Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Flydende biopsi (LB) er et koncept, der hurtigt vinder popularitet inden for det biomedicinske område.Konceptet er hovedsageligt baseret på påvisning af fragmenter af cirkulerende ekstracellulært DNA (ccfDNA), som hovedsageligt frigives som små fragmenter efter celledød i forskellige væv.En lille del af disse fragmenter stammer fra fremmede (fremmede) væv eller organismer.I det nuværende arbejde har vi anvendt dette koncept på muslinger, en vagtpostart kendt for deres høje havvandsfiltreringsevne.Vi bruger muslingers evne til at fungere som naturlige filtre til at indfange miljømæssige DNA-fragmenter fra en række forskellige kilder til at give information om biodiversiteten i de marine kystnære økosystemer.Vores resultater viser, at muslingehæmolymfe indeholder DNA-fragmenter, der varierer meget i størrelse, fra 1 til 5 kb.Haglgeværsekventering viste, at et stort antal DNA-fragmenter er af fremmed mikrobiel oprindelse.Blandt dem fandt vi DNA-fragmenter fra bakterier, archaea og vira, herunder vira, der vides at inficere en række værter, der almindeligvis findes i kystnære marine økosystemer.Som konklusion viser vores undersøgelse, at begrebet LB anvendt på muslinger repræsenterer en rig, men endnu uudforsket kilde til viden om mikrobiel diversitet i marine kystnære økosystemer.
Indvirkningen af ​​klimaændringer (CC) på biodiversiteten i marine økosystemer er et hastigt voksende forskningsområde.Global opvarmning forårsager ikke kun vigtige fysiologiske belastninger, men skubber også de evolutionære grænser for den termiske stabilitet af marine organismer, hvilket påvirker habitatet for en række arter, hvilket får dem til at søge efter mere gunstige forhold [1, 2].Ud over at påvirke biodiversiteten af ​​metazoer, forstyrrer CC den delikate balance mellem vært-mikrobielle interaktioner.Denne mikrobielle dysbakteriose udgør en alvorlig trussel mod marine økosystemer, da den gør marine organismer mere modtagelige for infektiøse patogener [3, 4].Det menes, at SS spiller en vigtig rolle i massedødsfald, hvilket er et alvorligt problem for forvaltningen af ​​globale marine økosystemer [5, 6].Dette er et vigtigt spørgsmål i betragtning af de økonomiske, økologiske og ernæringsmæssige påvirkninger af mange marine arter.Dette gælder især for toskallede, der lever i polarområderne, hvor virkningerne af CK er mere umiddelbare og alvorlige [6, 7].Faktisk kan toskallede som Mytilus spp.bruges i vid udstrækning til at overvåge virkningerne af CC på marine økosystemer.Ikke overraskende er et relativt stort antal biomarkører blevet udviklet til at overvåge deres helbred, ofte ved hjælp af en to-tiers tilgang, der involverer funktionelle biomarkører baseret på enzymatisk aktivitet eller cellulære funktioner såsom cellelevedygtighed og fagocytisk aktivitet [8].Disse metoder omfatter også måling af koncentrationen af ​​specifikke trykindikatorer, der akkumuleres i blødt væv efter absorption af store mængder havvand.Imidlertid giver den høje filtreringskapacitet og det halvåbne kredsløb for toskallede en mulighed for at udvikle nye hæmolymfebiomarkører ved hjælp af konceptet flydende biopsi (LB), en enkel og minimalt invasiv tilgang til patientbehandling.blodprøver [9, 10].Selvom der kan findes flere typer cirkulerende molekyler i humant LB, er dette koncept primært baseret på DNA-sekventeringsanalyse af cirkulerende ekstracellulære DNA (ccfDNA) fragmenter i plasma.Faktisk har tilstedeværelsen af ​​cirkulerende DNA i humant plasma været kendt siden midten af ​​det 20. århundrede [11], men det er først i de senere år, at fremkomsten af ​​high-throughput sekventeringsmetoder har ført til klinisk diagnose baseret på ccfDNA.Tilstedeværelsen af ​​disse cirkulerende DNA-fragmenter skyldes til dels den passive frigivelse af genomisk DNA (nuklear og mitokondrie) efter celledød. Hos raske individer er koncentrationen af ​​ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan øges med 5-10 gange hos patienter, der lider af forskellige patologier eller udsættes for stress, hvilket resulterer i vævsskade. Hos raske individer er koncentrationen af ​​ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan øges med 5-10 gange hos patienter, der lider af forskellige patologier eller udsættes for stress, hvilket resulterer i vævsskade. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/ml), но может повышаться в 5-10 sочно сразуся логией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hos raske mennesker er koncentrationen af ​​cccDNA normalt lav (<10 ng/mL), men den kan stige med 5-10 gange hos patienter med forskellige patologier eller under stress, der fører til vævsskade.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承口加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 旅理 刖 扅理 刖 手可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 распаце логиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-koncentrationer er normalt lave (<10 ng/ml) hos raske individer, men kan øges 5-10 gange hos patienter med forskellige patologier eller stress, hvilket resulterer i vævsskade.Størrelsen af ​​ccfDNA-fragmenter varierer meget, men varierer sædvanligvis fra 150 til 200 bp.[12].Analyse af selvafledt ccfDNA, dvs. ccfDNA fra normale eller transformerede værtsceller, kan bruges til at detektere genetiske og epigenetiske ændringer, der er til stede i det nukleare og/eller mitokondrielle genom, og derved hjælpe klinikere med at vælge specifikke molekylær-målrettede terapier [13].Imidlertid kan ccfDNA opnås fra fremmede kilder såsom ccfDNA fra føtale celler under graviditet eller fra transplanterede organer [14,15,16,17].ccfDNA er også en vigtig kilde til information til påvisning af tilstedeværelsen af ​​nukleinsyrer af et infektiøst agens (fremmed), hvilket muliggør ikke-invasiv påvisning af udbredte infektioner, der ikke er identificeret af blodkulturer, og undgår invasiv biopsi af inficeret væv [18].Nylige undersøgelser har faktisk vist, at humant blod indeholder en rig kilde til information, der kan bruges til at identificere virale og bakterielle patogener, og at omkring 1% af ccfDNA'et fundet i humant plasma er af fremmed oprindelse [19].Disse undersøgelser viser, at biodiversiteten af ​​en organismes cirkulerende mikrobiom kan vurderes ved hjælp af ccfDNA-analyse.Indtil for nylig blev dette koncept dog udelukkende brugt hos mennesker og i mindre grad hos andre hvirveldyr [20, 21].
