Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae biopsi hylif (LB) yn gysyniad sy'n dod yn fwyfwy poblogaidd yn y maes biofeddygol.Mae'r cysyniad yn seiliedig yn bennaf ar ganfod darnau o DNA allgellog sy'n cylchredeg (ccfDNA), sy'n cael eu rhyddhau'n bennaf fel darnau bach ar ôl marwolaeth celloedd mewn meinweoedd amrywiol.Mae cyfran fechan o'r darnau hyn yn tarddu o feinweoedd neu organebau tramor (tramor).Yn ein gwaith presennol, rydym wedi cymhwyso'r cysyniad hwn i gregyn gleision, rhywogaeth warchodol sy'n adnabyddus am eu gallu i hidlo dŵr môr uchel.Rydym yn defnyddio gallu cregyn gleision i weithredu fel hidlwyr naturiol i ddal darnau DNA amgylcheddol o amrywiaeth o ffynonellau i ddarparu gwybodaeth am fioamrywiaeth ecosystemau arfordirol morol.Mae ein canlyniadau'n dangos bod hemolymff cregyn gleision yn cynnwys darnau DNA sy'n amrywio'n fawr o ran maint, o 1 i 5 kb.Dangosodd dilyniannu dryll fod nifer fawr o ddarnau DNA o darddiad microbaidd tramor.Yn eu plith, canfuom ddarnau DNA o facteria, archaea, a firysau, gan gynnwys firysau y gwyddys eu bod yn heintio amrywiaeth o westeion a geir yn gyffredin mewn ecosystemau morol arfordirol.I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos bod y cysyniad o LB a gymhwysir at gregyn gleision yn ffynhonnell gyfoethog o wybodaeth nad yw wedi'i harchwilio eto am amrywiaeth microbaidd mewn ecosystemau arfordirol morol.
Mae effaith newid hinsawdd (CC) ar fioamrywiaeth ecosystemau morol yn faes ymchwil sy’n tyfu’n gyflym.Mae cynhesu byd-eang nid yn unig yn achosi straen ffisiolegol pwysig, ond hefyd yn gwthio terfynau esblygiadol sefydlogrwydd thermol organebau morol, gan effeithio ar gynefin nifer o rywogaethau, gan eu hannog i chwilio am amodau mwy ffafriol [1, 2].Yn ogystal ag effeithio ar fioamrywiaeth metazoans, mae CC yn amharu ar gydbwysedd bregus rhyngweithiadau lletyol-microbaidd.Mae'r dysbacteriosis microbaidd hwn yn fygythiad difrifol i ecosystemau morol gan ei fod yn gwneud organebau morol yn fwy agored i bathogenau heintus [3, 4].Credir bod SS yn chwarae rhan bwysig mewn marwolaethau torfol, sy'n broblem ddifrifol ar gyfer rheoli ecosystemau morol byd-eang [5, 6].Mae hwn yn fater pwysig o ystyried effeithiau economaidd, ecolegol a maethol llawer o rywogaethau morol.Mae hyn yn arbennig o wir ar gyfer cregyn deuglawr sy'n byw yn y rhanbarthau pegynol, lle mae effeithiau CK yn fwy uniongyrchol a difrifol [6, 7].Mewn gwirionedd, mae cregyn deuglawr fel Mytilus spp.yn cael eu defnyddio'n eang i fonitro effeithiau CC ar ecosystemau morol.Nid yw'n syndod bod nifer gymharol fawr o fiofarcwyr wedi'u datblygu i fonitro eu hiechyd, yn aml gan ddefnyddio dull dwy haen sy'n cynnwys biomarcwyr swyddogaethol yn seiliedig ar weithgaredd ensymatig neu swyddogaethau cellog fel hyfywedd celloedd a gweithgaredd phagocytig [8].Mae'r dulliau hyn hefyd yn cynnwys mesur y crynodiad o ddangosyddion pwysau penodol sy'n cronni mewn meinweoedd meddal ar ôl amsugno llawer iawn o ddŵr môr.Fodd bynnag, mae'r gallu hidlo uchel a'r system gylchrediad gwaed lled-agored o ddwygragennod yn rhoi cyfle i ddatblygu biofarcwyr hemolymff newydd gan ddefnyddio'r cysyniad o biopsi hylif (LB), dull syml a lleiaf ymledol o reoli cleifion.samplau gwaed [9, 10].Er y gellir dod o hyd i sawl math o foleciwlau sy'n cylchredeg yn LB dynol, mae'r cysyniad hwn wedi'i seilio'n bennaf ar ddadansoddiad dilyniant DNA o ddarnau DNA allgellog (CCFDNA) sy'n cylchredeg mewn plasma.Mewn gwirionedd, mae presenoldeb DNA sy'n cylchredeg mewn plasma dynol wedi bod yn hysbys ers canol yr 20fed ganrif [11], ond dim ond yn ystod y blynyddoedd diwethaf y mae dyfodiad dulliau dilyniannu trwybwn uchel wedi arwain at ddiagnosis clinigol yn seiliedig ar CCFDNA.Mae presenoldeb y darnau DNA sy'n cylchredeg hyn yn rhannol oherwydd rhyddhau DNA genomig yn oddefol (niwclear a mitochondrial) ar ôl marwolaeth celloedd. Mewn unigolion iach, mae crynodiad ccfDNA fel arfer yn isel (<10 ng/mL) ond gellir ei gynyddu 5-10 gwaith mewn cleifion sy'n dioddef o wahanol batholegau neu'n destun straen, gan arwain at niwed i feinwe. Mewn unigolion iach, mae crynodiad ccfDNA fel arfer yn isel (<10 ng/mL) ond gellir ei gynyddu 5-10 gwaith mewn cleifion sy'n dioddef o wahanol batholegau neu'n destun straen, gan arwain at niwed i feinwe. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в раЅьшаться в раЅьшаться в раЅьы и браы ульы и чной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Mewn pobl iach, mae crynodiad cccDNA fel arfer yn isel (<10 ng/mL), ond gall gynyddu 5-10 gwaith mewn cleifion â phatholegau amrywiol neu dan straen sy'n arwain at niwed i feinwe.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL）, 但在患有各种病理或承劏理或承劏理或承劏理或常较倠10 倍，从而导致组织损伤。在 健康个体中, ccfdna 的浓度较低 （（<10 ng/ml）但在各种病理或承個增加 5-10倍，从而组织。。。 损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-зон и зон и зоми ичными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Mae crynodiadau ccfDNA fel arfer yn isel (<10 ng/ml) mewn unigolion iach, ond gellir eu cynyddu 5-10 gwaith mewn cleifion â phatholegau neu straen amrywiol, gan arwain at niwed i feinwe.Mae maint darnau ccfDNA yn amrywio'n fawr, ond fel arfer maent yn amrywio o 150 i 200 bp.[12].Gellir defnyddio dadansoddiad o ccfDNA hunan-deilliedig, hy, ccfDNA o gelloedd cynnal arferol neu drawsnewidiedig, i ganfod newidiadau genetig ac epigenetig sy'n bresennol yn y genom niwclear a / neu mitocondriaidd, a thrwy hynny helpu clinigwyr i ddewis therapïau moleciwlaidd penodol [13].Fodd bynnag, gellir cael ccfDNA o ffynonellau tramor fel ccfDNA o gelloedd ffetws yn ystod beichiogrwydd neu o organau wedi'u trawsblannu [14,15,16,17].Mae ccfDNA hefyd yn ffynhonnell wybodaeth bwysig ar gyfer canfod presenoldeb asidau niwclëig o asiant heintus (tramor), sy'n caniatáu canfod anfewnwthiol heintiau eang nad ydynt wedi'u nodi gan ddiwylliannau gwaed, gan osgoi biopsi ymledol o feinwe heintiedig [18].Mae astudiaethau diweddar yn wir wedi dangos bod gwaed dynol yn cynnwys ffynhonnell gyfoethog o wybodaeth y gellir ei defnyddio i adnabod pathogenau firaol a bacteriol, a bod tua 1% o'r ccfDNA a geir mewn plasma dynol o darddiad tramor [19].Mae'r astudiaethau hyn yn dangos y gellir asesu bioamrywiaeth microbiome cylchredol organeb gan ddefnyddio dadansoddiad ccfDNA.Fodd bynnag, tan yn ddiweddar, defnyddiwyd y cysyniad hwn yn gyfan gwbl mewn bodau dynol ac, i raddau llai, mewn fertebratau eraill [20, 21].
