Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Ukontrolleret blødning er en af ​​de hyppigste dødsårsager.Opnåelse af hurtig hæmostase sikrer forsøgspersonens overlevelse som førstehjælp under kamp, ​​trafikulykker og dødsreduktionsoperationer.Nanoporøst fiberforstærket kompositstillads (NFRCS) afledt af en simpel hæmostatisk filmdannende sammensætning (HFFC) som en kontinuerlig fase kan udløse og forbedre hæmostase.Udviklingen af ​​NFRCS er baseret på designet af guldsmedens vinge.Guldsmedens vingestruktur består af tværgående og langsgående vinger, og vingemembranerne er forbundet med hinanden for at bevare mikrostrukturens integritet.HFFC belægger ensartet overfladen af ​​fiberen med en film af nanometer tykkelse og forbinder den tilfældigt fordelte bomuldstykkelse (Ct) (dispergeret fase) for at danne en nanoporøs struktur.Kombinationen af ​​kontinuerlige og dispergerede faser reducerer prisen på produktet ti gange sammenlignet med kommercielt tilgængelige produkter.Modificeret NFRCS (tamponer eller armbånd) kan bruges i en række biomedicinske applikationer.In vivo undersøgelser har konkluderet, at det udviklede Cp NFRCS udløser og forbedrer koagulationsprocessen på applikationsstedet.NFRCS kan modulere mikromiljøet og virke på cellulært niveau på grund af dets nanoporøse struktur, hvilket resulterer i bedre sårheling i excisionssårmodellen.
Ukontrolleret blødning under kamp, ​​intraoperative og nødsituationer kan udgøre en alvorlig trussel mod såredes liv1.Disse tilstande fører yderligere til en samlet stigning i perifer vaskulær modstand, hvilket fører til hæmoragisk shock.Passende foranstaltninger til at kontrollere blødning under og efter operationen betragtes som potentielt livstruende2,3.Skader på store kar fører til massivt blodtab, hvilket resulterer i en dødelighed på ≤ 50 % i kamp og 31 % under operation1.Massivt blodtab fører til et fald i kropsvolumen, hvilket reducerer hjertevolumen.En stigning i total perifer vaskulær modstand og en progressiv svækkelse af mikrocirkulationen fører til hypoxi i de livsstøttende organer.Hæmoragisk shock kan forekomme, hvis tilstanden fortsætter uden effektiv indgriben1,4,5.Andre komplikationer omfatter progression af hypotermi og metabolisk acidose, samt en koagulationsforstyrrelse, der hæmmer koagulationsprocessen.Svært hæmoragisk shock er forbundet med en højere risiko for død6,7,8.Ved grad III (progressivt) shock er blodtransfusion afgørende for patientens overlevelse under intraoperativ og postoperativ morbiditet og mortalitet.For at overvinde alle de ovennævnte livstruende situationer har vi udviklet et nanoporøst fiberforstærket kompositstillads (NFRCS), der anvender en minimal polymerkoncentration (0,5%) ved hjælp af en kombination af vandopløselige hæmostatiske polymerer.
Ved brug af fiberarmering kan der udvikles omkostningseffektive produkter.De tilfældigt arrangerede fibre ligner strukturen af ​​en guldsmedes vinge, balanceret af de vandrette og lodrette striber på vingerne.Vingens tværgående og langsgående vener kommunikerer med vingemembranen (fig. 1).NFRCS består af forstærket Ct som et stilladssystem med bedre fysisk og mekanisk styrke (Figur 1).På grund af overkommeligheden og håndværket foretrækker kirurger at bruge bomuldstrådsmålere (Ct) under operationer og forbindinger. I betragtning af dets mange fordele, herunder > 90% krystallinsk cellulose (medvirker til forbedring af hæmostatisk aktivitet), blev Ct brugt som et skeletsystem af NFRCS9,10. I betragtning af dets mange fordele, herunder > 90% krystallinsk cellulose (medvirker til forbedring af hæmostatisk aktivitet), blev Ct brugt som et skeletsystem af NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кристаллической целлюческой целюлозвы статической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. På grund af dets mange fordele, herunder >90 % krystallinsk cellulose (involveret i øget hæmostatisk aktivitet), blev Ct derfor brugt som NFRCS-skeletsystemet9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强攺止血ﴉ 9 ,10 的骨架系统.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %På grund af dets mange fordele, herunder over 90 % krystallinsk cellulose (hjælper med at forbedre hæmostatisk aktivitet), blev Ct brugt som et stillads for NFRCS9,10.Ct blev overfladisk belagt (nano-tyk filmdannelse blev observeret) og forbundet med en hæmostatisk filmdannende sammensætning (HFFC).HFFC fungerer som en matrigel, der holder tilfældigt placeret Ct sammen.Det udviklede design overfører spændinger i den dispergerede fase (forstærkende fibre).Det er vanskeligt at opnå nanoporøse strukturer med god mekanisk styrke ved brug af minimale polymerkoncentrationer.Derudover er det ikke nemt at tilpasse forskellige forme til forskellige biomedicinske anvendelser.
Figuren viser et diagram over NFRCS-designet baseret på guldsmedens vingestruktur (A).Dette billede viser en sammenlignende analogi af vingestrukturen af ​​en guldsmede (de krydsende og langsgående vener i vingen er indbyrdes forbundne) og et tværsnitsfotografi af Cp NFRCS (B).Skematisk repræsentation af NFRCS.
