Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn rendro'r wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae angen system in vitro ddibynadwy a all atgynhyrchu amgylchedd ffisiolegol y galon yn gywir ar gyfer profi cyffuriau. Mae argaeledd cyfyngedig systemau diwylliant meinwe calon dynol wedi arwain at ddehongliadau anghywir o effeithiau cyffuriau cardiaidd. Yma, rydym wedi datblygu model diwylliant meinwe cardiaidd (CTCM) sy'n ysgogi sleisys calon yn electrofecanyddol ac yn cael ymestyn ffisiolegol yn ystod cyfnodau systolig a diastolig y cylchred cardiaidd. Ar ôl 12 diwrnod o ddiwylliant, gwellodd y dull hwn hyfywedd adrannau'r galon yn rhannol, ond ni chadwodd eu cyfanrwydd strwythurol yn llawn. Felly, ar ôl sgrinio moleciwlau bach, gwelsom fod ychwanegu 100 nM triiodothyronine (T3) ac 1 μM dexamethasone (Dex) at ein cyfrwng wedi cynnal microstrwythur yr adrannau am 12 diwrnod. Ar y cyd â thriniaeth T3/Dex, cynhaliodd y system CTCM broffiliau trawsgrifio, hyfywedd, gweithgaredd metabolig, a chyfanrwydd strwythurol ar yr un lefel â meinwe calon ffres am 12 diwrnod. Yn ogystal, mae ymestyn gormodol meinwe'r galon mewn diwylliant yn achosi signalau cardiaidd hypertroffig, gan ddarparu tystiolaeth o allu CTCM i efelychu cyflyrau hypertroffig a achosir gan ymestyn cardiaidd. I gloi, gall CTCM fodelu ffisioleg a patholeg y galon mewn diwylliant dros gyfnodau hir o amser, gan alluogi sgrinio cyffuriau dibynadwy.
Cyn ymchwil glinigol, mae angen systemau in vitro dibynadwy a all atgynhyrchu amgylchedd ffisiolegol calon ddynol yn gywir. Dylai systemau o'r fath efelychu ymestyn mecanyddol, cyfradd curiad y galon, a phriodweddau electroffisiolegol wedi'u newid. Defnyddir modelau anifeiliaid yn gyffredin fel platfform sgrinio ar gyfer ffisioleg gardiaidd gyda dibynadwyedd cyfyngedig wrth adlewyrchu effeithiau cyffuriau yng nghalon ddynol1,2. Yn y pen draw, mae'r Model Arbrofol Diwylliant Meinwe Cardiaidd Delfrydol (CTCM) yn fodel sy'n hynod sensitif ac yn benodol ar gyfer amrywiol ymyriadau therapiwtig a ffarmacolegol, gan atgynhyrchu ffisioleg a patholegedd calon ddynol3 yn gywir. Mae absenoldeb system o'r fath yn cyfyngu ar ddarganfod triniaethau newydd ar gyfer methiant y galon4,5 ac mae wedi arwain at gardiowenwyndra cyffuriau fel prif reswm dros adael y farchnad6.
Dros y degawd diwethaf, mae wyth cyffur nad ydynt yn gyffuriau cardiofasgwlaidd wedi cael eu tynnu'n ôl o ddefnydd clinigol oherwydd eu bod yn achosi ymestyn yr ysbaid QT gan arwain at arrhythmias fentriglaidd a marwolaeth sydyn7. Felly, mae angen cynyddol am strategaethau sgrinio cyn-glinigol dibynadwy i asesu effeithiolrwydd a gwenwyndra cardiofasgwlaidd. Mae'r defnydd diweddar o gardiomyocytes sy'n deillio o gelloedd bonyn pluripotent a achosir gan bobl (hiPS-CM) mewn sgrinio cyffuriau a phrofi gwenwyndra yn darparu ateb rhannol i'r broblem hon. Fodd bynnag, mae natur anaeddfed hiPS-CMs a diffyg cymhlethdod amlgellog meinwe'r galon yn gyfyngiadau mawr ar y dull hwn. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos y gellir goresgyn y cyfyngiad hwn yn rhannol trwy ddefnyddio hiPS-CM cynnar i ffurfio hydrogeliau meinwe'r galon yn fuan ar ôl dechrau cyfangiadau digymell a chynyddu ysgogiad trydanol yn raddol dros amser. Fodd bynnag, nid oes gan y microfeinweoedd hiPS-CM hyn y priodweddau electroffisiolegol a chyfangol aeddfed sydd gan y myocardiwm oedolion. Yn ogystal, mae gan feinwe cardiaidd ddynol strwythur mwy cymhleth, sy'n cynnwys cymysgedd heterogenaidd o wahanol fathau o gelloedd, gan gynnwys celloedd endothelaidd, niwronau, a ffibroblastau stromal, wedi'u cysylltu gan setiau penodol o broteinau matrics allgellog. Mae'r heterogenedd hwn o boblogaethau nad ydynt yn gardiomyocytes11,12,13 yng nghalon mamaliaid oedolion yn rhwystr mawr i fodelu meinwe cardiaidd gan ddefnyddio mathau unigol o gelloedd. Mae'r cyfyngiadau mawr hyn yn pwysleisio pwysigrwydd datblygu dulliau ar gyfer meithrin meinwe myocardaidd gyfan o dan amodau ffisiolegol a phatholegol.
Mae adrannau tenau (300 µm) wedi'u meithrin o'r galon ddynol wedi profi i fod yn fodel addawol o myocardiwm dynol cyfan. Mae'r dull hwn yn darparu mynediad at system amlgellog 3D gyflawn debyg i feinwe calon ddynol. Fodd bynnag, tan 2019, roedd y defnydd o adrannau calon wedi'u meithrin wedi'i gyfyngu gan y goroesiad diwylliant byr (24 awr). Mae hyn oherwydd nifer o ffactorau gan gynnwys diffyg ymestyn ffisegol-fecanyddol, y rhyngwyneb aer-hylif, a'r defnydd o gyfryngau syml nad ydynt yn cefnogi anghenion meinwe'r galon. Yn 2019, dangosodd sawl grŵp ymchwil y gall ymgorffori ffactorau mecanyddol mewn systemau diwylliant meinwe'r galon ymestyn oes diwylliant, gwella mynegiant y galon, ac efelychu patholeg y galon. Mae dwy astudiaeth gain 17 a 18 yn dangos bod llwytho mecanyddol uniaxial yn cael effaith gadarnhaol ar ffenoteip y galon yn ystod diwylliant. Fodd bynnag, ni ddefnyddiodd yr astudiaethau hyn y llwytho ffisegol-fecanyddol tri dimensiwn deinamig o gylchred y galon, gan fod adrannau'r galon wedi'u llwytho naill ai â grymoedd tynnol isometrig 17 neu lwyth awcotonig llinol 18. Arweiniodd y dulliau hyn o ymestyn meinwe at atal llawer o enynnau cardiaidd neu orfynegiant genynnau sy'n gysylltiedig ag ymatebion ymestyn annormal. Yn nodedig, datblygodd Pitoulis et al. 19 faddon diwylliant sleisen galon deinamig ar gyfer ail-greu cylchred y galon gan ddefnyddio adborth trawsddygiwr grym a gyriannau tensiwn. Er bod y system hon yn caniatáu modelu cylchred y galon in vitro mwy cywir, mae cymhlethdod a thryloywder isel y dull yn cyfyngu ar gymhwyso'r system hon. Yn ddiweddar, mae ein labordy wedi datblygu system ddiwylliant symlach gan ddefnyddio ysgogiad trydanol a chyfrwng wedi'i optimeiddio i gynnal hyfywedd adrannau o feinwe calon moch a dynol am hyd at 6 diwrnod 20,21.
Yn y llawysgrif gyfredol, rydym yn disgrifio model diwylliant meinwe cardiaidd (CTCM) gan ddefnyddio adrannau o galon y mochyn sy'n ymgorffori ciwiau humoral i ailadrodd ffisioleg cardiaidd tri dimensiwn a chwyddiad pathoffisiolegol yn ystod cylchred y galon. Gall y CTCM hwn gynyddu cywirdeb rhagfynegiad cyffuriau cyn-glinigol i lefel na chyflawnwyd erioed o'r blaen trwy ddarparu system gardiaidd cost-effeithiol, trwybwn canolig sy'n dynwared ffisioleg/pathoffisioleg calon mamaliaid ar gyfer profi cyffuriau cyn-glinigol.
Mae signalau mecanyddol hemodynamig yn chwarae rhan hanfodol wrth gynnal swyddogaeth cardiomyocyte in vitro 22,23,24. Yn y llawysgrif gyfredol, rydym wedi datblygu CTCM (Ffigur 1a) a all efelychu amgylchedd cardiaidd oedolion trwy ysgogi ysgogiad trydanol a mecanyddol ar amleddau ffisiolegol (1.2 Hz, 72 curiad y funud). Er mwyn osgoi ymestyn meinwe gormodol yn ystod diastole, defnyddiwyd dyfais argraffu 3D i gynyddu maint meinwe 25% (Ffig. 1b). Amserwyd y cyflymder trydanol a ysgogwyd gan y system C-PACE i ddechrau 100 ms cyn systole gan ddefnyddio system gaffael data i atgynhyrchu'r cylchred cardiaidd yn llawn. Mae'r system diwylliant meinwe yn defnyddio gweithredydd niwmatig rhaglenadwy (LB Engineering, yr Almaen) i ehangu pilen silicon hyblyg yn gylchol i achosi ehangu sleisys y galon yn y siambr uchaf. Cysylltwyd y system â llinell aer allanol trwy drawsddygiwr pwysau, a oedd yn ei gwneud hi'n bosibl addasu'r pwysau (± 1 mmHg) a'r amser (± 1 ms) yn gywir (Ffig. 1c).
a Cysylltwch y darn meinwe â'r cylch cynnal 7 mm, a ddangosir mewn glas, y tu mewn i siambr ddiwyllio'r ddyfais. Mae'r siambr ddiwyllio wedi'i gwahanu oddi wrth y siambr aer gan bilen silicon hyblyg denau. Rhowch gasged rhwng pob siambr i atal gollyngiadau. Mae caead y ddyfais yn cynnwys electrodau graffit sy'n darparu ysgogiad trydanol. b Cynrychiolaeth sgematig o'r ddyfais meinwe fawr, y cylch canllaw a'r cylch cynnal. Mae'r darnau meinwe (brown) wedi'u gosod ar y ddyfais fawr gyda'r cylch canllaw wedi'i osod yn y rhigol ar ymyl allanol y ddyfais. Gan ddefnyddio'r canllaw, rhowch y cylch cynnal wedi'i orchuddio â glud acrylig meinwe yn ofalus dros y darn o feinwe'r galon. c Graff yn dangos amser yr ysgogiad trydanol fel swyddogaeth o bwysau siambr aer a reolir gan weithredydd niwmatig rhaglenadwy (PPD). Defnyddiwyd dyfais caffael data i gydamseru ysgogiad trydanol gan ddefnyddio synwyryddion pwysau. Pan fydd y pwysau yn y siambr ddiwyllio yn cyrraedd y trothwy gosodedig, anfonir signal pwls i'r C-PACE-EM i sbarduno ysgogiad trydanol. d Delwedd o bedwar CTCM wedi'u gosod ar silff deorydd. Mae pedair dyfais wedi'u cysylltu ag un PPD trwy gylched niwmatig, a mewnosodir synwyryddion pwysau yn y falf hemostatig i fonitro'r pwysau yn y gylched niwmatig. Mae pob dyfais yn cynnwys chwe adran meinwe.
