Diolch am ymweld â Nature.com. Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Yn dangos carwsél o dair sleid ar unwaith. Defnyddiwch y botymau Blaenorol a Nesaf i symud trwy dair sleid ar y tro, neu defnyddiwch y botymau llithrydd ar y diwedd i symud trwy dair sleid ar y tro.
Paratowyd gronynnau silica mandyllog gan ddefnyddio'r dull sol-gel gyda rhai addasiadau i gael gronynnau mandyllau llydan. Cafodd y gronynnau hyn eu deillio gydag N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanad (PMI) a styren trwy bolymeriad trosglwyddo cadwyn gwrthdro (RAFT) i gynhyrchu polyamidau rhyngosodedig N-phenylmaleimide. Cyfnod llonydd styren (PMP). Pacio colofnau dur di-staen twll cul (diamedr mewnol 100 × 1.8 mm) gyda phacio slyri. Gwerthuswyd perfformiad cromatograffig y golofn PMP i wahanu cymysgedd o peptidau synthetig yn cynnwys pum peptid (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, asid amino Leu enkephalin) a hydrolysad tryptig o albwmin serwm dynol (HAS). O dan amodau elution gorau posibl, cyrhaeddodd y nifer damcaniaethol o blatiau gyda chymysgedd o peptidau 280,000 o blatiau/m.sg. Wrth gymharu perfformiad gwahanu'r golofn a ddatblygwyd â'r golofn fasnachol Ascentis Express RP-Amide, gwelwyd bod effeithlonrwydd gwahanu'r golofn PMP yn well na'r golofn fasnachol o ran effeithlonrwydd gwahanu a datrysiad.
Mae'r diwydiant biofferyllol wedi dod yn farchnad fyd-eang sy'n ehangu gyda chynnydd sylweddol yn ei chyfran o'r farchnad yn ystod y blynyddoedd diwethaf. Gyda thwf ffrwydrol y diwydiant biofferyllol1,2,3 mae angen mawr am ddadansoddi peptidau a phroteinau. Yn ogystal â'r peptid targed, mae amrywiol amhureddau'n cael eu ffurfio yn ystod synthesis peptid, felly mae angen puro cromatograffig i gael y purdeb a ddymunir ar gyfer y peptid. Mae dadansoddi a nodweddu proteinau mewn hylifau'r corff, meinweoedd a chelloedd yn dasg hynod heriol oherwydd y nifer fawr o rywogaethau y gellir eu canfod o bosibl mewn un sampl. Er bod sbectrometreg màs yn offeryn effeithiol ar gyfer dilyniannu peptidau a phroteinau, os cyflwynir samplau o'r fath yn uniongyrchol i'r sbectromedr màs, bydd y gwahanu'n anfoddhaol. Gellir datrys y broblem hon trwy berfformio cromatograffaeth hylif (LC) cyn dadansoddiad MS, a fydd yn lleihau faint o ddadansoddwyr sy'n mynd i mewn i'r sbectromedr màs ar amser penodol4,5,6. Yn ogystal, gall dadansoddwyr ganolbwyntio mewn rhanbarth cul yn ystod gwahanu cyfnod hylif, a thrwy hynny ganolbwyntio'r dadansoddwyr hyn a chynyddu sensitifrwydd canfod MS. Mae cromatograffaeth hylif (LC) wedi datblygu'n sylweddol dros y degawd diwethaf ac mae wedi dod yn ddull a ddefnyddir yn helaeth ar gyfer dadansoddi proteomig7,8,9,10.
Defnyddir cromatograffaeth hylif cyfnod gwrthdro (RP-LC) yn helaeth i buro a gwahanu cymysgeddau o peptidau gan ddefnyddio silica wedi'i addasu ag octadecyl (ODS) fel y cyfnod llonydd11,12,13. Fodd bynnag, oherwydd eu strwythur cymhleth a'u natur amffoterig,14,15 ni all cyfnodau llonydd RP ddarparu gwahaniad boddhaol o peptidau a phroteinau. Felly, mae dadansoddi peptidau a phroteinau gyda darnau pegynol ac anbegynol yn gofyn am gyfnodau llonydd wedi'u cynllunio'n arbennig i ryngweithio a chadw'r dadansoddion hyn16. Gall cromatograffaeth gymysg, sy'n cynnig rhyngweithiadau amlfodd, fod yn ddewis arall yn lle RP-LC ar gyfer gwahanu peptidau, proteinau, a chymysgeddau cymhleth eraill. Paratowyd sawl cyfnod llonydd cymysg a defnyddiwyd colofnau wedi'u llenwi â'r cyfnodau llonydd hyn i wahanu peptidau a phroteinau17,18,19,20,21. Oherwydd presenoldeb grwpiau pegynol ac anbegynol, mae cyfnodau llonydd modd cymysg (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, rhyngosodiad pegynol/RPLC) yn addas ar gyfer gwahanu peptidau a phroteinau22,23,24,25,26,27,28. , mae cyfnodau llonydd rhyngosodedig pegynol gyda grwpiau pegynol wedi'u bondio'n gofalent yn dangos galluoedd gwahanu da a detholusrwydd unigryw ar gyfer dadansoddion pegynol ac anbegynol oherwydd bod y gwahanu'n dibynnu ar y rhyngweithio rhwng yr dadansoddion a'r cyfnod llonydd Rhyngweithiadau amlfodd 29,30,31,32. Yn ddiweddar, cafodd Zhang et al. 30 gyfnodau llonydd polyaminau â therfyn behenyl a gwahanu hydrocarbonau, gwrthiselderion, flavonoidau, niwcleosidau, estrogenau, a rhai dadansoddion eraill yn llwyddiannus. Mae gan y deunydd llonydd wedi'i fewnosod mewn pegynau grwpiau pegynol ac anbegynol, felly gellir ei ddefnyddio i wahanu peptidau a phroteinau yn rhannau hydroffobig a hydroffilig. Mae colofnau mewnlinol pegynol (e.e., colofnau C18 gydag amid mewnlinol) ar gael o dan yr enw masnach colofnau Ascentis Express RP-Amide, ond dim ond ar gyfer dadansoddi amin 33 y defnyddiwyd y colofnau hyn.