NFRC'er blev udviklet ved hjælp af HFFC som en kontinuerlig fase for at løse ovenstående begrænsninger.HFFC er sammensat af forskellige filmdannende hæmostatiske polymerer, herunder chitosan (som den vigtigste hæmostatiske polymer) med methylcellulose (MC), hydroxypropylmethylcellulose (HPMC 50 cp) og polyvinylalkohol (PVA)) (125 kDa) som en støttepolymer, der fremmer trombedannelse.dannelse.Tilsætningen af ​​polyvinylpyrrolidin K30 (PVP K30) forbedrede NFRCS's fugtabsorptionskapacitet.Polyethylenglycol 400 (PEG 400) blev tilsat for at forbedre polymertværbinding i bundne polymerblandinger.Tre forskellige hæmostatiske HFFC-sammensætninger (Cm HFFC, Ch HFFC og Cp HFFC), nemlig chitosan med MC (Cm), chitosan med HPMC (Ch) og chitosan med PVA (Cp), blev påført til Ct.Forskellige in vitro og in vivo karakteriseringsundersøgelser har bekræftet den hæmostatiske og sårhelende aktivitet af NFRCS.Kompositmaterialer, der tilbydes af NFRCS, kan bruges til at tilpasse forskellige former for stilladser til at opfylde specifikke behov.
Derudover kan NFRCS modificeres som en bandage eller rulle for at dække hele skadesområdet i underekstremiteterne og andre dele af kroppen.Specifikt til kamplemmerskader kan det designede NFRCS-design ændres til en halv arm eller et helt ben (Supplerende figur S11).NFRCS kan laves om til et armbånd med vævslim, som kan bruges til at stoppe blødninger fra alvorlige selvmordsskader i håndleddet.Vores hovedmål er at udvikle en NFRCS med så lidt polymer som muligt, der kan leveres til en stor befolkning (under fattigdomsgrænsen), og som kan placeres i en førstehjælpskasse.Enkel, effektiv og økonomisk i design, NFRCS gavner lokalsamfund og kan have en global indflydelse.
Chitosan (molekylvægt 80 kDa) og amarant blev købt fra Merck, Indien.Hydroxypropylmethylcellulose 50 Cp, polyethylenglycol 400 og methylcellulose blev købt fra Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polyvinylalkohol (molekylvægt 125 kDa) (87-90 % hydrolyseret) blev købt fra National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrrolidin K30 blev købt fra Molychem, Mumbai, sterile vatpinde blev købt fra Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, med Milli Q-vand (Direct-Q3-vandrensningssystem, Merck, Indien) som bærer.
NFRCS blev udviklet ved hjælp af en lyofiliseringsmetode11,12.Alle HFFC-sammensætninger (tabel 1) blev fremstillet under anvendelse af en mekanisk omrører.Forbered en 0,5% opløsning af chitosan under anvendelse af 1% eddikesyre i vand ved kontinuerlig omrøring ved 800 rpm på en mekanisk omrører.Den nøjagtige vægt af den påfyldte polymer angivet i tabel 1 blev tilsat til chitosanopløsningen og omrørt, indtil en klar polymeropløsning blev opnået.PVP K30 og PEG 400 blev tilsat til den resulterende blanding i mængderne angivet i tabel 1, og omrøring blev fortsat indtil en klar viskøs polymeropløsning blev opnået.Det resulterende bad af polymeropløsning blev sonikeret i 60 minutter for at fjerne indesluttede luftbobler fra polymerblandingen.Som vist i supplerende figur S1(b) blev Ct jævnt fordelt i hver brønd på en 6-brønds plade (skimmel) suppleret med 5 ml HFFC.
Seks-brøndspladen blev sonikeret i 60 minutter for at opnå ensartet befugtning og fordeling af HFFC i Ct-netværket.Frys derefter seksbrøndspladen ved -20°C i 8-12 timer.Fryseplader blev lyofiliseret i 48 timer for at opnå forskellige formuleringer af NFRCS.Den samme procedure bruges til at fremstille forskellige former og strukturer, såsom tamponer eller cylindriske tamponer, eller enhver anden form til forskellige anvendelser.
Nøjagtigt afvejet chitosan (80 kDa) (3%) opløses i 1% eddikesyre under anvendelse af en magnetomrører.Til den resulterende opløsning af chitosan blev tilsat 1 % PEG 400 og omrørt i 30 minutter.Hæld den resulterende opløsning i en firkantet eller rektangulær beholder og frys ved -80°C i 12 timer.Frosne prøver blev lyofiliseret i 48 timer for at opnå porøs Cs13.
Det udviklede NFRCS blev udsat for eksperimenter med Fourier transform infrarød spektroskopi (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan) for at bekræfte den kemiske kompatibilitet af chitosan med andre polymerer14,15.FTIR-spektrene (bredden af ​​det spektrale område fra 400 til 4000 cm-1) af alle testede prøver blev opnået ved at udføre 32 scanninger.