Yn y papur presennol, rydym yn defnyddio'r potensial LB i ddadansoddi ccfDNA Aulacomya atra, rhywogaeth ddeheuol a geir yn gyffredin yn Ynysoedd Kerguelen is-antarctig, grŵp o ynysoedd ar lwyfandir mawr a ffurfiodd 35 miliwn o flynyddoedd yn ôl.ffrwydrad folcanig.Gan ddefnyddio system arbrofol in vitro, canfuwyd bod darnau DNA mewn dŵr môr yn cael eu cymryd yn gyflym gan gregyn gleision ac yn mynd i mewn i'r adran hemolymff.Mae dilyniannu drylliau wedi dangos bod hemolymff cregyn gleision ccfDNA yn cynnwys darnau DNA o’i darddiad ei hun a heb fod yn hunan darddiad, gan gynnwys bacteria symbiotig a darnau DNA o fiomau sy’n nodweddiadol o ecosystemau arfordirol morol folcanig oer.Mae hemolymph ccfDNA hefyd yn cynnwys dilyniannau firaol sy'n deillio o firysau gyda gwahanol ystodau gwesteiwr.Canfuom hefyd ddarnau DNA o anifeiliaid amlgellog fel pysgod esgyrnog, anemonïau môr, algâu a phryfed.I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos y gellir cymhwyso cysyniad LB yn llwyddiannus i infertebratau morol i gynhyrchu repertoire genomig cyfoethog mewn ecosystemau morol.
Oedolion (55-70 mm o hyd) Casglwyd Mytilus platensis (M. platensis) ac Aulacomya atra (A. atra) o lannau creigiog rhynglanwol Port-au-Ffrainc (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Ynysoedd Kerguelen ym mis Rhagfyr 2018. Cafwyd cregyn gleision llawndwf eraill (Mytilus spp.) gan gyflenwr masnachol (PEI Mussel King Inc., Ynys y Tywysog Edward, Canada) a'u gosod mewn tanc awyredig a reolir gan dymheredd (4 ° C) yn cynnwys 10-20 L o heli artiffisial 32 ‰.(halen môr artiffisial Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, UDA).Ar gyfer pob arbrawf, mesurwyd hyd a phwysau cregyn unigol.
Mae protocol mynediad agored am ddim ar gyfer y rhaglen hon ar gael ar-lein ( https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1 ).Yn fyr, casglwyd hemolymff LB o gyhyrau abductor fel y disgrifiwyd [22].Eglurwyd yr hemolymff trwy allgyrchu ar 1200 × g am 3 munud, cafodd y supernatant ei rewi (-20 ° C) nes ei ddefnyddio.Ar gyfer ynysu a phuro cfDNA, cafodd samplau (1.5-2.0 ml) eu dadmer a'u prosesu gan ddefnyddio'r pecyn NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.Roedd ccfDNA yn cael ei storio ar -80°C tan ddadansoddiad pellach.Mewn rhai arbrofion, cafodd ccfDNA ei ynysu a'i buro gan ddefnyddio Pecyn Ymchwilydd DNA QIAamp (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Cafodd DNA wedi'i buro ei feintioli gan ddefnyddio assay PicoGreen safonol.Dadansoddwyd dosbarthiad darnau'r ccfDNA ynysig gan electrofforesis capilari gan ddefnyddio biodadansoddwr Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) gan ddefnyddio Pecyn DNA Sensitifrwydd Uchel.Perfformiwyd yr assay gan ddefnyddio 1 µl o'r sampl ccfDNA yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Ar gyfer dilyniannu darnau ccfDNA hemolymff, paratôdd Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) lyfrgelloedd dryll gan ddefnyddio pecyn Illumina DNA Mix o becyn Illumina MiSeq PE75.Defnyddiwyd addasydd safonol (BioO).Aseswyd ansawdd darllen sylfaenol gan ddefnyddio FastQC [23].Mae Trimmomatic [24] wedi'i ddefnyddio ar gyfer clipio addaswyr a darlleniadau o ansawdd gwael.Unwyd darlleniadau dryll gyda dau ben ei gilydd yn FLASH yn darlleniadau sengl hirach gydag isafswm gorgyffwrdd o 20 bp er mwyn osgoi anghydweddiad [25]. Cafodd darlleniadau cyfun eu hanodi â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata Tacsonomeg NCBI dwygragennog (gwerth e <1e−3 a homoleg 90%), a pherfformiwyd cuddio dilyniannau cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26]. Cafodd darlleniadau cyfun eu hanodi â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata Tacsonomeg NCBI dwygragennog (gwerth e <1e−3 a homoleg 90%), a pherfformiwyd cuddio dilyniannau cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономих таксономих таксономих таксономих NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности быломично былоности. 26]. Cafodd darlleniadau cyfun eu hanodi â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata tacsonomeg dwygragennog NCBI (gwerth e <1e-3 a 90% homoleg), a pherfformiwyd masgio dilyniant cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释䐈并的读数 用 并的读数,复杂度序列的掩蔽.使用 双壳类 ncbi 分类 (（（<1e-3和 90%同源）用用用注释䐈并读源 用 注释 合并读溕 2，复杂度序列的。。。。掩蔽掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽掩蔽 蔽掩蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической баЅны баЅны баЅыы ллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложноличнолого сложнолически ием LLWCH [26]. Cafodd darlleniadau cyfun eu hanodi â BLASTN gan ddefnyddio cronfa ddata tacsonomig dwygragennog NCBI (e gwerth <1e-3 a 90% homoleg), a pherfformiwyd masgio dilyniant cymhlethdod isel gan ddefnyddio DUST [26].Rhannwyd darlleniadau yn ddau grŵp: yn ymwneud â dilyniannau dwygragennog (a elwir yma yn hunan-ddarllen) ac anghysylltiedig (heb fod yn hunan-ddarllen).Yn y cyfamser, dosbarthwyd dosbarthiad tacsonomig darlleniadau microbiome estron gan ddefnyddio Kraken2 [28] a'i gynrychioli'n graff gan siart cylch krona ar alaeth [29, 30]. Yna nodwyd hunangyfrifiadau trwy aliniad â BLASTN (cronfa ddata dwygragennog NCBI, e-werth < 1e−10 a 60% homoleg) ar gyfer anodiad terfynol. Yna nodwyd hunangyfrifiadau trwy aliniad â BLASTN (cronfa ddata dwygragennog NCBI, e-werth < 1e−10 a 60% homoleg) ar gyfer anodiad terfynol. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворлюх двустворюскать е e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. Yna nodwyd hunan-contigs trwy baru yn erbyn BLASTN (cronfa ddata dwygragennog NCBI, gwerth e <1e-10 a 60% homology) ar gyfer anodi terfynol.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e值< 1e-10 和 60% 同源性）对齐来识庇场场识庇场场识庇场圌圌圌场圌圌圌识序终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，a 值< 1e-10 和60% Yna nodwyd hunangyfrifiadau ar gyfer anodi terfynol trwy baru yn erbyn BLASTN (cronfa ddata dwygragennog NCBI, e-werth <1e-10 a 60% homoleg). Ochr yn ochr, anodedig contigs grŵp nonself gyda BLASTN (nt cronfa ddata NCBI, gwerth e < 1e - 10 a homology 60%). Ochr yn ochr, anodedig contigs grŵp nonself gyda BLASTN (nt cronfa ddata NCBI, gwerth e < 1e - 10 a homology 60%). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN ( база данных nt NCBI < гия 60%). Ochr yn ochr, cafodd contigs grŵp tramor eu hanodi â BLASTN (cronfa ddata NT NCBI, gwerth e <1e-10 a 60% homology). Параралелельно контиги, не относщиеся к собственной группeich, ыыли анннотированч0 1 с з nOut, зOut ( и гомология 60%). Blastx также пыы проведен на несамостоятельных контигах с и исползовзовние dи баз дя д д дOur иOur (refse иOL и иOL иOL иOL иOL иOL иOL дOL дOL дOL дOL дOL мOREEX 60%). Blastx также выполняли на несамостоятельных контигах с и и ползовновнием м данннных б’ar 60 refseq nCOne .
Rhestrir y paent preimio a ddefnyddir ar gyfer PCR yn Nhabl S1.Defnyddiwyd yr amodau ymateb canlynol: dadnatureiddio ar 95 ° C am 3 munud, 95 ° C am 1 munud, gosod tymheredd anelio am 1 munud, elongation ar 72 ° C am 1 munud, 35 cylch, ac yn olaf 72 ° C o fewn 10 munud..Cafodd cynhyrchion PCR eu gwahanu gan electrofforesis mewn geliau agarose (1.5%) sy'n cynnwys staen gel DNA diogel SYBRTM (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ar 95 V.
Cafodd cregyn gleision (Mytilus spp.) eu cynefino mewn 500 ml o ddŵr môr ocsigenedig (32 PSU) am 24 awr ar 4°C.Ychwanegwyd DNA plasmid sy'n cynnwys mewnosodiad sy'n amgodio'r dilyniant cDNA galectin-7 dynol (rhif derbyn NCBI L07769) at y ffiol ar grynodiad terfynol o 190 μg/μl.Cregyn gleision a ddeorwyd o dan yr un amodau heb ychwanegu DNA oedd y rheolaeth.Roedd y trydydd tanc rheoli yn cynnwys DNA heb gregyn gleision.Er mwyn monitro ansawdd DNA mewn dŵr môr, cymerwyd samplau dŵr môr (20 μl; tri ailadrodd) o bob tanc ar yr amser a nodwyd.Ar gyfer olrhain DNA plasmid, cynaeafwyd cregyn gleision LB ar yr amseroedd a nodwyd a'u dadansoddi gan qPCR a ddPCR.Oherwydd y cynnwys halen uchel mewn dŵr môr, cafodd yr aliquots eu gwanhau mewn dŵr o ansawdd PCR (1:10) cyn yr holl brofion PCR.
Perfformiwyd droplet digidol PCR (ddPCR) gan ddefnyddio protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Defnyddiwch y proffil tymheredd i bennu'r tymheredd gorau posibl (Tabl S1).Cynhyrchwyd diferion gan ddefnyddio generadur gollwng QX200 (BioRad).Cynhaliwyd ddPCR fel a ganlyn: 95 ° C am 5 munud, 50 cylch o 95 ° C am 30 s a thymheredd anelio penodol am 1 munud a 72 ° C am 30 s, 4 ° C am 5 munud a 90 ° C o fewn 5 munud.Mesurwyd nifer y diferion ac adweithiau positif (nifer y copïau/µl) gan ddefnyddio darllenydd gollwng QX200 (BioRad).Gwrthodwyd samplau gyda llai na 10,000 o ddefnynnau.Ni pherfformiwyd rheolaeth patrwm bob tro roedd ddPCR yn cael ei redeg.
Perfformiwyd qPCR gan ddefnyddio paent preimio penodol Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Awstralia) a LGALS7.Perfformiwyd pob PCR meintiol mewn 20 µl gan ddefnyddio Pecyn PCR Gwyrdd QuantiFast SYBR (QIAGEN).Dechreuwyd qPCR gyda deori 15 munud ar 95 ° C ac yna 40 cylch ar 95 ° C am 10 eiliad ac ar 60 ° C am 60 eiliad gydag un casgliad data.Cynhyrchwyd cromliniau toddi gan ddefnyddio mesuriadau olynol ar 95 ° C ar gyfer 5 s, 65 ° C ar gyfer 60 s, a 97 ° C ar ddiwedd y qPCR.Perfformiwyd pob qPCR yn driphlyg, ac eithrio samplau rheoli.
Gan fod cregyn gleision yn adnabyddus am eu cyfradd hidlo uchel, fe wnaethom ymchwilio'n gyntaf i weld a allent hidlo a chadw darnau DNA sy'n bresennol mewn dŵr môr.Roedd gennym ddiddordeb hefyd mewn gweld a yw'r darnau hyn yn cronni yn eu system lymffatig lled-agored.Fe wnaethom ddatrys y mater hwn yn arbrofol trwy olrhain tynged darnau DNA hydawdd a ychwanegwyd at danciau cregyn gleision glas.Er mwyn hwyluso olrhain darnau DNA, fe wnaethom ddefnyddio DNA plasmid tramor (nid hunan) yn cynnwys y genyn galectin-7 dynol.Mae ddPCR yn olrhain darnau DNA plasmid mewn dŵr môr a chregyn gleision.Dengys ein canlyniadau pe bai maint y darnau DNA mewn dŵr môr yn aros yn gymharol gyson dros amser (hyd at 7 diwrnod) yn absenoldeb cregyn gleision, yna ym mhresenoldeb cregyn gleision, diflannodd y lefel hon bron yn gyfan gwbl o fewn 8 awr (Ffig. 1a,b).Darnau o DNA alldarddol eu canfod yn hawdd o fewn 15 munud mewn hylif mewnfalfwlaidd a hemolymff (Ffig. 1c).Gellid dal i ganfod y darnau hyn hyd at 4 awr ar ôl dod i gysylltiad.Mae'r gweithgaredd hidlo hwn mewn perthynas â darnau DNA yn debyg i weithgaredd hidlo bacteria ac algâu [31].Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall cregyn gleision hidlo a chronni DNA estron yn eu hadrannau hylif.