Yn yr astudiaeth gyfredol, paratowyd a gwerthuswyd cyfnod llonydd mewnosodedig pegynol (N-phenylmaleimide, polystyren mewnosodedig) ar gyfer gwahanu peptidau a hollti HSA tryptig. Defnyddiwyd y strategaeth ganlynol i baratoi'r cyfnod llonydd. Paratowyd gronynnau silica mandyllog yn ôl y gweithdrefnau a ddisgrifiwyd yn ein cyhoeddiadau blaenorol, gyda rhai newidiadau yn y cynlluniau paratoi 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Addaswyd y cymhareb o wrea, polyethylen glycol (PEG), TMOS ac asid asetig dyfrllyd i gael gronynnau silica â meintiau mandwll mawr. Yn ail, syntheseiddiwyd ligand phenylmaleimide-methylvinyl isocyanad newydd a defnyddiwyd ei ronynnau silica deilliadol i baratoi cyfnodau llonydd mewnosodedig pegynol. Pacio'r cyfnod llonydd a gafwyd i mewn i golofn ddur di-staen (diamedr mewnol 100 × 1.8 mm) yn ôl cynllun pacio wedi'i optimeiddio. Cynorthwyir pacio'r golofn gan ddirgryniad mecanyddol i sicrhau haen unffurf o fewn y golofn. Gwerthuswyd y golofn wedi'i phacio ar gyfer gwahanu cymysgedd o peptidau yn cynnwys pum peptid (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptid leucine-enkephalin). a hydrolysadau tryptig o albwmin serwm dynol (HSA). Gwelwyd bod y cymysgedd peptid a'r treuliad tryptig HSA yn gwahanu gyda datrysiad ac effeithlonrwydd da. Cymharwyd effeithlonrwydd gwahanu'r golofn PMP ag effeithlonrwydd gwahanu'r golofn Ascentis Express RP-Amide. Gwelwyd bod gan peptidau a phroteinau ddatrysiad da ac effeithlonrwydd gwahanu uchel ar y golofn PMP, ac mae effeithlonrwydd gwahanu'r golofn PMP yn uwch nag effeithlonrwydd gwahanu'r golofn Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyethylene glycol), wrea, asid asetig, trimethoxyorthosilicate (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsin, albwmin serwm dynol (HSA), clorid amoniwm, wrea, hecsamethylmethacryloyldisilazane (HMDS), clorid methacryloyl (MC), styren, 4-hydroxy-TEMPO, perocsid bensoyl (BPO), asetonitril (ACN) ar gyfer HPLC, methanol, 2-propanol ac aseton. Cwmni Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, UDA).
Cafodd cymysgedd o wrea (8 g), polyethylen glycol (8 g) ac 8 ml o asid asetig 0.01 N ei droi am 10 munud, ac ychwanegwyd 24 ml o TMOS ato o dan oeri iâ. Cafodd y cymysgedd adwaith ei gynhesu ar 40°C am 6 awr ac yna ar 120°C am 8 awr mewn awtoclaf dur di-staen. Cafodd y dŵr ei dywallt a sychwyd y gweddillion ar 70°C am 12 awr. Cafodd y blociau meddal sych eu malu'n llyfn a'u calchynnu mewn popty ar 550°C am 12 awr. Paratowyd a nodweddwyd tair swp i brofi atgynhyrchadwyedd meintiau gronynnau, maint mandwll ac arwynebedd.
Grŵp pegynol a chyfnod llonydd ar gyfer cadwyni polystyren. Disgrifir y weithdrefn baratoi isod.
Diddymwyd N-ffenylmaleimid (200 mg) a methyl finyl isocyanad (100 mg) mewn tolwen anhydrus, ac yna ychwanegwyd 0.1 ml o 2,2′-asoisobutyronitril (AIBN) at y fflasg adwaith i gael copolymer o ffenylmaleimid a methyl finyl isocyanad (PMCP). Gwresogwyd y cymysgedd ar 60°C am 3 awr, ei hidlo a'i sychu mewn popty ar 40°C am 3 awr.