I denne artikel bruger vi LB-potentialet til at analysere ccfDNA fra Aulacomya atra, en sydlig art, der almindeligvis findes på de subantarktiske Kerguelen-øer, en gruppe øer på toppen af ​​et stort plateau, der blev dannet for 35 millioner år siden.vulkanudbrud.Ved hjælp af et in vitro eksperimentelt system fandt vi ud af, at DNA-fragmenter i havvand hurtigt optages af muslinger og kommer ind i hæmolymferummet.Haglgeværsekventering har vist, at muslingehæmolymfe ccfDNA indeholder DNA-fragmenter af sin egen og ikke-selv-oprindelse, herunder symbiotiske bakterier og DNA-fragmenter fra biomer, der er typiske for kolde vulkanske kystnære økosystemer.Hæmolymfe ccfDNA indeholder også virale sekvenser afledt af vira med forskellige værtsområder.Vi fandt også DNA-fragmenter fra flercellede dyr som benfisk, søanemoner, alger og insekter.Som konklusion viser vores undersøgelse, at LB-konceptet med succes kan anvendes på marine hvirvelløse dyr for at generere et rigt genomisk repertoire i marine økosystemer.
Voksne (55-70 mm lange) Mytilus platensis (M. platensis) og Aulacomya atra (A. atra) blev opsamlet fra de klippefyldte kyster mellem tidevandet i Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 Ø).Kerguelen-øerne i december 2018. Andre voksne blåmuslinger (Mytilus spp.) blev hentet fra en kommerciel leverandør (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) og anbragt i en temperaturstyret (4°C) beluftet tank indeholdende 10-20 L 32‰ kunstig saltlage.(kunstigt havsalt Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).For hvert eksperiment blev længden og vægten af ​​individuelle skaller målt.
En gratis åben adgangsprotokol til dette program er tilgængelig online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kort fortalt blev LB-hæmolymfe opsamlet fra abduktormuskler som beskrevet [22].Hæmolymfen blev klaret ved centrifugering ved 1200 xg i 3 minutter, supernatanten blev frosset (-20°C) indtil brug.Til isolering og oprensning af cfDNA blev prøver (1,5-2,0 ml) optøet og behandlet ved hjælp af NucleoSnap cfDNA-kittet (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) i henhold til producentens instruktioner.ccfDNA blev opbevaret ved -80°C indtil yderligere analyse.I nogle eksperimenter blev ccfDNA isoleret og oprenset ved hjælp af QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Oprenset DNA blev kvantificeret ved anvendelse af et standard PicoGreen-assay.Fragmentfordelingen af ​​det isolerede ccfDNA blev analyseret ved kapillærelektroforese under anvendelse af en Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) under anvendelse af et High Sensitivity DNA Kit.Assayet blev udført under anvendelse af 1 µl af ccfDNA-prøven ifølge producentens instruktioner.
Til sekventering af hæmolymfe ccfDNA-fragmenter forberedte Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) haglgeværbiblioteker ved hjælp af Illumina DNA Mix-sættet fra Illumina MiSeq PE75-kittet.En standardadapter (BioO) blev brugt.Rådatafiler er tilgængelige fra NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 og SRR8924809).Grundlæggende læsekvalitet blev vurderet ved hjælp af FastQC [23].Trimmomatic [24] er blevet brugt til klippeadaptere og aflæsninger af dårlig kvalitet.Haglgeværlæsninger med parrede ender blev FLASH slået sammen til længere enkeltlæsninger med et minimum overlap på 20 bp for at undgå uoverensstemmelser [25]. Sammenlagte læsninger blev kommenteret med BLASTN ved hjælp af en toskallet NCBI Taxonomy-database (e-værdi < 1e-3 og 90% homologi), og maskering af sekvenser med lav kompleksitet blev udført ved hjælp af DUST [26]. Sammenlagte læsninger blev kommenteret med BLASTN ved hjælp af en toskallet NCBI Taxonomy-database (e-værdi < 1e-3 og 90% homologi), og maskering af sekvenser med lav kompleksitet blev udført ved hjælp af DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двулхорче 1e-3 og 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием [26]. Poolede læsninger blev kommenteret med BLASTN ved hjælp af NCBI toskallet taksonomidatabase (e-værdi < 1e-3 og 90 % homologi), og sekvensmaskering med lav kompleksitet blev udført ved hjælp af DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的缿唌DUST 2低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 輽濹 2 du 读濹 ]行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двиNCов е e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использование [26]. Poolede læsninger blev annoteret med BLASTN ved hjælp af NCBI toskallede taksonomiske database (e-værdi <1e-3 og 90% homologi), og lav kompleksitet sekvensmaskering blev udført ved hjælp af DUST [26].Aflæsninger blev opdelt i to grupper: relateret til toskallede sekvenser (her kaldet selvlæsninger) og ikke-relaterede (ikke-selvlæsninger).To grupper blev samlet separat ved hjælp af MEGAHIT for at generere contigs [27].I mellemtiden blev den taksonomiske fordeling af fremmede mikrobiomlæsninger klassificeret ved hjælp af Kraken2 [28] og grafisk repræsenteret ved et Krona-cirkeldiagram på Galaxy [29, 30].De optimale kmers blev bestemt til at være kmers-59 ud fra vores foreløbige eksperimenter. Selvkontiger blev derefter identificeret ved justering med BLASTN (toskallet NCBI-database, e-værdi < 1e−10 og 60 % homologi) for en endelig annotering. Selvkontiger blev derefter identificeret ved justering med BLASTN (toskallet NCBI-database, e-værdi < 1e−10 og 60 % homologi) for en endelig annotering. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (based данных двустворчатированы сопоставления с BLASTN) и гомология 60%) для окончательной аннотации. Self-contigs blev derefter identificeret ved at matche mod BLASTN (NCBI toskallede database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi) til endelig annotering.