Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden vil vi for at sikre fortsat understøttelse vise webstedet uden stilarter og JavaScript.
Morfogenese i den menneskelige tarm etablerer krypt-villus-funktioner i 3D-epitelmikroarkitektur og rumlig organisering. Denne unikke struktur er nødvendig for at opretholde tarmhomeostase ved at beskytte stamcelle-nichen i basalkrypten mod eksogene mikrobielle antigener og deres metabolitter. Derudover præsenterer tarmvilli og secernerende slim funktionelt differentierede epitelceller med en beskyttende barriere på tarmslimhindens overflade. Derfor er genskabelse af 3D-epitelstrukturer afgørende for konstruktionen af ​​in vitro-tarmmodeller. Især kan den organiske mimetiske gut-on-a-chip inducere spontan 3D-morfogenese af tarmepitelet med forbedrede fysiologiske funktioner og biomekanik. Her leverer vi en reproducerbar protokol til robust at inducere tarmmorfogenese i tarmen på en mikrofluidisk chip såvel som i en Transwell-indlejret hybridchip. Vi beskriver detaljerede metoder til fremstilling af enheder, dyrkning af Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller i konventionelle omgivelser såvel som på en mikrofluidisk platform, induktion af 3D-morfogenese og karakterisering. af etablerede 3D-epitelceller ved hjælp af flere billeddannelsesmodaliteter. Denne protokol opnår regenerering af funktionel tarmmikroarkitektur ved at kontrollere basolateral væskestrøm i 5 dage. Vores in vitro-morfogenesemetode anvender fysiologisk relevant forskydningsspænding og mekanisk bevægelse og kræver ikke kompleks cellemanipulation eller -manipulation, som kan overgå andre eksisterende teknikker. Vi forestiller os, at vores foreslåede protokol kan have brede implikationer for det biomedicinske forskningsmiljø og give en metode til at regenerere 3D-tarmepitelag in vitro til biomedicinske, kliniske og farmaceutiske anvendelser.
Eksperimenter viser, at intestinale epiteliale Caco-2-celler dyrket i gut-on-a-chip1,2,3,4,5 eller dobbeltlagede mikrofluidiske enheder6,7 kan undergå spontan 3D-morfogenese in vitro uden en klar forståelse af den underliggende mekanisme. I vores nylige undersøgelse fandt vi, at fjernelse af basolateralt secernerede morfogenantagonister fra kulturenheder er nødvendig og tilstrækkelig til at inducere 3D-epitelial morfogenese in vitro, hvilket er blevet påvist af Caco-2 og patient-afledte intestinale organoider. Epitelceller blev valideret. I dette studie fokuserede vi specifikt på celleproduktionen og koncentrationsfordelingen af ​​en potent Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), i gut-on-a-chip og modificerede mikrofluidiske enheder indeholdende Transwell-indsatser, kaldet "Hybrid Chip". Vi demonstrerer, at tilsætning af eksogene Wnt-antagonister (såsom DKK-1, Wnt-repressor 1, sekreteret frizzled-related protein 1 eller Soggy-1) til den on-chip tarm hæmmer morfogenese eller forstyrrer det præstrukturerede 3D-epitellag, hvilket tyder på, at antagonistisk stress under dyrkning er ansvarlig for intestinal morfogenese in vitro. Derfor er en praktisk tilgang til at opnå robust morfogenese ved epitelgrænsefladen at fjerne eller minimalt opretholde niveauerne af Wnt-antagonister i det basolaterale kompartment ved aktiv skylning (f.eks. i gut-on-a-chip eller hybrid-on-a-chip platforme) eller diffusion. Basolaterale medier (f.eks. fra Transwell-indsatser til store basolaterale reservoirer i brønde).
I denne protokol giver vi en detaljeret metode til fremstilling af gut-on-a-chip-mikroenheder og Transwell-indsættelige hybridchips (trin 1-5) til dyrkning af intestinale epitelceller på polydimethylsiloxan (PDMS)-baserede porøse membraner (trin 6A, 7A, 8, 9) eller polyestermembraner af Transwell-indsatser (trin 6B, 7B, 8, 9) og induceret 3D-morfogenese in vitro (trin 10). Vi identificerede også cellulære og molekylære træk, der indikerer vævsspecifik histogenese og afstamningsafhængig celledifferentiering, ved at anvende flere billeddannelsesmodaliteter (trin 11-24). Vi inducerer morfogenese ved hjælp af humane intestinale epitelceller, såsom Caco-2 eller intestinale organoider, i to kulturformater med tekniske detaljer, herunder overflademodifikation af porøse membraner, oprettelse af 2D-monolag og intestinal biokemisk og reproduktion af det biomekaniske mikromiljø in vitro. For at inducere 3D-morfogenese fra 2D-epitelmonolag fjernede vi morfogen. antagonister i begge dyrkede former ved at lade mediet strømme ind i kulturens basolaterale kompartment. Endelig giver vi en repræsentation af anvendeligheden af ​​et regenererbart 3D-epitellag, der kan bruges til at modellere morfogenafhængig epitelvækst, longitudinelle vært-mikrobiom-co-kulturer, patogeninfektion, inflammatorisk skade, epitelbarriere-dysfunktion og probiotika-baserede terapier Eksempel.påvirkninger.