Crynodiadau cymharol o DNA plasmid mewn dŵr môr ym mhresenoldeb (A) neu absenoldeb (B) cregyn gleision, wedi'i fesur gan ddPCR.Yn A, mynegir y canlyniadau fel canrannau, gyda ffiniau'r blychau yn cynrychioli'r 75ain a'r 25ain canradd.Dangosir y gromlin logarithmig wedi'i gosod mewn coch, ac mae'r arwynebedd sydd wedi'i liwio'n llwyd yn cynrychioli'r cyfwng hyder o 95%.Yn B, mae’r llinell goch yn cynrychioli’r cymedr ac mae’r llinell las yn cynrychioli’r cyfwng hyder 95% ar gyfer y crynodiad.C DNA plasmid yn cronni yn yr hemolymff a hylif falfaidd cregyn gleision ar wahanol adegau ar ôl ychwanegu DNA plasmid.Cyflwynir y canlyniadau fel copïau absoliwt wedi'u canfod/mL (±SE).
Nesaf, gwnaethom ymchwilio i darddiad CCFDNA mewn cregyn gleision a gasglwyd o welyau cregyn gleision ar Ynysoedd Kerguelen, grŵp anghysbell o ynysoedd sydd â dylanwad anthropogenig cyfyngedig.Canfuom fod crynodiadau hemolymff ccfDNA ar gyfartaledd mewn cregyn gleision yn yr ystod microgramau isel fesul ml hemolymff (gweler Tabl S2, gwybodaeth atodol).Mae'r ystod hon o grynodiadau yn llawer mwy nag mewn pobl iach (nogramau isel fesul mililitr), ond mewn achosion prin, mewn cleifion canser, gall lefel y ccfDNA gyrraedd sawl microgram fesul mililitr [34, 35].Dangosodd dadansoddiad o ddosbarthiad maint hemolymff ccfDNA fod y darnau hyn yn amrywio'n fawr o ran maint, yn amrywio o 1000 bp i 1000 bp.hyd at 5000 bp (Ffig. 2).Cafwyd canlyniadau tebyg gan ddefnyddio'r Pecyn Ymchwilydd QIAamp sy'n seiliedig ar silica, dull a ddefnyddir yn gyffredin mewn gwyddoniaeth fforensig i ynysu a phuro DNA genomig yn gyflym o samplau DNA crynodiad isel, gan gynnwys ccfDNA [36].
Electrophoregram ccfDNA cynrychiolydd o hemolymff cregyn gleision.Wedi'i dynnu gyda Phecyn Plasma NucleoSnap (top) a Phecyn Ymchwilydd DNA QIAamp.B Plot ffidil yn dangos dosbarthiad crynodiadau hemolymff ccfDNA (±SE) mewn cregyn gleision.Mae'r llinellau du a choch yn cynrychioli'r canolrif a'r chwartel cyntaf a'r trydydd chwartel, yn y drefn honno.
Mae gan tua 1% o ccfDNA mewn bodau dynol ac primatiaid ffynhonnell dramor [21, 37].O ystyried y system gylchrediad gwaed lled-agored o ddwygragennod, dŵr y môr sy'n llawn microbau, a dosbarthiad maint ccfDNA cregyn gleision, gwnaethom ddamcaniaethu y gallai hemolymff ccfDNA cregyn gleision gynnwys pwll cyfoethog ac amrywiol o DNA microbaidd.I brofi'r ddamcaniaeth hon, fe wnaethom ddilyniannu hemolymff ccfDNA o samplau Aulacomya atra a gasglwyd o Ynysoedd Kerguelen, gan roi dros 10 miliwn o ddarlleniadau, gyda 97.6% ohonynt wedi pasio rheolaeth ansawdd.Yna dosbarthwyd y darlleniadau yn ôl eu ffynonellau eu hunain a ffynonellau eraill gan ddefnyddio cronfeydd data dwygragennog BLASTN a NCBI (Ffig. S1, Gwybodaeth Atodol).
Mewn bodau dynol, gellir rhyddhau DNA niwclear a mitocondriaidd i'r llif gwaed [38].Fodd bynnag, yn yr astudiaeth bresennol, nid oedd yn bosibl disgrifio'n fanwl DNA genomig niwclear cregyn gleision, o ystyried nad yw'r genom A. atra wedi'i ddilyniannu na'i ddisgrifio.Fodd bynnag, roeddem yn gallu nodi nifer o ddarnau ccfDNA o'n tarddiad ein hunain gan ddefnyddio'r llyfrgell ddeugragennog (Ffig. S2, Gwybodaeth Atodol).Rydym hefyd yn cadarnhau presenoldeb darnau DNA o'n tarddiad hunain gan gyfeirio PCR ymhelaethu ar y rhai A. genynnau atra a oedd yn dilyniannu (Ffig. 3).Yn yr un modd, o ystyried bod genom mitocondriaidd A. atra ar gael mewn cronfeydd data cyhoeddus, gellir dod o hyd i dystiolaeth am bresenoldeb darnau ccfDNA mitocondriaidd yn hemolymff A. atra.Cadarnhawyd presenoldeb darnau DNA mitocondriaidd gan ymhelaethiad PCR (Ffig. 3).
Roedd genynnau mitocondriaidd amrywiol yn bresennol yn hemolymff A. atra (smotiau coch – rhif stoc: SRX5705969) ac M. platensis (smotiau glas – rhif stoc: SRX5705968) wedi'i chwyddo gan PCR.Ffigur wedi'i addasu o'r Llydaweg et al., 2011 B Ymhelaethiad ar uwchnatur haemolymff o A. atra Wedi'i storio ar bapur FTA.Defnyddiwch dyrnu 3 mm i'w ychwanegu'n uniongyrchol at y tiwb PCR sy'n cynnwys y cymysgedd PCR.
