Diolch i chi am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych yn ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig i CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu ddiffodd modd cydweddoldeb yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae morffogenesis perfedd dynol yn sefydlu nodweddion crypt-villus microarchitecture epithelial 3D a gofodol organization.This strwythur unigryw sydd ei angen i gynnal homeostasis perfedd drwy amddiffyn y cilfach bôn-gelloedd yn y crypt gwaelodol rhag antigenau microbaidd alldarddol a'u metabolites.In ogystal, fili berfeddol a secreting mwcws yn bresennol yn swyddogaethol gwahaniaethu ar yr wyneb epithelial celloedd epithelial gyda rhwystrol epithelial mucosol amddiffynnol ar yr wyneb epithelial mucosol a rhwystrol gwrth-berfeddol swyddogaethol ar yr wyneb epithelial amddiffynnol. strwythurau yn hanfodol ar gyfer adeiladu in vitro modelau perfedd.Notably, gall y perfedd mimetig organig-ar-a-sglodyn gymell morphogenesis 3D digymell o'r epitheliwm berfeddol gyda swyddogaethau ffisiolegol gwell a biomecanics.Here, rydym yn darparu protocol atgenhedladwy i ysgogi gadarn morphogenesis yn y perfedd ar ddyfais microfluidic trawsblannu fel microfluidic chip. co-2 neu gelloedd epithelial organoid berfeddol mewn lleoliadau confensiynol yn ogystal ag ar lwyfan microfluidic, sefydlu morphogenesis 3D, a nodweddu epithelia 3D sefydledig gan ddefnyddio dulliau delweddu lluosog. Mae'r protocol hwn yn cyflawni adfywiad microarchitecture perfedd swyddogaethol trwy reoli llif hylif basochrol ar gyfer 5 d.Our in vitro morphogenesis dull cyflogi peirianneg gell sy'n bodoli eisoes ac nid yw'n ei gwneud yn ofynnol i beirianneg fecanyddol motion cymhleth sy'n berthnasol, ac efallai y bydd angen technegau ffisiolegol cymhleth neu beirianyddol arall sy'n ffurfio gell sy'n berthnasol. .Rydym yn rhagweld y gallai ein protocol arfaethedig fod â goblygiadau eang i'r gymuned ymchwil fiofeddygol, gan ddarparu dull i adfywio haenau epithelial berfeddol 3D in vitro ar gyfer cymwysiadau biofeddygol, clinigol a fferyllol.
Mae arbrofion yn dangos y gall celloedd Caco-2 epithelial berfeddol sydd wedi'u meithrin mewn perfedd-ar-a-sglodyn1,2,3,4,5 neu ddyfeisiau microhylifol deuhaen6,7 gael eu gwneud yn ddigymell mewn morffogenesis 3D in vitro heb ddealltwriaeth glir o'r mecanwaith gwaelodol. wedi'i ddangos gan Caco-2 ac organoidau berfeddol sy'n deillio o gleifion.Dilyswyd celloedd epithelial.Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ganolbwyntio'n benodol ar gynhyrchu celloedd a dosbarthiad crynodiad antagonist Wnt grymus, Dickkopf-1 (DKK-1), mewn perfedd-ar-a-sglodyn a dyfeisiau micro-hylif wedi'u haddasu sy'n cynnwys mewnosodiadau Transwell, a elwir yn “Hybrid Chip”. Soggy-1) i'r perfedd ar-sglodion yn atal morphogenesis neu amharu ar yr haen epithelial 3D prestructured , gan awgrymu bod straen antagonistic yn ystod diwylliant yn gyfrifol am morphogenesis berfeddol in vitro.Felly, dull ymarferol i gyflawni morphogenesis cadarn yn y rhyngwyneb epithelial yw dileu neu gynnal cyn lleied â phosibl y lefelau o antagonists Wnt yn y comparting-flunwedd-wastad-gweithredol yn y basneg-flunwedd-cyfeiriad neu gutagonists gweithredol yn y basto-flunwedd-yn llwyfannau -a-sglodion) neu dryledu .Basolateral media (ee, o Transwell yn mewnosod i gronfeydd dŵr basolateral mawr mewn ffynhonnau).
Yn y protocol hwn, rydym yn darparu dull manwl ar gyfer ffugio microdevices perfedd-ar-sglodyn a sglodion hybrid transwell-fewnol (camau 1-5) i ddiwylliant celloedd epithelial berfeddol ar polydimethylsiloxane (pdms) pilenau mandyllog wedi'u seilio ar y pilenau (camau 6a, 7a, 7a, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8A, 8, 8, 8A, 8, 8A, 8, 8, 7A, 8, 8, 8A, 8, 8, 8A, 8, 8, 8A, 8, 8A, 8, 8, 8, 8A, 8, 8, 8A, 8, 8, 8, 7A, 8 MEMAN, 8, 8 MEMAN, 8 MEMAN, 8 MEMAN, 8 MEMAN, 8 MEMAN, 8 MEMAN, 8 MEMAN, 8 MEMAN, 8, 8, Phogenesis in vitro (Cam 10). Gwnaethom hefyd nodi nodweddion cellog a moleciwlaidd sy'n arwydd o histogenesis meinwe-benodol a gwahaniaethu cellog sy'n ddibynnol ar linach trwy gymhwyso dulliau delweddu lluosog (camau 11-24). Rydym yn cymell morffogenesis o ddiwylliant gan ddefnyddio memffwyr berfeddol dynol, fel caco-2 neu gelloedd perfeddol, fel manylion perfeddol, fel manylion. o monolayers 2d, ac biocemegol berfeddol ac atgynhyrchu'r microamgylchedd biomecanyddol.in vitro.to cymell morffogenesis 3D o monolayers epithelial 2D, gwnaethom dynnu antagonau morffogen yn y ddau ffurf ddiwylliannol trwy lifo cyfrwng y cyfrwng, ein bod yn darparu cyfrwng, yn darparu cyfrwng basolation, yn darparu cyfrwng basolate. gellir ei ddefnyddio i fodelu twf epithelial sy'n ddibynnol ar forffogen, cyd-ddiwylliannau gwesteiwr-microbiome hydredol, haint pathogen, anaf llidiol, camweithrediad rhwystr epithelial, a therapïau therapïau sy'n seiliedig ar probiotig.
