Nogle LC-fejlfindingsemner er aldrig forældede, da der er problemer i LC-praksis, selvom instrumentteknologien forbedres over tid. Der er mange måder, hvorpå problemer kan opstå i et LC-system og ende i dårlig topform. Når der opstår problemer relateret til topformen, hjælper en kort liste over mulige årsager til disse resultater med at forenkle vores fejlfindingsoplevelse.
Det har været sjovt at skrive denne "LC-fejlfinding"-spalte og tænke over emner hver måned, fordi nogle emner aldrig går af mode. Mens inden for kromatografiforskning, bliver visse emner eller ideer forældede, da de afløses af nyere og bedre ideer, inden for fejlfinding, da den første fejlfindingsartikel i LC-tidsskriftet (1) stadig dukkede op i dette tidsskrift (1) 983(1).I løbet af de sidste par år har jeg fokuseret adskillige LC-fejlfindingssektioner på nutidige tendenser, der påvirker væskekromatografi (LC) (f.eks. den relative sammenligning af vores forståelse af virkningen af ​​tryk på retention [2] New Advances) Vores fortolkning af LC-resultater og hvordan man fejlfinder med moderne LC-instrumenter, som startede i denne måned,'20. , som fokuserede på nogle af "liv og død"-emnerne i LC-fejlfinding - elementer, der er gode til enhver fejlfinding, er essentielle, uanset alderen på det system, vi bruger. Kerneemnet i denne serie er yderst relevant for LCGC's berømte "LC Troubleshooting Guide"-vægdiagram (4), der hænger i mange laboratorier, der er relateret til denne serie, og som er relateret til spidskompetencer i denne serie. bly, vægdiagrammet lister 44 forskellige potentielle årsager til dårlig topform! Vi kan ikke overveje alle disse problemer i detaljer i én artikel, så i denne første del om emnet vil jeg fokusere på nogle af dem, jeg ser oftest. Jeg håber, at unge og gamle LC-brugere vil finde nogle nyttige tips og påmindelser om dette vigtige emne.
Jeg oplever, at jeg i stigende grad svarer på fejlfindingsspørgsmål med "alt er muligt". Dette svar kan virke let, når jeg overvejer observationer, der er svære at fortolke, men jeg finder det ofte passende. Med mange mulige årsager til dårlig topform er det vigtigt at holde et åbent sind, når man overvejer, hvad problemet kan være, og at være i stand til at prioritere potentielle årsager for at begynde vores fejlfindingsindsats, hvor vi fokuserer på de mest almindelige muligheder.
Et nøgletrin i enhver fejlfindingsøvelse - men som jeg synes er undervurderet - er at erkende, at der er et problem, der skal løses. At erkende, at der er et problem, betyder ofte at erkende, at det, der sker med værktøjet, er anderledes end vores forventninger, som er formet af teori, empirisk viden og erfaring (5). y, forkant, hale, osv.), men også til bredden. Vores forventninger til den faktiske topform er enkle. Teori (6) understøtter godt lærebogens forventning om, at de kromatografiske toppe i de fleste tilfælde skal være symmetriske og passe til formen af ​​en gaussisk fordeling, som vist i figur 1a. Det, vi forventer fra en mere kompleks spidsartikel i denne artikel, og som vi vil diskutere i denne peakwidth-artikel. s i figur 1 viser nogle af de andre muligheder, der kunne observeres - med andre ord nogle af måderne, hvorpå tingene kunne gå galt. I resten af ​​denne del vil vi bruge tid på at diskutere nogle specifikke eksempler på situationer, der kan føre til disse formtyper.
Nogle gange observeres toppe slet ikke i kromatogrammet, hvor de forventes at blive elueret. Ovenstående vægdiagram indikerer, at fraværet af en top (forudsat at prøven faktisk indeholder målanalytten i en koncentration, der burde gøre detektorresponset tilstrækkeligt til at se det over støjen) normalt er relateret til et instrumentproblem eller forkerte mobilfaseforhold (hvis det observeres under alle forhold).toppe, normalt for "svage"). En kort liste over potentielle problemer og løsninger i denne kategori kan findes i tabel I.
