Tak, fordi du besøgte Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset understøttelse af CSS. For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller slår kompatibilitetstilstand fra i Internet Explorer). I mellemtiden vil vi for at sikre fortsat support vise webstedet uden stilarter og JavaScript.
Menneskelig tarmmorfogenese etablerer krypt-villus-træk ved 3D-epitelmikroarkitektur og rumlig organisation.Denne unikke struktur er nødvendig for at opretholde tarmhomeostase ved at beskytte stamcelle-nichen i basalkrypten mod eksogene mikrobielle antigener og deres metabolitter.Derudover er tarmvilli og secernerende slim til stede funktionelt differentieret med en beskyttende celle for epitheliale overfladen på en beskyttende mucus. At bruge 3D-epitelstrukturer er afgørende for konstruktionen af ​​in vitro-tarmmodeller. Det er bemærkelsesværdigt, at den organiske mimetiske tarm-på-en-chip kan inducere spontan 3D-morfogenese af tarmepitelet med forbedrede fysiologiske funktioner og biomekanik.Her giver vi en reproducerbar protokol til at inducere tarm- og influensa-influensa-influensa-protokol, som er robust og robust induceret af tarmen. indlejret hybrid chip. Vi beskriver detaljerede metoder til fremstilling af enheder, dyrkning af Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller i konventionelle omgivelser såvel som på en mikrofluidisk platform, induktion af 3D morfogenese og karakterisering af etablerede 3D epitel ved hjælp af flere billeddannelsesmodaliteter. Denne protokol for funktionel regenerering af væsker i flowet opnås ved hjælp af vi5. tro morfogenese-metoden anvender fysiologisk relevant forskydningsspænding og mekanisk bevægelse og kræver ikke kompleks cellekonstruktion eller manipulation, som kan udkonkurrere andre eksisterende teknikker. Vi forestiller os, at vores foreslåede protokol kan have brede implikationer for det biomedicinske forskningssamfund, hvilket giver en metode til at regenerere 3D intestinale epitellag in vitro til biomedicinske og farmaceutiske applikationer.
Eksperimenter viser, at tarmepitel-Caco-2-celler dyrket i gut-on-a-chip1,2,3,4,5 eller tolags mikrofluidic-enheder6,7 kan gennemgå spontan 3D-morfogenese in vitro uden en klar forståelse af den underliggende mekanisme. I vores nylige undersøgelse fandt vi, at fjernelse af basfoolateral kultur induceret og epitagonistisk anordning er tilstrækkeligt induceret og epitagonistisk. thelial morfogenese in vitro, hvilket er blevet påvist af Caco-2 og patient-afledte intestinale organoider.Epitelceller blev valideret. I denne undersøgelse fokuserede vi specifikt på celleproduktionen og koncentrationsfordelingen af ​​en potent Wnt-antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), i tarm-på-en-chip og modificerede mikrofluidiske enheder indeholdende Transwell-indsatser, kaldet "Hybrid Chip". zzled-relateret protein 1, eller Soggy-1) til on-chip-tarmen hæmmer morfogenese eller forstyrrer det præstrukturerede 3D-epitellag, hvilket tyder på, at antagonistisk stress under dyrkning er ansvarlig for intestinal morfogenese in vitro. Derfor er en praktisk tilgang til at opnå robust morfogenese på niveauet af den basontaglaterale grænseflade af den basontag-laterale eller den basontag-laterale grænseflade at fjerne eller vedligeholde den basontaglaterale grænseflade. ment ved aktiv skylning (f.eks. i tarm-på-en-chip- eller hybrid-on-a-chip-platforme) eller diffusion. Basolaterale medier (f.eks. fra Transwell-indsatser i store basolaterale reservoirer i brønde).
I denne protokol giver vi en detaljeret metode til fremstilling af tarm-på-en-chip-mikroenheder og Transwell-indsættelige hybridchips (trin 1-5) til dyrkning af tarmepitelceller på polydimethylsiloxan (PDMS)-baserede porøse membraner (trin 6A, 7A, 8, 9) eller polyesterserts, 9B-membraner, 8B-membraner, (7B)-membraner, ed 3D morfogenese in vitro (trin 10). Vi identificerede også cellulære og molekylære træk, der indikerer vævsspecifik histogenese og afstamningsafhængig cellulær differentiering ved at anvende flere billeddannelsesmodaliteter (trin 11-24). Vi inducerer morfogenese ved hjælp af humane intestinale epitelceller, såsom tarmkulturer i form af caco-2-strukturer, f.eks. skabelse af 2D monolag, og intestinal biokemisk og Reproduktion af det biomekaniske mikromiljø.in vitro.For at inducere 3D morfogenese fra 2D epitelmonolag fjernede vi morfogenantagonister i begge dyrkede former ved at flyde mediet ind i det basolaterale rum af kulturen. Endelig kan vi give en repræsentation af det anvendte epitellag. at modellere morfogenafhængig epitelvækst, langsgående vært-mikrobiom co-kulturer, patogen infektion, inflammatorisk skade, epitelbarriere dysfunktion og probiotika-baserede terapier Eksempel.påvirkninger.
