Diolch am ymweld â Nature.com.Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Yn arddangos carwsél o dri sleid ar unwaith.Defnyddiwch y botymau Blaenorol a Nesaf i symud trwy dri sleid ar y tro, neu defnyddiwch y botymau llithrydd ar y diwedd i symud trwy dri sleid ar y tro.
Mae'r rhwystr gwaed-ymennydd a'r rhwystr gwaed-ymennydd yn atal asiantau biotherapiwtig rhag cyrraedd eu targedau yn y system nerfol ganolog, a thrwy hynny yn rhwystro triniaeth effeithiol o glefydau niwrolegol.Er mwyn darganfod cludwyr ymennydd newydd mewn vivo, fe wnaethom gyflwyno llyfrgell peptid phage T7 a hylif gwaed a serebro-sbinol (CSF) a gasglwyd yn gyfresol gan ddefnyddio model pwll mawr ymwybodol mewn tuniau o lygod mawr.Cafodd clonau phage penodol eu cyfoethogi'n fawr yn CSF ar ôl pedair rownd o ddethol.Datgelodd profion peptidau ymgeisydd unigol fwy na 1000-plyg cyfoethogi yn CSF.Cadarnhawyd bioactifedd y cyflenwad peptid-gyfryngol i'r ymennydd gan ostyngiad o 40% yn lefel yr amyloid-β yn yr hylif serebro-sbinol gan ddefnyddio atalydd peptid BACE1 sy'n gysylltiedig â'r peptid tramwy newydd a nodwyd.Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai'r peptidau a nodir gan ddulliau dethol phage in vivo fod yn gyfryngau defnyddiol ar gyfer cyflwyno macromoleciwlau systemig i'r ymennydd gydag effaith therapiwtig.
Mae ymchwil therapi wedi'i dargedu yn y system nerfol ganolog (CNS) wedi canolbwyntio'n bennaf ar nodi cyffuriau ac asiantau optimaidd sy'n arddangos priodweddau sy'n targedu CNS, gyda llai o ymdrech i ddarganfod y mecanweithiau sy'n gyrru cyflenwi cyffuriau gweithredol i'r ymennydd.Mae hyn yn dechrau newid nawr gan fod cyflenwi cyffuriau, yn enwedig moleciwlau mawr, yn rhan annatod o ddatblygiad cyffuriau niwrowyddoniaeth fodern.Mae amgylchedd y system nerfol ganolog wedi'i ddiogelu'n dda gan y system rhwystr serebro-fasgwlaidd, sy'n cynnwys y rhwystr gwaed-ymennydd (BBB) ​​a'r rhwystr gwaed-ymennydd (BCBB)1, gan ei gwneud hi'n heriol dosbarthu cyffuriau i'r ymennydd1,2.Amcangyfrifir bod bron pob cyffur moleciwl mawr a mwy na 98% o gyffuriau moleciwl bach yn cael eu dileu o'r ymennydd3.Dyna pam ei bod yn bwysig iawn nodi systemau cludo ymennydd newydd sy'n darparu cyflenwad effeithlon a phenodol o gyffuriau therapiwtig i'r CNS 4,5.Fodd bynnag, mae'r BBB a'r BCSFB hefyd yn gyfle gwych i gyflenwi cyffuriau wrth iddynt dreiddio a mynd i mewn i holl strwythurau'r ymennydd trwy ei fasgwlaidd helaeth.Felly, mae'r ymdrechion presennol i ddefnyddio dulliau anfewnwthiol o gyflenwi i'r ymennydd yn seiliedig i raddau helaeth ar fecanwaith cludiant trwy gyfrwng derbynnydd (PMT) gan ddefnyddio'r derbynnydd BBB6 mewndarddol.Er gwaethaf datblygiadau allweddol diweddar wrth ddefnyddio'r llwybr derbynnydd trosglwyddo7,8, mae angen datblygu systemau darparu newydd ymhellach gyda gwell eiddo.I'r perwyl hwn, ein nod oedd nodi peptidau sy'n gallu cyfryngu trafnidiaeth CSF, gan y gallent mewn egwyddor gael eu defnyddio i ddosbarthu macromoleciwlau i'r CNS neu i agor llwybrau derbynyddion newydd.Yn benodol, gall derbynyddion a chludwyr penodol y system serebro-fasgwlaidd (BBB a BSCFB) fod yn dargedau posibl ar gyfer cyflenwi cyffuriau biotherapiwtig yn weithredol ac yn benodol.Mae hylif serebro-sbinol (CSF) yn gynnyrch cyfrinachol o'r plecsws coroid (CS) ac mae mewn cysylltiad uniongyrchol â hylif rhyng-ranol yr ymennydd trwy'r gofod isaracnoid a'r gofod fentriglaidd4.Yn ddiweddar, dangoswyd bod hylif serebro-sbinol subarachnoid yn tryledu'n ormodol i interstitiwm yr ymennydd9.Gobeithiwn gael mynediad i'r gofod parenchymal gan ddefnyddio'r llwybr mewnlif subarachnoid hwn neu'n uniongyrchol trwy'r BBB.Er mwyn cyflawni hyn, gwnaethom weithredu strategaeth ddethol phage in vivo gadarn sy'n ddelfrydol yn nodi peptidau a gludir gan y naill neu'r llall o'r ddau lwybr gwahanol hyn.
Rydym bellach yn disgrifio dull sgrinio dangosiad in vivo phage dilyniannol gyda samplu CSF ynghyd â dilyniannu trwybwn uchel (HTS) i fonitro rowndiau dethol cychwynnol gyda'r amrywiaeth llyfrgell uchaf.Cynhaliwyd sgrinio ar lygod mawr ymwybodol gyda chanwla seston mawr (CM) wedi'i fewnblannu'n barhaol er mwyn osgoi halogiad gwaed.Yn bwysig, mae'r dull hwn yn dewis targedu ymennydd a pheptidau gyda gweithgaredd trafnidiaeth ar draws y rhwystr serebro-fasgwlaidd.Fe wnaethom ddefnyddio T7 phages oherwydd eu maint bach (~ 60 nm)10 ac awgrymwyd eu bod yn addas ar gyfer cludo fesiglau sy'n caniatáu croesi'r rhwystr endothelaidd a/neu epithelial-medulla yn drawsgellog.Ar ôl pedair rownd o banio, ynyswyd poblogaethau phage gan ddangos cyfoethogiad cryf mewn vivo CSF ​​a chysylltiad microcynhwysiant ymennydd.Yn bwysig, roeddem yn gallu cadarnhau ein canfyddiadau trwy ddangos bod y peptidau ymgeisydd gorau a ffefrir wedi'u syntheseiddio'n gemegol yn gallu cludo cargo protein i'r hylif serebro-sbinol.Yn gyntaf, sefydlwyd effeithiau ffarmacodynamig y CNS trwy gyfuno peptid tramwy blaenllaw ag atalydd y peptid BACE1.Yn ogystal â dangos y gall strategaethau sgrinio swyddogaethol in vivo nodi peptidau cludo ymennydd newydd fel cludwyr cargo protein effeithiol, rydym yn disgwyl i ddulliau dethol swyddogaethol tebyg ddod yn bwysig hefyd wrth nodi llwybrau cludo ymennydd newydd.
Yn seiliedig ar unedau ffurfio plac (PFU), ar ôl y cam pecynnu phage, dyluniwyd a chrëwyd llyfrgell o beptidau phage T7 llinellol ar hap 12-mer gydag amrywiaeth o tua 109 (gweler Deunyddiau a Dulliau).Mae'n bwysig nodi ein bod wedi dadansoddi'r llyfrgell hon yn ofalus cyn panio mewn vivo.PCR ymhelaethu ar samplau llyfrgell phage gan ddefnyddio paent preimio wedi'u haddasu a gynhyrchir amplicons a oedd yn uniongyrchol berthnasol i HTS (Atodol Ffig. 1a).Oherwydd a) gwallau dilyniannu HTS11, b) effaith ar ansawdd paent preimio (NNK)1-12, ac c) presenoldeb math gwyllt (wt) phage (mewnosodiadau sgerbwd) yn y llyfrgell wrth gefn, gweithredwyd gweithdrefn hidlo dilyniant i echdynnu gwybodaeth ddilyniant wedi'i gwirio yn unig (Ffig Atodol 1b).Mae'r camau hidlo hyn yn berthnasol i holl lyfrgelloedd dilyniannu HTS.Ar gyfer y llyfrgell safonol, cafwyd cyfanswm o 233,868 o ddarlleniadau, gyda 39% ohonynt yn bodloni'r meini prawf hidlo ac yn cael eu defnyddio ar gyfer dadansoddi a dethol llyfrgelloedd ar gyfer rowndiau dilynol (Ffigur Atodol 1c–e).Roedd y darlleniadau yn bennaf yn lluosrifau o 3 phâr o sylfaen o hyd gyda brig ar 36 niwcleotidau (Ffig Atodol 1c), gan gadarnhau cynllun y llyfrgell (NNK) 1-12.Yn nodedig, roedd tua 11% o aelodau’r llyfrgell yn cynnwys mewnosodiad 12-dimensiwn o fath gwyllt (wt) asgwrn cefn PAGISRELVDKL, ac roedd bron i hanner y dilyniannau (49%) yn cynnwys mewnosodiadau neu ddileadau.Cadarnhaodd HTS y llyfrgell llyfrgell yr amrywiaeth uchel o peptidau yn y llyfrgell: dim ond unwaith y canfuwyd mwy nag 81% o ddilyniannau peptid a dim ond 1.5% a ddigwyddodd mewn ≥4 copi (Ffig Atodol 2a).Roedd cydberthynas dda rhwng amleddau asidau amino (aa) ym mhob un o'r 12 safle yn y repertoire â'r amleddau a ddisgwylir ar gyfer nifer y codonau a gynhyrchir gan repertoire dirywiol NKK (Ffig Atodol 2b).Roedd yr amlder a arsylwyd o weddillion aa a amgodiwyd gan y mewnosodiadau hyn yn cydberthyn yn dda â'r amledd a gyfrifwyd (r = 0.893) (Ffig Atodol 2c).Mae paratoi llyfrgelloedd phage ar gyfer pigiad yn cynnwys y camau o ymhelaethu a thynnu endotoxin.Dangoswyd yn flaenorol y gallai hyn leihau amrywiaeth llyfrgelloedd ffag12,13.Felly, fe wnaethom ddilyniannu llyfrgell ffag wedi'i chwyddo â phlât a oedd wedi cael ei thynnu o endotoxin a'i chymharu â'r llyfrgell wreiddiol i amcangyfrif amlder AA.Gwelwyd cydberthynas gref (r = 0.995) rhwng y pwll gwreiddiol a'r pwll wedi'i chwyddo a'i buro (Ffig Atodol 2d), sy'n nodi nad oedd cystadleuaeth rhwng clonau wedi'u chwyddo ar blatiau gan ddefnyddio T7 phage yn achosi rhagfarn fawr.Mae'r gymhariaeth hon yn seiliedig ar amlder motiffau tripeptid ym mhob llyfrgell, gan na ellir dal amrywiaeth y llyfrgelloedd (~109) yn llawn hyd yn oed gyda HTS.Datgelodd dadansoddiad amledd o aa ym mhob safle ogwydd bach dibynnol ar safle yn nhair safle olaf y repertoire a gofnodwyd (Ffig Atodol 2e).I gloi, daethom i'r casgliad bod ansawdd ac amrywiaeth y llyfrgell yn dderbyniol a dim ond mân newidiadau mewn amrywiaeth a arsylwyd oherwydd ymhelaethu a pharatoi llyfrgelloedd ffag rhwng sawl rownd o ddethol.