Gall ein protocol fod yn ddefnyddiol i ystod eang o wyddonwyr mewn effaith eang sylfaenol (ee, bioleg mwcosaidd berfeddol, bioleg bôn-gelloedd, a bioleg ddatblygiadol) ac ymchwil gymhwysol (ee, profi cyffuriau cyn-glinigol, modelu clefydau, peirianneg meinwe, a gastroenteroleg). signalau yn ystod datblygiad berfeddol, adfywio neu homeostasis .Yn ogystal, mae ein protocol yn ddefnyddiol ar gyfer holi haint o dan asiantau heintus amrywiol megis Norofeirws 8, Coronafeirws Syndrom Anadlol Acíwt Difrifol (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonela Typhimurium 9 neu Vibrio cholerae.Mae cynulleidfaoedd patholeg afiechyd a phathogenesis hefyd yn ddefnyddiol.Gall defnyddio system microffisioleg perfedd ar-sglodion ganiatáu cyd-ddiwylliant hydredol 10 ac asesiad dilynol o amddiffyniad gwesteiwr, ymatebion imiwn a thrwsio anaf sy'n gysylltiedig â phathogenau yn y llwybr gastroberfeddol (GI) 11. Anhwylderau GI eraill sy'n gysylltiedig â syndrom perfedd sy'n gollwng, clefyd coeliag, wlser llid yr ymennydd, clefyd llid y coluddion, clefyd llid y coluddion, clefyd llid y coluddion, clefyd llid y coluddion. haenau epithelial yn cael eu paratoi gan ddefnyddio haenau epithelial berfeddol 3D y claf , mae'r clefydau hyn yn cynnwys atroffi villous, byrhau crypt, difrod mwcosaidd, neu rhwystr epithelial nam.Biopsi neu bôn-gelloedd organoidau berfeddol 12,13.I fodelu'n well cymhlethdod uwch yr amgylchedd afiechyd, gall darllenwyr ystyried ychwanegu celloedd gwaed perifferol monofferol sy'n cynnwys celloedd gwaed PB, sy'n cynnwys clefyd monofferol, sy'n berthnasol. microarchitectures villus-crypt.celloedd imiwnedd meinwe-benodol, 5.
Gan y gellir gosod a delweddu microstrwythur epithelial 3D heb y broses dorri, efallai y bydd gan wylwyr sy'n gweithio ar drawsgrifomeg ofodol a delweddu cydraniad uchel neu uwch-ddarlledu ddiddordeb yn ein gwaith o fapio deinameg ysbeidiol genynnau a phroteinau ar gilfachau epithelial.Diddordeb mewn technology.Response i stimuli.Furthermore microbaidd neu imiwnedd.Ar ben hynny, gall hydredol gwesteiwr-microbiome crosstalk 10, 14 sy'n cydlynu homeostasis perfedd yn cael ei sefydlu yn yr haen mwcosaidd berfeddol 3D trwy gyd-ddiwylliannol amrywiol rywogaethau microbaidd, cymunedau microbaidd neu fecal microbiota, yn enwedig yn y perfedd-ar-a-chip.Mae'r dull hwn yn arbennig o ddeniadol i gynulleidfaoedd sy'n astudio imiwnoleg mwcosaidd, gastroenteroleg, microbiome dynol, diwylliannau a microbioleg glinigol sy'n ceisio meithrin microbiota perfedd heb ei feithrin yn flaenorol yn y labordy. i'r rhai sy'n datblygu llwyfannau sgrinio neu ddilysu fferyllol, biofeddygol Neu drwybwn uchel ar gyfer y diwydiant bwyd.Fel prawf-egwyddor, dangoswyd yn ddiweddar pa mor ymarferol yw system morffogenesis amlblecs trwybwn uchel y gellir ei graddio i fformat plât 24-ffynnon. labordai, diwydiant neu lywodraeth ac asiantaethau rheoleiddio i ddeall ailraglennu cellog morffogenesis perfedd in vitro ar y lefel drawsgrifiadomig i brofi cyffuriau neu fiotherapiwteg Aseswyd amsugniad a chludiant ymgeiswyr cyffuriau gan ddefnyddio surrogates perfedd 3D neu ddefnyddio modelau organ-ar-sglodyn arferol neu fasnachol i asesu atgynhyrchedd y broses morffogenesis perfedd.
Mae nifer gyfyngedig o fodelau arbrofol sy'n berthnasol i bobl wedi'u defnyddio i astudio morffogenesis epithelial berfeddol, yn bennaf oherwydd y diffyg protocolau y gellir eu gweithredu i gymell morffogenesis 3D in vitro. Mae modelau al process.These hefyd yn gyfyngedig iawn yn eu gallu i gael eu profi mewn modd scalable aml-ffordd. Gall haenau epithelial D ddarparu lle i astudio sut mae celloedd microbaidd yn cystadlu i ffurfio cilfachau gofodol ac esblygiad ecolegol mewn ymateb i ffactorau lletyol (ee, haenau mwcws mewnol yn erbyn allanol, secretion IgA a pheptidau gwrthficrobaidd). Ymhellach, gall morffoleg epithelial 3D ein galluogi i ddeall sut mae'r perfeddyn microbaidd yn strwythuro ei gymunedau asid-meicraidd byr (meicrobiaidd) sy'n ffurfio ei gymunedau asidig-byrraidd yn fyr. trefniadaeth gellog a chilfachau bôn-gelloedd yn y crypts gwaelodol. Dim ond pan fydd haenau epithelial 3D wedi'u sefydlu in vitro y gellir dangos y nodweddion hyn.
Yn ogystal â'n dull o greu strwythurau epithelial berfeddol 3D, mae yna nifer o in vitro methods.Intestinal diwylliant organoid yn gyflwr-of-the-celf meinwe peirianneg dechneg yn seiliedig ar amaethu bôn-gelloedd berfeddol o dan amodau morphogen penodol23,24,25.However, y defnydd o fodelau organoid 3D ar gyfer dadansoddiad trafnidiaeth neu host-microbiome cyd-ddiwylliant oherwydd bod y cyd-ddiwylliannau luminoid berfeddol felly, yn aml yn herio luminoid berfeddol cydrannau, ac felly luminoid berfeddol cyflwyno celloedd deuol neu antigenau alldarddol yn gyfyngedig.Gellir gwella mynediad i lumens organoid trwy ddefnyddio micro-chwistrellwr,26,27 ond mae'r dull hwn yn ymledol ac yn llafurddwys ac mae angen gwybodaeth arbenigol i berfformio. Ymhellach, nid yw diwylliannau organoid traddodiadol a gynhelir mewn sgaffaldiau hydrogel o dan amodau statig yn adlewyrchu'n gywir biomecaneg weithredol in vivo.