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BINC для BLASTN) х моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Self-contigs blev derefter identificeret til endelig annotering ved at matche mod BLASTN (NCBI toskallede database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi). Parallelt hermed blev nonself group contigs annoteret med BLASTN (nt NCBI database, e værdi < 1e−10 og 60% homologi). Parallelt hermed blev nonself group contigs annoteret med BLASTN (nt NCBI database, e værdi < 1e−10 og 60% homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (baseret på NCBI, på <10 %). Parallelt hermed blev fremmede gruppekontiger annoteret med BLASTN (NT NCBI-database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги. og гомология 60 %). Parallelt hermed blev ikke-selv-gruppe-kontiger annoteret med BLASTN (nt NCBI-database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi). BLASTX blev også udført på nonself contigs ved hjælp af nr og RefSeq protein NCBI databaser (e værdi < 1e-10 og 60% homologi). BLASTX blev også udført på nonself contigs ved hjælp af nr og RefSeq protein NCBI databaser (e værdi < 1e-10 og 60% homologi). BLASTX er tilgængelig for несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr. и RefSeq NCBI (f. 6. 0. 1. 0. 1. %). BLASTX blev også udført på ikke-selv-kontiger under anvendelse af nr- og RefSeq NCBI-proteindatabaserne (e-værdi < 1e-10 og 60 % homologi).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 Blastx таже выолннunde на несамостотелных контиgå и и исолованием баз б бе б г и и б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б бember 60 Åsk. . BLASTX blev også udført på ikke-selv-kontiger under anvendelse af nr- og RefSeq NCBI-proteindatabaserne (e-værdi <1e-10 og 60% homologi).BLASTN- og BLASTX-puljerne af ikke-selv-kontiger repræsenterer de endelige contigs (se Supplerende fil).
De primere, der bruges til PCR, er anført i tabel S1.Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) blev brugt til at amplificere ccfDNA-målgenerne.Følgende reaktionsbetingelser blev anvendt: denaturering ved 95°C i 3 minutter, 95°C i 1 minut, indstillet annealingstemperatur i 1 minut, forlængelse ved 72°C i 1 minut, 35 cyklusser og til sidst 72°C inden for 10 minutter..PCR-produkter blev adskilt ved elektroforese i agarosegeler (1,5%) indeholdende SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ved 95 V.
Muslinger (Mytilus spp.) blev akklimatiseret i 500 ml oxygeneret havvand (32 PSU) i 24 timer ved 4°C.Plasmid-DNA indeholdende et insert, der koder for den humane galectin-7-cDNA-sekvens (NCBI accessionsnummer L07769) blev tilsat til hætteglasset i en slutkoncentration på 190 μg/μl.Muslinger inkuberet under de samme betingelser uden DNA-tilsætning var kontrol.Den tredje kontroltank indeholdt DNA uden muslinger.For at overvåge kvaliteten af ​​DNA i havvand blev der taget havvandsprøver (20 μl; tre gentagelser) fra hver tank på det angivne tidspunkt.For plasmid-DNA-sporbarhed blev LB-muslinger høstet på de angivne tidspunkter og analyseret med qPCR og ddPCR.På grund af det høje saltindhold i havvand blev aliquoter fortyndet i PCR-kvalitetsvand (1:10) før alle PCR-assays.
Digital dråbe-PCR (ddPCR) blev udført ved hjælp af BioRad QX200-protokollen (Mississauga, Ontario, Canada).Brug temperaturprofilen til at bestemme den optimale temperatur (tabel S1).Dråber blev genereret ved hjælp af en QX200 dråbegenerator (BioRad).ddPCR blev udført som følger: 95°C i 5 minutter, 50 cykler af 95°C i 30 sekunder og en given annealingstemperatur i 1 minut og 72°C i 30 sekunder, 4°C i 5 minutter og 90°C inden for 5 minutter.Antallet af dråber og positive reaktioner (antal kopier/µl) blev målt ved hjælp af en QX200 dråbelæser (BioRad).Prøver med mindre end 10.000 dråber blev afvist.Mønsterkontrol blev ikke udført hver gang ddPCR blev kørt.
qPCR blev udført under anvendelse af Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) og LGALS7 specifikke primere.Alle kvantitative PCR'er blev udført i 20 µl under anvendelse af QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR blev startet med en 15 minutters inkubation ved 95°C efterfulgt af 40 cyklusser ved 95°C i 10 sekunder og ved 60°C i 60 sekunder med én dataindsamling.Smeltekurver blev genereret under anvendelse af successive målinger ved 95°C i 5 s, 65°C i 60 s og 97°C ved slutningen af ​​qPCR.Hver qPCR blev udført i tre eksemplarer, undtagen kontrolprøver.
Da muslinger er kendt for deres høje filtreringshastighed, undersøgte vi først, om de kunne filtrere og tilbageholde DNA-fragmenter, der findes i havvand.Vi var også interesserede i, om disse fragmenter akkumuleres i deres semi-åbne lymfesystem.Vi løste dette problem eksperimentelt ved at spore skæbnen for opløselige DNA-fragmenter tilsat blåmuslingetanke.For at lette sporing af DNA-fragmenter brugte vi fremmed (ikke selv) plasmid-DNA indeholdende det humane galectin-7-gen.ddPCR sporer plasmid-DNA-fragmenter i havvand og muslinger.Vores resultater viser, at hvis mængden af ​​DNA-fragmenter i havvand forblev relativt konstant over tid (op til 7 dage) i fravær af muslinger, så forsvandt dette niveau i nærvær af muslinger næsten fuldstændigt inden for 8 timer (fig. 1a,b).Fragmenter af eksogent DNA blev let påvist inden for 15 minutter i intravalvulær væske og hæmolymfe (fig. 1c).Disse fragmenter kunne stadig påvises op til 4 timer efter eksponering.Denne filtreringsaktivitet med hensyn til DNA-fragmenter er sammenlignelig med filtreringsaktiviteten af ​​bakterier og alger [31].Disse resultater tyder på, at muslinger kan filtrere og akkumulere fremmed DNA i deres væskerum.
