Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Udviklingen af ​​mikrobielle parasitter involverer en modvirkning mellem naturlig selektion, som får parasitter til at forbedre sig, og genetisk drift, som får parasitter til at miste gener og akkumulere skadelige mutationer.Her, for at forstå, hvordan denne modvirkning opstår på skalaen af ​​et enkelt makromolekyle, beskriver vi kryo-EM-strukturen af ​​ribosomet af Encephalitozoon cuniculi, en eukaryot organisme med et af de mindste genomer i naturen.Den ekstreme reduktion af rRNA i E. cuniculi-ribosomer er ledsaget af hidtil usete strukturelle ændringer, såsom udviklingen af ​​hidtil ukendte fusionerede rRNA-linkere og rRNA uden buler.Derudover overlevede E. cuniculi-ribosomet tabet af rRNA-fragmenter og proteiner ved at udvikle evnen til at bruge små molekyler som strukturelle efterligninger af nedbrudte rRNA-fragmenter og proteiner.Samlet set viser vi, at molekylære strukturer, der længe har været antaget at være reducerede, degenererede og udsat for invaliderende mutationer, har en række kompenserende mekanismer, der holder dem aktive på trods af ekstreme molekylære sammentrækninger.
Fordi de fleste grupper af mikrobielle parasitter har unikke molekylære værktøjer til at udnytte deres værter, er vi ofte nødt til at udvikle forskellige terapeutiske midler til forskellige grupper af parasitter1,2.Nye beviser tyder imidlertid på, at nogle aspekter af parasitudvikling er konvergerende og stort set forudsigelige, hvilket indikerer et potentielt grundlag for brede terapeutiske indgreb i mikrobielle parasitter3,4,5,6,7,8,9.
Tidligere arbejde har identificeret en fælles evolutionær tendens i mikrobielle parasitter kaldet genomreduktion eller genomnedbrydning10,11,12,13.Aktuel forskning viser, at når mikroorganismer opgiver deres frilevende livsstil og bliver til intracellulære parasitter (eller endosymbionter), gennemgår deres genom langsomme, men fantastiske metamorfoser over millioner af år9,11.I en proces kendt som genomnedbrydning akkumulerer mikrobielle parasitter skadelige mutationer, der gør mange tidligere vigtige gener til pseudogener, hvilket fører til gradvist gentab og mutationssammenbrud14,15.Dette sammenbrud kan ødelægge op til 95 % af generne i de ældste intracellulære organismer sammenlignet med nært beslægtede fritlevende arter.Udviklingen af ​​intracellulære parasitter er således et tovtrækkeri mellem to modsatrettede kræfter: Darwinistisk naturlig udvælgelse, der fører til forbedring af parasitter, og sammenbruddet af genomet, der kaster parasitter i glemmebogen.Hvordan parasitten formåede at komme ud af denne tovtrækkeri og bevare aktiviteten af ​​sin molekylære struktur, er stadig uklart.
Selvom mekanismen for genomnedbrydning ikke er fuldt ud forstået, ser det ud til at forekomme hovedsageligt på grund af hyppig genetisk drift.Fordi parasitter lever i små, aseksuelle og genetisk begrænsede populationer, kan de ikke effektivt eliminere skadelige mutationer, der nogle gange opstår under DNA-replikation.Dette fører til irreversibel ophobning af skadelige mutationer og reduktion af parasitgenomet.Som et resultat mister parasitten ikke kun gener, der ikke længere er nødvendige for dens overlevelse i det intracellulære miljø.Det er parasitpopulationers manglende evne til effektivt at eliminere sporadiske skadelige mutationer, der får disse mutationer til at akkumulere i hele genomet, inklusive deres vigtigste gener.
Meget af vores nuværende forståelse af genomreduktion er udelukkende baseret på sammenligninger af genomsekvenser, med mindre opmærksomhed på ændringer i faktiske molekyler, der udfører husholdningsfunktioner og tjener som potentielle lægemiddelmål.Sammenlignende undersøgelser har vist, at byrden af ​​skadelige intracellulære mikrobielle mutationer ser ud til at disponere proteiner og nukleinsyrer til at fejlfolde og aggregere, hvilket gør dem mere chaperonafhængige og overfølsomme over for varme19,20,21,22,23.Derudover oplevede forskellige parasitter - uafhængig evolution nogle gange adskilt med så meget som 2,5 milliarder år - et lignende tab af kvalitetskontrolcentre i deres proteinsyntese5,6 og DNA-reparationsmekanismer24.Der er dog lidt kendt om virkningen af ​​intracellulær livsstil på alle andre egenskaber af cellulære makromolekyler, herunder molekylær tilpasning til en stigende byrde af skadelige mutationer.
I dette arbejde, for bedre at forstå udviklingen af ​​proteiner og nukleinsyrer i intracellulære mikroorganismer, bestemte vi strukturen af ​​ribosomer af den intracellulære parasitt Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi er en svampelignende organisme, der tilhører en gruppe af parasitære mikrosporidier, der har usædvanligt små eukaryote genomer og derfor bruges som modelorganismer til at studere genomnedbrydning25,26,27,28,29,30.For nylig blev cryo-EM ribosomstrukturen bestemt for moderat reducerede genomer af Microsporidia, Paranosema locustae og Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom).Disse strukturer tyder på, at et vist tab af rRNA-amplifikation kompenseres af udviklingen af ​​nye kontakter mellem tilstødende ribosomale proteiner eller erhvervelsen af ​​nye msL131,32 ribosomale proteiner.Arter Encephalitozoon (genom ~2,5 millioner bp), sammen med deres nærmeste slægtning Ordospora, demonstrerer den ultimative grad af genomreduktion i eukaryoter - de har mindre end 2000 proteinkodende gener, og det forventes, at deres ribosomer ikke kun er blottet for rRNA-ekspansionsfragmenter (rRNA-bakterie-ribosomer) fragmenter, der også har fire diskaryotiske ribosomer. ribosomale proteiner på grund af deres mangel på homologer i E. cuniculi-genomet26,27,28.Derfor konkluderede vi, at E. cuniculi-ribosomet kan afsløre hidtil ukendte strategier for molekylær tilpasning til genomnedbrydning.
