Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae angen system ddibynadwy in vitro a all atgynhyrchu amgylchedd ffisiolegol y galon yn gywir ar gyfer profi cyffuriau.Mae argaeledd cyfyngedig systemau diwylliant meinwe'r galon ddynol wedi arwain at ddehongliadau anghywir o effeithiau cyffuriau cardiaidd.Yma, rydym wedi datblygu model diwylliant meinwe gardiaidd (CTCM) sy'n ysgogi tafelli calon yn electromecanyddol ac yn cael ei ymestyn yn ffisiolegol yn ystod cyfnodau systolig a diastolig y cylch cardiaidd.Ar ôl 12 diwrnod o ddiwylliant, fe wnaeth y dull hwn wella hyfywedd adrannau'r galon yn rhannol, ond nid oedd yn cadw eu cyfanrwydd strwythurol yn llawn.Felly, ar ôl sgrinio moleciwl bach, gwelsom fod ychwanegu 100 nM triiodothyronine (T3) ac 1 μM dexamethasone (DEX) i'n cyfrwng yn cynnal microstrwythur yr adrannau am 12 diwrnod.Mewn cyfuniad â thriniaeth T3/DEX, roedd y system CTCM yn cynnal proffiliau trawsgrifio, hyfywedd, gweithgaredd metabolig, a chywirdeb strwythurol ar yr un lefel â meinwe'r galon ffres am 12 diwrnod.Yn ogystal, mae ymestyn gormod o feinwe gardiaidd mewn diwylliant yn cymell signalau cardiaidd hypertroffig, gan ddarparu tystiolaeth ar gyfer gallu CTCM i ddynwared amodau hypertroffig a achosir gan ymestyn cardiaidd.I gloi, gall CTCM fodelu ffisioleg a phathoffisioleg y galon mewn diwylliant dros gyfnodau hir, gan alluogi sgrinio cyffuriau dibynadwy.
Cyn ymchwil glinigol, mae angen systemau in vitro dibynadwy a all atgynhyrchu amgylchedd ffisiolegol y galon ddynol yn gywir.Dylai systemau o'r fath ddynwared ymestyn mecanyddol newidiol, cyfradd curiad y galon ac eiddo electroffisiolegol.Defnyddir modelau anifeiliaid yn gyffredin fel platfform sgrinio ar gyfer ffisioleg gardiaidd gyda dibynadwyedd cyfyngedig wrth adlewyrchu effeithiau cyffuriau yn y galon ddynol1,2.Yn y pen draw, mae'r model arbrofol diwylliant meinwe gardiaidd delfrydol (CTCM) yn fodel sy'n hynod sensitif a phenodol ar gyfer amrywiol ymyriadau therapiwtig a ffarmacolegol, gan atgynhyrchu'n gywir ffisioleg a phathoffisioleg y galon ddynol3.Mae absenoldeb system o'r fath yn cyfyngu ar ddarganfod triniaethau newydd ar gyfer methiant y galon4,5 ac mae wedi arwain at gardiotoxicity cyffuriau fel rheswm mawr dros adael y farchnad6.
Dros y degawd diwethaf, mae wyth cyffur nad ydynt yn gardiofasgwlaidd wedi'u tynnu'n ôl o ddefnydd clinigol oherwydd eu bod yn achosi ymestyn cyfwng QT gan arwain at arrhythmias fentriglaidd a marwolaeth sydyn7.Felly, mae angen cynyddol am strategaethau sgrinio preclinical dibynadwy i asesu effeithiolrwydd cardiofasgwlaidd a gwenwyndra.Mae'r defnydd diweddar o gardiomyocytes sy'n deillio o gelloedd bôn-gelloedd (HIPS-CM) a ysgogwyd gan bobl mewn sgrinio cyffuriau a phrofi gwenwyndra yn darparu datrysiad rhannol i'r broblem hon.Fodd bynnag, mae natur anaeddfed HIPS-CMS a diffyg cymhlethdod amlgellog meinwe gardiaidd yn gyfyngiadau mawr ar y dull hwn.Mae astudiaethau diweddar wedi dangos y gellir goresgyn y cyfyngiad hwn yn rhannol trwy ddefnyddio HIPS-CM cynnar i ffurfio hydrogels meinwe cardiaidd yn fuan ar ôl dechrau cyfangiadau digymell a chynyddu ysgogiad trydanol yn raddol dros amser.Fodd bynnag, nid oes gan y microtissues clun-CM hyn briodweddau electroffisiolegol a chontractiol aeddfed y myocardiwm oedolion.Yn ogystal, mae gan feinwe gardiaidd ddynol strwythur mwy cymhleth, sy'n cynnwys cymysgedd heterogenaidd o wahanol fathau o gelloedd, gan gynnwys celloedd endothelaidd, niwronau, a ffibroblastau stromal, wedi'u rhyng -gysylltu gan setiau penodol o broteinau matrics allgellog.Mae'r heterogenedd hwn o boblogaethau nad ydynt yn gardiomyocyte11,12,13 yn y galon mamalaidd oedolion yn rhwystr mawr i fodelu meinwe gardiaidd gan ddefnyddio mathau o gelloedd unigol.Mae'r prif gyfyngiadau hyn yn pwysleisio pwysigrwydd datblygu dulliau ar gyfer diwyllio meinwe myocardaidd gyfan o dan amodau ffisiolegol a phatholegol.
Mae rhannau tenau diwylliedig (300 µm) o'r galon ddynol wedi profi i fod yn fodel addawol o myocardiwm dynol cyfan.Mae'r dull hwn yn darparu mynediad i system amlgellog 3D gyflawn sy'n debyg i feinwe'r galon ddynol.Fodd bynnag, tan 2019, roedd y defnydd o adrannau diwylliedig y galon wedi'i gyfyngu gan oroesiad byr (24 h) diwylliant.Mae hyn oherwydd nifer o ffactorau gan gynnwys diffyg ymestyn corfforol-fecanyddol, y rhyngwyneb aer-hylif, a'r defnydd o gyfryngau syml nad ydynt yn cefnogi anghenion meinwe gardiaidd.Yn 2019, dangosodd sawl grŵp ymchwil y gall ymgorffori ffactorau mecanyddol mewn systemau diwylliant meinwe gardiaidd ymestyn bywyd diwylliant, gwella mynegiant cardiaidd, a dynwared patholeg gardiaidd.Mae dwy astudiaeth cain 17 a 18 yn dangos bod llwytho mecanyddol uniaxial yn cael effaith gadarnhaol ar ffenoteip cardiaidd yn ystod diwylliant.Fodd bynnag, ni ddefnyddiodd yr astudiaethau hyn lwyth ffisegol-fecanyddol deinamig tri dimensiwn y cylch cardiaidd, gan fod adrannau'r galon wedi'u llwytho â naill ai grymoedd tynnol isometrig 17 neu lwyth auxotonig llinol 18.Arweiniodd y dulliau hyn o ymestyn meinweoedd at atal llawer o enynnau cardiaidd neu or -iselder genynnau sy'n gysylltiedig ag ymatebion ymestyn annormal.Yn nodedig, Pitoulis et al.19 Datblygodd faddon diwylliant tafell y galon ddeinamig ar gyfer ailadeiladu beiciau cardiaidd gan ddefnyddio adborth transducer grym a gyriannau tensiwn.Er bod y system hon yn caniatáu ar gyfer modelu beiciau cardiaidd in vitro mwy cywir, mae cymhlethdod a thrwybwn isel y dull yn cyfyngu cymhwysiad y system hon.Yn ddiweddar, mae ein labordy wedi datblygu system ddiwylliant symlach gan ddefnyddio ysgogiad trydanol a chyfrwng optimized i gynnal hyfywedd rhannau o feinwe mochyn a chalon ddynol am hyd at 6 diwrnod20,21.
Yn y llawysgrif gyfredol, rydym yn disgrifio model diwylliant meinwe gardiaidd (CTCM) gan ddefnyddio rhannau o'r galon mochyn sy'n ymgorffori ciwiau humoral i ailadrodd ffisioleg gardiaidd tri dimensiwn a gwrandawiad pathoffisiolegol yn ystod y cylch cardiaidd.Gall y CTCM hwn gynyddu cywirdeb rhagfynegiad cyffuriau cyn-glinigol i lefel na chyflawnwyd erioed o'r blaen trwy ddarparu system gardiaidd ganol trwybwn cost-effeithiol sy'n dynwared ffisioleg/pathoffisioleg y galon mamalaidd ar gyfer profi cyffuriau cyn-glinigol.
Mae signalau mecanyddol hemodynamig yn chwarae rhan hanfodol wrth gynnal swyddogaeth cardiomyocyte in vitro 22,23,24.Yn y llawysgrif gyfredol, rydym wedi datblygu CTCM (Ffigur 1A) a all ddynwared yr amgylchedd cardiaidd oedolion trwy gymell ysgogiad trydanol a mecanyddol ar amleddau ffisiolegol (1.2 Hz, 72 curiad y funud).Er mwyn osgoi ymestyn meinwe gormodol yn ystod diastole, defnyddiwyd dyfais argraffu 3D i gynyddu maint meinwe 25% (Ffig. 1 B).Amserwyd pacio trydanol a achoswyd gan y system C-Pace i ddechrau 100 ms cyn systole gan ddefnyddio system caffael data i atgynhyrchu'r cylch cardiaidd yn llawn.Mae'r system diwylliant meinwe yn defnyddio actuator niwmatig rhaglenadwy (Peirianneg LB, yr Almaen) i ehangu pilen silicon hyblyg yn gylchol i achosi ehangu'r tafelli calon yn y siambr uchaf.Roedd y system wedi'i chysylltu â llinell aer allanol trwy transducer gwasgedd, a oedd yn ei gwneud hi'n bosibl addasu'r pwysau (± 1 mmHg) ac amser (± 1 ms) yn gywir (Ffig. 1 C).
A atodi'r adran meinwe i'r cylch cymorth 7 mm, a ddangosir mewn glas, y tu mewn i siambr ddiwylliant y ddyfais.Mae'r siambr ddiwylliant wedi'i gwahanu o'r siambr aer gan bilen silicon hyblyg tenau.Rhowch gasged rhwng pob siambr i atal gollyngiadau.Mae caead y ddyfais yn cynnwys electrodau graffit sy'n darparu ysgogiad trydanol.b Cynrychiolaeth sgematig o'r ddyfais meinwe fawr, cylch tywys a chylch cymorth.Rhoddir yr adrannau meinwe (brown) ar y ddyfais rhy fawr gyda'r cylch tywys wedi'i gosod yn y rhigol ar ymyl allanol y ddyfais.Gan ddefnyddio'r canllaw, gosodwch y cylch cymorth yn ofalus wedi'i orchuddio â glud acrylig meinwe dros y rhan o feinwe gardiaidd.C Graff yn dangos amser ysgogiad trydanol fel swyddogaeth pwysau siambr aer a reolir gan actuator niwmatig rhaglenadwy (PPD).Defnyddiwyd dyfais caffael data i gydamseru ysgogiad trydanol gan ddefnyddio synwyryddion pwysau.Pan fydd y pwysau yn y siambr ddiwylliant yn cyrraedd y trothwy penodol, anfonir signal pwls i'r C-Pace-EM i sbarduno ysgogiad trydanol.D Delwedd o bedwar CTCM wedi'u gosod ar silff deorydd.Mae pedwar dyfais wedi'u cysylltu ag un PPD trwy gylched niwmatig, a mewnosodir synwyryddion pwysau yn y falf hemostatig i fonitro'r pwysau yn y gylched niwmatig.Mae pob dyfais yn cynnwys chwe adran meinwe.