Gellir cynnal samplu hylif serebro-sbinol cyfresol trwy fewnblannu caniwla yn llawfeddygol i mewn i CM llygod mawr ymwybodol er mwyn hwyluso'r broses o adnabod phage T7 a chwistrellir yn fewnwythiennol (iv) drwy'r BBB a/neu BCSFB (Ffig. 1a-b).Defnyddiwyd dwy fraich ddethol annibynnol (breichiau A a B) yn y tair rownd gyntaf o ddethol in vivo (Ffig. 1c).Fe wnaethom gynyddu llymder y detholiad yn raddol trwy leihau cyfanswm y phage a gyflwynwyd yn y tair rownd gyntaf o ddethol.Ar gyfer y bedwaredd rownd o panio, fe wnaethom gyfuno samplau o ganghennau A a B a pherfformio tri detholiad annibynnol ychwanegol.I astudio priodweddau in vivo gronynnau phage T7 yn y model hwn, chwistrellwyd phage math gwyllt (PAGISRELVDKL master insert) i lygod mawr trwy wythïen y gynffon.Dangosodd adferiad phages o hylif serebro-sbinol a gwaed ar wahanol adegau amser fod gan ffagau icosahedral T7 cymharol fach gyfnod clirio cychwynnol cyflym o'r adran gwaed (Ffig Atodol 3).Yn seiliedig ar y titers a weinyddwyd a chyfaint gwaed y llygod mawr, fe wnaethom gyfrifo mai dim ond tua 1% wt.canfuwyd phage o'r dos a roddwyd yn y gwaed 10 munud ar ôl pigiad mewnwythiennol.Ar ôl y dirywiad cyflym cychwynnol hwn, mesurwyd cliriad cynradd arafach gyda hanner oes o 27.7 munud.Yn bwysig, dim ond ychydig iawn o ffagau a adalwyd o'r adran CSF, gan ddangos cefndir isel ar gyfer mudo phage gwyllt i'r adran CSF (Ffig Atodol 3).Ar gyfartaledd, dim ond tua 1 x 10-3% o titrau o T7 phage yn y gwaed a 4 x 10-8% o ffagau wedi'u trwytho i ddechrau a ganfuwyd yn yr hylif serebro-sbinol dros y cyfnod samplu cyfan (0-250 mun).Yn nodedig, roedd hanner oes (25.7 munud) ffage math gwyllt mewn hylif serebro-sbinol yn debyg i'r hyn a welwyd mewn gwaed.Mae'r data hyn yn dangos bod y rhwystr sy'n gwahanu'r adran CSF oddi wrth y gwaed yn gyfan mewn llygod mawr sydd wedi'u tunio â CM, gan ganiatáu dewis mewn vivo o lyfrgelloedd ffag i nodi clonau sy'n cael eu cludo'n hawdd o'r gwaed i'r adran CSF.
(a) Sefydlu dull ar gyfer ailsamplu hylif serebro-sbinol (CSF) o bwll mawr.(b) Diagram yn dangos lleoliad cellog rhwystr y system nerfol ganolog (CNS) a'r strategaeth ddethol a ddefnyddir i nodi peptidau sy'n croesi'r rhwystr gwaed-ymennydd (BBB) ​​a'r rhwystr gwaed-ymennydd.(c) Siart llif sgrinio arddangos in vivo phage.Ym mhob rownd o ddethol, cafodd phages (dynodwyr anifeiliaid y tu mewn i'r saethau) eu chwistrellu'n fewnwythiennol.Cedwir dwy gangen amgen annibynnol (A, B) ar wahân tan y 4edd rownd ddethol.Ar gyfer rowndiau dethol 3 a 4, cafodd pob clôn phage a dynnwyd o CSF ​​ei ddilyniannu â llaw.(d) Cineteg ffage wedi'i ynysu o waed (cylchoedd coch) a hylif serebro-sbinol (trionglau gwyrdd) yn ystod y rownd gyntaf o ddethol dau lygod mawr tun ar ôl pigiad mewnwythiennol o'r llyfrgell peptid T7 (2 x 1012 phages/anifail).Mae sgwariau glas yn nodi'r crynodiad cychwynnol cyfartalog o phage yn y gwaed, wedi'i gyfrifo o faint o phage wedi'i chwistrellu, gan ystyried cyfanswm cyfaint y gwaed.Mae'r sgwariau du yn dynodi pwynt croestoriad y llinell y wedi'i allosod o grynodiadau phage gwaed.(d,dd) Cyflwynwch amledd a dosbarthiad cymharol yr holl fotiffau tripeptid gorgyffwrdd posibl a geir yn y peptid.Dangosir nifer y motiffau a ddarganfuwyd mewn 1000 o ddarlleniadau.Mae motiffau wedi'u cyfoethogi'n sylweddol (p < 0.001) wedi'u marcio â dotiau coch.(e) Plot gwasgariad cydberthynas yn cymharu amledd cymharol motiff tripeptid y llyfrgell chwistrellu â ffag sy'n deillio o waed o anifeiliaid #1.1 a #1.2.(dd) Plot gwasgariad cydberthynas sy'n cymharu amlderau cymharol motiffau phage tripeptide anifeiliaid #1.1 a #1.2 wedi'u hynysu mewn gwaed a hylif serebro-sbinol.(g, h) Cynrychiolaeth ID dilyniant o phage wedi'i gyfoethogi mewn gwaed (g) yn erbyn llyfrgelloedd wedi'i chwistrellu a phage wedi'i gyfoethogi yn CSF (h) yn erbyn gwaed ar ôl rownd o ddetholiad in vivo yn y ddau anifail.Mae maint y cod un llythyren yn dangos pa mor aml mae'r asid amino hwnnw'n digwydd yn y safle hwnnw.Gwyrdd = pegynol, porffor = niwtral, glas = sylfaenol, coch = asidig a du = asidau amino hydroffobig.Cynlluniwyd a chynhyrchwyd Ffigur 1a, b gan Eduard Urich.