Gan ddefnyddio un gweithredydd niwmatig, roeddem yn gallu rheoli 4 dyfais CTCM, pob un ohonynt yn gallu dal 6 adran feinwe (Ffig. 1d). Yn CTCM, mae'r pwysedd aer yn y siambr aer yn cael ei drawsnewid yn bwysedd cydamserol yn y siambr hylif ac yn ysgogi ehangu ffisiolegol y sleisen galon (Ffigur 2a a Ffilm Atodol 1). Dangosodd gwerthusiad o ymestyn meinwe ar 80 mm Hg. Art. ymestyn adrannau meinwe o 25% (Ffig. 2b). Dangoswyd bod yr ymestyn canrannol hwn yn cyfateb i hyd sarcomere ffisiolegol o 2.2–2.3 µm ar gyfer cyfangadwyedd adran y galon arferol17,19,25. Aseswyd symudiad meinwe gan ddefnyddio gosodiadau camera personol (Ffigur Atodol 1). Roedd osgled a chyflymder symudiad meinwe (Ffig. 2c, d) yn cyfateb i ymestyn yn ystod y cylchred cardiaidd ac amser yn ystod systole a diastole (Ffig. 2b). Arhosodd ymestyn a chyflymder meinwe'r galon yn ystod cyfangiad ac ymlacio yn gyson am 12 diwrnod mewn diwylliant (Ffig. 2f). Er mwyn gwerthuso effaith ysgogiad trydanol ar gyfangiad yn ystod diwylliant, fe wnaethom ddatblygu dull ar gyfer pennu anffurfiad gweithredol gan ddefnyddio algorithm cysgodi (Ffig. Atodol 2a,b) ac roeddem yn gallu gwahaniaethu rhwng anffurfiadau gydag ac heb ysgogiad trydanol. Yr un adran o'r galon (Ffig. 2f). Yn rhanbarth symudol y toriad (R6-9), roedd y foltedd yn ystod ysgogiad trydanol 20% yn uwch nag yn absenoldeb ysgogiad trydanol, sy'n dangos cyfraniad ysgogiad trydanol at swyddogaeth gyfangiad.
Mae olion cynrychioliadol o bwysau siambr aer, pwysedd siambr hylif, a mesuriadau symudiad meinwe yn cadarnhau bod pwysedd y siambr yn newid pwysedd siambr hylif, gan achosi symudiad cyfatebol o'r sleisen feinwe. b Olion cynrychioliadol o ganran ymestyn (glas) o adrannau meinwe sy'n cyfateb i ganran ymestyn (oren). c Mae'r symudiad a fesurwyd o'r sleisen gardiaidd yn gyson â'r cyflymder symudiad a fesurwyd. (d) Llwybrau cynrychioliadol o symudiad cylchol (llinell las) a chyflymder (llinell ddotiog oren) mewn sleisen o'r galon. e Mesur amser cylch (n = 19 sleisen fesul grŵp, o wahanol foch), amser crebachu (n = 19 sleisen fesul grŵp), amser ymlacio (n = 19 sleisen fesul grŵp, o wahanol foch), symudiad meinwe (n = 25 sleisen)/grŵp o wahanol foch), cyflymder systolig brig (n = 24(D0), 25(D12) sleisen/grŵp o wahanol foch) a chyfradd ymlacio brig (n=24(D0), 25(D12) sleisen/grŵp o wahanol foch). Ni ddangosodd prawf-t Myfyriwr dau gynffon unrhyw wahaniaeth arwyddocaol mewn unrhyw baramedr. Olion dadansoddi straen cynrychioliadol o adrannau meinwe gyda (coch) a heb (glas) ysgogiad trydanol, deg ardal ranbarthol o adrannau meinwe o'r un adran. Mae'r paneli gwaelod yn dangos meintioli'r gwahaniaeth canrannol mewn straen mewn adrannau meinwe gyda a heb ysgogiad trydanol mewn deg ardal o wahanol adrannau. (n = 8 sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf-t Myfyriwr Dau-gynffon; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf-t Myfyriwr Dau-gynffon; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,000,0,*, (n = 8 adran/grŵp o foch gwahanol, prawf-t Myfyriwr dwy-gynffon; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p <0.05） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p <0.05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,00). (n = 8 adran/grŵp, o foch gwahanol, prawf-t Myfyriwr dwy-gynffon; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± gwyriad safonol.
Yn ein system diwylliant sleisys calon biomimetig statig flaenorol [20, 21], fe wnaethom gynnal hyfywedd, swyddogaeth, a chyfanrwydd strwythurol sleisys calon am 6 diwrnod trwy gymhwyso ysgogiad trydanol ac optimeiddio cyfansoddiad y cyfrwng. Fodd bynnag, ar ôl 10 diwrnod, gostyngodd y ffigurau hyn yn sydyn. Byddwn yn cyfeirio at adrannau a ddiwylliwyd yn ein system diwylliant biomimetig statig flaenorol 20, 21 amodau rheoli (Ctrl) a byddwn yn defnyddio ein cyfrwng a optimeiddiwyd yn flaenorol fel amodau MC a diwylliant o dan ysgogiad mecanyddol a thrydanol ar yr un pryd (CTCM). o'r enw . Yn gyntaf, fe benderfynon ni nad oedd ysgogiad mecanyddol heb ysgogiad trydanol yn ddigonol i gynnal hyfywedd meinwe am 6 diwrnod (Ffig. Atodol 3a,b). Yn ddiddorol, gyda chyflwyniad ysgogiad ffisio-fecanyddol a thrydanol gan ddefnyddio STCM, arhosodd hyfywedd adrannau calon 12 diwrnod yr un fath ag mewn adrannau calon ffres o dan amodau MS, ond nid o dan amodau Ctrl, fel y dangosir gan ddadansoddiad MTT (Ffig. 1). 3a). Mae hyn yn awgrymu y gall ysgogiad mecanyddol ac efelychu'r cylchred cardiaidd gadw adrannau meinwe yn hyfyw am ddwywaith cyhyd ag yr adroddwyd yn ein system diwylliant statig flaenorol. Fodd bynnag, dangosodd asesiad o gyfanrwydd strwythurol adrannau meinwe trwy imiwnolabelu troponin T cardiaidd a connexin 43 fod mynegiant connexin 43 yn sylweddol uwch mewn meinweoedd MC ar ddiwrnod 12 nag mewn rheolyddion ar yr un diwrnod. Fodd bynnag, ni chynhaliwyd mynegiant connexin 43 unffurf a ffurfio disg-Z yn llawn (Ffig. 3b). Rydym yn defnyddio fframwaith deallusrwydd artiffisial (AI) i fesur cyfanrwydd strwythurol meinwe26, piblinell ddysgu dwfn sy'n seiliedig ar ddelweddau yn seiliedig ar staenio troponin-T a connexin43 i fesur cyfanrwydd strwythurol a fflwroleuedd sleisys y galon yn awtomatig o ran cryfder lleoleiddio. Mae'r dull hwn yn defnyddio Rhwydwaith Niwral Convolutional (CNN) a fframwaith dysgu dwfn i fesur cyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon yn ddibynadwy mewn modd awtomataidd a diduedd, fel y disgrifir yn y cyfeirnod.26. Dangosodd meinwe MC debygrwydd strwythurol gwell i ddiwrnod 0 o'i gymharu ag adrannau rheoli statig. Yn ogystal, datgelodd staenio trichrome Masson ganran sylweddol is o ffibrosis o dan amodau MS o'i gymharu ag amodau rheoli ar ddiwrnod 12 o ddiwylliant (Ffig. 3c). Er bod CTCM wedi cynyddu hyfywedd adrannau meinwe'r galon ar ddiwrnod 12 i lefel debyg i lefel meinwe calon ffres, ni wellodd gyfanrwydd strwythurol adrannau'r galon yn sylweddol.
Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd MTT sleisys calon ffres (D0) neu ddiwylliant sleisys calon am 12 diwrnod naill ai mewn diwylliant statig (D12 Ctrl) neu mewn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA un ffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a **p < 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl). Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd MTT sleisys calon ffres (D0) neu ddiwylliant sleisys calon am 12 diwrnod naill ai mewn diwylliant statig (D12 Ctrl) neu mewn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA un ffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a **p < 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl).mae'r histogram yn dangos meintioli hyfywedd adrannau calon ffres MTT (D0) neu ddiwylliant adrannau calon am 12 diwrnod naill ai mewn diwylliant statig (rheoliad D12) neu CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (rheoliad D12). ) ), 12 (D12 MC) adrannau/grŵp o wahanol foch, perfformir prawf ANOVA unffordd;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a **p < 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组进进行测试；与D0相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片， 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001，丂) D0.histogram yn dangos meintioli hyfywedd MTT mewn adrannau calon ffres (D0) neu adrannau calon a dyfwyd am 12 diwrnod mewn diwylliant statig (rheoliad D12) neu CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (rheoliad D12)), 12 (D12 MC) adrannau/grŵp o wahanol foch, prawf ANOVA unffordd;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0, **p < 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl).b Troponin-T (gwyrdd), connexin 43 (coch) a DAPI (glas) mewn adrannau calon newydd eu hynysu (D0) neu adrannau calon wedi'u meithrin o dan amodau statig (Ctrl) neu amodau CTCM (MC) am 12 diwrnod) o ddelweddau imiwno-fflworoleuedd cynrychioliadol (graddfa wag = 100 µm). Mesur cyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon drwy ddefnyddio deallusrwydd artiffisial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sleisen/grŵp o bob un o fochyn gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). Mesur cyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon drwy ddefnyddio deallusrwydd artiffisial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sleisen/grŵp o bob un o foch gwahanol, cynhelir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7(D0), Crl 12(D)) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; сравнению с D12 Ctrl). Mesur uniondeb strwythurol meinwe'r galon gan ddefnyddio deallusrwydd artiffisial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) adran/grŵp o wahanol foch, prawf ANOVA unffordd wedi'i gynnal; ####p < 0.0001 vs. gyda D0 a ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tafelli/grŵp pob un o wahanol fochyn, prawf ANOVA un ffordd;###0.相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tafelli/grŵp pob un o'r gwahanol foch, prawf ANOVAp unffordd;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D 1 ) , C 7 (D 2 ) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения, односторонний тест ANOVA; с D12 Ctrl). Deallusrwydd artiffisial i fesur uniondeb strwythurol meinwe'r galon (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) adran/grŵp o bob un o foch gwahanol, prawf ANOVA unffordd; ####p<0.0001 vs .D0 I'w gymharu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). c Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) ar gyfer sleisys calon wedi'u staenio â staen tricrom Masson (Graddfa noeth = 500 µm) (n = 10 sleisen/grŵp yr un o fochyn gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 Ctrl). c Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) ar gyfer sleisys calon wedi'u staenio â staen tricrom Masson (Graddfa noeth = 500 µm) (n = 10 sleisen/grŵp yr un o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; #### p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашеннымых Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется , выполняется онестон; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) o adrannau'r galon wedi'u staenio â staen tricrom Masson (graddfa heb ei orchuddio = 500 µm) (n = 10 adran/grŵp o foch gwahanol, prawf ANOVA unffordd wedi'i gynnal; #### p < 0 .0001 o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 Ctrl). c 用Masson三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（覸=尺）（覸=尺） 10 个切片/组，每组来自不同的猪, 进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比， 0 rl 2 p < 0.0001 与D0 相比 , * 0 rl 2 p < 0.0001 与D0 相比 , * 0 rl 2 p < 0.0001 与D0 相比 , * 0 rl 2 p <0.相比）. C用 masson三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右）裸尺度帰帰度庰裸尺度 = 500 µm）（n = 10个切片组每组来自不同 猪，进行 单向单向# Anova#５测# 0.0001与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенныыыыы красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, провоь стон однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) o adrannau'r galon wedi'u staenio â staen tricrom Masson (gwag = 500 µm) (n = 10 adran/grŵp, pob un o fochyn gwahanol, wedi'i brofi trwy ddadansoddiad amrywiant unffordd ;### # p < 0.0001 o'i gymharu â D0, ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 Ctrl).Mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± gwyriad safonol.
Fe wnaethon ni ragdybio, drwy ychwanegu moleciwlau bach at y cyfrwng diwylliant, y gellid gwella cyfanrwydd cardiomyocytau a lleihau datblygiad ffibrosis yn ystod diwylliant CTCM. Felly, fe wnaethon ni sgrinio am foleciwlau bach gan ddefnyddio ein diwylliannau rheoli statig20,21 oherwydd y nifer fach o ffactorau dryslyd. Dewiswyd Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ac SB431542 (SB) ar gyfer y sgrin hon. Defnyddiwyd y moleciwlau bach hyn yn flaenorol mewn diwylliannau hiPSC-CM i ysgogi aeddfedu cardiomyocytau trwy gynyddu hyd y sarcomere, tiwbynnau-T, a chyflymder dargludiad. Yn ogystal, mae'n hysbys bod Dex (glwcocorticoid) ac SB yn atal llid29,30. Felly, fe wnaethon ni brofi a fyddai cynnwys un neu gyfuniad o'r moleciwlau bach hyn yn gwella cyfanrwydd strwythurol adrannau'r galon. Ar gyfer sgrinio cychwynnol, dewiswyd dos pob cyfansoddyn yn seiliedig ar y crynodiadau a ddefnyddir yn gyffredin mewn modelau diwylliant celloedd (1 μM Dex27, 100 nM T327, a 2.5 μM SB31). Ar ôl 12 diwrnod o ddiwylliant, arweiniodd y cyfuniad o T3 a Dex at gyfanrwydd strwythurol cardiomyocytau gorau posibl ac ailfodelu ffibrog lleiaf posibl (Ffigurau Atodol 4 a 5). Yn ogystal, cynhyrchodd defnyddio crynodiadau dwbl neu ddwbl y rhain o T3 a Dex effeithiau niweidiol o'i gymharu â chrynodiadau arferol (Ffig. Atodol 6a,b).
Ar ôl sgrinio cychwynnol, fe wnaethom gymharu 4 amod diwylliant uniongyrchol (Ffigur 4a): Ctrl: adrannau calon wedi'u meithrin yn ein diwylliant statig a ddisgrifiwyd yn flaenorol gan ddefnyddio ein cyfrwng wedi'i optimeiddio; 20.21 TD: Ychwanegwyd Dex at T3 a Ctrl ddydd Mercher; MC: adrannau calon wedi'u meithrin mewn CTCM gan ddefnyddio ein cyfrwng wedi'i optimeiddio yn flaenorol; ac MT: CTCM gyda T3 a Dex wedi'u hychwanegu at y cyfrwng. Ar ôl 12 diwrnod o drin, arhosodd hyfywedd meinweoedd MS ac MT yr un fath ag mewn meinweoedd ffres a aseswyd gan assay MTT (Ffig. 4b). Yn ddiddorol, ni arweiniodd ychwanegu T3 a Dex at ddiwylliannau trawsffynhonnell (TD) at welliant sylweddol mewn hyfywedd o'i gymharu ag amodau Ctrl, sy'n dangos rôl bwysig ysgogiad mecanyddol wrth gynnal hyfywedd adrannau calon.
Diagram dylunio arbrofol yn darlunio'r pedwar amod diwylliant a ddefnyddiwyd i werthuso effeithiau ysgogiad mecanyddol ac atchwanegiadau T3/Dex ar gyfrwng am 12 diwrnod. b Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd 12 diwrnod ar ôl y diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, ac MT) o'i gymharu â sleisys calon ffres (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 o'i gymharu â D0 a **p < 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl). b Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd 12 diwrnod ar ôl y diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, ac MT) o'i gymharu â sleisys calon ffres (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 o'i gymharu â D0 a **p < 0.01 o'i gymharu â D12 ctrl). b гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 после количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культививи 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 118), 18 (D0), 18 (D0), 18 (D0), 18 (D0), 18 (D0), 118 D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Mae'r graff bar yn dangos meintioli hyfywedd 12 diwrnod ar ôl y diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (rheolaeth, TD, MC, ac MT) o'i gymharu ag adrannau calon ffres (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, a D12 MT), 12 (D12 MC) adrannau/grŵp o foch gwahanol, prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 a **p < 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl). b 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl、TD、MC和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n=12D、18) TD 和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向 ANOVA 测试；####p < 0.0001，##0p < 0.0001，##0p < 0.0001，##00 < 0.0001，##0p < 0.0001，##00 <0. < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со сезад и со семцию (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одностороней, одностороней, одностороней, одностороней, # VA # 0, # VA # 0, # VA # 1 # 0 ; ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram yn dangos pob un o'r 4 cyflwr diwylliant (rheolaeth, TD, MC ac MT) o'i gymharu ag adrannau calon ffres (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), o wahanol adrannau/grŵp 12 moch (D12 MC), prawf ANOVA unffordd; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. rheolaeth D12). Mae graff bar c yn dangos meintioli fflwcs glwcos 12 diwrnod ar ôl y diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, ac MT) o'i gymharu â sleisys calon ffres (D0) (n = 6 sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ###p < 0.001, o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 Ctrl). Mae graff bar c yn dangos meintioli fflwcs glwcos 12 diwrnod ar ôl y diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, ac MT) o'i gymharu â sleisys calon ffres (D0) (n = 6 sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ###p < 0.001, o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 Ctrl). c гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культививи 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 по срезами разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; c Mae'r histogram yn dangos meintioli fflwcs glwcos 12 diwrnod ar ôl diwylliant o dan bob un o'r 4 amod diwylliant (rheolaeth, TD, MC ac MT) o'i gymharu ag adrannau calon ffres (D0) (n = 6 adran/grŵp o foch gwahanol, prawf ANOVA unffordd wedi'i gynnal; ###p < 0.001 o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 Ctrl). c 条形图显示所有4种培养条件 (Ctrl, TD), MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比吔和天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p < 0.001 ，***##p < 0.001 ，***##p < 0.001 ，***##p < 0.001 ，***##p < 0.001 ，*** 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C条形图显示所有4种条件（（ctrl、td、 mc和 mt）新鲜心脏切片切片切片切片片切片和培养后后 12 天的通量定量 = 6 片/组，来自猪，,，，, ， ， 猪自猪单 VA测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послет кульельево потока 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n=зами сердца (D0) (n=ззами сердца (D0) (n=зато/ 6 сро разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; (контроль). c Histogram yn dangos meintioli fflwcs glwcos 12 diwrnod ar ôl diwylliant ar gyfer pob un o'r 4 amod diwylliant (rheolaeth, TD, MC, ac MT) o'i gymharu ag adrannau calon ffres (D0) (n = 6 adran/grŵp, o foch gwahanol, unochrog Lle perfformiwyd profion ANOVA, ###p < 0.001 o'i gymharu â D0, ***p < 0.001 o'i gymharu â D12 (rheolaeth).d Plotiau dadansoddi straen o feinweoedd ffres (glas), MC diwrnod 12 (gwyrdd), a MT diwrnod 12 (coch) mewn deg pwynt adran meinwe rhanbarthol (n = 4 sleisen/grŵp, prawf ANOVA unffordd; nid oedd gwahaniaeth arwyddocaol rhwng grwpiau). e Plot llosgfynydd yn dangos genynnau â mynegiant gwahaniaethol mewn adrannau calon ffres (D0) o'i gymharu ag adrannau calon a ddiwylliwyd o dan amodau statig (Ctrl) neu o dan amodau MT (MT) am 10-12 diwrnod. f Map gwres o enynnau sarcomere ar gyfer adrannau calon a ddiwylliwyd o dan bob un o'r amodau diwylliant. Mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± gwyriad safonol.
Mae dibyniaeth metabolaidd ar y newid o ocsideiddio asid brasterog i glycolysis yn nodwedd amlwg o ddadwahaniaethu cardiomyocytau. Mae cardiomyocytau anaeddfed yn defnyddio glwcos yn bennaf ar gyfer cynhyrchu ATP ac mae ganddynt mitochondria hypoplastig gydag ychydig o gristae5,32. Dangosodd dadansoddiadau defnydd glwcos, o dan amodau MC ac MT, fod y defnydd o glwcos yn debyg i'r hyn a wnaed mewn meinweoedd diwrnod 0 (Ffigur 4c). Fodd bynnag, dangosodd samplau Ctrl gynnydd sylweddol mewn defnydd o glwcos o'i gymharu â meinwe ffres. Mae hyn yn dangos bod y cyfuniad o CTCM a T3/Dex yn gwella hyfywedd meinwe ac yn cadw'r ffenoteip metabolaidd o adrannau calon a ddiwylliwyd am 12 diwrnod. Yn ogystal, dangosodd dadansoddiad straen fod lefelau straen wedi aros yr un fath ag mewn meinwe calon ffres am 12 diwrnod o dan amodau MT ac MS (Ffig. 4d).