Vores protokol kan være nyttig for en bred vifte af videnskabsmænd inden for grundlæggende (f.eks. tarmslimhindebiologi, stamcellebiologi og udviklingsbiologi) og anvendt forskning (f.eks. præklinisk lægemiddeltestning, sygdomsmodellering, vævsteknologi og gastroenterologi) bred indvirkning. På grund af reproducerbarheden og robustheden af ​​vores protokol til at inducere vores 3D-morphogenese-tekniske strategi, der kan inducere en morphogenese morphogenesis, formidles til publikum, der studerer dynamikken i cellesignalering under tarmudvikling, regenerering eller homeostase. Derudover er vores protokol nyttig til at afhøre infektion under forskellige smitsomme stoffer såsom Norovirus 8, Alvorligt Akut Respiratorisk Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella cholerio eller Vihimuriolera.Publikum af sygdomspatologi og patogenese er også nyttige. Brugen af ​​et on-chip tarmmikrofysiologisystem kan muliggøre langsgående co-kultur 10 og efterfølgende vurdering af værtsforsvar, immunresponser og patogen-relateret skadesreparation i mave-tarmkanalen (GI) 11. Andre mave-tarm-sygdomme forbundet med utæt tarmsygdom, syndrom, coliacitis, coliacitis, syndrom, coliacitis, syndrome irritabel tyktarm kan simuleres, når 3D intestinale epitellag fremstilles ved hjælp af patientens 3D intestinale epitellag , disse sygdomme omfatter villøs atrofi, kryptforkortelse, slimhindeskader eller svækket epitelbarriere. Biopsi eller stamcelle-afledt tarm-organoider kan overveje den højere sygdomsmodel13-miljøet af en højere sygdoms-organoider12. celletyper, såsom patienters perifere mononukleære blodceller (PBMC'er), til modeller, der indeholder 3D intestinal villus-krypt mikroarkitekturer.vævsspecifikke immunceller, 5.
Da 3D epitelmikrostruktur kan fikseres og visualiseres uden sektioneringsprocessen, kan seere, der arbejder med rumlig transkriptomik og højopløsnings- eller superopløsningsbilleddannelse, være interesseret i vores kortlægning af den spatiotemporale dynamik af gener og proteiner på epitelnicher.Interesseret i teknologi.Respons på mikrobielle eller immunstimuli. Ydermere kan langsgående vært-mikrobiom-krydstale 10, 14, der koordinerer tarmhomeostase, etableres i 3D-tarmslimhindelaget ved at dyrke forskellige mikrobielle arter, mikrobielle samfund eller fækal gubiota, især i en fækal gubiota.i platformen.Denne tilgang er særligt attraktiv for publikum, der studerer slimhindeimmunologi, gastroenterologi, humant mikrobiom, culturomics og klinisk mikrobiologi, der søger at dyrke tidligere udyrket tarmmikrobiota i laboratoriet. laterale rum, kan protokollen også formidles til dem, der udvikler farmaceutiske, biomedicinske eller high-throughput screenings- eller valideringsplatforme til fødevareindustrien.Som et proof-of-princip, har vi for nylig demonstreret gennemførligheden af ​​et multiplex high-throughput morfogenese-system, der kan skaleres til et 24-brønds plade-organ-on-1-chip-produkter,1-1-1-chip. valideringen af ​​vores in vitro morfogenesemetode kan fremskyndes og potentielt vedtages af mange forskningslaboratorier, industri eller regeringer og regulerende agenturer for at forstå cellulær omprogrammering af in vitro tarmmorfogenese på transkriptomisk niveau for at teste lægemidler eller bioterapeutika. Absorptionen og transporten af ​​lægemiddelkandidater blev vurderet ved hjælp af 3D-tarm-reproduktionsmodellen for at vurdere den kommercielle tarm-surrogat- eller morphogene-model. søs proces.
Et begrænset antal human-relevante eksperimentelle modeller er blevet brugt til at studere intestinal epitelmorfogenese, hovedsageligt på grund af manglen på implementerbare protokoller til at inducere 3D-morfogenese in vitro. Faktisk er meget af den nuværende viden om tarmmorfogenesen baseret på dyreforsøg (f.eks. zebrafisk20, mus21, eller de kan i høj grad være arbejdskrævende,21 eller omkostningskrævende,-21). og vigtigst af alt, ikke præcist bestemme menneskelige udviklingsprocesser. Disse modeller er også meget begrænsede i deres evne til at blive testet på en flervejs skalerbar måde. Derfor udkonkurrerer vores protokol til regenerering af 3D-vævsstrukturer in vitro in vivo dyremodeller såvel som andre traditionelle statiske 2D-cellekulturmodeller.Som tidligere tilladt at undersøge de forskellige epitetiske cellers strukturer i 3D-celler. krypt-villus-aksen som reaktion på forskellige slimhinde- eller immunstimuli.3D-epitellag kan give et rum til at studere, hvordan mikrobielle celler konkurrerer om at danne rumlige nicher og økologisk evolution som reaktion på værtsfaktorer (f.eks. indre versus ydre slimlag, sekretion af IgA og antimikrobielle peptider, 3D-bakterier, der tillader os, hvordan mikrobielle peptider kan forstå, 3D). ta strukturerer dets samfund og producerer synergistisk mikrobielle metabolitter (f.eks. kortkædede fedtsyrer), der former cellulær organisation og stamcelle-nicher i basalkrypterne. Disse funktioner kan kun påvises, når 3D-epitellag etableres in vitro.
Ud over vores metode til at skabe 3D intestinale epitelstrukturer, er der flere in vitro metoder. Intestinal organoid kultur er en state-of-the-art vævsteknologisk teknik baseret på dyrkning af intestinale stamceller under specifikke morfogene betingelser23,24,25. Brugen af ​​3D organoidmodeller til transportanalyse eller co-udfordring er dog ofte intestinale, biomekaniske og værts-udfordrende. sed i organoiden, og derfor er introduktionen af ​​luminale komponenter såsom mikrobielle celler eller eksogene antigener begrænset.Adgang til organoid lumen kan forbedres ved hjælp af en mikroinjektor,26,27, men denne metode er invasiv og arbejdskrævende og kræver specialiseret viden at udføre. Desuden afspejler traditionelle organoide kulturer, der opretholdes i hydrogel stilladser under statiske forhold, ikke nøjagtigt aktiv in vivo biomekanik.