Vores kryo-EM struktur repræsenterer det mindste eukaryote cytoplasmatiske ribosom, der skal karakteriseres og giver indsigt i, hvordan den ultimative grad af genomreduktion påvirker strukturen, samlingen og udviklingen af ​​det molekylære maskineri, der er integreret i cellen.Vi fandt ud af, at E. cuniculi-ribosomet overtræder mange af de vidt bevarede principper for RNA-foldning og ribosomsamling, og opdagede et nyt, hidtil ukendt ribosomalt protein.Helt uventet viser vi, at mikrosporidierribosomer har udviklet evnen til at binde små molekyler, og antager, at trunkeringer i rRNA og proteiner udløser evolutionære innovationer, der i sidste ende kan give nyttige kvaliteter til ribosomet.
For at forbedre vores forståelse af udviklingen af ​​proteiner og nukleinsyrer i intracellulære organismer besluttede vi at isolere E. cuniculi-sporer fra kulturer af inficerede pattedyrceller for at oprense deres ribosomer og bestemme strukturen af ​​disse ribosomer.Det er vanskeligt at opnå et stort antal parasitiske mikrosporidier, fordi mikrosporidier ikke kan dyrkes i et næringsmedium.I stedet vokser og formerer de sig kun inde i værtscellen.For at opnå E. cuniculi-biomasse til ribosomoprensning inficerede vi derfor pattedyrs nyrecellelinje RK13 med E. cuniculi-sporer og dyrkede disse inficerede celler i flere uger for at tillade E. cuniculi at vokse og formere sig.Ved at bruge et inficeret celle-monolag på omkring en halv kvadratmeter var vi i stand til at rense omkring 300 mg Microsporidia-sporer og bruge dem til at isolere ribosomer.Vi afbrød derefter de oprensede sporer med glasperler og isolerede de rå ribosomer under anvendelse af trinvis polyethylenglycolfraktionering af lysaterne.Dette gjorde det muligt for os at opnå ca. 300 µg rå E. cuniculi-ribosomer til strukturel analyse.
Vi indsamlede derefter cryo-EM-billeder ved hjælp af de resulterende ribosomprøver og behandlede disse billeder ved hjælp af masker svarende til den store ribosomale underenhed, lille underenhedshoved og lille underenhed.Under denne proces indsamlede vi billeder af omkring 108.000 ribosomale partikler og beregnede cryo-EM-billeder med en opløsning på 2,7 Å (Supplerende figurer 1-3).Vi brugte derefter cryoEM-billeder til at modellere rRNA, ribosomalt protein og dvalefaktor Mdf1 forbundet med E. cuniculi-ribosomer (fig. 1a, b).
a Struktur af E. cuniculi-ribosomet i kompleks med dvalefaktoren Mdf1 (pdb id 7QEP).b Kort over dvalefaktor Mdf1 forbundet med E. cuniculi-ribosomet.c Sekundær strukturkort, der sammenligner genvundet rRNA i mikrosporidiske arter med kendte ribosomale strukturer.Panelerne viser placeringen af ​​de amplificerede rRNA-fragmenter (ES) og ribosom-aktive steder, herunder afkodningsstedet (DC), sarcinicinsløjfen (SRL) og peptidyltransferasecentret (PTC).d Elektrondensiteten svarende til peptidyltransferasecentret i E. cuniculi-ribosomet antyder, at dette katalytiske sted har samme struktur i E. cuniculi-parasitten og dens værter, herunder H. sapiens.e, f Den tilsvarende elektrontæthed af afkodningscentret (e) og den skematiske struktur af afkodningscentret (f) indikerer, at E. cuniculi har rester U1491 i stedet for A1491 (E. coli-nummerering) i mange andre eukaryoter.Denne ændring tyder på, at E. cuniculi kan være følsom over for antibiotika, der er målrettet mod dette aktive sted.
I modsætning til de tidligere etablerede strukturer af V. necatrix og P. locustae ribosomer (begge strukturer repræsenterer den samme microsporidia familie Nosematidae og ligner hinanden meget), gennemgår 31,32 E. cuniculi ribosomer adskillige processer med rRNA og proteinfragmentering.Yderligere denaturering (Supplerende figurer 4-6).I rRNA inkluderede de mest slående ændringer fuldstændigt tab af det amplificerede 25S rRNA-fragment ES12L og delvis degeneration af h39-, h41- og H18-helixer (fig. 1c, supplerende fig. 4).Blandt ribosomale proteiner omfattede de mest slående ændringer fuldstændigt tab af eS30-proteinet og afkortning af eL8-, eL13-, eL18-, eL22-, eL29-, eL40-, uS3-, uS9-, uS14-, uS17- og eS7-proteinerne (Supplerende 4, 5).