Gan ddefnyddio un actuator niwmatig, roeddem yn gallu rheoli 4 dyfais CTCM, a gallai pob un ohonynt ddal 6 adran meinwe (Ffig. 1 D).Yn CTCM, mae'r pwysedd aer yn y siambr aer yn cael ei drawsnewid yn bwysedd cydamserol yn y siambr hylif ac yn cymell ehangu ffisiolegol y sleisen galon (Ffigur 2A a ffilm atodol 1).Gwerthusiad o ymestyn meinwe ar 80 mm Hg.Celf.yn dangos ymestyn adrannau meinwe 25% (Ffig. 2 B).Dangoswyd bod y darn canrannol hwn yn cyfateb i hyd sarcomere ffisiolegol o 2.2–2.3 µm ar gyfer contractadwyedd adran gardiaidd arferol17,19,25.Aseswyd symud meinwe gan ddefnyddio gosodiadau camera wedi'u haddasu (Ffigur Atodol 1).Roedd osgled a chyflymder symud meinwe (Ffig. 2 C, D) yn cyfateb i ymestyn yn ystod y cylch cardiaidd ac amser yn ystod systole a diastole (Ffig. 2 B).Arhosodd a chyflymder meinwe gardiaidd yn ystod crebachu ac ymlacio yn gyson am 12 diwrnod mewn diwylliant (Ffig. 2F).Er mwyn gwerthuso effaith ysgogiad trydanol ar gontractadwyedd yn ystod diwylliant, gwnaethom ddatblygu dull ar gyfer pennu anffurfiad gweithredol gan ddefnyddio algorithm cysgodi (Ffig Atodol Ffig. 2 A, B) ac roeddem yn gallu gwahaniaethu rhwng anffurfiadau ag ysgogiad trydanol a hebddo.Yr un rhan o'r galon (Ffig. 2f).Yn rhanbarth symudol y toriad (R6-9), roedd y foltedd yn ystod ysgogiad trydanol 20% yn uwch nag yn absenoldeb ysgogiad trydanol, sy'n dynodi cyfraniad ysgogiad trydanol i swyddogaeth gontractiol.
Mae olion cynrychioliadol pwysau siambr aer, pwysau siambr hylif, a mesuriadau symud meinwe yn cadarnhau bod pwysau siambr yn newid pwysau siambr hylif, gan achosi symudiad cyfatebol o'r sleisen meinwe.B Olion Cynrychioliadol o Ganran Ymestyn (Glas) o Adrannau Meinwe sy'n cyfateb i ymestyn y cant (oren).C Mae symudiad mesuredig y dafell gardiaidd yn gyson â chyflymder mesuredig y cynnig.(ch) taflwybrau cynrychioliadol mudiant cylchol (llinell las) a chyflymder (llinell dot oren) mewn tafell o'r galon.E Meintioli amser beicio (n = 19 sleisen i bob grŵp, o wahanol foch), amser crebachu (n = 19 sleisen i bob grŵp), amser ymlacio (n = 19 tafell i bob grŵp, o wahanol foch), symud meinwe (n = 25).tafelli)/grŵp o wahanol foch), cyflymder systolig brig (n = 24 (d0), 25 (d12) tafelli/grŵp o wahanol foch) a chyfradd ymlacio brig (n = 24 (d0), 25 (d12) sleisys/grŵp/grŵp o wahanol foch).Ni ddangosodd prawf t Myfyrwyr dwy gynffon unrhyw wahaniaeth sylweddol mewn unrhyw baramedr.f Dadansoddiad straen cynrychioliadol Olion adrannau meinwe gydag ysgogiad trydanol (coch) a heb (las), deg maes rhanbarthol o adrannau meinwe o'r un adran.Mae'r paneli gwaelod yn dangos meintioli'r gwahaniaeth canrannol mewn straen mewn adrannau meinwe gyda a heb ysgogiad trydanol mewn deg maes o wahanol adrannau. (n = 8 sleisen/grŵp o wahanol foch, perfformir prawf t myfyrwyr dwy gynffon; **** p <0.0001, ** p <0.01,*p <0.05). (n = 8 sleisen/grŵp o wahanol foch, perfformir prawf t myfyrwyr dwy gynffon; **** p <0.0001, ** p <0.01,*p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, прововодитсlureaidd двусторонн ddwys t-критерий стюденwaith; **** p <0,0001, ** p <0,000. (n = 8 adran/grŵp o wahanol foch, prawf-t Myfyriwr dwy gynffon; **** p <0.0001, ** p <0.01,*p <0.05). （N = 8 片/组 ， 来自 不同 的 猪 猪 ， 进行 双尾 学生 t 检验 ； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ，*p <0.05）。。 （N = 8 片/组 ， 来自 不同 的 猪 猪 ， 进行 双尾 学生 t 检验 ； **** p <0.0001 ， ** p <0.01 ，*p <0.05）。。 (n = 8 срезов/группTy, от разных свиней, двусторонний критерий стююдента; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,. (n = 8 adran/grŵp, o wahanol foch, prawf t dwy gynffon; **** p <0.0001, ** p <0.01,*p <0.05).Mae bariau gwall yn cynrychioli'r gwyriad cymedrig ± safonol.
Yn ein system diwylliant tafell y galon biomimetig statig blaenorol [20, 21], gwnaethom gynnal hyfywedd, swyddogaeth a chywirdeb strwythurol tafelli calon am 6 diwrnod trwy gymhwyso ysgogiad trydanol ac optimeiddio'r cyfansoddiad canolig.Fodd bynnag, ar ôl 10 diwrnod, gostyngodd y ffigurau hyn yn sydyn.Byddwn yn cyfeirio at adrannau a ddiwyllir yn ein System Diwylliant Biomimetig Statig blaenorol 20, 21 Amodau Rheoli (CTRL) a byddwn yn defnyddio ein cyfrwng a optimeiddiwyd yn flaenorol fel cyflyrau a diwylliant MC o dan ysgogiad mecanyddol a thrydanol ar yr un pryd (CTCM).Galwyd.Yn gyntaf, gwnaethom benderfynu nad oedd ysgogiad mecanyddol heb ysgogiad trydanol yn ddigonol i gynnal hyfywedd meinwe am 6 diwrnod (Ffig Atodol Ffig. 3 A, B).Yn ddiddorol, gyda chyflwyniad ysgogiad ffisio-fecanyddol a thrydanol gan ddefnyddio STCM, arhosodd hyfywedd adrannau 12 diwrnod y galon yr un fath ag yn adrannau ffres y galon o dan amodau MS, ond nid o dan amodau CTRL, fel y dangosir gan ddadansoddiad MTT (Ffig. 1).3a).Mae hyn yn awgrymu y gall ysgogiad mecanyddol ac efelychu'r cylch cardiaidd gadw adrannau meinwe yn hyfyw am ddwywaith cyhyd ag yr adroddwyd yn ein system diwylliant statig flaenorol.Fodd bynnag, dangosodd asesiad o gyfanrwydd strwythurol adrannau meinwe trwy imiwnolabelio troponin cardiaidd T a Connexin 43 fod mynegiant Connexin 43 yn sylweddol uwch mewn meinweoedd MC ar ddiwrnod 12 nag mewn rheolyddion ar yr un diwrnod.Fodd bynnag, ni chynhaliwyd mynegiant unffurf Connexin 43 a ffurfiad Z-disg yn llawn (Ffig. 3 B).Rydym yn defnyddio fframwaith deallusrwydd artiffisial (AI) i feintioli uniondeb strwythurol meinwe26, piblinell ddysgu ddwfn wedi'i seilio ar ddelwedd yn seiliedig ar troponin-T a staenio connexin43 i feintioli cyfanrwydd strwythurol a fflwroleuedd sleision y galon yn awtomatig o ran cryfder cryfder lleoleiddio.Mae'r dull hwn yn defnyddio rhwydwaith niwral argyhoeddiadol (CNN) a fframwaith dysgu dwfn i feintioli cyfanrwydd strwythurol meinwe gardiaidd yn ddibynadwy mewn modd awtomataidd a diduedd, fel y disgrifir yn y cyfeiriad.26. Dangosodd meinwe MC well tebygrwydd strwythurol i ddiwrnod 0 o'i gymharu ag adrannau rheoli statig.Yn ogystal, datgelodd staenio trichrom Masson ganran sylweddol is o ffibrosis o dan amodau MS o'i gymharu ag amodau rheoli ar ddiwrnod 12 o ddiwylliant (Ffig. 3 C).Er bod CTCM wedi cynyddu hyfywedd adrannau meinwe'r galon ar ddiwrnod 12 i lefel debyg i feinwe'r galon ffres, ni wnaeth wella cyfanrwydd strwythurol adrannau'r galon yn sylweddol.
Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd MTT tafelli calon ffres (D0) neu ddiwylliant sleisys y galon am 12 diwrnod naill ai mewn diwylliant statig (D12 CTRL) neu yn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 PROFIADAU AC. 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl). Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd MTT tafelli calon ffres (D0) neu ddiwylliant sleisys y galon am 12 diwrnod naill ai mewn diwylliant statig (D12 CTRL) neu yn CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 PROFIADAU AC. 0.01 o'i gymharu â D12 Ctrl).Mae'r histogram yn dangos meintioli hyfywedd adrannau calon ffres MTT (D0) neu ddiwylliant adrannau'r galon am 12 diwrnod mewn naill ai diwylliant statig (rheolaeth D12) neu CTCM (D12 MC) (n = 18 (d0), rheolaeth 15 (rheolaeth D12)), 12 (d12 mc) adrannau/grŵp o berfformiadau gwahanol, a pherfformiad gwahanol, un ano.#### p <0,0001 по сравнению с d0 и ** p <0,01 по сравнению с d12 ctrl). #### p <0.0001 o'i gymharu â d0 a ** p <0.01 o'i gymharu â d12 ctrl). A 条形图 显示 在 静态 培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (d0), 15 (d12 ctrl) 中 新鲜 心脏 切片 切片 (d0) 或 心脏 心脏 切片 培养 培养 12 天 的 的 的 活力 的 的 量化 ， ， ， ， ， ， ， ， 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 量化 的 的 量化 量化 的 的 量化 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的相比 ， #### p <0.0001 ， 与 d12 ctrl 相比 ， ** p <0.01)。 A 条形图 显示 在 静态 培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中 新鲜 心脏 心脏 切片 (D0) ， 来自 不同 不同 猪 的 12 (d12 mc) 切片 组 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 组 组 ， 组 ， 组 ， 组 组 组 ，相比 ， ** p。)histogram yn dangos meintioli hyfywedd MTT yn adrannau ffres y galon (D0) neu adrannau'r galon a ddiwyllir am 12 diwrnod mewn diwylliant statig (rheolaeth D12) neu CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (rheolaeth D12)), 12 (D12 MC) Adrannau/grŵp o wahanol Pigs, Profi One-Way;#### p <0,0001 по сравнению с d0, ** p <0,01 по сравнению с d12 ctrl). #### p <0.0001 o'i gymharu â d0, ** p <0.01 o'i gymharu â d12 ctrl).B troponin-T (gwyrdd), connexin 43 (coch) a dapi (glas) yn adrannau'r galon sydd wedi'u hynysu'n ffres (D0) neu adrannau'r galon a ddiwyllir o dan amodau statig (Ctrl) neu amodau CTCM (MC) am 12 diwrnod) o ddelweddau immunofluorescence cynrychioliadol (graddfa blank = 100 µm). Meintioldeb deallusrwydd artiffisial o uniondeb strwythurol meinwe'r galon (n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) sleisys/grŵp yr un o wahanol fochyn, perfformir prawf ANOVA unffordd; #### P <0.0001 o'i gymharu â d0 a ***** p <0.0001 CT1 CT1 o'i gymharu. Meintioldeb deallusrwydd artiffisial o uniondeb strwythurol meinwe'r galon (n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), sleisys 5 (d12 mc)/grŵp yr un o wahanol foch, perfformir prawf ANOVA unffordd; #### P <0.0001 o'i gymharu â d0 a ***** p <0.000 p <0.000 ctro. Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искуствевеннны d112 mc) 5 (d12 (D112 (D112 (n = 7 (D1 груп от разных свиней, проводится одновкторный тест anova; #### p <0,0001 по п сравнению с D0 п D0 и*** p <D0** P <D0** P <D0** P <D0** P <D0** P <DE Meintioli cyfanrwydd strwythurol meinwe gardiaidd gan ddeallusrwydd artiffisial (n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) adrannau/grwpiau o wahanol foch, perfformiwyd prawf ANOVA unffordd; #### p <0. 0.0001 vs. gyda d0 a *** 0 0. 000 p <0.000 p <000 p <000 p <000 p <DIM1000 P <000 P <DIM1000 P <DIG 0.人工 智能量化 心脏 心脏 组织 结构 完整性 （n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) sleisys/grŵp yr un o wahanol fochyn, prawf ANOVA unffordd; #### p <0.0001 与 d0 相比 ， ， **** p <0.0001 与 d12 ctrl 相比 相比 相比） 相比 相比人工 智能量化 心脏 心脏 组织 结构 完整性 （n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) sleisys/grŵp yr un o wahanol foch, prawf ANOVA unffordd; #### p <0.0001 与 d0 相比 ， ， **** p <0.0001 与 相比 相比。。。。。。 Искуствевеее интеллект для количественннной оценки структурной целостности серeic дrock тr (d 1 c) групрep каждой из разных свиней, односторонн ddwys тест anova; #### p <0,0001 vs d0 для с срав nadе *** p <0,0001 ctr пr пr пr iwt. Deallusrwydd artiffisial i feintioli cyfanrwydd strwythurol meinwe gardiaidd (n = 7 (d0), 7 (d12 ctrl), 5 (d12 mc) adrannau/grŵp yr un o wahanol foch, prawf ANOVA unffordd; #### p <0.0001 vs .d0 ar gyfer cymhariaeth ** 0 0.************************* pP PP PP POP. C Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) ar gyfer tafelli calon wedi'u staenio â staen trichrom Masson (graddfa noeth = 500 µm) (n = 10 sleisen/grŵp yr un o wahanol fochyn, perfformir prawf ANOVA unffordd; #### P <0.0001 o'i gymharu â D0 a *** P <0.001 CTROP o gymharu â D12 CTr. C Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) ar gyfer sleisys y galon wedi'u staenio â staen trichrom Masson (graddfa noeth = 500 µm) (n = 10 sleisen/grŵp yr un o wahanol foch, perfformir prawf ANOVA unffordd; ##### p <0.0001 o'i gymharu â D0 a *** p <0.001 Ctr. c репрезентативные изображения (слева) и количественнннная оценка (справа) срххсермuch: тuch оuch оыuch смuch она (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/групу от разных свиней, выполл пrр оrр оChOut оCT# нию с D0 и *** p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). C Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) adrannau'r galon wedi'u staenio â staen trichrom Masson (graddfa heb ei gorchuddio = 500 µm) (n = 10 adran/grŵp o wahanol foch, perfformiwyd prawf ANOVA unffordd; #### p <0 .0001 o'i gymharu â D0 ac *** p <0.001 o'i gymharu â D12 ctrl). C 用 Masson 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 切片 的 代表性 图像 （左） 和 和 （（右） （（= 500 µm） （N = 10 个 切片/组 组 ， ， 每 组 来自 来自 不同 的 的 与 测试 与 测试 测试 ， 与 测试 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与l 相比）。 C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （（左 左） 量化 （（右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 µ µm） （N = 10 个 切片 组 组 组 每 组 来自 不同 不同 猪 ， 进行 进行 ， ， ， 测试 与 与 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， TRL 相比）。 C Delweddau cynrychioliadol (chwith) a meintioli (dde) adrannau'r galon wedi'u staenio â staen trichrom Masson (gwag = 500 µm) (n = 10 adran/grŵp, pob un o fochyn gwahanol, wedi'i brofi gan ddadansoddiad unffordd o amrywiant; #### p <p <0.0001 o'i gymharu â d0, *** p <0.001 o'i gymharu â D12 o'i gymharu â D12 CT.Mae bariau gwall yn cynrychioli'r gwyriad cymedrig ± safonol.