Fe wnaethon ni chwistrellu llyfrgell peptid phage i ddau lygod mawr offeryn CM (cladinau A a B) a phage ynysig o hylif serebro-sbinol a gwaed (Ffigur 1d).Roedd clirio cyflym cychwynnol y llyfrgell yn llai amlwg o'i gymharu â'r ffag gwyllt.Hanner oes cymedrig y llyfrgell chwistrellu yn y ddau anifail oedd 24.8 munud mewn gwaed, yn debyg i phage math gwyllt, a 38.5 munud yn CSF.Roedd samplau gwaed a hylif serebro-sbinol ffage o bob anifail yn destun HTS a dadansoddwyd pob peptid a nodwyd ar gyfer presenoldeb motiff tripeptid byr.Dewiswyd motiffau tripeptid oherwydd eu bod yn darparu sylfaen fach iawn ar gyfer ffurfio strwythur a rhyngweithiadau peptid-protein14,15.Gwelsom gydberthynas dda yn nosbarthiad y motiffau rhwng y llyfrgell phage wedi'i chwistrellu a chlonau a dynnwyd o waed y ddau anifail (Ffig. 1e).Mae'r data'n dangos mai ychydig yn unig y mae cyfansoddiad y llyfrgell wedi'i gyfoethogi yn y adran waed.Dadansoddwyd amlder asidau amino a dilyniannau consensws ymhellach ym mhob safle gan ddefnyddio addasiad o feddalwedd Weblogo16.Yn ddiddorol, canfuom gyfoethogiad cryf mewn gweddillion glycin gwaed (Ffig. 1g).Pan gafodd gwaed ei gymharu â chlonau a ddewiswyd o CSF, gwelwyd detholiad cryf a rhai dad-ddewis o fotiffau (Ffig. 1f), ac roedd rhai asidau amino yn ffafriol yn bresennol mewn swyddi a bennwyd ymlaen llaw yn y 12 aelod (Ffig. 1h).Yn nodedig, roedd anifeiliaid unigol yn amrywio'n sylweddol o ran hylif serebro-sbinol, tra bod y ddau anifail yn cyfoethogi glycin gwaed (Ffig Atodol 4a-j).Ar ôl hidlo llym o ddata dilyniant yn hylif serebro-sbinol anifeiliaid # 1.1 a # 1.2, cafwyd cyfanswm o 964 a 420 o beptidau 12-mer unigryw (Ffig Atodol 1d-e).Chwyddwyd y clonau phage ynysig a buont yn destun ail rownd o ddetholiad in vivo.Roedd Phage a dynnwyd o'r ail rownd o ddethol yn destun HTS ym mhob anifail a defnyddiwyd yr holl peptidau a nodwyd fel mewnbwn i raglen adnabod motiffau i ddadansoddi achosion o fotiffau tripeptid (Ffig. 2a, b, ef).O'i gymharu â'r cylch cyntaf o'r phage a adferwyd o CSF, gwelsom ddetholiad pellach a dad-ddewis llawer o fotiffau yn CSF yng nghanghennau A a B (Ffig. 2).Defnyddiwyd algorithm adnabod rhwydwaith i benderfynu a oeddent yn cynrychioli patrymau gwahanol o ddilyniant cyson.Arsylwyd tebygrwydd clir rhwng y dilyniannau 12-dimensiwn a adferwyd gan CSF mewn cladin amgen A (Ffig. 2c, d) a chladin B (Ffig. 2g, h).Datgelodd y dadansoddiad cyfun ym mhob cangen broffiliau dethol gwahanol ar gyfer peptidau 12-mer (Ffig Atodol 5c,d) a chynnydd yn y gymhareb CSF/titer gwaed dros amser ar gyfer clonau cyfun ar ôl ail rownd y detholiad o'i gymharu â'r rownd gyntaf o ddethol (Ffig Atodol 5e).).
Cyfoethogi motiffau a pheptidau mewn hylif serebro-sbinol gan ddwy rownd olynol o ddetholiad arddangos ffage swyddogaethol in vivo.
Cafodd yr holl ffagiau hylif serebro-sbinol a adferwyd o rownd gyntaf pob anifail (anifeiliaid #1.1 a #1.2) eu cronni, eu chwyddo, eu dilyniannu gan HT a'u hail-chwistrellu gyda'i gilydd (2 x 1010 phages/anifail) 2 lygod mawr tuniedig SM (#1.1 → #).2.1 a 2.2, 1.2 → 2.3 a 2.4).(a,b,e,f) Plotiau gwasgariad cydberthynas sy'n cymharu amledd cymharol motiffau tripeptid yr holl ffagau sy'n deillio o CSF ​​yn y rownd ddethol gyntaf a'r ail.Amlder a dosbarthiad cymharol motiffau sy'n cynrychioli'r holl dripeptidau gorgyffwrdd posibl a geir mewn peptidau yn y ddau gyfeiriadedd.Dangosir nifer y motiffau a ddarganfuwyd mewn 1000 o ddarlleniadau.Amlygir motiffau a gafodd eu dewis yn sylweddol (p < 0.001) yn un o'r llyfrgelloedd a gymharwyd â dotiau coch.(c, d, g, h) Dilyniant logo cynrychioliad o'r holl ddilyniannau hir 12 asid amino llawn CSF yn seiliedig ar rowndiau 2 ac 1 o ddetholiad in vivo.Mae maint y cod un llythyren yn dangos pa mor aml mae'r asid amino hwnnw'n digwydd yn y safle hwnnw.I gynrychioli’r logo, mae amlder dilyniannau CSF a dynnwyd o anifeiliaid unigol rhwng dwy rownd ddethol yn cael ei gymharu a dangosir y dilyniannau cyfoethog yn yr ail rownd: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 a (h) #1.2–#2.4.Yr asidau amino sydd wedi'u cyfoethogi fwyaf mewn safle penodol yn (c, d) anifeiliaid.2.1 a dim.2.2 neu (g, h) mewn anifeiliaid rhif.2.3 a dim.2.4 yn cael eu dangos mewn lliw.Gwyrdd = pegynol, porffor = niwtral, glas = sylfaenol, coch = asidig a du = asidau amino hydroffobig.
Ar ôl y drydedd rownd o ddethol, fe wnaethom nodi 124 o ddilyniannau peptid unigryw (#3.1 a #3.2) o 332 o glonau phage a ailgyfansoddwyd gan CSF wedi'u hynysu oddi wrth ddau anifail (Ffig Atodol 6a).Y dilyniant LGSVS (18.7%) oedd â'r gyfran gymharol uchaf, ac yna'r mewnosodiadau math gwyllt PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), a SARGSWREIVSLS (2.2%).Yn y bedwaredd rownd olaf, fe wnaethom gyfuno dwy gangen a ddewiswyd yn annibynnol o dri anifail ar wahân (Ffig. 1c).O'r 925 o glonau phage dilyniannol a adferwyd o CSF, yn y bedwaredd rownd canfuom 64 o ddilyniannau peptid unigryw (Ffig Atodol 6b), ac ymhlith y rhain gostyngodd cyfran gymharol y phage math gwyllt i 0.8%.Y clonau CSF mwyaf cyffredin yn y bedwaredd rownd oedd LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) a RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Mae ystod hyd y peptidau a ddewiswyd oherwydd mewnosodiadau / dileadau niwcleotid neu godonau stopio cynamserol yn y preimwyr llyfrgell wrth ddefnyddio codonau dirywiol ar gyfer dylunio llyfrgell NNK.Mae codonau stopio cynamserol yn cynhyrchu peptidau byrrach ac yn cael eu dewis oherwydd eu bod yn cynnwys y motiff aa ffafriol.Gall peptidau hirach ddeillio o fewnosodiadau/dileadau ym mhresenwyr y llyfrgelloedd synthetig.Mae hwn yn gosod y codon stopio cynlluniedig y tu allan i'r ffrâm ac yn ei ddarllen nes bod codon stopio newydd yn ymddangos i lawr yr afon.Yn gyffredinol, fe wnaethom gyfrifo ffactorau cyfoethogi ar gyfer pob un o'r pedair rownd ddethol trwy gymharu'r data mewnbwn â'r data allbwn sampl.Ar gyfer y rownd gyntaf o sgrinio, gwnaethom ddefnyddio teitrau phage math gwyllt fel cyfeiriad cefndir amhenodol.Yn ddiddorol, roedd detholiad phage negyddol yn gryf iawn yn y cylch CSF cyntaf, ond nid mewn gwaed (Ffig. 3a), a allai fod oherwydd y tebygolrwydd isel o ymlediad goddefol y rhan fwyaf o aelodau'r llyfrgell peptid i'r adran CSF neu mae ffagau cymharol yn dueddol o gael eu cadw neu eu tynnu o'r llif gwaed yn fwy effeithlon na bacteriophages.Fodd bynnag, yn yr ail rownd o panio, gwelwyd detholiad cryf o ffagau yn CSF yn y ddau glwyd, sy'n awgrymu bod y rownd flaenorol wedi'i gyfoethogi mewn phages sy'n arddangos peptidau sy'n hyrwyddo'r nifer sy'n cymryd CSF (Ffig. 3a).Unwaith eto, heb gyfoethogi gwaed sylweddol.Hefyd yn y drydedd a'r bedwaredd rownd, cyfoethogwyd y clonau phage yn sylweddol yn CSF.Wrth gymharu amlder cymharol pob dilyniant peptid unigryw rhwng y ddwy rownd olaf o ddethol, canfuom fod y dilyniannau wedi'u cyfoethogi hyd yn oed yn fwy yn y bedwaredd rownd o ddethol (Ffig. 3b).Echdynnwyd cyfanswm o 931 o fotiffau tripeptide o bob un o'r 64 o ddilyniannau peptid unigryw gan ddefnyddio'r ddau gyfeiriadedd peptid.Archwiliwyd y motiffau mwyaf cyfoethog yn y bedwaredd rownd yn agosach am eu proffiliau cyfoethogi ar draws pob rownd o'i gymharu â'r llyfrgell wedi'i chwistrellu (toriad: cyfoethogiad o 10%) (Ffig Atodol 6c).Dangosodd patrymau dethol cyffredinol fod y rhan fwyaf o'r cymhellion a astudiwyd wedi'u cyfoethogi ym mhob rownd flaenorol o'r ddwy gangen ddethol.Fodd bynnag, roedd rhai motiffau (ee SGL, VSG, LGS GSV) yn bennaf o gladded amgen A, tra bod eraill (ee FGW, RTN, WGF, NTR) wedi'u cyfoethogi mewn clâd B amgen.
Dilysu cludiant CSF o peptidau ffag-arddangos wedi'u cyfoethogi â CSF a pheptidau arweinydd biotinylated wedi'u cyfuno â llwythi tâl streptavidin.
