Næringsoptagelse og fordeling integrerer insektforsøgning og livshistorietræk. For at kompensere for mangler i specifikke næringsstoffer på forskellige livsstadier kan insekter få disse næringsstoffer gennem supplerende fodring, for eksempel ved at spise af hvirveldyrsekreter i en proces kendt som vandpytter. reproduktion. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om An.arabiensis-agitation på ko-urin til optagelse af næringsstoffer forbedrer livshistoriekarakteristika.
Sørg for, at det er sikkert.arabiensis blev tiltrukket af lugten af ​​frisk, 24 timer, 72 timer og 168 timer gammel ko-urin, og værtssøgende og blodfodrede (48 timer efter blodmåltid) hunner blev målt i et Y-rørs olfaktometer, og gravide kvinder blev derefter brugt til at identificere biologiske kemiske stoffer, og derefter blev testet med elektroaktive hunner, der blev kombineret med spawning, og derefter testet i en biofysisk kemisk analyse. ko-urin i alle fire aldersklasser. Syntetiske blandinger af bioaktive forbindelser blev evalueret i Y-rør og markforsøg. For at undersøge ko-urin og dens vigtigste nitrogenholdige sammensætning urinstof som potentielle supplerende diæter til malariavektorer, blev fodringsparametre og livshistoriekarakteristika målt. Andelen af ​​hunmyg blev optaget af hunmyg, og mængden af ​​hunmyg, der blev absorberet, vurderet, og mængden af ​​hunmyg, der blev optaget, og mængden af ​​hunmyg, som blev optaget. overlevelse, bundet flugt og reproduktion.
Søg værtens blod og næring. I laboratorie- og feltstudier blev araberne tiltrukket af den naturlige og syntetiske duft af frisk og ældet ko-urin. Gravide hunner var ligeglade med reaktioner fra ko-urin på gydesteder. Værtssøgende og blodsugende hunner absorberer aktivt ko-urin og histourinstof i overensstemmelse med disse ressourcer og histourinstof, som en funktion af disse fysiologiske ressourcer og alt-liv-off. val eller reproduktion.
Anopheles arabinis erhvervelse og distribution af ko-urin for forbedrede livshistoriekarakteristika. Supplerende fodring af ko-urin påvirker vektorkapaciteten direkte ved at øge den daglige overlevelse og vektordensiteten og indirekte ved at ændre flyveaktiviteten og bør derfor overvejes i fremtidige modeller.
Næringsoptagelse og fordeling integrerer insektforsøgning og livshistoriekarakteristika [1,2,3]. Insekter er i stand til at udvælge og erhverve føde og udføre kompenserende fodring baseret på fødevaretilgængelighed og næringsbehov [1, 3]. Fordelingen af ​​næringsstoffer afhænger af livshistorieprocessen og kan føre til forskellige krav til diætkvalitet og -mængde i forskellige livsstadier [1]. I specifikke næringsstoffer kan insekter opnå disse næringsstoffer gennem supplerende fodring, såsom på mudder, forskellige ekskrementer og sekreter fra hvirveldyr og ådsler, en proces kendt som vandpytter [2]. Selvom en række forskellige sommerfugle- og mølarter primært beskrives, forekommer vandhuller også i andre typer insekter til foder og ressourcer, og kan have en betydelig effekt på andre insekttypers foder og ressourcer, 2, 4, 5, 6] ,7]. Malariamyggen Anopheles gambiae sensu lato (sl) fremstår som en 'underernæret' voksen [8], så vanding kan spille en vigtig rolle i dens livshistoriekarakteristika, men denne adfærd er hidtil blevet forsømt. Brugen af ​​agitation som et middel til at øge epidemiologiske konsekvenser kan have vigtige konsekvenser.
Kvælstofindtaget hos voksne hunanopheles-myg er begrænset på grund af lave kaloriereserver, der føres fra larvestadiet og ineffektiv udnyttelse af blodmel [9]. Kvinde Ann.gambiae sl kompenserer typisk for dette ved at supplere med supplerende blodmåltider [10, 11], hvorved flere mennesker risikerer at pådrage sig sygdommen og øger risikoen for, at myggene kan tilføres myggen, og derved øger myggenes tilskud. ing af hvirveldyrs ekskrementer for at erhverve nitrogenholdige forbindelser, der forbedrer tilpasning og flyvemanøvredygtighed, som demonstreret af andre insekter [2]. I denne henseende er den stærke og tydelige tiltrækning af en af ​​søskendearterne inden for An. Det gambiske sl-artskompleks, Anopheles arabinis, frisk og ældet ko-urin [12,13, er interessant, og dens præference] er interessant i dens præference, og er interessant i dens præference. at omgås og fodre med kvæg.Kourin er en ressource rig på nitrogenholdige forbindelser, hvor urinstof udgør 50-95% af det samlede kvælstof i frisk urin [15, 16]. Efterhånden som ko-urin ældes, udnytter mikroorganismer disse ressourcer til at reducere kompleksiteten af ​​nitrogenholdige forbindelser inden for 24 timer, med associeret organisk nitrogenindhold på 24 timer [15] amWmoni kalofile mikroorganismer (hvoraf mange producerer forbindelser, der er giftige for myg) trives [15], som kan være kvindelige Ann.arabiensis er fortrinsvis tiltrukket af urin i alderen 24 timer eller mindre [13, 14].
I denne undersøgelse blev der ledt efter værts- og blodfodrede Ans. I løbet af sin første gonadotropincyklus blev arabiensis vurderet for erhvervelse af nitrogenholdige forbindelser, herunder urinstof, ved urinblanding. Dernæst blev der udført en række eksperimenter for at vurdere, hvordan hunmyg allokerer denne potentielle næringsressource for at opnå en forbedret overlevelse og en yderligere lugt af urinen og forbedret overlevelse. e blev vurderet for at afgøre, om disse gav pålidelige spor for værts- og blodfodrede An. I deres søgen efter denne potentielle ernæringsressource opdagede arabiensis kemiske sammenhænge bag den observerede differentielle tiltrækningskraft. Syntetiske lugtblandinger af flygtige organiske forbindelser (VOC'er) identificeret i 24-timers ældet urin blev yderligere evalueret under laboratorie- og lugtforhold opnået i urinen under laboratorie- og urinbetingelser. forskellige fysiologiske tilstande.Myggeattraktion. De opnåede resultater bekræfter, at An.arabiensis erhverver og distribuerer nitrogenholdige forbindelser fundet i hvirveldyrs urin for at påvirke livshistoriens karakteristika. Disse resultater diskuteres i sammenhæng med potentielle epidemiologiske konsekvenser, og hvordan de kan bruges til vektorovervågning og kontrol.