Relative koncentrationer af plasmid-DNA i havvand i nærvær (A) eller fravær (B) af muslinger, målt ved ddPCR.I A er resultaterne udtrykt som procenter, hvor boksenes grænser repræsenterer 75. og 25. percentilen.Den tilpassede logaritmiske kurve er vist med rødt, og det gråtonede område repræsenterer 95 % konfidensintervallet.I B repræsenterer den røde linje middelværdien, og den blå linje repræsenterer 95 % konfidensintervallet for koncentrationen.C Akkumulering af plasmid-DNA i muslingers hæmolymfe og klapvæske på forskellige tidspunkter efter tilsætning af plasmid-DNA.Resultater præsenteres som absolutte kopier påvist/ml (±SE).
Dernæst undersøgte vi oprindelsen af ​​ccfDNA i muslinger indsamlet fra muslingebanker på Kerguelen-øerne, en fjern gruppe af øer med begrænset menneskeskabt indflydelse.Til dette formål blev cccDNA fra muslingehæmolymfer isoleret og oprenset ved metoder, der almindeligvis anvendes til at oprense humant cccDNA [32, 33].Vi fandt, at gennemsnitlige hæmolymfe ccfDNA-koncentrationer i muslinger er i det lave mikrogram pr. ml hæmolymfeområde (se tabel S2, Supplerende information).Dette interval af koncentrationer er meget større end hos raske mennesker (lave nanogram pr. milliliter), men i sjældne tilfælde, hos cancerpatienter, kan niveauet af ccfDNA nå adskillige mikrogram pr. milliliter [34, 35].En analyse af størrelsesfordelingen af ​​hæmolymfe ccfDNA viste, at disse fragmenter varierer meget i størrelse, varierende fra 1000 bp til 1000 bp.op til 5000 bp (fig. 2).Lignende resultater blev opnået ved brug af det silica-baserede QIAamp Investigator Kit, en metode, der almindeligvis anvendes i retsvidenskab til hurtigt at isolere og oprense genomisk DNA fra lavkoncentrations-DNA-prøver, inklusive ccfDNA [36].
Repræsentativt ccfDNA elektroforegram af muslingehæmolymfe.Ekstraheret med NucleoSnap Plasma Kit (øverst) og QIAamp DNA Investigator Kit.B Violinplot, der viser fordelingen af ​​hæmolymfe ccfDNA-koncentrationer (±SE) i muslinger.De sorte og røde streger repræsenterer henholdsvis medianen og den første og tredje kvartil.
Cirka 1 % af ccfDNA hos mennesker og primater har en fremmed kilde [21, 37].I betragtning af det halvåbne kredsløb af toskallede, mikrobielt rigt havvand og størrelsesfordelingen af ​​muslinge-ccfDNA, antog vi, at muslingehæmolymfe-ccfDNA kan indeholde en rig og forskelligartet pool af mikrobiel DNA.For at teste denne hypotese sekventerede vi hæmolymfe ccfDNA fra Aulacomya atra-prøver indsamlet fra Kerguelen-øerne, hvilket gav over 10 millioner aflæsninger, hvoraf 97,6% bestod kvalitetskontrol.Aflæsningerne blev derefter klassificeret efter selv- og ikke-selv-kilder ved hjælp af BLASTN og NCBI toskallede databaser (Fig. S1, Supplerende Information).
Hos mennesker kan både nukleært og mitokondrielt DNA frigives til blodbanen [38].I nærværende undersøgelse var det imidlertid ikke muligt at beskrive muslingers nukleare genomiske DNA i detaljer, da A. atra-genomet ikke er blevet sekventeret eller beskrevet.Imidlertid var vi i stand til at identificere et antal ccfDNA-fragmenter af vores egen oprindelse ved hjælp af toskallet bibliotek (Fig. S2, Supplerende Information).Vi bekræftede også tilstedeværelsen af ​​DNA-fragmenter af vores egen oprindelse ved rettet PCR-amplifikation af de A. atra-gener, der blev sekventeret (fig. 3).På samme måde, givet at mitokondrielle genom af A. atra er tilgængeligt i offentlige databaser, kan man finde beviser for tilstedeværelsen af ​​mitokondrielle ccfDNA-fragmenter i hæmolymfen af ​​A. atra.Tilstedeværelsen af ​​mitokondrielle DNA-fragmenter blev bekræftet ved PCR-amplifikation (fig. 3).
Forskellige mitokondrielle gener var til stede i hæmolymfen af ​​A. atra (røde prikker – lagernummer: SRX5705969) og M. platensis (blå prikker – lagernummer: SRX5705968) amplificeret ved PCR.Figur tilpasset fra Breton et al., 2011 B Amplifikation af hæmolymfesupernatant fra A. atra Lagret på FTA-papir.Brug en 3 mm punch til at tilføje direkte til PCR-røret, der indeholder PCR-blandingen.