Gwnaethom ddamcaniaethu, trwy ychwanegu moleciwlau bach at y cyfrwng diwylliant, y gallai cyfanrwydd cardiomyocyte gael ei wella a lleihau datblygiad ffibrosis yn ystod diwylliant CTCM.Felly gwnaethom sgrinio am foleciwlau bach gan ddefnyddio ein diwylliannau rheolaeth statig20,21 oherwydd y nifer fach o ffactorau dryslyd.Dewiswyd dexamethasone (dex), triiodothyronine (T3), a SB431542 (SB) ar gyfer y sgrin hon.Mae'r moleciwlau bach hyn wedi'u defnyddio o'r blaen mewn diwylliannau HIPSC-CM i gymell aeddfedu cardiomyocytes trwy gynyddu hyd sarcomere, tiwbiau T, a chyflymder dargludiad.Yn ogystal, gwyddys bod Dex (glucocorticoid) a SB yn atal llid29,30.Felly, gwnaethom brofi a fyddai cynnwys un neu gyfuniad o'r moleciwlau bach hyn yn gwella cyfanrwydd strwythurol adrannau'r galon.Ar gyfer sgrinio cychwynnol, dewiswyd dos pob cyfansoddyn yn seiliedig ar y crynodiadau a ddefnyddir yn gyffredin mewn modelau diwylliant celloedd (1 μM DEX27, 100 nM T327, a 2.5 μM SB31).Ar ôl 12 diwrnod o ddiwylliant, arweiniodd y cyfuniad o T3 a Dex at gyfanrwydd strwythurol cardiomyocyte gorau posibl ac ailfodelu ffibrog lleiaf posibl (Ffigurau Atodol 4 a 5).Yn ogystal, roedd defnyddio'r crynodiadau dwbl neu ddwbl y crynodiadau hyn o T3 a Dex yn cynhyrchu effeithiau niweidiol o gymharu â chrynodiadau arferol (Ffig Atodol. 6a, b).
Ar ôl sgrinio cychwynnol, gwnaethom berfformio cymhariaeth ben-i-ben o 4 cyflwr diwylliant (Ffigur 4a): Ctrl: adrannau'r galon a ddiwyllir yn ein diwylliant statig a ddisgrifiwyd yn flaenorol gan ddefnyddio ein cyfrwng optimized;20.21 TD: Ychwanegodd T3 a Ctrl S Dex ddydd Mercher;MC: Adrannau'r galon a ddiwyllir yn CTCM gan ddefnyddio ein cyfrwng a optimeiddiwyd o'r blaen;a MT: Ychwanegwyd CTCM gyda T3 a Dex at y cyfrwng.Ar ôl 12 diwrnod o dyfu, arhosodd hyfywedd meinweoedd MS a MT yr un fath ag mewn meinweoedd ffres a aseswyd gan assay MTT (Ffig. 4 B).Yn ddiddorol, ni arweiniodd ychwanegu T3 a DEX at ddiwylliannau Transwell (TD) at welliant sylweddol mewn hyfywedd o'i gymharu ag amodau CTRL, gan nodi rôl bwysig ysgogiad mecanyddol wrth gynnal hyfywedd adrannau'r galon.
Diagram dylunio arbrofol sy'n darlunio'r pedwar cyflwr diwylliant a ddefnyddir i werthuso effeithiau ysgogiad mecanyddol ac ychwanegiad T3/DEX ar gyfrwng am 12 diwrnod. B Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd 12 diwrnod ar ôl diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, a MT) o'i gymharu â sleisys y galon ffres (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) Perfformiad o wahanol Pigs, Pigs One One Pigs, Pigs One Pigs, Pigs One, Slices/. i d0 a ** p <0.01 o'i gymharu â d12 ctrl). B Mae graff bar yn dangos meintioli hyfywedd 12 diwrnod ar ôl diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, a MT) o'i gymharu â sleisys y galon ffres (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) Perfformiad o wahanol Pigs, Pigs One One Pigs, Pigs One Pigs, Pigs One, Slices/. i d0 a ** p <0.01 o'i gymharu â d12 ctrl). b гистограма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 д д пORellau п tros Com рования (контроль, td, mc и mt) по сравнению со свежими срезами сердца (d0) (d0) (n = 18 (d0), 12 (d12 ctr12 ctr у от разных свиней, проводится односторонн ddwys тест anova; #### p <0,0001, ### p <0,001 по с DROCT). B Mae graff y bar yn dangos meintioli hyfywedd ar 12 diwrnod ar ôl diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (rheolaeth, TD, MC, a MT) o'i gymharu ag adrannau ffres y galon (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, a D12 MT),#1 0. a ** p <0.01 trwy o'i gymharu â D12 Ctrl). B 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 和 和 不同 猪 猪### p <0.001 与 d0 相比 ， ** p <0.01 与 d12 控制））。。B 4 12 (D12 MC) B гистограма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, td, mc и mt) пO с со£ с соver 0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (d12 mc) срезы/группа, одностороронн ddwys т п001, п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п пOLOOLGE; ** p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram yn dangos pob un o'r 4 amod diwylliant (rheolaeth, TD, MC a MT) o'i gymharu ag adrannau ffres y galon (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), o wahanol foch 12 (D12 MC) adrannau/grŵp anova 1 1, PROFIAD ANA . C Mae graff bar yn dangos meintioli fflwcs glwcos 12 diwrnod ar ôl diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, a MT) o'i gymharu â sleisys calon ffres (D0) (n = 6 sleisen/grŵp o wahanol foch, perfformir prawf ANOVA unffordd; ### p <0.001, o'i gymharu â d0 a **t. C Mae graff bar yn dangos meintioli fflwcs glwcos 12 diwrnod ar ôl diwylliant ym mhob un o'r 4 amod diwylliant (Ctrl, TD, MC, a MT) o'i gymharu â sleisys calon ffres (D0) (n = 6 sleisen/grŵp o wahanol foch, perfformir prawf ANOVA unffordd; ### p <0.001, o'i gymharu â d0 a **t. c гистогррррам iddo показывает количественую оценку потока глюкозы через 12 дней посettр кrdod к tra ания (контроль, td, mc и mt) по сравнению со свежими срезами сердца (d0) (d0) (n = 6 срезоutлutлutлutлutдouve гOut гOut г гOut грets няется тест anova; ### p <0,001 по сравнению с d0 и *** p <0,001 по сравнению с d12 ctrl). Mae h histogram yn dangos meintioli fflwcs glwcos 12 diwrnod ar ôl diwylliant o dan bob un o'r 4 amod diwylliant (rheolaeth, TD, MC a MT) o'i gymharu ag adrannau ffres y galon (D0) (n = 6 adran/grŵp o wahanol foch, mae prawf ANOVA unffordd wedi'i berfformio; ### p <0.001 o'i gymharu â D0 a *** p <0.001 o'i gymharu â D1 2 CTr. C 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 与 新鲜 心脏 切片 (D0) 相比 ， 培养 培养 后 12 天 的 葡萄糖 通量 定量 定量 定量 （N = 6 片/组 ， ， ， 来自 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 来自 来自 ， ， 来自 来自 ， ， ， 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 来自 ， ， 来自 来自 来自 ， ， ， ， ， ， ， ， 与2 Ctrl 相比）。。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（Ctrl 、 TD 、 MC 和 MT） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片 ， 相比 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （（N = 6 片/组 ， ， 来自 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 来自 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，相比 ， *** P <0.001 与 D12 Ctrl 相比）。。 c гистограма, показывающая количественнную оценку потока глюкозы через 12 дней п п llwyr кrуou tewch дOutлrettлutв ования (контроль, TD, mc и mt) по сравнению со свежими срезами сердца (d0) (n = 6 срезров гutу оuch helaeth, оuch helaeth, орuch helaeth, ли проведены тесты anova; ### p <0,001 по сравнению с d0, *** p <0,001 по с сравнению с d12 (контроль). C histogram yn dangos meintioli fflwcs glwcos ar 12 diwrnod ar ôl diwylliant ar gyfer pob un o'r 4 amod diwylliant (rheolaeth, TD, MC, a MT) o'i gymharu ag adrannau ffres y galon (D0) (n = 6 adran/grŵp, o wahanol foch, unochrog oedd profion ANOVA yn cael eu perfformio, ### p <0.001 o'i gymharu â D0, **r cymharol i 0.D Lleiniau dadansoddi straen o feinweoedd ffres (glas), diwrnod 12 MC (gwyrdd), a diwrnod 12 MT (coch) ar ddeg pwynt meinwe ranbarthol (n = 4 tafell/grŵp, prawf ANOVA unffordd; nid oedd gwahaniaeth arwyddocaol rhwng grwpiau).E Volcano Plot yn dangos genynnau a fynegir yn wahanol yn adrannau ffres y galon (D0) o gymharu ag adrannau'r galon a ddiwyllir o dan amodau statig (Ctrl) neu o dan amodau MT (MT) am 10-12 diwrnod.f Map gwres genynnau sarcomere ar gyfer adrannau'r galon a ddiwyllir o dan bob un o'r amodau diwylliant.Mae bariau gwall yn cynrychioli'r gwyriad cymedrig ± safonol.