Den ekstreme reduktion af genomerne af Encephalotozoon/Ordospora-arter afspejles således i deres ribosomstruktur: E. cuniculi-ribosomer oplever det mest dramatiske tab af proteinindhold i eukaryote cytoplasmatiske ribosomer, der er underlagt strukturel karakterisering, og de har ikke engang de rRNA- og proteinfragmenter, der ikke kun er meget konserverede i de tre domoter, men også i store dele af livet.Strukturen af ​​E. cuniculi-ribosomet giver den første molekylære model for disse ændringer og afslører evolutionære begivenheder, der er blevet overset af både sammenlignende genomik og undersøgelser af intracellulær biomolekylær struktur (Supplerende Fig. 7).Nedenfor beskriver vi hver af disse begivenheder sammen med deres sandsynlige evolutionære oprindelse og deres potentielle indvirkning på ribosomfunktionen.
Vi fandt derefter, at ud over store rRNA-trunkeringer har E. cuniculi-ribosomer rRNA-variationer på et af deres aktive steder.Selvom peptidyltransferasecentret i E. cuniculi-ribosomet har samme struktur som andre eukaryote ribosomer (fig. 1d), adskiller afkodningscentret sig på grund af sekvensvariation ved nukleotid 1491 (E. coli-nummerering, fig. 1e, f).Denne observation er vigtig, fordi afkodningsstedet for eukaryote ribosomer typisk indeholder rester G1408 og A1491 sammenlignet med rester af bakterietype A1408 og G1491.Denne variation ligger til grund for den forskellige følsomhed af bakterielle og eukaryote ribosomer til aminoglycosidfamilien af ​​ribosomale antibiotika og andre små molekyler, der er målrettet mod afkodningsstedet.Ved afkodningsstedet for E. cuniculi-ribosomet blev rest A1491 erstattet med U1491, hvilket potentielt skaber en unik bindingsgrænseflade for små molekyler, der målretter mod dette aktive sted.Den samme A14901-variant er også til stede i andre mikrosporidier, såsom P. locustae og V. necatrix, hvilket tyder på, at den er udbredt blandt mikrosporidia-arter (fig. 1f).
Fordi vores E. cuniculi-ribosomprøver blev isoleret fra metabolisk inaktive sporer, testede vi cryo-EM-kortet af E. cuniculi for tidligere beskrevet ribosombinding under stress- eller sultforhold.Dvalefaktorer 31,32,36,37, 38. Vi matchede den tidligere etablerede struktur af det hibernerende ribosom med cryo-EM-kortet af E. cuniculi-ribosomet.Til docking blev S. cerevisiae-ribosomer brugt i kompleks med dvalefaktor Stm138, johannesbrødsribosomer i kompleks med Lso232-faktor og V. necatrix-ribosomer i kompleks med Mdf1- og Mdf231-faktorer.Samtidig fandt vi cryo-EM-densiteten svarende til hvilefaktoren Mdf1.I lighed med Mdf1-binding til V. necatrix-ribosomet, binder Mdf1 også til E. cuniculi-ribosomet, hvor det blokerer ribosomets E-sted, hvilket muligvis hjælper med at gøre ribosomer tilgængelige, når parasitsporer bliver metabolisk inaktive ved inaktivering af kroppen (figur 2).).
Mdf1 blokerer E-stedet af ribosomet, hvilket ser ud til at hjælpe med at inaktivere ribosomet, når parasitsporer bliver metabolisk inaktive.I strukturen af ​​E. cuniculi-ribosomet fandt vi, at Mdf1 danner en hidtil ukendt kontakt med L1-ribosomstammen, den del af ribosomet, der letter frigivelsen af ​​deacyleret tRNA fra ribosomet under proteinsyntese.Disse kontakter tyder på, at Mdf1 dissocierer fra ribosomet ved hjælp af den samme mekanisme som deacetyleret tRNA, hvilket giver en mulig forklaring på, hvordan ribosomet fjerner Mdf1 for at reaktivere proteinsyntese.
Vores struktur afslørede imidlertid en ukendt kontakt mellem Mdf1 og L1-ribosombenet (den del af ribosomet, der hjælper med at frigive deacyleret tRNA fra ribosomet under proteinsyntese).Især Mdf1 bruger de samme kontakter som albuesegmentet af det deacylerede tRNA-molekyle (fig. 2).Denne tidligere ukendte molekylære modellering viste, at Mdf1 dissocierer fra ribosomet ved hjælp af den samme mekanisme som deacetyleret tRNA, hvilket forklarer, hvordan ribosomet fjerner denne dvalefaktor for at reaktivere proteinsyntese.
Da vi konstruerede rRNA-modellen, fandt vi ud af, at E. cuniculi-ribosomet har unormalt foldede rRNA-fragmenter, som vi kaldte fusioneret rRNA (fig. 3).I ribosomer, der spænder over livets tre domæner, foldes rRNA til strukturer, hvor de fleste rRNA-baser enten basepar og folder med hinanden eller interagerer med ribosomale proteiner38,39,40.I E. cuniculi-ribosomer synes rRNA'er imidlertid at overtræde dette foldningsprincip ved at omdanne nogle af deres helixer til udfoldede rRNA-områder.
Struktur af H18 25S rRNA helix i S. cerevisiae, V. necatrix og E. cuniculi.Typisk, i ribosomer, der spænder over de tre livsdomæner, spoler denne linker sig ind i en RNA-helix, der indeholder 24 til 34 rester.I Microsporidia derimod reduceres denne rRNA-linker gradvist til to enkeltstrengede uridinrige linkere, der kun indeholder 12 rester.De fleste af disse rester er udsat for opløsningsmidler.Figuren viser, at parasitiske mikrosporidier synes at overtræde de generelle principper for rRNA-foldning, hvor rRNA-baser sædvanligvis er koblet til andre baser eller involveret i rRNA-protein-interaktioner.I mikrosporidier får nogle rRNA-fragmenter en ugunstig fold, hvor den tidligere rRNA-helix bliver til et enkeltstrenget fragment, der er forlænget næsten i en lige linje.Tilstedeværelsen af ​​disse usædvanlige regioner gør det muligt for mikrosporidia-rRNA at binde fjerne rRNA-fragmenter ved brug af et minimalt antal RNA-baser.