(a) Cymarebau cyfoethogi wedi'u cyfrifo ym mhob un o'r pedair rownd (R1-R4) yn seiliedig ar deitlau phage wedi'u chwistrellu (mewnbwn = I) (PFU) a theitrau ffage CSF a bennwyd (allbwn = O).Cyfrifwyd ffactorau cyfoethogi ar gyfer y tair rownd ddiwethaf (R2-R4) o gymharu â'r rownd flaenorol a'r rownd gyntaf (R1) gyda data pwysau.Mae bariau agored yn hylif serebro-sbinol, bariau cysgodol yn blasma.(***p<0.001, yn seiliedig ar brawf-t Myfyriwr).(b) Rhestr o'r peptidau phage mwyaf niferus, wedi'u rhestru yn ôl eu cyfran gymharol i'r holl ffagau a gasglwyd yn CSF ar ôl rownd 4 o ddethol.Mae'r chwe clon phage mwyaf cyffredin yn cael eu hamlygu mewn lliw, wedi'u rhifo a'u ffactorau cyfoethogi rhwng rowndiau 3 a 4 o ddethol (mewnosodiadau).(c,d) Dadansoddwyd y chwe chlon phage mwyaf cyfoethog, llyfrgelloedd phage gwag a phage rhieni o rownd 4 yn unigol mewn model samplu CSF.Casglwyd samplau CSF a gwaed ar yr adegau a nodwyd.(c) Swm cyfartal o 6 clon ffag ymgeisiol (2 x 1010 phages/anifeiliaid), ffagiau gwag (#1779) (2 x 1010 phages/anifeiliaid) a llyfrgelloedd pheptid ffag stoc (2 x 1012 gwedd/anifeiliaid) Rhoddir chwistrelliad o 3 CM o leiaf i'r anifail â rhinyn ar wahân drwy'r wythïen anadlol.Dangosir ffarmacocineteg CSF pob llyfrgell phage clôn a pheptid phage wedi'i chwistrellu dros amser.(d) yn dangos y gymhareb CSF/gwaed gyfartalog ar gyfer yr holl fages/mL a adferwyd dros yr amser samplu.(e) Cysylltwyd pedwar peptid arweinydd synthetig ac un rheolydd wedi'i sgramblo â biotin i streptafidin trwy eu N-terminus (arddangosiad tetramer) ac yna chwistrelliad (gwythïen gynffon iv, 10 mg streptavidin/kg).O leiaf tri llygod mawr mewndiwb (N = 3).).Casglwyd samplau CSF ar y pwyntiau amser a nodwyd a mesurwyd crynodiadau streptavidin gan ELISA gwrth-streptavidin CSF (nd = heb ei ganfod).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, yn seiliedig ar brawf ANOVA).(dd) Cymharu dilyniant asid amino y clôn peptid phage mwyaf cyfoethog #2002 (porffor) â chlonau peptid phage dethol eraill o'r 4edd rownd ddethol.Mae darnau o asid amino union yr un fath a rhai tebyg wedi'u codau lliw.
O'r holl ffagau cyfoethogi yn y bedwaredd rownd (Ffig. 3b), dewiswyd chwe chlon ymgeisydd ar gyfer dadansoddiad unigol pellach yn y model samplu CSF.Chwistrellwyd symiau cyfartal o chwe ymgeisydd phage, phage gwag (dim mewnosodiad) a llyfrgelloedd peptid prophage i dri anifail CM tun, a phenderfynwyd ffarmacocineteg mewn profion CSF (Ffig. 3c) a gwaed (Ffig Atodol 7).Targedodd pob clon phage a brofwyd y compartment CSF ar lefel 10-1000 gwaith yn uwch na lefel y phage rheoli gwag (#1779).Er enghraifft, roedd gan glonau #2020 a #2077 tua 1000 gwaith yn uwch o deitlau CSF na phage rheoli.Mae proffil ffarmacocinetig pob peptid a ddewiswyd yn wahanol, ond mae gan bob un ohonynt allu cartrefu CSF uchel.Gwelsom ostyngiad cyson dros amser ar gyfer clonau #1903 a #2011, tra ar gyfer clonau #2077, #2002 a #2009 gallai cynnydd yn ystod y 10 munud cyntaf nodi trafnidiaeth actif ond mae angen ei wirio.Sefydlogodd clonau #2020, #2002, a #2077 ar lefelau uchel, tra gostyngodd crynodiad clon CSF #2009 yn araf ar ôl y cynnydd cychwynnol.Yna gwnaethom gymharu amlder cymharol pob ymgeisydd CSF â'i grynodiad gwaed (Ffig. 3d).Roedd cydberthynas titer cymedrig pob ymgeisydd CSF â'i deitr gwaed ar bob adeg samplu yn dangos bod tri o'r chwe ymgeisydd wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn CSF gwaed.Yn ddiddorol, dangosodd clon #2077 sefydlogrwydd gwaed uwch (Ffigur Atodol 7).Er mwyn cadarnhau bod y peptidau eu hunain yn gallu cludo cargo heblaw gronynnau phage i'r adran CSF, fe wnaethom syntheseiddio pedwar peptid arweinydd sy'n deillio o biotin yn y N-terminws lle mae'r peptidau'n cysylltu â'r gronyn phage.Cyfunwyd peptidau biotinylated (rhifau 2002, 2009, 2020 a 2077) â streptavidin (SA) i gael ffurfiau amlmerig a oedd yn dynwared geometreg phage i raddau.Roedd y fformat hwn hefyd yn caniatáu inni fesur amlygiad SA mewn gwaed a hylif serebro-sbinol fel peptidau protein sy'n cludo cargo.Yn bwysig, gellid atgynhyrchu data phage yn aml pan weinyddwyd peptidau synthetig yn y fformat SA-cyfunol hwn (Ffig. 3e).Roedd gan y peptidau wedi'u sgramblo lai o amlygiad cychwynnol a chliriad CSF cyflymach gyda lefelau anghanfyddadwy o fewn 48 awr.Er mwyn cael mewnwelediad i lwybrau cyflwyno'r clonau phage peptid hyn i'r gofod CSF, fe wnaethom ddadansoddi lleoleiddio trawiadau peptid phage unigol gan ddefnyddio immunohistochemistry (IHC) i ganfod gronynnau ffag yn uniongyrchol 1 awr ar ôl pigiad mewnwythiennol in vivo.Yn nodedig, gellid canfod clonau #2002, #2077, a #2009 trwy staenio cryf mewn capilarïau'r ymennydd, tra na chanfuwyd phage rheoli (#1779) a chlôn #2020 (Ffigur Atodol 8).Mae hyn yn awgrymu bod y peptidau hyn yn cyfrannu at yr effaith ar yr ymennydd yn union trwy groesi'r BBB.Mae angen dadansoddiad manwl pellach i brofi'r ddamcaniaeth hon, gan y gallai llwybr BSCFB fod yn gysylltiedig hefyd.Wrth gymharu dilyniant asid amino y clôn mwyaf cyfoethog (# 2002) â pheptidau dethol eraill, nodwyd bod gan rai ohonynt estyniadau asid amino tebyg, a allai ddangos mecanwaith cludo tebyg (Ffig. 3f).
Oherwydd ei broffil plasma unigryw a chynnydd sylweddol yn CSF dros amser, archwiliwyd clôn arddangos phage #2077 ymhellach dros gyfnod hwy o 48 awr a llwyddodd i atgynhyrchu'r cynnydd cyflym mewn CSF a welwyd mewn cysylltiad â lefelau SA parhaus (Ffig. 4a).O ran clonau phage eraill a nodwyd, roedd #2077 wedi'i staenio'n gryf ar gyfer capilarïau'r ymennydd a dangosodd gydleoli sylweddol gyda lectin marciwr capilari o'i weld ar gydraniad uwch ac o bosibl rhywfaint o staenio yn y gofod parenchymal (Ffigur 4b).Er mwyn ymchwilio i weld a ellid cael effeithiau ffarmacolegol cyfryngol peptid yn y CNS, gwnaethom arbrawf lle cymysgwyd fersiynau biotinylated o i) y peptid tramwy #2077 a ii) peptid atalydd BACE1 â SA ar ddwy gymhareb wahanol.Ar gyfer un cyfuniad defnyddiasom yr atalydd peptid BACE1 yn unig ac ar gyfer y llall defnyddiwyd cymhareb 1:3 o atalydd peptid BACE1 i #2077 peptid.Rhoddwyd y ddau sampl yn fewnwythiennol a mesurwyd lefelau hylif gwaed a serebro-sbinol o peptid beta-amyloid 40 (Abeta40) dros amser.Mesurwyd Abeta40 yn CSF gan ei fod yn adlewyrchu ataliad BACE1 yn parenchyma'r ymennydd.Yn ôl y disgwyl, gostyngodd y ddau gyfadeilad lefelau gwaed Abetta40 yn sylweddol (Ffig. 4c, d).Fodd bynnag, dim ond samplau sy'n cynnwys cymysgedd o peptid rhif.2077 ac atalydd o'r peptid BACE1 wedi'i gyfuno â SA achosi gostyngiad sylweddol yn Abetta40 yn yr hylif serebro-sbinol (Ffig. 4c).Mae'r data yn dangos bod peptid dim.Mae 2077 yn gallu cludo'r protein SA 60 kDa i'r CNS ac mae hefyd yn achosi effeithiau ffarmacolegol ag atalyddion peptid BACE1 sydd wedi'u cyfuno â SA.