Vores protokol kan være nyttig for en bred vifte af forskere inden for grundforskning (f.eks. tarmslimhindebiologi, stamcellebiologi og udviklingsbiologi) og anvendt forskning (f.eks. præklinisk lægemiddeltestning, sygdomsmodellering, vævsteknologi og gastroenterologi) med bred effekt. På grund af reproducerbarheden og robustheden af ​​vores protokol til at inducere 3D-morfogenese af tarmepitelet in vitro, forestiller vi os, at vores tekniske strategi kan formidles til et publikum, der studerer dynamikken i cellesignalering under tarmudvikling, regenerering eller homeostase. Derudover er vores protokol nyttig til at undersøge infektion under forskellige infektiøse agenser såsom Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 eller Vibrio cholerae. Målgrupper for sygdomspatologi og patogenese er også nyttige. Brugen af ​​et on-chip tarmmikrofysiologisystem kan muliggøre longitudinel co-kultur 10 og efterfølgende vurdering af værtens forsvar, immunresponser og patogenrelateret skadereparation i mave-tarmkanalen (GI) 11. Andre GI-lidelser forbundet med utæt tarmsyndrom, cøliaki, Crohns sygdom, ulcerøs colitis, pouchitis eller irritabel tarmsyndrom kan simuleres, når 3D-tarmepitelag fremstilles ved hjælp af patientens 3D-tarmepitelag. Disse sygdomme omfatter villusatrofi, kryptforkortning, slimhindeskade eller nedsat epitelbarriere. Biopsi eller stamcelleafledte tarmorganoider 12,13. For bedre at modellere den højere kompleksitet af sygdomsmiljøet kan læsere overveje at tilføje sygdomsrelevante celletyper, såsom patientens perifere blodmononukleære celler (PBMC'er), til modeller, der indeholder 3D-tarmvillus-krypt-mikroarkitekturer. Vævsspecifikke immunceller, 5.
Da 3D-epitelmikrostruktur kan fikseres og visualiseres uden sektioneringsprocessen, kan seere, der arbejder med spatial transkriptomik og billeddannelse med høj opløsning eller super opløsning, være interesserede i vores kortlægning af den spatiotemporale dynamik af gener og proteiner på epitelnicher. Interesseret i teknologi. Reaktion på mikrobielle eller immune stimuli. Desuden kan longitudinel vært-mikrobiom-krydstale 10, 14, der koordinerer tarmhomeostase, etableres i 3D-tarmslimhinnelaget ved at co-dyrke forskellige mikrobielle arter, mikrobielle samfund eller fækal mikrobiota, især i gut-on-a-chip. i platformen. Denne tilgang er særligt attraktiv for målgrupper, der studerer mukosal immunologi, gastroenterologi, humant mikrobiom, kulturomik og klinisk mikrobiologi, der søger at dyrke tidligere udyrket tarmmikrobiota i laboratoriet. Hvis vores in vitro-morfogeneseprotokol kan tilpasses til skalerbare kulturformater, såsom multibrøndsindsatser i plader med 24, 96 eller 384 brønde, der kontinuerligt genopfylder basolaterale rum, kan protokollen også formidles til dem, der udvikler farmaceutiske, biomedicinske eller højkapacitetsscreenings- eller valideringsplatforme til fødevareindustrien. Som et proof-of-principle demonstrerede vi for nylig muligheden for et multiplex højkapacitetsmorfogenesesystem, der kan skaleres til et 24-brønds pladeformat. Derudover er flere organ-on-a-chip-produkter blevet kommercialiseret16,17,18. Derfor kan valideringen af ​​vores in vitro-morfogenesemetode accelereres og potentielt anvendes af mange forskningslaboratorier, industri eller offentlige og regulerende myndigheder for at forstå cellulær omprogrammering af in vitro-tarmmorfogenese på transkriptomisk niveau for at teste lægemidler eller bioterapeutika. Absorptionen og Transport af lægemiddelkandidater blev vurderet ved hjælp af 3D-tarmsurrogater eller ved hjælp af brugerdefinerede eller kommercielle organ-på-en-chip-modeller til at vurdere reproducerbarheden af ​​​​tarmmorfogeneseprocessen.
Et begrænset antal humanrelevante eksperimentelle modeller er blevet brugt til at studere tarmepitelmorfogenese, primært på grund af manglen på implementerbare protokoller til at inducere 3D-morfogenese in vitro. Faktisk er meget af den nuværende viden om tarmmorfogenese baseret på dyreforsøg (f.eks. zebrafisk20, mus21 eller kyllinger22). De er dog arbejds- og omkostningsintensive, kan være etisk tvivlsomme og vigtigst af alt, bestemmer ikke præcist menneskelige udviklingsprocesser. Disse modeller er også meget begrænsede i deres evne til at blive testet på en skalerbar måde med flere veje. Derfor overgår vores protokol til regenerering af 3D-vævsstrukturer in vitro in vivo-dyremodeller såvel som andre traditionelle statiske 2D-cellekulturmodeller. Som tidligere beskrevet tillod brugen af ​​3D-epitelstrukturer os at undersøge den rumlige lokalisering af differentierede celler i krypt-villus-aksen som reaktion på forskellige slimhinde- eller immunstimuli. 3D-epitellag kan give plads til at studere, hvordan mikrobielle celler konkurrerer om at danne rumlige nicher og økologisk udvikling som reaktion på værtsfaktorer (f.eks. indre versus ydre slimlag, sekretion af IgA og antimikrobielle peptider). Desuden kan 3D-epitelmorfologi give os mulighed for at forstå, hvordan tarmmikrobiotaen strukturerer sine samfund og synergistisk producerer mikrobielle metabolitter (f.eks. kortkædede fedtsyrer), der former cellulær organisation og stamcellenicher i basalkrypterne. Disse egenskaber kan kun påvises, når 3D-epitellag etableres in vitro.
Ud over vores metode til at skabe 3D-intestinale epitelstrukturer findes der flere in vitro-metoder. Intestinal organoidkultur er en avanceret vævsteknologiteknik baseret på dyrkning af intestinale stamceller under specifikke morfogenbetingelser23,24,25. Brugen af ​​3D-organoidmodeller til transportanalyse eller vært-mikrobiom-co-kulturer er dog ofte udfordrende, fordi tarmlumen er indesluttet i organoidet, og derfor er introduktionen af ​​luminale komponenter såsom mikrobielle celler eller eksogene antigener begrænset. Adgang til organoidlumen kan forbedres ved hjælp af en mikroinjektor,26,27 men denne metode er invasiv og arbejdskrævende og kræver specialiseret viden at udføre. Desuden afspejler traditionelle organoidkulturer, der vedligeholdes i hydrogel-stilladser under statiske forhold, ikke nøjagtigt aktiv in vivo-biomekanik.