Det mest slående eksempel på denne evolutionære overgang kan observeres i H18 25S rRNA helixen (fig. 3).Hos arter fra E. coli til mennesker indeholder baserne af denne rRNA-helix 24-32 nukleotider, der danner en let uregelmæssig helix.I tidligere identificerede ribosomale strukturer fra V. necatrix og P. locustae,31,32 er baserne af H18-helixen delvist oprullet, men nukleotidbaseparring er bevaret.I E. cuniculi bliver dette rRNA-fragment imidlertid de korteste linkere 228UUUGU232 og 301UUUUUUUUUUU307.I modsætning til typiske rRNA-fragmenter snoer disse uridinrige linkere sig ikke sammen eller kommer i omfattende kontakt med ribosomale proteiner.I stedet vedtager de opløsningsmiddelåbne og fuldt udfoldede strukturer, hvor rRNA-strengene er forlænget næsten lige.Denne strakte konformation forklarer, hvordan E. cuniculi kun bruger 12 RNA-baser til at udfylde hullet på 33 Å mellem H16- og H18-rRNA-spiralerne, mens andre arter kræver mindst dobbelt så mange rRNA-baser for at udfylde hullet.
Således kan vi demonstrere, at parasitiske mikrosporidier gennem energetisk ugunstig foldning har udviklet en strategi til at kontrahere selv de rRNA-segmenter, der forbliver bredt bevarede på tværs af arter i livets tre domæner.Ved at akkumulere mutationer, der transformerer rRNA-helixer til korte poly-U-linkere, kan E. cuniculi tilsyneladende danne usædvanlige rRNA-fragmenter indeholdende så få nukleotider som muligt til ligering af distale rRNA-fragmenter.Dette hjælper med at forklare, hvordan mikrosporidier opnåede en dramatisk reduktion i deres grundlæggende molekylære struktur uden at miste deres strukturelle og funktionelle integritet.
Et andet usædvanligt træk ved E. cuniculi rRNA er udseendet af rRNA uden fortykkelser (fig. 4).Udbulninger er nukleotider uden basepar, der vrider sig ud af RNA-helixen i stedet for at gemme sig i den.De fleste rRNA-fremspring fungerer som molekylære klæbemidler, der hjælper med at binde tilstødende ribosomale proteiner eller andre rRNA-fragmenter.Nogle af bulerne fungerer som hængsler, hvilket tillader rRNA-helixen at bøje og folde optimalt til produktiv proteinsyntese 41 .
a Et rRNA-fremspring (S. cerevisiae-nummerering) er fraværende i E. cuniculi-ribosomstrukturen, men er til stede i de fleste andre eukaryoter b. E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens og E. cuniculi interne ribosomer.parasitter mangler mange af de gamle, højt bevarede rRNA-buler.Disse fortykkelser stabiliserer ribosomstrukturen;derfor indikerer deres fravær i mikrosporidier en reduceret stabilitet af rRNA-foldning i mikrosporidia-parasitter.Sammenligning med P-stængler (L7/L12-stængler i bakterier) viser, at tabet af rRNA-buler nogle gange falder sammen med fremkomsten af ​​nye knopper ved siden af ​​de tabte knopper.H42-helixen i 23S/28S rRNA'et har en gammel bule (U1206 i Saccharomyces cerevisiae) anslået til at være mindst 3,5 milliarder år gammel på grund af dens beskyttelse i tre livsdomæner.I microsporidia elimineres denne bule.Der kom dog en ny bule ved siden af ​​den tabte bule (A1306 i E. cuniculi).
Påfaldende nok fandt vi, at E. cuniculi-ribosomer mangler de fleste af de rRNA-buler, der findes i andre arter, herunder mere end 30 buler, der er bevaret i andre eukaryoter (fig. 4a).Dette tab eliminerer mange kontakter mellem ribosomale underenheder og tilstødende rRNA-helixer, hvilket nogle gange skaber store hule hulrum i ribosomet, hvilket gør E. cuniculi-ribosomet mere porøst sammenlignet med mere traditionelle ribosomer (fig. 4b).Især fandt vi, at de fleste af disse buler også gik tabt i de tidligere identificerede V. necatrix og P. locustae ribosomstrukturer, som blev overset af tidligere strukturelle analyser31,32.
Nogle gange er tabet af rRNA-buler ledsaget af udviklingen af ​​nye buler ved siden af ​​den tabte bule.For eksempel indeholder den ribosomale P-stamme en U1208 bule (i Saccharomyces cerevisiae), der overlevede fra E. coli til mennesker og derfor vurderes til at være 3,5 milliarder år gammel.Under proteinsyntese hjælper denne bule P-stammen med at bevæge sig mellem åbne og lukkede konformationer, så ribosomet kan rekruttere translationsfaktorer og levere dem til det aktive sted.Hos E. cuniculi-ribosomer er denne fortykkelse fraværende;dog kan en ny fortykkelse (G883) kun placeret i tre basepar bidrage til at genoprette P-stammens optimale fleksibilitet (fig. 4c).
Vores data om rRNA uden buler tyder på, at rRNA-minimering ikke er begrænset til tabet af rRNA-elementer på overfladen af ​​ribosomet, men kan også involvere ribosomkernen, hvilket skaber en parasitspecifik molekylær defekt, der ikke er blevet beskrevet i fritlevende celler.levende arter observeres.