I betragtning af det rigelige mikrobielle indhold i havvand, fokuserede vi i første omgang på karakteriseringen af ​​mikrobielle DNA-sekvenser i hæmolymfe.For at gøre dette bruger vi to forskellige strategier.Den første strategi brugte Kraken2, et algoritmebaseret sekvensklassificeringsprogram, der kan identificere mikrobielle sekvenser med en nøjagtighed, der kan sammenlignes med BLAST og andre værktøjer [28].Mere end 6719 aflæsninger blev bestemt til at være af bakteriel oprindelse, mens 124 og 64 var fra henholdsvis archaea og vira (fig. 4).De mest udbredte bakterielle DNA-fragmenter var Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) og Bacteroidetes (17%) (fig. 4a).Denne fordeling er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af det marine blåmuslingemikrobiom [39, 40].Gammaproteobakterier var hovedklassen af ​​proteobakterier (44%), herunder mange Vibrionales (fig. 4b).ddPCR-metoden bekræftede tilstedeværelsen af ​​Vibrio DNA-fragmenter i ccfDNA fra A. atra hæmolymfe (fig. 4c) [41].For at få mere information om den bakterielle oprindelse af ccfDNA blev der taget en yderligere tilgang (fig. S2, Supplerende information). I dette tilfælde blev læsninger, der overlappede, samlet som parret ende-læsninger og blev klassificeret som af selv- (toskallede) eller ikke-selv-oprindelse ved hjælp af BLASTN og en e-værdi på 1e−3 og en cutoff med >90 % homologi. I dette tilfælde blev læsninger, der overlappede, samlet som parret ende-læsninger og blev klassificeret som af selv- (toskallede) eller ikke-selv-oprindelse ved hjælp af BLASTN og en e-værdi på 1e−3 og en cutoff med >90 % homologi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классивы ворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 og отсечениол с го гом. I dette tilfælde blev overlappende læsninger indsamlet som parrede læsninger og blev klassificeret som native (toskallede) eller ikke-originale ved brug af BLASTN og e-værdi på 1e-3 og cutoff med >90 % homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皒倢暒倢倢倢倢倢e值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 使缄的 的 的 的 的 用和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфицович ые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN og 1e-3 og порога гомолога. I dette tilfælde blev overlappende læsninger indsamlet som parrede læsninger og klassificeret som egne (toskallede) eller ikke-originale ved hjælp af e BLASTN og 1e-3 værdier og en homologitærskel >90%.Da A. atra-genomet endnu ikke er blevet sekventeret, brugte vi de novo-samlingsstrategien fra MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.I alt 147.188 contigs er blevet identificeret som afhængige (toskallede) af oprindelse.Disse contigs blev derefter eksploderet med e-værdier på 1e-10 ved hjælp af BLASTN og BLASTX.Denne strategi gjorde det muligt for os at identificere 482 ikke-toskallede fragmenter til stede i A. atra ccfDNA.Mere end halvdelen (57 %) af disse DNA-fragmenter blev opnået fra bakterier, hovedsageligt fra gællesymbionter, herunder sulfotrofe symbionter, og fra gællesymbionter Solemya velum (fig. 5).
Relativ overflod på typeniveau.B Mikrobiel diversitet af to hovedfylla (Firmicutes og Proteobacteria).Repræsentativ amplifikation af ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenter af 16S rRNA-genet (blåt) i tre atra-hæmolymfer.
I alt 482 indsamlede contigs blev analyseret.Generel profil af den taksonomiske fordeling af metagenomiske contig-annoteringer (prokaryoter og eukaryoter).B Detaljeret fordeling af bakterielle DNA-fragmenter identificeret af BLASTN og BLASTX.
Kraken2-analyse viste også, at muslinge-ccfDNA indeholdt arkæiske DNA-fragmenter, herunder DNA-fragmenter af Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) og Thaurmarcheota (11%) (fig. 6a).Tilstedeværelsen af ​​DNA-fragmenter afledt af Euryarchaeota og Crenarchaeota, som tidligere er fundet i det mikrobielle samfund af californiske muslinger, burde ikke komme som en overraskelse [42].Selvom Euryarchaeota ofte er forbundet med ekstreme forhold, er det nu anerkendt, at både Euryarchaeota og Crenarcheota er blandt de mest almindelige prokaryoter i det marine kryogene miljø [43, 44].Tilstedeværelsen af ​​methanogene mikroorganismer i muslinger er ikke overraskende i betragtning af de seneste rapporter om omfattende metanlækager fra bundlækager på Kerguelen-plateauet [45] og mulig mikrobiel metanproduktion observeret ud for Kerguelen-øernes kyst [46].
Vores opmærksomhed skiftede derefter til aflæsninger fra DNA-vira.Så vidt vi ved, er dette den første off-target undersøgelse af virusindholdet i muslinger.Som forventet fandt vi DNA-fragmenter af bakteriofager (Caudovirales) (fig. 6b).Det mest almindelige virale DNA kommer dog fra en filum af nukleocytovira, også kendt som det nukleære cytoplasmatiske store DNA-virus (NCLDV), som har det største genom af enhver virus.Inden for denne phylum tilhører de fleste DNA-sekvenser familierne Mimimidoviridae (58%) og Poxviridae (21%), hvis naturlige værter omfatter hvirveldyr og leddyr, mens en lille del af disse DNA-sekvenser tilhører kendte virologiske alger.Inficerer marine eukaryote alger.Sekvenserne blev også opnået fra Pandora-virussen, den gigantiske virus med den største genomstørrelse af alle kendte virale slægter.Interessant nok var rækken af ​​værter, der vides at være inficeret med virussen, som bestemt ved hæmolymfe ccfDNA-sekventering, relativt stor (figur S3, Supplerende information).Det omfatter vira, der inficerer insekter som Baculoviridae og Iridoviridae, samt vira, der inficerer amøber, alger og hvirveldyr.Vi fandt også sekvenser, der matchede Pithovirus sibericum-genomet.Pitovirus (også kendt som "zombievirus") blev først isoleret fra 30.000 år gammel permafrost i Sibirien [47].Vores resultater er således i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at ikke alle moderne arter af disse vira er uddøde [48], og at disse vira kan være til stede i fjerntliggende subarktiske marine økosystemer.
Til sidst testede vi for at se, om vi kunne finde DNA-fragmenter fra andre flercellede dyr.I alt 482 udenlandske contigs blev identificeret af BLASTN og BLASTX med nt, nr og RefSeq biblioteker (genomisk og protein).Vores resultater viser, at blandt de fremmede fragmenter af ccfDNA fra flercellede dyr dominerer DNA fra knogleknogler (fig. 5).Der er også fundet DNA-fragmenter fra insekter og andre arter.En relativt stor del af DNA-fragmenterne er ikke blevet identificeret, muligvis på grund af underrepræsentationen af ​​et stort antal marine arter i genomiske databaser sammenlignet med terrestriske arter [49].