Mae dulliau eraill a ddefnyddir gan nifer o grwpiau ymchwil yn defnyddio sgaffaldiau hydrogel 3D rhag-strwythuredig i ddynwared strwythur epithelial y perfedd trwy feithrin celloedd berfeddol dynol ynysig ar y gel Surface.Fabricate sgaffaldiau hydrogel gan ddefnyddio mowldiau 3D-argraffedig, micro-felin, neu lithographically fabricated. strwythur elial a stroma-epithelial crosstalk drwy gynnwys celloedd stromal yn y sgaffald.However, gall natur sgaffaldiau prestructured atal arddangos y broses morphogenetic digymell itself.These modelau hefyd nid yn darparu llif luminal deinamig neu interstitial, heb y straen cneifio hylif y mae angen i gelloedd berfeddol gael morphogenesis a swyddogaeth berfeddol a ddefnyddir yn ddiweddar ac yn cael ei ddefnyddio llwyfan microfluraidd batrwm epitholegol ac astudiaeth ffisiolegol scaffid diweddar strwythurau elial gan ddefnyddio technegau laser-ysgythru.Mae organoidau berfeddol Llygoden yn dilyn patrymau ysgythru i ffurfio strwythurau tiwbaidd berfeddol, a gellir ailadrodd llif hylif mewnluminal gan ddefnyddio modiwl microfluidics. tiwb, mae'r model hwn hefyd yn brin llif hylif luminal a anffurfiannau mecanyddol.Additionally, efallai y bydd gweithrediad model yn gyfyngedig, yn enwedig ar ôl y broses bioprinting yn gyflawn, amharu ar amodau arbrofol neu gell-i-gell interactions.Instead, mae ein protocol arfaethedig yn darparu morphogenesis perfedd digymell, straen cneifio ffisiolegol berthnasol, biomecaneg sy'n dynwared symudedd perfedd, hygyrchedd adeiliad micro-gelloedd annibynnol modcretonaidd. Felly, efallai y bydd ein protocol morffogenesis 3D in vitro yn darparu dull cyflenwol i oresgyn heriau dulliau presennol.
Mae ein protocol yn canolbwyntio'n gyfan gwbl ar morffogenesis epithelial 3D, gyda dim ond celloedd epithelial mewn diwylliant a dim mathau eraill o gelloedd amgylchynol megis celloedd mesenchymal, celloedd endothelaidd, a chelloedd imiwnedd. i ail-greu'r haen epithelial tonnog 3D, cymhlethdodau biolegol ychwanegol megis rhyngweithiadau epithelial-mesenchymal33,34, allgellog Matrics (ECM) dyddodiad 35 ac, yn ein model, nodweddion crypt-villus sy'n cyfleu cilfachau bôn-gelloedd mewn crypts gwaelodol yn parhau i gael eu hystyried ymhellach.Stromal celloedd (ee, chwarae rôl fibroblasts morol mewn proteingenesis berfeddol yn y broses o gynhyrchu fibroblasts mesphoblasts a phroteinau berfeddol yn y broses o gynhyrchu fibroblastau echlynegol mewn proteingenesis ECM) vivo35,37,38.Mae ychwanegu celloedd mesenchymal i'n model yn gwella'r broses morffogenetig ac effeithlonrwydd ymlyniad celloedd. Mae'r haen endothelaidd (hy, capilarïau neu lymffatig) yn chwarae rhan bwysig wrth reoleiddio trafnidiaeth foleciwlaidd39 a recriwtio celloedd imiwnedd40 yn y microenvironment.Y perfedd. Ymhellach, mae cydrannau fasgwlaidd y gellir eu cysylltu â modelau meinwe endothelaidd y gellir eu cysylltu â modelau endothelaidd yn cael eu cysylltu rhwng meinweoedd a rhagosodedig. efallai y bydd angen cynnwys celloedd othelial i fodelu nodweddion ffisiolegol mwy cywir gyda datrysiad lefel organ. Mae celloedd imiwnedd sy'n deillio o gleifion hefyd yn hanfodol ar gyfer arddangos ymatebion imiwn cynhenid, cyflwyniad antigen, crosstalk imiwn addasol cynhenid, ac imiwnedd meinwe-benodol yng nghyd-destun dynwared clefyd coluddol.
Mae'r defnydd o sglodion hybrid yn fwy syml na perfedd-ar-a-sglodion oherwydd bod y setup ddyfais yn symlach ac mae'r defnydd o Transwell yn mewnosod yn caniatáu ar gyfer diwylliant scalable o epithelium perfedd.However, ar gael yn fasnachol Transwell mewnosod gyda pilenni polyester nid elastig ac ni allant efelychu peristaltic-like movements.Furthermore, y compartment apical o'r orsaf Hintomatig Transwell gosod ar yr ochr hybrid, arhosol chipear yn sefydlog ar yr ochr Transwell, arhosodd mewnosoder chipear ar ochr hybrid. anaml y mae eiddo yn y compartment apical yn galluogi cyd-ddiwylliant bacteriol hirdymor mewn sglodion hybrid. Er y gallwn ysgogi morffogenesis 3D yn gadarn mewn mewnosodiadau Transwell wrth ddefnyddio sglodion hybrid, efallai y bydd prinder biomecaneg ffisiolegol berthnasol a llif hylif apical yn cyfyngu ar ymarferoldeb llwyfannau sglodion hybrid ar gyfer cymwysiadau posibl.
Nid yw adluniadau ar raddfa lawn o'r echelin crypt-villus dynol mewn diwylliannau perfedd-ar-a-sglodyn a hybrid-ar-sglodyn wedi'u sefydlu'n llawn.Since morphogenesis yn dechrau o monolayer epithelial, nid yw microarchitectures 3D o reidrwydd yn darparu tebygrwydd morffolegol i crypts in vivo.Although rydym yn nodweddu'r crypt cryptio boblogaeth amlhau yn y parth micro-enghreifftiol v3, a'r gell amlhau yn y parth microengylaidd v. Er bod sianeli uwch uwch ar y sglodion yn arwain at uchder uwch yr epitheliwm micro-beirianyddol, mae'r uchder uchaf yn dal i fod yn gyfyngedig i ~300-400 µm. Dyfnder gwirioneddol crypts berfeddol dynol yn y coluddion bach a mawr yw ~135 µm a ~400 µm, yn y drefn honno, vii 400 µm, ac mae uchder berfeddol ~ 4 yn fach.