Blodabsorptionshastigheden (BAR) for alle formuleringer blev evalueret under anvendelse af metoden beskrevet af Chen et al.16 med små ændringer.De udviklede NFRK'er af alle sammensætninger blev tørret i en vakuumovn ved 105°C natten over for at fjerne resterende opløsningsmiddel.30 mg NFRCS (initial prøvevægt - W0) og 30 mg Ct (positiv kontrol) blev anbragt i separate skåle indeholdende en forblanding af 3,8% natriumcitrat.Ved forudbestemte tidsintervaller, dvs. 5, 10, 20, 30, 40 og 60 sekunder, blev NFRCS fjernet, og deres overflader renset for uabsorberet blod ved at placere prøverne på Ct i 30 sekunder.Den endelige vægt af blod absorberet af NFRCS 16 blev betragtet (W1) på hvert tidspunkt.Beregn BAR-procenten ved hjælp af følgende formel:
Blodkoagulationstid (BCT) blev bestemt som rapporteret af Wang et al.17 .Den tid, der kræves for fuldblod (rotteblod forblandet med 3,8 % natriumcitrat) til at størkne i nærvær af NFRCS, blev beregnet som BCT for testprøven.De forskellige NFRCS-komponenter (30 mg) blev anbragt i 10 ml hætteglas med skruelåg og inkuberet ved 37°C.Blod (0,5 ml) blev tilsat til hætteglasset, og 0,3 ml 0,2 M CaCl2 blev tilsat for at aktivere blodkoagulation.Vend til sidst hætteglasset hvert 15. sekund (op til 180°), indtil der dannes en fast koagel.BCT for prøven er estimeret ved antallet af flips vails17,18.Baseret på BCT blev to optimale sammensætninger fra NFRCS Cm, Ch og Cp udvalgt til yderligere karakteriseringsundersøgelser.
BCT af Ch NFRCS og Cp NFRCS sammensætninger blev bestemt ved at implementere metoden beskrevet af Li et al.19 .Anbring 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs (positiv kontrol) i separate petriskåle (37 °C).Blod indeholdende 3,8 % natriumcitrat blev blandet med 0,2 M CaCl2 i et volumenforhold på 10:1 for at starte blodkoagulationsprocessen.20 µl 0,2 M CaCl2-rotteblodblanding blev påført prøveoverfladen og anbragt i en tom petriskål.Kontrollen var blod hældt i tomme petriskåle uden Ct.Med faste intervaller på 0, 3 og 5 minutter stoppes koagulationen ved at tilsætte 10 ml deioniseret (DI) vand til prøven, der indeholder skålen uden at forstyrre koaguleringen.Ikke-koagulerede erytrocytter (erythrocytter) gennemgår hæmolyse i nærværelse af deioniseret vand og frigiver hæmoglobin.Hæmoglobin på forskellige tidspunkter (HA(t)) blev målt ved 540 nm (λmax hæmoglobin) under anvendelse af et UV-Vis spektrofotometer.Den absolutte absorption af hæmoglobin (AH(0)) i 0 min af 20 µl blod i 10 ml deioniseret vand blev taget som referencestandard.Den relative hæmoglobinoptagelse (RHA) af koaguleret blod blev beregnet ud fra forholdet HA(t)/HA(0) under anvendelse af den samme batch af blod.
Ved anvendelse af en teksturanalysator (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) blev NFRKs klæbeegenskaber til beskadiget væv bestemt.Tryk et cylindrisk fad med åben bund mod indersiden af ​​svineskindet (uden fedtlaget).Prøver (Ch NFRCS og Cp NFRCS) blev påført via kanyle i cylindriske forme for at skabe vedhæftning til huden på grisen.Efter 3 minutters inkubation ved stuetemperatur (RT) (25°C) blev NFRCS-klæbestyrken registreret ved en konstant hastighed på 0,5 mm/sek.
Hovedtræk ved kirurgiske fugemasser er at øge blodkoagulationen og samtidig reducere blodtab.Tabsfri koagulation i NFRCS blev evalueret ved hjælp af en tidligere offentliggjort metode med små modifikationer 19 .Lav et mikrocentrifugerør (2 ml) (indvendig diameter 10 mm) med et 8 × 5 mm2 hul på den ene side af centrifugerøret (repræsenterer et åbent sår).NFRCS bruges til at lukke åbningen og tape bruges til at forsegle yderkanterne.Tilsæt 20 µl 0,2 M CaCl2 til mikrocentrifugerøret, der indeholder 3,8 % natriumcitrat-forblandingen.Efter 10 minutter blev mikrocentrifugerørene fjernet fra skålene, og stigningen i skålenes masse blev bestemt på grund af udstrømningen af ​​blod fra NFRK (n = 3).Blodtab Ch NFRCS og Cp NFRCS blev sammenlignet med Cs.
Våd integritet af NFRCS blev bestemt baseret på metoden beskrevet af Mishra og Chaudhary21 med mindre modifikationer.Anbring NFRCS i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe med 50 ml vand og hvirvl i 60 s uden at danne en top.Visuel inspektion og prioritering af prøver for fysisk integritet baseret på indsamling.
Bindingsstyrken af ​​HFFC til Ct blev undersøgt ved hjælp af tidligere offentliggjorte metoder med mindre modifikationer.Overfladebelægningens integritet blev vurderet ved at udsætte NFRK for akustiske bølger (ekstern stimulus) i nærvær af milliQ-vand (Ct).De udviklede NFRCS Ch NFRCS og Cp NFRCS blev anbragt i et bægerglas fyldt med vand og sonikeret i henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 og 30 minutter.Efter tørring blev den procentvise forskel mellem den oprindelige og endelige vægt af NFRCS anvendt til at beregne det procentvise materialetab (HFFC).In vitro BCT understøttede yderligere bindingsstyrken eller tabet af overfladematerialer.Effektiviteten af ​​HFFC-binding til Ct giver blodkoagulation og en elastisk belægning på overfladen af ​​Ct22.