(a) Chwistrelliad clonal (2 × 10 phage/anifail) o T7 phage yn dangos proffiliau ffarmacocinetig hirdymor o peptid CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) a phage rheoli heb bigiad (#1779) mewn o leiaf dri llygod mawr â mewnlifiad CM.(b) Delwedd ficrosgopig gydffocal o ficro-lestri cortigol cynrychioliadol mewn llygod mawr wedi'u chwistrellu â ffag (2 × 10 10 phage/anifail) yn dangos gwrth-staenio peptid #2077 a llestri (lectin).Rhoddwyd y clonau phage hyn i 3 llygod mawr a'u caniatáu i gylchredeg am 1 awr cyn darlifiad.Cafodd yr ymennydd ei dorri a'i staenio â gwrthgyrff polyclonaidd â label FITC yn erbyn capsid phage T7.Ddeng munud cyn y darlifiad a'r gosodiad dilynol, rhoddwyd lectin â label DyLight594 yn fewnwythiennol.Delweddau fflwroleuol yn dangos staen lectin (coch) o ochr luminal microvessels a phages (gwyrdd) yn lwmen capilarïau a meinwe perifasgwlaidd yr ymennydd.Mae'r bar graddfa yn cyfateb i 10 µm.(c, d) Cyplwyd peptid ataliol BACE1 biotinylated yn unig neu mewn cyfuniad â pheptid tramwy biotinylated #2077 â streptavidin ac yna chwistrelliad mewnwythiennol o o leiaf dri llygoden fawr CM tun (10 mg streptavidin/kg).Mesurwyd gostyngiad atalydd-gyfryngol peptid BACE1 yn Aβ40 gan Aβ1-40 ELISA mewn gwaed (coch) a hylif serebro-sbinol (oren) ar y pwyntiau amser a nodir.Er mwyn sicrhau gwell eglurder, llunnir llinell ddotiog ar y graff ar raddfa o 100%.(c) Canran y gostyngiad yn Aβ40 mewn gwaed (trionglau coch) a hylif serebro-sbinol (trionglau oren) mewn llygod mawr a gafodd eu trin â streptavidin wedi'i gyfuno â pheptid cludo #2077 a pheptid ataliol BACE1 mewn cymhareb 3:1.(d) Canran y gostyngiad yn y gwaed Aβ40 (cylchoedd coch) a hylif serebro-sbinol (cylchoedd oren) llygod mawr a gafodd eu trin â streptavidin ynghyd â pheptid ataliol BACE1 yn unig.Y crynodiad Aβ yn y rheolydd oedd 420 pg/ml (gwyriad safonol = 101 pg/ml).
Mae Phage display wedi'i gymhwyso'n llwyddiannus mewn sawl maes ymchwil biofeddygol17.Defnyddiwyd y dull hwn ar gyfer astudiaethau amrywiaeth fasgwlaidd in vivo18,19 yn ogystal ag astudiaethau sy'n targedu cychod yr ymennydd20,21,22,23,24,25,26.Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ymestyn y defnydd o'r dull dethol hwn nid yn unig i adnabod peptidau sy'n targedu pibellau cerebral yn uniongyrchol, ond hefyd i ddarganfod ymgeiswyr sydd â phriodweddau trafnidiaeth weithredol i groesi'r rhwystr gwaed-ymennydd.Rydyn ni nawr yn disgrifio datblygiad gweithdrefn ddethol in vivo mewn llygod mawr sydd wedi'u mewndiwio gan CM ac yn dangos ei botensial i nodi peptidau ag eiddo cartrefu CSF.Gan ddefnyddio'r phage T7 sy'n arddangos llyfrgell o peptidau ar hap 12-mer, roeddem yn gallu dangos bod y phage T7 yn ddigon bach (tua 60 nm mewn diamedr)10 i'w addasu i'r rhwystr gwaed-ymennydd, a thrwy hynny groesi'r rhwystr gwaed-ymennydd neu'r plexws coroid yn uniongyrchol.Gwelsom fod cynaeafu CSF o lygod mawr CM tuniedig yn ddull sgrinio swyddogaethol in vivo a reolir yn dda, a bod y ffag a echdynnwyd nid yn unig yn rhwym i'r fasgwlaidd ond hefyd yn gweithredu fel cludwr ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd.At hynny, trwy gasglu gwaed ar yr un pryd a chymhwyso HTS i CSF ​​a phages sy'n deillio o waed, gwnaethom gadarnhau nad oedd cyfoethogi gwaed neu ffitrwydd ar gyfer ehangu rhwng rowndiau dethol yn dylanwadu ar ein dewis o CSF.Fodd bynnag, mae'r adran gwaed yn rhan o'r weithdrefn ddethol, gan fod yn rhaid i ffages sy'n gallu cyrraedd y compartment CSF oroesi a chylchredeg yn y llif gwaed yn ddigon hir i gyfoethogi eu hunain yn yr ymennydd.Er mwyn tynnu gwybodaeth ddilyniant ddibynadwy o ddata HTS amrwd, fe wnaethom weithredu hidlwyr wedi'u haddasu i wallau dilyniannu platfform-benodol yn y llif gwaith dadansoddi.Trwy ymgorffori paramedrau cinetig yn y dull sgrinio, fe wnaethom gadarnhau ffarmacocineteg cyflym ffagiau math T7 gwyllt (t½ ~ 28 min) yn y gwaed24, 27, 28 a hefyd pennu eu hanner oes mewn hylif serebro-sbinol (t½ ~ 26 min y funud).Er gwaethaf proffiliau ffarmacocinetig tebyg mewn gwaed a CSF, dim ond 0.001% o grynodiad gwaed phage y gellid ei ganfod yn CSF, sy'n dangos symudedd cefndir isel o ffa T7 math gwyllt ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd.Mae'r gwaith hwn yn amlygu pwysigrwydd y rownd gyntaf o ddethol wrth ddefnyddio strategaethau panio in vivo, yn enwedig ar gyfer systemau phage sy'n cael eu clirio'n gyflym o'r cylchrediad, gan mai ychydig o glonau sy'n gallu cyrraedd adran y CNS.Felly, yn y rownd gyntaf, roedd y gostyngiad mewn amrywiaeth llyfrgelloedd yn fawr iawn, gan mai dim ond nifer gyfyngedig o glonau a gasglwyd yn y pen draw yn y model CSF llym iawn hwn.Roedd y strategaeth panio in vivo hon yn cynnwys nifer o gamau dethol megis cronni gweithredol yn y compartment CSF, goroesiad clôn yn y compartment gwaed, a thynnu clonau phage T7 yn gyflym o'r gwaed o fewn y 10 munud cyntaf (Ffig. 1d a Ffig Atodol. 4M).).Felly, ar ôl y rownd gyntaf, nodwyd gwahanol glonau phage yn CSF, er bod yr un pwll cychwynnol yn cael ei ddefnyddio ar gyfer anifeiliaid unigol.Mae hyn yn awgrymu bod nifer o gamau dethol llym ar gyfer llyfrgelloedd ffynhonnell gyda nifer fawr o aelodau llyfrgell yn arwain at leihad sylweddol mewn amrywiaeth.Felly, bydd digwyddiadau ar hap yn dod yn rhan annatod o'r broses ddethol gychwynnol, gan ddylanwadu'n fawr ar y canlyniad.Mae'n debygol bod llawer o'r clonau yn y llyfrgell wreiddiol â thuedd cyfoethogi CSF tebyg iawn.Fodd bynnag, hyd yn oed o dan yr un amodau arbrofol, gall canlyniadau dethol fod yn wahanol oherwydd y nifer fach o bob clôn penodol yn y pwll cychwynnol.
Mae'r motiffau a gyfoethogir yn CSF yn wahanol i'r rhai yn y gwaed.Yn ddiddorol, nodwyd y symudiad cyntaf tuag at peptidau llawn glycin yng ngwaed anifeiliaid unigol.(Ffig. 1g, Ffigys Atodol. 4e, 4f).Gall Phage sy'n cynnwys peptidau glycin fod yn fwy sefydlog ac yn llai tebygol o gael eu tynnu allan o gylchrediad.Fodd bynnag, ni chanfuwyd y peptidau hyn sy'n llawn glycin yn y samplau hylif serebro-sbinol, sy'n awgrymu bod y llyfrgelloedd wedi'u curadu wedi mynd trwy ddau gam dethol gwahanol: un yn y gwaed ac un arall yn cael cronni yn yr hylif serebro-sbinol.Mae clonau wedi'u cyfoethogi â CSF sy'n deillio o'r bedwaredd rownd o ddethol wedi'u profi'n helaeth.Cadarnhawyd bod bron pob un o'r clonau a brofwyd yn unigol wedi'u cyfoethogi yn CSF o'u cymharu â phage rheoli gwag.Archwiliwyd un trawiad peptid (#2077) yn fanylach.Dangosodd hanner oes plasma hirach o'i gymharu â thrawiadau eraill (Ffigur 3d a Ffigur 7 Atodol), ac yn ddiddorol, roedd y peptid hwn yn cynnwys gweddillion cystein yn y C-terminus.Dangoswyd yn ddiweddar y gall ychwanegu cystein at peptidau wella eu priodweddau ffarmacocinetig trwy rwymo i albwmin 29 .Nid yw hyn yn hysbys ar hyn o bryd ar gyfer peptid #2077 ac mae angen astudiaeth bellach.Dangosodd rhai peptidau ddibyniaeth falens mewn cyfoethogi CSF (data heb ei ddangos), a allai fod yn gysylltiedig â geometreg arwyneb arddangos y capsid T7.Roedd y system T7 a ddefnyddiwyd gennym yn dangos 5-15 copi o bob peptid fesul gronyn phage.Perfformiwyd IHC ar glonau phage plwm ymgeisydd a chwistrellwyd yn fewnwythiennol i gortecs cerebral llygod mawr (Ffig Atodol 8).Dangosodd y data fod o leiaf dri chlon (Rhif 2002, Rhif 2009 a Rhif 2077) yn rhyngweithio â'r BBB.Mae'n dal i gael ei benderfynu a yw'r rhyngweithiad BBB hwn yn arwain at gronni CSF neu symud y clonau hyn yn uniongyrchol i'r BCSFB.Yn bwysig, rydym yn dangos bod y peptidau a ddewiswyd yn cadw eu gallu cludo CSF ​​wrth eu syntheseiddio a'u rhwymo i'r cargo protein.Mae rhwymo peptidau biotinylated N-terminal i SA yn ei hanfod yn ailadrodd y canlyniadau a gafwyd gyda'u clonau phage priodol mewn gwaed a hylif serebro-sbinol (Ffig. 3e).Yn olaf, rydym yn dangos bod peptid plwm #2077 yn gallu hyrwyddo gweithrediad ymennydd atalydd peptid biotinylated o BACE1 wedi'i gyfuno â SA, gan achosi effeithiau ffarmacodynamig amlwg yn y CNS trwy leihau'n sylweddol lefelau Abeta40 yn CSF (Ffig. 4).Nid oeddem yn gallu nodi unrhyw homologau yn y gronfa ddata trwy berfformio chwiliad homoleg dilyniant peptid o'r holl drawiadau.Mae'n bwysig nodi bod maint y llyfrgell T7 oddeutu 109, tra bod maint y llyfrgell ddamcaniaethol ar gyfer 12-mers yn 4 x 1015. Felly, dim ond ffracsiwn bach o ofod amrywiaeth y llyfrgell peptid 12-mer a ddewiswyd gennym, a allai olygu y gellir nodi peptidau mwy optimized trwy werthuso gofod dilyniant cyfagos y trawiadau a nodwyd.Yn ddamcaniaethol, efallai mai un o'r rhesymau pam nad ydym wedi dod o hyd i unrhyw homologau naturiol o'r peptidau hyn yw dad-ddethol yn ystod esblygiad er mwyn atal mynediad heb reolaeth o rai motiffau peptid i'r ymennydd.