Andre tilgange, der anvendes af adskillige forskningsgrupper, anvender præstrukturerede 3D-hydrogel-stilladser til at efterligne tarmens epitelstruktur ved at dyrke isolerede humane tarmceller på geloverfladen. Fremstil hydrogel-stilladser ved hjælp af 3D-printede, mikrofresede eller litografisk fremstillede forme. Denne metode viser det selvorganiserede arrangement af isolerede epitelceller in vitro med fysiologisk relevante morfogengradienter, der etablerer en epitelstruktur med højt aspektforhold og stroma-epitel-krydstale ved at inkludere stromale celler i stilladset. Imidlertid kan karakteren af ​​præstrukturerede stilladser forhindre visningen af ​​selve den spontane morfogenetiske proces. Disse modeller giver heller ikke dynamisk luminal eller interstitiel strømning, da de mangler den væskeforskydningsspænding, som tarmceller har brug for for at gennemgå morfogenese og opnå fysiologisk funktion. En anden nylig undersøgelse brugte hydrogel-stilladser i en mikrofluidisk platform og mønstrede tarmepitelstrukturer ved hjælp af laserætsningsteknikker. Musetarmorganoider følger ætsede mønstre for at danne tarmrørformede strukturer, og intraluminal væskestrømning kan rekapituleres ved hjælp af en mikrofluidikmodul. Denne model udviser dog hverken spontane morfogenetiske processer eller inkluderer tarmmekanobiologiske bevægelser. 3D-printteknikker fra samme gruppe var i stand til at skabe miniature tarmrør med spontane morfogenetiske processer. Trods den komplekse fremstilling af forskellige tarmsegmenter i røret mangler denne model også luminal væskestrømning og mekanisk deformation. Derudover kan modellens operabilitet være begrænset, især efter at bioprintprocessen er afsluttet, hvilket forstyrrer eksperimentelle forhold eller celle-til-celle-interaktioner. I stedet giver vores foreslåede protokol spontan tarmmorfogenese, fysiologisk relevant forskydningsspænding, biomekanik, der efterligner tarmmotilitet, tilgængelighed af uafhængige apikale og basolaterale rum og genskabelse af komplekse biologiske mikromiljøer med modularitet. Derfor kan vores in vitro 3D-morfogeneseprotokol give en komplementær tilgang til at overvinde udfordringerne ved eksisterende metoder.
Vores protokol er udelukkende fokuseret på 3D epitelmorfogenese, med kun epitelceller i kultur og ingen andre typer omgivende celler såsom mesenkymale celler, endotelceller og immunceller. Som tidligere beskrevet er kernen i vores protokol induktion af epitelmorfogenese ved at fjerne morfogeninhibitorer, der udskilles på den basolaterale side af det introducerede medium. Mens den robuste modularitet af vores gut-on-a-chip og hybrid-on-a-chip giver os mulighed for at genskabe det bølgende 3D epitellag, skal yderligere biologiske kompleksiteter såsom epitel-mesenkymale interaktioner33,34, ekstracellulær matrix (ECM) aflejring35 og, i vores model, krypt-villus-funktioner, der formidler stamcelle-nicher i basale krypter, overvejes yderligere. Stromale celler (f.eks. fibroblaster) i mesenkymet spiller en nøglerolle i produktionen af ​​ECM-proteiner og regulering af intestinal morfogenese in vivo35,37,38. Tilføjelsen af ​​mesenkymale celler Vores model forbedrede den morfogenetiske proces og cellehæftningseffektiviteten. Endotellaget (dvs. kapillærer eller lymfekar) spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​molekylær transport39 og immuncelle-rekruttering40 i tarmmikromiljøet. Desuden er vaskulaturkomponenter, der kan forbindes mellem vævsmodeller, en forudsætning, når vævsmodeller designes til at demonstrere interaktioner mellem flere organer. Derfor kan det være nødvendigt at inkludere endotelceller for at modellere mere præcise fysiologiske træk med opløsning på organniveau. Patientafledte immunceller er også essentielle for at vise medfødte immunresponser, antigenpræsentation, medfødt adaptiv immunkrydstale og vævsspecifik immunitet i forbindelse med efterligning af tarmsygdomme.
Brugen af ​​hybridchips er mere ligetil end tarm-på-en-chip, fordi enhedens opsætning er enklere, og brugen af ​​Transwell-indsatser muliggør skalerbar dyrkning af tarmepitelet. Kommercielt tilgængelige Transwell-indsatser med polyestermembraner er dog ikke elastiske og kan ikke simulere peristaltiske bevægelser. Desuden forblev det apikale rum i Transwell-indsatsen placeret i hybridchippen stationært uden forskydningsspænding på den apikale side. Det er tydeligt, at de statiske egenskaber i det apikale rum sjældent muliggør langvarig bakteriel samkultur i hybridchips. Selvom vi robust kan inducere 3D-morfogenese i Transwell-indsatser, når vi bruger hybridchips, kan manglen på fysiologisk relevant biomekanik og apikal væskestrømning begrænse muligheden for hybridchipplatforme til potentielle anvendelser.
Fuldskala rekonstruktioner af den humane krypt-villus-akse i gut-on-a-chip og hybrid-on-a-chip kulturer er ikke fuldt ud etableret. Da morfogenese begynder fra et epitelmonolag, giver 3D-mikroarkitekturer ikke nødvendigvis morfologisk lighed med krypter in vivo. Selvom vi karakteriserede den prolifererende cellepopulation nær det basale kryptdomæne i det mikrokonstruerede 3D-epitel, var krypt- og villusregionerne ikke klart afgrænset. Selvom højere øvre kanaler på chippen fører til øget højde af det mikrokonstruerede epitel, er den maksimale højde stadig begrænset til ~300-400 µm. Den faktiske dybde af humane tarmkrypter i tyndtarmen og tyktarmen er henholdsvis ~135 µm og ~400 µm, og højden af ​​tyndtarmens villi er ~600 µm41.