Efter modellering af kanoniske ribosomale proteiner og rRNA fandt vi ud af, at konventionelle ribosomale komponenter ikke kan forklare de tre dele af kryo-EM-billedet.To af disse fragmenter er små molekyler i størrelse (fig. 5, supplerende fig. 8).Det første segment er klemt mellem de ribosomale proteiner uL15 og eL18 i en position, der sædvanligvis er besat af C-terminalen af ​​eL18, som er forkortet i E. cuniculi.Selvom vi ikke kan bestemme identiteten af ​​dette molekyle, er størrelsen og formen af ​​denne tæthedsø godt forklaret af tilstedeværelsen af ​​spermidinmolekyler.Dets binding til ribosomet stabiliseres af mikrosporidia-specifikke mutationer i uL15-proteinerne (Asp51 og Arg56), som ser ud til at øge affiniteten af ​​ribosomet til dette lille molekyle, da de tillader uL15 at pakke det lille molekyle ind i en ribosomal struktur.Supplerende figur 2).8, yderligere data 1, 2).
Cryo-EM-billeddannelse, der viser tilstedeværelsen af ​​nukleotider uden for ribosen bundet til E. cuniculi-ribosomet.I E. cuniculi-ribosomet indtager dette nukleotid samme plads som 25S rRNA A3186-nukleotidet (Saccharomyces cerevisiae-nummerering) i de fleste andre eukaryote ribosomer.b I den ribosomale struktur af E. cuniculi er dette nukleotid placeret mellem de ribosomale proteiner uL9 og eL20, hvorved kontakten mellem de to proteiner stabiliseres.cd eL20 sekvenskonserveringsanalyse blandt mikrosporidierarter.Det fylogenetiske træ af Microsporidia arter (c) og multipel sekvensjustering af eL20-proteinet (d) viser, at nukleotidbindende rester F170 og K172 er bevaret i de fleste typiske Microsporidia, med undtagelse af S. lophii, med undtagelse af tidlige forgrenede Microsporidia, som bibeholdt ES39L-udvidelsen.e Denne figur viser, at nukleotidbindende rester F170 og K172 kun er til stede i eL20 af det stærkt reducerede mikrosporidia-genom, men ikke i andre eukaryoter.Samlet set tyder disse data på, at mikrosporidiske ribosomer har udviklet et nukleotidbindingssted, der ser ud til at binde AMP-molekyler og bruge dem til at stabilisere protein-protein-interaktioner i den ribosomale struktur.Den høje konservering af dette bindingssted i Microsporidia og dets fravær i andre eukaryoter antyder, at dette sted kan give en selektiv overlevelsesfordel for Microsporidia.Den nukleotidbindende lomme i mikrosporidieribosomet ser således ikke ud til at være et degenereret træk eller slutform for rRNA-nedbrydning som tidligere beskrevet, men snarere en nyttig evolutionær innovation, der gør det muligt for mikrosporidieribosomet direkte at binde små molekyler ved at bruge dem som molekylære byggesten.byggesten til ribosomer.Denne opdagelse gør mikrosporidieribosomet til det eneste ribosom, der vides at bruge et enkelt nukleotid som dets strukturelle byggesten.f Hypotetisk evolutionær vej afledt af nukleotidbinding.
Den anden tæthed med lav molekylvægt er placeret ved grænsefladen mellem ribosomale proteiner uL9 og eL30 (fig. 5a).Denne grænseflade er tidligere beskrevet i strukturen af ​​Saccharomyces cerevisiae-ribosomet som et bindingssted for 25S-nukleotidet af rRNA A3186 (en del af ES39L rRNA-udvidelsen)38.Det blev vist, at i degenererede P. locustae ES39L ribosomer binder denne grænseflade et ukendt enkelt nukleotid 31, og det antages, at dette nukleotid er en reduceret endelig form af rRNA, hvor længden af ​​rRNA er ~130-230 baser.ES39L reduceres til et enkelt nukleotid 32.43.Vores kryo-EM-billeder understøtter ideen om, at tæthed kan forklares med nukleotider.Den højere opløsning af vores struktur viste imidlertid, at dette nukleotid er et ekstraribosomalt molekyle, muligvis AMP (fig. 5a, b).
Vi spurgte derefter, om nukleotidbindingsstedet optrådte i E. cuniculi-ribosomet, eller om det eksisterede tidligere.Da nukleotidbinding hovedsageligt medieres af Phe170- og Lys172-resterne i eL30-ribosomproteinet, vurderede vi bevarelsen af ​​disse rester i 4396 repræsentative eukaryoter.Som i tilfældet med uL15 ovenfor fandt vi, at Phe170- og Lys172-resterne kun er stærkt konserverede i typiske Microsporidier, men fraværende i andre eukaryoter, herunder atypiske Microsporidia Mitosporidium og Amphiamblys, hvori ES39L rRNA-fragmentet ikke er reduceret 44, 45, 45, 45c).-e).
Tilsammen understøtter disse data ideen om, at E. cuniculi og muligvis andre kanoniske mikrosporidier har udviklet evnen til effektivt at fange et stort antal små metabolitter i ribosomstrukturen for at kompensere for faldet i rRNA- og proteinniveauer.Derved har de udviklet en unik evne til at binde nukleotider uden for ribosomet, hvilket viser, at parasitære molekylære strukturer kompenserer ved at fange rigelige små metabolitter og bruge dem som strukturelle efterligninger af nedbrudt RNA og proteinfragmenter..