O ystyried y cynnwys microbaidd helaeth mewn dŵr môr, fe wnaethom ganolbwyntio i ddechrau ar nodweddu dilyniannau DNA microbaidd mewn hemolymff.I wneud hyn, rydym yn defnyddio dwy strategaeth wahanol.Defnyddiodd y strategaeth gyntaf Kraken2, rhaglen ddosbarthu dilyniant seiliedig ar algorithm sy'n gallu nodi dilyniannau microbaidd gyda chywirdeb tebyg i BLAST ac offer eraill [28].Penderfynwyd bod mwy na 6719 o ddarlleniadau o darddiad bacteriol, tra bod 124 a 64 o archaea a firysau, yn y drefn honno (Ffig. 4).Y darnau DNA bacteriol mwyaf niferus oedd Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), a Bacteroidetes (17%) (Ffig. 4a).Mae'r dosbarthiad hwn yn gyson ag astudiaethau blaenorol o'r microbiome cregyn gleision morol [39, 40].Gammaproteobacteria oedd y prif ddosbarth o Proteobacteria (44%), gan gynnwys llawer o Vibrionales (Ffig. 4b).Cadarnhaodd y dull ddPCR bresenoldeb darnau DNA Vibrio yn y ccfDNA o hemolymff A. atra (Ffig. 4c) [41].I gael mwy o wybodaeth am darddiad bacteriol ccfDNA, cymerwyd ymagwedd ychwanegol (Ffig. S2, Gwybodaeth Atodol). Yn yr achos hwn, cafodd darlleniadau a oedd yn gorgyffwrdd eu cydosod fel darlleniadau pen parau ac fe'u dosbarthwyd fel rhai o darddiad hunan (deufalfau) neu nonself gan ddefnyddio BLASTN ac e-werth o 1e -3 a thoriad gyda > 90% homology. Yn yr achos hwn, cafodd darlleniadau a oedd yn gorgyffwrdd eu cydosod fel darlleniadau pen parau ac fe'u dosbarthwyd fel rhai o darddiad hunan (deufalfau) neu nonself gan ddefnyddio BLASTN ac e-werth o 1e -3 a thoriad gyda > 90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения случае парными концами и бысрини кака чтения парными концами и бысрини какрили коными ые (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1оски или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3е 90%. Yn yr achos hwn, casglwyd darlleniadau gorgyffwrdd fel darlleniadau pen-paru a chawsant eu dosbarthu fel rhai brodorol (deufalf) neu heb fod yn wreiddiol gan ddefnyddio BLASTN ac e gwerth 1e-3 a thorbwynt gyda > 90% homology.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN和1e-3的e怼和>9分类为自身（双壳类）或非自身来源。在这种情况下，重叠读数组装为配末端读数，使用使用使璔 blast 1 倌 倌 倌 用 数 用 使璔 blast 1 倌 倌 倌 和 数 用 和 数 用 和 数 猄 倌 倌 倌 用 blast 1 倌倌0% 同源性的分类自身（双壳类）非自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и класкибифицы устворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 % и происхождению с Yn yr achos hwn, casglwyd darlleniadau gorgyffwrdd fel darlleniadau diwedd parau a'u dosbarthu fel darlleniadau eu hunain (deufalfau) neu heb fod yn wreiddiol gan ddefnyddio gwerthoedd e BLASTN ac 1e-3 a throthwy homoleg >90%.Gan nad yw'r genom A. atra wedi'i ddilyniannu eto, defnyddiwyd strategaeth cydosod de novo y cydosodwr Dilyniannu Cenhedlaeth Nesaf (NGS) MEGAHIT.Mae cyfanswm o 147,188 contig wedi'u nodi fel rhai dibynnol (deufalfau) o darddiad.Yna ffrwydrodd y contigs hyn gydag e-werthoedd o 1e-10 gan ddefnyddio BLASTN a BLASTX.Roedd y strategaeth hon yn ein galluogi i nodi 482 o ddarnau nad oeddent yn ddeugragennog yn bresennol yn A. atra ccfDNA.Cafwyd mwy na hanner (57%) o'r darnau DNA hyn o facteria, yn bennaf o symbiontau tagell, gan gynnwys symbiontau sulfotroffig, ac o symbiontau tagell Solemya velum (Ffig. 5).
Digonedd cymharol ar lefel math.B Amrywiaeth ficrobaidd dau brif ffyla (Firmicutes a Proteobacteria).Ymhelaethiad cynrychioliadol o ddPCR C Vibrio spp.A. Darnau o'r genyn rRNA 16S (glas) mewn tri haemolymff atra.
Dadansoddwyd cyfanswm o 482 contigau a gasglwyd.Proffil cyffredinol o ddosbarthiad tacsonomig anodiadau contig metagenomig (procaryotau ac ewcaryotau).B Dosbarthiad manwl o ddarnau DNA bacteriol a nodwyd gan BLASTN a BLASTX.
Dangosodd dadansoddiad Kraken2 hefyd fod ccfDNA cregyn gleision yn cynnwys darnau DNA archaeal, gan gynnwys darnau DNA o Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), a Thaurmarcheota (11%) (Ffig. 6a).Ni ddylai presenoldeb darnau DNA sy'n deillio o Euryarchaeota a Crenarchaeota, a ddarganfuwyd yn flaenorol yn y gymuned ficrobaidd o gregyn gleision Califfornia, fod yn syndod [42].Er bod Euryarchaeota yn aml yn gysylltiedig ag amodau eithafol, cydnabyddir bellach bod Euryarchaeota a Crenarcheota ymhlith y procaryotau mwyaf cyffredin yn yr amgylchedd cryogenig morol [43, 44].Nid yw presenoldeb micro-organebau methanogenig mewn cregyn gleision yn syndod, o ystyried adroddiadau diweddar o ollyngiadau methan helaeth o ollyngiadau gwaelod ar Lwyfandir Kerguelen [45] a chynhyrchiad methan microbaidd posibl a welwyd oddi ar arfordir Ynysoedd Kerguelen [46].
Fodd bynnag, daw'r DNA firaol mwyaf cyffredin o ffylwm o nucleocytoviruses, a elwir hefyd yn firws DNA mawr cytoplasmig niwclear (NCLDV), sydd â'r genom mwyaf o unrhyw firws.O fewn y ffylwm hwn, mae'r rhan fwyaf o ddilyniannau DNA yn perthyn i'r teuluoedd Mimimidoviridae (58%) a Poxviridae (21%), y mae eu cynhalwyr naturiol yn cynnwys fertebratau ac arthropodau, tra bod cyfran fach o'r dilyniannau DNA hyn yn perthyn i algâu firolegol hysbys.Mae'n heintio algâu ewcaryotig morol.Cafwyd y dilyniannau hefyd o'r firws Pandora, y firws enfawr gyda'r maint genom mwyaf o unrhyw genera firaol hysbys.Yn ddiddorol, roedd yr ystod o westeion y gwyddys eu bod wedi'u heintio â'r firws, fel y'i pennwyd gan ddilyniant ccfDNA hemolymph, yn gymharol fawr (Ffigur S3, Gwybodaeth Atodol).Mae'n cynnwys firysau sy'n heintio pryfed fel Baculoviridae ac Iridoviridae, yn ogystal â firysau sy'n heintio amoeba, algâu a fertebratau.Gwelsom hefyd ddilyniannau sy'n cyfateb i'r genom Pithovirus sibericum.Cafodd pitofeirysau (a elwir hefyd yn “firysau zombie”) eu hynysu gyntaf o rew parhaol 30,000 oed yn Siberia [47].Felly, mae ein canlyniadau'n gyson ag adroddiadau blaenorol sy'n dangos nad yw pob rhywogaeth fodern o'r firysau hyn wedi diflannu [48] ac y gallai'r firysau hyn fod yn bresennol mewn ecosystemau morol subarctig anghysbell.