Andre tilgange, der anvendes af flere forskergrupper, anvender præstrukturerede 3D-hydrogelstilladser til at efterligne tarmepitelstrukturen ved at dyrke isolerede menneskelige tarmceller på geloverfladen. Fremstil hydrogelstilladser ved hjælp af 3D-printede, mikroformede eller litografisk fremstillede forme. Denne metode viser det selvorganiserede in vitrophogeniske celle-isolerede, epitologiske fysiologiske arrangement med gradvist, epitologisk, fysiologisk, cellestruktur etablering af en epitelstruktur med højt aspektforhold og stroma-epitelial krydstale ved at inkludere stromaceller i stilladset. Imidlertid kan karakteren af ​​præstrukturerede stilladser forhindre visningen af ​​selve den spontane morfogenetiske proces. Disse modeller giver heller ikke dynamisk luminal eller interstitiel strømning, idet de mangler den væskecelleforskydning, der er brugt for nyligt anvendte hydrogel-celle-undersøgelsesstress, og som hydrogel-fysisk-funktioner, der er brugt under en morgoother-fysisk funktion. stilladser i en mikrofluidisk platform og mønstrede intestinale epitelstrukturer ved hjælp af laser-ætsningsteknikker. Musens intestinale organoider følger ætsede mønstre for at danne intestinale rørformede strukturer, og intraluminal væskestrøm kan rekapituleres ved hjælp af et mikrofluidikmodul. Denne model udviser dog hverken spontane, morfogenetiske processer, der kan skabe den samme gut-morfogenetiske proces. miniature-tarmrør med spontane morfogenetiske processer. På trods af den komplekse fremstilling af forskellige tarmsegmenter i røret, mangler denne model også luminal væskestrøm og mekanisk deformation. Derudover kan modeloperabiliteten være begrænset, især efter at bioprintningsprocessen er afsluttet, hvilket forstyrrer eksperimentelle forhold eller celle-til-celle-interaktioner. I stedet giver vores foreslåede spontane, biomekaniske, biomekaniske stressprotokol. efterligne tarmmotilitet, tilgængelighed af uafhængige apikale og basolaterale rum og genskabelse af komplekse biologiske mikromiljøer af modularitet. Derfor kan vores in vitro 3D-morfogeneseprotokol give en komplementær tilgang til at overvinde udfordringerne ved eksisterende metoder.
Vores protokol er udelukkende fokuseret på 3D-epitelmorfogenese, med kun epitelceller i kultur og ingen andre typer omgivende celler såsom mesenkymale celler, endotelceller og immunceller.Som tidligere beskrevet er kernen i vores protokol induktionen af ​​epitelial morfogenese ved at fjerne morfogenet sideløbende fra den basolaterale sekretionshæmmer af den basolaterale inhibitor, som er inhibitorer af vores guimodulære. t-på-en-chip og hybrid-på-en-chip giver os mulighed for at genskabe det bølgende 3D-epitellag, yderligere biologiske kompleksiteter såsom epitel-mesenkymale interaktioner33,34, ekstracellulær Matrix (ECM) aflejring 35 og, i vores model, krypt-villus-træk, der formidler stamcelle-nicher, forbliver i de basale celler, f.eks. senchym spiller en nøglerolle i produktionen af ​​ECM-proteiner og regulering af intestinal morfogenese in vivo35,37,38.Tilføjelsen af ​​mesenkymale celler til vores model forbedrede den morfogenetiske proces og cellevedhæftningseffektiviteten.Endotellaget (dvs. kapillærer eller lymfatiske organer) spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​molekylær celletransport i gu9-rekruttering og immunrekruttering af mikrovirer og kar. kulturkomponenter, der kan forbindes mellem vævsmodeller, er en forudsætning, når vævsmodeller er designet til at demonstrere multi-organ-interaktioner. Derfor kan det være nødvendigt at inkludere endotelceller for at modellere mere nøjagtige fysiologiske træk med opløsning på organniveau. Patient-afledte immunceller er også essentielle for at vise medfødte immunresponser, antigenpræsentation i den medfødte intem-specifikke adaptive vævssammenhæng og vævsspecifikke vævsadaptive sygdomskontekst.
Brugen af ​​hybridchips er mere ligetil end tarm-på-en-chip, fordi enhedens opsætning er enklere, og brugen af ​​Transwell-indsatser giver mulighed for skalerbar dyrkning af tarmepitel. Kommercielt tilgængelige Transwell-indsatser med polyestermembraner er imidlertid ikke elastiske og kan ikke simulere peristaltisk-lignende bevægelser. Ydermere forbliver den apikale stationært placeret i det apikale rum i det apikale rum. den apikale side. Det er klart, at de statiske egenskaber i det apikale rum sjældent muliggør langvarig bakteriel co-kultur i hybridchips. Mens vi robust kan inducere 3D-morfogenese i Transwell-inserts ved brug af hybridchips, kan manglen på fysiologisk relevant biomekanik og apikal væskestrøm begrænse muligheden for potentielle hybridapplikationsplatforme.
Fuldskala rekonstruktioner af den menneskelige krypt-villus-akse i tarm-på-en-chip- og hybrid-på-en-chip-kulturer er ikke blevet fuldt etableret. Da morfogenesen begynder fra et epitelialt monolag, giver 3D-mikroarkitekturer ikke nødvendigvis morfologisk lighed med krypter in vivo. Selvom vi karakteriserede den prolifererede mikrokrypten-cellepopulation nær den proliferiske 3D-cellepopulation. lium, var krypten og villøse regioner ikke tydeligt afgrænset. Selvom højere øvre kanaler på chippen fører til øget højde af det mikromanipulerede epitel, er den maksimale højde stadig begrænset til ~300-400 µm. Den faktiske dybde af menneskelige tarmkrypter i tyndtarmen og tyktarmen er ca. 135 µm hhv. ~600 µm41.