Den tredje usimulerede del af vores cryo-EM-kort, fundet i den store ribosomale underenhed.Den relativt høje opløsning (2,6 Å) af vores kort tyder på, at denne tæthed tilhører proteiner med unikke kombinationer af store sidekæderester, hvilket gjorde det muligt for os at identificere denne tæthed som et hidtil ukendt ribosomalt protein, som vi identificerede som det blev navngivet msL2 (Microsporidia-specifikt protein L2) (metoder, figur 6).Vores homologisøgning viste, at msL2 er konserveret i Microsporidia clade af slægten Encephaliter og Orosporidium, men fraværende i andre arter, herunder andre Microsporidia.I den ribosomale struktur optager msL2 et hul dannet af tabet af det udvidede ES31L rRNA.I dette tomrum hjælper msL2 med at stabilisere rRNA-foldning og kan kompensere for tabet af ES31L (figur 6).
en elektrondensitet og model af det Microsporidia-specifikke ribosomale protein msL2 fundet i E. cuniculi-ribosomer.b De fleste eukaryote ribosomer, inklusive 80S-ribosomet af Saccharomyces cerevisiae, har tabt ES19L rRNA-amplifikation i de fleste mikrosporidiske arter.Den tidligere etablerede struktur af V. necatrix microsporidia ribosomet antyder, at tabet af ES19L i disse parasitter kompenseres af udviklingen af ​​det nye msL1 ribosomale protein.I denne undersøgelse fandt vi, at E. cuniculi-ribosomet også udviklede et yderligere ribosomalt RNA-mimic protein som en tilsyneladende kompensation for tabet af ES19L.Imidlertid har msL2 (i øjeblikket annoteret som det hypotetiske ECU06_1135-protein) og msL1 forskellige strukturelle og evolutionære oprindelser.c Denne opdagelse af dannelsen af ​​evolutionært ubeslægtede msL1- og msL2-ribosomale proteiner antyder, at hvis ribosomer akkumulerer skadelige mutationer i deres rRNA, kan de opnå hidtil usete niveauer af sammensætningsdiversitet i selv en lille undergruppe af nært beslægtede arter.Denne opdagelse kunne hjælpe med at afklare oprindelsen og udviklingen af ​​det mitokondrielle ribosom, som er kendt for dets stærkt reducerede rRNA og unormale variationer i proteinsammensætning på tværs af arter.
Vi sammenlignede derefter msL2-proteinet med det tidligere beskrevne msL1-protein, det eneste kendte mikrosporidia-specifikke ribosomale protein, der findes i V. necatrix-ribosomet.Vi ønskede at teste, om msL1 og msL2 er evolutionært beslægtede.Vores analyse viste, at msL1 og msL2 optager det samme hulrum i den ribosomale struktur, men har forskellige primære og tertiære strukturer, hvilket indikerer deres uafhængige evolutionære oprindelse (fig. 6).Således giver vores opdagelse af msL2 bevis på, at grupper af kompakte eukaryote arter uafhængigt kan udvikle strukturelt adskilte ribosomale proteiner for at kompensere for tabet af rRNA-fragmenter.Dette fund er bemærkelsesværdigt ved, at de fleste cytoplasmatiske eukaryote ribosomer indeholder et invariant protein, herunder den samme familie på 81 ribosomale proteiner.Forekomsten af ​​msL1 og msL2 i forskellige klader af mikrosporidier som reaktion på tabet af udvidede rRNA-segmenter tyder på, at nedbrydning af parasittens molekylære arkitektur får parasitter til at søge kompenserende mutationer, hvilket i sidste ende kan føre til deres erhvervelse i forskellige parasitpopulationer.strukturer.
Til sidst, da vores model var færdig, sammenlignede vi sammensætningen af ​​E. cuniculi-ribosomet med den, der blev forudsagt fra genomsekvensen.Adskillige ribosomale proteiner, herunder eL14, eL38, eL41 og eS30, blev tidligere anset for at mangle fra E. cuniculi-genomet på grund af det tilsyneladende fravær af deres homologer fra E. cuniculi-genomet.Tab af mange ribosomale proteiner forudsiges også i de fleste andre stærkt reducerede intracellulære parasitter og endosymbionter.For eksempel, selvom de fleste fritlevende bakterier indeholder den samme familie på 54 ribosomale proteiner, har kun 11 af disse proteinfamilier påviselige homologer i hvert analyseret genom af værtsbegrænsede bakterier.Til støtte for denne opfattelse er et tab af ribosomale proteiner eksperimentelt blevet observeret i V. necatrix og P. locustae microsporidia, som mangler proteinerne eL38 og eL4131,32.
Vores strukturer viser dog, at kun eL38, eL41 og eS30 faktisk går tabt i E. cuniculi-ribosomet.eL14-proteinet blev konserveret, og vores struktur viste, hvorfor dette protein ikke kunne findes i homologisøgningen (fig. 7).I E. cuniculi-ribosomer går det meste af eL14-bindingsstedet tabt på grund af nedbrydning af det rRNA-amplificerede ES39L.I fravær af ES39L mistede eL14 det meste af sin sekundære struktur, og kun 18 % af eL14-sekvensen var identisk i E. cuniculi og S. cerevisiae.Denne dårlige sekvensbevarelse er bemærkelsesværdig, fordi selv Saccharomyces cerevisiae og Homo sapiens – organismer, der udviklede sig 1,5 milliarder år fra hinanden – deler mere end 51 % af de samme rester i eL14.Dette unormale tab af konservering forklarer, hvorfor E. cuniculi eL14 i øjeblikket er annoteret som det formodede M970_061160-protein og ikke som eL1427-ribosomproteinet.
