Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden typografier og JavaScript.
Fugles fertilitet afhænger af deres evne til at opbevare nok levedygtig sæd i en længere periode i sædopbevaringskanalerne (SST). Den nøjagtige mekanisme, hvorved sædceller trænger ind i, opholder sig i og forlader SST, er fortsat kontroversiel. Sædceller fra sharkasi-høner viste en høj tendens til agglutination og dannede mobile, filamentøse bundter indeholdende mange celler. På grund af vanskeligheden ved at observere sædcellernes motilitet og adfærd i en uigennemsigtig æggeleder, brugte vi en mikrofluidisk enhed med et mikrokanaltværsnit svarende til sædcellernes til at studere sædcellernes agglutination og motilitet. Denne undersøgelse diskuterer, hvordan sædceller dannes, hvordan de bevæger sig, og deres mulige rolle i at forlænge sædcellernes ophold i SST. Vi undersøgte sædcellernes hastighed og reologiske adfærd, når væskestrømning blev genereret i en mikrofluidisk kanal ved hydrostatisk tryk (strømningshastighed = 33 µm/s). Sædcellerne har en tendens til at svømme mod strømmen (positiv reologi), og sædcellernes hastighed er signifikant reduceret sammenlignet med enkeltstående sædceller. Det er blevet observeret, at sædbundter bevæger sig i en spiral og øges i længde og tykkelse, efterhånden som flere enkeltsædceller rekrutteres. Der blev observeret sædbundter, der nærmede sig og klæbede til sidevæggene af de mikrofluidiske kanaler for at undgå at blive fejet med med en væskestrømningshastighed > 33 µm/s. Der blev observeret sædbundter, der nærmede sig og klæbede til sidevæggene af de mikrofluidiske kanaler for at undgå at blive fejet med med en væskestrømningshastighed > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Det er observeret, at sædbundter nærmer sig og klæber til sidevæggene af de mikrofluidiske kanaler for at undgå at blive fejet væk ved væskestrømningshastigheder >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 sサs33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Det er observeret, at sædbundter nærmer sig og klæber til sidevæggene i den mikrofluidiske kanal for at undgå at blive fejet væk af væskestrømmen ved >33 µm/s.Skannings- og transmissionselektronmikroskopi viste, at sædbundterne var understøttet af rigeligt tæt materiale. De opnåede data demonstrerer den unikke mobilitet hos Sharkazi-kyllingesædceller, såvel som deres evne til at agglutinere og danne mobile bundter, hvilket bidrager til en bedre forståelse af langtidsopbevaring af sædceller i SMT.
For at opnå befrugtning hos mennesker og de fleste dyr skal sædceller og æg ankomme til befrugtningsstedet på det rigtige tidspunkt. Derfor skal parring finde sted før eller på tidspunktet for ægløsning. På den anden side opbevarer nogle pattedyr, såsom hunde, såvel som ikke-pattedyrarter, såsom insekter, fisk, krybdyr og fugle, sædceller i deres reproduktionsorganer i en længere periode, indtil deres æg er klar til befrugtning (asynkron befrugtning 1 ). Fugle er i stand til at opretholde levedygtigheden af ​​sædceller, der er i stand til at befrugte æg, i 2-10 uger 2.
Dette er en unik egenskab, der adskiller fugle fra andre dyr, da det giver en høj sandsynlighed for befrugtning efter en enkelt insemination i flere uger uden samtidig parring og ægløsning. Det primære sædopbevaringsorgan, kaldet sædopbevaringsrøret (SST), er placeret i de indre slimhindefolder ved den uterovaginale overgang. Til dato er de mekanismer, hvorved sæd trænger ind i, opholder sig i og forlader sædbanken, ikke fuldt ud forstået. Baseret på tidligere undersøgelser er der blevet fremsat mange hypoteser, men ingen af ​​dem er blevet bekræftet.