O safbwynt delweddu, efallai y bydd delweddu cydraniad uwch yn y fan a'r lle o ficrosaernïaeth 3D yn gyfyngedig i'r perfedd ar sglodyn, gan fod y pellter gweithio gofynnol o'r lens gwrthrychol i'r haen epithelial ar drefn ychydig milimetrau. o'r perfedd ar sglodyn yn cynnwys adlyniad parhaol rhwng pob haen, mae'n hynod heriol agor neu dynnu'r haen uchaf i archwilio strwythur wyneb yr haen epithelial. Er enghraifft, trwy ddefnyddio microsgop electron sganio (SEM).
Mae hydroffobigrwydd PDMS wedi bod yn ffactor cyfyngol mewn astudiaethau sy'n seiliedig ar ficro-hylifau sy'n ymdrin â moleciwlau bach hydroffobig, oherwydd gall PDMS gael ei arsugnu'n amhenodol moleciwlau hydroffobig. Gellir ystyried dewisiadau amgen i PDMS gyda deunyddiau polymerig eraill. Fel arall, gellir ystyried addasu arwyneb PDMS (ee, gorchuddio â defnyddiau lipoffilig (deunyddiau 432) neu polyethylen i leihau hydroffobig. moleciwlau ffobig.
Yn olaf, nid yw ein dull wedi'i nodweddu'n dda o ran darparu sgrinio trwybwn uchel neu “un-maint-ffit-pawb” platform.The arbrofol sy'n gyfeillgar i'r defnyddiwr protocol cyfredol yn gofyn am bwmp chwistrell parhaus fesul microdevice, sy'n cymryd lle mewn deorydd CO2 ac yn atal ar raddfa fawr arbrofion. Gall y cyfyngiad hwn gael ei wella'n sylweddol gan y scalability o fformatau diwylliant arloesol (ee wel, 24-48-mewnosoder bod yn dda, porous neu mewnosoder nishment a thynnu cyfrwng gwaelodol).
Er mwyn cymell morffogenesis 3D o epitheliwm berfeddol dynol in vitro, fe wnaethom ddefnyddio dyfais berfeddol sglodion microfluidic sy'n cynnwys dwy ficrosianel gyfochrog a philen hydraidd elastig yn y canol i greu rhyngwyneb lwmen-capilari. Gellir ei ddangos trwy drin cyfeiriadol y llif i gael gwared ar antagonists morffogen o'r compartment basolateral. Mae'r weithdrefn arbrofol gyfan (Ffigur 1) yn cynnwys pum rhan: (i) microfabrication y sglodion perfedd neu sglodion hybrid mewnosodadwy Transwell (camau 1-5; Blwch 1), (ii) paratoi celloedd epithelial berfeddol (Caco-2);blychau 2-5), (iii) diwylliant celloedd epithelial berfeddol ar sglodion berfeddol neu sglodion hybrid (camau 6-9), (iv) anwythiad morffogenesis 3D in vitro (cam 10) a (v) ) i nodweddu microstrwythur epithelial 3D (camau 11-24). Yn olaf, dyluniwyd grŵp rheoli priodol o dan yr epithelial yn ddilys (trafodwyd ymhellach trwy gymharu'r epithelial morffolinol) (trafodwyd ymhellach effeithiolrwydd morffoelial). i reolaethau gofodol, amserol, amodol neu weithdrefnol.
Fe wnaethon ni ddefnyddio dau blatfform diwylliant gwahanol: perfedd-ar-sglodyn gyda sianeli syth neu sianeli troellog aflinol, neu sglodion hybrid sy'n cynnwys mewnosodiadau Transwell (TW) mewn dyfais microhylifol, wedi'u ffugio fel y disgrifir ym Mlwch 1, a cham 1 -5. “Mae Device Fabrication” yn dangos y prif gamau wrth wneud sglodion sengl neu sglodyn hybrid. Mae'r weithdrefn a ddefnyddir yn y protocol hwn.” In vitro morphogenesis” yn dangos y camau cyffredinol y mae celloedd epithelial Caco-2 neu organoid yn cael eu meithrin ar sglodyn berfeddol neu ar fewnosodiadau Transwell o sglodion hybrid, ac yna sefydlu morphogenesis 3D a ffurfio strwythur epithelial nodweddu. Arddangosir rhif cam y rhaglen neu rif blwch o dan bob saeth. t astudiaethau ffisioleg, sefydlu ecosystemau lletyol-microbiome, a modeling.Immunofluorescence clefyd delweddau yn “Gwahaniaethu Cell” yn dangos niwclysau, F-actin a MUC2 a fynegir yn yr haen epithelial 3D Caco-2 a gynhyrchir ar y perfedd sglodion sglodion.MUC2 signalau yn bresennol mewn celloedd goblet a mwcws secretu F o mwcosaidd arwynebau staeniau a gynhyrchir gan mwcws asid staeniau a delweddau mwcosaidd a gynhyrchwyd gan staeniau mwcws Sisialytig Gweddillion N-acetylglucosamine gan ddefnyddio fflwroleuol germ gwenith agglutinin.The ddwy ddelwedd sy'n gorgyffwrdd yn “Host-Microbe Cyd-Diwylliannau” yn dangos cynrychioliadol lletyol-microbiome cyd-ddiwylliannau yn y perfedd ar chip.The panel chwith yn dangos y cyd-diwylliant o E. coli mynegi protein fflwroleuol gwyrdd (GFP) gyda microengineized celloedd E. 3th lleol yr epicoel GFP.Mae 3th dde yn dangos celloedd E. coli microengineered lleol. -diwylliedig gyda 3D Caco-2 celloedd epithelial, ddilyn gan immunofluorescence staenio gyda F-actin (coch) a niwclysau (glas).gwyrdd).Caco-2 celloedd wedi'u meithrin i sefydlu bar haen epithelial 3D. Graddfa, 50 µm.Delweddau yn y rhes waelod: “Gwahaniaethu celloedd” wedi'i addasu gyda chaniatâd cyfeirnod.2.Gwasg Prifysgol Rhydychen;Atgynhyrchwyd gyda chaniatâd Cyf.5.NAS;Addaswyd “Host-Microbe Co-Culture” gyda chaniatâd cyf.3.NAS;“Modelu Clefydau” wedi ei addasu gyda chaniatâd cyfeiriad.5.NAS.