og Microsporidia-ribosomet mistede ES39L rRNA-udvidelsen, hvilket delvist eliminerede eL14-ribosomale proteinbindingsstedet.I fravær af ES39L gennemgår eL14-mikrosporeproteinet et tab af sekundær struktur, hvor den tidligere rRNA-bindende a-helix degenererer til en loop med minimal længde.b Multipel sekvensjustering viser, at eL14-proteinet er stærkt konserveret i eukaryote arter (57 % sekvensidentitet mellem gær- og humane homologer), men dårligt konserveret og divergerende i mikrosporidier (hvor ikke mere end 24 % af resterne er identiske med eL14-homologen).fra S. cerevisiae eller H. sapiens).Denne dårlige sekvensbevarelse og sekundære strukturvariabilitet forklarer, hvorfor eL14-homologen aldrig er blevet fundet i E. cuniculi, og hvorfor dette protein menes at være gået tabt i E. cuniculi.I modsætning hertil blev E. cuniculi eL14 tidligere annoteret som et formodet M970_061160-protein.Denne observation tyder på, at mikrosporidiers genom-diversitet i øjeblikket er overvurderet: nogle gener, der i øjeblikket menes at gå tabt i mikrosporidier, er faktisk bevaret, omend i stærkt differentierede former;i stedet menes nogle at kode for microsporidia-gener for ormespecifikke proteiner (f.eks. det hypotetiske protein M970_061160) faktisk koder for de meget forskellige proteiner, der findes i andre eukaryoter.
Dette fund tyder på, at rRNA-denaturering kan føre til et dramatisk tab af sekvenskonservering i tilstødende ribosomale proteiner, hvilket gør disse proteiner uopdagelige til homologisøgninger.Vi kan således overvurdere den faktiske grad af molekylær nedbrydning i små genomorganismer, da nogle proteiner, der menes at være tabt, faktisk fortsætter, om end i stærkt ændrede former.
Hvordan kan parasitter bevare funktionen af ​​deres molekylære maskiner under forhold med ekstrem genomreduktion?Vores undersøgelse besvarer dette spørgsmål ved at beskrive den komplekse molekylære struktur (ribosom) af E. cuniculi, en organisme med et af de mindste eukaryote genomer.
Det har været kendt i næsten to årtier, at protein- og RNA-molekyler i mikrobielle parasitter ofte adskiller sig fra deres homologe molekyler i fritlevende arter, fordi de mangler kvalitetskontrolcentre, er reduceret til 50 % af deres størrelse i fritlevende mikrober osv.mange invaliderende mutationer, der forringer foldning og funktion.For eksempel forventes ribosomerne af små genomorganismer, herunder mange intracellulære parasitter og endosymbionter, at mangle adskillige ribosomale proteiner og op til en tredjedel af rRNA-nukleotider sammenlignet med frilevende arter 27, 29, 30, 49. Men den måde, hvorpå disse molekyler fungerer i mysteri, studerede hovedsageligt en parasit gennem store genomik.
Vores undersøgelse viser, at strukturen af ​​makromolekyler kan afsløre mange aspekter af evolution, som er vanskelige at udvinde fra traditionelle komparative genomiske undersøgelser af intracellulære parasitter og andre værtsbegrænsede organismer (Supplerende Fig. 7).Eksempelvis viser eksemplet med eL14-proteinet, at vi kan overvurdere den faktiske grad af nedbrydning af det molekylære apparat hos parasitære arter.Encephalitiske parasitter menes nu at have hundredvis af mikrosporidia-specifikke gener.Vores resultater viser dog, at nogle af disse tilsyneladende specifikke gener faktisk bare er meget forskellige varianter af gener, som er almindelige i andre eukaryoter.Desuden viser eksemplet med msL2-proteinet, hvordan vi overser nye ribosomale proteiner og undervurderer indholdet af parasitære molekylære maskiner.Eksemplet med små molekyler viser, hvordan vi kan overse de mest geniale innovationer i parasitære molekylære strukturer, der kan give dem ny biologisk aktivitet.
Tilsammen forbedrer disse resultater vores forståelse af forskellene mellem de molekylære strukturer af værtsbegrænsede organismer og deres modstykker i fritlevende organismer.Vi viser, at molekylære maskiner, der længe har været anset for at være reduceret, degenereret og udsat for forskellige invaliderende mutationer, i stedet har et sæt systematisk oversete usædvanlige strukturelle træk.
På den anden side tyder de ikke-voluminøse rRNA-fragmenter og fusionerede fragmenter, som vi fandt i ribosomer af E. cuniculi, på, at genomreduktion kan ændre selv de dele af det grundlæggende molekylære maskineri, som er bevaret i livets tre domæner – efter næsten 3,5 milliarder år.uafhængig udvikling af arter.
De bulefrie og fusionerede rRNA-fragmenter i E. cuniculi-ribosomer er af særlig interesse i lyset af tidligere undersøgelser af RNA-molekyler i endosymbiotiske bakterier.For eksempel har rRNA- og tRNA-molekyler i bladlusendosymbiont Buchnera aphidicola vist sig at have temperaturfølsomme strukturer på grund af A+T-sammensætningsbias og en høj andel af ikke-kanoniske basepar20,50.Disse ændringer i RNA, såvel som ændringer i proteinmolekyler, menes nu at være ansvarlige for endosymbionters overafhængighed af partnere og endosymbionters manglende evne til at overføre varme 21, 23 .Selvom parasitisk mikrosporidia rRNA har strukturelt adskilte ændringer, tyder arten af ​​disse ændringer på, at reduceret termisk stabilitet og højere afhængighed af chaperoneproteiner kan være fælles træk ved RNA-molekyler i organismer med reducerede genomer.