Gyda’i gilydd, mae ein canlyniadau’n darparu sail ar gyfer gwaith yn y dyfodol i nodi a nodweddu systemau trafnidiaeth y rhwystr serebro-fasgwlaidd in vivo yn fanylach.Mae gosodiad sylfaenol y dull hwn yn seiliedig ar strategaeth dewis swyddogaethol sydd nid yn unig yn nodi clonau ag eiddo rhwymo fasgwlaidd yr ymennydd, ond sydd hefyd yn cynnwys cam hanfodol lle mae gan glonau llwyddiannus weithgaredd cynhenid ​​​​i groesi rhwystrau biolegol in vivo i adran y CNS.yw egluro mecanwaith cludo'r peptidau hyn a'u dewis ar gyfer rhwymo i'r microfasgwlaidd sy'n benodol i ranbarth yr ymennydd.Gall hyn arwain at ddarganfod llwybrau newydd ar gyfer cludo'r BBB a'r derbynyddion.Disgwyliwn y gall y peptidau a nodwyd rwymo'n uniongyrchol i dderbynyddion serebro-fasgwlaidd neu i ligandau cylchredeg sy'n cael eu cludo trwy'r BBB neu'r BSFB.Bydd y fectorau peptid â gweithgaredd cludo CSF ​​a ddarganfuwyd yn y gwaith hwn yn cael eu hymchwilio ymhellach.Ar hyn o bryd rydym yn ymchwilio i benodolrwydd ymennydd y peptidau hyn am eu gallu i groesi'r BBB a/neu'r BSFB.Bydd y peptidau newydd hyn yn offer hynod werthfawr ar gyfer darganfod derbynyddion neu lwybrau newydd o bosibl ac ar gyfer datblygu llwyfannau hynod effeithlon ar gyfer cyflwyno macromoleciwlau, megis bioleg, i'r ymennydd.
Caniwleiddio'r seston fawr (CM) gan ddefnyddio addasiad o'r dull a ddisgrifiwyd yn flaenorol.Roedd llygod mawr Wistar anestheteiddiedig (200-350 g) wedi'u gosod ar gyfarpar stereotacsig a gwnaed toriad canolrifol dros groen y pen oedd wedi'i eillio a'i baratoi'n aseptig i ddatguddio'r benglog.Driliwch ddau dwll yn ardal y ffrâm uchaf a chlymwch y sgriwiau gosod yn y tyllau.Cafodd twll ychwanegol ei ddrilio yn y crib occipital ochrol ar gyfer arweiniad stereotactig o ganiwla dur gwrthstaen i mewn i'r CM.Rhowch sment deintyddol o amgylch y caniwla a'i ddiogelu gyda sgriwiau.Ar ôl halltu ffoto a chaledu sment, caewyd y clwyf croen gyda phwythiad supramid 4/0.Mae lleoliad cywir y caniwla yn cael ei gadarnhau gan ollyngiad digymell o hylif serebro-sbinol (CSF).Tynnwch y llygoden fawr o'r cyfarpar stereotacsig, derbyniwch ofal priodol ar ôl llawdriniaeth a rheolaeth poen, a gadewch iddo wella am o leiaf wythnos nes bod arwyddion gwaed yn cael eu gweld yn yr hylif serebro-sbinol.Cafwyd llygod mawr Wistar (Crl:WI/Han) o Charles River (Ffrainc).Cadwyd yr holl lygod mawr o dan amodau penodol heb bathogen.Cymeradwywyd yr holl arbrofion anifeiliaid gan Swyddfa Filfeddygol Dinas Basel, y Swistir, ac fe'u perfformiwyd yn unol â Thrwydded Anifeiliaid Rhif 2474 (Asesu Cludiant Actif yr Ymennydd trwy Fesur Lefelau Ymgeiswyr Therapiwtig yn Hylif Cerebro-sbinol ac Ymennydd Llygoden Fawr).
Cadwch y llygoden fawr yn ofalus gyda'r caniwla CM yn ei law.Tynnwch Datura o'r caniwla a chasglwch 10 µl o hylif serebro-sbinol sy'n llifo'n ddigymell.Gan fod amynedd y caniwla wedi'i beryglu yn y pen draw, dim ond samplau hylif serebro-sbinol clir heb unrhyw dystiolaeth o halogiad gwaed neu afliwio a gynhwyswyd yn yr astudiaeth hon.Yn gyfochrog, cymerwyd tua 10-20 μl o waed o doriad bach ar flaen y gynffon i mewn i diwbiau gyda heparin (Sigma-Aldrich).Casglwyd CSF a gwaed ar wahanol adegau ar ôl pigiad mewnwythiennol o T7 phage.Taflwyd tua 5-10 μl o hylif cyn casglu pob sampl CSF, sy'n cyfateb i gyfaint marw'r cathetr.
Cynhyrchwyd llyfrgelloedd gan ddefnyddio fector T7Select 10-3b fel y disgrifir yn llawlyfr system T7Select (Novagen, Rosenberg et al., Arloesedd 6, 1-6, 1996).Yn gryno, cafodd mewnosodiad DNA 12-mer ar hap ei syntheseiddio yn y fformat canlynol:
Defnyddiwyd y codon NNK i osgoi codonau stop dwbl a gorfynegiant asid amino yn y mewnosodiad.Mae N yn gymhareb hafalaidd gymysg â llaw o bob niwcleotid, ac mae K yn gymhareb hafalaidd gymysg â llaw o niwcleotidau adenin a cytosin.Troswyd rhanbarthau un sownd yn DNA â haen ddwbl trwy ddeoriad pellach gyda dNTP (Novagen) ac ensym Klenow (New England Biolabs) yn byffer Klenow (New England Biolabs) am 3 awr ar 37°C.Ar ôl yr adwaith, cafodd DNA llinyn dwbl ei adennill gan wlybaniaeth EtOH.Cafodd y DNA canlyniadol ei dreulio gydag ensymau cyfyngu EcoRI a HindIII (y ddau o Roche).Yna cafodd y mewnosodiad hollt a phuro (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) ei glymu mewn ffrâm i mewn i fector T7 wedi'i hollti ymlaen llaw ar ôl asid amino 348 o'r genyn capsid 10B.Deorwyd adweithiau clymu ar 16° C. am 18 awr cyn pecynnu in vitro.Perfformiwyd pecynnu Phage in vitro yn unol â'r cyfarwyddiadau a ddarparwyd gyda'r pecyn clonio T7Select 10-3b (Novagen) a chafodd yr hydoddiant pecynnu ei chwyddo unwaith i lysis gan ddefnyddio Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Cafodd y lysates eu hallgyrchu, eu titradu a'u rhewi ar -80 ° C. fel hydoddiant stoc o glyserol.
Ymhelaethiad PCR uniongyrchol ar ranbarthau newidyn phage wedi'i fwyhau mewn cawl neu blât gan ddefnyddio paent preimio ymasiad 454/Roche-amplicon perchnogol.Mae'r preimiwr ymasiad ymlaen yn cynnwys dilyniannau bob ochr i'r rhanbarth newidiol (NNK) 12 (templed-benodol), GS FLX Titanium Adapter A, a dilyniant allwedd llyfrgell pedwar sylfaen (TCAG) (Ffigur Atodol 1a):
Mae'r paent preimio ymasiad cefn hefyd yn cynnwys biotin sydd wedi'i gysylltu â gleiniau dal a'r Addasydd Titaniwm GS FLX B sydd ei angen ar gyfer ymhelaethu clonal yn ystod emwlsiwn PCR:
Yna bu'r amplicons yn destun pyrosequencing 454/Roche yn unol â'r protocol Titaniwm 454 GS-FLX.Ar gyfer dilyniannu Sanger â llaw (Dadansoddwr DNA Biosystemau Cymhwysol Hitachi 3730 xl), cafodd T7 phage DNA ei chwyddo gan PCR a'i ddilyniannu gyda'r parau preimio canlynol:
Roedd mewnosodiadau o blaciau unigol yn destun ymhelaethiad PCR gan ddefnyddio Pecyn Polymerase DNA Fast Start Roche (yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr).Perfformiwch gychwyn poeth (10 munud ar 95 °C) a 35 cylch hwb (50 s ar 95 °C, 1 munud ar 50 °C, ac 1 munud ar 72 °C).