Yn olaf, gwnaethom brofi i weld a allem ddod o hyd i ddarnau DNA o anifeiliaid amlgellog eraill.Nodwyd cyfanswm o 482 contig tramor gan BLASTN a BLASTX gyda llyfrgelloedd nt, nr a RefSeq (genomig a phrotein).Mae ein canlyniadau yn dangos bod ymhlith y darnau tramor o ccfDNA o anifeiliaid amlgellog DNA o esgyrn esgyrnog yn bennaf (Ffig. 5).Darganfuwyd darnau DNA o bryfed a rhywogaethau eraill hefyd.Nid yw rhan gymharol fawr o'r darnau DNA wedi'i nodi, o bosibl oherwydd tangynrychioli nifer fawr o rywogaethau morol mewn cronfeydd data genomig o gymharu â rhywogaethau daearol [49].
Yn y papur presennol, rydym yn cymhwyso'r cysyniad LB i gregyn gleision, gan ddadlau y gall dilyniannu ergyd ccfDNA hemolymff roi cipolwg ar gyfansoddiad ecosystemau arfordirol morol.Yn benodol, canfuom fod 1) hemolymff cregyn gleision yn cynnwys crynodiadau cymharol uchel (lefelau microgram) o ddarnau DNA cymharol fawr (~1-5 kb) sy'n cylchredeg;2) mae'r darnau DNA hyn yn annibynnol ac yn anannibynnol 3) Ymhlith ffynonellau tramor y darnau DNA hyn, canfuom DNA bacteriol, archaeal a firaol, yn ogystal â DNA anifeiliaid amlgellog eraill;4) Mae'r darnau ccfDNA tramor hyn yn cronni yn yr hemolymff yn digwydd yn gyflym ac yn cyfrannu at weithgaredd hidlo mewnol cregyn gleision.I gloi, mae ein hastudiaeth yn dangos bod y cysyniad o LB, sydd hyd yma wedi'i gymhwyso'n bennaf ym maes biofeddygaeth, yn amgodio ffynhonnell wybodaeth gyfoethog ond heb ei harchwilio y gellir ei defnyddio i ddeall yn well y rhyngweithio rhwng rhywogaethau gwarchodol a'u hamgylchedd.
Yn ogystal ag primatiaid, adroddwyd ynysu ccfDNA mewn mamaliaid, gan gynnwys llygod, cŵn, cathod a cheffylau [50, 51, 52].Fodd bynnag, hyd y gwyddom, ein hastudiaeth yw'r gyntaf i adrodd ar ganfod a dilyniannu ccfDNA mewn rhywogaethau morol sydd â system gylchrediad agored.Gall y nodwedd anatomegol hon a gallu hidlo cregyn gleision, yn rhannol o leiaf, esbonio nodweddion maint gwahanol ddarnau o DNA sy'n cylchredeg o gymharu â rhywogaethau eraill.Mewn bodau dynol, mae'r rhan fwyaf o ddarnau DNA sy'n cylchredeg yn y gwaed yn ddarnau bach sy'n amrywio o ran maint o 150 i 200 bp.gydag uchafbwynt uchaf o 167 bp [34, 53].Mae cyfran fach ond arwyddocaol o ddarnau DNA rhwng 300 a 500 bp mewn maint, ac mae tua 5% yn hirach na 900 bp.Y rheswm dros y dosbarthiad maint hwn yw bod prif ffynhonnell ccfDNA mewn plasma yn digwydd o ganlyniad i farwolaeth celloedd, naill ai oherwydd marwolaeth celloedd neu oherwydd necrosis o gylchredeg celloedd hematopoietig mewn unigolion iach neu oherwydd apoptosis o gelloedd tiwmor mewn cleifion canser (a elwir yn gylchredeg DNA tiwmor).Roedd dosbarthiad maint hemolymff ccfDNA a welsom mewn cregyn gleision yn amrywio o 1000 i 5000 bp, sy'n awgrymu bod gan ccfDNA cregyn gleision darddiad gwahanol.Mae hon yn ddamcaniaeth resymegol, gan fod gan gregyn gleision system fasgwlaidd lled-agored ac yn byw mewn amgylcheddau dyfrol morol sy'n cynnwys crynodiadau uchel o DNA genomig microbaidd.Mewn gwirionedd, mae ein harbrofion labordy gan ddefnyddio DNA alldarddol wedi dangos bod cregyn gleision yn cronni darnau DNA mewn dŵr môr, o leiaf ar ôl ychydig oriau maent yn cael eu diraddio ar ôl derbyniad cellog a / neu ryddhau a / neu storio mewn sefydliadau amrywiol.O ystyried pa mor brin yw celloedd (procaryotig ac ewcaryotig), bydd y defnydd o adrannau mewnfalfwlaidd yn lleihau faint o ccfDNA o hunan-ffynonellau yn ogystal ag o ffynonellau tramor.O ystyried pwysigrwydd imiwnedd cynhenid ​​dwygragennog a'r nifer fawr o ffagosytau sy'n cylchredeg, fe wnaethom ragdybio ymhellach bod hyd yn oed ccfDNA tramor yn cael ei gyfoethogi wrth gylchredeg ffagosytau sy'n cronni DNA tramor wrth amlyncu micro-organebau a / neu falurion cellog.Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n dangos bod ccfDNA hemolymff dwygragennog yn ystorfa unigryw o wybodaeth foleciwlaidd ac yn atgyfnerthu eu statws fel rhywogaeth sentinel.
Mae ein data'n dangos y gall dilyniannu a dadansoddi darnau ccfDNA hemolymff sy'n deillio o facteria ddarparu gwybodaeth allweddol am y fflora bacteriol lletyol a'r bacteria sy'n bresennol yn yr ecosystem forol o amgylch.Mae technegau dilyniannu saethiadau wedi datgelu dilyniannau o'r bacteria cymesurol A. atra tagell a fyddai wedi'u methu pe bai dulliau adnabod rRNA 16S confensiynol wedi'u defnyddio, yn rhannol oherwydd gogwydd llyfrgell gyfeirio.Mewn gwirionedd, dangosodd ein defnydd o ddata LB a gasglwyd o M. platensis yn yr un haen o gregyn gleision yn Kerguelen fod cyfansoddiad symbiontau bacteriol sy'n gysylltiedig â tagell yr un peth ar gyfer y ddau rywogaeth cregyn gleision ( Ffig. S4 , Gwybodaeth Atodol ).Gall y tebygrwydd hwn o ddwy fisglen sy'n wahanol yn enetig adlewyrchu cyfansoddiad cymunedau bacteriol yn y dyddodion oer, sylffwraidd a folcanig yn Kerguelen [55, 56, 57, 58].Mae lefelau uwch o ficro-organebau sy'n lleihau sylffwr wedi'u disgrifio'n dda wrth gynaeafu cregyn gleision o ardaloedd arfordirol bioturbated [59], megis arfordir Port-au-France.Mae angen mwy o ymchwil i ganfod y gydberthynas rhwng yr amgylchedd morol, wyneb gwely'r môr, a chyfansoddiad bacteria symbiotig mewn cregyn gleision.Mae'r astudiaethau hyn yn mynd rhagddynt ar hyn o bryd.
