gwreiddiol). Felly, gellir cymharu morffoleg epithelaidd cyn ac ar ôl cymhwyso llif basolateral hefyd.
Dylid cyflawni'r broses lithograffeg feddal mewn ystafell lân. Ar gyfer pob haen ar y sglodion (haenau uchaf ac isaf a philenni) a sglodion hybrid, defnyddiwyd gwahanol ffotofasgiau a'u cynhyrchu ar wafferi silicon ar wahân oherwydd bod uchderau'r microsianeli yn wahanol. Uchderau targed microsianeli uchaf ac isaf y perfedd ar y sglodion yw 500 µm a 200 µm, yn y drefn honno. Uchder targed sianel y sglodion hybrid yw 200 µm.
Rhowch wafer silicon 3 modfedd mewn dysgl gydag aseton. Troellwch y plât yn ysgafn am 30 eiliad, yna sychwch y wafer yn yr awyr. Trosglwyddwch y wafer i blât gydag IPA, yna troellwch y plât am 30 eiliad i'w lanhau.
Gellir defnyddio toddiant piranha (cymysgedd o hydrogen perocsid ac asid sylffwrig crynodedig, 1:3 (cyf/cyf)) yn ddewisol i wneud y mwyaf o gael gwared ar weddillion organig o wyneb y wafer silicon.
Mae hydoddiant piranha yn hynod gyrydol ac yn cynhyrchu gwres. Mae angen rhagofalon diogelwch ychwanegol. Ar gyfer gwaredu gwastraff, gadewch i'r hydoddiant oeri a'i drosglwyddo i gynhwysydd gwastraff glân a sych. Defnyddiwch gynwysyddion eilaidd a labelwch gynwysyddion gwastraff yn gywir. Dilynwch ganllawiau diogelwch y cyfleuster am weithdrefnau mwy manwl.
Dadhydradwch y wafferi trwy eu rhoi ar blât poeth 200 °C am 10 munud. Ar ôl dadhydradu, ysgwydwyd y waffer bum gwaith yn yr awyr i oeri.
Arllwyswch ~10 g o ffotowrthiant SU-8 2100 ar ganol y wafer silicon wedi'i glanhau. Defnyddiwch gefeiliau i wasgaru'r ffotowrthiant yn gyfartal ar y wafer. O bryd i'w gilydd, rhowch y wafer ar blât poeth 65°C i wneud y ffotowrthiant yn llai gludiog ac yn haws i'w wasgaru. Peidiwch â gosod y wafer yn uniongyrchol ar y plât poeth.
Dosbarthwyd SU-8 yn gyfartal ar y wafer trwy redeg cotio sbin. Rhaglennwch gylchdro sy'n dod i mewn o'r SU-8 am 5–10 eiliad i ledaenu ar 500 rpm ar gyflymiad o 100 rpm/s. Gosodwch y prif sbin ar gyfer patrymu trwch 200 µm ar 1,500 rpm, neu cyflawni trwch o 250 µm (gan wneud uchder o 500 µm ar gyfer haen uchaf y perfedd ar y sglodion; gweler "Camau hanfodol" isod) wedi'i osod ar gyflymiad o 300 rpm/s 30 eiliad ar 1,200 rpm.
Gellir addasu'r prif gyflymder nyddu yn ôl trwch targed y patrwm SU-8 ar y wafer silicon.
I greu patrymau SU-8 o 500 µm o uchder ar gyfer haen uchaf y perfedd ar y sglodion, ailadroddwyd y camau cotio nyddu a phobi meddal o'r Blwch hwn (camau 7 ac 8) yn olynol (gweler cam 9) i gynhyrchu dwy haen o SU-8 250 µm o drwch, y gellir eu haenu a'u cysylltu trwy amlygiad UV yng ngham 12 o'r blwch hwn, gan wneud haen 500 µm o uchder.
Pobwch y wafferi wedi'u gorchuddio â SU-8 yn feddal trwy eu gosod yn ofalus ar blât poeth ar 65 °C am 5 munud, yna newidiwch y gosodiad i 95 °C a'u magu am 40 munud ychwanegol.
