Tak fordi du besøgte Nature.com.Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.
Viser en karrusel med tre dias på én gang.Brug knapperne Forrige og Næste til at flytte gennem tre dias ad gangen, eller brug skyderknapperne i slutningen til at flytte gennem tre dias ad gangen.
Blod-hjerne-barrieren og blod-hjerne-barrieren forhindrer bioterapeutiske midler i at nå deres mål i centralnervesystemet og hindrer derved effektiv behandling af neurologiske sygdomme.For at opdage nye hjernetransportører in vivo introducerede vi et T7-fag-peptidbibliotek og serielt opsamlet blod og cerebrospinalvæske (CSF) ved hjælp af en kanyleret bevidst stor poolmodel af rotter.Specifikke fagkloner blev stærkt beriget i CSF efter fire selektionsrunder.Test af individuelle kandidatpeptider afslørede mere end 1000 gange berigelse i CSF.Bioaktiviteten af ​​den peptid-medierede levering til hjernen blev bekræftet af en 40% reduktion i niveauet af amyloid-β i cerebrospinalvæsken under anvendelse af en BACE1-peptidhæmmer forbundet med det identificerede nye transitpeptid.Disse resultater tyder på, at peptiderne identificeret ved in vivo fagudvælgelsesmetoder kan være nyttige vehikler til systemisk levering af makromolekyler til hjernen med en terapeutisk virkning.
Centralnervesystem (CNS) målrettet terapiforskning har i vid udstrækning fokuseret på at identificere optimerede lægemidler og midler, der udviser CNS-målrettede egenskaber, med mindre indsats for at opdage de mekanismer, der driver aktiv lægemiddellevering til hjernen.Dette begynder at ændre sig nu, da lægemiddellevering, især store molekyler, er en integreret del af moderne neurovidenskabelig lægemiddeludvikling.Miljøet i centralnervesystemet er godt beskyttet af det cerebrovaskulære barrieresystem, der består af blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren (BCBB)1, hvilket gør det udfordrende at levere lægemidler til hjernen1,2.Det anslås, at næsten alle lægemidler med store molekyler og mere end 98 % af lægemidler med små molekyler elimineres fra hjernen3.Derfor er det meget vigtigt at identificere nye hjernetransportsystemer, der giver effektiv og specifik levering af terapeutiske lægemidler til CNS 4,5.BBB og BCSFB præsenterer imidlertid også en glimrende mulighed for lægemiddellevering, da de trænger ind og trænger ind i alle strukturer i hjernen gennem dens omfattende vaskulatur.Således er de nuværende bestræbelser på at bruge ikke-invasive metoder til levering til hjernen i vid udstrækning baseret på mekanismen for receptor-medieret transport (PMT) ved hjælp af den endogene BBB6-receptor.På trods af de seneste vigtige fremskridt ved brug af transferrinreceptor-vejen7,8 er yderligere udvikling af nye leveringssystemer med forbedrede egenskaber påkrævet.Til dette formål var vores mål at identificere peptider, der er i stand til at mediere CSF-transport, da de i princippet kunne bruges til at levere makromolekyler til CNS eller til at åbne nye receptorveje.Specifikt kan specifikke receptorer og transportører af det cerebrovaskulære system (BBB og BSCFB) tjene som potentielle mål for aktiv og specifik levering af bioterapeutiske lægemidler.Cerebrospinalvæske (CSF) er et sekretorisk produkt af choroid plexus (CS) og er i direkte kontakt med interstitialvæsken i hjernen gennem subaraknoidalrummet og ventrikulærrummet4.For nylig er det blevet vist, at subarachnoid cerebrospinalvæske diffunderer for meget ind i hjernens interstitium9.Vi håber at få adgang til det parenkymale rum ved hjælp af denne subarachnoidale indstrømningskanal eller direkte gennem BBB.For at opnå dette implementerede vi en robust in vivo fagudvælgelsesstrategi, der ideelt identificerer peptider transporteret af en af ​​disse to forskellige veje.
Vi beskriver nu en sekventiel in vivo fagdisplay-screeningsmetode med CSF-sampling kombineret med high throughput-sekventering (HTS) for at overvåge indledende udvælgelsesrunder med den højeste biblioteksdiversitet.Screening blev udført på rotter ved bevidsthed med en permanent implanteret stor cisterna (CM) kanyle for at undgå blodkontaminering.Det er vigtigt, at denne tilgang udvælger både hjerne-målretning og peptider med transportaktivitet over den cerebrovaskulære barriere.Vi brugte T7-fager på grund af deres lille størrelse (~60 nm)10 og foreslog, at de er egnede til transport af vesikler, der tillader transcellulær krydsning af endotel- og/eller epitel-medulla-barrieren.Efter fire runder med panorering blev fagpopulationer isoleret, der viste stærk in vivo CSF-berigelse og cerebral mikrokarassociation.Det er vigtigt, at vi var i stand til at bekræfte vores resultater ved at demonstrere, at de foretrukne og kemisk syntetiserede bedste kandidatpeptider er i stand til at transportere proteinlast ind i cerebrospinalvæsken.Først blev de farmakodynamiske virkninger af CNS etableret ved at kombinere et førende transitpeptid med en inhibitor af BACE1-peptidet.Ud over at demonstrere, at in vivo funktionelle screeningsstrategier kan identificere nye hjernetransportpeptider som effektive proteinlastbærere, forventer vi, at lignende funktionelle selektionstilgange også bliver vigtige til at identificere nye hjernetransportveje.
Baseret på plakdannende enheder (PFU) blev der efter fagpakningstrinnet designet og skabt et bibliotek af tilfældige 12-mer lineære T7-fagpeptider med en diversitet på ca. 109 (se materialer og metoder).Det er vigtigt at bemærke, at vi omhyggeligt analyserede dette bibliotek før in vivo panorering.PCR-amplifikation af fagbiblioteksprøver under anvendelse af modificerede primere genererede amplikoner, der var direkte anvendelige til HTS (Supplerende Fig. 1a).På grund af a) HTS11 sekventeringsfejl, b) indflydelse på kvaliteten af ​​primere (NNK)1-12 og c) tilstedeværelsen af ​​vildtype (wt) fag (skeletinserts) i standbybiblioteket, blev en sekvensfiltreringsprocedure implementeret til kun at udtrække verificeret sekvensinformation (Supplerende Fig. 1b).Disse filtertrin gælder for alle HTS-sekventeringsbiblioteker.For standardbiblioteket blev der opnået i alt 233.868 læsninger, hvoraf 39 % bestod filterkriterierne og blev brugt til biblioteksanalyse og udvælgelse til efterfølgende runder (Supplerende figur 1c–e).Aflæsningerne var overvejende multipla af 3 basepar i længden med en top ved 36 nukleotider (Supplerende Fig. 1c), hvilket bekræfter biblioteksdesignet (NNK) 1-12.Det er bemærkelsesværdigt, at ca. 11% af biblioteksmedlemmerne indeholdt en 12-dimensional vildtype (wt)-rygrad PAGISRELVDKL-insert, og næsten halvdelen af ​​sekvenserne (49%) indeholdt insertioner eller deletioner.HTS for biblioteksbiblioteket bekræftede den høje diversitet af peptider i biblioteket: mere end 81 % af peptidsekvenserne blev kun fundet én gang, og kun 1,5 % forekom i ≥4 kopier (Supplerende Fig. 2a).Hyppighederne af aminosyrer (aa) i alle 12 positioner i repertoiret korrelerede godt med de forventede frekvenser for antallet af kodoner genereret af det degenererede NKK-repertoire (Supplerende Fig. 2b).Den observerede frekvens af aa-rester kodet af disse inserts korrelerede godt med den beregnede frekvens (r = 0,893) (Supplerende Fig. 2c).Fremstillingen af ​​fagbiblioteker til injektion omfatter trinene amplifikation og fjernelse af endotoksin.Dette har tidligere vist sig potentielt at reducere mangfoldigheden af ​​fagbiblioteker12,13.Derfor sekventerede vi et pladeamplificeret fagbibliotek, der havde gennemgået endotoksinfjernelse, og sammenlignede det med det originale bibliotek for at estimere hyppigheden af ​​AA.En stærk korrelation (r = 0,995) blev observeret mellem den oprindelige pool og den amplificerede og oprensede pool (Supplerende Fig. 2d), hvilket indikerer, at konkurrence mellem kloner amplificeret på plader under anvendelse af T7-fag ikke forårsagede større bias.Denne sammenligning er baseret på frekvensen af ​​tripeptidmotiver i hvert bibliotek, da mangfoldigheden af ​​biblioteker (~109) ikke kan fanges fuldt ud selv med HTS.Frekvensanalyse af aa ved hver position afslørede en lille positionsafhængig bias i de sidste tre positioner af det indtastede repertoire (Supplerende Fig. 2e).Som konklusion konkluderede vi, at kvaliteten og diversiteten af ​​biblioteket var acceptabel, og kun mindre ændringer i diversiteten blev observeret på grund af amplifikation og forberedelse af fagbiblioteker mellem flere selektionsrunder.