Mae hyd a chrynodiad hemolymff ccfDNA, ei rwyddineb puro, ac ansawdd uchel i ganiatáu dilyniannu dryll yn gyflym yn rhai o fanteision niferus defnyddio ccfDNA cregyn gleision i asesu bioamrywiaeth mewn ecosystemau arfordirol morol.Dengys ein canlyniadau y gellir defnyddio biopsïau hylifol o rywogaethau dangosol megis cregyn gleision i nodi niferoedd cymharol fawr o ddarnau firws ccfDNA y gwyddys eu bod yn heintio gwesteiwyr sydd fel arfer yn byw mewn ecosystemau morol arfordirol.Canfuwyd dosbarthiad tebyg pan archwiliwyd y firome hemolymff ccfDNA o gregyn gleision (M. platensis) a gasglwyd yn yr un haen cregyn gleision yn Kerguelen (Tabl S2, Gwybodaeth Atodol).Mae dilyniannu dryll ccfDNA yn wir yn ddull newydd sy'n ennill momentwm wrth astudio virome bodau dynol neu rywogaethau eraill [21, 37, 64].Mae'r dull hwn yn arbennig o ddefnyddiol ar gyfer astudio firysau DNA llinyn dwbl, gan nad oes un genyn yn cael ei gadw ymhlith yr holl firysau DNA llinyn dwbl, sy'n cynrychioli'r dosbarth mwyaf amrywiol ac eang o firysau yn Baltimore [65].Er bod y rhan fwyaf o'r firysau hyn yn parhau i fod heb eu dosbarthu a gallant gynnwys firysau o ran gwbl anhysbys o'r byd firaol [66], canfuom fod y firysau a'r ystodau gwesteiwr o'r cregyn gleision A. atra ac M. platensis yn disgyn rhwng y ddwy rywogaeth.yn yr un modd (gweler ffigur S3, gwybodaeth ychwanegol).Nid yw'r tebygrwydd hwn yn syndod, oherwydd gallai adlewyrchu diffyg detholusrwydd yn y nifer sy'n derbyn DNA sy'n bresennol yn yr amgylchedd.Ar hyn o bryd mae angen astudiaethau yn y dyfodol gan ddefnyddio RNA wedi'i buro i nodweddu'r virome RNA.
Yn ein hastudiaeth, defnyddiwyd piblinell drylwyr iawn wedi'i haddasu o waith Kowarski a chydweithwyr [37], a ddefnyddiodd ddileu dau gam o ddarlleniadau cyfun a contigau cyn ac ar ôl cydosod ccfDNA brodorol, gan arwain at gyfran uchel o ddarlleniadau heb eu mapio.Felly, ni allwn ddiystyru y gallai fod gan rai o’r darlleniadau hyn sydd heb eu mapio eu tarddiad eu hunain o hyd, yn bennaf oherwydd nad oes gennym genom cyfeirio ar gyfer y rhywogaeth hon o gregyn gleision.Fe wnaethom ddefnyddio'r biblinell hon hefyd oherwydd ein bod yn pryderu am y chimeras rhwng hunan-ddarllen a rhai nad ydynt yn hunan-ddarllen a'r hydoedd darllen a gynhyrchir gan yr Illumina MiSeq PE75.Rheswm arall dros y rhan fwyaf o ddarlleniadau heb eu cofnodi yw nad yw llawer o'r microbau morol, yn enwedig mewn ardaloedd anghysbell fel Kerguelen, wedi'u hanodi.Ar gyfer astudiaethau yn y dyfodol, o ystyried ein canlyniadau yn dangos bod hemolymff ccfDNA yn darllen yn hirach na bodau dynol a/neu famaliaid, rydym yn argymell defnyddio llwyfan dilyniannu sy'n fwy addas ar gyfer darnau ccfDNA hirach.Byddai cael y dilyniant A. atra genom niwclear cyflawn nad yw ar gael ar hyn o bryd hefyd yn hwyluso gwahaniaethu ccfDNA o ffynonellau hunan a ffynonellau eraill yn fawr.O ystyried bod ein hymchwil wedi canolbwyntio ar y posibilrwydd o gymhwyso’r cysyniad o fiopsi hylifol i gregyn gleision, rydym yn gobeithio, wrth i’r cysyniad hwn gael ei ddefnyddio mewn ymchwil yn y dyfodol, y bydd offer a phiblinellau newydd yn cael eu datblygu i gynyddu potensial y dull hwn i astudio amrywiaeth microbaidd cregyn gleision.ecosystem forol.
Fel biomarcwr clinigol anfewnwthiol, mae lefelau plasma dynol uchel o ccfDNA yn gysylltiedig ag amrywiol glefydau, difrod meinwe, a chyflyrau straen [67,68,69].Gall y darganfyddiad hwn esbonio, yn rhannol o leiaf, y ffaith bod gan gregyn gleision system gylchrediad lled-agored ac yn cronni symiau mawr o DNA tramor oherwydd eu gweithgaredd hidlo uchel.Ar y llaw arall, gall cregyn gleision, fel llawer o infertebratau, fod yn fwy ymwrthol i niwed i feinwe a achosir gan straen, a thrwy hynny gyfyngu ar ryddhau ccfDNA yn eu hemolymff [70, 71].