Gwasgarwyd gronynnau silica sych (2 g) mewn tolwen sych (100 ml), eu troi a'u soniceiddio am 10 munud mewn fflasg gwaelod crwn 500 ml. Diddymwyd PMCP (10 mg) mewn tolwen a'i ychwanegu fesul diferyn at y fflasg adwaith trwy dwndis ychwanegu. Cafodd y cymysgedd ei adlifo ar 100°C am 8 awr, ei hidlo, ei olchi ag aseton a'i sychu ar 60°C am 3 awr. Yna, diddymwyd y gronynnau silica sy'n gysylltiedig â PMCP (100 g) mewn tolwen (200 ml), ac ychwanegwyd 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) ato ym mhresenoldeb 100 μl o ddilaurad dibutyltin fel catalydd. Cafodd y cymysgedd ei droi ar 50°C am 8 awr, ei hidlo a'i sychu ar 50°C am 3 awr.
Gwasgarwyd styren (1 ml), perocsid bensoyl BPO (0.5 ml) a gronynnau silica ynghlwm wrth TEMPO-PMCP (1.5 g) mewn tolwen a'u puro â nitrogen. Cynhaliwyd polymeriad styren ar 100°C am 12 awr. Golchwyd y cynnyrch canlyniadol â methanol a'i sychu dros nos ar 60°C. Dangosir cynllun cyffredinol yr adwaith yn ffig. un.
Cafodd y samplau eu dadnwyo ar 393 K am 1 awr nes cael pwysau gweddilliol o lai na 10–3 Torr. Defnyddiwyd faint o N2 a amsugnwyd ar bwysedd cymharol P/P0 = 0.99 i bennu cyfanswm cyfaint y mandwll. Archwiliwyd morffoleg gronynnau silica pur a gronynnau silica wedi'u rhwymo i ligand gan ddefnyddio microsgop electron sganio (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Gosodwyd samplau sych (silica pur a gronynnau silica wedi'u rhwymo i ligand) ar wiail alwminiwm gan ddefnyddio tâp carbon. Dyddodwyd aur ar y sampl gan ddefnyddio dyfais chwistrellu Q150T, a dyddodwyd haen Au 5 nm o drwch ar y sampl. Mae hyn yn gwella effeithlonrwydd y broses foltedd isel ac yn darparu chwistrellu oer mân. Perfformiwyd dadansoddiad elfennol gan ddefnyddio dadansoddwr cyfansoddiad elfennol Thermo Electron (Waltham, MA, UDA) Flash EA1112. Defnyddiwyd dadansoddwr maint gronynnau Malvern (Swydd Gaerwrangon, DU) Mastersizer 2000 i gael y dosbarthiad maint gronynnau. Gwasgarwyd gronynnau silica heb eu gorchuddio a gronynnau silica wedi'u rhwymo i ligand (5 mg yr un) mewn 5 ml o isopropanol, eu soniceiddio am 10 munud, eu cynhyrfu am 5 munud, a'u gosod ar fainc optegol Mastersizer. Cynhelir dadansoddiad thermogravimetrig ar gyfradd o 5 °C y funud yn yr ystod tymheredd o 30 i 800 °C.
Paciowyd colofnau dur di-staen twll cul wedi'u leinio â ffibr gwydr gyda dimensiynau (ID 100 × 1.8 mm) trwy'r dull llenwi slyri gan ddilyn yr un weithdrefn ag yng nghyfeirnod 31. Cysylltwyd colofn ddur di-staen (wedi'i leinio â gwydr, ID 100 × 1.8 mm) ac allfa yn cynnwys ffrit 1 µm â pheiriant pecynnu slyri (Alltech Deerfield, IL, UDA). Paratowch ataliad o'r cyfnod llonydd trwy atal 150 mg o'r cyfnod llonydd mewn 1.2 ml o fethanol a'i fwydo i golofn gronfa ddŵr. Defnyddiwyd methanol fel y toddydd slyri a'r toddydd rheoli. Pacio'r golofn trwy gymhwyso dilyniant pwysau o 100 MP am 10 munud, 80 MP am 15 munud, a 60 MP am 30 munud. Defnyddiodd y broses bacio ddau ddirgrynwr colofn cromatograffaeth nwy (Alltech, Deerfield, IL, UDA) ar gyfer dirgryniad mecanyddol i sicrhau pacio colofn unffurf. Caewch y pecynnydd slyri a rhyddhewch y pwysau'n araf i atal difrod i'r llinyn. Datgysylltwyd y golofn o ffroenell y slyri ac atodwyd ffitiad arall i'r fewnfa a'i gysylltu â'r system LC i brofi ei weithrediad.
