Nogle emner om fejlfinding i LC-systemer er aldrig forældede, da der er problemer i LC-praksis, selvom instrumentteknologien forbedres over tid. Der er mange måder, hvorpå problemer kan opstå i et LC-system og ende i dårlig peak-form. Når der opstår problemer relateret til peak-form, hjælper en kort liste over mulige årsager til disse resultater med at forenkle vores fejlfindingsoplevelse.
Det har været sjovt at skrive denne klumme om "LC-fejlfinding" og tænke over emner hver måned, fordi nogle emner aldrig går af mode. Inden for kromatografiforskning bliver visse emner eller ideer forældede, efterhånden som de erstattes af nyere og bedre ideer, inden for fejlfinding, siden den første fejlfindingsartikel dukkede op i dette tidsskrift (LC Journal på det tidspunkt) i 1983 (1). I løbet af de sidste par år har jeg fokuseret adskillige LC-fejlfindingsafsnit på moderne tendenser, der påvirker væskekromatografi (LC) (for eksempel den relative sammenligning af vores forståelse af effekten af ​​tryk på retention [2] Nye fremskridt) Vores fortolkning af LC-resultater og hvordan man fejlfinder med moderne LC-instrumenter. I denne måneds del fortsætter jeg min serie (3), som startede i december 2021, og som fokuserede på nogle af "liv-og-død"-emnerne inden for LC-fejlfinding - elementer, der er gode for enhver fejlfinder, er essentielle, uanset alderen på det system, vi bruger. Kerneemnet i denne serie er yderst relevant for LCGC's berømte vægdiagram "LC Troubleshooting Guide" (4), der hænger i mange laboratorier. I den tredje del af denne serie valgte jeg at fokusere på problemer relateret til peakform eller peakegenskaber. Utroligt nok viser vægdiagrammet 44 forskellige potentielle årsager til dårlig peakform! Vi kan ikke behandle alle disse problemer i detaljer i én artikel, så i denne første del om emnet vil jeg fokusere på nogle af dem, jeg ser oftest. Jeg håber, at unge og gamle LC-brugere vil finde nogle nyttige tips og påmindelser om dette vigtige emne.
Jeg oplever, at jeg i stigende grad besvarer fejlfindingsspørgsmål med "alt er muligt". Dette svar kan virke let, når man overvejer observationer, der er vanskelige at fortolke, men jeg finder det ofte passende. Med mange mulige årsager til dårlig topform er det vigtigt at holde et åbent sind, når man overvejer, hvad problemet kan være, og at være i stand til at prioritere potentielle årsager for at begynde vores fejlfindingsindsats med fokus på de mest almindelige muligheder, dette punkt er meget vigtigt.
Et vigtigt trin i enhver fejlfindingsøvelse – men et som jeg synes er undervurderet – er at erkende, at der er et problem, der skal løses. At erkende, at der er et problem, betyder ofte at erkende, at det, der sker med værktøjet, er anderledes end vores forventninger, som er formet af teori, empirisk viden og erfaring (5). Den "topform", der refereres til her, refererer faktisk ikke kun til toppens form (symmetrisk, asymmetrisk, glat, luftig, forkant, haleformet osv.), men også til bredden. Vores forventninger til den faktiske topform er enkle. Teori (6) understøtter godt lærebogens forventning om, at de kromatografiske toppe i de fleste tilfælde skal være symmetriske og svare til formen af ​​en Gaussisk fordeling, som vist i figur 1a. Hvad vi forventer af topbredder er et mere komplekst problem, og vi vil diskutere dette emne i en fremtidig artikel. De andre topformer i figur 1 viser nogle af de andre muligheder, der kan observeres – med andre ord nogle af de måder, tingene kan gå galt på. I resten af ​​denne del vil vi bruge tid på at diskutere nogle specifikke eksempler på situationer, der kan føre til disse formtyper.
Nogle gange observeres toppe slet ikke i kromatogrammet, hvor de forventes at blive elueret. Ovenstående vægdiagram indikerer, at fraværet af en top (forudsat at prøven faktisk indeholder målanalytten i en koncentration, der burde gøre detektorresponsen tilstrækkelig til at se den over støjen) normalt er relateret til et instrumentproblem eller forkerte mobilfaseforhold (hvis de overhovedet observeres). Toppe, normalt for "svage"). En kort liste over potentielle problemer og løsninger i denne kategori kan findes i tabel I.
Som nævnt ovenfor er spørgsmålet om, hvor meget peak-udvidelse man bør tolerere, før man retter opmærksomheden og forsøger at løse det, et komplekst emne, som jeg vil diskutere i en fremtidig artikel. Min erfaring er, at betydelig peak-udvidelse ofte ledsages af en betydelig ændring i peak-formen, og peak-tailing er mere almindeligt end pre-peak eller splitting. De nominelt symmetriske toppe er dog også udvidede, hvilket kan skyldes et par forskellige årsager:
Hvert af disse problemer er blevet diskuteret i detaljer i tidligere udgaver af Troubleshooting LC, og læsere, der er interesserede i disse emner, kan henvise til disse tidligere artikler for information om de grundlæggende årsager og potentielle løsninger på disse problemer. Flere detaljer.