Som nævnt ovenfor er spørgsmålet om, hvor meget spidsudvidelse, der skal tolereres, før man er opmærksom på og forsøger at løse det, et komplekst emne, som jeg vil diskutere i en fremtidig artikel. Min erfaring er, at en betydelig udvidelse af spidsen ofte ledsages af en betydelig ændring i spidsformen, og spidshaling er mere almindelig end før-peak eller spaltning. De nominelle spidser er dog symmetriske årsager, som også kan skyldes:
Hvert af disse spørgsmål er blevet diskuteret i detaljer i tidligere udgaver af Fejlfinding LC, og læsere, der er interesserede i disse emner, kan henvise til disse tidligere artikler for at få oplysninger om de grundlæggende årsager og potentielle løsninger på disse problemer.Flere detaljer.
Peak tailing, peak fronting og spaltning kan alle være forårsaget af kemiske eller fysiske fænomener, og listen over potentielle løsninger på disse problemer varierer meget, afhængigt af om vi har at gøre med et kemisk eller fysisk problem. Ofte, ved at sammenligne de forskellige toppe i et kromatogram, kan du finde vigtige spor om, hvem der er skyld i alle spidser, der er de mest sandsynlige. fysisk.Hvis kun én eller få toppe er påvirket, men resten ser fine ud, er årsagen højst sandsynligt kemisk.
De kemiske årsager til peak tailing er for komplekse til at diskutere kort her. Den interesserede læser henvises til det nylige nummer af "LC Troubleshooting" for en mere dybdegående diskussion (10). En nem ting at prøve er imidlertid at reducere massen af ​​den injicerede analyt og se, om peak-formen forbedres. Hvis ja, så er dette en god anelse om, at "analysen skal være begrænset i forhold til massen". , eller de kromatografiske forhold skal ændres, så der kan opnås gode topformer selv med større masser indsprøjtet.
Der er også mange potentielle fysiske årsager til peak tailing.Læsere, der er interesseret i en detaljeret diskussion af mulighederne, henvises til et andet nyligt nummer af "LC Troubleshooting" (11). En af de mere almindelige fysiske årsager til peak tailing er en dårlig forbindelse på et punkt mellem injektoren og detektoren (12). Et ekstremt eksempel er vist i figur 1d, i et nyt tilfælde, i et par uger siden, i dette tilfælde. ve, som vi ikke havde brugt før, og installerede en lille volumen injektionsløkke med en ferrule, der var blevet støbt ind på et rustfrit stål kapillar. Efter nogle indledende fejlfindingseksperimenter, indså vi, at portdybden i injektionsventilstatoren var meget dybere, end vi var vant til, hvilket resulterede i et stort dødvolumen i bunden af ​​porten, dette problem kan nemt løses med en anden løkke i røret. til den korrekte position for at eliminere dødvolumen i bunden af ​​porten.
Spidsfronter som dem, der er vist i figur 1e, kan også være forårsaget af fysiske eller kemiske problemer. En almindelig fysisk årsag til forkanten er, at søjlens partikelleje ikke er godt pakket, eller at partiklerne har omorganiseret sig over tid. Ligesom med peak tailing forårsaget af dette fysiske fænomen, er den bedste måde at løse dette på ved at erstatte søjlen og fortsætte med at vende tilbage fra en forkant, som vi ofte kalder en forkant. spændingsbetingelser.Under ideelle (lineære) forhold er mængden af ​​analyt tilbageholdt af den stationære fase (dermed retentionsfaktoren) lineært relateret til koncentrationen af ​​analytten i søjlen. Kromatografisk betyder det, at når massen af ​​analyt, der injiceres i søjlen, stiger, bliver toppen højere, men ikke bredere. Dette forhold er brudt, når spidsen er bredere, men ikke længere, når retentionen er bredere, men også bliver den bredere, men ikke længere. ed.Derudover bestemmer ikke-lineære former formen af ​​kromatografiske toppe, hvilket resulterer i for- eller bagkanter.Som med masseoverbelastning, der forårsager peak tailing (10), kan peak-føring forårsaget af ikke-lineær retention også diagnosticeres ved at reducere den injicerede analytmasse.Hvis peak-formen forbedres, må metoden i den forreste kant ændres til ikke at overskride den forreste kant til at ændre kvaliteten til min. efterligne denne adfærd.
Nogle gange observerer vi, hvad der ser ud til at være en "delt" top, som vist i figur 1f. Det første trin i løsningen af ​​dette problem er at bestemme, om topformen skyldes delvis co-eluering (dvs. tilstedeværelsen af ​​to distinkte, men tæt eluerende forbindelser). Hvis der faktisk er to forskellige analytter, der eluerer tæt sammen, så er det f.eks. og de tilsyneladende "delte" toppe er relateret til fysisk. Ydeevne har intet at gøre med selve kolonnen.Ofte er det vigtigste fingerpeg om denne beslutning, om alle toppe i kromatogrammet udviser splittede former, eller kun en eller to. Hvis det kun er en eller to, er det sandsynligvis et spørgsmål om co-eluering;hvis alle toppe er delt, er det sandsynligvis et fysisk problem, højst sandsynligt relateret til selve kolonnen.