Fra et billeddannelsessynspunkt kan in situ superopløsningsbilleddannelse af 3D-mikroarkitekturer være begrænset til tarmen på en chip, da den nødvendige arbejdsafstand fra objektivlinsen til epitellaget er i størrelsesordenen nogle få millimeter. For at overvinde dette problem kan et fjernt objektiv være påkrævet. Ydermere er det nødvendigt at lave tynde sektioner til afbildning af præparatets høje elasticitets-forberedelse af MSF-laget til det høje elastiske præparat af MSF. bi-lags mikrofremstilling af tarmen på en chip involverer permanent adhæsion mellem hvert lag, det er ekstremt udfordrende at åbne eller fjerne det øverste lag for at undersøge overfladestrukturen af ​​epitellaget. For eksempel ved at bruge et scanning elektronmikroskop (SEM).
Hydrofobiciteten af ​​PDMS har været en begrænsende faktor i mikrofluidik-baserede undersøgelser, der beskæftiger sig med hydrofobe små molekyler, da PDMS ikke specifikt kan adsorbere sådanne hydrofobe molekyler. Alternativer til PDMS kan overvejes med andre polymere materialer. Alternativt kan overflademodifikation af PDMS (f.eks. belægning med 42-glycol) anses for at adsorbere 42-glycol eller polyethylen(42)-materialer. sorption af hydrofobe molekyler.
Endelig har vores metode ikke været velkarakteriseret i forhold til at give en high-throughput screening eller "one-size-fits-all" brugervenlig eksperimentel platform. Den nuværende protokol kræver en sprøjtepumpe pr. mikroenhed, som optager plads i en CO2-inkubator og forhindrer storskala-eksperimenter. ous indsatser, der tillader kontinuerlig genopfyldning og fjernelse af basolaterale medier).
For at inducere 3D-morfogenese af humant intestinalt epitel in vitro, brugte vi en mikrofluidisk chip intestinal enhed indeholdende to parallelle mikrokanaler og en elastisk porøs membran i mellem for at skabe en lumen-kapillær grænseflade. Vi demonstrerer også brugen af ​​en enkelt-kanal mikrofluidisk enhed (en hybrid indersiden af ​​​​basarolaterale chip), der sørger for kontinuert gennemstrømning af det polarolaterale, polarlaterale lag. begge platforme kan morfogenese af forskellige humane tarmepitelceller påvises ved at anvende retningsbestemt manipulation af flow for at fjerne morfogenantagonister fra det basolaterale rum. Hele den eksperimentelle procedure (figur 1) består af fem dele: (i) mikrofremstilling af tarmchippen eller Transwell indsættelig hybrid chip (intestinal celle 1-5) (intestinal cellepræparat); Caco-2-celler) eller humane intestinale organoider;boks 2-5), (iii) dyrkning af tarmepitelceller på intestinale chips eller hybridchips (trin 6-9), (iv) induktion af 3D-morfogenese in vitro (trin 10) og (v) ) for at karakterisere 3D-epitelmikrostrukturen (trin 11-24). Til sidst blev en passende kontrolgruppe fra vitrogenes nedenfor designet til at validere morphogenes nedenfor (en passende kontrolgruppe). ved at sammenligne epitelmorfogenese med rumlige, tidsmæssige, betingede eller proceduremæssige kontroller.
Vi brugte to forskellige kulturplatforme: tarm-på-en-chip med lige kanaler eller ikke-lineære sammenviklede kanaler, eller hybridchips indeholdende Transwell (TW)-indsatser i en mikrofluidisk enhed, fremstillet som beskrevet i boks 1, og trin 1-5."Device Fabrication" viser de vigtigste trin i fremstillingen af ​​en enkelt chip eller en hybrid celle eller en hybridcelle-kilde (C. intestinale organoider) og dyrkningsprocedure anvendt i denne protokol."In vitro morfogenese" viser de overordnede trin, hvor Caco-2 eller organoid-afledte epitelceller dyrkes på en intestinal chip eller på Transwell-indsatser af en hybrid chip, efterfulgt af induktion af 3D morfogenese og dannelsen af ​​et karakteriseret program med trinvise applikationsstrukturer nedenunder. stinale epitellag kan f.eks. bruges i celledifferentieringskarakterisering, tarmfysiologiske undersøgelser, etablering af værts-mikrobiom-økosystemer og sygdomsmodellering.Immunofluorescensbilleder i "Celldifferentiering", der viser kerner, F-actin og MUC2 udtrykt i 3D-kaco-2-cellens 3D-celle-chip, genererer celleepitel, og celle-2-chipen er tilstedeværende i gublet. cus secerneret fra slimhindeoverflader.Fluorescerende billeder i Gut Physiology viser slim produceret ved farvning for sialinsyre og N-acetylglucosaminrester ved hjælp af fluorescerende hvedekim-agglutinin. De to overlappende billeder i "Host-Microbe Co-Cultures" viser repræsentativ værts-mikrobiom-kokulturen på den grønne co-kultur i coli-kulturen i den grønne co-kultur. fluorescerende protein (GFP) med mikromanipulerede 3D Caco-2-epitelceller. Det højre panel viser lokaliseringen af ​​GFP E. coli co-dyrket med 3D Caco-2-epitelceller efterfulgt af immunfluorescensfarvning med F-actin (rød) og kerner (blå gut). gener (f.eks. lipopolysaccharid, LPS) og immunceller (f.eks. PBMC;grøn). Caco-2-celler blev dyrket for at etablere et 3D-epitellag. Målestok, 50 µm. Billeder i nederste række: "Differentiering af celler" tilpasset med tilladelse fra reference.2.Oxford University Press;Gengivet med tilladelse fra Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" tilpasset med tilladelse fra ref.3.NAS;"Disease Modeling" tilpasset med tilladelse fra reference.5.NAS.