Adeiladwyd MLC wedi'i deilwra gan ddefnyddio pwmp LC (10AD Shimadzu, Japan), samplwr gyda dolen chwistrellu 50 nL (Valco (UDA) C14 W.05), dadnwywr pilen (Shimadzu DGU-14A), a ffenestr gapilar UV-VIS. Dyfais synhwyrydd (UV-2075) a microgolofn wedi'i enameleiddio. Defnyddiwch diwbiau cysylltu cul a byr iawn i leihau effaith ehangu ychwanegol y golofn. Ar ôl llenwi'r golofn, gosodwch gapilar (50 µm id 365) wrth allfa'r gyffordd lleihau 1/16″ a gosodwch gapilar (50 µm) y gyffordd lleihau. Perfformir casglu data a phrosesu cromatogram gan ddefnyddio'r feddalwedd Multichro 2000. Ar 254 nm, monitrwyd amsugnedd UV y dadansoddion pwnc ar 0. Dadansoddwyd data cromatograffig gan ddefnyddio OriginPro8 (Northampton, MA).
Albwmin serwm dynol, powdr wedi'i lyoffilio, ≥ 96% (electrofforesis gel agarose) 3 mg wedi'i gymysgu â trypsin (1.5 mg), 4.0 M wrea (1 ml) a 0.2 M bicarbonad amoniwm (1 ml). Cafodd y toddiant ei droi am 10 munud a'i gadw mewn baddon dŵr ar 37°C am 6 awr, yna ei ddiffodd ag 1 ml o 0.1% TFA. Hidlo'r toddiant a'i storio islaw 4°C.
Gwerthuswyd gwahanu cymysgedd o peptidau a HSA treuliad tryptig ar golofn PMP ar wahân. Gwiriwch hydrolysis tryptig cymysgedd o peptidau a HSA wedi'u gwahanu gan golofn PMP a chymharwch y canlyniadau â cholofn Ascentis Express RP-Amide. Cyfrifir nifer y platiau damcaniaethol gan ddefnyddio'r hafaliad canlynol:
Dangosir delweddau SEM o ronynnau silica pur a gronynnau silica sy'n rhwymo i ligand yn Ffigur 2. Mae delweddau SEM o ronynnau silica pur (A, B) yn dangos siâp sfferig lle mae'r gronynnau wedi'u hirgul neu â chymesuredd afreolaidd o'i gymharu â'n hastudiaethau blaenorol. Mae wyneb y gronynnau silica sy'n rhwymo i'r ligand (C, D) yn llyfnach nag wyneb gronynnau silica pur, a allai fod oherwydd y cadwyni polystyren sy'n gorchuddio wyneb y gronynnau silica.
Micrograffau electron sganio o ronynnau silica pur (A, B) a gronynnau silica wedi'u rhwymo gan ligand (C, D).
Dangosir dosbarthiad maint gronynnau gronynnau silica pur a gronynnau silica wedi'u rhwymo i ligand yn Ffig. 2.3(A). Dangosodd cromliniau dosbarthiad maint gronynnau cyfeintiol fod maint y gronynnau silica wedi cynyddu ar ôl addasu cemegol (Ffig. 3A). Cymharir data dosbarthiad maint gronynnau silica o'r astudiaeth gyfredol a'r astudiaeth flaenorol yn Nhabl 1(A). Roedd maint gronynnau cyfeintiol d(0.5) PMP yn 3.36 µm, o'i gymharu â gwerth ad(0.5) o 3.05 µm yn ein hastudiaeth flaenorol (gronynnau silica wedi'u bondio â polystyren)34. Oherwydd y newid yng nghymhareb PEG, wrea, TMOS ac asid asetig yn y cymysgedd adwaith, roedd dosbarthiad maint gronynnau'r swp hwn yn gulach o'i gymharu â'n hastudiaeth flaenorol. Mae maint gronynnau'r cyfnod PMP ychydig yn fwy na maint y cyfnod gronynnau silica wedi'u rhwymo â polystyren a astudiwyd gennym yn gynharach. Mae hyn yn golygu bod swyddogaetholi arwyneb gronynnau silica gyda styren wedi dyddodi haen polystyren yn unig (0.97 µm) ar wyneb y silica, tra yn y cyfnod PMP roedd trwch yr haen yn 1.38 µm.
Dosbarthiad maint gronynnau (A) a dosbarthiad maint mandwll (B) gronynnau silica pur a gronynnau silica sy'n rhwymo i ligand.
Dangosir maint mandwll, cyfaint mandwll, ac arwynebedd y gronynnau silica a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn Nhabl 1 (B). Dangosir proffiliau PSD gronynnau silica pur a gronynnau silica sy'n rhwymo i ligand yn Ffig. 3(B). Roedd y canlyniadau'n gymharol â'n hastudiaeth flaenorol34. Roedd meintiau mandwll gronynnau silica pur a gronynnau silica sy'n rhwymo i ligand yn 310 Å a 241 Å, yn y drefn honno, sy'n dangos, ar ôl addasu cemegol, fod maint y mandwll wedi gostwng 69 Å, fel y dangosir yn Nhabl 1 (B), a dangosir y gromlin sifft yn Ffig. Arwynebedd penodol gronynnau silica yn yr astudiaeth gyfredol yw 116 m2/g, sy'n gymharol â'n hastudiaeth flaenorol (124 m2/g). Fel y dangosir yn Nhabl 1(B), gostyngodd arwynebedd (m2/g) gronynnau silica ar ôl addasu cemegol hefyd o 116 m2/g i 105 m2/g.