I ddadansoddi effaith gyffredinol CTCM a T3/Dex ar dirwedd drawsgrifio fyd-eang meinwe sleisys y galon, fe wnaethom gynnal RNAseq ar sleisys y galon o bob un o'r pedwar cyflwr diwylliant gwahanol (Data Atodol 1). Yn ddiddorol, dangosodd adrannau MT debygrwydd trawsgrifio uchel i feinwe calon ffres, gyda dim ond 16 wedi'u mynegi'n wahanol allan o 13,642 o enynnau. Fodd bynnag, fel y dangoswyd yn gynharach, dangosodd sleisys Ctrl 1229 o enynnau wedi'u mynegi'n wahanol ar ôl 10–12 diwrnod mewn diwylliant (Ffig. 4e). Cadarnhawyd y data hyn gan qRT-PCR o enynnau calon a ffibroblast (Ffig. Atodol 7a-c). Yn ddiddorol, dangosodd yr adrannau Ctrl lawr-reoleiddio genynnau'r galon a'r cylch celloedd ac actifadu rhaglenni genynnau llidiol. Mae'r data hyn yn awgrymu bod dadwahaniaethu, sydd fel arfer yn digwydd ar ôl diwylliant hirdymor, yn cael ei wanhau'n llwyr o dan amodau MT (Ffig. Atodol 8a,b). Dangosodd astudiaeth ofalus o enynnau sarcomere mai dim ond o dan amodau MT y mae'r genynnau sy'n amgodio'r sarcomere (Ffig. 4f) a'r sianel ïon (Ffig. Atodol 9) yn cael eu cadw, gan eu hamddiffyn rhag cael eu hatal o dan amodau Ctrl, TD, ac MC. Mae'r data hyn yn dangos, gyda chyfuniad o ysgogiad mecanyddol a humoral (T3/Dex), y gall trawsgriftom sleisen y galon aros yn debyg i sleisys calon ffres ar ôl 12 diwrnod mewn diwylliant.
Cefnogir y canfyddiadau trawsgrifio hyn gan y ffaith bod cyfanrwydd strwythurol cardiomyocytau mewn adrannau calon yn cael ei gadw orau o dan amodau MT am 12 diwrnod, fel y dangosir gan connexin 43 cyfan a lleol (Ffig. 5a). Yn ogystal, roedd ffibrosis mewn adrannau calon o dan amodau MT wedi'i leihau'n sylweddol o'i gymharu â Ctrl ac yn debyg i adrannau calon ffres (Ffig. 5b). Mae'r data hyn yn dangos bod y cyfuniad o ysgogiad mecanyddol a thriniaeth T3/Dex yn cadw strwythur cardiaidd yn effeithiol mewn adrannau calon mewn diwylliant.
Delweddau imiwno-fflworoleuedd cynrychioliadol o troponin-T (gwyrdd), connexin 43 (coch), a DAPI (glas) mewn adrannau calon newydd eu hynysu (D0) neu wedi'u meithrin am 12 diwrnod ym mhob un o'r pedwar amod diwylliant adran calon (bar graddfa = 100 µm). Mesur cyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon drwy ddefnyddio deallusrwydd artiffisial (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 sleisen/grŵp (D12 TD, D12 MC a D12 MT) o foch gwahanol, cynhelir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a *p < 0.05, neu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). Mesur cyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon drwy ddefnyddio deallusrwydd artiffisial (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 sleisen/grŵp (D12 TD, D12 MC a D12 MT) o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; #### p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a *p < 0.05, neu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллектаD ( 0 1 1 ), TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Mesur uniondeb strwythurol meinwe'r galon gan ddefnyddio deallusrwydd artiffisial (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) adran/grŵp o foch gwahanol, prawf ANOVA unffordd wedi'i gynnal; #### p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a *p < 0.05 neu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）,5（D12 TD,D12 MC和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化, 进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.****p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对不同猪的心脏结构完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5（d12 td 、 d12 mc 和 ）人工智能量 化进行单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0****港 测测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0****港 港渔测测试与D12 Ctrl 相比）.Mesur uniondeb strwythurol meinwe’r galon gan ddefnyddio deallusrwydd artiffisial mewn gwahanol foch (n = 7 adran/grŵp (D0 a D12 Ctrl), 5 adran/grŵp (D12 TD, D12 MC a D12 MT)) gyda phrawf ANOVA unffordd;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a *p < 0.05 neu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). b Delweddau cynrychioliadol a meintioli ar gyfer sleisys calon wedi'u staenio â staen tricrom Masson (Bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a D12 MC), 9 (D12 MT) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001, neu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). b Delweddau cynrychioliadol a meintioli ar gyfer sleisys calon wedi'u staenio â staen tricrom Masson (Bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a D12 MC), 9 (D12 MT) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf ANOVA unffordd; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0 a ***p < 0.001, neu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красМескон срезов сердца (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разныпу от разныпх срея срезов/компании односторонний тест ANOVA; b Delweddau cynrychioliadol a meintioli adrannau o'r galon wedi'u staenio â staen tricrom Masson (bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) adran/grŵp o foch gwahanol, wedi'u perfformio ANOVA unffordd; ####p < 0.0001 vs. D0 a ***p < 0.001 neu ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 1（ Ctrl, D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分#0;相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b用 masson三色染料的心脏切片的代表性和量化（比例尺尺尺 = 500 µm = 100 （（ 、d12 ctrl、d12 td 和 d12 mc） 来自不同的9个 d12 mt 切片切片切片切片切片切切切切切切切切切片切切片切片切片切片片切片片片片片片片片切片切片 切片切片切片切片切片切片切片切片/组，进行单因素方差分析；#.##0 <0>相比，***p <0.001，或****p <0.0001与D12 Ctrl相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом намасше = 500 мкм) ( n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо, один- спосо ## VA # 0 # VA # 0 ; сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Delweddau cynrychioliadol a meintioli adrannau o'r galon wedi'u staenio â thricrom Masson (bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 adran (D12 MT) o wahanol foch/grŵp, un dull ANOVA; ####p < 0.0001 o'i gymharu â D0, ***p < 0.001 neu ****p < 0.0001 o'i gymharu â D12 Ctrl).Mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± gwyriad safonol.
Yn olaf, aseswyd gallu CTCM i efelychu hypertroffedd cardiaidd trwy gynyddu ymestyn meinwe'r galon. Yn CTCM, cynyddodd pwysedd brig y siambr aer o 80 mmHg i 80 mmHg. Art. (ymestyn arferol) hyd at 140 mmHg Art. (Ffig. 6a). Mae hyn yn cyfateb i gynnydd o 32% mewn ymestyn (Ffig. 6b), a ddangoswyd yn flaenorol fel yr ymestyn canrannol cyfatebol sy'n ofynnol i adrannau'r galon gyflawni hyd sarcomere tebyg i'r hyn a welir mewn hypertroffedd. Arhosodd ymestyn a chyflymder meinwe'r galon yn ystod crebachiad ac ymlacio yn gyson yn ystod chwe diwrnod o ddiwylliant (Ffig. 6c). Cafodd meinwe'r galon o amodau MT ei rhoi dan amodau ymestyn arferol (MT (Normal)) neu or-ymestyn (MT (OS)) am chwe diwrnod. Ar ôl pedwar diwrnod mewn diwylliant eisoes, roedd y biomarciwr hypertroffig NT-ProBNP wedi'i godi'n sylweddol yn y cyfrwng o dan amodau MT (OS) o'i gymharu ag amodau MT (normal) (Ffig. 7a). Yn ogystal, ar ôl chwe diwrnod o ddiwyllio, cynyddodd maint y celloedd mewn MT (OS) (Ffig. 7b) yn sylweddol o'i gymharu ag adrannau o galon MT (normal). Yn ogystal, cynyddodd trawsleoliad niwclear NFATC4 yn sylweddol mewn meinweoedd gor-ymestynedig (Ffig. 7c). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos datblygiad cynyddol ailfodelu patholegol ar ôl gor-ymestyn ac yn cefnogi'r cysyniad y gellir defnyddio'r ddyfais CTCM fel platfform i astudio signalau hypertroffedd cardiaidd a achosir gan ymestyn.
Mae olion cynrychioliadol o bwysau siambr aer, pwysedd siambr hylif, a mesuriadau symudiad meinwe yn cadarnhau bod pwysedd y siambr yn newid pwysedd siambr hylif, gan achosi symudiad cyfatebol o'r sleisen feinwe. b Cromliniau canran ymestyn a chyfradd ymestyn cynrychioliadol ar gyfer adrannau meinwe sydd wedi'u hymestyn fel arfer (oren) a rhai sydd wedi'u gor-ymestyn (glas). c Graff bar sy'n dangos amser cylch (n = 19 sleisen fesul grŵp, o foch gwahanol), amser crebachu (n = 18-19 sleisen fesul grŵp, o foch gwahanol), amser ymlacio (n = 19 sleisen fesul grŵp, o foch gwahanol)), osgled symudiad meinwe (n = 14 sleisen/grŵp, o foch gwahanol), cyflymder systolig brig (n = 14 sleisen/grŵp, o foch gwahanol) a chyfradd ymlacio brig (n = 14 (D0), 15 (D6)) adrannau/grŵpiau) o foch gwahanol), ni ddangosodd prawf-t Myfyriwr dwy-gynffon unrhyw wahaniaeth arwyddocaol mewn unrhyw baramedr, gan nodi bod y paramedrau hyn wedi aros yn gyson yn ystod 6 diwrnod o ddiwylliant gyda gor-foltedd. Mae bariau gwall yn cynrychioli'r cymedr ± gwyriad safonol.