Forman4 fremsatte en hypotese om, at sædceller opretholder deres opholdssted i SST-hulrummet gennem kontinuerlig oscillerende bevægelse mod væskestrømmens retning gennem proteinkanaler placeret på SST-epitelceller (reologi). ATP udtømmes på grund af den konstante flagellære aktivitet, der er nødvendig for at holde sædcellerne i SST-lumen, og motiliteten falder til sidst, indtil sædcellerne føres ud af sædbanken af ​​væskestrømmen og begynder en ny rejse ned ad den opstigende æggeleder for at befrugte sædcellerne. Ægget (Forman4). Denne model for sædopbevaring understøttes af immuncytokemi-detektering af aquaporinerne 2, 3 og 9, der er til stede i SST-epitelceller. Til dato mangler der undersøgelser af kyllingesæds reologi og dens rolle i SST-opbevaring, vaginal sædselektion og sædkonkurrence. Hos kyllinger kommer sædceller ind i vagina efter naturlig parring, men mere end 80 % af sædcellerne udstødes fra vagina kort efter parring. Dette antyder, at vagina er det primære sted for sædselektion hos fugle. Derudover er det blevet rapporteret, at mindre end 1% af de sædceller, der befrugtes i vagina, ender i SST'er2. Ved kunstig insemination af kyllinger i vagina har antallet af sædceller, der når SST, en tendens til at stige 24 timer efter insemination. Indtil videre er mekanismen for sædselektion under denne proces uklar, og sædmotilitet kan spille en vigtig rolle i sædoptagelsen af ​​SST-sædceller. På grund af æggeledernes tykke og uigennemsigtige vægge er det vanskeligt direkte at overvåge sædmotiliteten i fugles æggeledere. Derfor mangler vi grundlæggende viden om, hvordan sædceller overgår til SST efter befrugtning.
Reologi er for nylig blevet anerkendt som en vigtig faktor, der kontrollerer sædtransport i pattedyrs kønsorganer. Baseret på motile sædcellers evne til at migrere modstrøms, anvendte Zaferani et al. et corra-mikrofluidisk system til passivt at isolere motile sædceller fra opsamlede sædprøver. Denne type sædsortering er essentiel for medicinsk infertilitetsbehandling og klinisk forskning og foretrækkes frem for traditionelle metoder, der er tid- og arbejdskrævende og kan kompromittere sædmorfologi og strukturel integritet. Der er dog hidtil ikke udført undersøgelser af effekten af ​​sekreter fra kyllingers kønsorganer på sædmotilitet.
Uanset mekanismen bag opbevaring af sædceller i SST'en, har mange forskere observeret, at residente sædceller agglutinerer hoved mod hoved i SST'en hos kyllinger 9, 10, vagtler 2 og kalkuner 11 for at danne agglutinerede sædbundter. Forfatterne antyder, at der er en sammenhæng mellem denne agglutination og langtidsopbevaring af sædceller i SST'en.
Tingari og Lake12 rapporterede en stærk sammenhæng mellem sædceller i kyllingens sædmodtagende kirtel og satte spørgsmålstegn ved, om fuglesædceller agglutinerer på samme måde som pattedyrs sædceller. De mener, at de dybe forbindelser mellem sædceller i sædlederen kan skyldes den stress, der forårsages af tilstedeværelsen af ​​et stort antal sædceller på et lille område.
Når man evaluerer sædcellernes opførsel på friske, hængende objektglas, kan man se forbigående tegn på agglutination, især ved kanterne af sæddråberne. Agglutinationen blev dog ofte forstyrret af den roterende handling, der er forbundet med kontinuerlig bevægelse, hvilket forklarer den forbigående karakter af dette fænomen. Forskerne bemærkede også, at når fortyndingsmidlet blev tilsat sæden, fremkom der aflange "trådlignende" celleaggregater.