Fra et billeddannelsessynspunkt kan in situ superopløsningsbilleddannelse af 3D-mikroarkitekturer være begrænset til tarmen på en chip, da den nødvendige arbejdsafstand fra objektivlinsen til epitellaget er i størrelsesordenen et par millimeter. For at overvinde dette problem kan et fjerntliggende objektiv være nødvendigt. Desuden er det udfordrende at lave tynde snit til forberedelse af billedprøver på grund af PDMS' høje elasticitet. Da lag-for-lag-mikrofabrikation af tarmen på en chip involverer permanent adhæsion mellem hvert lag, er det ekstremt udfordrende at åbne eller fjerne det øverste lag for at undersøge overfladestrukturen af ​​epitellaget. For eksempel ved hjælp af et scanningselektronmikroskop (SEM).
PDMS' hydrofobicitet har været en begrænsende faktor i mikrofluidbaserede studier, der beskæftiger sig med hydrofobe små molekyler, da PDMS kan adsorbere sådanne hydrofobe molekyler uspecifikt. Alternativer til PDMS kan overvejes med andre polymere materialer. Alternativt kan overflademodifikation af PDMS (f.eks. belægning med lipofile materialer 42 eller poly(ethylenglycol) 43) overvejes for at minimere adsorption af hydrofobe molekyler.
Endelig er vores metode ikke blevet velkarakteriseret med hensyn til at levere en screeningsplatform med høj kapacitet eller en brugervenlig "one-size-fits-all"-forsøgsplatform. Den nuværende protokol kræver en sprøjtepumpe pr. mikroenhed, hvilket optager plads i en CO2-inkubator og forhindrer storskalaforsøg. Denne begrænsning kan forbedres betydeligt ved skalerbarheden af ​​innovative kulturformater (f.eks. porøse indsatser med 24 brønde, 96 brønde eller 384 brønde, der tillader kontinuerlig genopfyldning og fjernelse af basolaterale medier).
For at inducere 3D-morfogenese af humant tarmepitel in vitro, anvendte vi en mikrofluidisk chip-intestinal enhed indeholdende to parallelle mikrokanaler og en elastisk porøs membran imellem for at skabe en lumen-kapillær grænseflade. Vi demonstrerer også brugen af ​​en enkeltkanals mikrofluidisk enhed (en hybridchip), der giver kontinuerlig basolateral flow under polariserede epitellag dyrket på Transwell-indsatser. I begge platforme kan morfogenese af forskellige humane tarmepitelceller demonstreres ved at anvende retningsbestemt manipulation af flowet for at fjerne morfogenantagonister fra det basolaterale rum. Hele den eksperimentelle procedure (figur 1) består af fem dele: (i) mikrofabrikation af tarmchippen eller Transwell-indsættelige hybridchip (trin 1-5; boks 1), (ii) fremstilling af tarmepitelceller (Caco-2-celler) eller humane tarmorganoider; boks 2-5), (iii) dyrkning af tarmepitelceller på tarmchips eller hybridchips (trin 6-9), (iv) induktion af 3D-morfogenese in vitro (trin 10) og (v)) for at karakterisere den 3D-epiteliale mikrostruktur (trin 11-24). Endelig blev en passende kontrolgruppe (diskuteret yderligere nedenfor) designet til at validere effektiviteten af ​​in vitro-morfogenese ved at sammenligne epitelmorfogenese med rumlige, tidsmæssige, betingede eller proceduremæssige kontroller.
Vi brugte to forskellige kulturplatforme: gut-on-a-chip med lige kanaler eller ikke-lineære, indviklede kanaler eller hybridchips indeholdende Transwell (TW)-indsatser i en mikrofluidisk enhed, fremstillet som beskrevet i boks 1, og trin 1-5. ”Enhedsfremstilling” viser de vigtigste trin i fremstillingen af ​​en enkelt chip eller en hybridchip. ”Kultur af humane tarmepitelceller” forklarer cellekilden (Caco-2 eller humane tarmorganoider) og dyrkningsproceduren, der anvendes i denne protokol. ”In vitro-morfogenese” viser de overordnede trin, hvor Caco-2 eller organoid-afledte epitelceller dyrkes på en tarmchip eller på Transwell-indsatser i en hybridchip, efterfulgt af induktion af 3D-morfogenese og dannelsen af ​​en karakteriseret epitelstruktur. Programtrinnummeret eller boksnummeret vises under hver pil. Applikationen giver eksempler på, hvordan etablerede tarmepitellag kan bruges, for eksempel til celledifferentieringskarakterisering, tarmfysiologiske studier, etablering af vært-mikrobiomøkosystemer og sygdomsmodellering. Immunofluorescens Billeder i "Cell Differentiation" viser kerner, F-actin og MUC2 udtrykt i 3D Caco-2 epitellaget genereret på tarmchippen. MUC2-signalering er til stede i bægerceller og slim udskilt fra slimhindeoverflader. Fluorescerende billeder i Gut Physiology viser slim produceret ved farvning for sialinsyre og N-acetylglucosaminrester ved hjælp af fluorescerende hvedekimagglutinin. De to overlappende billeder i "Host-Microbe Co-Cultures" viser repræsentative vært-mikrobiom-co-kulturer i tarmen på en chip. Venstre panel viser co-kulturen af ​​E. coli, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), med mikrokonstruerede 3D Caco-2 epitelceller. Højre panel viser lokaliseringen af ​​GFP E. coli co-dyrket med 3D Caco-2 epitelceller, efterfulgt af immunofluorescensfarvning med F-actin (rød) og kerner (blå). Sygdomsmodellering illustrerer sund versus utæt tarm i tarmbetændelseschips under fysiologisk udfordring med bakterielle antigener (f.eks. lipopolysaccharid, LPS) og immunceller (f.eks. PBMC; grøn). Caco-2-celler blev dyrket for at etablere et 3D-epitellag. Skalalinje, 50 µm. Billeder i nederste række: "Differentiering af celler" tilpasset med tilladelse fra reference.2. Oxford University Press; Gengivet med tilladelse fra Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" tilpasset med tilladelse fra ref.3. NAS; "Disease Modeling" tilpasset med tilladelse fra reference.5. NAS.