Seriel cerebrospinalvæskeprøvetagning kan udføres ved kirurgisk at implantere en kanyle i CM af bevidste rotter for at lette identifikation af T7-fag injiceret intravenøst ​​(iv) via BBB og/eller BCSFB (fig. 1a-b).Vi brugte to uafhængige selektionsarme (arme A og B) i de første tre runder af in vivo selektion (fig. 1c).Vi øgede gradvist selektionens stringens ved at reducere den samlede mængde fag, der blev introduceret i de første tre selektionsrunder.Til den fjerde panoreringsrunde kombinerede vi prøver fra grenene A og B og udførte tre yderligere uafhængige valg.For at studere in vivo-egenskaberne af T7-fagpartikler i denne model blev vildtype-fag (PAGISRELVDKL master-insert) injiceret i rotter via halevenen.Genvinding af fager fra cerebrospinalvæske og blod på forskellige tidspunkter viste, at relativt små T7 icosaedriske fager havde en hurtig initial clearance-fase fra blodrummet (Supplerende Fig. 3).Baseret på de administrerede titere og rotternes blodvolumen beregnede vi, at kun ca. 1 vægt-%.fag fra den indgivne dosis blev påvist i blodet 10 minutter efter intravenøs injektion.Efter dette indledende hurtige fald blev en langsommere primær clearance målt med en halveringstid på 27,7 minutter.Det er vigtigt, at kun meget få fager blev hentet fra CSF-rummet, hvilket indikerer en lav baggrund for vildtype-fagmigration ind i CSF-rummet (Supplerende Fig. 3).I gennemsnit blev der kun påvist ca. 1 x 10-3% titere af T7-fag i blodet og 4 x 10-8% af initialt infunderede fager i cerebrospinalvæsken over hele prøvetagningsperioden (0-250 min).Det er bemærkelsesværdigt, at halveringstiden (25,7 min) af vildtype-fag i cerebrospinalvæske svarede til den, der blev observeret i blod.Disse data viser, at barrieren, der adskiller CSF-rummet fra blodet, er intakt i CM-kanylerede rotter, hvilket tillader in vivo-selektion af fagbiblioteker for at identificere kloner, der let transporteres fra blodet ind i CSF-rummet.
(a) Opsætning af en metode til genudtagning af cerebrospinalvæske (CSF) fra en stor pool.(b) Diagram, der viser den cellulære placering af centralnervesystembarrieren (CNS) og selektionsstrategien, der bruges til at identificere peptider, der krydser blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren.(c) In vivo fagdisplayscreeningsflowdiagram.I hver selektionsrunde blev fager (dyreidentifikatorer inde i pilene) injiceret intravenøst.To uafhængige alternative grene (A, B) holdes adskilt indtil 4. udvælgelsesrunde.Til selektionsrunde 3 og 4 blev hver fagklon ekstraheret fra CSF sekventeret manuelt.(d) Kinetik af fag isoleret fra blod (røde cirkler) og cerebrospinalvæske (grønne trekanter) under den første selektionsrunde i to kanylerede rotter efter intravenøs injektion af T7-peptidbiblioteket (2 x 1012 fager/dyr).Blå firkanter angiver den gennemsnitlige initiale koncentration af fag i blodet, beregnet ud fra mængden af ​​injiceret fag, under hensyntagen til det samlede blodvolumen.De sorte firkanter angiver skæringspunktet for y-linjen ekstrapoleret fra fagkoncentrationer i blodet.(e,f) Præsenter den relative frekvens og fordeling af alle mulige overlappende tripeptidmotiver fundet i peptidet.Antallet af motiver fundet i 1000 aflæsninger er vist.Signifikant (p < 0,001) berigede motiver er markeret med røde prikker.(e) Korrelationsspredningsdiagram, der sammenligner den relative frekvens af tripeptidmotivet af det injicerede bibliotek med blod-afledte fag fra dyr #1.1 og #1.2.(f) Korrelationsspredningsdiagram, der sammenligner de relative frekvenser af dyrefag-tripeptidmotiver #1.1 og #1.2 isoleret i blod og cerebrospinalvæske.(g, h) Sekvens-ID-repræsentation af fag beriget i blod (g) versus injicerede biblioteker og fag beriget med CSF (h) versus blod efter en runde in vivo-selektion i begge dyr.Størrelsen af ​​koden på et bogstav angiver, hvor ofte den aminosyre forekommer i den position.Grøn = polær, lilla = neutral, blå = basisk, rød = sur og sort = hydrofobe aminosyrer.Figur 1a, b er designet og produceret af Eduard Urich.