Meintioliad graff bar o grynodiad NT-ProBNP mewn cyfryngau diwylliant o sleisys calon a dyfwyd o dan amodau ymestyn arferol (Norm) neu or-ymestyn (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a D4 MTOS) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir ANOVA dwy ffordd; **p < 0.01 o'i gymharu ag ymestyn arferol). Meintioliad graff bar o grynodiad NT-ProBNP mewn cyfryngau diwylliant o sleisys calon a dyfwyd o dan amodau ymestyn arferol (Norm) neu or-ymestyn (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a D4 MTOS) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir ANOVA dwy ffordd; **p < 0.01 o'i gymharu ag ymestyn arferol).Histogram meintiol o grynodiad NT-ProBNP mewn cyfrwng diwylliant o sleisys calon a dyfwyd o dan amodau ymestyn MT arferol (norm) neu or-ymestyn (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a D4).MTOS) sleisen /grŵp o wahanol foch, perfformir dadansoddiad amrywiant dau ffactor;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 o'i gymharu ag ymestyn arferol). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm) 、 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4) MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01）. a Meintioliad o grynodiad NT-ProBNP mewn sleisys calon wedi'u meithrin o dan amodau ymestyn arferol MT (Norm) neu orymestyn (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) o wahanol ** o'i gymharu ag ymestyn arferol, p < 0.01).histogram Mesur crynodiadau NT-ProBNP mewn sleisys calon a dyfir o dan amodau ymestyn MT arferol (norm) neu or-ymestyn (OS) (n = 4 sleisen/grŵp (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) a D4 MTOS) o foch gwahanol, dadansoddiad amrywiant dwyffordd;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 o'i gymharu ag ymestyn arferol). b Delweddau cynrychioliadol ar gyfer sleisys calon wedi'u staenio â throponin-T a WGA (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celloedd/grŵp o 10 sleisen wahanol o foch gwahanol, perfformir prawf-t Myfyriwr dwy gynffon; ****p < 0.0001 o'i gymharu ag ymestyn arferol). b Delweddau cynrychioliadol ar gyfer sleisys calon wedi'u staenio â throponin-T a WGA (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celloedd/grŵp o 10 sleisen wahanol o foch gwahanol, perfformir prawf-t Myfyriwr dau gynffon; ****p < 0.0001 o'i gymharu ag ymestyn arferol). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и колипроде размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных спон, спрезных срезов от разных спо, хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Delweddau cynrychioliadol o adrannau o'r galon wedi'u staenio â throponin-T ac AZP (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celloedd/grŵp o 10 adran wahanol o foch gwahanol, perfformiwyd prawf-t Myfyriwr dau gynffon; ****p < 0.0001 o'i gymharu â straen arferol). b 用肌钙蛋白-T和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表怼（ MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369 (D6 MTNorm) 细胞/组,两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）. b Delweddau cynrychioliadol o sleisys calon wedi'u staenio â chalcarein-T a WGA (chwith) a maint celloedd (dde) (n = 330 (D6 MTOS), 369 o 10 sleisen wahanol (D6 MTNorm)) Celloedd/cyfradd, prawf t ar gyfer ymestyn arferol, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и коленкераче клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клеткий, Клеткипи, критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Delweddau cynrychioliadol o adrannau o'r galon wedi'u staenio â throponin-T ac AZP (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) o 10 adran wahanol o foch gwahanol) Celloedd/grŵp, maen prawf dau gynffon T y Myfyriwr; ****p < 0.0001 o'i gymharu â straen arferol). c Delweddau cynrychioliadol ar gyfer sleisys calon MTOS diwrnod 0 a diwrnod 6 wedi'u imiwnolabelu ar gyfer troponin-T ac NFATC4 a meintioli trawsleoliad NFATC4 i gnewyllynnau CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf-t Myfyriwr dau gynffon; *p < 0.05). c Delweddau cynrychioliadol ar gyfer sleisys calon MTOS diwrnod 0 a diwrnod 6 wedi'u imiwnolabelu ar gyfer troponin-T ac NFATC4 a meintioli trawsleoliad NFATC4 i gnewyllynnau CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sleisen/grŵp o foch gwahanol, perfformir prawf-t Myfyriwr dau gynffon; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/групрах он выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Delweddau cynrychioliadol ar gyfer adrannau o'r galon ar MTOS 0 a 6 diwrnod, wedi'u labelu'n imiwnolegol ar gyfer troponin-T ac NFATC4, a meintioli trawsleoliad NFATC4 yng nghnewyllyn celloedd ceudodol (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sleisen/grŵp o foch gwahanol) wedi'u perfformio prawf-t Myfyriwr dau gynffon; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 MT = 4 MT切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Delweddau cynrychioliadol o imiwn-labelu calcanin-T a NFATC4 第0天和第6天MTOS sleisys calon, a NFATC4 o wahanol NFATC4 易位至 cnewyllyn cell CM的的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS, 焇) 化时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 a 6 день для имуномаркировки тропонином-Ти стон 4 NFATC оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатыты Стьюдента; *p < 0,05). c Delweddau cynrychioliadol o sleisys calon MTOS ar ddiwrnod 0 a 6 ar gyfer imiwnolabelu troponin-T ac NFATC4 a meintioli trawsleoliad NFATC4 yng nghnewyllyn CM o wahanol foch (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sleisen/grŵp, maen prawf-t dwy gynffon Myfyriwr; *p < 0.05).Mae bariau gwall yn cynrychioli cymedr ± gwyriad safonol.
Mae ymchwil cardiofasgwlaidd gyfieithiadol yn gofyn am fodelau cellog sy'n atgynhyrchu'r amgylchedd cardiaidd yn gywir. Yn yr astudiaeth hon, datblygwyd a nodweddwyd dyfais CTCM a all ysgogi adrannau ultra-denau o'r galon. Mae system CTCM yn cynnwys ysgogiad electromecanyddol cydamserol yn ffisiolegol a chyfoethogi hylif T3 a Dex. Pan gafodd adrannau calon moch eu hamlygu i'r ffactorau hyn, arhosodd eu hyfywedd, eu cyfanrwydd strwythurol, eu gweithgaredd metabolaidd, a'u mynegiant trawsgrifio yr un fath ag mewn meinwe calon ffres ar ôl 12 diwrnod o ddiwylliant. Yn ogystal, gall ymestyn gormodol meinwe'r galon achosi hypertroffedd y galon a achosir gan hyperestyniad. At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi rôl hanfodol amodau diwylliant ffisiolegol wrth gynnal ffenoteip cardiaidd arferol ac yn darparu llwyfan ar gyfer sgrinio cyffuriau.
Mae llawer o ffactorau'n cyfrannu at greu amgylchedd gorau posibl ar gyfer gweithrediad a goroesiad cardiomyocytau. Mae'r rhai mwyaf amlwg o'r ffactorau hyn yn gysylltiedig â (1) rhyngweithiadau rhynggellog, (2) ysgogiad electromecanyddol, (3) ffactorau humoral, a (4) swbstradau metabolaidd. Mae rhyngweithiadau ffisiolegol cell-i-gell yn gofyn am rwydweithiau tri dimensiwn cymhleth o fathau lluosog o gelloedd a gefnogir gan fatrics allgellog. Mae rhyngweithiadau cellog cymhleth o'r fath yn anodd eu hail-greu in vitro trwy gyd-ddiwyllio mathau unigol o gelloedd, ond gellir eu cyflawni'n hawdd gan ddefnyddio natur organotypig adrannau'r galon.
Mae ymestyn mecanyddol ac ysgogiad trydanol cardiomyocytes yn hanfodol ar gyfer cynnal ffenoteip cardiaidd33,34,35. Er bod ysgogiad mecanyddol wedi'i ddefnyddio'n helaeth ar gyfer cyflyru ac aeddfedu hiPSC-CM, mae sawl astudiaeth gain wedi ceisio ysgogi sleisys calon mewn diwylliant yn fecanyddol yn ddiweddar gan ddefnyddio llwytho uniaxial. Mae'r astudiaethau hyn yn dangos bod llwytho mecanyddol uniaxial 2D yn cael effaith gadarnhaol ar ffenoteip y galon yn ystod y diwylliant. Yn yr astudiaethau hyn, llwythwyd rhannau o'r galon naill ai â grymoedd tynnol isometrig17, llwytho awcotonig llinol18, neu ail-grewyd y cylchred cardiaidd gan ddefnyddio adborth trawsddygiwr grym a gyriannau tensiwn. Fodd bynnag, mae'r dulliau hyn yn defnyddio ymestyn meinwe uniaxial heb optimeiddio amgylcheddol, gan arwain at atal llawer o enynnau cardiaidd neu orfynegiant genynnau sy'n gysylltiedig ag ymatebion ymestyn annormal. Mae'r CTCM a ddisgrifir yma yn darparu ysgogiad electromecanyddol 3D sy'n dynwared y cylchred cardiaidd naturiol o ran amser cylchred ac ymestyn ffisiolegol (ymestyn 25%, 40% systole, 60% diastole, a 72 curiad y funud). Er nad yw'r ysgogiad mecanyddol tri dimensiwn hwn ar ei ben ei hun yn ddigonol i gynnal cyfanrwydd meinwe, mae angen cyfuniad o ysgogiad humoral a mecanyddol gan ddefnyddio T3/Dex i gynnal hyfywedd, swyddogaeth a chyfanrwydd meinwe yn ddigonol.
Mae ffactorau humoral yn chwarae rhan bwysig wrth addasu ffenoteip calon oedolyn. Amlygwyd hyn mewn astudiaethau HiPS-CM lle ychwanegwyd T3 a Dex at gyfryngau diwylliant i gyflymu aeddfedu celloedd. Gall T3 ddylanwadu ar gludo asidau amino, siwgrau a chalsiwm ar draws pilenni celloedd36. Yn ogystal, mae T3 yn hyrwyddo mynegiant MHC-α a gostwng MHC-β, gan hyrwyddo ffurfio myofibriliau twitch cyflym mewn cardiomyocytes aeddfed o'i gymharu â myofibriliau twitch araf mewn CM ffetws. Mae diffyg T3 mewn cleifion hypothyroid yn arwain at golli bandiau myofibrilar a chyfradd is o ddatblygiad tôn37. Mae Dex yn gweithredu ar dderbynyddion glwcocorticoid ac mae wedi'i ddangos i gynyddu cyfangadwyedd myocardaidd mewn calonnau wedi'u perfusio ynysig;38 credir bod y gwelliant hwn yn gysylltiedig â'r effaith ar fynediad calsiwm-yrru-blaendal (SOCE)39,40. Yn ogystal, mae Dex yn rhwymo i'w dderbynyddion, gan achosi ymateb mewngellol eang sy'n atal swyddogaeth imiwnedd a llid30.