Både gut-on-chip og hybridchips blev fremstillet ved hjælp af PDMS-replikaer, der blev afformet fra siliciumforme ved blød litografi1,44 og mønstret med SU-8. Designet af mikrokanalerne i hver chip bestemmes ved at overveje hydrodynamik såsom forskydningsspænding og hydrodynamisk tryk1,4,12. Det originale gut-on-a-chip-design (Extended Data Fig. 1a), som bestod af to sidestillede parallelle lige mikrokanaler, har udviklet sig til et komplekst gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b), der inkluderer et par buede mikrokanaler for at inducere øget væskeopholdstid, ikke-lineære strømningsmønstre og multiaksial deformation af dyrkede celler (Fig. 2a-f)12. Når mere kompleks tarmbiomekanik skal genskabes, kan kompleks gut-on-a-chips vælges. Vi har vist, at den komplicerede Gut-Chip også kraftigt inducerer 3D-morfogenese i en lignende tidsramme med en lignende grad af epitelvækst sammenlignet med den originale. Gut-Chip, uanset den dyrkede celletype. For at inducere 3D-morfogenese er lineære og komplekse on-chip-tarmdesign derfor udskiftelige. PDMS-replikaer hærdet på silikoneforme med SU-8-mønstre gav negative egenskaber efter afformning (fig. 2a). For at fremstille tarmen på en chip blev det forberedte øvre PDMS-lag sekventielt bundet til en porøs PDMS-film og derefter justeret med det nedre PDMS-lag ved irreversibel binding ved hjælp af en koronabehandler (fig. 2b-f). For at fremstille hybridchips blev hærdede PDMS-replikaer bundet til objektglas for at skabe enkeltkanals mikrofluidiske enheder, der kunne rumme Transwell-indsatser (fig. 2h og udvidede data fig. 2). Bindingsprocessen udføres ved at behandle overfladerne af PDMS-replikaen og glasset med oxygenplasma eller koronabehandling. Efter sterilisering af den mikrofabrikerede enhed, der var fastgjort til silikonerøret, var enhedsopsætningen klar til at udføre 3D-morfogenese af tarmepitelet (figur 2g).
a, Skematisk illustration af fremstillingen af ​​PDMS-dele fra SU-8-mønstrede siliciumforme. Den uhærdede PDMS-opløsning blev hældt på en siliciumform (venstre), hærdet ved 60 °C (midten) og taget ud af formen (højre). Den taget ud af formen blev skåret i stykker og renset til videre brug. b, Fotografi af siliciumformen, der blev brugt til at fremstille PDMS' øvre lag. c, Fotografi af siliciumformen, der blev brugt til at fremstille PDMS' porøse membran. d, En serie fotografier af de øvre og nedre PDMS-komponenter og den samlede on-chip tarmanordning. e, Skematisk oversigt over justeringen af ​​de øvre, membran- og nedre PDMS-komponenter. Hvert lag er irreversibelt bundet ved plasma- eller koronabehandling. f, Skematisk oversigt over den fremstillede tarm-på-en-chip-anordning med overlejrede, snoede mikrokanaler og vakuumkamre. g, Opsætning af tarm-på-en-chip til mikrofluidisk cellekultur. Den fremstillede tarm-på-en-chip samlet med et silikonerør og en sprøjte blev placeret på et dækglas. Chipanordningen blev placeret på låg på en 150 mm petriskål til behandling. Bindemidlet bruges til at lukke silikonerøret. h, Visuelle snapshots af hybridchipfremstilling og 3D-morfogenese ved hjælp af hybridchips. Transwell-indsatser fremstillet uafhængigt til dyrkning af 2D-monolag af tarmepitelceller blev indsat i hybridchippen for at inducere tarm 3D-morfogenese. Mediet perfunderes gennem mikrokanaler under cellelaget etableret på Transwell-indsatsen. Skalalinje, 1 cm. h Genoptrykt med tilladelse fra reference.4. Elsevier.
I denne protokol blev Caco-2-cellelinjen og intestinale organoider anvendt som epitelkilder (fig. 3a). Begge celletyper blev dyrket uafhængigt (boks 2 og boks 5) og brugt til at pode de ECM-coatede mikrokanaler fra on-chip tarm- eller Transwell-indsatser. Når cellerne er konfluente (>95% dækning i kolber), høstes rutinemæssigt dyrkede Caco-2-celler (mellem passager 10 og 50) i T-kolber for at fremstille dissocierede cellesuspensioner ved hjælp af trypsiniseringsvæske (boks 2). Humane intestinale organoider fra intestinale biopsier eller kirurgiske resektioner blev dyrket i Matrigel scaffold domes i 24-brønds plader for at understøtte det strukturelle mikromiljø. Medium indeholdende essentielle morfogener (såsom Wnt, R-spondin og Noggin) og vækstfaktorer fremstillet som beskrevet i boks 3 blev suppleret hver anden dag, indtil organoiderne voksede til ~500 µm i diameter. Fuldt udvoksede organoider høstes og dissocieres til enkeltceller til podning på tarm eller Transwell-indsatser på en chip (boks 5). Som vi tidligere har rapporteret, kan det differentieres i henhold til sygdomstype12,13 (f.eks. colitis ulcerosa, Crohns sygdom, kolorektal cancer eller normal donor), læsionssted (f.eks. læsion versus ikke-læsioneret område) og gastrointestinal placering i trakten (f.eks. tolvfingertarm, jejunum, ileum, cecum, colon eller endetarm). Vi leverer en optimeret protokol i boks 5 til dyrkning af colonorganoider (koloider), der typisk kræver højere koncentrationer af morfogener end tyndtarmsorganoider.