Splittede toppe relateret til selve søjlens fysiske egenskaber skyldes sædvanligvis delvist blokerede indløbs- eller udløbsfritter eller reorganisering af partikler i søjlen, hvilket tillader den mobile fase at flyde hurtigere end den mobile fase i visse områder af søjlekanaldannelsen i andre områder (11).Delvist tilstoppet fritte kan nogle gange fjernes ved at vende strømmen gennem søjlen;Men efter min erfaring er dette normalt en kortsigtet snarere end en langsigtet løsning. Dette er ofte fatalt med moderne søjler, hvis partiklerne rekombinerer i søjlen. På dette tidspunkt er det bedst at udskifte søjlen og fortsætte.
Toppen i figur 1g, også fra et nyligt tilfælde i mit eget laboratorium, indikerer normalt, at signalet er så højt, at det har nået den høje ende af responsområdet. For optiske absorbansdetektorer (UV-vis i dette tilfælde), når analytkoncentrationen er meget høj, absorberer analytten det meste af lyset, der passerer gennem detektorflowcellen, og efterlader meget lidt lys under disse forhold, der kan detekteres af forskellige betingelser. kilder til støj, som f.eks. omstrejfende lys og "mørkestrøm", hvilket gør signalet meget "svagt" i udseende og uafhængigt af analytkoncentrationen.Når dette sker, kan problemet ofte let løses ved at reducere analyttens injektionsvolumen – reducere injektionsvolumenet, fortynde prøven eller begge dele.
I kromatografiskole bruger vi detektorsignalet (dvs. y-aksen i kromatogrammet) som en indikator for analytkoncentrationen i prøven. Så det synes underligt at se et kromatogram med et signal under nul, da den enkle fortolkning er, at dette indikerer en negativ analytconcentration-som selvfølgelig er naturligt, at det er fysisk muligt. er).
I dette tilfælde betyder en negativ top blot, at de molekyler, der elueres fra søjlen, absorberer mindre lys end selve den mobile fase umiddelbart før og efter toppen. Dette kan f.eks. ske ved brug af relativt lave detektionsbølgelængder (<230 nm) og mobilfaseadditiver, der absorberer det meste af lyset ved disse bølgelængder. Sådanne additiver kan f.eks. være mobile fase-opløsningsmiddelkomponenter eller buffer-komponenter i form af negativ acetat eller buffer. s at udarbejde en kalibreringskurve og opnå nøjagtig kvantitativ information, så der er ingen grundlæggende grund til at undgå dem i sig selv (denne metode kaldes nogle gange som "indirekte UV-detektion") (13). Men hvis vi virkelig vil undgå negative toppe helt, i tilfælde af absorbansdetektion, er den bedste løsning at bruge en anden detektionsbølgelængde, så den mobile analysefase absorberer mere end den mobile analysefase, så den mobile lys absorberer mere end analytfasen, så de absorberer lyset i analytten. .
Negative toppe kan også forekomme, når der bruges brydningsindeks (RI), når brydningsindekset for andre komponenter end analytten i prøven, såsom opløsningsmiddelmatrixen, er forskellig fra brydningsindekset for den mobile fase. Dette sker også med UV-vis-detektion, men denne effekt har en tendens til at blive svækket i forhold til RI-detektion. mobil fase.
I del tre om det grundlæggende emne for LC-fejlfinding diskuterede jeg situationer, hvor den observerede topform adskiller sig fra den forventede eller normale topform.Effektiv fejlfinding af sådanne problemer begynder med viden om forventede topformer (baseret på teori eller tidligere erfaring med eksisterende metoder), så afvigelser fra disse forventninger er indlysende.Peakformproblemer har også mange forskellige, brede, installationsproblemer, osv.). i detaljer nogle af de grunde, jeg oftest ser. At kende disse detaljer giver et godt sted at starte fejlfinding, men fanger ikke alle muligheder. Læsere, der er interesseret i en mere dybdegående liste over årsager og løsninger, kan henvise til LCGC "LC Troubleshooting Guide" vægdiagrammet.
(4) LCGC "LC Troubleshooting Guide" vægdiagram.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF og Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31-44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.