Chwyddwyd Phage o lyfrgelloedd, phage math gwyllt, phage a achubwyd o CSF ​​a gwaed, neu glonau unigol yn Escherichia coli BL5615 mewn cawl TB (Sigma Aldrich) neu mewn dysglau 500 cm2 (Thermo Scientific) am 4 h ar 37 ° C.Tynnwyd Phage o'r platiau trwy rinsio'r platiau gyda byffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) neu drwy gasglu'r placiau gyda blaenau pibed di-haint.Cafodd Phage eu hynysu oddi wrth ddiwylliant supernatant neu glustogiad echdynnu gydag un rownd o wlybaniaeth polyethylen glycol (PEG 8000) (Promega) a'i ail-ddarparu mewn byffer Tris-EDTA.
Bu'r ffage chwyddedig yn destun 2-3 rownd o dynnu endotoxin gan ddefnyddio gleiniau tynnu endotoxin (Miltenyi Biotec) cyn pigiad mewnwythiennol (IV) (500 μl / anifail).Yn y rownd gyntaf, cyflwynwyd 2 × 1012 phages;yn yr ail, 2 × 1010 phages;yn y drydedd a'r bedwaredd rownd dewis, 2 × 109 phages yr anifail.Pennwyd cynnwys phage mewn CSF a samplau gwaed a gasglwyd ar y pwyntiau amser a nodwyd trwy gyfrif plac yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (llawlyfr system T7Select).Perfformiwyd detholiad Phage trwy chwistrelliad mewnwythiennol o lyfrgelloedd wedi'u puro i'r wythïen gynffon neu trwy ail-chwistrellu phage a echdynnwyd o CSF ​​o'r rownd ddethol flaenorol, a pherfformiwyd cynaeafau dilynol ar 10 munud, 30 munud, 60 munud, 90 munud, 120 min, 180 min, a 240 min yn y drefn honno CSF ​​a samplau gwaed.Cynhaliwyd cyfanswm o bedair rownd o panio in vivo lle cafodd y ddwy gangen ddethol eu storio a'u dadansoddi ar wahân yn ystod y tair rownd gyntaf o ddethol.Roedd yr holl fewnosodiadau phage a dynnwyd o CSF ​​o'r ddwy rownd gyntaf o ddethol yn destun pyrosequencing 454/Roche, tra bod yr holl glonau a dynnwyd o CSF ​​o'r ddwy rownd ddiwethaf o ddethol wedi'u dilyniannu â llaw.Roedd pob gwedd gwaed o'r rownd gyntaf o ddethol hefyd yn destun pyro-ddilyniant 454/Roche.Ar gyfer pigiad clonau phage, chwyddwyd ffagau dethol yn E. coli (BL5615) ar blatiau 500 cm2 ar 37°C am 4 awr.Cafodd clonau a ddewiswyd yn unigol a'u dilyniannu â llaw eu lluosogi mewn cyfrwng TB.Ar ôl echdynnu phage, puro a thynnu endotoxin (fel y disgrifir uchod), chwistrellwyd 2 × 1010 phages / anifail mewn 300 μl yn fewnwythiennol i mewn i un wythïen gynffon.
Rhagbrosesu a hidlo ansoddol o ddata dilyniant.Troswyd data crai 454/Roche o fformat map ffrwd safonol deuaidd (sff) i fformat darllenadwy gan bobl Pearson (fasta) gan ddefnyddio meddalwedd gwerthwr.Perfformiwyd prosesu'r dilyniant niwcleotid ymhellach gan ddefnyddio rhaglenni a sgriptiau C perchnogol (pecyn meddalwedd heb ei ryddhau) fel y disgrifir isod.Mae'r dadansoddiad o ddata cynradd yn cynnwys gweithdrefnau hidlo aml-gam llym.I hidlo darlleniadau nad oedd yn cynnwys dilyniant DNA mewnosod 12mer dilys, cafodd y darlleniadau eu halinio'n ddilyniannol i'r label cychwyn (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label stop (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) a mewnosodiad cefndir (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) gan ddefnyddio'r prawf Needleman-Wunsch byd-eang.aliniad yn caniatáu hyd at 2 anghysondeb fesul aliniad31.Felly, yn darllen heb dagiau cychwyn a stopio a darlleniadau sy'n cynnwys mewnosodiadau cefndir, hy, aliniadau sy'n fwy na'r nifer a ganiateir o ddiffyg cyfatebiaeth, eu tynnu o'r llyfrgell.O ran y darlleniadau sy'n weddill, mae'r dilyniant DNA N-mer sy'n ymestyn o'r marc cychwyn ac yn dod i ben cyn i'r marc atal gael ei dynnu allan o'r dilyniant darllen gwreiddiol a'i brosesu ymhellach (y cyfeirir ato o hyn ymlaen fel “mewnosoder”).Ar ôl cyfieithu'r mewnosodiad, caiff y rhan ar ôl y codon stop cyntaf ar ddiwedd 5′ y paent preimio ei dynnu o'r mewnosodiad.Yn ogystal, tynnwyd niwcleotidau a oedd yn arwain at godonau anghyflawn ym mhen 3′ y paent preimio hefyd.I eithrio mewnosodiadau sy'n cynnwys dilyniannau cefndir yn unig, dilëwyd mewnosodiadau wedi'u cyfieithu yn dechrau gyda'r patrwm asid amino “PAG” hefyd.Tynnwyd peptidau â hyd ôl-gyfieithu o lai na 3 asid amino o'r llyfrgell.Yn olaf, dileu diswyddiad yn y pwll mewnosod a phenderfynu ar amlder pob mewnosodiad unigryw.Roedd canlyniadau'r dadansoddiad hwn yn cynnwys rhestr o ddilyniannau niwcleotid (mewnosod) a'u hamleddau (darllen) (Ffigurau Atodol 1c a 2).
Mewnosodiadau DNA grŵp N-mer yn ôl dilyniant tebygrwydd: Er mwyn dileu gwallau dilyniannu 454/Roche-benodol (fel problemau gyda dilyniannu estyniadau homopolymer) a chael gwared ar ddiswyddiadau llai pwysig, mae mewnosodiadau dilyniant DNA N-mer wedi'u hidlo'n flaenorol (mewnosod) yn cael eu didoli yn ôl tebygrwydd.mewnosodiadau (caniateir hyd at 2 fas nad ydynt yn cyfateb) gan ddefnyddio algorithm ailadroddol a ddiffinnir fel a ganlyn: didolir mewnosodiadau yn gyntaf yn ôl eu hamlder (yr uchaf i'r isaf), ac os ydynt yr un fath, yn ôl eu didoli eilaidd yn ôl hyd (yr hiraf i'r byrraf).Felly, mae'r mewnosodiadau mwyaf aml a hiraf yn diffinio'r “grŵp” cyntaf.Mae amledd y grŵp wedi'i osod i'r amledd allweddol.Yna, ceisiwyd ychwanegu pob mewnosodiad a oedd yn weddill yn y rhestr wedi'i didoli at y grŵp trwy aliniad pairwise Needleman-Wunsch.Os nad yw nifer y diffyg cyfatebiaeth, mewnosodiadau neu ddileadau mewn aliniad yn fwy na throthwy o 2, ychwanegir mewnosodiad i'r grŵp, a chynyddir amlder cyffredinol y grŵp gan ba mor aml yr ychwanegwyd y mewnosodiad.Mae mewnosodiadau sy'n cael eu hychwanegu at grŵp yn cael eu marcio fel rhai sydd wedi'u defnyddio a'u heithrio rhag cael eu prosesu ymhellach.Os na ellir ychwanegu'r dilyniant mewnosod at grŵp sydd eisoes yn bodoli, defnyddir y dilyniant mewnosod i greu grŵp newydd gyda'r amledd mewnosod priodol a'i farcio fel y'i defnyddiwyd.Daw'r iteriad i ben pan fydd pob dilyniant mewnosod naill ai wedi'i ddefnyddio i ffurfio grŵp newydd neu gellir ei gynnwys mewn grŵp sydd eisoes yn bodoli.Wedi'r cyfan, mae mewnosodiadau wedi'u grwpio sy'n cynnwys niwcleotidau yn cael eu trosi yn y pen draw yn ddilyniannau peptid (llyfrgelloedd peptid).Canlyniad y dadansoddiad hwn yw set o fewnosodiadau a'u hamleddau cyfatebol sy'n ffurfio nifer y darlleniadau olynol (Ffig Atodol 2).