I denne artikel anvender vi LB-konceptet på muslinger, idet vi argumenterer for, at hæmolymfe ccfDNA-skudsekventering kan give indsigt i sammensætningen af ​​marine kystnære økosystemer.Især fandt vi, at 1) muslingehæmolymfe indeholder relativt høje koncentrationer (mikrogramniveauer) af relativt store (~1-5 kb) cirkulerende DNA-fragmenter;2) disse DNA-fragmenter er både uafhængige og ikke-uafhængige 3) Blandt de fremmede kilder til disse DNA-fragmenter fandt vi bakterielt, arkæalt og viralt DNA samt DNA fra andre flercellede dyr;4) Akkumuleringen af ​​disse fremmede ccfDNA-fragmenter i hæmolymfen sker hurtigt og bidrager til muslingers interne filtreringsaktivitet.Som konklusion viser vores undersøgelse, at begrebet LB, som hidtil hovedsageligt er blevet anvendt inden for biomedicin, koder for en rig, men uudforsket kilde til viden, som kan bruges til bedre at forstå interaktionen mellem vagtfuglearter og deres miljø.
Ud over primater er ccfDNA-isolering blevet rapporteret hos pattedyr, herunder mus, hunde, katte og heste [50, 51, 52].Men så vidt vi ved, er vores undersøgelse den første til at rapportere påvisning og sekventering af ccfDNA i marine arter med et åbent cirkulationssystem.Denne anatomiske egenskab og filtreringsevne hos muslinger kan i det mindste delvist forklare de forskellige størrelseskarakteristika for cirkulerende DNA-fragmenter sammenlignet med andre arter.Hos mennesker er de fleste DNA-fragmenter, der cirkulerer i blodet, små fragmenter, der varierer i størrelse fra 150 til 200 bp.med en maksimal top på 167 bp [34, 53].En lille, men betydelig del af DNA-fragmenter er mellem 300 og 500 bp i størrelse, og omkring 5% er længere end 900 bp.[54].Årsagen til denne størrelsesfordeling er, at hovedkilden til ccfDNA i plasma opstår som et resultat af celledød, enten på grund af celledød eller på grund af nekrose af cirkulerende hæmatopoietiske celler hos raske individer eller på grund af apoptose af tumorceller hos cancerpatienter (kendt som cirkulerende tumor-DNA).ctDNA).Størrelsesfordelingen af ​​hæmolymfe-ccfDNA, som vi fandt i muslinger, varierede fra 1000 til 5000 bp, hvilket tyder på, at muslinge-ccfDNA har en anden oprindelse.Dette er en logisk hypotese, da muslinger har et halvåbent karsystem og lever i marine vandmiljøer, der indeholder høje koncentrationer af mikrobielt genomisk DNA.Faktisk har vores laboratorieforsøg med brug af eksogent DNA vist, at muslinger ophober DNA-fragmenter i havvand, i hvert fald efter et par timer nedbrydes de efter cellulær optagelse og/eller frigives og/eller opbevares i forskellige organisationer.I betragtning af sjældenheden af ​​celler (både prokaryote og eukaryote), vil brugen af ​​intravalvulære rum reducere mængden af ​​ccfDNA fra selvkilder såvel som fra fremmede kilder.I betragtning af vigtigheden af ​​toskallet medfødt immunitet og det store antal cirkulerende fagocytter, antog vi yderligere, at selv fremmed ccfDNA er beriget i cirkulerende fagocytter, der akkumulerer fremmed DNA ved indtagelse af mikroorganismer og/eller celleaffald.Tilsammen viser vores resultater, at toskallet hæmolymfe ccfDNA er et unikt depot af molekylær information og forstærker deres status som en skildvagtsart.
Vores data indikerer, at sekventering og analyse af bakterie-afledte hæmolymfe ccfDNA-fragmenter kan give nøgleoplysninger om værtsbakteriefloraen og bakterierne, der er til stede i det omgivende marine økosystem.Skudsekventeringsteknikker har afsløret sekvenser af den kommensale bakterie A. atra gill, som ville være gået glip af, hvis konventionelle 16S rRNA-identifikationsmetoder var blevet brugt, til dels på grund af en bias i referencebiblioteket.Faktisk viste vores brug af LB-data indsamlet fra M. platensis i det samme muslingelag ved Kerguelen, at sammensætningen af ​​gælleassocierede bakteriesymbionter var den samme for begge muslingearter (Fig. S4, Supplerende Information).Denne lighed mellem to genetisk forskellige muslinger kan afspejle sammensætningen af ​​bakteriesamfund i de kolde, svovlholdige og vulkanske aflejringer i Kerguelen [55, 56, 57, 58].Højere niveauer af svovlreducerende mikroorganismer er blevet velbeskrevet ved høst af muslinger fra bioturberede kystområder [59], såsom Port-au-Frances kyst.En anden mulighed er, at den kommensale muslingeflora kan blive påvirket af horisontal transmission [60, 61].Mere forskning er nødvendig for at bestemme sammenhængen mellem havmiljøet, havbundens overflade og sammensætningen af ​​symbiotiske bakterier i muslinger.Disse undersøgelser er i øjeblikket i gang.