Cyflwynir canlyniadau'r dadansoddiad elfennol o'r cyfnod llonydd yn Nhabl. 2. Mae cynnwys carbon y cyfnod llonydd cyfredol yn 6.35%, sy'n is nag yn ein hastudiaeth flaenorol (gronynnau silica sy'n gysylltiedig â polystyren, 7.93%35 a 10.21%, yn y drefn honno) 42. Mae cynnwys carbon y cyfnod llonydd cyfredol isod, gan fod rhai ligandau pegynol fel phenylmaleimide methyl finyl isocyanad (PCMP) a 4-hydroxy-TEMPO wedi'u defnyddio yn ogystal â styren wrth baratoi SP. Mae canran pwysau'r nitrogen yn y cyfnod llonydd cyfredol yn 2.21% o'i gymharu â 0.1735 a 0.85% mewn astudiaethau blaenorol42. Mae hyn yn golygu bod gan y cyfnod llonydd cyfredol ganran pwysau uchel o nitrogen oherwydd y phenylmaleimide. Yn yr un modd, mae gan gynhyrchion (4) a (5) gynnwys carbon o 2.7% a 2.9%, yn y drefn honno, tra bod gan y cynnyrch terfynol (6) gynnwys carbon o 6.35%, fel y dangosir yn Nhabl 2. Defnyddiwyd dadansoddiad thermogravimetrig (TGA) ar gam llonydd PMP i brofi am golli pwysau, a dangosir y gromlin TGA yn Ffigur 4. Mae'r gromlin TGA yn dangos colli pwysau o 8.6%, sy'n cytuno'n dda â'r cynnwys carbon (6.35%), gan fod y ligandau nid yn unig yn cynnwys C, ond hefyd N, O a H.
Dewiswyd y ligand phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate i addasu wyneb y gronynnau silica oherwydd ei grwpiau polar phenylmaleimide a finylisocyanate. Gall grwpiau finyl isocyanate adweithio ymhellach â styren trwy bolymerization radical byw. Yr ail reswm yw mewnosod grŵp sydd â rhyngweithiadau cymedrol â'r dadansoddyn a dim rhyngweithiadau electrostatig cryf rhwng yr dadansoddyn a'r cyfnod llonydd, gan nad oes gan y rhan phenylmaleimide wefr rithwir ar pH arferol. Gellir rheoli polaredd y cyfnod llonydd gan y swm gorau posibl o styren ac amser adwaith y polymerization radical rhydd. Mae cam olaf yr adwaith (polymerization radical rhydd) yn hanfodol gan ei fod yn newid polaredd y cyfnod llonydd. Cynhaliwyd dadansoddiad elfennol i wirio'r cynnwys carbon yn y cyfnodau llonydd hyn. Gwelwyd bod cynyddu faint o styren a'r amser adwaith yn cynyddu cynnwys carbon y cyfnod llonydd ac i'r gwrthwyneb. Mae gan SPs a baratowyd gyda gwahanol grynodiadau o styren lwythi carbon gwahanol. Yn yr un modd, gosodwyd y cyfnodau llonydd hyn ar golofnau dur di-staen a gwiriwyd eu nodweddion cromatograffig (detholusrwydd, datrysiad, gwerth N, ac ati). Yn seiliedig ar yr arbrofion hyn, dewiswyd cyfansoddiad wedi'i optimeiddio ar gyfer paratoi'r cyfnod llonydd PMP i ddarparu polaredd rheoledig a chadw da o'r dadansoddyn.
Gwerthuswyd y golofn PMP hefyd ar gyfer dadansoddi pum cymysgedd o peptidau (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) gan ddefnyddio capasiti'r cyfnod symudol. 60/40 (v/v) ACN/dŵr (0.1% TFA) ar gyfradd llif o 80 µl/mun. O dan amodau elution gorau posibl (200,000 platiau/m2), nifer y platiau damcaniaethol (N) fesul colofn (100 × 1.8 mm) yw 20,000 ± 100. Dangosir y gwerthoedd N ar gyfer y tair colofn PMP yn Nhabl 3 a dangosir y cromatogramau yn Ffigur 5A. Dadansoddiad cyflym ar gyfradd llif uchel (700 µl/mun) ar golofn PMP, pump peptid wedi'u heluo o fewn un funud, gwerth N rhagorol o 13,500 ± 330 y golofn (diamedr 100 x 1.8 mm), sy'n cyfateb i 135,000 o blatiau/m (Ffig. 5B). Llenwyd tair colofn o'r un maint (diamedr mewnol 100 x 1.8 mm) â thri swp gwahanol o gyfnod llonydd PMP i brofi atgynhyrchedd. Cofnodwyd dadansoddion ar gyfer pob colofn trwy wahanu'r un cymysgedd prawf ar bob colofn gan ddefnyddio amodau eluo gorau posibl, nifer y platiau damcaniaethol N, ac amser cadw. Dangosir y data atgynhyrchedd ar gyfer y colofnau PMP yn Nhabl 4. Roedd atgynhyrchedd y golofn PMP yn cydberthyn yn dda â gwerthoedd %RSD isel iawn fel y dangosir yn Nhabl 3.