Vi injicerede et fag-peptidbibliotek i to CM-instrumentrotter (klader A og B) og isolerede fag fra cerebrospinalvæske og blod (figur 1d).Den indledende hurtige clearance af biblioteket var mindre udtalt sammenlignet med vildtype-fagen.Den gennemsnitlige halveringstid af det injicerede bibliotek i begge dyr var 24,8 minutter i blod, svarende til vildtype-fager, og 38,5 minutter i CSF.Blod- og cerebrospinalvæskefagprøver fra hvert dyr blev udsat for HTS, og alle identificerede peptider blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​et kort tripeptidmotiv.Tripeptidmotiver blev valgt, fordi de giver et minimalt grundlag for strukturdannelse og peptid-protein-interaktioner14,15.Vi fandt en god korrelation i fordelingen af ​​motiver mellem det injicerede fagbibliotek og kloner ekstraheret fra blodet fra begge dyr (fig. 1e).Dataene indikerer, at sammensætningen af ​​biblioteket kun er marginalt beriget i blodrummet.Aminosyrefrekvenser og konsensussekvenser blev yderligere analyseret ved hver position ved hjælp af en tilpasning af Weblogo16-softwaren.Interessant nok fandt vi en stærk berigelse i blodglycinrester (fig. 1g).Når blod blev sammenlignet med kloner udvalgt fra CSF, blev der observeret stærk selektion og nogen fravalg af motiver (fig. 1f), og visse aminosyrer var fortrinsvis til stede i forudbestemte positioner i 12-leddet (fig. 1h).Det er bemærkelsesværdigt, at individuelle dyr afveg signifikant i cerebrospinalvæske, hvorimod blodglycinberigelse blev observeret i begge dyr (Supplerende Fig. 4a-j).Efter stringent filtrering af sekvensdata i cerebrospinalvæsken fra dyr #1.1 og #1.2 blev der opnået i alt 964 og 420 unikke 12-mer peptider (Supplerende Fig. 1d-e).De isolerede fagkloner blev amplificeret og underkastet en anden runde in vivo-selektion.Fager ekstraheret fra anden selektionsrunde blev udsat for HTS i hvert dyr, og alle identificerede peptider blev brugt som input til et motivgenkendelsesprogram til at analysere forekomsten af ​​tripeptidmotiver (fig. 2a, b, ef).Sammenlignet med den første cyklus af fagen udvundet fra CSF, observerede vi yderligere selektion og fravalg af mange motiver i CSF i grenene A og B (fig. 2).En netværksidentifikationsalgoritme blev anvendt til at bestemme, om de repræsenterede forskellige mønstre af ensartet sekvens.En klar lighed blev observeret mellem de 12-dimensionelle sekvenser udvundet af CSF i alternativ clade A (fig. 2c, d) og clade B (fig. 2g, h).Den samlede analyse i hver gren afslørede forskellige selektionsprofiler for 12-mer peptider (Supplerende Fig. 5c,d) og en stigning i CSF/blodtiterforholdet over tid for poolede kloner efter den anden selektionsrunde sammenlignet med den første selektionsrunde (Supplerende Fig. 5e).).
Berigelse af motiver og peptider i cerebrospinalvæske ved to på hinanden følgende runder af in vivo funktionel fag-display-selektion.
Alle cerebrospinalvæskefager udvundet fra den første runde af hvert dyr (dyr #1.1 og #1.2) blev poolet, amplificeret, HT-sekventeret og reinjiceret sammen (2 x 1010 fager/dyr) 2 SM-kanylerede rotter (#1.1 → #).2.1 og 2.2, 1.2 → 2.3 og 2.4).(a,b,e,f) Korrelationsspredningsplot, der sammenligner den relative frekvens af tripeptidmotiver af alle CSF-afledte fager i den første og anden selektionsrunde.Relativ frekvens og fordeling af motiver, der repræsenterer alle mulige overlappende tripeptider fundet i peptider i begge orienteringer.Antallet af motiver fundet i 1000 aflæsninger er vist.Motiver, der var signifikant (p < 0,001) udvalgt eller udelukket i et af de sammenlignede biblioteker, er fremhævet med røde prikker.(c, d, g, h) Sekvenslogo-repræsentation af alle CSF-rige 12 aminosyrer lange sekvenser baseret på runde 2 og 1 af in vivo-selektion.Størrelsen af ​​koden på et bogstav angiver, hvor ofte den aminosyre forekommer i den position.For at repræsentere logoet sammenlignes frekvensen af ​​CSF-sekvenser ekstraheret fra individuelle dyr mellem to selektionsrunder, og de berigede sekvenser i anden runde vises: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 og (h) #1.2–#2.4.De mest berigede aminosyrer i en given position i (c, d) dyr nr.2.1 og nr.2.2 eller (g, h) hos dyr nr.2.3 og nr.2.4 er vist i farver.Grøn = polær, lilla = neutral, blå = basisk, rød = sur og sort = hydrofobe aminosyrer.
Efter den tredje selektionsrunde identificerede vi 124 unikke peptidsekvenser (#3.1 og #3.2) fra 332 CSF-rekonstituerede fagkloner isoleret fra to dyr (Supplerende Fig. 6a).Sekvensen LGSVS (18,7%) havde den højeste relative andel, efterfulgt af vildtype-insertene PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) og SARGSWREIVSLS (2,2%).I den sidste fjerde runde samlede vi to uafhængigt udvalgte grene fra tre separate dyr (fig. 1c).Af de 925 sekventerede fagkloner, der blev udvundet fra CSF, fandt vi i fjerde runde 64 unikke peptidsekvenser (Supplerende Fig. 6b), blandt hvilke den relative andel af vildtype-fag faldt til 0,8%.De mest almindelige CSF-kloner i fjerde runde var LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) og RLSSVDSDLSGC (3,2%).%)).Længdeintervallet for de udvalgte peptider skyldes nukleotidinsertioner/deletioner eller for tidlige stopkodoner i biblioteksprimerne ved anvendelse af degenererede kodoner til NNK-biblioteksdesign.For tidlige stopkodoner genererer kortere peptider og udvælges, fordi de indeholder det gunstige aa-motiv.Længere peptider kan skyldes insertioner/deletioner i de syntetiske bibliotekers primere.Dette placerer det designede stopkodon uden for rammen og læser det, indtil et nyt stopkodon dukker op nedstrøms.Generelt beregnede vi berigelsesfaktorer for alle fire udvælgelsesrunder ved at sammenligne inputdataene med prøveoutputdataene.Til den første runde af screening brugte vi vildtype fagtitre som en ikke-specifik baggrundsreference.Interessant nok var negativ fagudvælgelse meget stærk i den første CSF-cyklus, men ikke i blod (fig. 3a), hvilket kan skyldes den lave sandsynlighed for passiv diffusion af de fleste medlemmer af peptidbiblioteket ind i CSF-kompartmentet eller relative fager har tendens til at blive mere effektivt tilbageholdt eller fjernet fra blodbanen end bakteriofager.I den anden runde af panorering blev der imidlertid observeret stærk selektion af fager i CSF i begge klader, hvilket tyder på, at den foregående runde var beriget med fager, der udviser peptider, der fremmer CSF-optagelse (fig. 3a).Igen uden væsentlig blodberigelse.Også i den tredje og fjerde runde blev fagklonerne signifikant beriget i CSF.Ved at sammenligne den relative frekvens af hver unik peptidsekvens mellem de sidste to selektionsrunder fandt vi, at sekvenserne var endnu mere beriget i den fjerde selektionsrunde (fig. 3b).I alt 931 tripeptidmotiver blev ekstraheret fra alle 64 unikke peptidsekvenser under anvendelse af begge peptidorienteringer.De mest berigede motiver i den fjerde runde blev nærmere undersøgt for deres berigelsesprofiler på tværs af alle runder sammenlignet med det injicerede bibliotek (cut-off: 10 % berigelse) (Supplerende Fig. 6c).Generelle udvælgelsesmønstre viste, at de fleste af de undersøgte motiver blev beriget i alle tidligere runder af begge udvælgelsesgrene.Nogle motiver (f.eks. SGL, VSG, LGS GSV) var dog overvejende fra alternativ klade A, mens andre (f.eks. FGW, RTN, WGF, NTR) blev beriget med alternativ klade B.
Validering af CSF-transport af CSF-berigede fag-fremviste peptider og biotinylerede lederpeptider konjugeret til streptavidin-nyttelast.