Både tarm-på-chip og hybridchips blev fremstillet ved hjælp af PDMS-replikaer, der blev fjernet fra siliciumforme ved blød litografi1,44 og mønstret med SU-8. Designet af mikrokanalerne i hver chip bestemmes ved at overveje hydrodynamik såsom forskydningsspænding og hydrodynamisk tryk1,4,12. Det originale tarm-på-en-a-chip, som bestod af parallelle tarm-på-en-a-chip. lige mikrokanaler, har udviklet sig til en kompleks tarm-på-en-chip (Udvidet Data Fig. 1b), der omfatter et par buede mikrokanaler for at inducere Øget væskeopholdstid, ikke-lineære strømningsmønstre og multiaksial deformation af dyrkede celler (fig. 2a-f) gut-chips komplekset skal rekonstrueres biomekanik. sen. Vi har påvist, at den indviklede tarm-chip også kraftigt inducerer 3D-morfogenese i en lignende tidsramme med en lignende grad af epitelvækst sammenlignet med den originale tarm-chip, uanset den dyrkede celletype. For at inducere 3D-morfogenese, er lineære og komplekse on-chip tarm-udformninger udvekslet med silcon-PD-negative mønstre med silcon-SUPD-udskiftelige tarm-mønstre. efter udtagning af formen (fig.2a). For at fremstille tarmen på en chip blev det forberedte øvre PDMS-lag sekventielt bundet til en porøs PDMS-film og derefter justeret med det nedre PDMS-lag ved irreversibel binding ved hjælp af en corona-behandler (fig. 2b-f). 2 timer og udvidede data Fig. 2). Bindingsprocessen udføres ved at behandle overfladerne af PDMS-replikaen og glasset med oxygenplasma eller coronabehandling. Efter sterilisering af den mikrofabrikerede enhed fastgjort til silikonerøret var enhedens opsætning klar til at udføre 3D-morfogenese af tarmepitelet (Figur 2).
a, Skematisk illustration af fremstillingen af ​​PDMS-dele fra SU-8 mønstrede siliciumforme. Den uhærdede PDMS-opløsning blev hældt på en siliciumform (til venstre), hærdet ved 60 °C (midten) og taget ud af formen (højre). Den udstøbte PDMS blev skåret i stykker og renset til videre brug. støbeform, der bruges til at fremstille den porøse PDMS-membran.d, En serie af fotografier af de øvre og nedre PDMS-komponenter og den samlede på-chip-tarm-enhed.e, Skematisk af justeringen af ​​den øvre, membran og nedre PDMS-komponenter. Hvert lag er irreversibelt bundet af plasma- eller koronabehandling.f, Skematisk af den sammensatte mikro-chip-kanal og den sammensatte mikro-chip-enhed. um chambers.g, Opsætning af tarm-på-en-chip til mikrofluidisk cellekultur. Den fabrikerede tarm på en chip samlet med et silikonerør og en sprøjte blev anbragt på et dækglas. Chipanordningen blev placeret på låget af en 150 mm petriskål til forarbejdning. Bindemidlet bruges til at lukke silikone-snapshots og hybrid-chips-snapshots i hybrid-chips-morphos-trans-brønds-snaps3-rør. erter fremstillet uafhængigt til dyrkning af 2D-monolag af tarmepitelceller blev indsat i hybridchippen for at inducere intestinal 3D-morfogenese. Mediet perfunderes gennem mikrokanaler under cellelaget etableret på Transwell-indsatsen. Målestok, 1 cm.h Genoptrykt med tilladelse fra reference.4.Elsevier.
I denne protokol blev Caco-2-cellelinjen og intestinale organoider brugt som epitelkilder (fig. 3a). Begge typer celler blev dyrket uafhængigt (boks 2 og boks 5) og brugt til at udså de ECM-coatede mikrokanaler af on-chip-tarm- eller Transwell-inserts. da passager 10 og 50) i T-kolber høstes for at fremstille dissocierede cellesuspensioner med trypsiniseringsvæske (boks 2). Humane intestinale organoider fra intestinale biopsier eller kirurgiske resektioner blev dyrket i Matrigel-stillads-kupler i 24-brønds plader for at understøtte det strukturelle mikromiljø, der indeholder essentielle morphonium, Rpon- og indeholdende morphonium og Noggin. Faktorer fremstillet som beskrevet i boks 3 blev suppleret hver anden dag, indtil organoiderne voksede til ~500 µm i diameter. Fuldt udvoksede organoider høstes og dissocieres i enkeltceller til podning på tarm- eller Transwell-indlæg på en chip (boks 5). Som vi tidligere har rapporteret, kan det differentieres i henhold til sygdomstype 12, tyktarmsbetændelse, tyktarmsbetændelse, 13 eller normal sygdom. ), læsionssted (f.eks. læsion versus ikke-læsioneret område) og gastrointestinal placering i kanalen (f.eks. tolvfingertarm, jejunum, ileum, blindtarm, tyktarm eller rektum). Vi leverer en optimeret protokol i boks 5 til dyrkning af tyktarmsorganoider (koloider), der typisk kræver højere koncentrationer af morfogener end tyndtarmsorganer.