Gwahanu cymysgeddau peptid ar golofn PMP (B) a cholofn Ascentis Express RP-Amide (A), cyfnod symudol 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensiynau colofn PMP (100 x 1.8 mm id), trefn elusiwn dadansoddiad y cyfansoddion: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (asid lewsig enkeffalin).
Gwerthuswyd colofn PMP (diamedr mewnol 100 x 1.8 mm) ar gyfer gwahanu hydrolysad tryptig albwmin serwm dynol gan HPLC. Mae'r cromatogram yn Ffigur 6 yn dangos bod y samplau wedi'u gwahanu'n dda gyda datrysiad da iawn. Dadansoddwyd hydoddiannau HSA gan ddefnyddio cyfradd llif o 100 μl/mun, cyfnod symudol o 70/30 asetonitril/dŵr a 0.1% TFA. Rhannwyd hollti HSA yn 17 copa, fel y dangosir yn y cromatogram (Ffig. 6), sy'n cyfateb i 17 peptid. Cyfrifwyd effeithlonrwydd gwahanu copaon unigol o'r hydrolysad HSA a dangosir y gwerthoedd yn Nhabl 5.
Gwahanwyd hydrolysadau tryptig HSA ar golofn PMP (diamedr mewnol 100 x 1.8 mm), cyfradd llif (100 μl/mun), cyfnod symudol 60/40 asetonitril/dŵr, a 0.1% TFA.
lle mae L yn hyd y golofn, η yw gludedd y cyfnod symudol, ΔP yw pwysau cefn y golofn, ac u yw cyflymder llinol y cyfnod symudol. Roedd athreiddedd y golofn PMP yn 2.5 × 10–14 m2, roedd y gyfradd llif yn 25 µl/mun, defnyddiwyd 60/40 v/v. ACN/dŵr. Roedd athreiddedd y golofn PMP (ID 100 × 1.8 mm) yn debyg i athreiddedd ein hastudiaeth Ref.34 flaenorol. Mae athreiddedd colofn wedi'i llenwi â gronynnau mandyllog arwynebol yn 1.7 × 10 .6 µm, 2.5 × 10-14 m2 ar gyfer gronynnau 5 µm43. Felly, mae athreiddedd y cyfnod PMP yn debyg i athreiddedd gronynnau craidd-plisgyn gyda maint o 5 μm.
lle mae Wx yn fàs y golofn sydd wedi'i llenwi â chlorofform, Wy yw màs y golofn sydd wedi'i llenwi â methanol, a ρ yw dwysedd y toddydd. Dwysedd methanol (ρ = 0.7866) a chlorofform (ρ = 1.484). Roedd cyfanswm mandylledd y golofn gronynnau silica-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 a'n colofn C18-wrea31 a astudiwyd yn flaenorol yn 0.63 a 0.55, yn y drefn honno. Mae hyn yn golygu bod presenoldeb ligandau wrea yn lleihau athreiddedd y cyfnod llonydd. Ar y llaw arall, cyfanswm mandylledd y golofn PMP (diamedr mewnol 100 × 1.8 mm) yw 0.60. Mae colofnau PMP yn llai athraidd na cholofnau sydd wedi'u pacio â gronynnau silica wedi'u rhwymo â C18 oherwydd mewn cyfnodau llonydd math C18 mae'r ligandau C18 ynghlwm wrth y gronynnau silica mewn cadwyni llinol, tra mewn cyfnodau llonydd math polystyren mae polymer cymharol drwchus yn cael ei ffurfio o amgylch y gronynnau. haen A. Mewn arbrawf nodweddiadol, cyfrifir mandylledd colofn fel a ganlyn:
Ar ffig. 7A, mae B yn dangos plotiau Van Deemter ar gyfer colofn PMP (mewnol 100 x 1.8 mm) a cholofn Ascentis Express RP-Amide (mewnol 100 x 1.8 mm) o dan yr un amodau elution, 60/40 ACN/H2O a 0 .1% TFA 20 µl/mun i 800 µl/mun ar y ddwy golofn. Y gwerthoedd HETP lleiaf ar y gyfradd llif optimaidd (80 µl/mun) oedd 2.6 µm a 3.9 µm ar gyfer y golofn PMP a'r golofn Ascentis Express RP-Amide, yn y drefn honno. Mae'r gwerthoedd HETP yn dangos bod effeithlonrwydd gwahanu'r golofn PMP (mewnol 100 x 1.8 mm) yn llawer uwch nag effeithlonrwydd gwahanu'r golofn Ascentis Express RP-Amide sydd ar gael yn fasnachol (mewnol 100 x 1.8 mm). Mae graff van Deemter yn Ffig. 7(A) yn dangos nad yw'r gostyngiad yng ngwerth N yn sylweddol uwch gyda llif cynyddol o'i gymharu â'n hastudiaeth flaenorol. Mae effeithlonrwydd gwahanu uwch colofn PMP (meintr id 100 × 1.8 mm) o'i gymharu â cholofn Ascentis Express RP-Amide yn seiliedig ar y siâp a maint gronynnau gwell a'r weithdrefn pacio colofn soffistigedig a ddefnyddir yn y gwaith cyfredol34.