a, Arbejdsgang til induktion af tarmmorfogenese i tarmchippen. Caco-2 humant tarmepitel og tarmorganoider anvendes i denne protokol til at demonstrere 3D-morfogenese. De isolerede epitelceller blev podet i den forberedte tarm-på-en-chip-enhed (chippræparation). Når cellerne er podet (podet) og fastgjort (vedhæftet) til PDMS' porøse membran på dag 0 (D0), initieres apikal (AP) flow og opretholdes i de første 2 dage (flow, AP, D0-D2). Basolateral (BL) flow initieres også sammen med cykliske strækbevægelser (stræk, flow, AP og BL), når et komplet 2D-monolag er dannet. Intestinal 3D-morfogenese forekom spontant efter 5 dages mikrofluidisk kultur (morfogenese, D5). Fasekontrastbilleder viser repræsentativ morfologi af Caco-2-celler på hvert eksperimentelt trin eller tidspunkt (søjlediagram, 100 µm). Fire skematiske diagrammer, der illustrerer de tilsvarende kaskader af tarmmorfogenese (øverst til højre). Den stiplede Pile i skematisk billede repræsenterer retningen af ​​væskestrømningen.b, SEM-billede, der viser overfladetopologien af ​​det etablerede 3D Caco-2-epitel (venstre). Indsætningen, der fremhæver det forstørrede område (hvid stiplet boks), viser de regenererede mikrovilli på 3D Caco-2-laget (højre).c, Horisontal frontalvisning af etableret Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rød) og kontinuerlige børstekantmembraner mærket F-actin (grøn) og kerner (blå). Immunofluorescens-konfokal visualisering af epitelceller på intestinale chips. Pile, der peger på den midterste skematiske visning, angiver placeringen af ​​fokalplanet for hver konfokal visning.d, Tidsforløb for morfologiske ændringer i organoider dyrket på en chip opnået ved fasekontrastmikroskopi på dag 3, 7, 9, 11 og 13. Indsætningen (øverst til højre) viser den høje forstørrelse af det medfølgende billede.e, DIC-fotomikrografi af organoid 3D-epitel etableret i tarmen på snit taget på dag 7.f, Overlejrede immunofluorescensbilleder viser markører for stamceller (LGR5; magenta), bægerceller (MUC2; grøn), F-actin (grå) og kerner (cyan) dyrket på tarmchips i henholdsvis 3 dage (venstre) og 13-dages (midterste) organoider på epitellaget. Se også udvidede data figur 3, som fremhæver LGR5-signalering uden MUC2-signalering. Fluorescensbilleder, der viser epitelmikrostrukturen (højre) af 3D-organoidt epitel etableret i tarmen på en chip ved farvning af plasmamembranen med CellMask-farvestof (højre) på dag 13 af kulturen. Skalalinjen er 50 μm, medmindre andet er angivet. b Genoptrykt med tilladelse fra reference. 2. Oxford University Press; c Tilpasset med tilladelse fra reference. 2. Oxford University Press; e og f tilpasset med tilladelse ved reference. 12 Under Creative Commons-licens CC BY 4.0.
I tarmen på en chip er det nødvendigt at modificere den hydrofobe overflade af PDMS' porøse membran for vellykket ECM-belægning. I denne protokol anvender vi to forskellige metoder til at modificere hydrofobiciteten af ​​PDMS-membraner. Til dyrkning af Caco-2-celler var overfladeaktivering alene ved UV/ozonbehandling tilstrækkelig til at reducere hydrofobiciteten af ​​PDMS-overfladen, belægge ECM'en og fastgøre Caco-2-celler til PDMS-membranen. Mikrofluidisk kultur af organoid epitel kræver dog kemisk baseret overfladefunktionalisering for at opnå effektiv aflejring af ECM-proteiner ved sekventielt at påføre polyethylenimin (PEI) og glutaraldehyd på PDMS-mikrokanaler. Efter overflademodifikation blev ECM-proteiner aflejret for at dække den funktionaliserede PDMS-overflade og derefter introduceret i det isolerede organoid epitel. Efter at cellerne er fastgjort, starter den mikrofluidiske cellekultur ved kun at perfundere mediet ind i den øvre mikrokanal, indtil cellerne danner et komplet monolag, mens den nedre mikrokanal opretholder statiske forhold. Denne optimerede metode til overfladeaktivering og ECM-belægning muliggør fastgørelse af organoid epitel for at inducere 3D-morfogenese på PDMS-overfladen.
Transwell-kulturer kræver også ECM-coating før cellepodning; Transwell-kulturer kræver dog ikke komplekse forbehandlingstrin for at aktivere overfladen af ​​porøse indsatser. Til dyrkning af Caco-2-celler på Transwell-indsatser accelererer ECM-coating på porøse indsatser bindingen af ​​dissocierede Caco-2-celler (<1 time) og dannelsen af ​​en tight junction-barriere (<1-2 dage). For at dyrke organoider på Transwell-indsatser podes isolerede organoider på ECM-coatede indsatser, fastgøres til membranoverfladen (<3 timer) og opretholdes, indtil organoiderne danner et komplet monolag med barriereintegritet. Transwell-kulturer udføres i 24-brønds plader uden brug af hybridchips.