Homogeniteten af ​​de udviklede NFRCS blev bestemt af BCT af prøver (30 mg) taget fra tilfældigt udvalgte generelle placeringer af NFRCS.Følg den tidligere nævnte BCT-procedure for at bestemme NFRCS-overholdelse.Nærhed mellem alle fem prøver sikrer ensartet overfladedækning og HFFC-aflejring i Ct-nettet.
Det nominelle blodkontaktareal (NBCA) blev bestemt som tidligere rapporteret med nogle modifikationer.Koaguler blodet ved at klemme 20 µl blod mellem de to overflader af Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs.Efter 1 time blev de to dele af stenten adskilt og man målte området af koaguleret manuelt.Den gennemsnitlige værdi af tre gentagelser blev betragtet som NBCA NFRCS19.
Dynamic Vapor Sorption (DVS)-analyse blev brugt til at evaluere effektiviteten af ​​NFRCS til at absorbere vand fra det ydre miljø eller fra skadestedet, der er ansvarligt for at starte koagulation.DVS evaluerer eller registrerer dampoptagelsen og -tabet i en prøve gravimetrisk ved hjælp af en ultrafølsom balance med en masseopløsning på ±0,1 µg.Et partielt damptryk (relativ fugtighed) genereres af en elektronisk massestrømsregulator omkring prøven ved at blande mættede og tørre bæregasser. I henhold til retningslinjerne for den europæiske farmakopé, baseret på procentdelen af ​​fugtoptagelse i prøverne, blev prøverne kategoriseret i 4 kategorier (0-0,012 % w/w- ikke-hygroskopiske, 0,2-2 % w/w let hygroskopiske, 2-15 % moderat hygroskopiske og > 15 % meget hygroskopiske 23 %. I henhold til retningslinjerne for den europæiske farmakopé, baseret på procentdelen af ​​fugtoptagelse i prøverne, blev prøverne kategoriseret i 4 kategorier (0-0,012 % vægt/vægt- ikke-hygroskopiske, 0,2-2 % vægt/vægt let hygroskopiske, 2-15 % moderat hygroskopiske og > 15 % hygroskopiske)23 meget.I overensstemmelse med anbefalingerne i den europæiske farmakopé, afhængigt af procentdelen af ​​fugtabsorption af prøverne, blev prøverne opdelt i 4 kategorier (0-0,012 % w/w – ikke-hygroskopisk, 0,2-2 % w/w let hygroskopisk, 2-15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderat hygroskopisk og > 15 % meget hygroskopisk)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（鈁0-0,012% w/w-2% w/w.-2% w/w. /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23.根据 欧洲 药典 指南 , 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 刱为 分为 刱为 刱＆为 .200%-0.湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23.I overensstemmelse med anbefalingerne i den europæiske farmakopé opdeles prøverne i 4 klasser afhængigt af procentdelen af ​​fugt absorberet af prøven (0-0,012 vægtprocent – ​​ikke-hygroskopisk, 0,2-2 vægtprocent let hygroskopisk, 2-15 vægtprocent).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderat hygroskopisk, > 15 % meget hygroskopisk) 23.Den hygroskopiske effektivitet af NFCS X NFCS og TsN NFCS blev bestemt på en analysator DVS TA TGA Q5000 SA.Under denne proces blev kørselstid, relativ fugtighed (RH) og prøvevægt i realtid ved 25°C24 opnået.Fugtindholdet beregnes ved nøjagtig NFRCS-masseanalyse ved hjælp af følgende ligning:
MC er NFRCS-fugtighed.m1 – tørvægt af NSAID'er.m2 er NFRCS-massen i realtid ved en given RH.
Det samlede overfladeareal blev estimeret ved hjælp af et nitrogenadsorptionseksperiment med flydende nitrogen efter tømning af prøverne ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10-3 Torr). Det samlede overfladeareal blev estimeret ved hjælp af et nitrogenadsorptionseksperiment med flydende nitrogen efter tømning af prøverne ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10-3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азота. при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Det samlede overfladeareal blev estimeret ved hjælp af et nitrogenadsorptionseksperiment med flydende nitrogen, efter at prøver var tømt ved 25 °C i 10 timer (< 7 × 10-3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总积逢积鯝✨ 25°C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбции азота жидким азоц ов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Det samlede overfladeareal blev estimeret under anvendelse af nitrogenadsorptionsforsøg med flydende nitrogen efter at prøverne var tømt i 10 timer ved 25°C (< 7 x 10-3 torr).Samlet overfladeareal, porevolumen og NFRCS-porestørrelse blev bestemt med en Quantachrome fra NOVA 1000e, Østrig under anvendelse af RS 232-software.
Forbered 5% RBC'er (saltvand som fortyndingsmiddel) fra fuldblod.Overfør derefter en alikvot af HFFC (0,25 ml) til en plade med 96 brønde og 5 % RBC-masse (0,1 ml).Inkuber blandingen ved 37°C i 40 minutter.En blanding af røde blodlegemer og serum blev betragtet som en positiv kontrol, og en blanding af saltvand og røde blodlegemer som en negativ kontrol.Hæmagglutination blev bestemt i henhold til Stajitzky-skalaen.De foreslåede skalaer er som følger: + + + + tætte granulære aggregater;+ + + glatte bundpuder med buede kanter;+ + glatte bundpuder med afrevne kanter;+ smalle røde ringe rundt om kanterne af de glatte puder;– (negativ) diskret rød knap 12 i midten af ​​den nederste brønd.