Cafodd y ddau perfedd-ar-sglodion a sglodion hybrid eu ffugio gan ddefnyddio replicas PDMS a gafodd eu dymchwel o fowldiau silicon gan lithography1,44 meddal a phatrymau gyda SU-8. Mae dyluniad y microchannels ym mhob sglodion yn cael ei bennu trwy ystyried hydrodynameg megis straen cneifio a phwysau hydrodynamig1,4,12.The perfedd-ar-a-chip gwreiddiol, sy'n cynnwys dylunio jut-ar-a-chip gwreiddiol, sef dwy set data juxta cyfochrog, sef microchannels syth. wedi datblygu i fod yn berfedd-ar-sglodyn cymhleth (Data Estynedig Ffig. 1b) sy'n cynnwys pâr o ficrosianelau crwm i gymell Mwy o amser preswylio hylif, patrymau llif aflinol, ac anffurfiad aml-axial o gelloedd meithrin (Ffig. 2a–f) 12.Pan fydd angen ail-greu biomecaneg perfedd mwy cymhleth, rydym wedi dewis yn gryf fod Gut-Chip wedi'i ddewis yn gryf. yn cymell morphogenesis 3D mewn ffrâm amser tebyg gyda gradd debyg o dwf epithelial o'i gymharu â'r perfedd-Chip gwreiddiol, waeth beth fo'r cell diwylliedig type.Therefore, i gymell morphogenesis 3D, dyluniadau perfedd ar-sglodion llinol a chymhleth yn ymgyfnewidiol. PDMS replicas halltu ar silicon molds gyda phatrymau SU-8 darparu nodweddion negyddol ar ôl demolding (Ffig.2a).I wneud y perfedd ar sglodyn, cafodd yr haen PDMS uchaf a baratowyd ei bondio'n ddilyniannol i ffilm PDMS mandyllog ac yna ei halinio â'r haen PDMS isaf trwy fondio anghildroadwy gan ddefnyddio triniwr corona (Ffig. 2b–f). ed Data Ffig. 2).Mae'r broses fondio yn cael ei berfformio trwy drin arwynebau'r atgynhyrchiad PDMS a gwydr gyda phlasma ocsigen neu driniaeth corona. Ar ôl sterileiddio'r ddyfais microfabricated sydd ynghlwm wrth y tiwb silicon, roedd y ddyfais gosod yn barod i berfformio morffogenesis 3D o'r epitheliwm berfeddol (Ffigur 2g).
a, Darlun sgematig o baratoi rhannau PDMS o fowldiau silicon patrymog SU-8. Cafodd y datrysiad PDMS heb ei wella ei dywallt ar fowld silicon (chwith), wedi'i halltu ar 60 ° C (canol) a'i ddymchwel (dde).Torrwyd y PDMS dymchwel yn ddarnau a'i lanhau i'w ddefnyddio ymhellach.b, Ffotograff o'r mowld silicon a ddefnyddiwyd i baratoi'r haen uchaf PDMS, ffotograff o'r mowld silicon a ddefnyddiwyd i baratoi'r haen uchaf PDMS, silicon porw. cyfres o ffotograffau o'r cydrannau PDMS uchaf ac isaf a'r dyfais berfeddol ar-sglodyn wedi'i ymgynnull.e, Sgematig o aliniad y cydrannau PDMS uchaf, pilen, ac isaf. Mae pob haen wedi'i bondio'n ddiwrthdro gan plasma neu driniaeth corona. ic cell culture.The perfedd gwneuthuredig ar sglodion ymgynnull gyda thiwb silicon a chwistrell ei roi ar ddyfais sglodion coverslip.The ei roi ar y caead o ddysgl Petri 150 mm ar gyfer processing.The rhwymwr yn cael ei ddefnyddio i gau'r tube.h silicon, cipluniau Gweledol o saernïo sglodion hybrid a 3D morphogenesis gan ddefnyddio sglodion hybrid.Transwell eu paratoi'n annibynnol mewn mewnosoder diwylliannau chips.Transwell mewn mewnosoder celloedd hybrid i mewn i gelloedd coluddol berfeddol mewn mewnosoder diwylliannau coluddol mewn mewnosoder. duce berfeddol 3D morphogenesis.The cyfrwng yn cael ei ddarlifo drwy microchannels o dan yr haen gell a sefydlwyd ar y Transwell insert.Scale bar, 1 cm.h Ailargraffwyd gyda chaniatâd gan reference.4.Elsevier.
Yn y protocol hwn, defnyddiwyd y llinell gell Caco-2 ac organoidau berfeddol fel ffynonellau epithelial (Ffig. 3a).Cafodd y ddau fath o gelloedd eu meithrin yn annibynnol (Blwch 2 a Blwch 5) a'u defnyddio i hadau microsianeli wedi'u gorchuddio ag ECM o berfedd ar-sglodion neu fewnosodiadau Transwell. yn cael eu cynaeafu i baratoi ataliadau celloedd daduniad gan hylif trypsinization (blwch 2). Organoidau berfeddol dynol o biopsïau berfeddol neu echdoriadau llawfeddygol eu meithrin yn cromenni sgaffald Matrigel yn 24-ffynnon platiau i gefnogi'r microenvironment.Medium strwythurol sy'n cynnwys morffogenau hanfodol (fel Wnt, R-spondin, a Noggin ei baratoi ar gyfer atodiad bob dydd) a Noggin yn tyfu organoidau ychwanegol hyd nes y disgrifiwyd Blwch 30 atodiad eraill yn tyfu organoidau 5 diwrnod ychwanegol µm mewn diamedr. Mae organoidau sydd wedi'u tyfu'n llawn yn cael eu cynaeafu a'u datgysylltu'n gelloedd sengl i'w hadu i'r perfedd neu mewnosodiadau Transwell ar sglodyn (Blwch 5).Fel yr ydym wedi adrodd yn flaenorol, gellir ei wahaniaethu yn ôl math o glefyd 12,13 (ee colitis briwiol, clefyd Crohn, canser y colon a'r rhefr, neu roddwr arferol), safle briwiau heb y briw (ee lleoliad y briw, lleoliad y briw (ee, lleoliad nam ar y briwiau) jejunum, ilewm, cecum, colon, neu rectwm). Rydym yn darparu protocol wedi'i optimeiddio ym Mlwch 5 ar gyfer meithrin organoidau colonig (coloidau) sydd fel arfer angen crynodiadau uwch o forffogenau nag organoidau berfeddol bach.