In vitro 3D-morfogenese kan initieres ved at anvende væskestrøm til den basolaterale side af et etableret epitellag. I tarmen på en chip begyndte epitelmorfogenesen, da mediet blev perfunderet ind i de øvre og nedre mikrokanaler (fig. 3a). Som tidligere beskrevet er det kritisk at introducere væskestrøm i det inferiore (basolaterale) rum for kontinuerlig fjernelse af retningsbestemte sekreterede morfogeninhibitorer. For at give tilstrækkelige næringsstoffer og serum til celler bundet på porøse membraner og generere luminal forskydningsspænding anvender vi typisk dobbeltstrøm i tarmen på en chip. I hybridchips blev Transwell-indsatser indeholdende epitelmonolager indsat i hybridchipsene. Derefter blev mediet påført under den basolaterale side af den porøse Transwell-indsats gennem mikrokanalen. Intestinal morfogenese fandt sted 3-5 dage efter initiering af basolateral strømning i begge kulturplatforme.
De morfologiske træk ved mikrokonstruerede 3D-epitellag kan analyseres ved at anvende forskellige billeddannelsesmodaliteter, herunder fasekontrastmikroskopi, differentiel interferenskontrast (DIC) mikroskopi, SEM eller immunofluorescens-konfokalmikroskopi (figur 3 og 4). Fasekontrast- eller DIC-billeddannelse kan nemt udføres når som helst under dyrkningen for at overvåge formen og fremspringet af 3D-epitellag. På grund af den optiske gennemsigtighed af PDMS- og polyesterfilm kan både gut-on-a-chip- og hybridchipplatforme give realtids in situ-billeddannelse uden behov for sektionering eller adskillelse af enheden. Ved udførelse af immunofluorescensbilleddannelse (figur 1, 3c, f og 4b, c) fikseres celler typisk med 4% (vægt/vol) paraformaldehyd (PFA), efterfulgt af Triton X-100 og 2% (vægt/vol) bovint serumalbumin (BSA) i rækkefølge. Afhængigt af celletypen kan forskellige fikseringsmidler, permeabilisatorer og blokeringsmidler anvendes. Primære antistoffer, der målretter Afstamningsafhængige celle- eller regionmarkører bruges til at fremhæve celler immobiliseret in situ på chippen, efterfulgt af sekundære antistoffer sammen med et kontrastfarvestof, der er målrettet mod enten kernen (f.eks. 4',6-diamidino-2-phenylen) indol, DAPI) eller F-actin (f.eks. fluorescensmærket phalloidin). Fluorescensbaseret live-billeddannelse kan også udføres in situ for at detektere slimproduktion (fig. 1, "Celledifferentiering" og "Tarmfysiologi"), tilfældig kolonisering af mikrobielle celler (fig. 1, "Vært-mikrobe co-kultur"), rekruttering af immunceller (fig. 1, 'Sygdomsmodellering') eller konturerne af 3D epitelmorfologi (fig. 3c, f og 4b, c). Når tarmen på chippen modificeres for at adskille det øverste lag fra det nedre mikrokanallag, som beskrevet i ref. Som vist i fig. 2, kan 3D epitelmorfologien såvel som mikrovilli på den apikale børstekant visualiseres ved SEM. (Fig. 3b). Ekspressionen af ​​differentieringsmarkører kan vurderes ved at udføre kvantitativ PCR5- eller enkeltcelle-RNA-sekventering. I dette tilfælde høstes 3D-lag af epitelceller dyrket i tarmchips eller hybridchips ved trypsinisering og anvendes derefter til molekylær eller genetisk analyse.
a, Arbejdsgang til induktion af intestinal morfogenese i en hybridchip. Caco-2 og intestinale organoider anvendes i denne protokol til at demonstrere 3D-morfogenese i en hybridchipplatform. Dissocierede epitelceller blev podet i forberedte Transwell-indsatser (TW-forberedelse; se figur nedenfor). Når cellerne var podet (podet) og fastgjort til polyestermembraner i Transwell-indsatser, blev alle celler dyrket under statiske forhold (TW-kultur). Efter 7 dage blev et enkelt Transwell-indsats indeholdende et 2D-monolag af epitelceller integreret i en hybridchip for at introducere et basolateralt flow (Flow, BL), hvilket i sidste ende førte til genereringen af ​​et 3D-epitellag (morfogenese). Fasekontrastmikrografer, der viser morfologiske træk ved humane organepitelceller afledt af normal donor (C103-linje) ascenderende colon ved hvert eksperimentelt trin eller tidspunkt. Skematiske tegninger i de øverste lag illustrerer den eksperimentelle konfiguration for hvert trin. b, Hybridchips (venstre skematisk) kan føre til 3D-morfogenese af organoide epitelceller med Top-down konfokalmikroskopibilleder taget ved forskellige Z-positioner (øvre, midterste og nedre; se højre skematiske billede og tilsvarende stiplede linjer). viste tydelige morfologiske karakteristika. F-actin (cyan), kerne (grå). c, Fluorescens-konfokalmikrografer (3D-vinklet visning) af organoid-afledte epitelceller dyrket i statisk Transwell (TW; indsat i hvid stiplet boks) versus hybridchip (største fulde billede), der sammenligner henholdsvis 2D versus 3D-morfologi. Et par 2D lodrette tværsnitsvisninger (indsat i øverste højre hjørne; "XZ") viser også 2D- og 3D-funktioner. Skalalinje, 100 µm. c Genoptrykt med tilladelse fra reference.4. Elsevier.
Kontroller kan fremstilles ved at dyrke de samme celler (Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller) i todimensionelle monolag under konventionelle statiske dyrkningsbetingelser. Det er værd at bemærke, at der kan opstå næringsstofudtømning på grund af mikrokanalernes begrænsede volumenkapacitet (dvs. ~4 µL i den øverste kanal på det originale gut-chip-design). Derfor kan epitelmorfologien før og efter påføring af basolateral flow også sammenlignes.
Blødlitografiprocessen bør udføres i et rent rum. For hvert lag på chippen (øvre og nedre lag og membraner) og hybridchips blev der anvendt forskellige fotomasker, som blev fremstillet på separate siliciumwafere, fordi mikrokanalernes højder var forskellige. Målhøjderne for de øvre og nedre mikrokanaler i tarmen på chippen er henholdsvis 500 µm og 200 µm. Kanalmålhøjden for hybridchippen er 200 µm.