Hæmokompatibiliteten af ​​NFRCS blev undersøgt i henhold til metoden fra Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Den gravimetriske metode beskrevet af Singh et al.Mindre modifikationer blev foretaget for at vurdere trombedannelse i nærvær af eller på overfladen af ​​NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS blev inkuberet i phosphatbufret saltvand (PBS) i 24 timer ved 37°C.Efter 24 timer blev PBS fjernet, og NFRCS blev behandlet med 2 ml blod indeholdende 3,8% natriumcitrat.På overfladen af ​​NFRCS tilsættes 0,04 ml 0,1 M CaCl2 til de inkuberede prøver.Efter 45 minutter blev 5 ml destilleret vand tilsat for at standse koagulering.Koaguleret blod på overfladen af ​​NFRK blev behandlet med 36-38% formaldehydopløsning.Klumperne fikseret med formaldehyd blev tørret og vejet.Procentdelen af ​​trombose blev estimeret ved at beregne vægten af ​​glasset uden blod og prøve (negativ kontrol) og glasset med blod (positiv kontrol).
Som en indledende bekræftelse blev prøverne visualiseret under et optisk mikroskop for at forstå HFFC-overfladebelægningens, Ct-sammenkoblede Ct-netværks og Ct-netværks evne til at danne porer.Tynde sektioner af Ch og Cp fra NFRCS blev trimmet med et skalpelblad.Den resulterende sektion blev placeret på et objektglas, dækket med et dækglas, og kanterne blev fastgjort med lim.De forberedte objektglas blev set under et optisk mikroskop, og fotografier blev taget i forskellige forstørrelser.
Polymeraflejring i Ct-netværk blev visualiseret ved anvendelse af fluorescensmikroskopi baseret på metoden beskrevet af Rice et al.29. HFFC-sammensætningen, der blev anvendt til formuleringen, blev blandet med et fluorescerende farvestof (amaranth), og NFRCS (Ch & Cp) blev fremstillet ifølge den tidligere nævnte metode. HFFC-sammensætningen, der blev anvendt til formuleringen, blev blandet med et fluorescerende farvestof (amaranth), og NFRCS (Ch & Cp) blev fremstillet ifølge den tidligere nævnte metode.HFFC-sammensætningen anvendt til formulering blev blandet med et fluorescerende farvestof (amaranth), og NFRCS (Ch og Cp) blev opnået ifølge den tidligere nævnte metode.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方提到的。CS（CFR将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方提到的。CS（CFRHFFC-sammensætningen anvendt i formuleringen blev blandet med et fluorescerende farvestof (Amaranth) og modtog NFRCS (Ch og Cp), som tidligere nævnt.Tynde sektioner af NFRK blev skåret fra de opnåede prøver, anbragt på objektglas og dækket med dækglas.Observer de forberedte objektglas under et fluorescerende mikroskop ved hjælp af et grønt filter (310-380 nm).Billeder blev taget ved 4x forstørrelse for at forstå Ct-forhold og overskydende polymeraflejring i Ct-netværket.
Overfladetopografien af ​​NFRCS Ch og Cp blev bestemt ved hjælp af et atomic force microscope (AFM) med en ultraskarp TESP cantilever i tappetilstand: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Overfladeruhed blev bestemt ved root mean square (RMS) under anvendelse af software (Scanning Probe Image Processor).Forskellige NFRCS-placeringer blev gengivet på 3D-billeder for at kontrollere overfladeens ensartethed.Standardafvigelsen af ​​scoren for et givet område er defineret som overfladeruheden.RMS-ligningen blev brugt til at kvantificere overfladeruheden af ​​NFRCS31.
FESEM-baserede undersøgelser blev udført med FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, for at forstå overflademorfologien af ​​Ch NFRCS og Cp NFRCS, som viste bedre BCT end Cm NFRCS.FESEM-studiet blev udført i overensstemmelse med metoden beskrevet af Zhao et al.32 med mindre ændringer.NFRCS 20 til 30 mg Ch NFRCS og Cp NFRCS blev forblandet med 20 µl 3,8% natriumcitrat forblandet med rotteblod.20 μl 0,2 M CaCl2 blev tilsat til de blodbehandlede prøver for at starte koagulation, og prøverne blev inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter.Derudover blev overskydende erytrocytter fjernet fra NFRCS-overfladen ved at skylle med saltvand.
Efterfølgende prøver blev behandlet med 0,1% glutaraldehyd og derefter tørret i en varmluftovn ved 37°C for at fjerne fugt.De tørrede prøver blev overtrukket og analyseret 32 ​​.Andre billeder opnået under analysen var koageldannelse på overfladen af ​​individuelle bomuldsfibre, polymeraflejring mellem Ct, erytrocytmorfologi (form), koagelintegritet og erytrocytmorfologi i nærvær af NFRCS.Ubehandlede NFRCS-områder og Ch- og Cp-behandlede NFRCS-områder inkuberet med blod blev scannet for elementære ioner (natrium, kalium, nitrogen, calcium, magnesium, zink, kobber og selen)33.Sammenlign procentdele af elementære ioner mellem behandlede og ubehandlede prøver for at forstå elementær ionakkumulering under koageldannelse og koagelhomogenitet.