Anopheles arabicans (Dongola-stamme) blev holdt ved 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativ luftfugtighed og en 12:12 timers lys:mørke cyklus. Larverne blev opdrættet i plastbakker (20 cm × 18 cm × 7 cm) fyldt med destilleret vand og fodret med Tetramin® fisk, som blev opsamlet med Tetramin® fisk (Tetramin®). 0 ml kopper (Nolato Hertila, Åstorp, SE) og derefter overført til Bugdorm-bure (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) for at tillade fremkomst af voksne. Voksne blev forsynet med en 10 % saccharoseopløsning ad libitum indtil 4 dage efter fremspiring, hvor hun blev tilbudt umiddelbart før, hun blev udsat for at blive udsat for natten (dpe-, med- eller udskåret). bearbejdet vand forud for eksperimentet, som beskrevet nedenfor. Hunnerne, der blev brugt til flyverørseksperimenter, blev udsultet i kun 4-6 timer med vand ad libitum. For at forberede blodsugende myg til efterfølgende bioassays, blev 4 dpe hunner forsynet med defibrotisk fåreblod (Håtunalab, Bro, SE) ved hjælp af et membranfodringssystem, hvorefter hun blev overført til Discovery, UK. individuelle bure og tilvejebragte diæt direkte, som beskrevet nedenfor, eller 10 % saccharose ad libitum i 3 dage forud for eksperimenterne beskrevet nedenfor. Sidstnævnte hunner blev brugt til flyverørsbioassays og overført til laboratoriet og fik derefter destilleret vand ad libitum i 4-6 timer før eksperimentet.
Fodringsassays blev brugt til at kvantificere urin- og urinstofforbrug hos voksne an.arabiske hunner. Værtssøgende og blodfodrede hunner fik en diæt indeholdende 1 % fortyndet frisk og ældet ko-urin, forskellige koncentrationer af urinstof og to kontroller (10 % saccharose og vand) i 48 timer. Derudover 5 mg mlani-12 xylen-12de; -1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) blev tilføjet til diæten og leveret i en 4 × 4 matrix i 250 µl mikrocentrifugerør (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Figur 1A) Fyld til kanten (~300 µl). For at undgå konkurrence mellem myg og potentielle farver på 1 cm i diameter af myg og 1 cm kæledyrsfarve (d2 cm) 6 cm i højden; Semadeni, Ostermundigen, CH; figur 1A) i fuldstændig mørke ved 25 ± 2 cm °C og 65 ± 5 % relativ luftfugtighed. Disse eksperimenter blev gentaget 5 til 10 gange. Efter udsættelse for diæt blev myg placeret ved -20 °C indtil videre analyse.
Kig efter kvægurin og urinstof absorberet af værten og den blodsugende kvindelige Anopheles arabianus. I fodringsforsøg (A) fik hunmyg en diæt bestående af frisk og ældet ko-urin, forskellige koncentrationer af urinstof, saccharose (10%) og destilleret vand (H2O). Host-søgende blod absorberede (B) intet blod, der blev optaget af værten (B) og ikke sugede mere af hun (B). te, at værtssøgende hunner optog 72 timers ko-urin mindre end 168 timers ko-urin (B). Det gennemsnitlige totale nitrogenindhold (± standardafvigelse) i urinen er repræsenteret i indsættelsen.Værtssøgende (D, F) og blodsugende (E, G) hunner optager urinstof i en dosisafhængige mængder af hver anden (D-en anden) signifikante volumen (D-en anden) (Dosis-afhængige volumen). måde ANOVA ved hjælp af Tukeys post hoc-analyse; p < 0,05). Fejlbjælker repræsenterer standardfejl for middelværdien (BE). Den lige stiplede linje repræsenterer den log-lineære regressionslinje (F, G)
For at frigive absorberet mad blev myg individuelt anbragt i 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 230 µl destilleret vand, og vævet blev ødelagt ved hjælp af en engangsstøder og trådløs motor (VWR International, Lund, SE), efterfulgt af centrifugering ved 10 krpm i 10 minutter. rig) og absorbans (λ620) blev bestemt ved anvendelse af en spektrofotometer-baseret mikropladelæser (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativt blev myggene malet i 1 ml destilleret vand, hvoraf 900 µl blev overført til en kuvetteanalyse for λ,0m0 foto for λ,0m, 0,0; , Kista, SE). For at kvantificere diætindtagelsen blev en standardkurve fremstillet ved seriel fortynding for at give 0,2 µl til 2,4 µl 1 mg ml-1 xylencyanid. Derefter blev den optiske tæthed af kendte farvestofkoncentrationer brugt til at bestemme mængden af ​​mad, hver myg indtog.
Volumendata blev analyseret ved hjælp af en-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys post hoc parvise sammenligninger (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989-2007). Lineære regressionsanalyser beskrev koncentrationsafhængig urinstofindtagelse og sammenlignede mosquis-værts- og blodsugningsresponser mellem vs. 0 til Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Ca. 20 µl urinprøver fra hver aldersgruppe blev bundet på Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) og indkapslet i blikkapsler (8 mm × 5 mm). Kapslerne blev indsat i forbrændingskammeret i en 0,0-, MA-, Scientificr-fisk, CHNS/O-, Scientificer-analyse (CHNS/O20-analyse). , USA) for at bestemme nitrogenindholdet i frisk og ældet urin i overensstemmelse med producentens protokol. Total nitrogen (g N l-1) blev kvantificeret baseret på kendte urinstofkoncentrationer brugt som standard.