Placer en 7,5 cm siliciumwafer i en skål med acetone. Drej forsigtigt pladen i 30 sekunder, og lad derefter waferen lufttørre. Overfør waferen til en plade med IPA, og drej derefter pladen i 30 sekunder for at rengøre den.
En piranha-opløsning (blanding af hydrogenperoxid og koncentreret svovlsyre, 1:3 (vol/vol)) kan eventuelt anvendes til at maksimere fjernelsen af ​​organiske rester fra siliciumwaferens overflade.
Piranha-opløsning er ekstremt ætsende og genererer varme. Yderligere sikkerhedsforanstaltninger er nødvendige. Lad opløsningen køle af og overfør den til en ren, tør affaldsbeholder ved bortskaffelse. Brug sekundære beholdere, og mærk affaldsbeholderne korrekt. Følg venligst anlæggets sikkerhedsretningslinjer for mere detaljerede procedurer.
Dehydrer waferne ved at placere dem på en 200 °C varm plade i 10 minutter. Efter dehydrering blev waferen rystet fem gange i luft for at afkøle.
Hæld ~10 g fotoresist SU-8 2100 på midten af ​​den rengjorte siliciumwafer. Brug en pincet til at fordele fotoresisten jævnt på waferen. Placer waferen lejlighedsvis på en 65 °C varm plade for at gøre fotoresisten mindre klæbrig og lettere at fordele. Placer ikke waferen direkte på varmepladen.
SU-8 blev jævnt fordelt på waferen ved at køre spincoating. Programmer en indgående rotation af SU-8 i 5-10 sekunder til at udbrede sig ved 500 rpm med en acceleration på 100 rpm/s. Indstil hovedspinningen til 200 µm tykkelsesmønster ved 1.500 rpm, eller opnå en tykkelse på 250 µm (hvilket giver en højde på 500 µm for det øverste lag af tarmen på chippen; se "Kritiske trin" nedenfor) indstillet til en acceleration på 300 rpm/s 30 sekunder ved 1.200 rpm.
Hovedomdrejningshastigheden kan justeres i henhold til den ønskede tykkelse af SU-8-mønsteret på siliciumwaferen.
For at fremstille SU-8-mønstre med en højde på 500 µm til det øverste lag af tarmen på chippen, blev spin-coating- og soft bake-trinnene i denne boks (trin 7 og 8) gentaget sekventielt (se trin 9) for at producere to lag af 250 µm tykt SU-8, som kan lagdeles og sammenføjes ved UV-eksponering i trin 12 i denne boks, hvilket giver et lag på 500 µm.
Bag de SU-8-coatede wafere forsigtigt ved at placere dem på en varm plade ved 65 °C i 5 minutter, og skift derefter til 95 °C, og inkuber i yderligere 40 minutter.
For at opnå en højde på 500 μm af SU-8-mønsteret i den øvre mikrokanal, gentag trin 7 og 8 for at generere to 250 μm tykke SU-8-lag.
Brug UV-maskejusteringen til at udføre en lampetest i henhold til producentens anvisninger for at beregne waferens eksponeringstid. (eksponeringstid, ms) = (eksponeringsdosis, mJ/cm2)/(lampeeffekt, mW/cm2).
Efter bestemmelse af eksponeringstiden placeres fotomasken på maskeholderen på UV-maskejusteringen, og fotomasken placeres på den SU-8-belagte wafer.
Placer den trykte overflade af fotomasken direkte på den SU-8-belagte side af siliciumwaferen for at minimere UV-spredning.
Eksponér den SU-8-belagte wafer og fotomaske vertikalt for 260 mJ/cm2 UV-lys i den forudbestemte eksponeringstid (se trin 10 i denne boks).
Efter UV-eksponering blev SU-8-belagte siliciumskiver bagt ved 65 °C i 5 minutter og 95 °C i 15 minutter på hver varmeplade for at fremstille mønstre med en højde på 200 μm. Forlæng efterbagningstiden ved 95 °C til 30 minutter for at fremstille mønstre med en højde på 500 μm.
Fremkalderen hældes i en glasskål, og den bagte wafer placeres i skålen. Mængden af ​​SU-8-fremkalder kan variere afhængigt af glaspladens størrelse. Sørg for at bruge nok SU-8-fremkalder til helt at fjerne ueksponeret SU-8. For eksempel, når du bruger en glasskål med en diameter på 150 mm og en kapacitet på 1 liter, skal du bruge ~300 ml SU-8-fremkalder. Fremkald formen i 25 minutter med lejlighedsvis forsigtig rotation.
Skyl den udviklede form med ~10 mL frisk udvikler efterfulgt af IPA ved at sprøjte opløsningen med en pipette.
Placer waferen i en plasmarenser og udsæt den for iltplasma (atmosfærisk gas, måltryk 1 × 10−5 Torr, effekt 125 W) i 1,5 min.
Placer waferen i en vakuumekssikkator med et objektglas indeni. Wafere og objektglas kan placeres side om side. Hvis vakuumekssikkatoren er opdelt i flere lag af en plade, placeres objektglassene i det nederste kammer og wafere i det øvre kammer. Dryp 100 μL trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silanopløsning på et objektglas og påfør vakuum til silanisering.
Optø et hætteglas med frosne Caco-2-celler i et 37 °C vandbad, og overfør derefter de optøede celler til en T75-kolbe indeholdende 15 ml 37 °C forvarmet Caco-2-medium.
For at lade Caco-2-celler passere ved ~90% konfluens, opvarm først Caco-2-medium, PBS og 0,25% trypsin/1 mM EDTA i et 37°C vandbad.
Aspirer mediet ved vakuumaspiration. Vask cellerne to gange med 5 ml varmt PBS ved at gentage vakuumaspirationen og tilsætte frisk PBS.