I gyflawni uchder o 500 μm i'r patrwm SU-8 yn y microsianel uchaf, ailadroddwch gamau 7 ac 8 i gynhyrchu dwy haen SU-8 250 μm o drwch.
Gan ddefnyddio'r Alinydd Mwgwd UV, perfformiwch brawf lamp yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr i gyfrifo amser amlygiad y wafer. (amser amlygiad, ms) = (dos amlygiad, mJ/cm2)/(pŵer lamp, mW/cm2).
Ar ôl pennu'r amser amlygiad, rhowch y ffotomasg ar ddeiliad masg yr alinydd masg UV a rhowch y ffotomasg ar y wafer wedi'i gorchuddio â SU-8.
Rhowch wyneb printiedig y ffotomasg yn uniongyrchol ar ochr y wafer silicon sydd wedi'i gorchuddio â SU-8 i leihau gwasgariad UV.
Amlygwch y wafer a'r ffotomasg wedi'u gorchuddio â SU-8 yn fertigol i 260 mJ/cm2 o olau UV am yr amser amlygiad a bennwyd ymlaen llaw (gweler cam 10 o'r blwch hwn).
Ar ôl dod i gysylltiad ag UV, cafodd wafferi silicon wedi'u gorchuddio â SU-8 eu pobi ar 65°C am 5 munud a 95°C am 15 munud ar bob plât poeth i greu patrymau gydag uchder o 200 μm. Estynnwch yr amser ôl-bobi ar 95°C i 30 munud i greu patrymau gydag uchder o 500 μm.
Caiff y datblygwr ei dywallt i ddysgl wydr, a rhoddir y wafer wedi'i bobi yn y ddysgl. Gall cyfaint y datblygwr SU-8 amrywio yn dibynnu ar faint y plât gwydr. Gwnewch yn siŵr eich bod yn defnyddio digon o ddatblygwr SU-8 i gael gwared ar SU-8 heb ei ddatgelu yn llwyr. Er enghraifft, wrth ddefnyddio dysgl wydr 150 mm mewn diamedr gyda chynhwysedd o 1 L, defnyddiwch ~300 mL o ddatblygwr SU-8. Datblygwch y mowld am 25 munud gyda chylchdro ysgafn o bryd i'w gilydd.
Rinsiwch y mowld datblygedig gyda ~10 mL o ddatblygwr ffres ac yna IPA trwy chwistrellu'r toddiant gan ddefnyddio piped.
Rhowch y wafer mewn glanhawr plasma a'i amlygu i blasma ocsigen (nwy atmosfferig, pwysedd targed 1 × 10−5 Torr, pŵer 125 W) am 1.5 munud.
Rhowch y wafer mewn sychwr gwactod gyda sleid wydr y tu mewn. Gellir gosod wafers a sleidiau ochr yn ochr. Os yw'r sychwr gwactod wedi'i rannu'n sawl haen gan blât, rhowch y sleidiau yn y siambr isaf a'r wafers yn y siambr uchaf. Gollyngwch 100 μL o doddiant trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane ar sleid wydr a defnyddiwch wactod ar gyfer silaneiddio.
Dadmerwch ffiol o gelloedd Caco-2 wedi'u rhewi mewn baddon dŵr 37°C, yna trosglwyddwch y celloedd wedi'u dadmer i fflasg T75 sy'n cynnwys 15 mL o gyfrwng Caco-2 wedi'i gynhesu ymlaen llaw 37°C.
I basio celloedd Caco-2 ar gydlifiant ~90%, cynheswch gyfrwng Caco-2, PBS, a 0.25% trypsin/1 mM EDTA mewn baddon dŵr 37°C yn gyntaf.
Anadlu'r cyfrwng drwy anadlu gwactod. Golchwch y celloedd ddwywaith gyda 5 mL o PBS cynnes drwy ailadrodd anadlu gwactod ac ychwanegu PBS ffres.