For at vurdere effekten af ​​diæt på værtssøgende og blodsugende kvindelige overlevelse, blev myggene individuelt placeret i store petriskåle (12 cm i diameter og 6 cm i højden; Semadeni) med et net-dækket hul i låget (3 cm i diameter) med Til ventilation og fødeforsyning. Diæter blev leveret direkte efter 4 dpe og inkluderede 1% fortyndet urin, 1 koncentration af urin og 1% fortyndet 1 urin. 0% saccharose og vand.Hver diæt blev pipetteret på en dental tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) indsat i en 5 ml sprøjte (Thermo Fisher Scientific, Gøteborg, SE), stemplet fjernet og placeret oven på en petriskål (figur 1).1A). to gange dagligt, mens døde myg blev kasseret, indtil den sidste myg døde (n = 40 pr. behandling). Overlevelse af myg fodret på forskellige diæter blev statistisk analyseret ved hjælp af Kaplan-Meyer overlevelseskurver og log-rank tests for at sammenligne overlevelsesfordelingssammenligninger mellem diæter (IBM SPSS Statistics 0.04).
En brugerdefineret myggeflyvemølle baseret på Attisano et al.[17], fremstillet af 5 mm tykke klare akrylpaneler (10 cm brede x 10 cm lange x 10 cm høje) uden front- og bagpaneler (fig. 3: top). En omdrejningsenhed med et lodret rør lavet af en gaskromatografisøjle (0,275 mm) ophængt en ende til en ende. et par neodymmagneter 9 cm fra hinanden. Et vandret rør lavet af samme materiale (6,5 cm L) delte det lodrette rør og dannede en tøjret arm og en arm, der bar et lille stykke aluminiumsfolie som et lysafbrydende signal.
24-timers-sultede hunner fik ovenstående diæt i 30 minutter før fastholdelse. Fuldfodrede hunmyg blev derefter individuelt bedøvet på is i 2-3 minutter og fastgjort til insektnåle med bivoks (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) og derefter bundet til armene på en vandret mølle. r, derefter gemt og vist ved hjælp af PC-Lab 2000™-software (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Flyvemøllen blev placeret i et klimareguleret rum (12 timer:12 timer, lys: mørk, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % RF).
For at visualisere flyveaktivitetsmønstret blev den samlede fløjne distance (m) og det samlede antal på hinanden følgende flyveaktiviteter beregnet pr. time over en 24-timers periode. Derudover blev de gennemsnitlige distancer fløjet af individuelle kvinder sammenlignet på tværs af behandlinger og analyseret ved hjælp af envejs ANOVA og Tukey's post hoc analyse (JMP Pro, v14.0.0), hvor SAS var en gennemsnitlig distance, der var afhængig af instituttet i forhold til en variabel, inkl. , beregnes det gennemsnitlige antal runder i intervaller på 10 minutter.
For at vurdere effekten af ​​diæt på reproduktionsevnen af ​​An.arabiensis blev seks hunner (4 dpe) overført direkte til Bugdorm-bure (30 cm × 30 cm × 30 cm) efter blodopsamling og derefter tilvejebragt den eksperimentelle diæt i 48 timer som beskrevet ovenfor. Diæter blev derefter fjernet, og gydekopper (30 ml) blev forsynet med 8 timers destillering af Nolato i 4 timer. , der skiftes hver 24. time. Gentag hver diætkur 20-50 gange. Æg blev talt og registreret for hvert forsøgsbur. Delprøver af æg blev brugt til at vurdere gennemsnitsstørrelsen og længdevariationen af ​​individuelle æg (n ≥ 200 pr. diæt) ved hjælp af et Dialux-20 mikroskop (WeFC a Letzlar, DM1000) udstyret med Ernstz, Letzlar, DM1000; 20 R2;Leica Microsystems Ltd., DE). De resterende æg blev holdt i et klimakontrolleret rum under standard opdrætsforhold i 24 timer, og en delprøve af nyligt opståede larver i 1. stadium (n ≥ 200 pr. diæt) blev målt, som beskrevet ovenfor. Antallet af æg og størrelsen af ​​æg og larver blev sammenlignet mellem en-vejs-behandlinger AJNO, Pro v4c og 1-vejs-behandlinger (AJNO, Pro v4c). 0,0, SAS Institute Inc.).
Headspace flygtige fra frisk (1 time efter prøveudtagning), 24 timers, 72 timers og 168 timers ældet urin blev opsamlet fra prøver indsamlet fra Zebu kvæg, Arsi racer. For nemheds skyld blev urinprøver indsamlet tidligt om morgenen, mens køerne stadig var i stalden. Urinprøver blev indsamlet fra 000 ml individuelle polyamidprøver til hver enkelt prøve. ingposer (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH og Co., Minden, DE) i 3 l polyamid med låg I vinylchlorid plastiktromler. Headspace flygtige stoffer fra hver kvægurinprøve blev opsamlet enten direkte (frisk) eller efter modning ved stuetemperatur i 24 timer, 72 timer og 168 timers repræsentative urinprøver i hver urinprøve.
Til opsamling af flygtige stoffer i headspace blev der brugt et lukket kredsløb til at cirkulere en aktiveret kulfiltreret gasstrøm (100 ml min-1) gennem en polyamidpose til adsorptionssøjlen i 2,5 timer ved hjælp af en membranvakuumpumpe (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Som kontrol blev headspace-opsamlingen udført af en tom ad 5 mm teflon-søjle. id) indeholdende 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) mellem glasuldspropper. Inden brug blev søjlen skyllet med 1 ml redestilleret n-hexan (Merck, Darmstadt, DE) og 1 ml pentan (99,0% kvalitet, rene opløsningsmiddel-rigtige GC), Sigma-4-syreholdige GC. μl pentan. Headspace-samlinger blev samlet og derefter opbevaret ved -20°C, indtil de blev brugt til yderligere analyse.