Mae dibyniaeth metabolaidd ar y switsh o ocsidiad asid brasterog i glycolysis yn ddilysnod dedifferentiation cardiomyocyte.Mae cardiomyocytes anaeddfed yn defnyddio glwcos yn bennaf ar gyfer cynhyrchu ATP ac mae ganddynt mitocondria hypoplastig heb lawer o cristae5,32.Dangosodd dadansoddiadau defnyddio glwcos fod defnyddio glwcos o dan amodau MC a MT yn debyg i'r un ym meinweoedd diwrnod 0 (Ffigur 4C).Fodd bynnag, dangosodd samplau Ctrl gynnydd sylweddol yn y defnydd o glwcos o'i gymharu â meinwe ffres.Mae hyn yn dangos bod y cyfuniad o CTCM a T3/DEX yn gwella hyfywedd meinwe ac yn cadw ffenoteip metabolaidd adrannau'r galon diwylliedig 12 diwrnod.Yn ogystal, dangosodd dadansoddiad straen fod lefelau straen yn aros yr un fath ag ym meinwe ffres y galon am 12 diwrnod o dan amodau MT ac MS (Ffig. 4 D).
Er mwyn dadansoddi effaith gyffredinol CTCM a T3/DEX ar dirwedd trawsgrifio fyd -eang meinwe dafell gardiaidd, gwnaethom berfformio RNaseq ar dafelli cardiaidd o'r pedwar cyflwr diwylliant gwahanol (data atodol 1).Yn ddiddorol, dangosodd adrannau MT debygrwydd trawsgrifio uchel i feinwe ffres y galon, gyda dim ond 16 wedi'u mynegi'n wahanol allan o 13,642 o enynnau.Fodd bynnag, fel y gwnaethom ddangos yn gynharach, roedd tafelli Ctrl yn arddangos 1229 o enynnau a fynegwyd yn wahanol ar ôl 10–12 diwrnod mewn diwylliant (Ffig. 4E).Cadarnhawyd y data hyn gan qRT-PCR genynnau calon a ffibroblast (Ffig Atodol Ffig. 7a-c).Yn ddiddorol, dangosodd yr adrannau CTRL ddadreoleiddio genynnau cardiaidd a beiciau celloedd ac actifadu rhaglenni genynnau llidiol.Mae'r data hyn yn awgrymu bod dedifferentiation, sydd fel arfer yn digwydd ar ôl diwyllio yn y tymor hir, wedi'i wanhau'n llwyr o dan amodau MT (Ffig Atodol 8 A, B).Dangosodd astudiaeth ofalus o enynnau sarcomere mai dim ond o dan amodau MT y mae'r genynnau sy'n amgodio'r sarcomere (Ffig. 4f) a sianel ïon (Ffig atodol Ffig. 9) wedi'u cadw, gan eu hamddiffyn rhag ataliad o dan amodau CTRL, TD, a MC.Mae'r data hyn yn dangos, gyda chyfuniad o ysgogiad mecanyddol a humoral (T3/DEX), y gall y trawsgrifiad sleisen galon aros yn debyg i dafelli calon ffres ar ôl 12 diwrnod mewn diwylliant.
Cefnogir y canfyddiadau trawsgrifio hyn gan y ffaith mai'r ffordd orau o gadw cyfanrwydd strwythurol cardiomyocytes yn adrannau'r galon o dan amodau MT am 12 diwrnod, fel y dangosir gan Connexin 43 cyfan a lleol (Ffig. 5 A).Yn ogystal, gostyngwyd ffibrosis yn adrannau'r galon o dan amodau MT yn sylweddol o'i gymharu â CTRL ac yn debyg i adrannau ffres y galon (Ffig. 5 B).Mae'r data hyn yn dangos bod y cyfuniad o ysgogiad mecanyddol a thriniaeth T3/DEX yn cadw strwythur cardiaidd yn effeithiol yn adrannau'r galon mewn diwylliant.
Delweddau immunofluorescence cynrychioliadol o troponin-T (gwyrdd), connexin 43 (coch), a dapi (glas) yn adrannau'r galon sydd wedi'u hynysu'n ffres (D0) neu wedi'u diwyllio am 12 diwrnod ym mhob un o'r pedair cyflwr diwylliant adran y galon (bar graddfa = 100 µm).). Meintioli deallusrwydd artiffisial o gyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon (n = 7 (d0 a d12 ctrl), 5 (d12 td, d12 mc a d12 mt) tafelli/grŵp o wahanol foch, perfformir prawf ANOVA unffordd; ###*p <0.** p <p <p <P-pscriaeth i D0 a*p. Meintioli deallusrwydd artiffisial o gyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon (n = 7 (d0 a d12 ctrl), 5 (d12 td, d12 mc a d12 mt) tafelli/grŵp o wahanol foch, perfformir prawf ANOVA unffordd; ###*p <0.** p <p <p <P-pscriaeth i D0 a*p. Количественнная оценка структурной целостности ткани сердца с помощю искуссbor) D112 (D12 DE 1 Mc и d12 mt) срезов/группTy от разных свиней, проведен одновкторный тест anova; #### P <0,0001 п DOeu0 пOL пOL пOL п пOL пOL пOL пOL пOL пOL пOL пOL пOL пOL п пOL пOL п пOL пOL п пOL пOL п пAE сравнению с d12 ctrl). Meintioli cyfanrwydd strwythurol meinwe'r galon gan ddefnyddio deallusrwydd artiffisial (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) Adrannau/Grŵp o wahanol foch, Perfformiwyd prawf ANOVA unffordd; ### P <0.*P <neu*P <neu p <neu p <neu p <neu p <neu p <neu p <neu p <neu p <neu p <neu psms a*neu pscress o'i gymharu â d0 a*<neu p <neu*P <neu*P <neu PP o gymharu â D0 a*P <neu*P <neu*P <neu*P <neu*PROSEDD.对 不同 猪 的 心脏 心脏 完整性 （N = 7 （D0 和 D12 Ctrl） （5 （d12 TD 、 D12 MC 和 D12 MT） 组） 人工 人工 智能量 智能量 化 进行 单 单 向 单 单 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， <0.0001 与 D12 Ctrl 相比）。。Meintioli cyfanrwydd strwythurol meinwe gardiaidd gan ddefnyddio deallusrwydd artiffisial mewn gwahanol foch (n = 7 (D0 a D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) adrannau/grŵp) gyda phrawf ANOVA unffordd;#### p <0,0001 по сравнению с d0 и*p <0,05 или **** p <0,0001 по с сравнению с d12 ctrl). #### p <0.0001 o'i gymharu â d0 a*p <0.05 neu **** p <0.0001 o'i gymharu â d12 ctrl). b Delweddau Cynrychioliadol a Meintioli ar gyfer Sleisys y Galon wedi'u staenio â staen trichrom Masson (bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a D12 MC), 9 (D12 MT) Slices/Grŵp/Grŵp o wahanol foch, neu mae PREFION ANOBSE 1 PONCE o'i gymharu â D12 Ctrl). b Delweddau Cynrychioliadol a Meintioli ar gyfer Sleisys y Galon wedi'u staenio â staen trichrom Masson (bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a D12 MC), 9 (D12 MT) Slices/Grŵp/Grŵp o wahanol foch, neu mae PREFION ANOBSE 1 PONCE o'i gymharu â D12 Ctrl). B репрезентативные изображения и количественннаve оценка срезов сердца, окраше fuлuchб d инейка = 500 мкм) (n = 10 (d0, d12 ctrl, d12 td и d12 mc), 9 (d12 mt) срезов/груяпу о######### рвз с дvaоOut д еVAOut тORC 0,0001 по сравнению с d0 и *** p <0,001 или **** p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Delweddau Cynrychioliadol a Meintioli Adrannau'r Galon wedi'u staenio â staen trichrom Masson (bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) Adrannau/Grŵp o foch gwahanol, Perfformiwyd Pos 0 0. 1 VS. trl). B 用 masson 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 切片 的 代表性 图像 和 量化 量化 比例 比例 尺 尺 尺 尺 尺 尺 µ）） n = 10 （d0 、 d12 Ctrl 、 d12 td 和 d12 mc）） ， 来自 组 组 差 猪 猪 猪 猪 差 猪 猪 差 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 不同 不同 不同 不同） 来自） 来自 不同 不同 来自 不同 不同 不同 来自 来自 来自 不同 来自 来自 不同 不同 不同 来自 来自 来自 来自 不同 不同 不同 不同 不同 不同 来自 来自 来自 来自 来自 不同 来自 来自 不同 不同 不同 不同 不同 来自 不同 来自 不同 不同 不同 不同 来自 不同 不同 不同 来自 不同 不同<0.0001 与 d0 相比 ， *** p <0.001 ， 或 **** p <0.0001 与 d12 ctrl 相比））。。 B 用 masson 三 色 色 染料 心脏 切片 的 的 代表性 和 （（比例 比例 尺 尺 尺 尺 尺 尺 尺 尺 µ） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc）） 来自 不同 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个 个） 不同 不同 不同 个） 不同 不同 不同 个））） 来自 来自 来自 来自 来自） 来自 来自 来自 来自 来自 来自） 和 和 和 和 和切片/组 ， 进行 单 因素 方 差 差 分析 ； #### p <0.0001 与 d0 相比 ， *** p <0.001 ， 或 **** p <0.0001 与 d12 ctrl 相比））。。 B репрезезенентативные изображения и количествественннаа оценка срезов сердца, окрашей м м м м м м мOve м м мOveн м) (n = 10 (d0, d12 ctrl, d12 td и d12 mc), 9 (d12 mt) срезов от разных свиней / групы, одинrever с** с**, *** p <н с** н с**. или **** p <0,0001 по сравнению с d12 ctrl). b Delweddau cynrychioliadol a meintioli adrannau'r galon wedi'u staenio â thrichrom Masson (bar graddfa = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (d12 mt) o wahanol foch/grŵp, un dull anova;#D0 0.* 0 0.* 0 0.* 0 0.** POP 0.Mae bariau gwall yn cynrychioli'r gwyriad cymedrig ± safonol.
Yn olaf, aseswyd gallu CTCM i ddynwared hypertroffedd cardiaidd trwy gynyddu ymestyn meinwe gardiaidd.Yn CTCM, cynyddodd pwysau siambr aer brig o 80 mmHg i 80 mmHg.Celf.(ymestyn arferol) hyd at 140 mmHg celf.(Ffig. 6a).Mae hyn yn cyfateb i gynnydd o 32% mewn ymestyn (Ffig. 6b), a ddangoswyd o'r blaen fel y darn canrannol cyfatebol sy'n ofynnol ar gyfer adrannau'r galon i gyflawni hyd sarcomere tebyg i'r hyn a welir mewn hypertroffedd.Arhosodd a chyflymder meinwe gardiaidd yn ystod crebachu ac ymlacio yn gyson yn ystod chwe diwrnod o ddiwylliant (Ffig. 6 C).Roedd meinwe gardiaidd o amodau MT yn destun ymestyn arferol (MT (arferol)) neu amodau gor -stretch (MT (OS)) am chwe diwrnod.Eisoes ar ôl pedwar diwrnod mewn diwylliant, codwyd y biomarcwr hypertroffig NT-proBNP yn sylweddol yn y cyfrwng o dan amodau MT (OS) o'i gymharu ag amodau MT (arferol) (Ffig. 7 A).Yn ogystal, ar ôl chwe diwrnod o ddiwyllio, cynyddodd maint y gell yn MT (OS) (Ffig. 7b) yn sylweddol o gymharu â rhannau o galon MT (normal).Yn ogystal, cynyddwyd trawsleoliad niwclear NFATC4 yn sylweddol mewn meinweoedd gor -estynedig (Ffig. 7 C).Mae'r canlyniadau hyn yn dangos datblygiad cynyddol ailfodelu patholegol ar ôl hyperdistension ac yn cefnogi'r cysyniad y gellir defnyddio'r ddyfais CTCM fel platfform i astudio signalau hypertroffedd cardiaidd a achosir gan ymestyn.