Hyd yma, mae dadansoddiad DNA o fioamrywiaeth mewn ecosystemau dyfrol wedi canolbwyntio'n bennaf ar fetabarcodio DNA amgylcheddol (eDNA).Fodd bynnag, mae'r dull hwn fel arfer yn gyfyngedig o ran dadansoddi bioamrywiaeth pan ddefnyddir paent preimio.Mae'r defnydd o ddilyniannu dryll yn osgoi cyfyngiadau PCR a'r dewis rhagfarnllyd o setiau paent preimio.Felly, mewn un ystyr, mae ein dull yn agosach at y dull dilyniannu dryll eDNA trwybwn uchel a ddefnyddiwyd yn ddiweddar, sy'n gallu dilyniannu DNA tameidiog yn uniongyrchol a dadansoddi bron pob organeb [72, 73].Fodd bynnag, mae nifer o faterion sylfaenol sy'n gwahaniaethu LB oddi wrth ddulliau eDNA safonol.Wrth gwrs, y prif wahaniaeth rhwng eDNA a LB yw'r defnydd o westeion hidlo naturiol.Adroddwyd am y defnydd o rywogaethau morol fel sbyngau a dwygragennog (Dresseina spp.) fel hidlydd naturiol ar gyfer astudio eDNA [74, 75].Fodd bynnag, defnyddiodd astudiaeth Dreissena fiopsïau meinwe y tynnwyd DNA ohonynt.Nid yw dadansoddiad o ccfDNA gan LB yn gofyn am fiopsi meinwe, offer arbenigol ac weithiau drud a logisteg sy'n gysylltiedig ag eDNA neu fiopsi meinwe.Mewn gwirionedd, fe wnaethom adrodd yn ddiweddar y gellir storio a dadansoddi ccfDNA o LB gyda chefnogaeth FTA heb gynnal cadwyn oer, sy'n her fawr i ymchwil mewn ardaloedd anghysbell [76].Mae echdynnu ccfDNA o fiopsïau hylif hefyd yn syml ac yn darparu DNA o ansawdd uchel ar gyfer dilyniannu drylliau a dadansoddi PCR.Mae hyn yn fantais fawr o ystyried rhai o'r cyfyngiadau technegol sy'n gysylltiedig â dadansoddiad eDNA [77].Mae symlrwydd a chost isel y dull samplu hefyd yn arbennig o addas ar gyfer rhaglenni monitro hirdymor.Yn ogystal â'u gallu hidlo uchel, nodwedd adnabyddus arall o ddwygragennog yw cyfansoddiad cemegol mwcopolysaccharid eu mwcws, sy'n hyrwyddo amsugno firysau [78, 79].Mae hyn yn gwneud cregyn deuglawr yn ffilter naturiol delfrydol ar gyfer nodweddu bioamrywiaeth ac effaith newid hinsawdd mewn ecosystem ddyfrol benodol.Er y gellir gweld presenoldeb darnau DNA sy'n deillio o westeiwr fel cyfyngiad ar y dull o'i gymharu ag eDNA, mae'r gost sy'n gysylltiedig â chael ccfDNA mor frodorol o'i gymharu ag eDNA yn ddealladwy ar yr un pryd ar gyfer y swm helaeth o wybodaeth sydd ar gael ar gyfer astudiaethau iechyd.Mae hyn yn cynnwys presenoldeb dilyniannau firaol wedi'u hintegreiddio i genom y gwesteiwr gwesteiwr.Mae hyn yn arbennig o bwysig i gregyn gleision, o ystyried presenoldeb retrofirysau lewcemig a drosglwyddir yn llorweddol mewn cregyn deuglawr [80, 81].Mantais arall LB dros eDNA yw ei fod yn manteisio ar y gweithgaredd phagocytic o gylchredeg celloedd gwaed yn yr hemolymff, sy'n amlyncu micro-organebau (a'u genomau).Yn olaf, mae'r dull yn manteisio ar gynhwysedd hidlo uchel cregyn gleision (cyfartaledd 1.5 l/h o ddŵr môr) a chylchrediad dau ddiwrnod, sy'n cynyddu'r cymysgedd o wahanol haenau o ddŵr môr, gan ganiatáu dal eDNA heterologaidd.Yn debyg i'r dadansoddiad o LB a gasglwyd gan fodau dynol, mae'r dull hwn hefyd yn agor y posibilrwydd o fesur newidiadau genetig ac epigenetig yn DNA lletyol mewn ymateb i sylweddau alldarddol.Er enghraifft, gellir rhagweld technolegau dilyniannu trydedd genhedlaeth i berfformio dadansoddiad methylation genom-eang mewn ccfDNA brodorol gan ddefnyddio dilyniannu nanopore.Dylai'r broses hon gael ei hwyluso gan y ffaith bod hyd y darnau ccfDNA cregyn gleision yn ddelfrydol yn gydnaws â llwyfannau dilyniannu hir-ddarllen sy'n caniatáu dadansoddiad methylation DNA genom-eang o rediad dilyniannu sengl heb fod angen trawsnewidiadau cemegol.85,86] Mae hwn yn bosibilrwydd diddorol, gan y dangoswyd bod patrymau methylation DNA yn adlewyrchu ymateb i straen amgylcheddol ac yn parhau dros lawer o genedlaethau.Felly, gall roi mewnwelediad gwerthfawr i'r mecanweithiau sylfaenol sy'n rheoli ymateb ar ôl dod i gysylltiad â newid yn yr hinsawdd neu lygryddion [87].Fel y soniwyd uchod, mae defnyddio LB i asesu bioamrywiaeth ecosystem benodol hefyd yn gofyn am biblinell biowybodeg drylwyr sy'n ystyried presenoldeb darnau DNA o'r ffynhonnell.Y gobaith yw y bydd mentrau fel y Prosiect Genomau Mamaliaid Morol a'r prosiect Fish10k a sefydlwyd yn ddiweddar [88] yn hwyluso dadansoddiad o'r fath yn y dyfodol.Mae cymhwyso'r cysyniad LB i organebau bwydo hidlo morol hefyd yn gydnaws â'r datblygiadau diweddaraf mewn technoleg dilyniannu, gan ei gwneud yn addas iawn ar gyfer datblygu biomarcwyr aml-ohm i ddarparu gwybodaeth bwysig am iechyd cynefinoedd morol mewn ymateb i straen amgylcheddol.
Mae data dilyniannu genomau wedi'u hadneuo yn Archif Darllen Sequence NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 dan Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Effaith newid hinsawdd ar fywyd morol ac ecosystemau.Bioleg Cole.2009;19: P602–P614.
Ystyried effeithiau cyfunol newid hinsawdd a ffactorau lleol eraill sy’n achosi straen ar yr amgylchedd morol.amgylchedd gwyddonol cyffredinol.2021; 755: 142564.
Mae Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Gwyddoniaeth y cyntaf o Fawrth.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Goddefgarwch gwres llai o dan amodau straen gwres ailadroddus yn esbonio marwolaethau uchel cregyn gleision yn yr haf.Adroddiad gwyddonol 2019;9:17498.
2015; 112: 1083-8.
Mae'n bosibl bod pathogenau lluosog nad ydynt yn benodol i rywogaethau wedi achosi marwolaethau torfol Pinna nobilis.Bywyd.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Int J Iechyd cylchynol.2005;64:468-77.
Maw Environ Res 2017;130:338-65.
Nat Parch Glân Oncol.2017;14:531–48.
Aeddfedu biopsi hylif: Yn caniatáu i DNA tiwmor gylchredeg.Nat Parch Cancr.2017; 17:223-38.
Cofnodion cyfarfodydd is-gwmnïau Soc Biol.1948;142:241-3.
Meintioli dadansoddiad biomolar.2019; 17: 100087.
2021;18:297-312.
Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Astudiaeth o gwrs beichiogrwydd a'i gymhlethdodau gan ddefnyddio RNA allgellog cylchredeg yng ngwaed menywod yn ystod beichiogrwydd.Dopediatreg.2020; 8: 605219.
Nat Parch Nephrol.2021;17:591-603.
Anna MD.2016; 67:419-32.
Meddyginiaeth Nat.2021; 27: 115-24.