(A) Plot Van Deemter (HETP yn erbyn cyflymder llinol cyfnod symudol) a gafwyd ar golofn PMP (mewnol 100 x 1.8 mm) mewn 60/40 ACN/H2O gyda 0.1% TFA. (B) Plot Van Deemter (HETP yn erbyn cyflymder llinol cyfnod symudol) a gafwyd ar golofn Ascentis Express RP-Amide (mewnol 100 x 1.8 mm) mewn 60/40 ACN/H2O gyda 0.1% TFA.
Paratowyd a gwerthuswyd cyfnod llonydd pegynol o polystyren rhyngosodedig ar gyfer gwahanu cymysgedd o beptidau synthetig a hydrolysad tryptig o albwmin serwm dynol (HSA) mewn cromatograffaeth hylif perfformiad uchel. Mae perfformiad cromatograffig colofnau PMP ar gyfer cymysgeddau peptid yn rhagorol o ran effeithlonrwydd gwahanu a datrysiad. Mae effeithlonrwydd gwahanu gwell colofnau PMP oherwydd sawl rheswm megis maint gronynnau silica a maint mandwll, synthesis rheoledig o gyfnodau llonydd, a deunyddiau pacio colofn cymhleth. Yn ogystal â'r effeithlonrwydd gwahanu uchel, mantais arall o'r cyfnod llonydd hwn yw'r pwysau cefn isel ar y golofn ar gyfraddau llif uchel. Mae colofnau PMP yn atgynhyrchadwy iawn a gellir eu defnyddio i ddadansoddi cymysgeddau o beptidau a threuliad tryptig amrywiol broteinau. Rydym yn bwriadu defnyddio'r golofn hon ar gyfer gwahanu cyfansoddion bioactif o gynhyrchion naturiol, darnau o blanhigion meddyginiaethol a madarch mewn cromatograffaeth hylif. Yn y dyfodol, bydd colofnau PMP hefyd yn cael eu gwerthuso ar gyfer gwahanu proteinau ac gwrthgyrff monoclonaidd.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Ymchwiliad i systemau gwahanu peptid cromatograffaeth cyfnod gwrthdro rhan I: Datblygu protocol ar gyfer nodweddu colofnau. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Ymchwiliad i systemau gwahanu peptid cromatograffaeth cyfnod gwrthdro rhan I: Datblygu protocol ar gyfer nodweddu colofnau.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., a Petersson, P. Ymchwiliad i Systemau Gwahanu Peptidau drwy Gromatograffeg Cyfnod Gwrthdro, Rhan I: Datblygu Protocol ar gyfer Nodweddu Colofnau. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Ymchwiliad i systemau gwahanu peptid cromatograffaeth cyfnod gwrthdro rhan I: Datblygu protocol ar gyfer nodweddion colofn. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Ymchwiliad i systemau gwahanu peptid cromatograffaeth cyfnod gwrthdro rhan I: Datblygu protocol ar gyfer nodweddion colofn.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., a Petersson, P. Ymchwiliad i Systemau Gwahanu Peptidau drwy Gromatograffeg Cyfnod Gwrthdro, Rhan I: Datblygu Protocol ar gyfer Nodweddu Colofnau.J.色谱法。 1603, 113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. ac eraill. Dulliau ar gyfer creu peptidau gweithredol gwell ar gyfer trin clefydau heintus. Biotechnoleg. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Peptidau therapiwtig synthetig: Gwyddoniaeth a marchnad. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Peptidau therapiwtig synthetig: Gwyddoniaeth a marchnad.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Chreschatyski M. Peptidau therapiwtig synthetig: gwyddoniaeth a marchnad.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Khreschatsky M. Peptidau therapiwtig synthetig: gwyddoniaeth a marchnad. darganfod cyffuriau. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Cromatograffaeth hylif proteomig uwch. Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Cromatograffaeth hylif proteomig uwch.Gweler F., Smith RD a Shen Yu. Cromatograffaeth hylif proteomig uwch. Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Cyfansoddiad protein uwch 液相色谱。Gweler F., Smith RD a Shen Yu. Cromatograffaeth hylif proteomig uwch.J. Cromatograffeg. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Mae cromatograffaeth hylif uwch-sbectrometreg màs yn gallu cyfuno metabolomeg a phroteomeg eang eu sail. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM a Salisbury, JJ Rôl UHPLC mewn datblygiad fferyllol. Chesnut, SM a Salisbury, JJ Rôl UHPLC mewn datblygiad fferyllol.Chesnut, SM a Salisbury, JJ Rôl UHPLC mewn datblygiad fferyllol.Chesnut, SM a Salisbury, JJ Rôl UHPLC mewn datblygu cyffuriau. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. a Clausen, AM Agweddau sylfaenol ac ymarferol cromatograffaeth hylif pwysedd uwch-uchel ar gyfer gwahanu cyflym. Wu, N. a Clausen, AM Agweddau sylfaenol ac ymarferol cromatograffaeth hylif pwysedd uwch-uchel ar gyfer gwahanu cyflym.Wu, N. a Clausen, AM Agweddau sylfaenol ac ymarferol cromatograffaeth hylif pwysedd uchel ar gyfer gwahanu cyflym. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. a Clausen, AM Agweddau sylfaenol ac ymarferol cromatograffaeth hylif pwysedd uwch-uchel ar gyfer gwahanu cyflym.Wu, N. a Clausen, AM Agweddau sylfaenol ac ymarferol cromatograffaeth hylif pwysedd uchel ar gyfer gwahanu cyflym.J. Medi. Gwyddoniaeth. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA a Tchelitcheff, P. Defnyddio cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad mewn datblygiad fferyllol. Wren, SA a Tchelitcheff, P. Defnyddio cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad mewn datblygiad fferyllol.Ren, SA a Chelischeff, P. Defnyddio cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-uchel mewn datblygiad fferyllol. Dryw, SA a Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA a Tchelitcheff, P.Ren, SA a Chelischeff, P. Cymhwyso cromatograffaeth hylif uwch-berfformiad wrth ddatblygu cyffuriau.J. Cromatograffeg. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hydrogel macroporous monolithig sy'n deillio o emwlsiwn olew-mewn-dŵr gyda chyfnod mewnol uchel ar gyfer puro enterofeirws 71 yn effeithlon. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA Rôl cromatograffaeth hylif mewn proteomeg. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA Rôl cromatograffaeth hylif mewn proteomeg.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA Rôl cromatograffaeth hylif mewn proteomeg. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA Rôl cromatograffaeth hylif mewn proteomeg.J. Cromatograffeg. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. A Guillarme, D. Tueddiadau newydd mewn gwahaniadau cromatograffig hylif cyfnod gwrthdro o peptidau a phroteinau therapiwtig: Damcaniaeth a chymwysiadau. A Guillarme, D. Tueddiadau newydd mewn gwahaniadau cromatograffig hylif cyfnod gwrthdro o peptidau a phroteinau therapiwtig: Damcaniaeth a chymwysiadau. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хгрои обращенной фазой: теория и приложения. A Guillarme, D. Tueddiadau newydd wrth wahanu peptidau a phroteinau therapiwtig trwy gromatograffaeth hylif cyfnod gwrthdro: damcaniaeth a chymwysiadau. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势:理论和应用。 a Guillarme, D.a Guillarmé, D. Tueddiadau newydd wrth wahanu peptidau a phroteinau therapiwtig trwy gromatograffaeth hylif cyfnod gwrthdro: damcaniaeth a chymwysiadau.J. Pharm. Gwyddor Fiofeddygol. anws. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE a Gebler, JC Gwahanu peptidau mewn dau ddimensiwn gan ddefnyddio system RP-RP-HPLC gyda pH gwahanol yn y dimensiynau gwahanu cyntaf ac ail. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE a Gebler, JC Gwahanu peptidau mewn dau ddimensiwn gan ddefnyddio system RP-RP-HPLC gyda pH gwahanol yn y dimensiynau gwahanu cyntaf ac ail.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Gwahanu peptidau mewn dau ddimensiwn gan ddefnyddio'r system RP-RP-HPLC gyda pH gwahanol yn y dimensiynau gwahanu cyntaf ac ail.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Gwahanu peptidau mewn dau ddimensiwn gan ddefnyddio gwahanol werthoedd pH yn y dimensiynau gwahanu cyntaf ac ail gan ddefnyddio'r system RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Ymchwiliad i drosglwyddiad màs a nodweddion cinetig colofnau cromatograffaeth perfformiad uchel wedi'u pacio â gronynnau C18 cwbl fandyllog a mandyllog arwynebol sy'n llai na 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tueddiadau diweddar a heriau dadansoddol wrth ynysu, adnabod a dilysu peptidau bioactif planhigion. anws. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB ac eraill. Tirwedd proteomig teyrnas bywyd. Natur 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Ôl-driniaeth peptidau therapiwtig trwy gromatograffaeth hylif paratoadol. Molecules (Basel, Y Swistir) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. a Geng, X. Cromatograffaeth modd cymysg a'i chymwysiadau i fiopolymerau. Yang, Y. a Geng, X. Cromatograffaeth modd cymysg a'i chymwysiadau i fiopolymerau.Yang, Yu. a Geng, X. Cromatograffaeth modd cymysg a'i chymhwysiad i fiopolymerau. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. a Geng, X. Cromatograffaeth modd cymysg a'i chymhwysiad mewn biopolymerau.Yang, Yu. a Gene, X. Cromatograffaeth modd cymysg a'i chymhwysiad i fiopolymerau.J. Cromatograffeg. A 1218(49), 8813–8825 (2011).