a, Llif gwaith ar gyfer sefydlu morffogenesis perfedd yn y perfedd naddion.Caco-2 epitheliwm berfeddol dynol ac organoidau berfeddol yn cael eu defnyddio yn y protocol hwn i ddangos 3D morphogenesis.The celloedd epithelial ynysig eu hadu yn y perfedd-ar-a-chip dyfais parod (paratoi sglodion). Unwaith y bydd celloedd yn hadu (hadu) a'u hatodi (atodi PDMS0) pilen mandyllog (apiti) i'r diwrnod (apmitical llif) a'i gynnal am y 2 ddiwrnod cyntaf (llif, AP, D0-D2).Mae llif basochrol (BL) hefyd yn cael ei gychwyn ynghyd â chynigion ymestyn cylchol (ymestyn, llif, AP a BL) pan fydd monolayer 2D cyflawn yn cael ei ffurfio. Digwyddodd morffogenesis 3D Intestinal yn ddigymell ar ôl 5 diwrnod o ddiwylliant microfluidic (morphogenesis cam-dangos 2 cam neu lun arbrawf cynrychioliadol) (morphogenesis pwynt-ffocws, D5 pwynt amser-cyferbyniad). graff, 100 µm). Pedwar diagram sgematig yn dangos y rhaeadrau cyfatebol o forffogenesis perfedd (dde uchaf).Mae'r saethau toredig yn y sgematig yn cynrychioli cyfeiriad llif hylif.b, delwedd SEM yn dangos topoleg arwyneb yr epitheliwm Caco-2 3D sefydledig (chwith). dde).c, golwg blaen llorweddol o sefydledig Caco-2 3D, claudin (ZO-1, coch) a philenni ffin brwsh parhaus labelu F-actin (gwyrdd) a niwclysau (glas) Immunofluorescence confocal Delweddu o gelloedd epithelial ar chips.Arrows berfeddol yn pwyntio at y sgematig canol yn nodi lleoliad y newidiad organfocus plane ffocalaidd ar gyfer pob cyfnod plane ffocalaidd a gafwyd. gan microsgopeg cyferbyniad cam ar ddiwrnodau 3, 7, 9, 11, a 13.Mae'r mewnosodiad (dde uchaf) yn dangos y chwyddo uchel y image.e a ddarperir, photomicrograph DIC o epitheliwm organoid 3D a sefydlwyd yn y perfedd ar sleisen a gymerwyd ar ddiwrnod 7.f, delweddau immunofluorescence Overlaid yn dangos marcwyr ar gyfer bôn-gelloedd (LGR5;magenta), celloedd goblet (MUC2; gwyrdd), F-actin (llwyd) a niwclysau (cyan) tyfu ar sglodion perfedd am 3 diwrnod, yn y drefn honno (Chwith) a 13-diwrnod (canol) organoidau ar y epithelial layer.Gweler hefyd Data Estynedig Ffigur 3, sy'n tynnu sylw at LGR5 signalau yn dangos heb MUC2scelin organoidal signaling.Fluorethright epithelial delweddu epithelial 3 epithelial signaling.Fluorethright . a sefydlwyd yn y perfedd ar sglodyn trwy staenio'r bilen plasma gyda llifyn CellMask (dde) ar ddiwrnod 13 o ddiwylliant. Mae bar graddfa yn 50 μm oni nodir yn wahanol.b Wedi'i ailargraffu gyda chaniatâd cyfeirnod.2.Gwasg Prifysgol Rhydychen;c Addaswyd gyda chaniatâd Cyfeiriad.2.Gwasg Prifysgol Rhydychen;d ac dd wedi'i addasu gyda chaniatâd trwy gyfeirnod.12 O dan Creative Commons License CC BY 4.0.
Yn y perfedd ar sglodyn, mae angen addasu wyneb hydroffobig y bilen mandyllog PDMS ar gyfer coating.In ECM llwyddiannus y protocol hwn, rydym yn defnyddio dau ddull gwahanol i addasu hydroffobigrwydd pilenni PDMS.Ar gyfer meithrin celloedd Caco-2, gweithredu arwyneb gan driniaeth UV/osôn yn unig yn ddigon i leihau hydroffobigrwydd yr wyneb PDMS a chôt y microflun PDMS organ celloedd, côt y microflun PDMS celloedd meithrin-2. oid epithelium yn gofyn am functionalization wyneb cemegol sy'n seiliedig i gyflawni dyddodiad effeithlon o broteinau ECM drwy ddilyniannol gwneud cais polyethyleneimine (PEI) a glutaraldehyde i PDMS microchannels.After addasu wyneb, proteinau ECM eu hadneuo i gwmpasu'r wyneb PDMS functionalized ac yna eu cyflwyno i mewn i'r epitheliwm organoid ynysig.Ar ôl i'r celloedd microchannel uchaf yn dechrau cael eu hatodi i mewn i'r celloedd microchannel uchaf. mae celloedd yn ffurfio monolayer cyflawn, tra bod y microchannel isaf yn cynnal amodau statig. Mae'r dull optimeiddio hwn ar gyfer actifadu arwyneb a chotio ECM yn galluogi atodi epitheliwm organoid i gymell morffogenesis 3D ar wyneb PDMS.
Mae diwylliannau Transwell hefyd angen cotio ECM cyn hadu celloedd;fodd bynnag, nid diwylliannau Transwell oes angen camau pretreatment cymhleth i actifadu wyneb mewnosodiadau mandyllog.For tyfu celloedd Caco-2 ar Transwell mewnosod, ECM cotio ar mewnosodiadau mandyllog cyflymu'r ymlyniad o ddatgymalu celloedd Caco-2 (<1 awr) a ffurfio rhwystr cyffordd dynn (<1-2 diwrnod). monolayer cyflawn gyda chywirdeb rhwystr .Transwell diwylliannau yn cael eu perfformio mewn platiau 24-ffynnon heb ddefnyddio sglodion hybrid.