Cynhyrchu Motiffau: Yn seiliedig ar restr o beptidau unigryw, crëwyd llyfrgell yn cynnwys yr holl batrymau asid amino posibl (aa) fel y dangosir isod.Echdynnwyd pob patrwm posibl o hyd 3 o'r peptid ac ychwanegwyd ei batrwm gwrthdro ynghyd â llyfrgell motiffau cyffredin yn cynnwys yr holl batrymau (tripeptidau).Rhoddwyd trefn ar lyfrgelloedd o fotiffau hynod ailadroddus a dilëwyd diswyddiadau.Yna, ar gyfer pob tripeptid yn y llyfrgell motiffau, gwnaethom wirio am ei bresenoldeb yn y llyfrgell gan ddefnyddio offer cyfrifiannol.Yn yr achos hwn, mae amlder y peptid sy'n cynnwys y tripeptide motiff a ddarganfuwyd yn cael ei ychwanegu a'i neilltuo i'r motiff yn y llyfrgell motiffau (“nifer y motiffau”).Mae canlyniad cynhyrchu motiffau yn arae dau ddimensiwn sy'n cynnwys pob digwyddiad o dripeptidau (motiffau) a'u gwerthoedd priodol, sef nifer y darlleniadau dilyniannu sy'n arwain at y motiff cyfatebol pan fydd y darlleniadau'n cael eu hidlo, eu grwpio a'u cyfieithu.Metrigau fel y disgrifir yn fanwl uchod.
Normaleiddio nifer y motiffau a'r plotiau gwasgariad cyfatebol: Cafodd nifer y motiffau ar gyfer pob sampl ei normaleiddio gan ddefnyddio
lle ni yw nifer y darlleniadau sy'n cynnwys testun i.Felly, mae vi yn cynrychioli amlder canrannol darlleniadau (neu peptidau) sy'n cynnwys motiff i yn y sampl.Cyfrifwyd gwerthoedd P ar gyfer y nifer annormal o fotiffau gan ddefnyddio union brawf Fisher.O ran correlogramau o nifer y cymhellion, cyfrifwyd cydberthnasau Spearman gan ddefnyddio'r nifer normal o gymhellion ag R.
I ddelweddu cynnwys asidau amino ym mhob safle yn y llyfrgell peptid, crëwyd logogramau gwe 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Yn gyntaf, mae cynnwys asidau amino ym mhob safle o'r peptid 12-mer yn cael ei storio mewn matrics 20 × 12.Yna, mae set o 1000 o beptidau sy'n cynnwys yr un cynnwys asid amino cymharol ym mhob safle yn cael ei gynhyrchu mewn fformat fasta-secence a'i ddarparu fel mewnbwn i we-logo 3, sy'n cynhyrchu cynrychiolaeth graffigol o'r cynnwys asid amino cymharol ym mhob safle.ar gyfer llyfrgell peptid penodol.I ddelweddu setiau data aml-ddimensiwn, crëwyd mapiau gwres gan ddefnyddio offeryn a ddatblygwyd yn fewnol yn R (biosHeatmap, pecyn R sydd eto i'w ryddhau).Cyfrifwyd y dendrogramau a gyflwynir yn y mapiau gwres gan ddefnyddio dull clystyru hierarchaidd Ward gyda metrig pellter Ewclidaidd.Ar gyfer dadansoddiad ystadegol o ddata sgorio motiffau, cyfrifwyd gwerthoedd P ar gyfer sgorio heb ei normaleiddio gan ddefnyddio union brawf Fisher.Cyfrifwyd gwerthoedd-P ar gyfer setiau data eraill yn R gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr neu ANOVA.
Chwistrellwyd clonau phage dethol a phages heb fewnosodiadau yn fewnwythiennol trwy'r wythïen gynffon (2 × 1010 phages / anifail mewn 300 μl PBS).Ddeng munud cyn y darlifiad a'r sefydlogiad dilynol, cafodd yr un anifeiliaid eu chwistrellu'n fewnwythiennol â 100 μl o lectin wedi'i labelu gan DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 munud ar ôl pigiad phage, cafodd llygod mawr eu darlifo trwy'r galon gyda 50 ml PBS ac yna 50 ml 4% PFA/PBS.Cafodd samplau ymennydd eu gosod hefyd dros nos mewn 4% PFA/PBS a'u socian mewn 30% o swcros dros nos ar 4°C.Mae samplau wedi'u rhewi'n fflach yn y cymysgedd OCT.Perfformiwyd dadansoddiad imiwnohistocemegol o samplau wedi'u rhewi ar dymheredd ystafell ar gylch-drosiadau 30 µm wedi'u blocio ag 1% BSA a'u deor â gwrthgyrff polyclonaidd wedi'u labelu gan FITC yn erbyn T7 phage (Novus NB 600-376A) ar 4 ° C.Deor dros nos.Yn olaf, cafodd yr adrannau eu golchi 3 gwaith gyda PBS a'u harchwilio gyda microsgop laser confocal (Leica TCS SP5).
Cafodd yr holl peptidau ag isafswm purdeb o 98% eu syntheseiddio gan GenScript USA, eu biotinyleiddio a'u lyoffileiddio.Mae biotin yn cael ei rwymo trwy wahanydd glycin triphlyg ychwanegol yn y N-terminws.Gwirio pob peptid gan ddefnyddio sbectrometreg màs.
Roedd Streptavidin (Sigma S0677) wedi'i gymysgu â gormodedd cyfartal 5-plyg o peptid biotinylated, peptid ataliol BACE1 biotinylated, neu gyfuniad (cymhareb 3: 1) o peptid ataliol BACE1 biotinylated a pheptid ataliol BACE1 mewn 5-10% DMSO / deor yn PSO.1 awr ar dymheredd ystafell cyn y pigiad.Chwistrellwyd peptidau cyfun streptavidin yn fewnwythiennol ar ddogn o 10 mg / kg i mewn i un o wythiennau cynffon llygod mawr â cheudod yr ymennydd.
Aseswyd crynodiad cyfadeiladau streptavidin-peptid gan ELISA.Cafodd platiau microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) eu gorchuddio dros nos ar 4°C gyda gwrthgorff gwrth-streptavidin llygoden 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011).Ar ôl blocio (byffer blocio: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ar dymheredd yr ystafell am 2 awr, golchwch y plât gyda 0.05% Tween-20/PBS (clustog golchi) am 3 eiliad, ychwanegwyd samplau byffer toplasma 000 a plasma wedi'u gwahanu'n dda. , CSF 1:115).Yna deorwyd y plât dros nos ar 4°C gyda gwrthgorff canfod (1 μg/ml, gwrth-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Ar ôl tri cham golchi, canfuwyd streptavidin trwy ddeor mewn toddiant swbstrad TMB (Roche) am hyd at 20 munud.Ar ôl atal datblygiad lliw gyda 1M H2SO4, mesurwch yr amsugnedd ar 450 nm.
Aseswyd swyddogaeth y cyfadeilad atalydd streptavidin-peptide-BACE1 gan Aβ(1-40) ELISA yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (Wako, 294-64701).Yn gryno, cafodd samplau CSF eu gwanhau mewn gwanedydd safonol (1:23) a'u deor dros nos ar 4°C mewn platiau 96-ffynnon wedi'u gorchuddio â gwrthgorff dal BNT77.Ar ôl pum cam golchi, ychwanegwyd gwrthgorff BA27 cyfun HRP a'i ddeor am 2 awr ar 4 ° C., ac yna pum cam golchi.Canfuwyd Aβ(1-40) trwy ddeor mewn hydoddiant TMB am 30 munud ar dymheredd ystafell.Ar ôl i ddatblygiad lliw gael ei atal gyda hydoddiant stopio, mesurwch yr amsugnedd ar 450 nm.Roedd samplau plasma yn destun echdynnu cyfnod solet cyn Aβ(1-40) ELISA.Ychwanegwyd plasma at 0.2% DEA (Sigma) mewn platiau 96-ffynnon a'i ddeor ar dymheredd ystafell am 30 munud.Ar ôl golchi'r platiau SPE (Oasis, 186000679) yn olynol â dŵr a 100% methanol, ychwanegwyd samplau plasma at y platiau SPE a thynnwyd yr holl hylif.Cafodd samplau eu golchi (yn gyntaf gyda 5% methanol yna 30% methanol) a'u hegluro â 2% NH4OH / 90% methanol.Ar ôl sychu'r eluate ar 55 ° C am 99 munud ar gerrynt N2 cyson, gostyngwyd y samplau mewn gwanwyr safonol a mesurwyd Aβ(1-40) fel y disgrifir uchod.
Sut i ddyfynnu'r erthygl hon: Urich, E. et al.Cludo cargo i'r ymennydd gan ddefnyddio peptidau tramwy a nodir yn vivo.y wyddoniaeth.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB a Moos T. Cyflenwi cyffuriau macromoleciwlaidd i'r ymennydd gan ddefnyddio therapi wedi'i dargedu.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., a Martinez-Martinez, P. Cyflenwi cyffuriau peptid a phrotein ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Y rhwystr gwaed-ymennydd: tagfa yn natblygiad cyffuriau'r ymennydd.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, a Byrd, A. Rhagolygon ar gyfer cyflenwi cyffuriau gwell a thargedu i'r ymennydd trwy'r llwybr coroid plexus-CSF.Ymchwil Fferyllol 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Moderneiddio biopharmaceuticals gyda cheffylau Trojan moleciwlaidd ar gyfer esgor ar yr ymennydd.Cemeg Bioconjug 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, cludiant peptid trwy dderbynnydd WM ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd.Endocr Parch. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Cynyddu treiddiad yr ymennydd ac effeithiolrwydd gwrthgyrff therapiwtig gan ddefnyddio gwennol moleciwlaidd monofalent.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Mae cludiant derbynnydd Transferrin (TfR) yn pennu nifer yr ymennydd sy'n manteisio ar amrywiadau affinedd o wrthgyrff TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).