a, Workflow for induktion af tarmmorfogenese i tarmchippen. Caco-2 humant tarmepitel og intestinale organoider bruges i denne protokol til at demonstrere 3D morfogenese. De isolerede epitelceller blev podet i den forberedte tarm-på-en-chip-enhed (chippræparation). 0 (D0), apikalt (AP) flow påbegyndes og vedligeholdes i de første 2 dage (flow, AP, D0-D2). Basolateralt (BL) flow påbegyndes også sammen med cykliske strækbevægelser (stretch, flow, AP og BL), når der dannes et komplet 2D monolag. Intestinal 3D morfogenese opstår efter 5 dages mikroflugendyrkning spontant (Pha-morphogenese). kontrastbilleder viser repræsentativ morfologi af Caco-2-celler ved hvert eksperimentelt trin eller tidspunkt (søjlediagram, 100 µm). Fire skematiske diagrammer, der illustrerer de tilsvarende kaskader af tarmmorfogenese (øverst til højre). De stiplede pile i skemaet repræsenterer væskestrømmens retning.b, SEM-billede, der viser overfladetopologien af ​​Caco-left-3, der fremhæver det etablerede Caco-left-område (fremhæver den etablerede caco-left-forstørrelse). stiplet boks) viser de regenererede mikrovilli på 3D Caco-2-laget (højre).c, Horisontalt frontalt billede af etableret Caco-2 3D, claudin (ZO-1, rød) og kontinuerte børstekantmembraner mærket F-actin (grøn) og kerner (blå) Immunfluorescens-konfokale celler viser placeringen af ​​den midterste del af intestinal-chipsene på intestinal-chips. brændplan for hver konfokal visning.d, Tidsforløb for morfologiske ændringer i organoider dyrket på en chip opnået ved fasekontrastmikroskopi på dag 3, 7, 9, 11 og 13. Indsatsen (øverst til højre) viser den høje forstørrelse af det medfølgende billede.e, DIC-mikrografi af organoid 3D-epitel, der er optaget i tarmen 7, viser immunoid-markørbilledet på dagen, fluorid-markør. stamceller (LGR5;magenta), bægerceller (MUC2; grøn), F-actin (grå) og kerner (cyan) dyrket på tarmchips i henholdsvis 3 dage (venstre) og 13-dages (midterste) organoider på epitellaget. Se også udvidede data Figur 3, som fremhæver LGR5-signalering af billeder af MUC3-signaler uden MUC2-mikrostruktur (D) organoid epitel etableret i tarmen på en chip ved farvning af plasmamembranen med CellMask farvestof (højre) på dag 13 af dyrkning.Skala bar er 50 μm, medmindre andet er angivet.b Genoptrykt med tilladelse fra reference.2.Oxford University Press;c Tilpasset med tilladelse fra Reference.2.Oxford University Press;e og f tilpasset med tilladelse ved reference.12 Under Creative Commons-licens CC BY 4.0.
I tarmen på en chip er det nødvendigt at modificere den hydrofobe overflade af den PDMS porøse membran for vellykket ECM-coating.I denne protokol anvender vi to forskellige metoder til at modificere hydrofobiciteten af ​​PDMS-membraner. Til dyrkning af Caco-2-celler var overfladeaktivering ved UV/ozonbehandling alene tilstrækkelig til at reducere hydrofobiciteten af ​​ECMMS-cellen og til at reducere hydrofobiciteten af ​​Caco-2-cellerne for at reducere ECM-2-overfladen. Mikrofluidisk kultur af organoidepitel kræver imidlertid kemisk-baseret overfladefunktionalisering for at opnå effektiv aflejring af ECM-proteiner ved sekventielt at påføre polyethylenimin (PEI) og glutaraldehyd på PDMS-mikrokanaler. Efter overflademodifikation blev ECM-proteiner deponeret for at dække den funktionaliserede organoide celle, hvorefter de indførte PDMS-celler i mikrofluenten. idic cellekultur starter ved kun at perfusionere mediet ind i den øvre mikrokanal, indtil cellerne danner et komplet monolag, mens den nedre mikrokanal opretholder statiske betingelser.Denne optimerede metode til overfladeaktivering og ECM-coating muliggør vedhæftning af organoidepitel for at inducere 3D-morfogenese på PDMS-overfladen.
Transwell-kulturer kræver også ECM-coating før cellepodning;Transwell-kulturer kræver dog ikke komplekse forbehandlingstrin for at aktivere overfladen af ​​porøse indsatser. Til dyrkning af Caco-2-celler på Transwell-indsatser accelererer ECM-coating på porøse indsatser vedhæftningen af ​​dissocierede Caco-2-celler (<1 time) og dannelsen af ​​stram forbindelsesbarriere (<1-2 dage med isolerede organoider i ECM-kulturer, er isolerede ECM-kulturer). coatede indsatser, fastgjort til membranoverfladen (<3 timer) og vedligeholdt indtil organoiderne danner et komplet monolag med barriereintegritet. Transwell-kulturer udføres i 24-brøndsplader uden brug af hybridchips.
In vitro 3D-morfogenese kan initieres ved at påføre væskestrøm til det basolaterale aspekt af et etableret epitellag. I tarmen på en chip begyndte epitelmorfogenese, da mediet blev perfunderet ind i de øvre og nedre mikrokanaler (fig. 3a). Som tidligere beskrevet er det kritisk at indføre væskestrøm i den inferilaterale rehibitor-retning for inferilateral rehibitor (morfhogentor) for den inferilaterale rehibitor (morfogen-rehibitor). For at give tilstrækkelige næringsstoffer og serum til celler bundet på porøse membraner og generere luminal forskydningsspænding, anvender vi typisk dual flow i tarmen på en chip.I hybridchips blev Transwell-indsatser, der indeholder epiteliale monolag, indsat i hybridchipsene. Derefter blev mediet påført under den basolaterale side af den porøse Transwell-indgang i den porøse Transwell-initation af 5 dage. basolateral flow i begge kulturplatforme.