Gellir cychwyn morffogenesis 3D in vitro trwy gymhwyso llif hylif i'r agwedd basolateral o haen epithelial sefydledig.Yn y perfedd ar sglodion, dechreuodd morffogenesis epithelial pan oedd y cyfrwng yn cael ei ddarlifo i mewn i'r microsianeli uchaf ac isaf (Ffig. 3a). i gelloedd rhwymo ar bilennau mandyllog a chynhyrchu straen cneifio luminal, rydym yn nodweddiadol yn gwneud cais llif deuol yn y perfedd ar sglodion hybrid chip.In, mewnosod Transwell sy'n cynnwys monolayers epithelial eu gosod yn y chips.Then hybrid, y cyfrwng ei gymhwyso o dan yr ochr basolateral y mandyllog Transwell mewnosoder drwy'r microchannel.Intestinal morphogenesis digwydd 3-5 diwrnod initiation diwylliannau basolateral ar ôl diwylliannau basolateral ination 3-5 diwrnod.
Gellir dadansoddi nodweddion morffolegol haenau epithelial 3D micro -beirianneg trwy gymhwyso amrywiol foddau delweddu, gan gynnwys microsgopeg cyferbyniad cyfnod, microsgopeg cyferbyniad ymyrraeth wahaniaethol (DIC), SEM, neu ficrosgopeg confocal immunofluorescence (ffigurau 3 a 4 yn gwneud y cyferbyniad yn hawdd neu dicter ue i dryloywder optegol PDMS a ffilmiau polyester, gall y llwyfannau sglodion perfedd-ar-sglodyn a hybrid ddarparu delweddu amser real yn y fan a'r lle heb fod angen ei rannu neu ddadosod y ddyfais. Pan fydd perfformio delweddu immunofluorescence (ffigurau 1, 3c, f a 4b yn nodweddiadol, yn cael Triton X-100 a 2% (wt/vol)) serwm albwmin buchol (BSA), mewn trefn. Yn dibynnu ar y math o gell, gellir defnyddio gwahanol atgyweirwyr, athreiddwyr, ac asiantau blocio. Gwrthgyrff primary sy'n targedu celloedd llinach-ddibynnol neu farcwyr celloedd y mae celloedd yn eu dilyn mewn serch hynny ar y blaen, gan ddilyniant , 4 ′, 6-diamidino-2-phenylene) indole, dapi) neu f-actin (ee, phalloidin wedi'i labelu'n fflwroleuol). Gellir perfformio delweddu byw wedi'i seilio ar bluorescence yn y fan a'r lle i ganfod cynhyrchiad mwcws (Ffig.1, "Gwahaniaethu cell" a "ffisioleg perfedd"), cytrefu ar hap o gelloedd microbaidd (Ffig. 1, "Host-microb cyd-ddiwylliant") , recriwtio celloedd imiwnedd (Ffig. 1, 'Modelu Clefyd') neu gyfuchliniau morffoleg epithelial 3D (Ffig. 3c,f). fel y disgrifir yn cyf.Fel y dangosir yn Ffig. 2, gall y morffoleg epithelial 3D yn ogystal â'r microvilli ar y ffin brwsh apical yn cael ei ddelweddu gan SEM (Ffig. 3b). Gall mynegiant y marcwyr gwahaniaethu yn cael ei asesu gan berfformio meintiol PCR5 neu un-gell RNA dilyniannu. a ddefnyddir ar gyfer dadansoddiad moleciwlaidd neu enetig.
a, Llif gwaith ar gyfer sefydlu morffogenesis berfeddol mewn sglodion hybrid.Caco-2 ac organoidau berfeddol yn cael eu defnyddio yn y protocol hwn i ddangos morphogenesis 3D mewn sglodion hybrid platform.Dissociated celloedd epithelial eu hadu mewn mewnosod Transwell parod (TW prep; gweler y ffigur isod).Unwaith celloedd yn hadu (hadu Ôl) ac ynghlwm wrth bilen polyester holl mewn diwylliant Transwellter 7 diwrnodau mewnosodedig (mewnosodwyd celloedd TW sengl yn Transwell diwylliant, mewnosodwyd celloedd sengl mewn diwylliant Transwell). sy'n cynnwys monolayer 2D o gelloedd epithelial ei integreiddio i mewn i sglodion hybrid i gyflwyno llif basolateral (Llif, BL), a arweiniodd yn y pen draw at gynhyrchu haen epithelial 3D (morphogenesis).Micrograffau cyferbyniad Cyfnod yn dangos nodweddion morffolegol celloedd epithelial organ dynol sy'n deillio o rhoddwr arferol (llinell C103) colon esgynnol ar bob pwynt cam arbrofol. gall sglodion brid (sgematig chwith) arwain at morffogenesis 3D o gelloedd epithelial organoid gyda golygfeydd microsgopeg confocal o'r brig i lawr yn cael eu cymryd mewn gwahanol safleoedd Z (uwch, canol, ac is;gweler sgematig dde a llinellau dotiog cyfatebol).dangosodd nodweddion morffolegol amlwg.F-actin (cyan), cnewyllyn (llwyd).c, micrograffau confocal fflworoleuedd (golwg onglog 3D) o gelloedd epithelial sy'n deillio o organoid wedi'u meithrin yn Transwell statig (TW; mewnosod o fewn blwch doriad gwyn) yn erbyn sglodion hybrid (saethiad llawn mwyaf) gan gymharu morffoleg 2D yn erbyn croestoriad uchaf, cornel dde 2D croestoriad yn y drefn honno (cornel dde croestoriad uchaf; Mae “XZ”) hefyd yn dangos nodweddion 2D a 3D. Graddfa bar, 100 µm.c Wedi'i ailargraffu gyda chaniatâd cyfeirnod.4.Elsevier.
Gellir paratoi rheolaethau trwy feithrin yr un celloedd (Caco-2 neu gelloedd epithelial organoid berfeddol) yn haenau mono-ddimensiwn dau ddimensiwn o dan amodau diwylliant statig confensiynol.
Dylai'r broses lithograffeg meddal yn cael ei berfformio mewn room.For glân pob haen ar y sglodion (haenau uchaf ac isaf a philenni) a sglodion hybrid, photomasks gwahanol yn cael eu defnyddio a'u gwneud ar wafferi silicon ar wahân oherwydd bod uchder y microchannels yn different.The uchder targed y microsianeli uchaf ac isaf y perfedd ar y sglodion yn 500 µm, uchder y sianel targed hybrid yn y drefn honno yw 500 µm, 2 µm a chinsial. µm.
Rhowch wafer silicon 3-modfedd mewn dysgl gyda aseton.Gently chwyrlïo y plât am 30 eiliad, yna aer sych y wafer.Transfer y wafer i blât gyda IPA, yna troelli y plât am 30 s i lanhau.