Tidlige forsøg på at efterligne en sædcelle blev gjort ved at fjerne en tynd tråd fra en hængende dråbe, hvilket resulterede i en aflang sædcellelignende vesikel, der stak ud fra sæddråben. Sædcellerne stillede sig straks op parallelt i vesiklen, men hele enheden forsvandt hurtigt på grund af 3D-begrænsningen. For at studere sædcellers agglutination er det derfor nødvendigt at observere sædcellernes motilitet og adfærd direkte i isolerede sædopbevaringsrør, hvilket er vanskeligt at opnå. Derfor er det nødvendigt at udvikle et instrument, der efterligner sædceller, for at understøtte studier af sædmotilitet og agglutinationsadfærd. Brillard et al.13 rapporterede, at den gennemsnitlige længde af sædopbevaringsrør hos voksne kyllinger er 400-600 µm, men nogle sædcelletumorer kan være så lange som 2000 µm. Mero og Ogasawara14 opdelte sædkirtlerne i forstørrede og ikke-forstørrede sædopbevaringskanaler, som begge var ens i længde (~500 µm) og halsbredde (~38 µm), men den gennemsnitlige lumendiameter af kanalerne var henholdsvis 56,6 og 56,6 µm. . , og 11,2 µm. I den aktuelle undersøgelse anvendte vi en mikrofluidisk enhed med en kanalstørrelse på 200 µm × 20 µm (B × H), hvis tværsnit er noget tæt på det amplificerede SST. Derudover undersøgte vi sædmotilitet og agglutinationsadfærd i strømmende væske, hvilket er i overensstemmelse med Foremans hypotese om, at væske produceret af SST-epitelceller holder sædceller i lumen i en modstrøms (reologisk) retning.
Formålet med denne undersøgelse var at overvinde problemerne med at observere sædcellernes motilitet i æggelederen og at undgå vanskelighederne ved at studere sædcellernes reologi og adfærd i et dynamisk miljø. Der blev anvendt en mikrofluidisk enhed, der skaber hydrostatisk tryk for at simulere sædcellernes motilitet i en kyllings kønsorganer.
Da en dråbe af en fortyndet sædprøve (1:40) blev fyldt i mikrokanalanordningen, kunne to typer sædmotilitet identificeres (isoleret sæd og bundet sæd). Derudover havde sædcellerne en tendens til at svømme mod strømmen (positiv reologi; video 1, 2). Selvom sædbundter havde en lavere hastighed end ensomme sædceller (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​sædceller, der udviste positiv rheotaxis (p < 0,001; tabel 2). Selvom sædbundter havde en lavere hastighed end ensomme sædceller (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​sædceller, der udviste positiv rheotaxis (p < 0,001; tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливетич сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; tabel 2). Selvom spermatozobundterne havde en lavere hastighed end enkeltsædcellers (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​spermatozoer, der viste positiv rheotaxis (p < 0,001; tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 昧 倧倲 示 阳百分比 （p <0,001； 2。。。。。。））))) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелитичив сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Selvom sædbundternes hastighed var lavere end for enkelte sædceller (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​sædceller med positiv reologi (p < 0,001; tabel 2).Positiv reologi for enkelte sædceller og totter estimeres til henholdsvis ca. 53 % og 85 %.
Det er blevet observeret, at sædcellerne fra sharkashikyllinger umiddelbart efter ejakulation danner lineære bundter, der består af snesevis af individer. Disse totter øges i længde og tykkelse over tid og kan forblive in vitro i flere timer, før de forsvinder (video 3). Disse filamentøse bundter er formet som echidna-sædceller, der dannes for enden af ​​bitestiklen. Sharkashi-hønesæd har vist sig at have en høj tendens til at agglutinere og danne et netbundt på mindre end et minut efter indsamling. Disse stråler er dynamiske og i stand til at klæbe til nærliggende vægge eller statiske genstande. Selvom sædbundter reducerer sædcellernes hastighed, er det tydeligt, at de makroskopisk øger deres linearitet. Bundternes længde varierer afhængigt af antallet af sædceller, der indsamles i bundterne. To dele af bundtet blev isoleret: den første del, inklusive det frie hoved af den agglutinerede sædcelle, og den terminale del, inklusive halen og hele den distale ende af sæden. Ved hjælp af et højhastighedskamera (950 fps) blev frie hoveder af agglutinerede sædceller observeret i den første del af bundtet. Disse hoveder er ansvarlige for bundtets bevægelse på grund af deres oscillerende bevægelse, hvor de trækker de resterende ind i bundtet med en spiralformet bevægelse (Video 4). I lange totter er det dog blevet observeret, at nogle frie sædceller klæber til kroppen, og den endedel af totten fungerer som vinger, der hjælper med at fremdrive totten.