Peak-tailing, peak fronting og splitting kan alle være forårsaget af kemiske eller fysiske fænomener, og listen over potentielle løsninger på disse problemer varierer meget, afhængigt af om vi har at gøre med et kemisk eller fysisk problem. Ved at sammenligne de forskellige toppe i et kromatogram kan man ofte finde vigtige spor om, hvilken der er synderen. Hvis alle toppe i et kromatogram udviser lignende former, er årsagen højst sandsynligt ikke fysisk. Hvis kun en eller et par toppe er påvirket, men resten ser fine ud, er årsagen højst sandsynligt kemisk.
De kemiske årsager til peak-tailing er for komplekse til at blive diskuteret kort her. Den interesserede læser henvises til det seneste nummer af "LC Troubleshooting" for en mere dybdegående diskussion (10). Det er dog nemt at forsøge at reducere massen af ​​den injicerede analyt og se, om topformen forbedres. Hvis det er tilfældet, er dette et godt tegn på, at problemet er "masseoverbelastning". I dette tilfælde skal metoden begrænses til at injicere små analytmasser, eller de kromatografiske betingelser skal ændres, så gode topformer kan opnås, selv med større injicerede masser.
Der er også mange potentielle fysiske årsager til peak tailing. Læsere, der er interesserede i en detaljeret diskussion af mulighederne, henvises til et andet nyligt nummer af "LC Troubleshooting" (11). En af de mere almindelige fysiske årsager til peak tailing er en dårlig forbindelse på et punkt mellem injektoren og detektoren (12). Et ekstremt eksempel er vist i figur 1d, som blev taget i mit laboratorium for et par uger siden. I dette tilfælde byggede vi et system med en ny injektionsventil, som vi ikke havde brugt før, og installerede en injektionssløjfe med lille volumen med en ferrule, der var blevet støbt på en kapillær af rustfrit stål. Efter nogle indledende fejlfindingseksperimenter indså vi, at portdybden i injektionsventilens stator var meget dybere, end vi var vant til, hvilket resulterede i et stort dødvolumen i bunden af ​​porten. Dette problem løses let ved at udskifte injektionssløjfen med et andet rør, hvor vi kan justere ferrulen til den korrekte position for at eliminere dødvolumenet i bunden af ​​porten.
Topfronter som dem vist i figur 1e kan også være forårsaget af fysiske eller kemiske problemer. En almindelig fysisk årsag til forkanten er, at partikellejet i søjlen ikke er godt pakket, eller at partiklerne har reorganiseret sig over tid. Som med peak-tailing forårsaget af dette fysiske fænomen, er den bedste måde at løse dette på at udskifte søjlen og fortsætte. Fundamentalt set opstår forkanttopformer med kemisk oprindelse ofte fra det, vi kalder "ikke-lineære" retentionsbetingelser. Under ideelle (lineære) forhold er mængden af ​​analyt, der tilbageholdes af den stationære fase (deraf retentionsfaktoren), lineært relateret til koncentrationen af ​​analyten i søjlen. Kromatografisk betyder dette, at når massen af ​​analyt, der injiceres i søjlen, stiger, bliver toppen højere, men ikke bredere. Dette forhold brydes, når retentionsadfærden er ikke-lineær, og toppene bliver ikke kun højere, men også bredere, efterhånden som mere masse injiceres. Derudover bestemmer ikke-lineære former formen af ​​kromatografiske toppe, hvilket resulterer i for- eller bagkanter. Som med masseoverbelastning, der forårsager peak-tailing (10), forårsages peak-leading ved ikke-lineær retention kan også diagnosticeres ved at reducere den injicerede analytmasse. Hvis toppens form forbedres, skal metoden modificeres, så den ikke overskrider den injektionskvalitet, der forårsager forkanten, eller de kromatografiske betingelser skal ændres for at minimere denne adfærd.
Nogle gange observerer vi, hvad der ser ud til at være en "split" peak, som vist i figur 1f. Det første skridt i at løse dette problem er at bestemme, om peakformen skyldes delvis co-eluering (dvs. tilstedeværelsen af ​​to forskellige, men tæt eluerende forbindelser). Hvis der faktisk er to forskellige analytter, der eluerer tæt sammen, handler det om at forbedre deres opløsning (for eksempel ved at øge selektivitet, retention eller pladetælling), og de tilsyneladende "split" peaks er relateret til fysiske forhold. Ydeevne har intet at gøre med selve kolonnen. Ofte er det vigtigste spor til denne beslutning, om alle toppe i kromatogrammet udviser splitformer, eller kun en eller to. Hvis det kun er en eller to, er det sandsynligvis et problem med co-eluering; hvis alle toppe er split, er det sandsynligvis et fysisk problem, sandsynligvis relateret til selve kolonnen.