Mae olion cynrychioliadol pwysau siambr aer, pwysau siambr hylif, a mesuriadau symud meinwe yn cadarnhau bod pwysau siambr yn newid pwysau siambr hylif, gan achosi symudiad cyfatebol o'r sleisen meinwe.B Canran ymestyn cynrychioliadol a chromliniau cyfradd ymestyn ar gyfer adrannau meinwe sydd wedi'u hymestyn fel arfer (oren) a gor -estynedig (glas).C graff bar yn dangos amser beicio (n = 19 sleisen fesul grŵp, o wahanol foch), amser crebachu (n = 18-19 sleisys fesul grŵp, o wahanol foch), amser ymlacio (n = 19 sleisen fesul grŵp, o wahanol foch)), osgled symud meinwe (n = 14 sleisys/grwpiau, o slices/grwpiau, o biceiniau, o belogys), pelysiad, o belysiadau/sions Nid oedd cyfradd (n = 14 (d0), 15 (d6)) adrannau/grwpiau) o wahanol foch), prawf-t dwy gynffon yn dangos unrhyw wahaniaeth arwyddocaol mewn unrhyw baramedr, gan nodi bod y paramedrau hyn wedi aros yn gyson yn ystod 6 diwrnod o ddiwylliant gyda gor-foltedd.Mae bariau gwall yn cynrychioli'r gwyriad cymedrig ± safonol.
Meintioli graff bar o grynodiad NT-proBNP mewn cyfryngau diwylliant o dafelli calon a ddiwyllir o dan amodau ymestyn arferol (norm) neu or-ymestyn (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mtnorm, a d4 mtos) sleisys/grŵp) o wahanol berfformiadau; Meintioli graff bar o grynodiad NT-proBNP mewn cyfryngau diwylliant o dafelli calon a ddiwyllir o dan amodau ymestyn arferol (norm) neu or-ymestyn (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mtnorm, a d4 mtos) sleisys/grŵp) o wahanol berfformiadau;Histogram meintiol o grynodiad NT-proBNP mewn cyfrwng diwylliant o dafelli calon a ddiwyllir o dan amodau ymestyn MT arferol (Norm) neu or-ymestyn (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mtnorm, a d4) .mtos) slices /grŵp o wahanol berfformiadau, dau berfformiad, dau berfformiad o wahanol golomodau, dau berfformiad o wahanol goledd, dau berfformiad o wahanol [grwpiau.** p <0,01 по сравнению с нормальны растяжением). ** p <0.01 o'i gymharu â ymestyn arferol). a 在 mt 正常 拉伸 (norm) 或 过度 拉伸 (OS) 条件 下 培养 培养 的 心脏 切片 培养 基 中 中 nt-probnp 浓度 的 条形 图量化 图量化 （N = 4 (d2 mtnorm) 、 3 （d2 mtos 、 d4 和））））））））））））））） 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、正常 拉伸相比 ， p <0.01）。 Meintioli crynodiad NT-proBNP mewn sleisys y galon a ddiwyllir o dan amodau ymestyn arferol (norm) neu or-ymestyn (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mtnorm 和 d4 mtos) o wahanol 猪 的 的 切片/组 组 ， ，1).Meintioli histogram o grynodiadau NT-proBNP mewn sleisys y galon a ddiwyllir o dan amodau ymestyn MT arferol (Norm) neu or-ymestyn (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mtos, d4 mtnorm) a d4 mtos) tafelli/grŵp o wahanol foch, dadansoddiad dwy ffordd, dadansoddiad dwy ffordd o amrywiant;** p <0,01 по сравнению с нормальны растяжением). ** p <0.01 o'i gymharu â ymestyn arferol). B Delweddau cynrychioliadol ar gyfer sleisys y galon wedi'u staenio â throponin-T a WGA (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (d6 mtos), celloedd/grŵp 369 (d6 mtnorm) o 10 tafell wahanol o foch gwahanol, mae prawf t dwy gynffon yn cael ei berfformio; ***** p <0. isg y mae prawf t B Delweddau cynrychioliadol ar gyfer sleisys y galon wedi'u staenio â throponin-T a WGA (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (d6 mtos), celloedd/grŵp 369 (d6 mtnorm) o 10 tafell wahanol o wahanol foch, mae prawf t dwy-tailed yn cael ei berfformio; ***** p <0.*l1 cymharol p <0. b репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных трононином- и Reзззрuch (слева) иutрutеutрett еток (справа) (n = 330 (d6 mtos), 369 (d6 mtnorm) клеток/групу из 10 разных срезов от раз сOutй свинut дrр сOut сOut рOut рOut рOut рOutOutOutOutйOutйOutйOutйOutйOutйOutйOr. Стюдента; **** p <0,0001 по сравнению с нормальныны растяжением). B Delweddau cynrychioliadol o adrannau'r galon wedi'u staenio â throponin-T ac AZP (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (d6 mtos), celloedd/grŵp 369 (d6 mtnorm) o 10 rhan wahanol o foch gwahanol, perfformiwyd prawf t dwy-gynffon myfyriwr dwy gynffon B Delweddau cynrychioliadol o dafelli calon wedi'u staenio â calcarein-T a WGA (chwith) a maint celloedd (dde) (n = 330 (d6 mtos), 369 o 10 sleisen wahanol (d6 mtnorm)) celloedd/组 ， ， 两 方法 方法 有尾 学生 学生 t prawf ； o gymharu ag ymestyn arferol ， ***** p <0. ， 两 学生 学生 学生 ； ； ； 方法 ； B репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-т и азп (слева) и ц ц rhain ( справа) (n = 330 (d6 mtos), 369 (d6 mtnorm) из 10 различных срезов от разных свиней клетк cyfan; 1 по сравнению с нормальны растяжением). B Delweddau cynrychioliadol o adrannau'r galon wedi'u staenio â throponin-T ac AZP (chwith) a meintioli maint celloedd (dde) (n = 330 (d6 mtos), 369 (d6 mtnorm) o 10 rhan wahanol o wahanol foch) celloedd/grŵp, t;**** p <0.0001 o'i gymharu â straen arferol). C Delweddau Cynrychioliadol ar gyfer Diwrnod 0 a Diwrnod 6 MTOs Sleisys y Galon wedi'u imiwnoleiddio ar gyfer troponin-T a NFATC4 a meintioli trawsleoliad NFATC4 i niwclysau CMS (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) slipiau/grŵp o wahanol figiau; *perfformiodd t-t-t-t-t-t-T-TETED MISTYD MISTYD MISTYTED C Delweddau Cynrychioliadol ar gyfer Diwrnod 0 a Diwrnod 6 MTOs Sleisys y Galon wedi'u imiwnoleiddio ar gyfer troponin-T a NFATC4 a meintioli trawsleoliad NFATC4 i niwclysau CMS (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) slipiau/grŵp o wahanol figiau; *perfformiodd t-t-t-t-t-t-T-TETED MISTYD MISTYD MISTYTED C репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней mtos, иммуномеченых д дOutл iwt iwt, gwn д тOut т т helaeth, транслокации nfatc4 в я дра кавернозных кл тOutall (nO = 4 (d0), 3 (d6 mtos) срезов/груп vustеOutтOutтOutтOut сOutуOut я яOut яOut яOut яOut яOut яOutOut яOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOut яOutOver яOLOOLOOOOveOOVOOOROOOOOOOveOOVOOOveOOVOOveOut olafи L рий стююдента; *p <0,05). C Delweddau cynrychioliadol ar gyfer rhannau'r galon ar 0 a 6 diwrnod MTOs, wedi'u himiwneiddio ar gyfer troponin-T a NFATC4, a meintioli trawsleoliad NFATC4 yng nghnewyllyn celloedd ceudodol (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) sleisys/grŵp o wahanol berfformiad o wahanol bethau;*p <0.05). c 用 于 肌钙 蛋白 -t 和 nfatc4 免疫 标记 的 第 0 天 和 第 6 天 mtos 心脏 心脏 切片 代表性 图像 ， 以及 以及 不同 猪 的 的 nfatc4 易位 至 cm 细胞 核 的 量化 切片 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； ； 。 C Delweddau cynrychioliadol o immunolabeling calcanin-t a nfatc4 第 0 天 和 第 6 天 mtos sleisys calon, a nfATC4 o wahanol nfatc4 易位 至 至 cm niwclews celloedd 的 maint 化 (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos). C Delweddau cynrychioliadol o dafelli calon MTOs ar ddiwrnod 0 a 6 ar gyfer troponin-t a nfATC4 imiwnolabelu a meintioli trawsleoliad nfATC4 yng nghnewyllyn CM o wahanol foch (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) sleisys/grwp/grŵp taenau t;Mae bariau gwall yn cynrychioli gwyriad cymedrig ± safonol.
Mae angen modelau cellog ar ymchwil cardiofasgwlaidd drosiadol sy'n atgynhyrchu'r amgylchedd cardiaidd yn gywir.Yn yr astudiaeth hon, datblygwyd a nodweddwyd dyfais CTCM a all ysgogi rhannau ultrathin o'r galon.Mae'r system CTCM yn cynnwys ysgogiad electromecanyddol cydamserol ffisiolegol a chyfoethogi hylif T3 a Dex.Pan oedd adrannau'r galon mochyn yn agored i'r ffactorau hyn, arhosodd eu hyfywedd, cywirdeb strwythurol, gweithgaredd metabolaidd, a mynegiant trawsgrifiadol yr un fath ag ym meinwe'r galon ffres ar ôl 12 diwrnod o ddiwylliant.Yn ogystal, gall ymestyn gormod o feinwe gardiaidd achosi hypertroffedd y galon a achosir gan hyperextension.At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi rôl hanfodol amodau diwylliant ffisiolegol wrth gynnal ffenoteip cardiaidd arferol ac yn darparu llwyfan ar gyfer sgrinio cyffuriau.
Mae llawer o ffactorau'n cyfrannu at greu'r amgylchedd gorau posibl ar gyfer gweithrediad a goroesiad cardiomyocytes.Mae'r mwyaf amlwg o'r ffactorau hyn yn gysylltiedig â (1) rhyngweithiadau rhynggellog, (2) ysgogiad electromecanyddol, (3) ffactorau humoral, a (4) swbstradau metabolaidd.Mae rhyngweithiadau ffisiolegol celloedd-i-gell yn gofyn am rwydweithiau tri dimensiwn cymhleth o sawl math o gell a gefnogir gan fatrics allgellog.Mae'n anodd ailadeiladu rhyngweithiadau cellog cymhleth o'r fath yn vitro trwy gyd-ddiwylliant mathau o gelloedd unigol, ond gellir eu cyflawni'n hawdd gan ddefnyddio natur organotypig adrannau'r galon.
Mae ymestyn mecanyddol ac ysgogiad trydanol cardiomyocytes yn hanfodol ar gyfer cynnal ffenoteip cardiaidd33,34,35.Er bod ysgogiad mecanyddol wedi'i ddefnyddio'n helaeth ar gyfer cyflyru ac aeddfedu HIPSC-CM, mae sawl astudiaeth gain wedi ceisio ysgogi tafelli calon mewn diwylliant yn fecanyddol yn ddiweddar gan ddefnyddio llwytho uniaxial.Mae'r astudiaethau hyn yn dangos bod llwytho mecanyddol uniaxial 2D yn cael effaith gadarnhaol ar ffenoteip y galon yn ystod diwylliant.Yn yr astudiaethau hyn, cafodd rhannau o'r galon naill ai eu llwytho â grymoedd tynnol isometrig17, llwytho auxotonig llinol18, neu ail -greu'r cylch cardiaidd gan ddefnyddio adborth transducer grym a gyriannau tensiwn.Fodd bynnag, mae'r dulliau hyn yn defnyddio ymestyn meinwe uniaxial heb optimeiddio amgylcheddol, gan arwain at atal llawer o enynnau cardiaidd neu orbwysleisio genynnau sy'n gysylltiedig ag ymatebion ymestyn annormal.Mae'r CTCM a ddisgrifir yma yn darparu ysgogiad electromecanyddol 3D sy'n dynwared y cylch cardiaidd naturiol o ran amser beicio ac ymestyn ffisiolegol (ymestyn 25%, 40% systole, 60% diastole, a 72 curiad y funud).Er nad yw'r ysgogiad mecanyddol tri dimensiwn hwn yn unig yn ddigonol i gynnal cyfanrwydd meinwe, mae'n ofynnol i gyfuniad o ysgogiad humoral a mecanyddol gan ddefnyddio T3/DEX gynnal hyfywedd, swyddogaeth ac uniondeb meinwe yn ddigonol.