De morfologiske træk ved mikrokonstruerede 3D-epitellag kan analyseres ved at anvende forskellige billeddannelsesmodaliteter, herunder fasekontrastmikroskopi, differentiel interferenskontrast (DIC) mikroskopi, SEM eller immunofluorescens konfokalmikroskopi (figur 3 og 4). Fasekontrast eller DIC-billeddannelse kan nemt udføres af 3- og protheli-kulturen til enhver tid under epitheli-kulturen. optisk gennemsigtighed af PDMS- og polyesterfilm, både tarm-på-en-chip- og hybridchip-platformene kan give real-time in situ-billeddannelse uden behov for sektionering eller adskillelse af enheden. Ved udførelse af immunfluorescensbilleddannelse (figur 1, 3c, f og 4b, c), fikseres cellerne typisk med 4% (pFA1t/00) (PFA1t/0) og 4% (PFA10de) % (wt/vol) ) bovint serumalbumin (BSA), i rækkefølge. Afhængigt af celletypen kan forskellige fikseringsmidler, permeabilisatorer og blokeringsmidler anvendes. Primære antistoffer, der er målrettet mod afstamningsafhængige celle- eller regionsmarkører, bruges til at fremhæve celler immobiliseret in situ på chippen, efterfulgt af enten sekundære antistoffer sammen med a,′-antistoffer, der modvirker en, 6-di-eus (f.eks. 2-phenylen) indol, DAPI) eller F-actin (f.eks. fluorescensmærket phalloidin). Fluorescensbaseret levende billeddannelse kan også udføres in situ for at detektere slimproduktion (fig.1, "Celdifferentiering" og "Tarmfysiologi"), tilfældig kolonisering af mikrobielle celler (Fig. 1, "Værtsmikrobe co-kultur"), rekruttering af immunceller (Fig. 1, 'Sygdomsmodellering') eller konturerne af 3D-epitelmorfologien (fig. 4b modificeret, guwh 4b og gufc). det øvre lag fra det nedre mikrokanallag, som beskrevet i ref.Som vist i fig. 2, kan 3D-epitelmorfologien såvel som mikrovilli på den apikale børstegrænse visualiseres ved SEM (fig. 3b). Udtrykket af differentieringsmarkører kan vurderes ved at udføre kvantitativ PCR5 eller enkeltcelle-voksende RNA i dette tilfælde af enkeltcellet 3D, i dette tilfælde af gulinct celle. chips eller hybridchips høstes ved trypsinisering og bruges derefter til molekylær eller genetisk analyse.
a, Workflow for induktion af intestinal morfogenese i en hybrid chip. Caco-2 og intestinale organoider bruges i denne protokol til at demonstrere 3D morfogenese i en hybrid chip platform. Dissocierede epitelceller blev podet i forberedte Transwell inserts (TW prep; se figuren nedenfor). Når alle celler blev sået til membraner i polyestere, blev de sået i membrankulturer (såede celler) under statiske betingelser (TW-kultur). Efter 7 dage blev et enkelt Transwell-indlæg indeholdende et 2D-monolag af epitelceller integreret i en hybridchip for at introducere en basolateral strømning (Flow, BL), hvilket i sidste ende førte til dannelsen af ​​et 3D-epitellag (morfogenese). Fasekontrastmikrografer, der viser normale organer, der har cellemorfologiske træk fra den menneskelige 10-celle, der har doneret 10-celle-epitellinie. på ved hvert eksperimentelt trin eller tidspunkt. Skemaerne i de øverste lag illustrerer den eksperimentelle konfiguration for hvert trin.b, Hybridchips (venstre skematisk) kan føre til 3D-morfogenese af organoide epitelceller med top-down konfokale mikroskopibilleder taget ved forskellige Z-positioner (øvre, midterste og nedre;se højre skematisk og tilsvarende stiplede linjer).viste tydelige morfologiske karakteristika.F-actin (cyan), kerne (grå).c, Fluorescens konfokale mikrofotografier (3D-vinklet visning) af organoid-afledte epitelceller dyrket i statisk Transwell (TW; indsat i hvid stiplet boks) versus hybridchip (største fuldskud) sammenlignet med 32D lodret visning i forhold til 2D-morphologi. (indsat i øverste højre hjørne; "XZ") viser også 2D- og 3D-funktioner.Skalabjælke, 100 µm.c Genoptrykt med tilladelse fra reference.4.Elsevier.
Kontroller kan fremstilles ved at dyrke de samme celler (Caco-2 eller intestinale organoide epitelceller) i todimensionelle monolag under konventionelle statiske dyrkningsbetingelser. Det kan bemærkes, at næringsstofudtømning kan resultere på grund af mikrokanalernes begrænsede volumenkapacitet (dvs. ~4 µL i den øverste kanal på den oprindelige tarm-morphologi-design, kan også sammenlignes efter den oprindelige tarm-morphologi-design, før og efter epitheli-remorphologi). .
Den bløde litografiproces bør udføres i et rent rum. For hvert lag på chippen (øvre og nedre lag og membraner) og hybridchips blev der brugt forskellige fotomasker og fremstillet på separate siliciumwafers, fordi højderne af mikrokanalerne var forskellige. Målhøjderne for de øvre og nedre mikrokanaler i tarmen på chippen er henholdsvis µm, µm, µm-højden af ​​hybrid-chippen. er 200 µm.