Delvist tilstoppede toppe relateret til selve kolonnens fysiske egenskaber skyldes normalt delvist blokerede indløbs- eller udløbsfritter eller reorganisering af partikler i kolonnen, hvilket tillader den mobile fase at strømme hurtigere end den mobile fase i visse områder af kolonnens kanaldannelse i andre regioner (11). Delvist tilstoppet fritte kan undertiden fjernes ved at vende strømmen gennem kolonnen; men efter min erfaring er dette normalt en kortsigtet snarere end en langsigtet løsning. Dette er ofte fatalt med moderne kolonner, hvis partiklerne rekombineres i kolonnen. På dette tidspunkt er det bedst at udskifte kolonnen og fortsætte.
Toppen i figur 1g, også fra en nylig forekomst i mit eget laboratorium, indikerer normalt, at signalet er så højt, at det har nået den høje ende af responsområdet. For optiske absorbansdetektorer (UV-vis i dette tilfælde), når analytkoncentrationen er meget høj, absorberer analytten det meste af det lys, der passerer gennem detektorens flowcelle, hvilket efterlader meget lidt lys at detektere. Under disse forhold er det elektriske signal fra fotodetektoren stærkt påvirket af forskellige støjkilder, såsom spredt lys og "mørk strøm", hvilket gør signalet meget "sløret" i udseende og uafhængigt af analytkoncentrationen. Når dette sker, kan problemet ofte let løses ved at reducere analyttens injektionsvolumen - reducere injektionsvolumenet, fortynde prøven eller begge dele.
I kromatografiskolen bruger vi detektorsignalet (dvs. y-aksen i kromatogrammet) som en indikator for analytkoncentrationen i prøven. Så det virker mærkeligt at se et kromatogram med et signal under nul, da den simple fortolkning er, at dette indikerer en negativ analytkoncentration – hvilket selvfølgelig ikke er fysisk muligt. Efter min erfaring observeres negative toppe oftest, når man bruger optiske absorbansdetektorer (f.eks. UV-vis).
I dette tilfælde betyder en negativ top blot, at de molekyler, der eluerer fra kolonnen, absorberer mindre lys end selve den mobile fase umiddelbart før og efter toppen. Dette kan f.eks. forekomme, når man bruger relativt lave detektionsbølgelængder (<230 nm) og mobile faseadditiver, der absorberer det meste af lyset ved disse bølgelængder. Sådanne additiver kan være mobile faseopløsningsmiddelkomponenter såsom methanol eller bufferkomponenter såsom acetat eller formiat. Man kan faktisk bruge negative toppe til at udarbejde en kalibreringskurve og opnå nøjagtig kvantitativ information, så der er ingen grundlæggende grund til at undgå dem i sig selv (denne metode kaldes undertiden "indirekte UV-detektion") (13). Men hvis vi virkelig ønsker at undgå negative toppe helt, er den bedste løsning i tilfælde af absorbansdetektion at bruge en anden detektionsbølgelængde, så analytten absorberer mere end den mobile fase, eller ændre sammensætningen af ​​den mobile fase, så de absorberer mindre lys end analytter.
Negative toppe kan også forekomme ved brug af brydningsindeksdetektion (RI), når brydningsindekset for andre komponenter end analytten i prøven, såsom opløsningsmiddelmatricen, er forskelligt fra brydningsindekset for den mobile fase. Dette sker også med UV-vis-detektion, men denne effekt har en tendens til at blive dæmpet i forhold til RI-detektion. I begge tilfælde kan negative toppe minimeres ved at matche prøvematricens sammensætning bedre med den mobile fases.
I del tre om det grundlæggende emne LC-fejlfinding diskuterede jeg situationer, hvor den observerede topform afviger fra den forventede eller normale topform. Effektiv fejlfinding af sådanne problemer begynder med kendskab til forventede topformer (baseret på teori eller tidligere erfaring med eksisterende metoder), så afvigelser fra disse forventninger er åbenlyse. Problemer med topform har mange forskellige potentielle årsager (for bred, haleformet, forkant osv.). I denne del diskuterer jeg i detaljer nogle af de årsager, jeg ser oftest. Kendskab til disse detaljer giver et godt sted at starte fejlfinding, men dækker ikke alle muligheder. Læsere, der er interesserede i en mere dybdegående liste over årsager og løsninger, kan henvise til LCGC's "LC Troubleshooting Guide"-vægdiagram.
(4) Vægdiagram til LCGC “LC Fejlfindingsvejledning”. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Dataanalyse og signalbehandling i kromatografi (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF og Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.