Tykkelsen af ​​Cp HFFC-overfladebelægningen på Ct-overfladen blev bestemt ved anvendelse af FESEM.Tværsnittene af Cp NFRCS blev skåret fra rammen og sputtercoatet.De resulterende sputterbelægningsprøver blev observeret af FESEM, og tykkelsen af ​​overfladebelægningen blev målt 34, 35, 36.
Røntgenmikro-CT giver høj opløsning 3D ikke-destruktiv billeddannelse og giver dig mulighed for at studere det interne strukturelle arrangement af NFRK.Micro-CT bruger en røntgenstråle, der passerer gennem prøven, til at registrere den lokale lineære dæmpningskoefficient for røntgenstrålerne i prøven, hvilket hjælper med at opnå morfologisk information.Den interne placering af Ct i Cp NFRCS og blodbehandlet Cp NFRCS blev undersøgt ved mikro-CT for at forstå absorptionseffektivitet og blodkoagulering i nærvær af NFRCS37,38,39.3D-strukturerne af blodbehandlede og ubehandlede Cp NFRCS-prøver blev rekonstrueret ved hjælp af mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Tyskland).Ved hjælp af VG STUDIO-MAX software version 2.2 blev flere røntgenbilleder taget fra forskellige vinkler (ideelt set 360° dækning) for at udvikle 3D-billeder til NFRCS.De indsamlede projektionsdata blev rekonstrueret til 3D volumetriske billeder ved hjælp af den tilsvarende simple 3D ScanIP Academic software.
For at forstå fordelingen af ​​koaguleret blev der desuden tilsat 20 µl forblandet citratblod og 20 µl 0,2 M CaCl2 til NFRCS for at starte blodkoagulation.De forberedte prøver efterlades til at hærde.NFRK-overfladen blev behandlet med 0,5% glutaraldehyd og tørret i en varmluftovn ved 30-40°C i 30 min.Blodproppen dannet på NFRCS blev scannet, rekonstrueret, og et 3D-billede af blodproppen blev visualiseret.
Antibakterielle assays blev udført på Cp NFRCS (bedst sammenlignet med Ch NFRCS) under anvendelse af den tidligere beskrevne metode med mindre modifikationer.Den antibakterielle aktivitet af Cp NFRCS og Cp HFFC blev bestemt under anvendelse af tre forskellige testmikroorganismer [S.aureus (gram-positive bakterier), E.coli (gram-negative bakterier) og hvid Candida (C.albicans)], der voksede på agar i petriskåle i en inkubator.Ensartet inokuler 50 ml af den fortyndede bakteriekultursuspension i en koncentration på 105-106 CFU ml-1 på agarmediet.Hæld mediet i en petriskål og lad det størkne.Brønde blev lavet på overfladen af ​​agarpladen for at fylde med HFFC (3 brønde for HFFC og 1 for negativ kontrol).Tilsæt 200 µl HFFC til 3 brønde og 200 µl pH 7,4 PBS til den 4. brønd.På den anden side af petriskålen placeres en 12 mm Cp NFRCS-skive på den størknede agar og fugtes med PBS (pH 7,4).Ciprofloxacin, ampicillin og fluconazol tabletter betragtes som referencestandarder for Staphylococcus aureus, Escherichia coli og Candida albicans.Mål hæmningszonen manuelt og tag et digitalt billede af hæmningszonen.
Efter institutionel etisk godkendelse blev undersøgelsen udført på Kasturba Medical College of Education and Research i Manipal, Karnataka, i det sydlige Indien.Den in vitro TEG-eksperimentelle protokol er blevet gennemgået og godkendt af den institutionelle etiske komité ved Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Forsøgspersonerne blev rekrutteret fra frivillige bloddonorer (i alderen 18 til 55) fra hospitalets blodbank.Derudover blev der indhentet en informeret samtykkeerklæring fra de frivillige til indsamling af blodprøver.Native TEG (N-TEG) ​​blev brugt til at studere effekten af ​​Cp HFFC-formuleringen på fuldblod blandet med natriumcitrat.N-TEG er bredt anerkendt for sin rolle i point-of-care genoplivning, hvilket skaber problemer for klinikere på grund af potentialet for klinisk signifikant forsinkelse i resultater (rutinemæssig koagulationstest).N-TEG-analyse blev udført under anvendelse af fuldblod.Informeret samtykke og detaljeret sygehistorie blev indhentet fra alle deltagere.Undersøgelsen omfattede ikke deltagere med hæmostatiske eller trombotiske komplikationer såsom graviditet/postpartum eller leversygdom.Forsøgspersoner, der tog lægemidler, der påvirker koagulationskaskaden, blev også udelukket fra undersøgelsen.Grundlæggende laboratorietests (hæmoglobin, protrombintid, aktiveret tromboplastin og trombocyttal) blev udført på alle deltagere i henhold til standardprocedurer.N-TEG bestemmer blodpropsviskoelasticitet, initial koagelstruktur, partikelinteraktion, koagelforstærkning og koagellyse.N-TEG-analysen giver grafiske og numeriske data om de kollektive virkninger af flere cellulære elementer og plasma.N-TEG-analyse blev udført på to forskellige volumener af Cp HFFC (10 µl og 50 µl).Som et resultat blev 1 ml fuldblod med citronsyre tilsat 10 μl Cp HFFC.Tilsæt 1 ml (Cp HFFC + citratblod), 340 µl blandet blod til 20 µl 0,2 M CaCl2-holdig TEG-skål.Derefter blev TEG-skåle sat i TEG® 5000, US for at måle R, K, alfavinkel, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % af blodprøverne i nærvær af Cp HFFC41.