(a) Berigelsesforhold beregnet i alle fire runder (R1-R4) baseret på injicerede (input = I) fag-titere (PFU) og bestemte CSF-fagtitere (output = O).Berigelsesfaktorer for de sidste tre runder (R2-R4) blev beregnet ved sammenligning med den foregående runde og den første runde (R1) med vægtdata.Åbne søjler er cerebrospinalvæske, skraverede søjler er plasma.(***p<0,001, baseret på Elevens t-test).(b) Liste over de mest udbredte fagpeptider, rangeret i henhold til deres relative forhold til alle fager indsamlet i CSF efter runde 4 af selektion.De seks mest almindelige fagkloner er fremhævet i farve, nummereret og deres berigelsesfaktorer mellem runde 3 og 4 af selektion (indskud).(c,d) De seks mest berigede fagkloner, tomme fag- og forældrefagpeptidbiblioteker fra runde 4 blev analyseret individuelt i en CSF-prøveudtagningsmodel.CSF og blodprøver blev indsamlet på de angivne tidspunkter.(c) Lige mængder af 6 kandidat-fag-kloner (2 x 1010 fager/dyr), tomme fager (#1779) (2 x 1010 fager/dyr) og stam-fag-peptidbiblioteker (2 x 1012 fager/dyr) Injicer mindst 3 CM adskilte CM indgivet i en haledyrsdåse.CSF-farmakokinetikken for hver injiceret fagklon og fagpeptidbibliotek over tid er vist.(d) viser det gennemsnitlige CSF/blod-forhold for alle genvundne fager/ml over prøvetagningstiden.(e) Fire syntetiske lederpeptider og en forvrænget kontrol blev forbundet med biotin til streptavidin gennem deres N-terminal (tetramer-display) efterfulgt af injektion (halevene iv, 10 mg streptavidin/kg).Mindst tre intuberede rotter (N = 3).).CSF-prøver blev indsamlet på de angivne tidspunkter, og streptavidinkoncentrationer blev målt ved CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ikke påvist).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, baseret på ANOVA-test).(f) Sammenligning af aminosyresekvensen af ​​den mest berigede fagpeptidklon #2002 (lilla) med andre udvalgte fagpeptidkloner fra 4. selektionsrunde.Identiske og lignende aminosyrefragmenter er farvekodede.
Af alle berigede fager i den fjerde runde (fig. 3b) blev seks kandidatkloner udvalgt til yderligere individuel analyse i CSF-prøveudtagningsmodellen.Lige mængder af seks kandidatfag-, tomme fag- (ingen indsættelse) og profagpeptidbiblioteker blev injiceret i tre kanylerede CM-dyr, og farmakokinetik blev bestemt i CSF (fig. 3c) og blod (supplerende fig. 7) assays.Alle testede fagkloner målrettede CSF-kompartmentet på et niveau, der var 10-1000 gange højere end niveauet for den tomme kontrolfag (#1779).For eksempel havde kloner #2020 og #2077 ca. 1000 gange højere CSF-titre end kontrolfag.Den farmakokinetiske profil af hvert udvalgt peptid er forskellig, men alle har en høj CSF-målsøgningsevne.Vi observerede et konstant fald over tid for klonerne #1903 og #2011, mens for klonerne #2077, #2002 og #2009 en stigning i løbet af de første 10 minutter kan indikere aktiv transport, men skal verificeres.Kloner #2020, #2002 og #2077 stabiliserede sig på høje niveauer, mens CSF-koncentrationen af ​​klon #2009 langsomt faldt efter den første stigning.Vi sammenlignede derefter den relative frekvens af hver CSF-kandidat med dens blodkoncentration (fig. 3d).Korrelationen af ​​den gennemsnitlige titer for hver CSF-kandidat med dens blodtiter på alle prøveudtagningstidspunkter viste, at tre af de seks kandidater var signifikant beriget i blod-CSF.Interessant nok viste klon #2077 højere blodstabilitet (supplerende figur 7).For at bekræfte, at peptiderne selv er i stand til aktivt at transportere anden last end fagpartikler ind i CSF-rummet, syntetiserede vi fire lederpeptider derivatiseret med biotin i N-terminalen, hvor peptiderne binder sig til fagpartiklen.Biotinylerede peptider (nr. 2002, 2009, 2020 og 2077) blev konjugeret med streptavidin (SA) for at opnå multimere former, der i nogen grad efterligner faggeometri.Dette format gjorde det også muligt for os at måle SA-eksponering i blod og cerebrospinalvæske som lasttransporterende proteinpeptider.Det er vigtigt, at fagdata ofte kunne reproduceres, når syntetiske peptider blev administreret i dette SA-konjugerede format (fig. 3e).De scramblede peptider havde mindre initial eksponering og hurtigere CSF-clearance med upåviselige niveauer inden for 48 timer.For at få indsigt i leveringsvejene for disse peptidfagkloner i CSF-rummet analyserede vi lokaliseringen af ​​individuelle fagpeptidhits ved hjælp af immunhistokemi (IHC) til direkte at detektere fagpartikler 1 time efter intravenøs injektion in vivo.Især kunne klon #2002, #2077 og #2009 påvises ved kraftig farvning i hjernekapillærer, mens kontrolfag (#1779) og klon #2020 ikke blev påvist (Supplerende figur 8).Dette tyder på, at disse peptider bidrager til effekten på hjernen netop ved at krydse BBB.Yderligere detaljeret analyse er påkrævet for at teste denne hypotese, da BSCFB-ruten også kan være involveret.Ved sammenligning af aminosyresekvensen for den mest berigede klon (#2002) med andre udvalgte peptider, blev det bemærket, at nogle af dem har lignende aminosyreforlængelser, hvilket kan indikere en lignende transportmekanisme (fig. 3f).
På grund af dens unikke plasmaprofil og signifikante stigning i CSF over tid, blev fagdisplayklon #2077 yderligere udforsket over en længere 48-timers periode og var i stand til at reproducere den hurtige stigning i CSF observeret i forbindelse med vedvarende SA-niveauer (fig. 4a).Med hensyn til andre identificerede fagkloner farvede #2077 kraftigt for hjernekapillærer og viste signifikant kolokalisering med kapillarmarkørlektin, når det blev set i højere opløsning og muligvis en vis farvning i det parenkymale rum (figur 4b).For at undersøge om peptid-medierede farmakologiske effekter kunne opnås i CNS, udførte vi et eksperiment, hvor biotinylerede versioner af i) #2077 transitpeptidet og ii) BACE1-hæmmerpeptidet blev blandet med SA i to forskellige forhold.Til en kombination brugte vi kun BACE1 peptidhæmmeren og til den anden brugte vi et 1:3 forhold mellem BACE1 peptidhæmmer og #2077 peptid.Begge prøver blev administreret intravenøst, og blod- og cerebrospinalvæskeniveauer af beta-amyloid peptid 40 (Abeta40) blev målt over tid.Abeta40 blev målt i CSF, da det afspejler BACE1-hæmning i hjerneparenkymet.Som forventet reducerede begge komplekser signifikant blodniveauer af Abeta40 (fig. 4c, d).Det er dog kun prøver, der indeholder en blanding af peptid nr.2077 og en inhibitor af BACE1-peptidet konjugeret til SA forårsagede et signifikant fald i Abeta40 i cerebrospinalvæsken (fig. 4c).Dataene viser, at peptidnr.2077 er i stand til at transportere SA-proteinet på 60 kDa ind i CNS og inducerer også farmakologiske effekter med SA-konjugerede inhibitorer af BACE1-peptidet.