Længden og koncentrationen af ​​hæmolymfe ccfDNA, dets lette rensning og høje kvalitet for at muliggøre hurtig haglgeværsekventering er nogle af de mange fordele ved at bruge muslinge-ccfDNA til at vurdere biodiversiteten i marine kystnære økosystemer.Denne tilgang er især effektiv til at karakterisere virale samfund (viromer) i et givet økosystem [62, 63].I modsætning til bakterier, archaea og eukaryoter indeholder virale genomer ikke fylogenetisk konserverede gener såsom 16S-sekvenser.Vores resultater indikerer, at flydende biopsier fra indikatorarter såsom muslinger kan bruges til at identificere relativt store antal ccfDNA-virusfragmenter, der vides at inficere værter, der typisk bor i kystnære marine økosystemer.Dette inkluderer vira, der vides at inficere protozoer, leddyr, insekter, planter og bakterielle vira (f.eks. bakteriofager).En lignende fordeling blev fundet, da vi undersøgte hæmolymfe-ccfDNA-viromet af blåmuslinger (M. platensis) indsamlet i det samme muslingelag ved Kerguelen (Tabel S2, Supplerende Information).Haglgeværsekventering af ccfDNA er faktisk en ny tilgang, der tager fart i studiet af viromet hos mennesker eller andre arter [21, 37, 64].Denne tilgang er særlig nyttig til at studere dobbeltstrengede DNA-vira, da intet enkelt gen er bevaret blandt alle dobbeltstrengede DNA-vira, der repræsenterer den mest forskelligartede og brede klasse af vira i Baltimore [65].Selvom de fleste af disse vira forbliver uklassificerede og kan omfatte vira fra en fuldstændig ukendt del af den virale verden [66], fandt vi ud af, at viromerne og værtsområderne for muslingerne A. atra og M. platensis falder mellem de to arter.tilsvarende (se figur S3, yderligere information).Denne lighed er ikke overraskende, da den kan afspejle en mangel på selektivitet i optagelsen af ​​DNA til stede i miljøet.Fremtidige undersøgelser med oprenset RNA er i øjeblikket nødvendige for at karakterisere RNA-viromet.
I vores undersøgelse brugte vi en meget streng pipeline tilpasset fra arbejdet fra Kowarski og kolleger [37], som brugte en to-trins sletning af poolede læsninger og contigs før og efter samling af native ccfDNA, hvilket resulterede i en høj andel af ikke-kortlagte læsninger.Derfor kan vi ikke udelukke, at nogle af disse ukortlagte læsninger stadig kan have deres egen oprindelse, primært fordi vi ikke har et referencegenom for denne muslingeart.Vi brugte også denne pipeline, fordi vi var bekymrede over kimærerne mellem selv- og ikke-selv-læsninger og læselængderne genereret af Illumina MiSeq PE75.En anden grund til de fleste ukendte aflæsninger er, at mange af de marine mikrober, især i fjerntliggende områder som Kerguelen, ikke er blevet kommenteret.Vi brugte Illumina MiSeq PE75, idet vi antog ccfDNA-fragmentlængder svarende til humant ccfDNA.Til fremtidige undersøgelser, givet vores resultater, der viser, at hæmolymfe ccfDNA har længere læsninger end mennesker og/eller pattedyr, anbefaler vi at bruge en sekventeringsplatform, der er mere egnet til længere ccfDNA-fragmenter.Denne praksis vil gøre det meget lettere at identificere flere indikationer til en dybere analyse.At opnå den aktuelt utilgængelige komplette A. atra-kernegenomsekvens ville også i høj grad lette skelnen mellem ccfDNA fra egne og ikke-selvkilder.I betragtning af at vores forskning har fokuseret på muligheden for at anvende konceptet flydende biopsi på muslinger, håber vi, at i takt med at dette koncept bliver brugt i fremtidig forskning, vil der blive udviklet nye værktøjer og rørledninger for at øge denne metodes potentiale til at studere muslingers mikrobielle mangfoldighed.marine økosystem.
Som en ikke-invasiv klinisk biomarkør er forhøjede humane plasmaniveauer af ccfDNA forbundet med forskellige sygdomme, vævsskade og stresstilstande [67,68,69].Denne stigning er forbundet med frigivelsen af ​​DNA-fragmenter af egen oprindelse efter vævsskade.Vi behandlede dette problem ved hjælp af akut varmestress, hvor muslinger kortvarigt blev udsat for en temperatur på 30 °C.Vi udførte denne analyse på tre forskellige typer muslinger i tre uafhængige forsøg.Vi fandt dog ingen ændring i ccfDNA-niveauer efter akut varmestress (se figur S5, yderligere information).Denne opdagelse kan i det mindste delvist forklare det faktum, at muslinger har et halvåbent kredsløb og akkumulerer store mængder fremmed DNA på grund af deres høje filtreringsaktivitet.På den anden side kan muslinger, ligesom mange hvirvelløse dyr, være mere modstandsdygtige over for stress-induceret vævsskade, og derved begrænse frigivelsen af ​​ccfDNA i deres hæmolymfe [70, 71].
Hidtil har DNA-analyse af biodiversitet i akvatiske økosystemer hovedsageligt fokuseret på miljø-DNA (eDNA) metabarcoding.Denne metode er dog normalt begrænset i biodiversitetsanalyse, når der anvendes primere.Brugen af ​​shotgun-sekventering omgår begrænsningerne ved PCR og det skæve udvalg af primersæt.Således er vores metode i en vis forstand tættere på den nyligt anvendte high-throughput eDNA Shotgun sekventeringsmetode, som er i stand til direkte at sekventere fragmenteret DNA og analysere næsten alle organismer [72, 73].Der er dog en række grundlæggende problemer, der adskiller LB fra standard eDNA-metoder.Naturligvis er den største forskel mellem eDNA og LB brugen af ​​naturlige filterværter.Brugen af ​​marine arter såsom svampe og muslinger (Dresseina spp.) som et naturligt filter til at studere eDNA er blevet rapporteret [74, 75].Dreissenas undersøgelse brugte dog vævsbiopsier, hvorfra DNA blev ekstraheret.Analyse af ccfDNA fra LB kræver ikke vævsbiopsi, specialiseret og nogle gange dyrt udstyr og logistik forbundet med eDNA eller vævsbiopsi.Faktisk rapporterede vi for nylig, at ccfDNA fra LB kan lagres og analyseres med FTA-støtte uden at opretholde en kølekæde, hvilket er en stor udfordring for forskning i fjerntliggende områder [76].Ekstraktionen af ​​ccfDNA fra flydende biopsier er også enkel og giver højkvalitets-DNA til haglgeværsekventering og PCR-analyse.Dette er en stor fordel i betragtning af nogle af de tekniske begrænsninger forbundet med eDNA-analyse [77].Prøvetagningsmetodens enkelhed og lave pris er også særdeles velegnet til langsigtede overvågningsprogrammer.Ud over deres høje filtreringsevne er et andet velkendt træk ved toskallede den kemiske mucopolysaccharid-sammensætning af deres slim, som fremmer absorptionen af ​​vira [78, 79].Dette gør toskallede til et ideelt naturligt filter til at karakterisere biodiversitet og påvirkningen af ​​klimaændringer i et givet akvatisk økosystem.Selvom tilstedeværelsen af ​​værts-afledte DNA-fragmenter kan ses som en begrænsning af metoden sammenlignet med eDNA, er omkostningerne forbundet med at have et sådant naturligt ccfDNA sammenlignet med eDNA samtidig forståeligt for den store mængde information, der er tilgængelig for sundhedsundersøgelser.offset vært.Dette inkluderer tilstedeværelsen af ​​virale sekvenser integreret i værtsværtens genom.Dette er især vigtigt for muslinger i betragtning af tilstedeværelsen af ​​horisontalt overførte leukæmi-retrovira i toskallede [80, 81].En anden fordel ved LB i forhold til eDNA er, at det udnytter den fagocytiske aktivitet af cirkulerende blodceller i hæmolymfen, som opsluger mikroorganismer (og deres genomer).Fagocytose er hovedfunktionen af ​​blodceller i toskallede [82].Endelig udnytter metoden den høje filtreringskapacitet af muslinger (gennemsnitligt 1,5 l/h havvand) og to-dages cirkulation, som øger blandingen af ​​forskellige lag af havvand, hvilket muliggør indfangning af heterologt eDNA.[83, 84].Muslinge-ccfDNA-analyse er således en interessant vej i betragtning af muslingers ernæringsmæssige, økonomiske og miljømæssige påvirkninger.I lighed med analysen af ​​LB indsamlet fra mennesker åbner denne metode også muligheden for at måle genetiske og epigenetiske ændringer i værts-DNA som reaktion på eksogene stoffer.For eksempel kan tredje generations sekventeringsteknologier forudses til at udføre genomomfattende methyleringsanalyse i naturligt ccfDNA ved hjælp af nanopore-sekventering.Denne proces bør lettes af det faktum, at længden af ​​muslinge-ccfDNA-fragmenterne er ideelt forenelig med langlæste sekventeringsplatforme, der tillader genom-dækkende DNA-methyleringsanalyse fra et enkelt sekventeringsforløb uden behov for kemiske transformationer.85,86] Dette er en interessant mulighed, da det har vist sig, at DNA-respons-methylering over for mange miljøgenerering af stress og vedvarende mønstre afspejler et methyleringsmønster.Derfor kan det give værdifuld indsigt i de underliggende mekanismer, der styrer respons efter eksponering for klimaændringer eller forurenende stoffer [87].Brugen af ​​LB er dog ikke uden begrænsninger.Det er overflødigt at sige, at dette kræver tilstedeværelsen af ​​indikatorarter i økosystemet.Som nævnt ovenfor kræver brug af LB til at vurdere biodiversiteten af ​​et givet økosystem også en streng bioinformatik-pipeline, der tager højde for tilstedeværelsen af ​​DNA-fragmenter fra kilden.Et andet stort problem er tilgængeligheden af ​​referencegenomer for marine arter.Det er håbet, at initiativer såsom Marine Mammal Genomes Project og det nyligt etablerede Fish10k-projekt [88] vil lette en sådan analyse i fremtiden.Anvendelsen af ​​LB-konceptet på marine filterfødende organismer er også kompatibel med de seneste fremskridt inden for sekventeringsteknologi, hvilket gør det velegnet til udvikling af multi-ohm biomarkører til at give vigtig information om sundheden for marine habitater som reaktion på miljøstress.
Genomsekventeringsdata er blevet deponeret i NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 under Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimaændringernes indvirkning på livet i havet og økosystemerne.Cole Biologi.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Overvej de kombinerede virkninger af klimaændringer og andre lokale stressfaktorer på havmiljøet.generelt videnskabeligt miljø.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Videnskab af den første marts.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Reduceret varmetolerance under gentagne varmestressforhold forklarer den høje sommerdødelighed for blåmuslinger.Videnskabelig rapport 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Nylige ændringer i hyppigheden, årsagerne og omfanget af dyredødsfald.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Flere ikke-artsspecifikke patogener kan have forårsaget massedødelighed af Pinna nobilis.Liv.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potentiel indvirkning af klimaændringer på arktiske zoonotiske sygdomme.Int J Cirkumpolær sundhed.2005;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Blåmuslinger (Mytilus edulis spp.) som signalorganismer i kystforureningsovervågning: en gennemgang.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integration af flydende biopsi i kræftbehandling.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531-48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Væskebiopsimodning: Tillader tumor-DNA at cirkulere.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsyrer i humant plasma.Mødereferat for Soc Biol datterselskaber.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. En ny rolle for cellefrit DNA som en molekylær markør for cancerbehandling.Kvantificering af biomolær analyse.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Flydende biopsi kommer ind i klinikken – implementeringsproblemer og fremtidige udfordringer.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297-312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW og andre.Foster-DNA er til stede i moderens plasma og serum.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Undersøgelse af graviditetsforløbet og dets komplikationer ved hjælp af cirkulerende ekstracellulært RNA i blodet hos kvinder under graviditet.Dopædiatri.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Væskebiopsi: donorcellefrit DNA bruges til at påvise allogene læsioner i et nyretransplantat.Nat Rev Nephrol.2021;17:591-603.
Juan FC, Lo YM Innovationer i prænatal diagnostik: moderens plasmagenomsekventering.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Hurtig patogendetektion med næste generations metagenomisk sekventering af inficerede kropsvæsker.Nat Medicin.2021;27:115-24.