Yn ddewisol, gellir defnyddio hydoddiant piranha (cymysgedd o hydrogen perocsid ac asid sylffwrig crynodedig, 1:3 (cyfrol / cyf)) i gael gwared ar weddillion organig o'r wyneb wafferi silicon i'r eithaf.
Ateb Piranha yn hynod cyrydol ac yn cynhyrchu rhagofalon diogelwch heat.Additional yn necessary.For gwaredu gwastraff, yn caniatáu i'r ateb i oeri a throsglwyddo i glan, gwastraff sych container.Use cynwysyddion eilaidd a labelu gwastraff yn gywir containers.Please dilynwch ganllawiau diogelwch y cyfleuster ar gyfer gweithdrefnau manylach.
Dadhydradu'r wafferi trwy eu gosod ar blât poeth 200 ° C am 10 munud. Ar ôl dadhydradu, cafodd y wafer ei ysgwyd mewn aer bum gwaith i oeri.
Arllwyswch ~10 go ffotoresist SU-8 2100 ar ganol y wafer silicon wedi'i lanhau.Defnyddiwch pliciwr i wasgaru'r ffotoresydd yn gyfartal ar y wafer. O bryd i'w gilydd rhowch y wafer ar blât poeth 65°C i wneud y ffotoresist yn llai gludiog ac yn haws i'w wasgaru.Peidiwch â gosod y wafer yn uniongyrchol ar y plât poeth.
Dosbarthwyd SU-8 yn gyfartal ar y wafer trwy redeg cotio sbin.Rhaglenwch gylchdro sy'n dod i mewn o'r SU-8 ar gyfer 5-10 s i luosogi ar 500 rpm ar gyflymiad o 100 rpm/s. Gosodwch y prif sbin ar gyfer patrwm trwch 200 µm ar 1,500 rpm, neu gyflawni haen uchaf 2m rpm (2m µ0) uchder perfedd ar y sglodyn; gweler “Camau critigol” isod) wedi'i osod ar gyflymiad o 300 rpm / s 30 eiliad ar 1,200 rpm.
Gellir addasu'r prif gyflymder troelli yn ôl trwch targed y patrwm SU-8 ar y wafer silicon.
Er mwyn ffugio patrymau SU-8 o uchder 500 µm ar gyfer haen uchaf y coludd ar y sglodion, cafodd y cotio sbin a chamau pobi meddal y Blwch hwn (camau 7 ac 8) eu hailadrodd yn ddilyniannol (gweler cam 9) i gynhyrchu dwy haen o 250 µm Haen drwchus o SU-8, y gellir ei haenu a'i chysylltu â haen UV o uchel yn y cam 0.0 µm hwn, gan wneud y blwch hwn yn uchel 0 µ µ
Pobwch y wafferi wedi'u gorchuddio â SU-8 yn feddal trwy osod y wafferi yn ofalus ar blât poeth ar 65 ° C am 5 munud, yna newidiwch y gosodiad i 95 ° C a'i ddeor am 40 munud ychwanegol.
Er mwyn cyrraedd uchder o 500 μm o batrwm SU-8 yn y microchannel uchaf, ailadroddwch gamau 7 ac 8 i gynhyrchu dwy haen SU-8 250 μm o drwch.
Gan ddefnyddio'r Aliniwr Mwgwd UV, gwnewch brawf lamp yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr i gyfrifo amser datguddio'r wafer. (amser amlygiad, ms) = (dos amlygiad, mJ/cm2)/(pŵer lamp, mW/cm2).
Ar ôl pennu'r amser amlygiad, rhowch y mwgwd ffoto ar ddeiliad mwgwd yr aliniwr mwgwd UV a gosodwch y mwgwd ffoto ar y wafer â gorchudd SU-8.
Rhowch wyneb printiedig y mwgwd ffoto yn uniongyrchol ar ochr gorchuddio SU-8 y wafer silicon i leihau gwasgariad UV.
Amlygwch y wafer wedi'i orchuddio â SU-8 a mwgwd ffoto yn fertigol i 260 mJ/cm2 o olau UV ar gyfer yr amser amlygiad a bennwyd ymlaen llaw (gweler cam 10 o'r blwch hwn).
Ar ôl dod i gysylltiad â UV, cafodd wafferi silicon wedi'u gorchuddio â SU-8 eu pobi ar 65 ° C am 5 munud a 95 ° C am 15 munud ar bob plât poeth i wneud patrymau gydag uchder o 200 μm. Ymestyn yr amser ôl-bobi ar 95 ° C i 30 munud i wneud patrymau gydag uchder o 500 µm.
Mae'r datblygwr yn cael ei dywallt i ddysgl gwydr, ac mae'r wafer pobi yn cael ei roi yn y dish.The cyfaint o datblygwr SU-8 Gall amrywio yn dibynnu ar faint y plât gwydr.Make yn siwr i ddefnyddio digon o datblygwr SU-8 i gael gwared yn gyfan gwbl heb eu hamlygu SU-8.For enghraifft, wrth ddefnyddio dysgl wydr 150 mm diamedr gyda chynhwysedd 1 L, defnyddiwch ~300 ml o SU-8 munud y datblygwr achlysurol gyda llwydni cylchdro ysgafn.
Rinsiwch y mowld datblygedig gyda ~10 ml o ddatblygwr ffres ac yna IPA trwy chwistrellu'r hydoddiant gan ddefnyddio pibed.
Rhowch y wafer mewn glanhawr plasma a'i amlygu i plasma ocsigen (nwy atmosfferig, pwysedd targed 1 × 10−5 Torr, pŵer 125 W) am 1.5 munud.
Gosodwch y wafer mewn sychwr gwactod gyda sleid wydr y tu mewn.Gellir gosod wafferi a sleidiau ochr yn ochr. .
Dadmer ffiol o gelloedd Caco-2 wedi'u rhewi mewn baddon dŵr 37°C, yna trosglwyddwch y celloedd sydd wedi dadmer i fflasg T75 sy'n cynnwys 15 mL o gyfrwng Caco-2 37°C wedi'i gynhesu ymlaen llaw.
I basio celloedd Caco-2 ar ~ 90% cydlifiad, cyfrwng Caco-2 cynnes cyntaf, PBS, a 0.25% trypsin / 1 mM EDTA mewn baddon dŵr 37 ° C.
Allsugnwch y cyfrwng trwy wactod aspiration.Wash celloedd ddwywaith gyda 5 ml o PBS cynnes trwy ailadrodd dyhead gwactod ac ychwanegu PBS ffres.