På den anden side viser vores strukturer, at parasitmikrosporidier har udviklet en unik evne til at modstå bredt konserverede rRNA- og proteinfragmenter og udvikler evnen til at bruge rigelige og let tilgængelige små metabolitter som strukturelle efterligninger af degenererede rRNA- og proteinfragmenter.Nedbrydning af molekylær struktur..Denne udtalelse understøttes af det faktum, at små molekyler, der kompenserer for tabet af proteinfragmenter i rRNA og ribosomer af E. cuniculi, binder til mikrosporidia-specifikke rester i uL15- og eL30-proteinerne.Dette tyder på, at binding af små molekyler til ribosomer kan være et produkt af positiv selektion, hvor Microsporidia-specifikke mutationer i ribosomale proteiner er blevet udvalgt for deres evne til at øge affiniteten af ​​ribosomer til små molekyler, hvilket kan føre til mere effektive ribosomale organismer.Opdagelsen afslører en smart innovation i mikrobielle parasitters molekylære struktur og giver os en bedre forståelse af, hvordan parasitternes molekylære strukturer opretholder deres funktion på trods af reduktiv evolution.
På nuværende tidspunkt er identifikationen af ​​disse små molekyler uklar.Det er ikke klart, hvorfor udseendet af disse små molekyler i den ribosomale struktur adskiller sig mellem mikrosporidierarter.Det er især ikke klart, hvorfor nukleotidbinding observeres i ribosomerne af E. cuniculi og P. locustae, og ikke i ribosomerne af V. necatrix, på trods af tilstedeværelsen af ​​F170-resten i eL20- og K172-proteinerne i V. necatrix.Denne deletion kan være forårsaget af rest 43 uL6 (placeret ved siden af ​​nukleotidbindingslommen), som er tyrosin i V. necatrix og ikke threonin i E. cuniculi og P. locustae.Den voluminøse aromatiske sidekæde af Tyr43 kan interferere med nukleotidbinding på grund af sterisk overlap.Alternativt kan den tilsyneladende nukleotiddeletion skyldes den lave opløsning af kryo-EM-billeddannelse, som hindrer modelleringen af ​​V. necatrix ribosomale fragmenter.
På den anden side tyder vores arbejde på, at processen med genomnedbrydning kan være en opfinderisk kraft.Især antyder strukturen af ​​E. cuniculi-ribosomet, at tabet af rRNA og proteinfragmenter i microsporidia-ribosomet skaber evolutionært tryk, der fremmer ændringer i ribosomstrukturen.Disse varianter forekommer langt fra det aktive sted af ribosomet og ser ud til at hjælpe med at opretholde (eller genoprette) optimal ribosomsamling, som ellers ville blive forstyrret af reduceret rRNA.Dette tyder på, at en stor innovation af microsporidia-ribosomet ser ud til at have udviklet sig til et behov for at buffer gendrift.
Måske illustreres dette bedst ved nukleotidbinding, som hidtil aldrig er blevet observeret i andre organismer.Det faktum, at nukleotidbindende rester er til stede i typiske mikrosporidier, men ikke i andre eukaryoter, tyder på, at nukleotidbindingssteder ikke blot er relikvier, der venter på at forsvinde, eller det endelige sted for rRNA, der skal genskabes i form af individuelle nukleotider.I stedet virker dette websted som en nyttig funktion, der kunne have udviklet sig over flere runder af positiv udvælgelse.Nukleotidbindingssteder kan være et biprodukt af naturlig selektion: når først ES39L er nedbrudt, tvinges mikrosporidier til at søge kompensation for at genoprette optimal ribosombiogenese i fravær af ES39L.Da dette nukleotid kan efterligne de molekylære kontakter af A3186-nukleotidet i ES39L, bliver nukleotidmolekylet en byggesten i ribosomet, hvis binding forbedres yderligere ved mutation af eL30-sekvensen.
Med hensyn til den molekylære udvikling af intracellulære parasitter viser vores undersøgelse, at kræfterne fra darwinistisk naturlig selektion og genetisk drift af genomnedbrydning ikke fungerer parallelt, men svinger.For det første eliminerer genetisk drift vigtige træk ved biomolekyler, hvilket gør kompensation hårdt nødvendig.Kun når parasitter opfylder dette behov gennem darwinistisk naturlig selektion, vil deres makromolekyler have en chance for at udvikle deres mest imponerende og innovative egenskaber.Det er vigtigt, at udviklingen af ​​nukleotidbindingssteder i E. cuniculi-ribosomet antyder, at dette tab-til-forstærkningsmønster af molekylær udvikling ikke kun amortiserer skadelige mutationer, men nogle gange giver helt nye funktioner til parasitære makromolekyler.
Denne idé er i overensstemmelse med Sewell Wrights bevægelige ligevægtsteori, som siger, at et strengt system af naturlig udvælgelse begrænser organismers evne til at innovere51,52,53.Men hvis genetisk drift forstyrrer naturlig selektion, kan disse drifter frembringe ændringer, der ikke i sig selv er adaptive (eller endda skadelige), men fører til yderligere ændringer, der giver højere kondition eller ny biologisk aktivitet.Vores rammer understøtter denne idé ved at illustrere, at den samme type mutation, der reducerer foldningen og funktionen af ​​et biomolekyle, ser ud til at være den vigtigste udløser for dets forbedring.I tråd med den win-win evolutionære model viser vores undersøgelse, at genomnedbrydning, traditionelt set som en degenerativ proces, også er en vigtig drivkraft for innovation, som nogle gange og måske endda ofte tillader makromolekyler at erhverve nye parasitiske aktiviteter.kan bruge dem.