Placer en 3-tommers siliciumwafer i et fad med acetone. Rør pladen forsigtigt i 30 sekunder, og lufttørre derefter waferen. Overfør waferen til en plade med IPA, og drej derefter pladen i 30 s for at rengøre.
En piranha-opløsning (blanding af hydrogenperoxid og koncentreret svovlsyre, 1:3 (vol/vol)) kan eventuelt bruges til at maksimere fjernelse af organiske rester fra siliciumwaferoverfladen.
Piranha-opløsningen er ekstremt ætsende og genererer varme. Yderligere sikkerhedsforanstaltninger er nødvendige. Ved bortskaffelse af affald skal opløsningen køle af og overføres til en ren, tør affaldsbeholder. Brug sekundære beholdere og mærke affaldsbeholdere korrekt. Følg venligst anlæggets sikkerhedsretningslinjer for mere detaljerede procedurer.
Dehydrer waferne ved at placere dem på en 200 °C varmeplade i 10 min. Efter dehydrering blev waferen rystet fem gange i luft for at afkøle.
Hæld ~10 g fotoresist SU-8 2100 på midten af ​​den rensede siliciumwafer. Brug en pincet til at fordele fotoresisten jævnt på waferen. Placer lejlighedsvis waferen på en 65°C varmeplade for at gøre fotoresisten mindre klistret og lettere at sprede. Placer ikke waferen direkte på varmepladen.
SU-8 blev jævnt fordelt på waferen ved at køre spin-coating. Programmer en indkommende rotation af SU-8 i 5-10 s for at forplante sig ved 500 rpm ved en acceleration på 100 rpm/s. Indstil hovedspinningen til 200 µm tykkelsesmønster ved 1.500 rpm 50 eller opnå en µm højde 50, det øverste lag af tarmen på chippen; se "Kritiske trin" nedenfor) indstillet til en acceleration på 300 rpm/s 30 sekunder ved 1.200 rpm.
Hovedspinhastigheden kan justeres i henhold til måltykkelsen af ​​SU-8-mønsteret på siliciumwaferen.
For at fremstille SU-8-mønstre med en højde på 500 µm til det øverste lag af tarmen på chippen, blev spincoatingen og bløde bage-trinene i denne boks (trin 7 og 8) gentaget sekventielt (se trin 9) for at producere to lag på 250 µm Et tykt lag SU-8, som kan sammenføjes ved 1-lag af 10 boks og sammenføjes med 1 µ-lag i en kasse. m høj.
Blødbag de SU-8 coatede wafere ved forsigtigt at placere waflerne på en varmeplade ved 65 °C i 5 minutter, skift derefter indstillingen til 95 °C og inkuber i yderligere 40 minutter.
For at opnå en 500 μm højde af SU-8-mønsteret i den øvre mikrokanal, gentag trin 7 og 8 for at generere to 250 μm tykke SU-8-lag.
Brug UV Mask Aligner til at udføre en lampetest i henhold til producentens instruktioner for at beregne eksponeringstiden for waferen.(eksponeringstid, ms) = (eksponeringsdosis, mJ/cm2)/(lampeeffekt, mW/cm2).
Efter at have bestemt eksponeringstiden skal du placere fotomasken på maskeholderen på UV-maskejusteringen og placere fotomasken på den SU-8 coatede wafer.
Placer den printede overflade af fotomasken direkte på den SU-8-coatede side af siliciumwaferen for at minimere UV-spredning.
Udsæt den SU-8 coatede wafer og fotomaske lodret for 260 mJ/cm2 UV-lys i den forudbestemte eksponeringstid (se trin 10 i denne boks).
Efter UV-eksponering blev SU-8-coatede siliciumwafers bagt ved 65 °C i 5 minutter og 95 °C i 15 minutter på hver varmeplade for at fremstille mønstre med en højde på 200 μm. Forlæng efterbagningstiden ved 95 °C til 30 minutter for at fremstille mønstre med en højde på 500 µm.
Fremkalderen hældes i et glasfad, og den bagte oblat lægges i fadet. Volumen af ​​SU-8 fremkalder kan variere afhængigt af glaspladens størrelse. Sørg for at bruge nok SU-8 fremkalder til fuldstændigt at fjerne ueksponeret SU-8. For eksempel, når du bruger et glasfad med en diameter på 150 mm med en kapacitet på 1 L med en kapacitet på 1 L med en gang på 5 mL - 8 minutter. rotation.
Skyl den udviklede form med ~10 mL frisk fremkalder efterfulgt af IPA ved at sprøjte opløsningen med en pipette.
Placer waferen i en plasmarenser og udsæt den for oxygenplasma (atmosfærisk gas, måltryk 1 × 10−5 Torr, effekt 125 W) i 1,5 min.
Placer waferen i en vakuumekssikkator med et objektglas indeni.Vafler og objektglas kan placeres side om side. Hvis vakuumekssikkatoren er opdelt i flere lag af en plade, placeres objektglassene i det nederste kammer og oblaterne i det øverste kammer.Drop 100 μL trichlor(1H, 2H, fluorsilanopløsning, 1H) glasopløsning og påfør 1H-2H-glasopløsning, vakuum til silanisering.
Optø et hætteglas med frosne Caco-2-celler i et 37°C vandbad, og overfør derefter de optøede celler til en T75-kolbe indeholdende 15 mL 37°C forvarmet Caco-2-medium.
For at passere Caco-2-celler ved ~90% konfluens, varm først Caco-2-medium, PBS og 0,25% trypsin/1 mM EDTA i et 37°C vandbad.
Aspirer mediet ved vakuumaspiration. Vask cellerne to gange med 5 mL varm PBS ved at gentage vakuumaspiration og tilføje frisk PBS.