Mae ffactorau humoral yn chwarae rhan bwysig wrth fodiwleiddio ffenoteip y galon oedolion.Amlygwyd hyn mewn astudiaethau HIPS-CM lle ychwanegwyd T3 a DEX at gyfryngau diwylliant i gyflymu aeddfedu celloedd.Gall T3 ddylanwadu ar gludo asidau amino, siwgrau a chalsiwm ar draws pilenni celloedd36.Yn ogystal, mae T3 yn hyrwyddo mynegiant MHC-α a dadreoleiddio MHC-β, gan hyrwyddo ffurfio myofibrils twitch cyflym mewn cardiomyocytes aeddfed o gymharu â myofibrils twitch araf mewn cm ffetws.Mae diffyg T3 mewn cleifion isthyroid yn arwain at golli bandiau myofibrillar a chyfradd is o ddatblygiad tôn37.Mae Dex yn gweithredu ar dderbynyddion glucocorticoid a dangoswyd ei fod yn cynyddu contractadwyedd myocardaidd mewn calonnau darlifedig ynysig;38 Credir bod y gwelliant hwn yn gysylltiedig â'r effaith ar fynediad sy'n cael ei yrru gan flaendal calsiwm (SOCE) 39,40.Yn ogystal, mae Dex yn rhwymo i'w dderbynyddion, gan achosi ymateb mewngellol eang sy'n atal swyddogaeth imiwnedd a llid30.
Mae ein canlyniadau'n dangos bod ysgogiad mecanyddol corfforol (MS) wedi gwella perfformiad diwylliant cyffredinol o'i gymharu â CTRL, ond wedi methu â chynnal hyfywedd, cyfanrwydd strwythurol, a mynegiant cardiaidd dros 12 diwrnod mewn diwylliant.O'i gymharu â CTRL, roedd ychwanegu T3 a DEX at ddiwylliannau CTCM (MT) yn gwella hyfywedd ac yn cynnal proffiliau trawsgrifio tebyg, uniondeb strwythurol, a gweithgaredd metabolaidd gyda meinwe'r galon ffres am 12 diwrnod.Yn ogystal, trwy reoli graddfa'r ymestyn meinwe, crëwyd model hypertroffedd cardiaidd a achosir gan hyperextension gan ddefnyddio STCM, gan ddangos amlochredd y system STCM.Dylid nodi, er bod ailfodelu cardiaidd a ffibrosis fel arfer yn cynnwys organau cyfan y gall eu celloedd sy'n cylchredeg ddarparu'r cytocinau priodol yn ogystal â ffagocytosis a ffactorau ailfodelu eraill, gall rhannau o'r galon ddynwared y broses ffibrog o hyd mewn ymateb i straen a thrawma.i mewn i myofibroblastau.Mae hyn wedi'i werthuso o'r blaen yn y model tafell gardiaidd hwn.Dylid nodi y gellir modiwleiddio paramedrau CTCM trwy newid pwysau/osgled trydanol ac amlder i efelychu llawer o amodau fel tachycardia, bradycardia, a chefnogaeth gylchrediad y gwaed mecanyddol (calon wedi'i dadlwytho mecanyddol).Mae hyn yn gwneud y system yn drwybwn canolig ar gyfer profi cyffuriau.Mae gallu CTCM i fodelu hypertroffedd cardiaidd a achosir gan or-drosiad yn paratoi'r ffordd ar gyfer profi'r system hon ar gyfer therapi wedi'i bersonoli.I gloi, mae'r astudiaeth bresennol yn dangos bod ymestyn mecanyddol ac ysgogiad humoral yn hanfodol ar gyfer cynnal diwylliant adrannau meinwe gardiaidd.
Er bod y data a gyflwynir yma yn awgrymu bod CTCM yn llwyfan addawol iawn ar gyfer modelu myocardiwm cyfan, mae gan y dull diwylliant hwn rai cyfyngiadau.Prif gyfyngiad diwylliant CTCM yw ei fod yn gosod straen mecanyddol deinamig parhaus ar y tafelli, sy'n atal y gallu i fonitro cyfangiadau tafell gardiaidd yn ystod pob cylch.Yn ogystal, oherwydd maint bach adrannau cardiaidd (7 mm), mae'r gallu i werthuso swyddogaeth systolig y tu allan i systemau diwylliant gan ddefnyddio synwyryddion grym traddodiadol yn gyfyngedig.Yn y llawysgrif gyfredol, rydym yn goresgyn y cyfyngiad hwn yn rhannol trwy werthuso foltedd optegol fel dangosydd o swyddogaeth contractile.Fodd bynnag, bydd y cyfyngiad hwn yn gofyn am waith pellach a gellir mynd i'r afael ag ef yn y dyfodol trwy gyflwyno dulliau ar gyfer monitro swyddogaeth sleisys y galon mewn diwylliant yn optegol, megis mapio optegol gan ddefnyddio llifynnau calsiwm a sensitif i galsiwm a foltedd.Cyfyngiad arall ar CTCM yw nad yw'r model gweithio yn trin straen ffisiolegol (preload ac ôl -lwyth).Yn CTCM, achoswyd pwysau i gyfeiriadau gwahanol i atgynhyrchu darn ffisiolegol 25% mewn diastole (ymestyn llawn) a systole (hyd y crebachu yn ystod ysgogiad trydanol) mewn meinweoedd mawr iawn.Dylai'r cyfyngiad hwn gael ei ddileu mewn dyluniadau CTCM yn y dyfodol trwy bwysau digonol ar y meinwe gardiaidd o'r ddwy ochr a thrwy gymhwyso'r union berthnasoedd cyfaint pwysau sy'n digwydd yn siambrau'r galon.
Mae'r ailfodelu a achosir gan or-or-bwysleisio a adroddir yn y llawysgrif hon wedi'i gyfyngu i ddynwared signalau hyperstrtroffig hypertroffig.Felly, gall y model hwn helpu i astudio signalau hypertroffig a achosir gan ymestyn heb yr angen am ffactorau humoral neu niwral (nad ydynt yn bodoli yn y system hon).Mae angen astudiaethau pellach i gynyddu lluosedd CTCM, er enghraifft, cyd-ddiwylliant â chelloedd imiwnedd, cylchredeg ffactorau humoral plasma, a mewnlifiad wrth gyd-ddiwylliant â chelloedd niwronau yn gwella posibiliadau modelu afiechydon gyda CTCM.
Defnyddiwyd tri ar ddeg o foch yn yr astudiaeth hon.Perfformiwyd yr holl weithdrefnau anifeiliaid yn unol â chanllawiau sefydliadol ac fe'u cymeradwywyd gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Prifysgol Louisville.Clampiwyd y bwa aortig a darlifwyd y galon ag 1 L o gardioplegia di -haint (NaCl 110 mM, 1.2 mM CACL2, 16 mM KCl, 16 mm mgcl2, 10 mm NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH hyd at 7.4); Roedd y calonnau'n cael eu cadw mewn toddiant cardioplegig oer iâ nes eu cludo i'r labordy ar rew sydd fel arfer yn <10 munud. Roedd y calonnau'n cael eu cadw mewn toddiant cardioplegig oer iâ nes eu cludo i'r labordy ar rew sydd fel arfer yn <10 munud. сердца хранили в в леном кардиоплегическоооо растворе до транспортировки в латориcom 10 iwt Roedd calonnau'n cael eu storio mewn toddiant cardioplegig oer iâ nes eu cludo i'r labordy ar rew, sydd fel arfer yn cymryd <10 munud.将 心脏 保存 在 冰冷 的 心脏 停搏液 中 中 ， 直到 冰上 运送 到 实验室 ， 通常 通常 <10 分钟。将 心脏 保存 在 冰冷 的 心脏 停搏液 中 中 ， 直到 冰上 运送 到 实验室 ， 通常 通常 <10 分钟。 Держите сердца в л ледяной кардиооплегии до транспортировки в лаборато rhain Cadwch galonnau ar iâ cardioplegia nes eu bod yn cael eu cludo i'r labordy ar rew, fel arfer <10 munud.
Datblygwyd y ddyfais CTCM mewn meddalwedd dylunio gyda chymorth cyfrifiadur SolidWorks (CAD).Mae'r siambrau diwylliant, rhanwyr a siambrau aer wedi'u gwneud o blastig acrylig clir CNC.Mae'r cylch wrth gefn diamedr 7mm wedi'i wneud o polyethylen dwysedd uchel (HDPE) yn y canol ac mae ganddo rigol O-ring i ddarparu ar gyfer yr O-ring silicon a ddefnyddir i selio'r cyfryngau oddi tano.Mae pilen silica denau yn gwahanu'r siambr ddiwylliant o'r plât gwahanu.Mae'r bilen silicon wedi'i thorri laser o ddalen silicon 0.02 ″ o drwch ac mae ganddo galedwch o 35a.Mae'r gasgedi silicon gwaelod a uchaf yn cael eu torri gan laser o ddalen silicon 1/16 ″ o drwch ac mae ganddyn nhw galedwch o 50a.Defnyddir sgriwiau dur gwrthstaen 316L a chnau adenydd ar gyfer cau'r bloc a chreu sêl aerglos.
Dyluniwyd Bwrdd Cylchdaith Argraffedig pwrpasol (PCB) i gael ei integreiddio â'r system C-Pace-EM.Mae socedi cysylltydd peiriant y Swistir ar y PCB wedi'u cysylltu ag electrodau graffit gan wifrau copr wedi'u platio arian a sgriwiau efydd 0-60 wedi'u sgriwio i'r electrodau.Rhoddir y bwrdd cylched printiedig yng ngorchudd yr argraffydd 3D.
Mae'r ddyfais CTCM yn cael ei rheoli gan actuator niwmatig rhaglenadwy (PPD) sy'n creu pwysau cylchrediad gwaed rheoledig tebyg i gylchred cardiaidd.Wrth i'r pwysau y tu mewn i'r siambr aer gynyddu, mae'r bilen silicon hyblyg yn ehangu i fyny, gan orfodi'r cyfrwng o dan y safle meinwe.Yna bydd yr ardal o feinwe yn cael ei hymestyn gan y diarddel hylif hwn, gan ddynwared ehangiad ffisiolegol y galon yn ystod diastole.Ar anterth ymlacio, rhoddwyd ysgogiad trydanol trwy electrodau graffit, a oedd yn lleihau'r pwysau yn y siambr aer ac a achosodd grebachu adrannau meinwe.Y tu mewn i'r bibell mae falf hemostatig gyda synhwyrydd pwysau i ganfod y pwysau yn y system aer.Mae'r pwysau a synhwyrir gan y synhwyrydd pwysau yn cael ei gymhwyso i gasglwr data sydd wedi'i gysylltu â'r gliniadur.Mae hyn yn caniatáu monitro'r pwysau y tu mewn i'r siambr nwy yn barhaus.Pan gyrhaeddwyd y pwysau siambr uchaf (safon 80 mmHg, 140 mmHg OS), gorchmynnwyd y ddyfais caffael data i anfon signal i'r system C-Pace-EM i gynhyrchu signal foltedd biphasig am 2 ms, wedi'i osod i 4 V.