(a) Klonal injektion (2 × 10 fager/dyr) af T7-fag, der viser langtidsfarmakokinetiske profiler af CSF-peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) og uinjiceret kontrolfag (#1779) i mindst tre CM-intuberede rotter.(b) Konfokalt mikroskopisk billede af repræsentative kortikale mikrokar i fag-injicerede rotter (2 × 1010 fager/dyr), der viser modfarvning af peptid #2077 og kar (lectin).Disse fagkloner blev administreret til 3 rotter og fik lov til at cirkulere i 1 time før perfusion.Hjerner blev sektioneret og farvet med polyklonale FITC-mærkede antistoffer mod T7-fag-capsidet.Ti minutter før perfusion og efterfølgende fiksering blev DyLight594-mærket lektin administreret intravenøst.Fluorescerende billeder, der viser lektinfarvning (rød) af den luminale side af mikrokar og fager (grøn) i lumen af ​​kapillærer og perivaskulært hjernevæv.Skalabjælken svarer til 10 µm.(c, d) Biotinyleret BACE1-hæmmende peptid alene eller i kombination med biotinyleret transitpeptid #2077 blev koblet til streptavidin efterfulgt af intravenøs injektion af mindst tre kanylerede CM-rotter (10 mg streptavidin/kg).BACE1 peptidhæmmer-medieret reduktion i Aβ40 blev målt ved Aβ1-40 ELISA i blod (rød) og cerebrospinalvæske (orange) på de angivne tidspunkter.For bedre klarhed tegnes en stiplet linje på grafen i en skala på 100%.(c) Procentvis reduktion i Aβ40 i blod (røde trekanter) og cerebrospinalvæske (orange trekanter) hos rotter behandlet med streptavidin konjugeret til transitpeptid #2077 og BACE1-hæmmende peptid i et 3:1-forhold.(d) Procentvis reduktion i blod Aβ40 (røde cirkler) og cerebrospinalvæske (orange cirkler) hos rotter behandlet med streptavidin kun koblet til et BACE1-hæmmende peptid.Ap-koncentrationen i kontrollen var 420 pg/ml (standardafvigelse = 101 pg/ml).
Fagdisplay er blevet anvendt med succes inden for flere områder af biomedicinsk forskning17.Denne metode er blevet brugt til in vivo vaskulære diversitetsundersøgelser18,19 samt undersøgelser rettet mod cerebrale kar20,21,22,23,24,25,26.I denne undersøgelse udvidede vi anvendelsen af ​​denne selektionsmetode ikke kun til direkte identifikation af peptider rettet mod cerebrale kar, men også til opdagelsen af ​​kandidater med aktive transportegenskaber til at krydse blod-hjerne-barrieren.Vi beskriver nu udviklingen af ​​en in vivo-selektionsprocedure i CM-intuberede rotter og demonstrerer dens potentiale til at identificere peptider med CSF-hosingegenskaber.Ved at bruge T7-fagen, der udviser et bibliotek af 12-mer tilfældige peptider, var vi i stand til at demonstrere, at T7-fagen er lille nok (ca. 60 nm i diameter)10 til at blive tilpasset til blod-hjerne-barrieren og derved direkte krydse blod-hjerne-barrieren eller choroid plexus.Vi observerede, at CSF-høstning fra kanylerede CM-rotter var en velkontrolleret in vivo-funktionel screeningsmetode, og at den ekstraherede fag ikke kun bandt til vaskulaturen, men også fungerede som en transportør over blod-hjerne-barrieren.Ved samtidig at indsamle blod og påføre HTS til CSF og blodafledte fager bekræftede vi desuden, at vores valg af CSF ikke var påvirket af blodberigelse eller egnethed til ekspansion mellem udvælgelsesrunder.Blodkammeret er dog en del af udvælgelsesproceduren, da fager, der er i stand til at nå CSF-rummet, skal overleve og cirkulere i blodbanen længe nok til at berige sig selv i hjernen.For at udtrække pålidelig sekvensinformation fra rå HTS-data implementerede vi filtre tilpasset platformspecifikke sekventeringsfejl i analyseworkflowet.Ved at inkorporere kinetiske parametre i screeningsmetoden bekræftede vi den hurtige farmakokinetik af vildtype T7-fager (t½ ~ 28 min) i blod24, 27, 28 og bestemte også deres halveringstid i cerebrospinalvæske (t½ ~ 26 min) pr. minut).På trods af lignende farmakokinetiske profiler i blod og CSF, kunne kun 0,001% af blodkoncentrationen af ​​fag påvises i CSF, hvilket indikerer lav baggrundsmobilitet af vildtype T7-fag over blod-hjerne-barrieren.Dette arbejde fremhæver vigtigheden af ​​den første selektionsrunde ved brug af in vivo panoreringsstrategier, især for fagsystemer, der hurtigt fjernes fra cirkulationen, da få kloner er i stand til at nå CNS-rummet.I første runde var reduktionen i biblioteksdiversitet således meget stor, da kun et begrænset antal kloner til sidst blev indsamlet i denne meget strenge CSF-model.Denne in vivo panoreringsstrategi omfattede adskillige selektionstrin, såsom aktiv akkumulering i CSF-rummet, klonoverlevelse i blodrummet og hurtig fjernelse af T7-fagkloner fra blodet inden for de første 10 minutter (fig. 1d og supplerende fig. 4M).).Efter den første runde blev forskellige fagkloner således identificeret i CSF, selvom den samme indledende pulje blev brugt til individuelle dyr.Dette tyder på, at flere strenge udvælgelsestrin for kildebiblioteker med et stort antal biblioteksmedlemmer resulterer i en betydelig reduktion i diversitet.Derfor vil tilfældige begivenheder blive en integreret del af den indledende udvælgelsesproces, hvilket har stor indflydelse på resultatet.Det er sandsynligt, at mange af klonerne i det originale bibliotek havde en meget lignende CSF-berigelsestilbøjelighed.Selv under de samme eksperimentelle betingelser kan selektionsresultaterne dog variere på grund af det lille antal af hver bestemt klon i den indledende pulje.