Mens sædcellerne er i en langsom væskestrøm, bevæger de sig parallelt med hinanden, men de begynder at overlappe hinanden og klæbe til alt, der er stille, for ikke at blive vasket væk af strømmen, når strømningshastigheden øges. Bundterne dannes, når en håndfuld sædceller nærmer sig hinanden. De begynder at bevæge sig synkront og vikles om hinanden, hvorefter de klæber til et klæbrigt stof. Figur 1 og 2 viser, hvordan sædcellerne nærmer sig hinanden og danner en forbindelse, når halerne vikles om hinanden.
Forskerne anvendte hydrostatisk tryk for at skabe væskestrøm i en mikrokanal for at studere sædreologi. En mikrokanal med en størrelse på 200 µm × 20 µm (B × H) og en længde på 3,6 µm blev anvendt. Der blev anvendt mikrokanaler mellem beholdere med sprøjter monteret i enderne. Frugtfarve blev brugt til at gøre kanalerne mere synlige.
Bind forbindelseskabler og tilbehør til væggen. Videoen blev optaget med et fasekontrastmikroskop. Med hvert billede præsenteres fasekontrastmikroskopi- og kortlægningsbilleder. (A) Forbindelsen mellem to strømme modstår strømmen på grund af spiralformet bevægelse (rød pil). (B) Forbindelsen mellem rørbundtet og kanalvæggen (røde pile), samtidig med at de er forbundet til to andre bundter (gule pile). (C) Sædbundter i den mikrofluidiske kanal begynder at forbinde sig med hinanden (røde pile) og danner et net af sædbundter. (D) Dannelse af et netværk af sædbundter.
Da en dråbe fortyndet sæd blev fyldt i den mikrofluidiske enhed, og en strømning blev skabt, observeredes det, at sædstrålen bevægede sig mod strømningsretningen. Bundterne sidder tæt op ad mikrokanalernes vægge, og de frie hoveder i den første del af bundterne sidder tæt op ad dem (video 5). De klæber også til eventuelle stationære partikler i deres bane, såsom snavs, for at modstå at blive revet væk af strømmen. Med tiden bliver disse totter til lange filamenter, der fanger andre enkeltstående sædceller og kortere totter (video 6). Efterhånden som strømningen begynder at aftage, begynder lange sædlinjer at danne et netværk af sædlinjer (video 7; figur 2).
Ved høj strømningshastighed (V > 33 µm/s) øges trådenes spiralbevægelser i et forsøg på at fange mange individuelle sæddannende bundter og bedre modstå strømningens drivende kraft. Ved høj strømningshastighed (V > 33 µm/s) øges trådenes spiralbevægelser i et forsøg på at fange mange individuelle sæddannende bundter og bedre modstå strømningens drivende kraft. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку опытаю множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующих силей. Ved høje strømningshastigheder (V > 33 µm/s) øges strengenes spiralformede bevægelser, da de forsøger at fange mange individuelle sædceller og danner bundter, der bedre er i stand til at modstå strømningens drivende kraft.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 缾 坟 徍从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захть отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Ved høje strømningshastigheder (V > 33 µm/s) øges filamenternes spiralformede bevægelse i et forsøg på at indfange mange individuelle sædceller, der danner bundter, for bedre at modstå strømningens driftkræfter.De forsøgte også at fastgøre mikrokanaler til sidevæggene.
Sædbundter blev identificeret som klynger af sædhoveder og krøllede haler ved hjælp af lysmikroskopi (LM). Sædbundter med forskellige aggregater er også blevet identificeret som snoede hoveder og flagellære aggregater, flere sammenvoksede sædhaler, sædhoveder fastgjort til en hale og sædhoveder med bøjede kerner som flere sammenvoksede kerner. Transmissionselektronmikroskopi (TEM). Scanningselektronmikroskopi (SEM) viste, at sædbundterne var indkapslede aggregater af sædhoveder, og sædaggregaterne viste et fastgjort netværk af indviklede haler.
Sædcellernes morfologi og ultrastruktur samt dannelsen af ​​sædcellernes bundter blev undersøgt ved hjælp af lysmikroskopi (halvt snit), scanningselektronmikroskopi (SEM) og transmissionselektronmikroskopi (TEM). Sædprøver blev farvet med acridinorange og undersøgt ved hjælp af epifluorescensmikroskopi.