Cafwyd adrannau'r galon a pherfformiwyd amodau diwylliant mewn 6 ffynnon fel a ganlyn: trosglwyddo'r calonnau a gynaeafwyd o'r llong drosglwyddo i hambwrdd sy'n cynnwys cardioplegia oer (4 ° C.).Roedd y fentrigl chwith wedi'i ynysu â llafn di-haint a'i dorri'n ddarnau o 1-2 cm3.Roedd y blociau meinwe hyn ynghlwm wrth gynhaliaeth meinwe gyda glud meinwe a'u rhoi mewn baddon meinwe microtome dirgrynu yn cynnwys toddiant Tyrode ac ocsigenedig yn barhaus (3 g/l 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mm Nacl (8.1 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 mm, 6 MM HEPES (2.38 g), 1 mm mgcl2 (hydoddiant 1 ml 1 m), 1.8 mM CACL2 (hydoddiant 1.8 ml 1 m), hyd at 1 l ddh2o).Gosodwyd y microtome dirgrynol i dorri tafelli 300 µm o drwch ar amledd o 80 Hz, osgled dirgryniad llorweddol o 2 mm, a chyfradd ymlaen llaw o 0.03 mm/s.Amgylchynwyd y baddon meinwe gan rew i gadw'r toddiant yn cŵl a chynhaliwyd y tymheredd ar 4 ° C.Trosglwyddwch adrannau meinwe o'r baddon microtome i faddon deori sy'n cynnwys toddiant Tyrode ocsigenedig yn barhaus ar rew nes bod digon o adrannau ar gael ar gyfer un plât diwylliant.Ar gyfer diwylliannau transwell, roedd adrannau meinwe ynghlwm wrth gynhaliaeth polywrethan di-haint 6 mm o led a'u rhoi mewn 6 ml o gyfrwng optimized (199 cyfrwng, 1x ei ychwanegiad, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcaline a 2x gwrthfiotig-antifiotig).Rhoddwyd ysgogiad trydanol (10 V, amledd 1.2 Hz) ar yr adrannau meinwe trwy'r C-PACE.Ar gyfer amodau TD, ychwanegwyd T3 ffres a DEX ar 100 nm ac 1 μm ar bob newid canolig.Mae'r cyfrwng yn dirlawn ag ocsigen cyn ei amnewid 3 gwaith y dydd.Tyfwyd adrannau meinwe mewn deorydd ar 37 ° C a 5% CO2.
Ar gyfer diwylliannau CTCM, gosodwyd adrannau meinwe ar argraffydd 3D wedi'i wneud yn arbennig mewn dysgl Petri sy'n cynnwys datrysiad Tyrode wedi'i addasu.Mae'r ddyfais wedi'i chynllunio i gynyddu maint tafell y galon 25% o arwynebedd y cylch cynnal.Gwneir hyn fel nad yw'r rhannau o'r galon yn ymestyn ar ôl cael eu trosglwyddo o ddatrysiad Tyrode i'r cyfrwng ac yn ystod diastole.Gan ddefnyddio glud histoacrylig, gosodwyd adrannau 300 µm o drwch ar gylch cynnal 7 mm mewn diamedr.Ar ôl atodi'r adrannau meinwe â'r cylch cynnal, torrwch yr adrannau meinwe gormodol i ffwrdd a gosod yr adrannau meinwe atodedig yn ôl i faddon toddiant Tyrode ar rew (4 ° C) nes bod digon o adrannau wedi'u paratoi ar gyfer un ddyfais.Ni ddylai cyfanswm yr amser prosesu ar gyfer pob dyfais fod yn fwy na 2 awr.Ar ôl i 6 adran meinwe fod ynghlwm wrth eu cylchoedd cynnal, ymgynnull y ddyfais CTCM.Mae Siambr Diwylliant CTCM wedi'i llenwi ymlaen llaw gyda chyfrwng 21 ml cyn-ocsigenedig.Trosglwyddwch yr adrannau meinwe i'r siambr ddiwylliant a thynnwch unrhyw swigod aer yn ofalus gyda phibed.Yna caiff yr adran meinwe ei thywys i'r twll a'i wasgu'n ysgafn i'w lle.Yn olaf, rhowch y cap electrod ar y ddyfais a throsglwyddwch y ddyfais i'r deorydd.Yna cysylltwch y CTCM â'r tiwb aer a'r system C-Pace-EM.Mae'r actuator niwmatig yn agor ac mae'r falf aer yn agor y CTCM.Ffurfiwyd y system C-Pace-EM i gyflenwi 4 V ar 1.2 Hz yn ystod pacio biphasig am 2 ms.Newidiwyd y cyfrwng ddwywaith y dydd a newidiwyd yr electrodau unwaith y dydd er mwyn osgoi cronni graffit ar yr electrodau.Os oes angen, gellir tynnu adrannau meinwe o'u ffynhonnau diwylliant i ddiarddel unrhyw swigod aer a allai fod wedi cwympo oddi tanynt.Ar gyfer amodau triniaeth MT, ychwanegwyd T3/DEX yn ffres gyda phob newid canolig gyda 100 nm T3 ac 1 μM DEX.Tyfwyd y dyfeisiau CTCM mewn deorydd ar 37 ° C a 5% CO2.
I gael taflwybrau estynedig o dafelli calon, datblygwyd system gamera arbennig.Defnyddiwyd camera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) gyda lens macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Perfformiwyd delweddu ar dymheredd yr ystafell ar ôl disodli'r cyfrwng â chyfrwng ffres.Mae'r camera wedi'i leoli ar ongl 51 ° ac mae fideo wedi'i recordio ar 30 ffrâm yr eiliad.Yn gyntaf, defnyddiwyd meddalwedd ffynhonnell agored (Musclemotion43) gyda Image-J i feintioli symudiad tafelli calon.Crëwyd y mwgwd gan ddefnyddio MATLAB (MathWorks, Natick, MA, UDA) i ddiffinio rhanbarthau o ddiddordeb ar gyfer curo tafelli calon er mwyn osgoi sŵn.Mae masgiau wedi'u segmentu â llaw yn cael eu rhoi ar yr holl ddelweddau mewn dilyniant ffrâm ac yna'n cael eu trosglwyddo i'r ategyn cyhyrau.Mae cynnig cyhyrau yn defnyddio dwyster cyfartalog y picseli ym mhob ffrâm i feintioli ei symudiad o'i gymharu â'r ffrâm gyfeirio.Cofnodwyd, hidlo a defnyddiwyd data i feintioli amser beicio ac asesu ymestyn meinwe yn ystod y cylch cardiaidd.Cafodd y fideo wedi'i recordio ei phrosesu gan ddefnyddio hidlydd digidol sero cam cyntaf.Er mwyn meintioli ymestyn meinwe (brig-i-uchaf), perfformiwyd dadansoddiad brig-i-uchaf i wahaniaethu rhwng copaon a chafnau yn y signal a gofnodwyd.Yn ogystal, perfformir detrending gan ddefnyddio polynomial 6ed gorchymyn i ddileu drifft signal.Datblygwyd cod y rhaglen yn MATLAB i bennu cynnig meinwe fyd -eang, amser beicio, amser ymlacio, ac amser crebachu (Cod Rhaglen Atodol 44).
Ar gyfer dadansoddi straen, gan ddefnyddio'r un fideos a grëwyd ar gyfer asesu ymestyn mecanyddol, gwnaethom olrhain dwy ddelwedd yn gyntaf yn cynrychioli copaon symud (y pwyntiau cynnig uchaf (uchaf) ac isaf (is)) yn ôl y feddalwedd cyhyrau.Yna fe wnaethom rannu'r rhanbarthau meinwe a chymhwyso math o algorithm cysgodi i'r meinwe segmentiedig (Ffig Atodol. 2 A).Yna rhannwyd y meinwe wedi'i segmentu yn ddeg is-wyneb, a chyfrifwyd y straen ar bob wyneb gan ddefnyddio'r hafaliad canlynol: straen = (sup-sdown)/sdown, lle mae SUP a SDOWN yn bellteroedd y siâp o gysgodion brig a gwaelod y ffabrig, yn y drefn honno (Ffig Atodol Ffig .2B).
Roedd adrannau'r galon yn sefydlog mewn paraformaldehyd 4% am 48 awr.Cafodd meinweoedd sefydlog eu dadhydradu mewn 10% ac 20% swcros am 1 h, yna mewn 30% swcros dros nos.Yna cafodd yr adrannau eu hymgorffori yn y cyfansoddyn tymheredd torri gorau posibl (cyfansoddyn OCT) a'u rhewi'n raddol mewn baddon iâ isopentane/sych.Storio blociau ymgorffori OCT ar -80 ° C nes eu gwahanu.Paratowyd sleidiau fel rhannau gyda thrwch o 8 μm.
I dynnu OCT o adrannau'r galon, cynheswch y sleidiau ar floc gwresogi ar 95 ° C am 5 munud.Ychwanegwch 1 ml PBS i bob sleid a deori am 30 munud ar dymheredd yr ystafell, yna treiddiwch yr adrannau trwy osod 0.1% Triton-X yn PBS am 15 munud ar dymheredd yr ystafell.Er mwyn atal gwrthgyrff amhenodol rhag rhwymo i'r sampl, ychwanegwch 1 ml o doddiant BSA 3% i sleidiau a deori am 1 awr ar dymheredd yr ystafell.Yna tynnwyd y BSA a golchwyd y sleidiau gyda PBS.Marciwch bob sampl gyda phensil.Gwrthgyrff cynradd (gwanedig 1: 200 mewn 1% BSA) (Connexin 43 (ABCAM; #AB11370), NFATC4 (ABCAM; #AB99431) a Troponin-T (thermo gwyddonol; #MA5-12960) wedi'u hychwanegu dros 90 munud (y mae munudau'n cael eu hystyried, yn erbyn 1: IFIC; #A16079), yn erbyn cwningen Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) am 90 munud ychwanegol wedi'i olchi 3 gwaith gyda PBS i wahaniaethu staenio targed o'r cefndir, dim ond y gwrthgorff eilaidd y gwnaethom ei ddefnyddio fel rheolaeth) Yn olaf, roedd y llabotamed niwcen a llithrydd yn cael ei ychwanegu at lithryddion a llithryddion a selog. Microsgop Yence gyda chwyddhad 40x.
Defnyddiwyd WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ar 5 μg/ml yn PBS ar gyfer staenio WGA a'i gymhwyso i rannau sefydlog am 30 munud ar dymheredd yr ystafell.Yna golchwyd y sleidiau gyda PBS ac ychwanegwyd Sudan Black at bob sleid a'u deori am 30 munud.Yna golchwyd y sleidiau gyda PBS ac ychwanegwyd cyfrwng ymgorffori Vectashield.Delweddwyd sleidiau ar ficrosgop keyence ar chwyddhad 40x.
Tynnwyd OCT o'r samplau fel y disgrifir uchod.Ar ôl cael gwared ar yr OCT, trochwch y sleidiau yn noddiant Bouin dros nos.Yna rinsiwyd y sleidiau â dŵr distyll am 1 awr ac yna eu rhoi mewn toddiant fuchsin asid aloe bibrich am 10 munud.Yna golchwyd y sleidiau â dŵr distyll a'u rhoi mewn toddiant o 5% ffosffomolybdenwm/asid ffosffotungstig 5% am 10 munud.Heb rinsio, trosglwyddwch y sleidiau yn uniongyrchol i'r toddiant glas anilin am 15 munud.Yna golchwyd y sleidiau â dŵr distyll a'u rhoi mewn toddiant asid asetig 1% am 2 funud.Cafodd sleidiau eu sychu mewn 200 N ethanol a'u trosglwyddo i xylene.Delweddwyd sleidiau lliw gan ddefnyddio microsgop keyence gydag amcan 10x.Meintiolwyd canran ardal ffibrosis gan ddefnyddio meddalwedd Dadansoddwr Keyence.