Mae ein canlyniadau'n dangos bod ysgogiad mecanyddol corfforol (MS) wedi gwella perfformiad cyffredinol y diwylliant o'i gymharu â Ctrl, ond methodd â chynnal hyfywedd, uniondeb strwythurol, a mynegiant cardiaidd dros 12 diwrnod mewn diwylliant. O'i gymharu â Ctrl, gwellodd ychwanegu T3 a Dex at ddiwylliannau CTCM (MT) hyfywedd a chynnal proffiliau trawsgrifio tebyg, uniondeb strwythurol, a gweithgaredd metabolaidd gyda meinwe calon ffres am 12 diwrnod. Yn ogystal, trwy reoli graddfa ymestyn y meinwe, crëwyd model hypertroffedd cardiaidd a achosir gan hyperestyniad gan ddefnyddio STCM, gan ddangos amlochredd y system STCM. Dylid nodi, er bod ailfodelu cardiaidd a ffibrosis fel arfer yn cynnwys organau cyfan y gall eu celloedd sy'n cylchredeg ddarparu'r cytocinau priodol yn ogystal â ffagosytosis a ffactorau ailfodelu eraill, gall adrannau o'r galon ddal i efelychu'r broses ffibrotig mewn ymateb i straen a thrawma. i mewn i myoffibroblastau. Mae hyn wedi'i werthuso o'r blaen yn y model sleisen cardiaidd hwn. Dylid nodi y gellir modiwleiddio paramedrau CTCM trwy newid pwysau/osgled trydanol ac amlder i efelychu llawer o gyflyrau fel tachycardia, bradycardia, a chefnogaeth gylchrediad gwaed mecanyddol (calon heb ei dadlwytho'n fecanyddol). Mae hyn yn gwneud y system yn drwybwn canolig ar gyfer profi cyffuriau. Mae gallu CTCM i fodelu hypertroffedd cardiaidd a achosir gan or-ymdrech yn paratoi'r ffordd ar gyfer profi'r system hon ar gyfer therapi personol. I gloi, mae'r astudiaeth bresennol yn dangos bod ymestyn mecanyddol ac ysgogiad humoral yn hanfodol ar gyfer cynnal diwylliant adrannau meinwe cardiaidd.
Er bod y data a gyflwynir yma yn awgrymu bod CTCM yn blatfform addawol iawn ar gyfer modelu myocardiwm cyfan, mae gan y dull diwylliant hwn rai cyfyngiadau. Prif gyfyngiad diwylliant CTCM yw ei fod yn gosod straen mecanyddol deinamig parhaus ar y sleisys, sy'n atal y gallu i fonitro cyfangiadau sleisys cardiaidd yn weithredol yn ystod pob cylchred. Yn ogystal, oherwydd maint bach adrannau cardiaidd (7 mm), mae'r gallu i werthuso swyddogaeth systolig y tu allan i systemau diwylliant gan ddefnyddio synwyryddion grym traddodiadol yn gyfyngedig. Yn y llawysgrif gyfredol, rydym yn goresgyn y cyfyngiad hwn yn rhannol trwy werthuso foltedd optegol fel dangosydd o swyddogaeth gyfangol. Fodd bynnag, bydd angen gwaith pellach ar y cyfyngiad hwn a gellir mynd i'r afael ag ef yn y dyfodol trwy gyflwyno dulliau ar gyfer monitro swyddogaeth sleisys calon mewn diwylliant yn optegol, megis mapio optegol gan ddefnyddio calsiwm a llifynnau sy'n sensitif i foltedd. Cyfyngiad arall ar CTCM yw nad yw'r model gweithio yn trin straen ffisiolegol (rhaglwyth ac ôl-lwyth). Yn CTCM, ysgogwyd pwysau i gyfeiriadau cyferbyniol i atgynhyrchu ymestyn ffisiolegol 25% mewn diastole (ymestyn llawn) a systole (hyd y crebachiad yn ystod ysgogiad trydanol) mewn meinweoedd mawr iawn. Dylid dileu'r cyfyngiad hwn mewn dyluniadau CTCM yn y dyfodol trwy roi pwysau digonol ar y meinwe gardiaidd o'r ddwy ochr a thrwy gymhwyso'r union berthnasoedd pwysau-cyfaint sy'n digwydd yn siambrau'r galon.
Mae'r ailfodelu a achosir gan or-ymestyn a adroddir yn y llawysgrif hon wedi'i gyfyngu i efelychu signalau hyper-ymestyn hypertroffig. Felly, gall y model hwn helpu wrth astudio signalau hypertroffig a achosir gan ymestyn heb yr angen am ffactorau humoral na niwral (nad ydynt yn bodoli yn y system hon). Mae angen astudiaethau pellach i gynyddu lluosogrwydd CTCM, er enghraifft, cyd-ddiwyllio â chelloedd imiwnedd, ffactorau humoral plasma sy'n cylchredeg, a nerfu pan fydd cyd-ddiwyllio â chelloedd niwronal yn gwella'r posibiliadau o fodelu clefydau gyda CTCM.
Defnyddiwyd tair ar ddeg o foch yn yr astudiaeth hon. Perfformiwyd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn unol â chanllawiau sefydliadol ac fe'u cymeradwywyd gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol Louisville. Cafodd bwa'r aorta ei glampio a chafodd y galon ei pherfwsio ag 1 L o gardioplegia di-haint (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hyd at 7.4); Cadwyd y calonnau mewn toddiant cardioplegig oer iâ nes eu cludo i'r labordy ar rew sydd fel arfer yn <10 munud. Cadwyd y calonnau mewn toddiant cardioplegig oer iâ nes eu cludo i'r labordy ar rew sydd fel arfer yn <10 munud. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обызанию1. Storiwyd calonnau mewn toddiant cardioplegig oer iâ nes eu cludo i'r labordy ar rew, sydd fel arfer yn cymryd <10 munud.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Cadwch y calonnau ar rew cardioplegia nes eu bod yn cael eu cludo i'r labordy ar rew, fel arfer <10 munud.
Datblygwyd y ddyfais CTCM mewn meddalwedd dylunio â chymorth cyfrifiadur (CAD) SolidWorks. Mae'r siambrau diwylliant, y rhannwyr a'r siambrau aer wedi'u gwneud o blastig acrylig clir CNC. Mae'r cylch wrth gefn 7mm o ddiamedr wedi'i wneud o polyethylen dwysedd uchel (HDPE) yn y canol ac mae ganddo rigol O-ring i ddarparu ar gyfer yr O-ring silicon a ddefnyddir i selio'r cyfrwng oddi tano. Mae pilen silica denau yn gwahanu'r siambr diwylliant o'r plât gwahanu. Mae'r bilen silicon wedi'i thorri â laser o ddalen silicon 0.02″ o drwch ac mae ganddi galedwch o 35A. Mae'r gasgedi silicon gwaelod a brig wedi'u torri â laser o ddalen silicon 1/16″ o drwch ac mae ganddyn nhw galedwch o 50A. Defnyddir sgriwiau a chnau asgell dur di-staen 316L ar gyfer clymu'r bloc a chreu sêl aerglos.
Mae bwrdd cylched printiedig (PCB) pwrpasol wedi'i gynllunio i'w integreiddio â system C-PACE-EM. Mae socedi cysylltydd peiriant Swisaidd ar y PCB wedi'u cysylltu ag electrodau graffit gan wifrau copr wedi'u platio ag arian a sgriwiau efydd 0-60 wedi'u sgriwio i'r electrodau. Mae'r bwrdd cylched printiedig wedi'i osod yng nghlawr yr argraffydd 3D.
Mae'r ddyfais CTCM yn cael ei rheoli gan weithredydd niwmatig rhaglenadwy (PPD) sy'n creu pwysau cylchrediad gwaed rheoledig tebyg i gylchred cardiaidd. Wrth i'r pwysau y tu mewn i'r siambr aer gynyddu, mae'r bilen silicon hyblyg yn ehangu i fyny, gan orfodi'r cyfrwng o dan safle'r meinwe. Yna bydd ardal y meinwe yn cael ei hymestyn gan yr alldafliad hwn o hylif, gan efelychu ehangu ffisiolegol y galon yn ystod diastole. Ar anterth ymlacio, cymhwyswyd ysgogiad trydanol trwy electrodau graffit, a leihaodd y pwysau yn y siambr aer ac achosodd grebachiad adrannau meinwe. Y tu mewn i'r bibell mae falf hemostatig gyda synhwyrydd pwysau i ganfod y pwysau yn y system aer. Mae'r pwysau a synhwyrir gan y synhwyrydd pwysau yn cael ei gymhwyso i gasglwr data sy'n gysylltiedig â'r gliniadur. Mae hyn yn caniatáu monitro parhaus o'r pwysau y tu mewn i'r siambr nwy. Pan gyrhaeddwyd y pwysau siambr uchaf (safonol 80 mmHg, 140 mmHg OS), gorchmynnwyd i'r ddyfais caffael data anfon signal i'r system C-PACE-EM i gynhyrchu signal foltedd deuffasig am 2 ms, wedi'i osod i 4 V.
Cafwyd adrannau o'r galon a pherfformiwyd yr amodau diwylliant mewn 6 ffynnon fel a ganlyn: Trosglwyddwyd y calonnau a gasglwyd o'r llestr trosglwyddo i hambwrdd yn cynnwys cardioplegia oer (4°C). Ynyswyd y fentrigl chwith gyda llafn di-haint a'i dorri'n ddarnau o 1-2 cm3. Cysylltwyd y blociau meinwe hyn â chefnogaeth meinwe gyda glud meinwe a'u rhoi mewn baddon meinwe microtome dirgrynol yn cynnwys hydoddiant Tyrode ac a ocsigenwyd yn barhaus (3 g/L o 2,3-bwtanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glwcos (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml o hydoddiant 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml o hydoddiant 1 M), hyd at 1 L ddH2O). Gosodwyd y microtome dirgrynol i dorri sleisys 300 µm o drwch ar amledd o 80 Hz, osgled dirgryniad llorweddol o 2 mm, a chyfradd symud ymlaen o 0.03 mm/s. Amgylchynwyd y baddon meinwe gan iâ i gadw'r hydoddiant yn oer a chynhaliwyd y tymheredd ar 4°C. Trosglwyddwyd adrannau meinwe o'r baddon microtome i faddon deori yn cynnwys hydoddiant Tyrode wedi'i ocsigenu'n barhaus ar iâ nes bod digon o adrannau'n cael eu cael ar gyfer un plât diwylliant. Ar gyfer diwylliannau transwell, atodwyd adrannau meinwe i gefnogaethau polywrethan di-haint 6 mm o led a'u gosod mewn 6 ml o gyfrwng wedi'i optimeiddio (cyfrwng 199, 1x atchwanegiad ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalïaidd a 2X gwrthfiotig-gwrthffyngol). Cymhwyswyd ysgogiad trydanol (10 V, amledd 1.2 Hz) i'r adrannau meinwe trwy'r C-Pace. Ar gyfer amodau TD, ychwanegwyd T3 a Dex ffres ar 100 nM ac 1 μM ym mhob newid cyfrwng. Mae'r cyfrwng yn cael ei ddirlawn ag ocsigen cyn ei ailosod 3 gwaith y dydd. Cafodd adrannau meinwe eu meithrin mewn deorydd ar 37°C a 5% CO2.
Ar gyfer diwylliannau CTCM, gosodwyd adrannau meinwe ar argraffydd 3D wedi'i wneud yn bwrpasol mewn dysgl Petri yn cynnwys hydoddiant Tyrode wedi'i addasu. Mae'r ddyfais wedi'i chynllunio i gynyddu maint sleisen y galon 25% o arwynebedd y cylch cynnal. Gwneir hyn fel nad yw adrannau'r galon yn ymestyn ar ôl cael eu trosglwyddo o hydoddiant Tyrode i'r cyfrwng ac yn ystod diastole. Gan ddefnyddio glud histoacrylig, gosodwyd adrannau 300 µm o drwch ar gylch cynnal 7 mm mewn diamedr. Ar ôl cysylltu'r adrannau meinwe â'r cylch cynnal, torrwch yr adrannau meinwe gormodol i ffwrdd a rhowch yr adrannau meinwe ynghlwm yn ôl i faddon hydoddiant Tyrode ar rew (4°C) nes bod digon o adrannau wedi'u paratoi ar gyfer un ddyfais. Ni ddylai cyfanswm yr amser prosesu ar gyfer pob dyfais fod yn fwy na 2 awr. Ar ôl cysylltu 6 adran meinwe â'u cylchoedd cynnal, cydosodwyd y ddyfais CTCM. Mae siambr ddiwylliant CTCM wedi'i llenwi ymlaen llaw â 21 ml o gyfrwng wedi'i ocsigenu ymlaen llaw. Trosglwyddwch yr adrannau meinwe i'r siambr ddiwylliant a thynnwch unrhyw swigod aer yn ofalus gyda phibed. Yna caiff y darn meinwe ei dywys i'r twll a'i wasgu'n ysgafn i'w le. Yn olaf, rhowch gap yr electrod ar y ddyfais a throsglwyddwch y ddyfais i'r deorydd. Yna cysylltwch y CTCM â'r tiwb aer a'r system C-PACE-EM. Mae'r gweithredydd niwmatig yn agor ac mae'r falf aer yn agor y CTCM. Cafodd y system C-PACE-EM ei ffurfweddu i ddarparu 4 V ar 1.2 Hz yn ystod pacio deu-ffasig am 2 ms. Newidiwyd y cyfrwng ddwywaith y dydd a newidiwyd yr electrodau unwaith y dydd i osgoi cronni graffit ar yr electrodau. Os oes angen, gellir tynnu adrannau meinwe o'u pyllau diwylliant i gael gwared ar unrhyw swigod aer a allai fod wedi syrthio oddi tanynt. Ar gyfer amodau triniaeth MT, ychwanegwyd T3/Dex yn ffres gyda phob newid cyfrwng gyda 100 nM T3 ac 1 μM Dex. Cafodd y dyfeisiau CTCM eu meithrin mewn deorydd ar 37°C a 5% CO2.
I gael llwybrau estynedig o dafelli calon, datblygwyd system gamera arbennig. Defnyddiwyd camera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) gyda lens macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Perfformiwyd delweddu ar dymheredd ystafell ar ôl disodli'r cyfrwng â chyfrwng ffres. Mae'r camera wedi'i osod ar ongl o 51° a recordir fideo ar 30 ffrâm yr eiliad. Yn gyntaf, defnyddiwyd meddalwedd ffynhonnell agored (MUSCLEMOTION43) gydag Image-J i fesur symudiad y dafelli calon. Crëwyd y mwgwd gan ddefnyddio MATLAB (MathWorks, Natick, MA, UDA) i ddiffinio rhanbarthau o ddiddordeb ar gyfer tafelli calon sy'n curo er mwyn osgoi sŵn. Cymhwysir masgiau wedi'u segmentu â llaw i bob delwedd mewn dilyniant ffrâm ac yna'u trosglwyddo i'r ategyn MUSCLEMOTION. Mae Muscle Motion yn defnyddio dwyster cyfartalog y picseli ym mhob ffrâm i fesur ei symudiad o'i gymharu â'r ffrâm gyfeirio. Cofnodwyd data, hidlwyd ef a'i ddefnyddio i fesur amser cylchred ac asesu ymestyn meinwe yn ystod y cylchred cardiaidd. Cafodd y fideo a recordiwyd ei brosesu ar ôl ei brosesu gan ddefnyddio hidlydd digidol cam sero trefn gyntaf. I fesur ymestyn meinwe (brig-i-brig), perfformiwyd dadansoddiad brig-i-brig i wahaniaethu rhwng copaon a phen isafbwyntiau yn y signal a recordiwyd. Yn ogystal, perfformir dad-dueddu gan ddefnyddio polynomial 6ed drefn i ddileu drifft signal. Datblygwyd cod rhaglen yn MATLAB i bennu symudiad meinwe byd-eang, amser cylchred, amser ymlacio, ac amser crebachu (Cod Rhaglen Atodol 44).
Ar gyfer dadansoddi straen, gan ddefnyddio'r un fideos a grëwyd ar gyfer asesu ymestyn mecanyddol, fe wnaethom olrhain dau ddelwedd yn gyntaf yn cynrychioli copaon symudiad (y pwyntiau symudiad uchaf (uchaf) ac isaf (isaf)) yn ôl y feddalwedd MUSCLEMOTION. Yna fe wnaethom segmentu'r rhanbarthau meinwe a chymhwyso math o algorithm cysgodi i'r meinwe segmentu (Ffig. Atodol 2a). Yna rhannwyd y meinwe segmentu yn ddeg is-arwyneb, a chyfrifwyd y straen ar bob arwyneb gan ddefnyddio'r hafaliad canlynol: Straen = (Sup-Sdown)/Sdown, lle mae Sup ac Sdown yn bellteroedd y siâp o gysgodion uchaf ac isaf y ffabrig, yn y drefn honno (Ffig. Atodol .2b).
Cafodd adrannau o'r galon eu gosod mewn 4% paraformaldehyd am 48 awr. Dadhydrwyd y meinweoedd gosodedig mewn 10% a 20% swcros am 1 awr, yna mewn 30% swcros dros nos. Yna cafodd yr adrannau eu mewnosod mewn cyfansoddyn tymheredd torri gorau posibl (cyfansoddyn OCT) a'u rhewi'n raddol mewn baddon isopentan/iâ sych. Storiwch flociau mewnosod OCT ar -80 °C nes eu bod yn gwahanu. Paratowyd sleidiau fel adrannau â thrwch o 8 μm.
I gael gwared ar OCT o adrannau'r galon, cynheswch y sleidiau ar floc gwresogi ar 95 °C am 5 munud. Ychwanegwch 1 ml o PBS at bob sleid a'i ddeori am 30 munud ar dymheredd ystafell, yna treiddiodd yr adrannau trwy osod 0.1% Triton-X mewn PBS am 15 munud ar dymheredd ystafell. Er mwyn atal gwrthgyrff anbenodol rhag rhwymo i'r sampl, ychwanegwch 1 ml o doddiant 3% BSA at y sleidiau a'i ddeori am 1 awr ar dymheredd ystafell. Yna tynnwyd y BSA a golchwyd y sleidiau â PBS. Marciwch bob sampl â phensil. Ychwanegwyd gwrthgyrff cynradd (wedi'u gwanhau 1:200 mewn 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) a throponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dros 90 munud, yna gwrthgyrff eilaidd (wedi'u gwanhau 1:200 mewn 1% BSA) yn erbyn Alexa Fluor 488 y llygoden (Thermo Scientific; #A16079), yn erbyn Alexa Fluor 594 y gwningen (Thermo Scientific; #T6391) am 90 munud ychwanegol. Golchwyd 3 gwaith gyda PBS. I wahaniaethu rhwng staenio targed a chefndir, dim ond yr gwrthgorff eilaidd a ddefnyddiwyd fel rheolydd. Yn olaf, ychwanegwyd staen niwclear DAPI a gosodwyd y sleidiau mewn vectashield (Vector Laboratories) a'u selio â farnais ewinedd. Chwyddiad -x) a microsgop Keyence gyda chwyddiad 40x.
Defnyddiwyd WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ar 5 μg/ml mewn PBS ar gyfer staenio WGA a'i roi ar adrannau sefydlog am 30 munud ar dymheredd ystafell. Yna golchwyd y sleidiau gyda PBS ac ychwanegwyd du Sudan at bob sleid a'i ddeori am 30 munud. Yna golchwyd y sleidiau gyda PBS ac ychwanegwyd cyfrwng mewnosod vectashield. Gwelwyd y sleidiau ar ficrosgop Keyence ar chwyddiad o 40x.
Tynnwyd OCT o'r samplau fel y disgrifiwyd uchod. Ar ôl tynnu'r OCT, trochwch y sleidiau mewn toddiant Bouin dros nos. Yna rinsiwyd y sleidiau â dŵr distyll am 1 awr ac yna eu rhoi mewn toddiant asid aloe fuchsin Bibrich am 10 munud. Yna golchwyd y sleidiau â dŵr distyll a'u rhoi mewn toddiant o 5% ffosffomolybdenwm/5% asid ffosffotwngstig am 10 munud. Heb rinsio, trosglwyddwyd y sleidiau'n uniongyrchol i'r toddiant glas anilin am 15 munud. Yna golchwyd y sleidiau â dŵr distyll a'u rhoi mewn toddiant asid asetig 1% am 2 funud. Sychwyd y sleidiau mewn ethanol 200 N a'u trosglwyddo i xylen. Delweddwyd y sleidiau wedi'u lliwio gan ddefnyddio microsgop Keyence gydag amcan 10x. Mesurwyd canran arwynebedd ffibrosis gan ddefnyddio meddalwedd Keyence Analyzer.
Asesiad Hyfywedd Celloedd MTT CyQUANT™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), rhif catalog V13154, yn ôl protocol y gwneuthurwr gyda rhai addasiadau. Yn benodol, defnyddiwyd dyrnod llawfeddygol gyda diamedr o 6 mm i sicrhau maint meinwe unffurf yn ystod dadansoddiad MTT. Platiwyd meinweoedd yn unigol i mewn i byllau plât 12-byll yn cynnwys swbstrad MTT yn ôl protocol y gwneuthurwr. Caiff yr adrannau eu deori ar 37°C am 3 awr ac mae'r meinwe fyw yn metaboleiddio'r swbstrad MTT i ffurfio cyfansoddyn formazan porffor. Amnewidiwch y toddiant MTT gydag 1 ml DMSO a deori ar 37°C am 15 munud i echdynnu formazan porffor o adrannau'r galon. Gwanhawyd samplau 1:10 mewn DMSO mewn platiau gwaelod clir 96-byll a mesurwyd dwyster lliw porffor ar 570 nm gan ddefnyddio darllenydd plât Cytation (BioTek). Normaleiddiwyd y darlleniadau i bwysau pob sleisen o'r galon.