In vivo-undersøgelsesprotokollen blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra Komiteen for Kontrol og Tilsyn med Dyreforsøg (CPCSEA).Alle in vivo NFRCS-undersøgelser (2 × 2 cm2) blev udført på Wistar hunrotter (med en vægt på 200 til 250 g).Alle dyr blev akklimatiseret ved en temperatur på 24-26°C, dyrene havde fri adgang til standardfoder og vand ad libitum.Alle dyr blev tilfældigt opdelt i forskellige grupper, hver gruppe bestod af tre dyr.Alle undersøgelser blev udført i overensstemmelse med dyreforsøg: rapport om in vivo-eksperimenter 43 .Før undersøgelsen blev dyrene bedøvet ved intraperitoneal (ip) administration af en blanding af 20-50 mg ketamin (pr. 1 kg legemsvægt) og 2-10 mg xylazin (pr. 1 kg legemsvægt).Efter undersøgelsen blev blødningsvolumenet beregnet ved at evaluere forskellen mellem prøvernes begyndelses- og slutvægt, den gennemsnitlige værdi opnået fra de tre tests blev taget som prøvens blødningsvolumen.
Rottehaleamputationsmodellen blev implementeret for at forstå potentialet af NFRCS til at modulere blødning i traumer, kamp eller trafikulykker (skademodel).Skær 50 % af halen af ​​med et skalpelblad og læg det i luften i 15 sek. for at sikre normal blødning.Derudover blev testprøver placeret på halen af ​​en rotte ved at påføre tryk (Ct, Cs, Ch NFRCS og Cp NFRCS).Blødning og PCT blev rapporteret for testprøver (n ​​= 3)17,45.
Effektiviteten af ​​NFRCS trykkontrol i kamp blev undersøgt på en model af den overfladiske lårbensarterie.Lårarterien blotlægges, punkteres med en 24G trokar og blødes inden for 15 sekunder.Efter at der er observeret ukontrolleret blødning, placeres testprøven på punkturstedet med tryk.Umiddelbart efter påføring af testprøven blev koagulationstiden registreret, og hæmostatisk effektivitet blev observeret i de næste 5 minutter.Den samme procedure blev gentaget med Cs og Ct46.
Dowling et al.47 foreslog en leverskademodel til at vurdere hæmostatisk potentiale af hæmostatiske materialer i forbindelse med intraoperativ blødning.BCT blev registreret for Ct-prøver (negativ kontrol), Cs-ramme (positiv kontrol), Ch NFRCS-prøver og Cp NFRCS-prøver.Den suprahepatiske vena cava hos rotten blev eksponeret ved at udføre en median laparotomi.Derefter blev den distale del af venstre lap skåret ud med en saks.Lav et snit i leveren med et skalpelblad og lad det bløde i et par sekunder.Nøjagtigt vejede Ch NFRCS og Cp NFRCS testprøver blev placeret på den beskadigede overflade uden positivt tryk, og BCT blev registreret.Kontrolgruppen (Ct) påførte derefter pres efterfulgt af Cs 30 s47 uden at bryde skaden.
In vivo sårhelingsassays blev udført under anvendelse af en excisionssårmodel for at evaluere sårhelingsegenskaberne af de udviklede polymerbaserede NFRCS'er.Modeller af excisionssår blev udvalgt og udført i henhold til tidligere offentliggjorte metoder med mindre modifikationer19,32,48.Alle dyr blev bedøvet som tidligere beskrevet.Brug en biopsistanse (12 mm) til at lave et cirkulært dybt snit i huden på ryggen.Forberedte sårsteder blev klædt på med Cs (positiv kontrol), Ct (i erkendelse af, at bomuldspuder interfererer med helingen), Ch NFRCS og Cp NFRCS (eksperimentel gruppe) og en negativ kontrol uden nogen behandling.På hver dag af undersøgelsen blev sårområdet målt i alle rotter.Brug et digitalkamera til at tage et billede af sårområdet og tage en ny bandage på.Procentdelen af ​​sårlukning blev målt med følgende formel:
Baseret på procentdelen af ​​sårlukning på den 12. dag af undersøgelsen, blev rottehuden fra den bedste gruppe skåret ud ((Cp NFRCS) og kontrolgruppen) og undersøgt ved H&E-farvning og Massons trichromfarvning. Baseret på procentdelen af ​​sårlukning på den 12. dag af undersøgelsen, blev rottehuden fra den bedste gruppe skåret ud ((Cp NFRCS) og kontrolgruppen) og undersøgt ved H&E-farvning og Massons trichromfarvning.Baseret på procentdelen af ​​sårlukning på den 12. dag af undersøgelsen, blev huden på rotterne fra den bedste gruppe ((Cp NFRCS) og kontrolgruppen) skåret ud og undersøgt ved farvning med hæmatoxylin-eosin og Massons trichrom.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大雤嚌栓ﲿ雠硌Mad三色染色研究.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大雡艍色輠皌的大雤嚌眳组)Rotter i den bedste gruppe ((Cp NFRCS) og kontrolgrupper) blev skåret ud for hæmatoxylin-eosin-farvning og Massons trichrom-farvning baseret på procent sårlukning på dag 12 af undersøgelsen.Den implementerede farvningsprocedure blev udført i overensstemmelse med tidligere beskrevne metoder49,50.Kort fortalt, efter fiksering i 10% formalin, blev prøverne dehydreret under anvendelse af en række graderede alkoholer.Brug en mikrotom til at opnå tynde snit (5 µm tyk) af det udskårne væv.Tynde serielle snit af kontroller og Cp NFRCS blev behandlet med hæmatoxylin og eosin for at studere histopatologiske ændringer.Massons trichromfarvning blev brugt til at detektere dannelsen af ​​kollagenfibriller.De opnåede resultater blev blindt undersøgt af patologer.