Adfærdsreaktioner fra værtssøgende og blodspisende An.Headspace flygtige ekstrakter indsamlet fra frisk, 24-timers, 72-timers og 168-timers ældet urin blev analyseret for flygtige ekstrakter fra Arabidopsis-myg ved hjælp af et lige glasrør olfaktometer [18]. Eksperimenterne blev udført i løbet af 13-1 timers aktivitet i løbet af ZT,'Ab-aktiviteten. [19].Et glasrørs olfaktometer (80 cm × 9,5 cm id) blev belyst med 3 ± 1 lx rødt lys fra oven. Trækulsfiltreret og befugtet luftstrøm (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relativ fugtighed) passerede bioassayet ved 30 cm s-1 skærm, hvilket skaber en serie af stål og en lamineret skærm. ensartet fanestruktur.Dental tampondispenser (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), ophængt fra en 5 cm spiral på vindenden af ​​olfaktometeret, med stimulatorskift hvert 5. minut. Til analyse blev 10 μl af hvert headspace-ekstrakt, fortyndet 1:10, brugt som en værts-di-stimulus. ammemyg blev anbragt i individuelle udløsningsbure 2-3 timer før forsøgets start. Udløsningsburet blev placeret på olfaktometerets medvindsside, og myggene fik lov til at akklimatisere sig i 1 min., og derefter blev burets sommerfugleventil åbnet for at frigive. Tiltrækning til behandling eller kontrol blev analyseret som andelen af ​​kilden til udslip af myg inden for 5 minutter, hvor myggen kom i kontakt med 5 minutter. blev replikeret mindst 30 gange, og for at undgå virkningerne af en hvilken som helst dag, blev det samme antal behandlinger og kontroller testet på hver forsøgsdag.Søg svar fra værts- og blodfodrede Ans. Arabic versus headspace-sæt blev analyseret ved hjælp af nominel logistisk regression efterfulgt af parvise sammenligninger for ulige forhold (JMP.0 Institute Inc., v4AS).
Ans gyderespons. Headspace-ekstrakter fra frisk og ældet ko-urin blev analyseret i Bugdorm-bure (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastkopper (30 mL; Nolato Hertila) fyldt med 20 mL destilleret vand gav gydesubstratet og blev placeret i det modsatte hjørne, og blev placeret i det modsatte hjørne. med 10 μl af hvert headspace-ekstrakt i en 1:10 fortynding. En lige stor mængde pentan blev brugt til at justere kontrolkoppen. Behandlings- og kontrolkopper blev udskiftet mellem hvert eksperiment for at kontrollere positionseffekter. Ti blodfodrede hunner blev sluppet ud i forsøgsbure ved ZT 9-11 og æg i kopper blev beregnet til 24 timers ægoptælling: lagt i behandlingsbægeret – antallet af æg lagt i kontrolkoppen)/(det samlede antal lagte æg). Hver behandling blev gentaget 8 gange.
Gaschromatografisk og elektronantennemønsterdetektion (GC-EAD) analyse af kvindelige An.arabiensis blev udført som tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt blev friske headspace flygtige ekstrakter separeret ved hjælp af en Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, US) udstyret med en HP-5-søjle (A205 mm × 5 0 tykkelse, Agilent Technologies 6890 GC) ).og aldrende urin. Hydrogen blev brugt som den mobile fase med en gennemsnitlig lineær strømningshastighed på 45 cm s-1. Hver prøve (2 μl) blev injiceret i 30 sekunder i splitfri tilstand med en indløbstemperatur på 225 °C. GC ovntemperaturen blev programmeret fra 35 °C (3 minutters hold) til 300 minutter hold °C ved 10 min. 4 psi nitrogen blev tilsat og delt 1:1 i et Gerstel 3D/2 lavt dødvolumenkryds (Gerstel, Mülheim, DE) mellem flammeioniseringsdetektoren og EAD. GC effluentkapillæren til EAD blev ført gennem en Gerstel ODP-2 overføringsledning, som sporer GC ovnens temperatur med 0 cm og et glasrør, - 8 mm. befugtet luft (1,5 l min−1). Antennen blev placeret 0,5 cm fra udløbet af røret. Hver enkelt myg tegnede sig for et replikat, og for værtssøgende myg blev der udført mindst tre replikater på urinprøver i hver alder.
Identifikation af bioaktive forbindelser i headspace-samlinger af frisk og ældet kvægurin ved hjælp af et kombineret GC- og massespektrometer (GC-MS; 6890 GC og 5975 MS; Agilent Technologies) for at fremkalde antennereaktioner i GC-EAD-analyse, der opererer i elektronpåvirkningsioniseringstilstand ved 70 HP-søjle- 5 eV. (60 m × 0,25 mm indvendig diameter, 0,25 μm filmtykkelse) ved brug af helium som den mobile fase med en gennemsnitlig lineær strømningshastighed på 35 cm s-1. En 2 μl prøve blev injiceret ved hjælp af de samme injektorindstillinger og ovntemperatur som for GC-EAD-analysen. Forbindelserne blev identificeret baseret på deres specifikante retentionstid og libr-indekset libr1 og sammenlignet med deres specifikke retentionstid og libr1. ary (Agilent). Identificerede forbindelser blev bekræftet ved at injicere autentiske standarder (Yderligere fil 1: Tabel S2). Til kvantificering blev heptylacetat (10 ng, 99,8 % kemisk renhed, Aldrich) injiceret som en ekstern standard.
Evaluering af effektiviteten af ​​en syntetisk lugtblanding bestående af bioaktive forbindelser identificeret i frisk og ældet urin til at tiltrække værtssøgende og blodsugende Ans.arabiensis, ved brug af det samme olfaktometer og protokol som ovenfor. Syntetiske blandinger efterlignede sammensætningen og proportionerne af forbindelser i blandede headspace flygtige ekstrakter af friske, 4-1 timer, 8 timer, 2 timer og 4 timer, -timealdret urin (Figur 5D-G; Yderligere fil 1: Tabel S2). Til analyse skal du bruge 10 μl af en 1:100 fortynding af den fuldsyntetiske blanding, med en samlet frigivelseshastighed fra ca. enkelte forbindelser af den komplette blanding fjernes.Søg svar fra vært og blodfodret Ans.Arab vs syntetiske og subtraktive blandinger blev analyseret ved hjælp af nominel logistisk regression efterfulgt af parvise sammenligninger for ulige forhold (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
For at vurdere, om ko-urin kunne tjene som værtshabitat-cue for malariamyg, blev frisk og ældet ko-urin, opsamlet som beskrevet ovenfor, og vand anbragt i maskede 3 l spande (100 ml) og sat i værtslokkemad.(BG-HDT version; BioGents, Regensburg, DE). Ti fælder placeret 50 m fra hinanden på græsarealer, 400 m fra landsbysamfund (Silay, Etiopien, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) og ingen kvæg, på permanente ynglepladser og landsbyer. roteres om natten i i alt fem nætter. Myggetal fanget i fælder lokket med urin af forskellige aldre blev sammenlignet ved hjælp af logistisk regression med en beta binomial fordeling (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
I en malaria-endemisk landsby nær byen Maki, Oromia-regionen, Etiopien (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figur 6A). Undersøgelsen blev udført mellem midten af ​​august og midten af ​​september før den årlige indendørs resterende sprøjtning, sammen med en lang periode på 50 m fra hinanden (0 m) fra hinanden. udkanten af ​​landsbyen blev udvalgt til undersøgelsen (Fig. 6A). Kriterierne, der blev brugt til at udvælge husene, var: ingen dyr tilladt i huset, ingen indendørs madlavning (tegning af brænde eller kul) var tilladt (i hvert fald i forsøgsperioden), og huse med højst to indbyggere, der sov i uinsekticider.under det behandlede myggenet.Etisk godkendelse er blevet givet af Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) på Det Naturvidenskabelige Fakultet (CNS-IRB), Addis Abeba University, i overensstemmelse med retningslinjerne fastsat af World Medical Association Declaration of Helsinki.Samtykke fra hver leder af sundhedsplejen er opnået ved den lokale distriktsadministration, og hele distriktsadministrationsprocessen blev afsluttet. 'kebele') niveau. Det eksperimentelle design fulgte et 2 × 2 latinsk firkantet design, hvor syntetiske blandinger og kontroller blev tildelt til parrede huse den første nat og byttet mellem huse den næste forsøgsnat. Denne proces blev gentaget ti gange. Derudover blev CDC-fælderne sat til at køre fem på hinanden følgende dag på dagen i slutningen af ​​dagen, for at estimere myggeaktiviteten i udvalgte huse.
En syntetisk blanding indeholdende seks bioaktive forbindelser blev opløst i heptan (97,0 % opløsningsmiddel GC-kvalitet, Sigma Aldrich) og frigivet ved 140 ng h-1 ved hjælp af en bomuldsvægedispenser [20]. Vægedispenseren gjorde det muligt for alle forbindelser at blive frigivet i konstante proportioner gennem hele 12 timers eksperimentet. Control and Prevention (CDC) lysfælde (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Figur 6A). Fælderne blev hængt 0,8 – 1 m over jorden, nær ved fodenden af ​​sengen, og en frivillig sov under et ubehandlet myggenet og opereret mellem kl. 18.00 og 06.30. , og gravide [21] blev efterfølgende screenet ved hjælp af polymerase kædereaktion (PCR) analyse for at identificere arten morfologisk identificeret som A. gambiae sl. Medlemmer af komplekset [23]. I feltstudiet blev fældefangst af parrede huse analyseret ved hjælp af en nominel logistisk tilpasningsmodel, hvor tiltrækning var den afhængige blanding vs. behandling (J. 4-effekt)0. SAS Institute Inc.).Her rapporterer vi χ2- og p-værdierne fra sandsynlighedsforholdstesten.
Evaluer, om det er sikkert.arabiensis var i stand til at opnå urin, dens vigtigste nitrogenkilde, urinstof, ved direkte fodring, inden for 48 timer efter administration i 4 dage efter (dpe) værtssøgende og blodfodrede kvindefodringsforsøg (Fig. 1A). Både værtssøgende og blodsugende hunner absorberede signifikant mere diæt, <5 p,206F) = (5 p. henholdsvis 0,0001 og F(5.299) = 56,00, p < 0,0001; Fig. 1B,C). Ydermere spiste værtssøgende hunner mindre i urinen efter 72 timer sammenlignet med urinen efter 168 timer (Fig. 1B).Når hun blev tilbudt en diæt indeholdende 2 M, absorberede hun en betydelig mængde urinstof - seekingly 9 M. sammenlignet med alle andre koncentrationer og vand, mens det ikke kan skelnes fra 10 % saccharose (F(10.813) = 15,72, p < 0,0001; figur 1D). Dette var i modsætning til reaktionen fra blodfodrede hunner, som typisk absorberede signifikant mere urinstofholdige diæter end 50 % sucrose, omend 50 % sucrose, omend 5(7) 0 %. 5, p < 0,0001; figur 1).1E). Desuden, når man sammenligner mellem de to fysiologiske tilstande, absorberede phlebotomized hunner mere urinstof end værtssøgende hunner ved de laveste koncentrationer, og disse hunner absorberede lignende mængder urinstof ved højere koncentrationer (F(1,953.08)= 01;08;08;Fig. 1F, G). Mens indtag fra en urinstofholdig diæt så ud til at have optimale værdier (fig. 1D,E), var kvinder i begge fysiologiske tilstande i stand til at modulere mængden af ​​absorberet urinstof over hele intervallet af urinstofkoncentrationer på en log-lineær måde (fig. 1F,G).).Tilsvarende ser myg ud til at kontrollere deres nitrogenoptagelse ved at regulere mængden af ​​absorberet urin, da mængden af ​​nitrogen i urinen afspejles i den absorberede mængde (figur 1B, C og B indsat).
For at vurdere virkningerne af urin og urinstof på værtssøgende og blodsugende mygoverlevelse, blev hunnerne fodret med urin i alle fire aldre (frisk, 24 timer, 72 timer og 168 timer efter aflejring) og en række urinstofkoncentrationer, såvel som destilleret vand og 10 % saccharose havde en signifikant effekt på overlevet kontrol (denne survigur havde en signifikant kontrol over den samlede kontrol). vival hos værtssøgende hunner (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) og blodfodrede hunner (urin: χ,02, p. χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Figur 2D,E).I alle eksperimenter havde kvinder fodret med en diæt med urin, urinstof og vand signifikant lavere overlevelsesrater sammenlignet med kvinder fodret med en saccharosediæt (figur 2B-E). h forældet urin (p = 0,016) med den laveste overlevelsessandsynlighed (fig. 2B). Desuden overlevede værtssøgende hunner fodret med 135 mM urinstof længere end vandkontroller (p < 0,04) (fig.2C). Sammenlignet med vand overlevede kvinder fodret med frisk urin og 24-timers urin længere (hhv. p = 0,001 og p = 0,012; figur 2D), mens kvinder fodret med 72-timers urin overlevede længere end dem, der fik kvinden kort frisk urin og 24 timers alderen <1,0 p. 0 p. e 2D). Når de blev fodret med 135 mM urinstof, overlevede blodfodrede hunner længere end alle andre koncentrationer af urinstof og vand (p < 0,013; figur 2E).
Overlevelse af værts- og blodsugende kvindelige Anopheles arabinis, der fodrer med ko-urin og urinstof. I bioassayet (A) fik hunmyg en diæt bestående af frisk og ældet ko-urin, forskellige koncentrationer af urinstof, saccharose (10%) og destilleret vand (H2O). Overlevelsen af ​​værts-, C- og mygsøgende blod (E-D) blev registreret 2 timer, indtil alle hunner fodret med urin (B, D) og urinstof (C, E) og kontroller, saccharose og vand, er døde
Den samlede distance og antallet af runder bestemt i flyvemølletesten over en 24-timers periode adskilte sig mellem værtssøgende og blodsugende myg, som viste mindre flyveaktivitet samlet set (fig. 3). Værtssøgende myg, der gav frisk og ældet urin eller saccharose og vand, viste tydelige flyvemønstre, mens hun fodrede mere ved dawn (fig. 4- og 168-timers gamle myg, der fodrede med urin, udviste forskellige flyvemønstre og var primært dagaktive. Hunmyg, der gav saccharose eller 72-timers urin, udviste aktivitet i hele 24-timersperioden, mens hunner, der gav vand, var mere aktive i midtperioden. Myg udviste den højeste aktivitet om morgenen, mens de indtog den tidlige nat og den højeste aktivitet om morgenen og om morgenen. 72-timers ældet urin oplevede et stabilt fald i aktivitet over 24 timer (figur 3).
Flyvepræstationer for jægersøgende blodsugende kvindelige Anopheles arabinis, der fodrer med ko-urin og urinstof.I flyvemølletesten blev hunmyg fodret med frisk og ældet ko-urin, forskellige koncentrationer af urinstof, saccharose (10%) og destilleret vand (H2O) bundet til vandret, frit roterende hun-blod (til højre og venstre roterende blod). , blev den samlede distance og antallet af flyvninger i timen for hver diæt over en 24-timers periode registreret (mørke: grå; lys: hvid). Gennemsnitlig distance og gennemsnitligt antal anfald er vist til højre for den cirkadiske aktivitetsgraf. Fejlbjælker repræsenterer standardfejl for gennemsnittet. Statistisk analyse se tekst
Generelt fulgte den samlede flyveaktivitet for værtssøgende hunner et mønster svarende til det for flyvedistance over en 24-timers periode. Gennemsnitlig flyvedistance var signifikant påvirket af diæt indtaget (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), og værtssøgende hunner indtog 72 timers urin og fløj signifikant længere end 0 crose sammenlignet med alle andre 0 crose-distancer. fodrede myg fløj længere end friske (p = 0,022) og 24-timers ældne urin (p = 0,022)-fodrede myg. I modsætning til flyveaktivitetsmønsteret beskrevet af urindiæten, udviste urinstoffodrede værtssøgende hunner vedvarende flyveaktivitet over en 24-timers flyveaktivitet i den anden halvdel af den mørke periode i den anden halvdel af den mørke periode (f. søger hunner fodret med urinstof øgede signifikant gennemsnitlig flyvedistance afhængigt af den absorberede koncentration (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Værtssøgende hunner fodret med enhver koncentration af urinstof fløj længere end hunner fodret med enten vand eller saccharose (p < 0,03).
Den overordnede flyveaktivitet for blodsugende myg var stabil og opretholdt over 24 timer på tværs af alle diæter, med øget urinaktivitet i anden halvdel af den mørke periode for hunner fodret med vand såvel som hos hunner fodret med friske og 24 timer gamle (billede 3). Mens urindiæt signifikant påvirkede den gennemsnitlige flyvedistance hos blodfodrede hunner (F = 38(5,01), 0 = 38(5, 01). t gjorde ikke (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24).
Virkningerne af urin- og urinstoffodring på reproduktionsparametre blev vurderet i æglægningsbioassays (Figur 4A) og blev undersøgt i henhold til antallet af æg lagt af hver hunkøn, ægstørrelse og nyudklækkede larver i første stadium. Antallet af æg, der blev lagt.Urinfodrede arabiske hunner varierede efter kost (F. 4B). Hunner fodret med en 24-timers urin, blodmel lagde signifikant flere æg end hunner, der blev fodret med andre urindiæter og lignede dem, der blev fodret med saccharose (Fig. 4B). Ligeledes varierede størrelsen af ​​æg lagt af urinfodrede hunner efter kost (F(5, 209) = 120.0, - 0, - 0, - 0,-2, urin, urin. fodrede hunner, der lægger signifikant større æg end vandfodrede hunner, mens æggene fra hunner fodret med 168 timers urin var signifikant mindre (Fig. 4C). Derudover påvirkede urindiæt larvestørrelsen signifikant (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), med signifikante æg fra 7-2 larve og 4-2 larve. gamle urinfodrede hunner end fra æg lagt fra æglarver.Vandfodrede og 168 timers urinfodrede hunner (Figur 4D).
Reproduktionsevne hos kvindelige Anopheles arabinis, der fodrede med ko-urin og urinstof. Blodfodrede hunmyg blev fodret med diæter bestående af frisk og ældet ko-urin, forskellige koncentrationer af urinstof, saccharose (10%) og destilleret vand (H2O) i 48 timer, før de blev anbragt i bioassays (Egg-størrelse A, 8 timer, Egg-størrelse A, substrater, A, B). , F) og larvernes størrelse (D, G) var signifikant påvirket af den tilvejebragte diæt (ko-urin: BD; urinstof: EG). Middelværdier for hver parameter målt ved hjælp af forskellige bogstavnavne var signifikant forskellige fra hinanden (envejs ANOVA ved hjælp af Tukeys post hoc-analyse; p < 0,05). Fejlbjælker repræsenterer standardfejl for gennemsnittet
Som den vigtigste nitrogenholdige komponent i urinen, har urinstof, når det blev givet som en diæt til hundyr, der blev fodret med blod, signifikant påvirket reproduktionsparametrene i alle undersøgelser. Antallet af æg lagt af hunner, der blev fodret med urinstof, efter et blodmåltid, afhængig af urinstofkoncentrationen (F(11, 360) = 4,69; p < 1,00 s mellem 1 og 1,00 hundyr. 34 mM lagde flere æg (Figur 4E). Hunner fodret med urinstofkoncentrationer på 134 µM eller derover lægger større æg end hunner fodret med vand (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Figur 4F), og larvestørrelser på (31,0 F) moder, selvom de er påvirket af (31,0 F) moder, selvom de er påvirket af (31,0 F). p < 0,0001) var mere variabel (fig. 4G).
Samlet tiltrækningskraft for værtssøgende bovin urin headspace flygtige ekstrakter. Arabiensis vurderet i glasrørets olfaktometer (fig. 5A) var signifikant påvirket af urinens alder (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; fig. 5B viste, at 24 timers lugtniveau var signifikant højere). sammenlignet med alle andre behandlinger (72 timer: p = 0,0060, 168 timer: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), Bortset fra lugten af ​​frisk urin (p = 0,13; Figur 5B). 0,067; Fig. 5C), blev disse hunner fundet at være signifikant mere attraktive for headspace-flygtige ekstrakter sammenlignet med 72-timers ældet urin sammenlignet med kontroller (p = 0,0066; Figur 5C).
Adfærdsreaktioner på naturlige og syntetiske ko-urin-lugte i søgen efter værts- og blodfodrede Anopheles arabianus. Skematisk af glasrørets olfaktometer (A). Tiltrækning af headspace flygtige ekstrakter fra frisk og ældet ko-urin til vært (B) og blodsugende (C) myg. -time (E), 72-timers (F) og 168-timers (G) ældet ko-urin er vist. Elektronantennedetektion (EAD) spor viser spændingsændringer som reaktion på bioaktive forbindelser i headspace elueret fra gaskromatografen og detekteret af en flammeioniseringsdetektor bar (FID). s (µg h-1) af de biologisk aktive forbindelser er vist.En enkelt stjerne (*) angiver en konsekvent lav-amplitude-respons.Dobbeltstjerner (**) angiver ikke-reproducerbare responser.Find værten (H) og den blodsugende (I) An.arabiensis har forskellige tiltrækningskraft til syntetiske blandinger af urin- og ældets forskellige navne af friske og ældede myg-lugtende, forskellige urin- og ældstede mængder af frisk og ældet ko. hinanden (en-vejs ANOVA ved hjælp af Tukeys post hoc analyse;p < 0,05). Fejlbjælker repræsenterer standardfejl på skalaen
Hun Ann.arabiensis, 72 timer og 120 timer efter blodmåltid, under gydning, blev der ikke vist nogen præference for headspace flygtige ekstrakter fra frisk og ældet ko-urin sammenlignet med pentankontroller (χ2 = 3,07, p > 0,05; Yderligere fil 1: Fig. S1).
For kvindelige Ann.arabiensis, GC-EAD og GC-MS analyser identificerede otte, seks, tre og tre bioaktive forbindelser (Figur 5D-G). Selvom der blev observeret forskelle i antallet af forbindelser, der fremkaldte elektrofysiologiske responser, var de fleste af disse forbindelser til stede i hvert headspace flygtigt ekstrakt indsamlet fra frisk og ældet ældet urin, for hver antenna-ekstrakt, kun produceret af den ovennævnte fysiologiske forbindelse. tærsklen blev inkluderet i yderligere analyser.
Den samlede flygtige frigivelseshastighed af bioaktive forbindelser i headspace-samlingen steg fra 29 µg h-1 i frisk urin til 242 µg h-1 i 168-timers ældet urin, hovedsageligt på grund af p-cresol og m-formaldehyd Phenol-stigninger såvel som phenol. I modsætning hertil falder frigivelseshastighederne af 1-, cyclohexanal- og andre urinforbindelser, f.eks. alder, hvilket korrelerede med det observerede fald i signalintensitet (overflod) i kromatogrammet (fig. 5D)-G venstre panel) og fysiologiske reaktioner på disse forbindelser (fig. 5D-G højre panel).
Samlet set havde den syntetiske blanding et lignende naturligt forhold mellem bioaktive forbindelser identificeret i flygtige ekstrakter af friske og ældede urin-headspaces (fig. 5D-G) og så ikke ud til at fremkalde signifikant appel i søgningen efter en vært (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; fig. 5H) = χ-dvs, 2-mosquitoe, 4-blod, 2, 4, 2, 4, 4, 2, 3, 2, 4 Imidlertid viste post hoc parvise sammenligninger mellem behandlinger, at værtssøgende myg var signifikant attraktive for den syntetiske blanding af 24-timers ældet urin sammenlignet med pentankontroller (p = 0,0086; figur 5H).
For at vurdere de enkelte komponenters rolle i syntetiske blandinger af 24-timers ældet urin, blev seks subtraktive blandinger evalueret mod komplette blandinger i Y-rør-assayet, hvor individuelle forbindelser blev fjernet. For værtssøgende myg havde subtrahering af individuelle forbindelser fra den komplette blanding en signifikant effekt på adfærdsreaktioner (χ2 = 19.60, χ2 = 19.60, χ2 = 19.60; 2A), var alle subtraktive blandinger mere attraktive end mindre end fuldt blandede. I modsætning hertil påvirkede fjernelse af individuelle forbindelser fra den fuldsyntetiske blanding ikke adfærdsreaktionerne af blodsugende myg (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), med undtagelse af decanal-niveauer, som resulterede i det lavere decanal-niveau, sammenlignet med 2-filen: 2. B).
I en malaria-endemisk landsby i Etiopien blev effektiviteten af ​​en syntetisk blanding af 24-timers ko-urin til at tiltrække myg under markforhold evalueret i ti nætter (fig. 6A). I ​​alt 4.861 myg blev fanget og identificeret, hvoraf 45,7% var Anthropus, 3% sløv og 5% anthropus. ,4% var Culex spp.(Yderligere fil 1: Tabel S1). Anopheles arabinis er det eneste medlem af An.Gambian artskompleks identificeret ved PCR-analyse.I gennemsnit blev der fanget 320 myg pr. nat, i hvilket tidsrum fælder med syntetisk blanding lokkemad fangede flere myg end parrede fælder uden blanding, (χ,0129) = .0129 (χ,07,06) ).Fælder uden lokkemad blev sat på hver af de fem kontrolnætter i begyndelsen, midten og slutningen af ​​forsøget. Lignende antal myg blev fanget i hvert par fælder, hvilket indikerer, at der ikke er nogen skævhed mellem husene (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05 fælder med fælder i undersøgelsesperioden og ingen myg-par i undersøgelsesperioden. fanget i fælderne, der indeholdt den syntetiske blanding, var signifikant øget: værtssøgning (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nylig blodfodring (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) og graviditet (χ2,0,0, 0,28;Yderligere fil 1: Tabel S1). Dette afspejles også i det samlede antal indfangede myg: værtssøgning > blodsugende > gravid > halvgravid > hankøn.
Feltvurdering af effektiviteten af ​​en 24-timers syntetisk ko-urin-lugtblanding. Feltforsøg blev udført i det sydlige centrale Etiopien (kort), nær byen Maki (indsæt), ved hjælp af en Centers for Disease Control (CDC) lysfælde (højre) i parrede huse, med et latinsk firkantet design (luftbillede tiltrukket af cd'en) (Aerial image) (Aerial image) (Abayntrapture). besques (B), men ikke Anopheles farroes (C), på en anden måde, en fysiologisk tilstandsafhængig effekt.Desuden fangede disse fælder et betydeligt øget antal af værts-Culex-myggene.(D) Sammenlignet med kontrol. Stængerne til venstre repræsenterer det gennemsnitlige udvælgelsesindeks for myg fanget i par af lugtende fælden, mens (åbnen) 0 lokker repræsenterer den gennemsnitlige lugtende fælde og kontrol (1) indeks i par af kontrolfælder (åbne; N = 5).).Asterisker angiver statistiske signifikansniveauer (*p = 0,01 og ***p < 0,0001)
De tre arter blev fanget forskelligt i fælder, der indeholdt syntetiske blandinger. Leder efter vært (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), blodfodring (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) og graviditet (χ1801, 0,3) = 612,01,0) = χ181,0) .arabiensis blev fanget i fælden, der frigjorde den syntetiske blanding (fig. 6B), mens mængden af ​​An ikke var forskellig. Pharoensis i forskellige fysiologiske tilstande blev fundet (fig. 6C). For Culex blev der kun fundet en signifikant stigning i antallet af myg, der søgte værter i fælder, der var lokket med den syntetiske blanding (13129) (13129) (13129; 6D), sammenlignet med kontrolfælder.
Værtslokkefælder placeret uden for potentielle værter mellem ynglepladser og landlige samfund i Etiopien blev brugt til at vurdere, om malariamyg bruger ko-urin-lugt som en værtshabitat-cue. I fravær af vært-cues, varme og med eller uden tilstedeværelse af ko-urin-lugt, blev der ikke fanget myg (Figurvery-file of co-odore, co-urin, s31: tilstedeværelsen af ​​hun-urin, høj-urin, S31). ariamyg blev tiltrukket og fanget, omend i små antal, uafhængigt af urinens alder (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Yderligere fil 1: Figur S3). I modsætning hertil fangede vandkontroller ikke malariamyg ved høje temperaturer (Yderligere fil 1: Figur S3).
Malariamyg erhverver og distribuerer kvælstofholdige forbindelser gennem kompenserende fodring med ko-urin (dvs. vandpytter) for at forbedre livshistorieegenskaber, svarende til andre insekter [2, 4, 24, 25, 26]. Kourin er en let tilgængelig fornyelig ressource tæt forbundet med malariamyg, som er tæt forbundet med malaria-vektorer og kursteder, såsom malariamyg og rastepladser. Hunmyg lokaliserer denne ressource ved hjælp af lugt og er i stand til at regulere optagelsen af ​​nitrogenholdige forbindelser i urinen, herunder urinstof, den vigtigste nitrogenholdige komponent i urinen [15, 16]. Afhængig af hunmyggens fysiologiske tilstand tildeles næringsstoffer i urinen for at øge værtens flugt, overlevelse og overlevelse af hunmyg, samt overlevelsesaktivitet og overlevelse af hunmyg. karakteristika for blodfodrede individer under den første gonadotrope cyklus. Derfor spiller urinblanding en vigtig ernæringsmæssig rolle for malariavektorer, der er lukkede som underernærede voksne [8], da det giver hunmyg evnen til at erhverve vigtige nitrogenholdige forbindelser ved at engagere sig i lavrisiko-fodring. Denne opdagelse har betydelige, epidemiologiske konsekvenser for deres levetid, og som følge af, at hunlige vektorer kan øges. kapacitet. Ydermere kan denne adfærd være målet for fremtidige vektorstyringsprogrammer.