Motiverne beriget med CSF adskiller sig fra dem i blodet.Interessant nok bemærkede vi det første skift mod glycin-rige peptider i blodet fra individuelle dyr.(Fig. lg, Supplerende Fig. 4e, 4f).Fag indeholdende glycinpeptider kan være mere stabile og mindre tilbøjelige til at blive taget ud af cirkulation.Imidlertid blev disse glycinrige peptider ikke påvist i cerebrospinalvæskeprøverne, hvilket tyder på, at de kurerede biblioteker gik igennem to forskellige udvælgelsestrin: et i blodet og et andet fik lov til at akkumulere i cerebrospinalvæsken.CSF-berigede kloner fra den fjerde selektionsrunde er blevet grundigt testet.Næsten alle de individuelt testede kloner blev bekræftet til at være beriget med CSF sammenlignet med blank kontrolfag.Et peptidhit (#2077) blev undersøgt mere detaljeret.Det viste en længere plasmahalveringstid sammenlignet med andre hits (figur 3d og supplerende figur 7), og interessant nok indeholdt dette peptid en cysteinrest ved C-terminalen.Det er for nylig blevet vist, at tilsætning af cystein til peptider kan forbedre deres farmakokinetiske egenskaber ved at binde til albumin 29 .Dette er i øjeblikket ukendt for peptid #2077 og kræver yderligere undersøgelse.Nogle peptider viste en valensafhængighed i CSF-berigelse (data ikke vist), som kan være relateret til den viste overfladegeometri af T7-capsidet.T7-systemet, vi brugte, viste 5-15 kopier af hvert peptid pr. fagpartikel.IHC blev udført på kandidat blyfag-kloner injiceret intravenøst ​​i hjernebarken hos rotter (Supplerende Fig. 8).Dataene viste, at mindst tre kloner (nr. 2002, nr. 2009 og nr. 2077) interagerede med BBB.Det skal stadig bestemmes, om denne BBB-interaktion resulterer i akkumulering af CSF eller bevægelse af disse kloner direkte til BCSFB.Det er vigtigt, at vi viser, at de udvalgte peptider bevarer deres CSF-transportkapacitet, når de syntetiseres og bindes til proteinlasten.Binding af N-terminale biotinylerede peptider til SA gentager i det væsentlige resultaterne opnået med deres respektive fagkloner i blod og cerebrospinalvæske (fig. 3e).Endelig viser vi, at ledende peptid #2077 er i stand til at fremme hjernevirkningen af ​​en biotinyleret peptidhæmmer af BACE1 konjugeret til SA, hvilket forårsager udtalte farmakodynamiske effekter i CNS ved signifikant at reducere Abeta40-niveauer i CSF (fig. 4).Vi var ikke i stand til at identificere nogen homologer i databasen ved at udføre en peptidsekvenshomologisøgning af alle hits.Det er vigtigt at bemærke, at størrelsen af ​​T7-biblioteket er ca. 109, mens den teoretiske biblioteksstørrelse for 12-merer er 4 x 1015. Derfor har vi kun udvalgt en lille del af diversitetsrummet i 12-mer-peptidbiblioteket, hvilket kan betyde, at mere optimerede peptider kan identificeres ved at identificere de tilstødende sekvenser af disse tilstødende sekvenser.Hypotetisk kan en af ​​grundene til, at vi ikke har fundet nogen naturlige homologer af disse peptider, være fravalg under evolution for at forhindre ukontrolleret indtrængen af ​​visse peptidmotiver i hjernen.
Samlet giver vores resultater grundlag for fremtidigt arbejde med at identificere og karakterisere transportsystemerne af den cerebrovaskulære barriere in vivo mere detaljeret.Den grundlæggende opsætning af denne metode er baseret på en funktionel selektionsstrategi, der ikke kun identificerer kloner med cerebrale vaskulære bindingsegenskaber, men også inkluderer et kritisk trin, hvor vellykkede kloner har iboende aktivitet til at krydse biologiske barrierer in vivo ind i CNS-rummet.er at belyse transportmekanismen for disse peptider og deres præference for binding til den mikrovaskulatur, der er specifik for hjerneregionen.Dette kan føre til opdagelsen af ​​nye veje til transport af BBB og receptorer.Vi forventer, at de identificerede peptider direkte kan binde til cerebrovaskulære receptorer eller til cirkulerende ligander, der transporteres gennem BBB eller BCSFB.Peptidvektorerne med CSF-transportaktivitet opdaget i dette arbejde vil blive yderligere undersøgt.Vi er i øjeblikket ved at undersøge disse peptiders hjernespecificitet for deres evne til at krydse BBB og/eller BCSFB.Disse nye peptider vil være ekstremt værdifulde værktøjer til den potentielle opdagelse af nye receptorer eller veje og til udviklingen af ​​nye højeffektive platforme til levering af makromolekyler, såsom biologiske stoffer, til hjernen.
Kanyler den store cisterne (CM) ved hjælp af en modifikation af den tidligere beskrevne metode.Bedøvede Wistar-rotter (200-350 g) blev monteret på et stereotaksisk apparat, og et mediansnit blev lavet over den barberede og aseptisk forberedte hovedbund for at blotlægge kraniet.Bor to huller i området af den øverste ramme og fastgør fastgørelsesskruerne i hullerne.Et yderligere hul blev boret i den laterale occipitale kam til stereotaktisk føring af en kanyle af rustfrit stål ind i CM.Påfør dental cement rundt om kanylen og fastgør med skruer.Efter fotohærdning og cementhærdning blev hudsåret lukket med 4/0 supramidsutur.Korrekt placering af kanylen bekræftes af spontan lækage af cerebrospinalvæske (CSF).Fjern rotten fra det stereotaksiske apparat, modtag passende postoperativ pleje og smertebehandling, og lad den komme sig i mindst en uge, indtil der observeres tegn på blod i cerebrospinalvæsken.Wistar-rotter (Crl:WI/Han) blev opnået fra Charles River (Frankrig).Alle rotter blev holdt under specifikke patogenfrie betingelser.Alle dyreforsøg blev godkendt af veterinærkontoret i byen Basel, Schweiz, og blev udført i overensstemmelse med dyrelicens nr. 2474 (vurdering af aktiv hjernetransport ved at måle niveauer af terapeutiske kandidater i cerebrospinalvæsken og rottehjerne).
Hold forsigtigt rotten ved bevidsthed med CM-kanylen i hånden.Fjern Datura fra kanylen og opsaml 10 µl spontant strømmende cerebrospinalvæske.Da kanylens åbenhed i sidste ende blev kompromitteret, blev kun prøver af klare cerebrospinalvæske uden tegn på blodkontaminering eller misfarvning inkluderet i denne undersøgelse.Parallelt hermed blev ca. 10-20 μl blod taget fra et lille snit ved halespidsen i rør med heparin (Sigma-Aldrich).CSF og blod blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter intravenøs injektion af T7-fag.Ca. 5-10 μl væske blev kasseret, før hver CSF-prøve blev opsamlet, hvilket svarer til kateterets døde volumen.
Biblioteker blev genereret under anvendelse af T7Select 10-3b vektoren som beskrevet i T7Select systemmanualen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Kort fortalt blev et tilfældigt 12-mer DNA-insert syntetiseret i følgende format:
NNK-kodonet blev brugt til at undgå dobbeltstopkodoner og aminosyreoverekspression i insertet.N er et manuelt blandet ækvimolært forhold af hvert nukleotid, og K er et manuelt blandet ækvimolært forhold mellem adenin og cytosin nukleotider.Enkeltstrengede regioner blev omdannet til dobbeltstrenget DNA ved yderligere inkubation med dNTP (Novagen) og Klenow-enzym (New England Biolabs) i Klenow-buffer (New England Biolabs) i 3 timer ved 37°C.Efter reaktionen blev dobbeltstrenget DNA udvundet ved EtOH-fældning.Det resulterende DNA blev fordøjet med restriktionsenzymer EcoRI og HindIII (begge fra Roche).Det spaltede og oprensede (QIAquick, Qiagen) insert (T4-ligase, New England Biolabs) blev derefter ligeret in-frame ind i en præ-spaltet T7 vektor efter aminosyre 348 af 10B capsid-genet.Ligeringsreaktioner blev inkuberet ved 16°C i 18 timer før in vitro-pakning.Fagpakning in vitro blev udført i overensstemmelse med instruktionerne leveret med T7Select 10-3b kloningskittet (Novagen), og pakningsopløsningen blev amplificeret én gang til lysis under anvendelse af Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lysaterne blev centrifugeret, titreret og frosset ved -80°C som en stamopløsning af glycerol.