Assay hyfywedd celloedd MTT CYQUANT ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), rhif catalog V13154, yn unol â phrotocol y gwneuthurwr gyda rhai addasiadau.Yn benodol, defnyddiwyd dyrnu llawfeddygol â diamedr o 6 mm i sicrhau maint meinwe unffurf yn ystod dadansoddiad MTT.Cafodd meinweoedd eu platio'n unigol i ffynhonnau plât 12 ffynnon sy'n cynnwys swbstrad MTT yn unol â phrotocol y gwneuthurwr.Mae'r adrannau'n cael eu deori ar 37 ° C. am 3 awr ac mae'r meinwe fyw yn metaboli'r swbstrad MTT i ffurfio cyfansoddyn formazan porffor.Amnewid yr hydoddiant MTT gyda 1 ml DMSO a'i ddeor ar 37 ° C am 15 munud i echdynnu formazan porffor o adrannau'r galon.Gwanhawyd samplau 1:10 yn DMSO mewn platiau gwaelod clir 96-well a dwyster lliw porffor wedi'u mesur ar 570 nm gan ddefnyddio darllenydd plât cytation (Biotek).Cafodd darlleniadau eu normaleiddio i bwysau pob tafell o'r galon.
Disodlwyd cyfryngau tafell y galon â chyfryngau sy'n cynnwys 1 μCI/mL [5-3H] -Lucose (Moravek Biocemicals, Brea, CA, UDA) ar gyfer assay defnyddio glwcos fel y disgrifiwyd o'r blaen.Ar ôl 4 awr o ddeori, ychwanegwch 100 µl o gyfrwng at diwb microcentrifuge agored sy'n cynnwys 100 µL o 0.2 N HCl.Yna gosodwyd y tiwb mewn tiwb scintillation yn cynnwys 500 μl o Dh2O i anweddu [3H] 2O am 72 awr ar 37 ° C.Yna tynnwch y tiwb microcentrifuge o'r tiwb scintillation ac ychwanegwch 10 ml o hylif scintillation.Perfformiwyd cyfrifiadau scintillation gan ddefnyddio dadansoddwr scintillation hylif Tri-Carb 2900tr (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, UDA).Yna cyfrifwyd y defnydd o glwcos gan ystyried [5-3h]-glwcos-weithgaredd penodol, ecwilibriwm anghyflawn a chefndir, gwanhau [5-3h] -to glwcos heb ei labelu, a gwrth-effeithlonrwydd scintillation.Mae'r data'n cael ei normaleiddio i fàs rhannau'r galon.
Ar ôl homogeneiddio meinwe yn Trizol, roedd RNA wedi'i ynysu oddi wrth adrannau'r galon gan ddefnyddio'r Qiagen Mirneasy Micro Kit #210874 yn unol â phrotocol y gwneuthurwr.Perfformiwyd paratoi llyfrgell RNasec, dilyniannu a dadansoddi data fel a ganlyn:
Defnyddiwyd 1 μg o RNA fesul sampl fel deunydd cychwyn ar gyfer paratoi'r llyfrgell RNA.Cynhyrchwyd llyfrgelloedd dilyniannu gan ddefnyddio Pecyn Paratoi Llyfrgell RNA Ultratm NEBNEXT ar gyfer Illumina (NEB, UDA) yn dilyn argymhellion y gwneuthurwr, ac ychwanegwyd codau mynegai at y dilyniannau priodoledd ar gyfer pob sampl.Yn fyr, purwyd mRNA o gyfanswm yr RNA gan ddefnyddio gleiniau magnetig ynghlwm wrth oligonucleotidau poly-T.Gwneir darnio gan ddefnyddio cations divalent ar dymheredd uchel mewn byffer adwaith synthesis llinyn cyntaf NEBNEXT (5x).Syntheseiddiwyd cDNA llinyn cyntaf gan ddefnyddio primers hecsamer ar hap a M-Mulv reverse transcriptase (RNase H-).Yna caiff yr ail cDNA llinyn ei syntheseiddio gan ddefnyddio DNA polymeras I a RNase H. Mae'r bargodion sy'n weddill yn cael eu trosi'n bennau di -flewyn -ar -dafod gan weithgaredd exonuclease/polymeras.Ar ôl adenylation o ben 3 ′ y darn DNA, mae addasydd NEBNEXT gyda strwythur dolen hairpin ynghlwm wrtho i'w baratoi ar gyfer hybridization.Ar gyfer dewis darnau cDNA o'r hyd a ffefrir 150-200 bp.Cafodd darnau llyfrgell eu puro gan ddefnyddio system Ampure XP (Beckman Coulter, Beverly, UDA).Yna, defnyddiwyd ensym defnyddiwr 3 μl (NEB, UDA) gyda cDNA a ddewiswyd gan faint wedi'i glymu ag addasydd am 15 munud ar 37 ° C ac yna am 5 munud ar 95 ° C cyn PCR.Yna perfformiwyd PCR gan ddefnyddio Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, Universal PCR Primers, a Primers Mynegai (X).Yn olaf, cafodd cynhyrchion PCR eu puro (system XP Ampure) ac ansawdd llyfrgell a aseswyd ar system Agilent Bioanalyzer 2100.Yna dilynwyd y llyfrgell cDNA gan ddefnyddio dilyniant Novaseq.Troswyd ffeiliau delwedd amrwd o Illumina i ddarlleniadau amrwd gan ddefnyddio galw sylfaen casava.Mae data crai yn cael ei storio mewn ffeiliau fformat FASTQ (FQ) sy'n cynnwys dilyniannau darllen a rhinweddau sylfaen cyfatebol.Dewiswch Hisat2 i gyfateb darlleniadau dilyniannu wedi'i hidlo i'r genom cyfeirio sscrofa11.1.Yn gyffredinol, mae Hisat2 yn cefnogi genomau o unrhyw faint, gan gynnwys genomau mwy na 4 biliwn o ganolfannau, a gosodir gwerthoedd diofyn ar gyfer y mwyafrif o baramedrau.Gellir alinio darlleniadau splicing o ddata RNA SEQ yn effeithlon gan ddefnyddio HisAT2, y system gyflymaf sydd ar gael ar hyn o bryd, gyda'r un cywirdeb neu well cywirdeb nag unrhyw ddull arall.
Mae digonedd y trawsgrifiadau yn adlewyrchu'n uniongyrchol lefel mynegiant genynnau.Asesir lefelau mynegiant genynnau yn ôl digonedd y trawsgrifiadau (cyfrif dilyniannu) sy'n gysylltiedig â'r genom neu'r exons.Mae nifer y darlleniadau yn gymesur â lefelau mynegiant genynnau, hyd genynnau, a dyfnder dilyniant.Cyfrifwyd FPKM (darnau fesul mil o barau sylfaen o drawsgrifiad fesul miliwn o barau sylfaen) a phenderfynwyd ar werthoedd p-fynegiant gwahaniaethol gan ddefnyddio'r pecyn DESEQ2.Yna gwnaethom gyfrifo'r gyfradd darganfod ffug (FDR) ar gyfer pob gwerth P gan ddefnyddio dull Benjamini-Hochberg9 yn seiliedig ar y R-swyddogaeth adeiledig “P.adjust”.
Troswyd RNA wedi'i ynysu o adrannau'r galon i cDNA mewn crynodiad o 200 ng/μl gan ddefnyddio cymysgedd meistr SuperScript IV Vilo o Thermo (Thermo, Cat. Rhif 11756050).Perfformiwyd RT-PCR meintiol gan ddefnyddio plât microamp plât endura biosystems cymhwysol 384-well plât adwaith tryloyw (Thermo, cath. Rhif 4483319) a glud optegol microamp (Thermo, Cat. Rhif. 4311971).Roedd y gymysgedd adweithio yn cynnwys cymysgedd meistr datblygedig cyflym 5 µl taqman (Thermo, Cat # 4444557), primer taqman 0.5 µl a 3.5 µl H2O cymysg fesul ffynnon.Rhedwyd cylchoedd qPCR safonol a mesurwyd gwerthoedd CT gan ddefnyddio offeryn PCR amser real Biosystems Quantstudio 5 (modiwl 384-ffynnon; cynnyrch # A28135).Prynwyd primers Taqman gan Thermo (GAPDH (SS03375629_U1), PARP12 (SS06908795_M1), PKDCC (SS06903874_M1), CYGB (SS069000011 (SSG111), ROC1), ROG181), ROG 8_mh), gata4 (ss03383805_u1), gja1 (ss03374839_u1), col1a2 (ss03375009_u1), col3a1 (ss04323794_m1) ACLECOME1), ACLECOME1), ACLECOMS Apdh.
Aseswyd rhyddhau NT-ProBNP yn y cyfryngau gan ddefnyddio'r pecyn NT-Probnp (mochyn) (Cat. Rhif MBS2086979, MyBiosource) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr.Yn fyr, ychwanegwyd 250 µl o bob sampl a safon yn ddyblyg i bob ffynnon.Yn syth ar ôl ychwanegu'r sampl, ychwanegwch 50 µl o ymweithredydd assay A i bob ffynnon.Ysgwydwch y plât yn ysgafn a'i selio â seliwr.Yna deorwyd y tabledi ar 37 ° C am 1 awr.Yna allsugno'r toddiant a golchwch y ffynhonnau 4 gwaith gyda 350 µl o doddiant golchi 1x, gan ddeor yr hydoddiant golchi am 1-2 munud bob tro.Yna ychwanegwch 100 µl o ymweithredydd assay B y ffynnon a'i selio gyda seliwr plât.Cafodd y dabled ei hysgwyd yn ysgafn a'i deori ar 37 ° C am 30 munud.Allsugno'r toddiant a golchwch y ffynhonnau 5 gwaith gyda 350 µl o doddiant golchi 1x.Ychwanegwch 90 µl o doddiant swbstrad i bob ffynnon a seliwch y plât.Deorwch y plât ar 37 ° C am 10-20 munud.Ychwanegwch ddatrysiad stopio 50 µl i bob ffynnon.Mesurwyd y plât ar unwaith gan ddefnyddio darllenydd plât Cytation (Biotek) wedi'i osod ar 450 nm.
Perfformiwyd dadansoddiadau pŵer i ddewis y meintiau grŵp a fydd yn darparu> pŵer 80% i ganfod newid absoliwt 10% yn y paramedr gyda chyfradd gwallau math I 5%. Perfformiwyd dadansoddiadau pŵer i ddewis y meintiau grŵp a fydd yn darparu> pŵer 80% i ganfod newid absoliwt 10% yn y paramedr gyda chyfradd gwallau math I 5%. Аализ мощности ынл выполнен для выбора разеров групп v, которые обеспечат> 80% мщззззз down dough helaeth ения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Perfformiwyd dadansoddiad pŵer i ddewis meintiau grŵp a fyddai'n darparu> pŵer 80% i ganfod newid paramedr absoliwt 10% gyda chyfradd gwallau math I 5%.CC Ыыл проведен анализ мощностectr енения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Perfformiwyd dadansoddiad pŵer i ddewis maint grŵp a fyddai’n darparu> pŵer 80% i ganfod newid paramedr absoliwt 10% a chyfradd gwallau math I 5%.Dewiswyd adrannau meinwe ar hap cyn yr arbrawf.Roedd yr holl ddadansoddiadau'n ddall cyflwr a datgodiwyd samplau dim ond ar ôl i'r holl ddata gael ei ddadansoddi.Defnyddiwyd meddalwedd GraphPad Prism (San Diego, CA) i berfformio'r holl ddadansoddiadau ystadegol. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05. Для всей статистики p-значения считались значи gof при значениях <0,05. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05.对于 所有 统计 数据 ， p 值 在值 <0.05 时 被 认为 是 显着 的。。对于 所有 统计 数据 ， p 值 在值 <0.05 时 被 认为 是 显着 的。。 Для всей статистики p-значения считались значи gof при значениях <0,05. Ar gyfer yr holl ystadegau, ystyriwyd bod gwerthoedd-p yn arwyddocaol ar werthoedd <0.05.Perfformiwyd prawf t Myfyrwyr dwy gynffon ar y data gyda dim ond 2 gymariaeth.Defnyddiwyd ANOVA unffordd neu ddwy ffordd i bennu arwyddocâd rhwng grwpiau lluosog.Wrth berfformio profion post hoc, cymhwyswyd cywiriad Tukey i gyfrif am sawl cymariaethau.Mae gan ddata RNasec ystyriaethau ystadegol arbennig wrth gyfrifo FDR a P.adjust fel y disgrifir yn yr adran dulliau.
I gael mwy o wybodaeth am ddylunio astudiaeth, gweler yr adroddiad ymchwil natur haniaethol sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon.