Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden typografier og JavaScript.
Flydende biopsi (LB) er et koncept, der hurtigt vinder popularitet inden for det biomedicinske felt. Konceptet er hovedsageligt baseret på detektion af fragmenter af cirkulerende ekstracellulært DNA (ccfDNA), som hovedsageligt frigives som små fragmenter efter celledød i forskellige væv. En lille del af disse fragmenter stammer fra fremmede væv eller organismer. I nuværende arbejde har vi anvendt dette koncept på muslinger, en vagtpostart kendt for deres høje filtreringskapacitet i havvand. Vi bruger muslingers evne til at fungere som naturlige filtre til at indfange miljømæssige DNA-fragmenter fra en række forskellige kilder for at give information om biodiversiteten i marine kystøkosystemer. Vores resultater viser, at muslingers hæmolymfe indeholder DNA-fragmenter, der varierer meget i størrelse, fra 1 til 5 kb. Haglgeværsekventering viste, at et stort antal DNA-fragmenter er af fremmed mikrobiel oprindelse. Blandt dem fandt vi DNA-fragmenter fra bakterier, arkæer og vira, herunder vira, der vides at inficere en række værter, der almindeligvis findes i kystnære marine økosystemer. Afslutningsvis viser vores undersøgelse, at konceptet LB anvendt på muslinger repræsenterer en rig, men endnu uudforsket kilde til viden om mikrobiel diversitet i marine kystøkosystemer.
Klimaændringers (CC) indvirkning på biodiversiteten i marine økosystemer er et hurtigt voksende forskningsområde. Global opvarmning forårsager ikke kun betydelige fysiologiske stressfaktorer, men flytter også de evolutionære grænser for den termiske stabilitet hos marine organismer, hvilket påvirker levestederne for en række arter og får dem til at søge efter mere gunstige forhold [1, 2]. Ud over at påvirke biodiversiteten hos metazoer forstyrrer CC den skrøbelige balance mellem vært-mikrobielle interaktioner. Denne mikrobielle dysbakteriose udgør en alvorlig trussel mod marine økosystemer, da den gør marine organismer mere modtagelige for infektiøse patogener [3, 4]. Det menes, at SS spiller en vigtig rolle i massedødsfald, hvilket er et alvorligt problem for forvaltningen af ​​globale marine økosystemer [5, 6]. Dette er et vigtigt problem i betragtning af de økonomiske, økologiske og ernæringsmæssige konsekvenser af mange marine arter. Dette gælder især for muslinger, der lever i polarområderne, hvor virkningerne af CK er mere umiddelbare og alvorlige [6, 7]. Faktisk bruges muslinger som Mytilus spp. i vid udstrækning til at overvåge virkningerne af CC på marine økosystemer. Ikke overraskende er der blevet udviklet et relativt stort antal biomarkører til at overvåge deres helbred, ofte ved hjælp af en todelt tilgang, der involverer funktionelle biomarkører baseret på enzymatisk aktivitet eller cellulære funktioner såsom cellelevedygtighed og fagocytisk aktivitet [8]. Disse metoder omfatter også måling af koncentrationen af ​​specifikke trykindikatorer, der akkumuleres i blødt væv efter absorption af store mængder havvand. Den høje filtreringskapacitet og det semi-åbne kredsløbssystem hos muslinger giver dog mulighed for at udvikle nye hæmolymfebiomarkører ved hjælp af konceptet med flydende biopsi (LB), en simpel og minimalt invasiv tilgang til patientbehandling af blodprøver [9, 10]. Selvom flere typer cirkulerende molekyler kan findes i humane LB, er dette koncept primært baseret på DNA-sekventeringsanalyse af cirkulerende ekstracellulære DNA (ccfDNA)-fragmenter i plasma. Faktisk har tilstedeværelsen af ​​cirkulerende DNA i humant plasma været kendt siden midten af ​​det 20. århundrede [11], men det er først i de senere år, at fremkomsten af ​​højkapacitetssekventeringsmetoder har ført til klinisk diagnose baseret på ccfDNA. Tilstedeværelsen af ​​disse cirkulerende DNA-fragmenter skyldes delvist den passive frigivelse af genomisk DNA (nukleært og mitokondrielt) efter celledød. Hos raske individer er koncentrationen af ​​ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan øges 5-10 gange hos patienter, der lider af forskellige patologier eller udsættes for stress, hvilket resulterer i vævsskade. Hos raske individer er koncentrationen af ​​ccfDNA normalt lav (<10 ng/ml), men kan øges 5-10 gange hos patienter, der lider af forskellige patologier eller udsættes for stress, hvilket resulterer i vævsskade. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/ml), но может повышаться в 5-10 сразнычно. патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Hos raske mennesker er koncentrationen af ​​cccDNA normalt lav (<10 ng/ml), men den kan stige 5-10 gange hos patienter med forskellige patologier eller under stress, der fører til vævsskade.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，滎而导燴组在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 刏 扊 兿 刖 扊中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/ml) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 расично. патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. ccfDNA-koncentrationerne er normalt lave (<10 ng/ml) hos raske individer, men kan øges 5-10 gange hos patienter med forskellige patologier eller stress, hvilket resulterer i vævsskade.Størrelsen af ​​ccfDNA-fragmenter varierer meget, men ligger normalt fra 150 til 200 bp. [12]. Analyse af selvafledt ccfDNA, dvs. ccfDNA fra normale eller transformerede værtsceller, kan bruges til at detektere genetiske og epigenetiske ændringer i det nukleare og/eller mitokondrielle genom, hvorved klinikere kan vælge specifikke molekylært målrettede terapier [13]. CcfDNA kan dog opnås fra fremmede kilder, såsom ccfDNA fra føtale celler under graviditet eller fra transplanterede organer [14,15,16,17]. ccfDNA er også en vigtig informationskilde til at detektere tilstedeværelsen af ​​nukleinsyrer fra et infektiøst agens (fremmed), hvilket muliggør ikke-invasiv detektion af udbredte infektioner, der ikke identificeres ved blodkulturer, hvilket undgår invasiv biopsi af inficeret væv [18]. Nylige undersøgelser har faktisk vist, at humant blod indeholder en rig kilde til information, der kan bruges til at identificere virale og bakterielle patogener, og at omkring 1% af det ccfDNA, der findes i humant plasma, er af fremmed oprindelse [19]. Disse studier viser, at biodiversiteten i en organismes cirkulerende mikrobiom kan vurderes ved hjælp af ccfDNA-analyse. Indtil for nylig blev dette koncept dog udelukkende anvendt hos mennesker og i mindre grad hos andre hvirveldyr [20, 21].
I denne artikel bruger vi LB-potentialet til at analysere ccfDNA'et hos Aulacomya atra, en sydlig art, der almindeligvis findes på de subantarktiske Kerguelenøer, en gruppe øer oven på et stort plateau, der blev dannet for 35 millioner år siden. Ved hjælp af et in vitro-eksperimentelt system fandt vi, at DNA-fragmenter i havvand hurtigt optages af muslinger og trænger ind i hæmolymfe-rummet. Haglgeværsekventering har vist, at muslinges hæmolymfe-ccfDNA indeholder DNA-fragmenter af egen og ikke-selvoprindelse, herunder symbiotiske bakterier og DNA-fragmenter fra biomer, der er typiske for kolde vulkanske marine kystøkosystemer. Hæmolymfe-ccfDNA indeholder også virussekvenser afledt af virus med forskellige værtsområder. Vi fandt også DNA-fragmenter fra flercellede dyr såsom benfisk, søanemoner, alger og insekter. Afslutningsvis viser vores undersøgelse, at LB-konceptet med succes kan anvendes på marine hvirvelløse dyr for at generere et rigt genomisk repertoire i marine økosystemer.
Voksne (55-70 mm lange) Mytilus platensis (M. platensis) og Aulacomya atra (A. atra) blev indsamlet fra de tidevandsmæssige klippekyster ved Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 Ø). Kerguelenøerne i december 2018. Andre voksne blåmuslinger (Mytilus spp.) blev indkøbt fra en kommerciel leverandør (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) og placeret i en temperaturkontrolleret (4°C) luftet tank indeholdende 10-20 liter 32‰ kunstig saltlage (kunstig havsalt Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). For hvert forsøg blev længden og vægten af ​​de enkelte skaller målt.
En gratis, åben adgangsprotokol til dette program er tilgængelig online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kort fortalt blev LB-hæmolymfe indsamlet fra abduktormuskler som beskrevet [22]. Hæmolymfen blev klaret ved centrifugering ved 1200 × g i 3 minutter, og supernatanten blev frosset (-20 °C) indtil brug. Til isolering og oprensning af cfDNA blev prøver (1,5-2,0 ml) optøet og behandlet ved hjælp af NucleoSnap cfDNA-kittet (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) i henhold til producentens instruktioner. ccfDNA blev opbevaret ved -80 °C indtil yderligere analyse. I nogle eksperimenter blev ccfDNA isoleret og oprenset ved hjælp af QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). Oprenset DNA blev kvantificeret ved hjælp af et standard PicoGreen-assay. Fragmentfordelingen af ​​det isolerede ccfDNA blev analyseret ved kapillærelektroforese ved hjælp af en Agilent 2100 bioanalysator (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) med et High Sensitivity DNA Kit. Assayet blev udført med 1 µl af ccfDNA-prøven i henhold til producentens instruktioner.
Til sekventering af hæmolymfe ccfDNA-fragmenter fremstillede Genome Québec (Montreal, Quebec, Canada) shotgun-biblioteker ved hjælp af Illumina DNA Mix-kittet fra Illumina MiSeq PE75-kittet. En standardadapter (BioO) blev anvendt. Rådatafiler er tilgængelige fra NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 og SRR8924809). Grundlæggende aflæsningskvalitet blev vurderet ved hjælp af FastQC [23]. Trimmomatic [24] er blevet anvendt til klipningsadaptere og aflæsninger af dårlig kvalitet. Shotgun-aflæsninger med parrede ender blev FLASH-fusioneret til længere enkeltaflæsninger med et minimumsoverlap på 20 bp for at undgå uoverensstemmelser [25]. Sammenflettede aflæsninger blev annoteret med BLASTN ved hjælp af en toskallede NCBI-taksonomidatabase (e-værdi < 1e−3 og 90% homologi), og maskering af lavkomplekse sekvenser blev udført ved hjælp af DUST [26]. Sammenflettede aflæsninger blev annoteret med BLASTN ved hjælp af en toskallede NCBI-taksonomidatabase (e-værdi < 1e−3 og 90% homologi), og maskering af lavkomplekse sekvenser blev udført ved hjælp af DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии BINCOVER (nedsat e < 1e-3 og 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельном с ис. De samlede aflæsninger blev annoteret med BLASTN ved hjælp af NCBI's bivalve-taksonomidatabase (e-værdi < 1e-3 og 90% homologi), og lavkompleks sekvensmaskering blev udført ved hjælp af DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的伿幕2]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 诽濹 2 ，进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных молхчовский (nedsat e <1e-3 og 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнельнель с исп6] D. Poolede aflæsninger blev annoteret med BLASTN ved hjælp af NCBI's taksonomiske database for muslinger (e-værdi <1e-3 og 90% homologi), og lavkompleks sekvensmaskering blev udført ved hjælp af DUST [26].Aflæsningerne blev opdelt i to grupper: relaterede til muslingesekvenser (her kaldet selvaflæsninger) og ikke-relaterede (ikke-selvaflæsninger). To grupper blev samlet separat ved hjælp af MEGAHIT for at generere contigs [27]. I mellemtiden blev den taksonomiske fordeling af fremmede mikrobiomaflæsninger klassificeret ved hjælp af Kraken2 [28] og grafisk repræsenteret af et Krona-tærtediagram på Galaxy [29, 30]. De optimale kmere blev bestemt til at være kmere-59 ud fra vores indledende eksperimenter. Selv-contigs blev derefter identificeret ved alignment med BLASTN (bivalve NCBI-database, e-værdi < 1e-10 og 60% homologi) for en endelig annotation. Selv-contigs blev derefter identificeret ved alignment med BLASTN (bivalve NCBI-database, e-værdi < 1e-10 og 60% homologi) for en endelig annotation. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN. <1e-10 og гомология 60%) til окончательной аннотации. Selv-contigs blev derefter identificeret ved matchning mod BLASTN (NCBI toskallede database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi) med henblik på endelig annotation.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (BiNC for BLASTN) двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Selv-contigs blev derefter identificeret til endelig annotation ved matchning mod BLASTN (NCBI toskallede database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi). Parallelt blev ikke-selv-gruppecontigs annoteret med BLASTN (nt NCBI-database, e-værdi < 1e-10 og 60% homologi). Parallelt blev ikke-selv-gruppecontigs annoteret med BLASTN (nt NCBI-database, e-værdi < 1e-10 og 60% homologi). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (baseret på NCBI, 1. januar 10. januar) 60 %). Parallelt blev fremmede gruppecontigs annoteret med BLASTN (NT NCBI-database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN. <1e-10 og гомология 60 %). Parallelt blev ikke-selvgruppecontigs annoteret med BLASTN (nt NCBI-database, e-værdi <1e-10 og 60% homologi). BLASTX blev også udført på ikke-selv-contigs ved hjælp af nr- og RefSeq-protein-NCBI-databaserne (e-værdi < 1e-10 og 60% homologi). BLASTX blev også udført på ikke-selv-contigs ved hjælp af nr- og RefSeq-protein-NCBI-databaserne (e-værdi < 1e-10 og 60% homologi). BLASTX er klar til brug for несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr. и RefSeq NCBI (sen. <1e-1e. гомология 60 %). BLASTX blev også udført på ikke-selv-contigs ved hjælp af nr- og RefSeq NCBI-proteindatabaserne (e-værdi < 1e-10 og 60% homologi).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 咧怉 吺 吺 BLASTX taler til несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr. и RefSeq NCBI (september <1e-1) гомология 60 %). BLASTX blev også udført på ikke-selv-contigs ved hjælp af nr- og RefSeq NCBI-proteindatabaserne (e-værdi <1e-10 og 60% homologi).BLASTN- og BLASTX-puljerne af ikke-selv-contigs repræsenterer de endelige contigs (se Supplerende fil).
Primerne anvendt til PCR er anført i tabel S1. Taq DNA-polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) blev anvendt til at amplificere ccfDNA-målgenerne. Følgende reaktionsbetingelser blev anvendt: denaturering ved 95 °C i 3 minutter, 95 °C i 1 minut, indstillet annealingtemperatur i 1 minut, forlængelse ved 72 °C i 1 minut, 35 cyklusser og endelig 72 °C inden for 10 minutter. PCR-produkter blev separeret ved elektroforese i agarosegeler (1,5 %) indeholdende SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) ved 95 V.
Muslinger (Mytilus spp.) blev akklimatiseret i 500 ml iltet havvand (32 PSU) i 24 timer ved 4°C. Plasmid-DNA indeholdende et insert, der koder for den humane galectin-7 cDNA-sekvens (NCBI-accessionsnummer L07769), blev tilsat hætteglasset i en slutkoncentration på 190 μg/μl. Muslinger inkuberet under de samme forhold uden DNA-tilsætning udgjorde kontrolgruppen. Den tredje kontroltank indeholdt DNA uden muslinger. For at overvåge DNA-kvaliteten i havvand blev der taget havvandsprøver (20 μl; tre gentagelser) fra hver tank på det angivne tidspunkt. For at sikre sporbarhed af plasmid-DNA blev LB-muslinger høstet på de angivne tidspunkter og analyseret ved hjælp af qPCR og ddPCR. På grund af det høje saltindhold i havvand blev aliquoter fortyndet i vand af PCR-kvalitet (1:10) før alle PCR-analyser.
Digital dråbe-PCR (ddPCR) blev udført ved hjælp af BioRad QX200-protokollen (Mississauga, Ontario, Canada). Brug temperaturprofilen til at bestemme den optimale temperatur (Tabel S1). Dråber blev genereret ved hjælp af en QX200 dråbegenerator (BioRad). ddPCR blev udført som følger: 95 °C i 5 min, 50 cyklusser af 95 °C i 30 s og en given annealingtemperatur i 1 min og 72 °C i 30 s, 4 °C i 5 min og 90 °C inden for 5 minutter. Antallet af dråber og positive reaktioner (antal kopier/µl) blev målt ved hjælp af en QX200 dråbelæser (BioRad). Prøver med mindre end 10.000 dråber blev kasseret. Mønsterkontrol blev ikke udført hver gang ddPCR blev kørt.
qPCR blev udført ved hjælp af Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) og LGALS7-specifikke primere. Alle kvantitative PCR'er blev udført i 20 µl ved hjælp af QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR blev startet med en 15 minutters inkubation ved 95 °C efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 °C i 10 sekunder og ved 60 °C i 60 sekunder med én dataindsamling. Smeltekurver blev genereret ved hjælp af successive målinger ved 95 °C i 5 sekunder, 65 °C i 60 sekunder og 97 °C ved afslutningen af ​​qPCR'en. Hver qPCR blev udført i triplikat, bortset fra kontrolprøverne.
Da muslinger er kendt for deres høje filtreringshastighed, undersøgte vi først, om de kunne filtrere og tilbageholde DNA-fragmenter, der findes i havvand. Vi var også interesserede i, om disse fragmenter akkumuleres i deres halvåbne lymfesystem. Vi løste dette problem eksperimentelt ved at spore skæbnen af ​​opløselige DNA-fragmenter, der blev tilsat blåmuslingetanke. For at lette sporing af DNA-fragmenter brugte vi fremmed (ikke selv-) plasmid-DNA, der indeholdt det humane galectin-7-gen. ddPCR sporer plasmid-DNA-fragmenter i havvand og muslinger. Vores resultater viser, at hvis mængden af ​​DNA-fragmenter i havvand forblev relativt konstant over tid (op til 7 dage) i fravær af muslinger, så forsvandt dette niveau næsten fuldstændigt inden for 8 timer i nærvær af muslinger (fig. 1a, b). Fragmenter af eksogent DNA blev let detekteret inden for 15 minutter i intravalvulær væske og hæmolymfe (fig. 1c). Disse fragmenter kunne stadig detekteres op til 4 timer efter eksponering. Denne filtreringsaktivitet i forhold til DNA-fragmenter er sammenlignelig med filtreringsaktiviteten hos bakterier og alger [31]. Disse resultater tyder på, at muslinger kan filtrere og akkumulere fremmed DNA i deres væskekompartmenter.
Relative koncentrationer af plasmid-DNA i havvand i nærvær (A) eller fravær (B) af muslinger, målt ved ddPCR. I A er resultaterne udtrykt som procentdele, hvor boksenes kanter repræsenterer 75. og 25. percentil. Den tilpassede logaritmiske kurve er vist med rødt, og det grå område repræsenterer 95%-konfidensintervallet. I B repræsenterer den røde linje middelværdien, og den blå linje repræsenterer 95%-konfidensintervallet for koncentrationen. C Akkumulering af plasmid-DNA i hæmolymfen og klapvæsken hos muslinger på forskellige tidspunkter efter tilsætning af plasmid-DNA. Resultaterne præsenteres som absolutte kopier detekteret/ml (±SE).
Dernæst undersøgte vi oprindelsen af ​​ccfDNA i muslinger indsamlet fra muslingebanker på Kerguelenøerne, en fjerntliggende øgruppe med begrænset menneskeskabt indflydelse. Til dette formål blev cccDNA fra muslingehæmolymfer isoleret og oprenset ved hjælp af metoder, der almindeligvis anvendes til at oprense humant cccDNA [32, 33]. Vi fandt, at gennemsnitlige koncentrationer af hæmolymfe-ccfDNA i muslinger ligger i det lave område af mikrogram pr. ml hæmolymfe (se tabel S2, supplerende information). Dette koncentrationsområde er meget større end hos raske mennesker (lave nanogram pr. milliliter), men i sjældne tilfælde, hos kræftpatienter, kan niveauet af ccfDNA nå flere mikrogram pr. milliliter [34, 35]. En analyse af størrelsesfordelingen af ​​hæmolymfe-ccfDNA viste, at disse fragmenter varierer meget i størrelse, fra 1000 bp til 1000 bp og op til 5000 bp (fig. 2). Lignende resultater blev opnået ved hjælp af det silicabaserede QIAamp Investigator Kit, en metode, der almindeligvis anvendes i retsmedicin til hurtigt at isolere og oprense genomisk DNA fra DNA-prøver med lav koncentration, herunder ccfDNA [36].
Repræsentativt ccfDNA-elektroforegram af muslingehæmolymfe. Ekstraheret med NucleoSnap Plasma Kit (øverst) og QIAamp DNA Investigator Kit. B Violinplot, der viser fordelingen af ​​hæmolymfe-ccfDNA-koncentrationer (±SE) i muslinger. De sorte og røde linjer repræsenterer henholdsvis medianen og den første og tredje kvartil.
Cirka 1% af ccfDNA hos mennesker og primater har en fremmed kilde [21, 37]. I betragtning af det halvåbne kredsløbssystem hos muslinger, mikrobielt rige havvand og størrelsesfordelingen af ​​muslingers ccfDNA, fremsatte vi en hypotese om, at muslingers hæmolymfe-ccfDNA kan indeholde en rig og forskelligartet pulje af mikrobielt DNA. For at teste denne hypotese sekventerede vi hæmolymfe-ccfDNA fra Aulacomya atra-prøver indsamlet fra Kerguelenøerne, hvilket gav over 10 millioner aflæsninger, hvoraf 97,6% bestod kvalitetskontrollen. Aflæsningerne blev derefter klassificeret efter selv- og ikke-selvkilder ved hjælp af BLASTN- og NCBI-muslingedatabaserne (fig. S1, supplerende information).
Hos mennesker kan både nukleart og mitokondrie-DNA frigives til blodbanen [38]. I den foreliggende undersøgelse var det imidlertid ikke muligt at beskrive det nukleare genomiske DNA hos muslinger i detaljer, da A. atra-genomet ikke er blevet sekventeret eller beskrevet. Vi var dog i stand til at identificere et antal ccfDNA-fragmenter af vores egen oprindelse ved hjælp af muslingebiblioteket (fig. S2, supplerende information). Vi bekræftede også tilstedeværelsen af ​​DNA-fragmenter af vores egen oprindelse ved rettet PCR-amplifikation af de A. atra-gener, der blev sekventeret (fig. 3). Tilsvarende, da A. atras mitokondrie-genom er tilgængeligt i offentlige databaser, kan man finde beviser for tilstedeværelsen af ​​mitokondrie-ccfDNA-fragmenter i hæmolymfen hos A. atra. Tilstedeværelsen af ​​mitokondrie-DNA-fragmenter blev bekræftet ved PCR-amplifikation (fig. 3).
Forskellige mitokondrielle gener var til stede i hæmolymfen hos A. atra (røde prikker – lagernummer: SRX5705969) og M. platensis (blå prikker – lagernummer: SRX5705968) amplificeret ved PCR. Figur tilpasset fra Breton et al., 2011 B Amplifikation af hæmolymfesupernatant fra A. atra Opbevaret på FTA-papir. Brug en 3 mm dorn til at tilsætte direkte til PCR-røret, der indeholder PCR-blandingen.
I betragtning af det rigelige mikrobielle indhold i havvand fokuserede vi i første omgang på karakterisering af mikrobielle DNA-sekvenser i hæmolymfe. For at gøre dette bruger vi to forskellige strategier. Den første strategi brugte Kraken2, et algoritmebaseret sekvensklassificeringsprogram, der kan identificere mikrobielle sekvenser med en nøjagtighed, der kan sammenlignes med BLAST og andre værktøjer [28]. Mere end 6719 aflæsninger blev bestemt til at være af bakteriel oprindelse, mens 124 og 64 var fra henholdsvis arkæer og virus (fig. 4). De mest udbredte bakterielle DNA-fragmenter var Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) og Bacteroidetes (17%) (fig. 4a). Denne fordeling er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af det marine blåmuslingemikrobiom [39, 40]. Gammaproteobakterier var hovedklassen af ​​Proteobacteria (44%), inklusive mange Vibrionales (fig. 4b). ddPCR-metoden bekræftede tilstedeværelsen af ​​Vibrio-DNA-fragmenter i ccfDNA'et fra A. atra-hæmolymfen (fig. 4c) [41]. For at opnå mere information om ccfDNA'ets bakterielle oprindelse blev der anvendt en yderligere tilgang (fig. S2, supplerende information). I dette tilfælde blev de overlappende aflæsninger samlet som parvise aflæsninger og klassificeret som af selv- (muslinger) eller ikke-selv-oprindelse ved hjælp af BLASTN og en e-værdi på 1e-3 og en afskæring med >90% homologi. I dette tilfælde blev de overlappende aflæsninger samlet som parvise aflæsninger og klassificeret som af selv- (muslinger) eller ikke-selv-oprindelse ved hjælp af BLASTN og en e-værdi på 1e-3 og en afskæring med >90% homologi. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классиф (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения > 0%. I dette tilfælde blev overlappende aflæsninger indsamlet som parvise aflæsninger og klassificeret som native (toskallede) eller ikke-originale ved hjælp af BLASTN og e-værdi på 1e-3 og cutoff med >90% homologi.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和和叠3 皒e> 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 , 使用 使用 使用 使焚 焚 焚 的 的 用值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классианфициров (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN og 1e-3 и порог. I dette tilfælde blev overlappende aflæsninger indsamlet som parvise aflæsninger og klassificeret som egne (muslinger) eller ikke-originale ved hjælp af e BLASTN- og 1e-3-værdier og en homologitærskel >90%.Da A. atra-genomet endnu ikke er blevet sekventeret, anvendte vi de novo-assemblingsstrategien fra MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-assembleren. I alt 147.188 contigs er blevet identificeret som afhængige (muslinger) af oprindelse. Disse contigs blev derefter eksploderet med e-værdier på 1e-10 ved hjælp af BLASTN og BLASTX. Denne strategi tillod os at identificere 482 ikke-muslingefragmenter, der findes i A. atra ccfDNA. Mere end halvdelen (57%) af disse DNA-fragmenter blev opnået fra bakterier, primært fra gællesymbionter, herunder sulfotrofe symbionter, og fra gællesymbionterne Solemya velum (fig. 5).
Relativ forekomst på typeniveau. B Mikrobiel diversitet af to hovedfyla (Firmicutes og Proteobacteria). Repræsentativ amplifikation af ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenter af 16S rRNA-genet (blåt) i tre atra-hæmolymfer.
I alt 482 indsamlede contigs blev analyseret. Generel profil af den taksonomiske fordeling af metagenomiske contig-annotationer (prokaryoter og eukaryoter). B Detaljeret fordeling af bakterielle DNA-fragmenter identificeret ved BLASTN og BLASTX.
Kraken2-analyse viste også, at muslingers ccfDNA indeholdt arkæiske DNA-fragmenter, herunder DNA-fragmenter fra Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) og Thaurmarcheota (11%) (fig. 6a). Tilstedeværelsen af ​​DNA-fragmenter afledt af Euryarchaeota og Crenarchaeota, som tidligere er fundet i det mikrobielle samfund af californiske muslinger, burde ikke komme som en overraskelse [42]. Selvom Euryarchaeota ofte er forbundet med ekstreme forhold, er det nu anerkendt, at både Euryarchaeota og Crenarcheota er blandt de mest almindelige prokaryoter i det marine kryogene miljø [43, 44]. Tilstedeværelsen af ​​metanogene mikroorganismer i muslinger er ikke overraskende i betragtning af de seneste rapporter om omfattende metanlækager fra bundlækager på Kerguelenplateauet [45] og mulig mikrobiel metanproduktion observeret ud for Kerguelenøernes kyst [46].
Vores opmærksomhed skiftede derefter til aflæsninger fra DNA-vira. Så vidt vi ved, er dette den første off-target-undersøgelse af virusindholdet i muslinger. Som forventet fandt vi DNA-fragmenter fra bakteriofager (Caudovirales) (fig. 6b). Det mest almindelige virale DNA kommer dog fra en række af nukleocytovirusser, også kendt som den nukleære cytoplasmatiske store DNA-virus (NCLDV), som har det største genom af alle vira. Inden for denne række tilhører de fleste DNA-sekvenser familierne Mimimidoviridae (58%) og Poxviridae (21%), hvis naturlige værter omfatter hvirveldyr og leddyr, mens en lille andel af disse DNA-sekvenser tilhører kendte virologiske alger. Inficerer marine eukaryote alger. Sekvenserne blev også opnået fra Pandora-virussen, den kæmpevirus med den største genomstørrelse af alle kendte virale slægter. Interessant nok var udvalget af værter, der vides at være inficeret med virussen, bestemt ved hæmolymfe ccfDNA-sekventering, relativt stort (figur S3, supplerende information). Det omfatter vira, der inficerer insekter såsom Baculoviridae og Iridoviridae, samt vira, der inficerer amøber, alger og hvirveldyr. Vi fandt også sekvenser, der matcher Pithovirus sibericum-genomet. Pitovirus (også kendt som "zombievirus") blev først isoleret fra 30.000 år gammel permafrost i Sibirien [47]. Vores resultater er således i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at ikke alle moderne arter af disse vira er uddøde [48], og at disse vira kan være til stede i fjerntliggende subarktiske marine økosystemer.
Endelig testede vi, om vi kunne finde DNA-fragmenter fra andre flercellede dyr. I alt 482 fremmede contigs blev identificeret af BLASTN og BLASTX med nt-, nr- og RefSeq-biblioteker (genomiske og protein). Vores resultater viser, at blandt de fremmede fragmenter af ccfDNA fra flercellede dyr dominerer DNA fra knogler (fig. 5). DNA-fragmenter fra insekter og andre arter er også blevet fundet. En relativt stor del af DNA-fragmenterne er ikke blevet identificeret, muligvis på grund af underrepræsentationen af ​​et stort antal marine arter i genomiske databaser sammenlignet med terrestriske arter [49].
I denne artikel anvender vi LB-konceptet på muslinger og argumenterer for, at hæmolymfe-ccfDNA-sekvensering kan give indsigt i sammensætningen af ​​marine kystøkosystemer. Vi fandt især, at 1) muslinges hæmolymfe indeholder relativt høje koncentrationer (mikrogramniveauer) af relativt store (~1-5 kb) cirkulerende DNA-fragmenter; 2) disse DNA-fragmenter er både uafhængige og ikke-uafhængige; 3) Blandt de fremmede kilder til disse DNA-fragmenter fandt vi bakterielt, arkæalt og viralt DNA, såvel som DNA fra andre flercellede dyr; 4) Akkumuleringen af ​​disse fremmede ccfDNA-fragmenter i hæmolymfen sker hurtigt og bidrager til muslingers interne filtreringsaktivitet. Afslutningsvis viser vores undersøgelse, at LB-konceptet, som hidtil primært er blevet anvendt inden for biomedicin, koder for en rig, men uudforsket kilde til viden, der kan bruges til bedre at forstå interaktionen mellem sentinelarter og deres miljø.
Ud over primater er ccfDNA-isolering blevet rapporteret hos pattedyr, herunder mus, hunde, katte og heste [50, 51, 52]. Så vidt vi ved, er vores undersøgelse dog den første, der rapporterer detektion og sekventering af ccfDNA hos marine arter med et åbent cirkulationssystem. Denne anatomiske egenskab og filtreringsevne hos muslinger kan i det mindste delvist forklare de forskellige størrelseskarakteristika for cirkulerende DNA-fragmenter sammenlignet med andre arter. Hos mennesker er de fleste DNA-fragmenter, der cirkulerer i blodet, små fragmenter, der varierer i størrelse fra 150 til 200 bp med en maksimal top på 167 bp [34, 53]. En lille, men betydelig del af DNA-fragmenterne er mellem 300 og 500 bp i størrelse, og omkring 5% er længere end 900 bp [54]. Årsagen til denne størrelsesfordeling er, at den primære kilde til ccfDNA i plasma opstår som følge af celledød, enten på grund af celledød eller på grund af nekrose af cirkulerende hæmatopoietiske celler hos raske individer eller på grund af apoptose af tumorceller hos kræftpatienter (kendt som cirkulerende tumor-DNA, ctDNA). Størrelsesfordelingen af ​​hæmolymfe-ccfDNA, som vi fandt i muslinger, varierede fra 1000 til 5000 bp, hvilket tyder på, at muslingers ccfDNA har en anden oprindelse. Dette er en logisk hypotese, da muslinger har et halvåbent vaskulært system og lever i marine akvatiske miljøer, der indeholder høje koncentrationer af mikrobielt genomisk DNA. Faktisk har vores laboratorieforsøg med eksogent DNA vist, at muslinger akkumulerer DNA-fragmenter i havvand, i det mindste efter et par timer nedbrydes de efter cellulær optagelse og/eller frigives og/eller opbevares i forskellige organisationer. I betragtning af cellernes sjældenhed (både prokaryote og eukaryote) vil brugen af ​​intravalvulære rum reducere mængden af ​​ccfDNA fra egne kilder såvel som fra fremmede kilder. I betragtning af vigtigheden af ​​​​medfødt immunitet hos muslinger og det store antal cirkulerende fagocytter, fremsatte vi yderligere en hypotese om, at selv fremmed ccfDNA er beriget med cirkulerende fagocytter, der akkumulerer fremmed DNA ved indtagelse af mikroorganismer og/eller cellulært affald. Samlet set viser vores resultater, at ccfDNA fra muslingers hæmolymfe er et unikt lager af molekylær information og styrker deres status som en sentinelart.
Vores data indikerer, at sekventering og analyse af bakterieafledte hæmolymfe-ccfDNA-fragmenter kan give nøgleinformation om værtens bakterieflora og de bakterier, der er til stede i det omgivende marine økosystem. Skudsekventeringsteknikker har afsløret sekvenser af den kommensale bakterie A. atra gill, som ville være blevet overset, hvis konventionelle 16S rRNA-identifikationsmetoder var blevet anvendt, delvist på grund af en referencebiblioteksbias. Faktisk viste vores brug af LB-data indsamlet fra M. platensis i det samme muslingelag ved Kerguelen, at sammensætningen af ​​gælleassocierede bakterielle symbionter var den samme for begge muslingearter (fig. S4, supplerende information). Denne lighed mellem to genetisk forskellige muslinger kan afspejle sammensætningen af ​​bakteriesamfund i de kolde, svovlholdige og vulkanske aflejringer i Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Højere niveauer af svovlreducerende mikroorganismer er blevet velbeskrevet ved høst af muslinger fra bioturberede kystområder [59], såsom Port-au-Frances kyst. En anden mulighed er, at muslingefloraen kan være påvirket af horisontal transmission [60, 61]. Mere forskning er nødvendig for at bestemme sammenhængen mellem havmiljøet, havbundens overflade og sammensætningen af ​​symbiotiske bakterier i muslinger. Disse undersøgelser er i øjeblikket i gang.
Længden og koncentrationen af ​​hæmolymfe ccfDNA, dets lette oprensning og høje kvalitet, der muliggør hurtig shotgun-sekventering, er nogle af de mange fordele ved at bruge muslinge-ccfDNA til at vurdere biodiversitet i marine kystøkosystemer. Denne tilgang er især effektiv til at karakterisere virussamfund (viromer) i et givet økosystem [62, 63]. I modsætning til bakterier, arkæer og eukaryoter indeholder virusgenomer ikke fylogenetisk konserverede gener såsom 16S-sekvenser. Vores resultater indikerer, at flydende biopsier fra indikatorarter såsom muslinger kan bruges til at identificere relativt store antal ccfDNA-virusfragmenter, der vides at inficere værter, der typisk bebor kystnære marine økosystemer. Dette inkluderer vira, der vides at inficere protozoer, leddyr, insekter, planter og bakterievirus (f.eks. bakteriofager). En lignende fordeling blev fundet, da vi undersøgte hæmolymfe ccfDNA-viromet hos blåmuslinger (M. platensis) indsamlet i det samme muslingelag ved Kerguelen (Tabel S2, Supplerende Information). Shotgun-sekventering af ccfDNA er i sandhed en ny tilgang, der vinder frem i studiet af viromet hos mennesker eller andre arter [21, 37, 64]. Denne tilgang er især nyttig til at studere dobbeltstrengede DNA-vira, da intet enkelt gen er bevaret blandt alle dobbeltstrengede DNA-vira, hvilket repræsenterer den mest forskelligartede og brede klasse af vira i Baltimore [65]. Selvom de fleste af disse vira forbliver uklassificerede og kan omfatte vira fra en fuldstændig ukendt del af den virale verden [66], fandt vi, at viromerne og værtsområderne for muslingerne A. atra og M. platensis falder mellem de to arter på samme måde (se figur S3, yderligere information). Denne lighed er ikke overraskende, da den kan afspejle en manglende selektivitet i optagelsen af ​​DNA, der er til stede i miljøet. Fremtidige undersøgelser med oprenset RNA er i øjeblikket nødvendige for at karakterisere RNA-viromet.
I vores undersøgelse anvendte vi en meget stringent pipeline tilpasset fra Kowarski og kollegers arbejde [37], som anvendte en totrinsdeletion af poolede reads og contigs før og efter samling af nativt ccfDNA, hvilket resulterede i en høj andel af ikke-kortlagte reads. Derfor kan vi ikke udelukke, at nogle af disse ikke-kortlagte reads stadig kan have deres egen oprindelse, primært fordi vi ikke har et referencegenom for denne muslingeart. Vi anvendte også denne pipeline, fordi vi var bekymrede over kimærerne mellem selv- og ikke-selv-reads og de readlængder, der genereres af Illumina MiSeq PE75. En anden grund til størstedelen af ​​ikke-kortlagte reads er, at mange af de marine mikrober, især i fjerntliggende områder som Kerguelen, ikke er blevet annoteret. Vi anvendte Illumina MiSeq PE75, under antagelse af ccfDNA-fragmentlængder svarende til humant ccfDNA. I betragtning af vores resultater, der viser, at hæmolymfe-ccfDNA har længere reads end menneskers og/eller pattedyrs, anbefaler vi til fremtidige undersøgelser at bruge en sekventeringsplatform, der er mere egnet til længere ccfDNA-fragmenter. Denne praksis vil gøre det meget lettere at identificere flere indikationer for dybere analyse. Indhentning af den i øjeblikket utilgængelige komplette A. atra-nukleare genomsekvens ville også i høj grad lette diskrimineringen af ​​ccfDNA fra selv- og ikke-selv-kilder. I betragtning af at vores forskning har fokuseret på muligheden for at anvende konceptet med flydende biopsi på muslinger, håber vi, at når dette koncept bruges i fremtidig forskning, vil der blive udviklet nye værktøjer og pipelines for at øge potentialet af denne metode til at studere den mikrobielle diversitet i muslinger og det marine økosystem.
Som en ikke-invasiv klinisk biomarkør er forhøjede humane plasmaniveauer af ccfDNA forbundet med forskellige sygdomme, vævsskader og stresstilstande [67,68,69]. Denne stigning er forbundet med frigivelsen af ​​DNA-fragmenter af egen oprindelse efter vævsskade. Vi undersøgte dette problem ved hjælp af akut varmestress, hvor muslinger kortvarigt blev udsat for en temperatur på 30 °C. Vi udførte denne analyse på tre forskellige typer muslinger i tre uafhængige eksperimenter. Vi fandt dog ingen ændring i ccfDNA-niveauer efter akut varmestress (se figur S5, yderligere information). Denne opdagelse kan i det mindste delvist forklare, at muslinger har et halvåbent kredsløbssystem og akkumulerer store mængder fremmed DNA på grund af deres høje filtreringsaktivitet. På den anden side kan muslinger, ligesom mange hvirvelløse dyr, være mere modstandsdygtige over for stressinduceret vævsskade, hvorved frigivelsen af ​​ccfDNA i deres hæmolymfe begrænses [70, 71].
DNA-analyse af biodiversitet i akvatiske økosystemer har hidtil primært fokuseret på miljømæssig DNA (eDNA) metabarcoding. Denne metode er dog normalt begrænset i biodiversitetsanalyse, når der anvendes primere. Brugen af ​​shotgun-sekventering omgår begrænsningerne ved PCR og den forudindtagede udvælgelse af primersæt. Således er vores metode på en måde tættere på den nyligt anvendte high-throughput eDNA Shotgun-sekventeringsmetode, som er i stand til direkte at sekventere fragmenteret DNA og analysere næsten alle organismer [72, 73]. Der er dog en række grundlæggende problemer, der adskiller LB fra standard eDNA-metoder. Hovedforskellen mellem eDNA og LB er naturligvis brugen af ​​naturlige filterværter. Brugen af ​​marine arter såsom svampe og muslinger (Dresseina spp.) som et naturligt filter til at studere eDNA er blevet rapporteret [74, 75]. Dreissenas undersøgelse anvendte dog vævsbiopsier, hvorfra DNA blev ekstraheret. Analyse af ccfDNA fra LB kræver ikke vævsbiopsi, specialiseret og til tider dyrt udstyr og logistik forbundet med eDNA eller vævsbiopsi. Faktisk har vi for nylig rapporteret, at ccfDNA fra LB kan opbevares og analyseres med FTA-støtte uden at opretholde en kølekæde, hvilket er en stor udfordring for forskning i fjerntliggende områder [76]. Ekstraktionen af ​​ccfDNA fra flydende biopsier er også enkel og giver DNA af høj kvalitet til shotgun-sekventering og PCR-analyse. Dette er en stor fordel i betragtning af nogle af de tekniske begrænsninger forbundet med eDNA-analyse [77]. Enkelheden og de lave omkostninger ved prøveudtagningsmetoden er også særligt velegnede til langsigtede overvågningsprogrammer. Ud over deres høje filtreringsevne er et andet velkendt træk ved muslinger den kemiske mukopolysaccharidsammensætning af deres slim, som fremmer absorptionen af ​​vira [78, 79]. Dette gør muslinger til et ideelt naturligt filter til karakterisering af biodiversitet og klimaændringers indvirkning i et givet akvatisk økosystem. Selvom tilstedeværelsen af ​​værtsafledte DNA-fragmenter kan ses som en begrænsning af metoden sammenlignet med eDNA, er omkostningerne forbundet med at have et sådant nativt ccfDNA sammenlignet med eDNA samtidig forståelige i betragtning af den enorme mængde information, der er tilgængelig til sundhedsstudier, der er forbundet med værtsafledte DNA'er. Dette inkluderer tilstedeværelsen af ​​virale sekvenser integreret i værtens genom. Dette er især vigtigt for muslinger, givet tilstedeværelsen af ​​horisontalt overførte leukæmiske retrovirusser i muslinger [80, 81]. En anden fordel ved LB i forhold til eDNA er, at det udnytter den fagocytiske aktivitet af cirkulerende blodlegemer i hæmolymfen, som opsluger mikroorganismer (og deres genomer). Fagocytose er hovedfunktionen af ​​blodlegemer i muslinger [82]. Endelig udnytter metoden den høje filtreringskapacitet hos muslinger (gennemsnit 1,5 l/t havvand) og to-dages cirkulation, hvilket øger blandingen af ​​forskellige lag af havvand, hvilket muliggør opsamling af heterolog eDNA. [83, 84]. Analyse af muslingers ccfDNA er således en interessant vej givet de ernæringsmæssige, økonomiske og miljømæssige påvirkninger af muslinger. I lighed med analysen af ​​LB indsamlet fra mennesker åbner denne metode også muligheden for at måle genetiske og epigenetiske ændringer i værts-DNA som reaktion på eksogene stoffer. For eksempel kan tredjegenerations sekventeringsteknologier forestilles at udføre genomdækkende methyleringsanalyse i nativt ccfDNA ved hjælp af nanoporesekventering. Denne proces bør lettes af, at længden af ​​muslinge-ccfDNA-fragmenterne ideelt set er kompatibel med long-read-sekventeringsplatforme, der tillader genomdækkende DNA-methyleringsanalyse fra en enkelt sekventeringskørsel uden behov for kemiske transformationer.85,86] Dette er en interessant mulighed, da det er blevet vist, at DNA-methyleringsmønstre afspejler en reaktion på miljøstress og vedvarer over mange generationer. Derfor kan det give værdifuld indsigt i de underliggende mekanismer, der styrer reaktionen efter eksponering for klimaændringer eller forurenende stoffer [87]. Brugen af ​​LB er dog ikke uden begrænsninger. Det siger sig selv, at dette kræver tilstedeværelsen af ​​indikatorarter i økosystemet. Som nævnt ovenfor kræver brugen af ​​LB til at vurdere biodiversiteten i et givet økosystem også en stringent bioinformatisk pipeline, der tager højde for tilstedeværelsen af ​​DNA-fragmenter fra kilden. Et andet stort problem er tilgængeligheden af ​​referencegenomer for marine arter. Det er håbet, at initiativer som Marine Mammal Genomes Project og det nyligt etablerede Fish10k-projekt [88] vil fremme en sådan analyse i fremtiden. Anvendelsen af ​​LB-konceptet på marine filterfødende organismer er også kompatibel med de seneste fremskridt inden for sekventeringsteknologi, hvilket gør det velegnet til udvikling af multi-ohm biomarkører for at give vigtig information om marine habitaters sundhed som reaktion på miljøbelastning.
Genomsekventeringsdata er blevet deponeret i NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 under Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Klimaændringers indvirkning på havliv og økosystemer. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S m.fl. Overvej de kombinerede virkninger af klimaændringer og andre lokale stressfaktorer på havmiljøet. General Scientific Environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Videnskab af den første marts. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Reduceret varmetolerance under gentagne varmestressforhold forklarer den høje sommerdødelighed hos blåmuslinger. Videnskabelig rapport 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER m.fl. Nylige ændringer i hyppigheden, årsagerne og omfanget af dyredødsfald. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Flere ikke-artsspecifikke patogener kan have forårsaget massedødelighed af Pinna nobilis. Liv. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potentiel indvirkning af klimaændringer på zoonotiske sygdomme i arktiske områder. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al. Blåmuslinger (Mytilus edulis spp.) som signalorganismer i overvågning af kystforurening: en gennemgang. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integration af flydende biopsi i kræftbehandling. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C m.fl. Modning af flydende biopsi: Tillader tumor-DNA at cirkulere. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsyrer i humant plasma. Mødereferat fra Soc Biols datterselskaber. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. En ny rolle for cellefrit DNA som en molekylær markør til kræftbehandling. Kvantificering af biomolær analyse. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Flydende biopsi kommer ind i klinikken – implementeringsproblemer og fremtidige udfordringer. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW m.fl. Foster-DNA findes i maternelt plasma og serum. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Undersøgelse af graviditetsforløbet og dets komplikationer ved hjælp af cirkulerende ekstracellulært RNA i blodet hos kvinder under graviditet. Dopediatrics. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J m.fl. Flydende biopsi: donorcellefrit DNA bruges til at detektere allogene læsioner i et nyretransplantat. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovationer inden for prænatal diagnostik: genomsekventering af maternel plasma. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D m.fl. Hurtig patogenpåvisning med næste generations metagenomisk sekventering af inficerede kropsvæsker. Nat Medicine. 2021;27:115-24.