Stabiliteten af ​​Cp NFRCS-prøver blev undersøgt ved stuetemperatur (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) i 12 måneder51.Cp NFRCS (overflademisfarvning og mikrobiel vækst) blev visuelt inspiceret og testet for foldslidstyrke og BCT i henhold til ovenstående metoder, der er beskrevet i afsnittet Materialer og metoder.
Skalerbarheden og reproducerbarheden af ​​Cp NFRCS blev undersøgt ved at fremstille Cp NFRCS med en størrelse på 15×15 cm2.Derudover blev 30 mg prøver (n = 5) udskåret fra forskellige Cp NFRCS-fraktioner, og BCT af de undersøgte prøver blev evalueret som beskrevet tidligere i metodeafsnittet.
Vi har forsøgt at udvikle forskellige former og strukturer under anvendelse af Cp NFRCS-sammensætninger til forskellige biomedicinske anvendelser.Sådanne former eller konfigurationer omfatter koniske podninger til næseblod, tandbehandlinger og cylindriske podninger til vaginal blødning.
Alle datasæt er udtrykt som middel ± standardafvigelse og blev analyseret ved ANOVA ved anvendelse af Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) efterfulgt af Bonferronis multiple sammenligningstest (*p<0,05).
Alle procedurer udført i humane undersøgelser var i overensstemmelse med instituttets og det nationale forskningsråds standarder samt Helsinki-erklæringen 1964 og dens efterfølgende ændringer eller lignende etiske standarder.Alle deltagere blev informeret om egenskaberne ved undersøgelsen og dens frivillige karakter.Deltagerdata forbliver fortrolige, når de først er indsamlet.Den in vitro TEG-eksperimentelle protokol er blevet gennemgået og godkendt af den institutionelle etiske komité ved Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Frivillige underskrev informeret samtykke til at indsamle blodprøver.
Alle procedurer udført i dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Kastuba Faculty of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Alle dyreforsøg designet blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Komitéen for Kontrol og Tilsyn med Dyreforsøg (CPCSEA).Alle forfattere følger ARRIVE-retningslinjerne.
FTIR-spektrene for alle NFRCS blev analyseret og sammenlignet med chitosanspektret vist i figur 2A.Karakteristiske spektrale toppe af chitosan (registreret) ved 3437 cm-1 (OH- og NH-strækning, overlapning), 2945 og 2897 cm-1 (CH-strækning), 1660 cm-1 (NH2-stamme), 1589 cm-1 (N-H-bøjning), 1157 cm-1 C (brostrækning O, 7 cm-1 C), 1157 cm-1 C hydroxyl), 993 cm-1 (stræk CO, Bo-OH) 52,53,54.Supplerende tabel S1 viser FTIR NFRCS-absorptionsspektrumværdierne for chitosan (reporter), ren chitosan, Cm, Ch og Cp.FTIR-spektrene for alle NFRCS (Cm, Ch og Cp) viste de samme karakteristiske absorptionsbånd som ren chitosan uden nogen væsentlige ændringer (fig. 2A).FTIR-resultaterne bekræftede fraværet af kemiske eller fysiske interaktioner mellem de polymerer, der blev brugt til at udvikle NFRCS, hvilket indikerer, at de anvendte polymerer er inerte.
In vitro karakterisering af Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS og Cs.(A) repræsenterer de kombinerede FTIR-spektre af sammensætningerne af chitosan og Cm NFRCS, Ch NFRCS og Cp NFRCS under kompression.(B) a) Fuldblodsoptagelseshastighed af NFRCS Cm, Ch, Cp og Cg (n = 3);Ct-prøverne viste en højere BAR, fordi vatpinden har en højere absorptionseffektivitet;b) Blod efter blodabsorption Illustration af den absorberede prøve.Grafisk repræsentation af BCT af testprøve C (Cp NFRCS havde den bedste BCT (15 s, n = 3)). Data i C, D, E og G blev vist som middelværdi ± SD, og ​​fejlstængerne repræsenterer SD, ***p < 0,0001. Data i C, D, E og G blev vist som middelværdi ± SD, og ​​fejlstængerne repræsenterer SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей представляю *** 0.0001. Data i C, D, E og G præsenteres som middelværdi ± standardafvigelse, og fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001. Данные в C, D, E og G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрешностей предностей предютставля*** p <0,0001. Data i C, D, E og G er vist som middelværdi ± standardafvigelse, fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse, ***p<0,0001.