Direkte PCR-amplifikation af fagvariable regioner amplificeret i bouillon eller plade ved hjælp af proprietære 454/Roche-amplicon-fusionsprimere.Den fremadgående fusionsprimer indeholder sekvenser, der flankerer den variable region (NNK) 12 (skabelonspecifik), GS FLX Titanium Adapter A og en fire-baser biblioteksnøglesekvens (TCAG) (Supplerende figur 1a):
Den omvendte fusionsprimer indeholder også biotin knyttet til capture perler og GS FLX Titanium Adapter B, der kræves til klonal amplifikation under emulsions-PCR:
Amplikonerne blev derefter udsat for 454/Roche pyrosequencing i henhold til 454 GS-FLX Titanium-protokollen.Til manuel Sanger-sekventering (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) blev T7-fag-DNA amplificeret ved PCR og sekventeret med følgende primerpar:
Inserts fra individuelle plaques blev udsat for PCR-amplifikation under anvendelse af Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (i henhold til producentens instruktioner).Udfør en varm start (10 min ved 95 °C) og 35 boost-cyklusser (50 s ved 95 °C, 1 min ved 50 °C og 1 min ved 72 °C).
Fager fra biblioteker, vildtype-fager, fag reddet fra CSF og blod eller individuelle kloner blev amplificeret i Escherichia coli BL5615 i TB-bouillon (Sigma Aldrich) eller i 500 cm2 skåle (Thermo Scientific) i 4 timer ved 37°C.Fager blev ekstraheret fra pladerne ved at skylle pladerne med Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) eller ved at opsamle pladerne med sterile pipettespidser.Fager blev isoleret fra kultursupernatant eller ekstraktionsbuffer med én runde polyethylenglycol (PEG 8000) præcipitation (Promega) og resuspenderet i Tris-EDTA-buffer.
Den amplificerede fag blev udsat for 2-3 runder af endotoksinfjernelse under anvendelse af endotoksinfjernelsesperler (Miltenyi Biotec) før intravenøs (IV) injektion (500 μl/dyr).I første runde blev 2×1012 fager introduceret;i den anden, 2×1010 fager;i tredje og fjerde udvælgelsesrunde, 2×109 fager pr. dyr.Fagindhold i CSF og blodprøver indsamlet på de angivne tidspunkter blev bestemt ved plaktælling i henhold til producentens instruktioner (T7Select-systemmanual).Fagselektion blev udført ved intravenøs injektion af oprensede biblioteker i halevenen eller ved geninjektion af fag ekstraheret fra CSF fra den foregående selektionsrunde, og efterfølgende høst blev udført efter henholdsvis 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min og 240 min blodprøver.I alt fire runder in vivo panorering blev udført, hvor de to udvalgte grene blev separat opbevaret og analyseret under de første tre udvælgelsesrunder.Alle fag-inserts ekstraheret fra CSF fra de første to selektionsrunder blev udsat for 454/Roche pyrosequencing, mens alle kloner ekstraheret fra CSF fra de sidste to selektionsrunder blev manuelt sekventeret.Alle blodfager fra den første selektionsrunde blev også udsat for 454/Roche pyrosequencing.Til injektion af fagkloner blev udvalgte fager amplificeret i E. coli (BL5615) på 500 cm2 plader ved 37°C i 4 timer.Individuelt selekterede og manuelt sekventerede kloner blev opformeret i TB-medium.Efter fagekstraktion, oprensning og fjernelse af endotoksin (som beskrevet ovenfor), blev 2×1010 fager/dyr i 300 μl injiceret intravenøst ​​i en halevene.
Forbehandling og kvalitativ filtrering af sekvensdata.Rå 454/Roche data blev konverteret fra et binært standard stream map format (sff) til et Pearson human readable format (fasta) ved hjælp af leverandørsoftware.Yderligere behandling af nukleotidsekvensen blev udført under anvendelse af proprietære C-programmer og scripts (ufrigivet softwarepakke) som beskrevet nedenfor.Analysen af ​​primære data omfatter strenge flertrinsfiltreringsprocedurer.For at frafiltrere læsninger, der ikke indeholdt en gyldig 12mer insert DNA-sekvens, blev læsningerne sekventielt justeret til startmærke (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stopmærke (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) og baggrundsindsættelse (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ved hjælp af den globale test Needleman-Wunsch.justering, der tillader op til 2 uoverensstemmelser pr. justering31.Derfor blev læsninger uden start- og stop-tags og læsninger indeholdende baggrundsindsættelser, dvs. justeringer, der overstiger det tilladte antal uoverensstemmelser, fjernet fra biblioteket.Hvad angår de resterende aflæsninger, blev N-mer-DNA-sekvensen, der strækker sig fra startmærket og slutter før stopmærket, udskåret fra den oprindelige læsesekvens og viderebehandlet (herefter benævnt "indsæt").Efter translation af insertet fjernes delen efter det første stopkodon ved 5'-enden af ​​primeren fra insertet.Derudover blev nukleotider, der fører til ufuldstændige kodoner ved 3'-enden af ​​primeren, også fjernet.For at udelukke inserts, der kun indeholdt baggrundssekvenser, blev translaterede inserts, der begyndte med aminosyremønsteret "PAG", også fjernet.Peptider med en post-translationel længde på mindre end 3 aminosyrer blev fjernet fra biblioteket.Til sidst skal du fjerne redundans i indsatspuljen og bestemme frekvensen af ​​hvert unikt indlæg.Resultaterne af denne analyse inkluderede en liste over nukleotidsekvenser (inserts) og deres (læse) frekvenser (Supplerende figurer 1c og 2).
Gruppér N-mer DNA-inserts efter sekvenslighed: For at eliminere 454/Roche-specifikke sekventeringsfejl (såsom problemer med sekventering af homopolymerudvidelser) og fjerne mindre vigtige redundanser, sorteres tidligere filtrerede N-mer DNA-sekvensinserts (inserts) efter lighed.indsættelser (op til 2 ikke-matchende baser tilladt) ved hjælp af en iterativ algoritme defineret som følger: indsættelser sorteres først efter deres frekvens (højeste til laveste), og hvis de er ens, efter deres sekundære sortering efter længde (længst til kortest) ).De hyppigste og længste indsættelser definerer således den første "gruppe".Gruppefrekvensen indstilles til nøglefrekvensen.Derefter blev hver indsættelse, der var tilbage i den sorterede liste, forsøgt tilføjet til gruppen ved parvis Needleman-Wunsch-justering.Hvis antallet af mismatches, insertioner eller deletioner i en alignment ikke overstiger en tærskel på 2, tilføjes en insertion til gruppen, og den samlede gruppefrekvens øges med, hvor ofte insertionen blev tilføjet.Indsæt, der tilføjes til en gruppe, markeres som brugte og udelukkes fra videre behandling.Hvis indsættelsessekvensen ikke kan tilføjes til en allerede eksisterende gruppe, bruges indsætningssekvensen til at oprette en ny gruppe med den passende indsættelsesfrekvens og markeres som brugt.Iterationen slutter, når hver indsættelsessekvens enten er blevet brugt til at danne en ny gruppe eller kan indgå i en allerede eksisterende gruppe.Grupperede inserts bestående af nukleotider bliver trods alt til sidst oversat til peptidsekvenser (peptidbiblioteker).Resultatet af denne analyse er et sæt af indsættelser og deres tilsvarende frekvenser, der udgør antallet af på hinanden følgende aflæsninger (Supplerende Fig. 2).
Motivgenerering: Baseret på en liste over unikke peptider blev der oprettet et bibliotek indeholdende alle mulige aminosyremønstre (aa) som vist nedenfor.Hvert muligt mønster med længde 3 blev ekstraheret fra peptidet, og dets omvendte mønster blev tilføjet sammen med et fælles motivbibliotek indeholdende alle mønstre (tripeptider).Biblioteker med meget gentagne motiver blev sekventeret og redundans fjernet.Derefter kontrollerede vi for hvert tripeptid i motivbiblioteket for dets tilstedeværelse i biblioteket ved hjælp af beregningsværktøjer.I dette tilfælde tilføjes frekvensen af ​​peptidet, der indeholder det fundne motivtripeptid, og tildeles motivet i motivbiblioteket ("antal motiver").Resultatet af motivgenerering er et todimensionelt array, der indeholder alle forekomster af tripeptider (motiver) og deres respektive værdier, som er antallet af sekventeringslæsninger, der resulterer i det tilsvarende motiv, når læsningerne filtreres, grupperes og oversættes.Metrics som beskrevet i detaljer ovenfor.