Cafodd cyfrwng sleisen y galon ei ddisodli â chyfrwng yn cynnwys 1 μCi/ml [5-3H]-glwcos (Moravek Biochemicals, Brea, CA, UDA) ar gyfer assay defnyddio glwcos fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Ar ôl 4 awr o ddeori, ychwanegwch 100 µl o gyfrwng at diwb microcentrifuge agored yn cynnwys 100 µl o 0.2 N HCl. Yna gosodwyd y tiwb mewn tiwb scintillation yn cynnwys 500 μl o dH2O i anweddu [3H]2O am 72 awr ar 37°C. Yna tynnwch y tiwb microcentrifuge o'r tiwb scintillation ac ychwanegwch 10 ml o hylif scintillation. Perfformiwyd cyfrifiadau scintillation gan ddefnyddio dadansoddwr scintillation hylif Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, UDA). Yna cyfrifwyd y defnydd o glwcos gan ystyried gweithgaredd penodol [5-3H]-glwcos, cydbwysedd a chefndir anghyflawn, gwanhau [5-3H]-i glwcos heb ei labelu, ac effeithlonrwydd y cownter fflachio. Mae'r data wedi'i normaleiddio i fàs adrannau'r galon.
Ar ôl homogeneiddio meinwe yn Trizol, ynyswyd RNA o adrannau'r galon gan ddefnyddio'r Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Perfformiwyd paratoi llyfrgell RNAsec, dilyniannu a dadansoddi data fel a ganlyn:
Defnyddiwyd 1 μg o RNA fesul sampl fel deunydd cychwyn ar gyfer paratoi'r llyfrgell RNA. Cynhyrchwyd llyfrgelloedd dilyniannu gan ddefnyddio Pecyn Paratoi Llyfrgell RNA NEBNext UltraTM ar gyfer Illumina (NEB, UDA) yn dilyn argymhellion y gwneuthurwr, ac ychwanegwyd codau mynegai at y dilyniannau priodoledd ar gyfer pob sampl. Yn gryno, purwyd mRNA o gyfanswm yr RNA gan ddefnyddio gleiniau magnetig ynghlwm ag oligoniwcleotidau poly-T. Cynhelir darnio gan ddefnyddio cationau deuwerth ar dymheredd uchel mewn Byffer Adwaith Synthesis Llinyn Cyntaf NEBNext (5X). Syntheseiddiwyd cDNA'r llinyn cyntaf gan ddefnyddio primerau hecsamer ar hap a thranscriptase gwrthdro M-MuLV (RNase H-). Yna syntheseiddir yr ail linyn cDNA gan ddefnyddio polymerase DNA I ac RNase H. Caiff y gorchuddion sy'n weddill eu trosi'n bennau di-fin gan weithgaredd exonuclease/polymerase. Ar ôl adenyleiddio pen 3′ y darn DNA, mae Addasydd NEBNext gyda strwythur dolen hairpin ynghlwm wrtho i'w baratoi ar gyfer hybridio. Ar gyfer dewis darnau cDNA o hyd dewisol 150-200 bp. Purwyd darnau llyfrgell gan ddefnyddio'r system AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, UDA). Yna, defnyddiwyd 3 μl o USER Enzyme (NEB, UDA) gyda cDNA wedi'i ddewis yn ôl maint wedi'i glymu ag addasydd am 15 munud ar 37°C ac yna am 5 munud ar 95°C cyn PCR. Yna perfformiwyd PCR gan ddefnyddio polymerase DNA Phusion High-Fidelity, primerau PCR cyffredinol, a primerau Mynegai (X). Yn olaf, purwyd cynhyrchion PCR (system AMPure XP) ac aseswyd ansawdd y llyfrgell ar system Agilent Bioanalyzer 2100. Yna dilyniannwyd y llyfrgell cDNA gan ddefnyddio dilyniannwr Novaseq. Troswyd ffeiliau delwedd crai o Illumina yn ddarlleniadau crai gan ddefnyddio CASAVA Base Calling. Mae data crai yn cael ei storio mewn ffeiliau fformat FASTQ(fq) sy'n cynnwys dilyniannau darllen a rhinweddau sylfaen cyfatebol. Dewiswch HISAT2 i baru darlleniadau dilyniannu wedi'u hidlo â'r genom cyfeirio Sscrofa11.1. Yn gyffredinol, mae HISAT2 yn cefnogi genomau o unrhyw faint, gan gynnwys genomau sy'n fwy na 4 biliwn o fasau, ac mae gwerthoedd diofyn wedi'u gosod ar gyfer y rhan fwyaf o baramedrau. Gellir alinio darlleniadau clytio o ddata RNA Seq yn effeithlon gan ddefnyddio HISAT2, y system gyflymaf sydd ar gael ar hyn o bryd, gyda'r un cywirdeb neu well nag unrhyw ddull arall.
Mae nifer y trawsgrifiadau yn adlewyrchu'n uniongyrchol lefel mynegiant genynnau. Asesir lefelau mynegiant genynnau gan nifer y trawsgrifiadau (cyfrif dilyniannu) sy'n gysylltiedig â'r genom neu'r exonau. Mae nifer y darlleniadau yn gymesur â lefelau mynegiant genynnau, hyd y genynnau, a dyfnder dilyniannu. Cyfrifwyd FPKM (darnau fesul mil o barau sylfaen o drawsgrifiad wedi'u dilyniannu fesul miliwn o barau sylfaen) a phennwyd gwerthoedd-P mynegiant gwahaniaethol gan ddefnyddio'r pecyn DESeq2. Yna cyfrifwyd y gyfradd darganfod ffug (FDR) ar gyfer pob gwerth P gan ddefnyddio'r dull Benjamini-Hochberg9 yn seiliedig ar y swyddogaeth-R adeiledig “p.adjust”.
Cafodd RNA a ynyswyd o adrannau o'r galon ei drawsnewid yn cDNA ar grynodiad o 200 ng/μl gan ddefnyddio'r cymysgedd SuperScript IV Vilo Master gan Thermo (Thermo, rhif cat. 11756050). Perfformiwyd RT-PCR meintiol gan ddefnyddio plât adwaith tryloyw 384-ffynnon Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, rhif cat. 4483319) a glud optegol microamp (Thermo, rhif cat. 4311971). Roedd y cymysgedd adwaith yn cynnwys 5 µl o gymysgedd Taqman Fast Advanced Master (Thermo, rhif cat. 4444557), 0.5 µl o Taqman Primer a 3.5 µl o H2O wedi'i gymysgu fesul ffynnon. Rhedwyd cylchoedd qPCR safonol a mesurwyd gwerthoedd CT gan ddefnyddio offeryn PCR amser real Quantstudio 5 Applied Biosystems (modiwl 384-ffynnon; rhif cynnyrch A28135). Prynwyd primerau Taqman gan Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Normaleiddiwyd gwerthoedd CT yr holl samplau i'r genyn cadw tŷ GAPDH.
Aseswyd rhyddhau NT-ProBNP i'r cyfryngau gan ddefnyddio'r pecyn NT-ProBNP (mochyn) (Rhif Cat. MBS2086979, MyBioSource) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr. Yn gryno, ychwanegwyd 250 µl o bob sampl a safon mewn dyblyg i bob ffynnon. Yn syth ar ôl ychwanegu'r sampl, ychwanegwch 50 µl o Adweithydd Assay A i bob ffynnon. Ysgwydwch y plât yn ysgafn a'i selio â seliwr. Yna cafodd y tabledi eu deori ar 37°C am 1 awr. Yna sugnwch yr hydoddiant a golchwch y ffynhonnau 4 gwaith gyda 350 µl o hydoddiant golchi 1X, gan ddeori'r hydoddiant golchi am 1-2 funud bob tro. Yna ychwanegwch 100 µl o Adweithydd Assay B fesul ffynnon a'i selio â seliwr plât. Ysgwydwyd y dabled yn ysgafn a'i deori ar 37°C am 30 munud. Anadlwch yr hydoddiant a golchwch y ffynhonnau 5 gwaith gyda 350 µl o hydoddiant golchi 1X. Ychwanegwch 90 µl o doddiant swbstrad i bob twll a seliwch y plât. Deorwch y plât ar 37°C am 10-20 munud. Ychwanegwch 50 µl o Doddiant Stop i bob twll. Mesurwyd y plât ar unwaith gan ddefnyddio darllenydd platiau Cytation (BioTek) wedi'i osod ar 450 nm.
Perfformiwyd dadansoddiadau pŵer i ddewis meintiau'r grwpiau a fydd yn darparu pŵer >80% i ganfod newid absoliwt o 10% yn y paramedr gyda chyfradd gwall Math I o 5%. Perfformiwyd dadansoddiadau pŵer i ddewis meintiau'r grwpiau a fydd yn darparu pŵer >80% i ganfod newid absoliwt o 10% yn y paramedr gyda chyfradd gwall Math I o 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обинару10 абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Perfformiwyd dadansoddiad pŵer i ddewis meintiau grwpiau a fyddai'n darparu pŵer >80% i ganfod newid paramedr absoliwt o 10% gyda chyfradd gwall Math I o 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для иля иля дили абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Perfformiwyd dadansoddiad pŵer i ddewis maint grŵp a fyddai'n darparu pŵer >80% i ganfod newid paramedr absoliwt o 10% a chyfradd gwall math I o 5%.Dewiswyd adrannau meinwe ar hap cyn yr arbrawf. Roedd yr holl ddadansoddiadau'n ddall o ran cyflwr a dim ond ar ôl i'r holl ddata gael ei ddatgodio y cafodd y samplau eu datgodio. Defnyddiwyd meddalwedd GraphPad Prism (San Diego, CA) i gyflawni'r holl ddadansoddiadau ystadegol. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05.对于所有统计数据，p值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05.Perfformiwyd prawf-t Myfyriwr dwy-gynffon ar y data gyda dim ond 2 gymhariaeth. Defnyddiwyd ANOVA unffordd neu ddwyffordd i bennu arwyddocâd rhwng grwpiau lluosog. Wrth gynnal profion ôl-hoc, cymhwyswyd cywiriad Tukey i ystyried cymhariaethau lluosog. Mae gan ddata RNAsec ystyriaethau ystadegol arbennig wrth gyfrifo FDR a p.adjust fel y disgrifir yn yr adran Dulliau.
Am ragor o wybodaeth am ddyluniad astudiaethau, gweler crynodeb yr Adroddiad Ymchwil Natur sydd wedi'i gysylltu â'r erthygl hon.