Normalisering af antallet af motiver og tilsvarende scatterplot: Antallet af motiver for hver prøve blev normaliseret vha.
hvor ni er antallet af læsninger, der indeholder emne i.Vi repræsenterer således den procentvise frekvens af aflæsninger (eller peptider), der indeholder motiv i i prøven.P-værdier for det ikke-normaliserede antal motiver blev beregnet ved hjælp af Fishers eksakte test.Med hensyn til korrelogrammer af antallet af motiver, blev Spearmans korrelationer beregnet ved hjælp af det normaliserede antal motiver med R.
For at visualisere indholdet af aminosyrer på hver position i peptidbiblioteket blev weblogogrammer 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) oprettet.Først opbevares indholdet af aminosyrer i hver position af 12-mer peptidet i en 20×12 matrix.Derefter genereres et sæt på 1000 peptider indeholdende det samme relative aminosyreindhold i hver position i fasta-sekvensformat og leveres som input til web-logo 3, som genererer en grafisk repræsentation af det relative aminosyreindhold i hver position.for et givet peptidbibliotek.For at visualisere multidimensionelle datasæt blev varmekort oprettet ved hjælp af et internt udviklet værktøj i R (biosHeatmap, en R-pakke, der endnu ikke er frigivet).Dendrogrammerne præsenteret i varmekortene blev beregnet ved hjælp af Wards hierarkiske klyngemetode med den euklidiske afstandsmetrik.Til statistisk analyse af motivscoringsdata blev P-værdier for unormaliseret scoring beregnet ved hjælp af Fishers eksakte test.P-værdier for andre datasæt blev beregnet i R ved hjælp af Students t-test eller ANOVA.
Udvalgte fagkloner og fager uden insert blev injiceret intravenøst ​​via halevenen (2×1010 fager/dyr i 300 μl PBS).Ti minutter før perfusion og efterfølgende fiksering blev de samme dyr injiceret intravenøst ​​med 100 μl DyLight594-mærket lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutter efter faginjektion blev rotter perfunderet gennem hjertet med 50 ml PBS efterfulgt af 50 ml 4% PFA/PBS.Hjerneprøver blev yderligere fikseret natten over i 4% PFA/PBS og gennemblødt i 30% saccharose natten over ved 4°C.Prøver lynfryses i OCT-blandingen.Immunhistokemisk analyse af frosne prøver blev udført ved stuetemperatur på 30 µm kryosnit blokeret med 1% BSA og inkuberet med polyklonale FITC-mærkede antistoffer mod T7-fag (Novus NB 600-376A) ved 4 °C.Inkuber natten over.Til sidst blev snittene vasket 3 gange med PBS og undersøgt med et konfokalt lasermikroskop (Leica TCS SP5).
Alle peptider med en minimumsrenhed på 98 % blev syntetiseret af GenScript USA, biotinyleret og lyofiliseret.Biotin er bundet via en yderligere tripel glycin spacer ved N-terminalen.Tjek alle peptider ved hjælp af massespektrometri.
Streptavidin (Sigma S0677) blev blandet med et 5-fold ækvimolært overskud af biotinyleret peptid, biotinyleret BACE1-hæmmende peptid eller en kombination (3:1-forhold) af biotinyleret BACE1-hæmmende peptid og BACE1-hæmmende peptid i DMSOBS/10 %-kuberet peptid.1 time ved stuetemperatur før injektion.Streptavidin-konjugerede peptider blev injiceret intravenøst ​​i en dosis på 10 mg/kg i en af ​​halevenerne på rotter med en cerebral kavitet.
Koncentrationen af ​​streptavidin-peptidkomplekser blev vurderet ved ELISA.Nunc Maxisorp mikrotiterplader (Sigma) blev coatet natten over ved 4°C med 1,5 μg/ml muse-anti-streptavidin-antistof (Thermo, MA1-20011).Efter blokering (blokeringsbuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatine, 1 % BSA) ved stuetemperatur i 2 timer vaskes pladen med 0,05 % Tween-20/PBS (vaskebuffer) i 3 sekunder, CSF og plasma-bufferprøver 0ma blev tilsat CSF, 0ma og plasma fortyndet 0ma-prøver (0ma) SF 1:115).Pladen blev derefter inkuberet natten over ved 4°C med detektionsantistof (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Efter tre vasketrin blev streptavidin påvist ved inkubation i TMB-substratopløsning (Roche) i op til 20 minutter.Efter at have stoppet farveudviklingen med 1M H2SO4 måles absorbansen ved 450 nm.
Funktionen af ​​streptavidin-peptid-BACE1-inhibitorkomplekset blev vurderet ved Aβ(1-40) ELISA ifølge producentens protokol (Wako, 294-64701).Kort fortalt blev CSF-prøver fortyndet i standardfortyndingsmiddel (1:23) og inkuberet natten over ved 4°C i 96-brøndsplader coatet med BNT77-indfangningsantistof.Efter fem vasketrin blev HRP-konjugeret BA27-antistof tilsat og inkuberet i 2 timer ved 4°C, efterfulgt af fem vasketrin.Aβ(1-40) blev påvist ved inkubation i TMB-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur.Efter at farveudviklingen er stoppet med stopopløsning, måles absorbansen ved 450 nm.Plasmaprøver blev udsat for fastfaseekstraktion før Aβ(1-40) ELISA.Plasma blev tilsat til 0,2% DEA (Sigma) i plader med 96 brønde og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter.Efter successiv vask af SPE-pladerne (Oasis, 186000679) med vand og 100 % methanol, blev plasmaprøver tilsat til SPE-pladerne, og al væske blev fjernet.Prøver blev vasket (først med 5 % methanol og derefter 30 % methanol) og elueret med 2 % NH4OH/90 % methanol.Efter tørring af eluatet ved 55 °C i 99 minutter ved konstant N2-strøm blev prøverne reduceret i standardfortyndingsmidler, og Aβ(1-40) blev målt som beskrevet ovenfor.
Sådan citeres denne artikel: Urich, E. et al.Lastlevering til hjernen ved hjælp af transitpeptider identificeret in vivo.videnskaben.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB og Moos T. Levering af makromolekylære lægemidler til hjernen ved hjælp af målrettet terapi.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., og Martinez-Martinez, P. Levering af peptid- og proteinlægemidler på tværs af blod-hjerne-barrieren.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blod-hjerne-barrieren: en flaskehals i udvikling af hjernemedicin.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG og Byrd, A. Udsigter for forbedret lægemiddellevering og målretning til hjernen via choroideus plexus-CSF-vejen.Pharmaceutical Research 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering af biofarmaceutika med molekylære trojanske heste til hjernelevering.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptor-medieret peptidtransport over blod-hjerne-barrieren.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Øg hjernepenetration og effektivitet af terapeutiske antistoffer ved hjælp af monovalente molekylære shuttles.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrinreceptor (TfR) transport bestemmer hjernens optagelse af affinitetsvarianter af TfR-antistoffer.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).