Sædudstrygning med acridinorange (fig. 3B) viste, at sædcellernes hoveder var klistret sammen og dækket af sekretorisk materiale, hvilket førte til dannelsen af ​​store totter (fig. 3D). Sædcellerne bestod af sædaggregater med et netværk af vedhæftede haler (fig. 4A-C). Sædcellerne er sammensat af halerne fra mange sædceller, der er klistret sammen (fig. 4D). Hemmeligheder (fig. 4E,F) dækkede hovederne på sædcellerne.
Dannelse af sædcellebundtet Ved hjælp af fasekontrastmikroskopi og sædudstryg farvet med acridinorange viste det sig, at sædcellehovederne klæber sammen. (A) Tidlig dannelse af sædcelletotter begynder med en sædcelle (hvid cirkel) og tre sædcellehoveder (gul cirkel), hvor spiralen starter ved halen og slutter ved hovedet. (B) Fotomikrografi af en sædudstryg farvet med acridinorange, der viser adhærerende sædcellehoveder (pile). Udskillelsen dækker hovedet/hovederne. Forstørrelse × 1000. (C) Udvikling af en stor stråle transporteret af flow i en mikrofluidisk kanal (ved hjælp af et højhastighedskamera ved 950 fps). (D) Mikrograf af en sædudstryg farvet med acridinorange, der viser store totter (pile). Forstørrelse: ×200.
Skanningselektronmikrografi af en sædstråle og et sædudstryg farvet med acridinorange. (A, B, D, E) er digitale farveskanningselektronmikrografier af sædceller, og C og F er mikrografier af acridinorange-farvede sædudstryg, der viser vedhæftning af flere sædceller, der omslutter halevævet. (AC) Sædaggregater vises som et netværk af vedhæftede haler (pile). (D) Adhæsion af flere sædceller (med klæbende stof, lyserød omrids, pil) der omslutter halen. (E og F) Sædhovedaggregater (visere) dækket med klæbende materiale (visere). Sædcellerne dannede bundter med flere hvirvellignende strukturer (F). (C) ×400 og (F) ×200 forstørrelser.
Ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi fandt vi, at sædbundterne havde påsatte haler (fig. 6A, C), hoveder påsat haler (fig. 6B) eller hoveder påsat haler (fig. 6D). Hovederne på sædcellerne i bundtet er buede og præsenteres i sektion to kerneområder (fig. 6D). I incisionsbundtet havde sædcellerne et snoet hoved med to kerneområder og flere flagellære områder (fig. 5A).
Digitalt farveelektronmikrografi, der viser de forbindende haler i sædbundtet og det agglutinerende materiale, der forbinder sædhovederne. (A) Fastgjort hale af et stort antal sædceller. Bemærk, hvordan halen ser ud i både portræt- (pil) og landskabs- (pil) projektioner. (B) Sædcellens hoved (pil) er forbundet med halen (pil). (C) Flere sædhaler (pile) er fastgjort. (D) Agglutinationsmateriale (AS, blå) forbinder fire sædhoveder (lilla).
Skanningselektronmikroskopi blev brugt til at detektere sædhoveder i sædbundter dækket af sekreter eller membraner (figur 6B), hvilket indikerer, at sædbundterne var forankret af ekstracellulært materiale. Det agglutinerede materiale var koncentreret i sædhovedet (vandmandshovedlignende samling; figur 5B) og udvidet distalt, hvilket gav et strålende gult udseende under fluorescensmikroskopi, når det blev farvet med acridinorange (figur 6C). Dette stof er tydeligt synligt under et scanningsmikroskop og betragtes som et bindemiddel. Halvtynde snit (figur 5C) og sædudstryg farvet med acridinorange viste sædbundter med tætpakkede hoveder og krøllede haler (figur 5D).
Diverse fotomikrografer, der viser aggregering af sædcellers hoveder og foldede haler ved hjælp af forskellige metoder. (A) Tværsnits digitalt farvetransmissionselektronmikrografi af et sædcellebundt, der viser et sammenrullet sædcellehoved med en todelt kerne (blå) og flere flagellære dele (grøn). (B) Digitalt farvescanningselektronmikrografi, der viser en klynge af vandmandslignende sædcellers hoveder (pile), der ser ud til at være dækket. (C) Halvtyndt snit, der viser aggregerede sædcellers hoveder (pile) og krøllede haler (pile). (D) Mikrograf af et sædudstryg farvet med acridinorange, der viser aggregater af sædcellers hoveder (pile) og krøllede, vedhængende haler (pile). Bemærk, at et klæbrigt stof (S) dækker sædcellehovedet. (D) × 1000 forstørrelse.
Ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (fig. 7A) blev det også bemærket, at sædcellernes hoveder var snoede, og at kernerne havde en spiralform, hvilket bekræftes af sædudstryg farvet med acridinorange og undersøgt ved hjælp af fluorescensmikroskopi (fig. 7B).
(A) Digital farvetransmissionselektronmikrografi og (B) Acridinorange-farvet sædudstryg, der viser spiralformede hoveder og fastgørelse af sædhoveder og -haler (pile). (B) × 1000 forstørrelse.
Et interessant fund er, at Sharkazis sædceller aggregerer og danner mobile, filamentøse bundter. Egenskaberne ved disse bundter giver os mulighed for at forstå deres mulige rolle i absorptionen og opbevaringen af ​​sædceller i sædcellevævet.
Efter parring kommer sædcellerne ind i vagina og gennemgår en intens selektionsproces, hvilket resulterer i, at kun et begrænset antal sædceller kommer ind i SST15,16. Mekanismerne, hvorved sædceller kommer ind i og forlader SST, er til dato uklare. Hos fjerkræ opbevares sædceller i SST i en længere periode på 2 til 10 uger, afhængigt af arten6. Der er fortsat uenighed om sædens tilstand under opbevaring i SST. Er de i bevægelse eller i hvile? Med andre ord, hvordan opretholder sædceller deres position i SST så længe?
Forman4 foreslog, at SST-residens og -udstødning kunne forklares ud fra sædmotilitet. Forfatterne fremsætter hypotesen om, at sædceller opretholder deres position ved at svømme mod den væskestrøm, der skabes af SST-epitelet, og at sædceller udstødes fra SST, når deres hastighed falder til under det punkt, hvor de begynder at bevæge sig bagud på grund af mangel på energi. Zaniboni5 bekræftede tilstedeværelsen af ​​aquaporiner 2, 3 og 9 i den apikale del af SST-epitelceller, hvilket indirekte kan understøtte Foremans sædopbevaringsmodel. I den aktuelle undersøgelse fandt vi, at næsten halvdelen af ​​Sharkashis sædceller udviser positiv reologi i den strømmende væske, og at agglutinerede sædbundter øger antallet af sædceller, der udviser positiv reologi, selvom agglutination bremser dem. Hvordan sædceller bevæger sig op ad fuglens æggeleder til befrugtningsstedet, er ikke fuldt ud forstået. Hos pattedyr tiltrækker follikulærvæsken sædcellerne kemoattraktion. Imidlertid menes det, at kemoattraktanter kan dirigere sædceller til at nærme sig lange afstande7. Derfor er andre mekanismer ansvarlige for sædtransport. Sædcellers evne til at orientere sig og flyde mod æggeledervæsken, der frigives efter parring, er rapporteret at være en væsentlig faktor i målretningen af ​​sædceller hos mus. Parker17 foreslog, at sædceller krydser æggelederne ved at svømme mod ciliærstrømmen hos fugle og krybdyr. Selvom det ikke er blevet eksperimentelt påvist hos fugle, var Adolphi18 den første til at opdage, at fuglesæd giver positive resultater, når et tyndt lag væske mellem et dækglas og et objektglas skabes med en strimmel filterpapir. Reologi. Hino og Yanagimachi [19] placerede et museæggestok-æggeleder-livmoderkompleks i en perfusionsring og injicerede 1 µl blæk i isthmus for at visualisere væskestrømmen i æggelederne. De bemærkede en meget aktiv bevægelse af sammentrækning og afslapning i æggelederen, hvor alle blækkuglerne bevægede sig støt mod æggelederens ampulla. Forfatterne understreger vigtigheden af ​​​​gennemstrømningen af ​​​​æggeledervæsken fra de nedre til de øvre æggeleder for sædcelleopbygning og befrugtning. Brillard20 rapporterede, at sædceller hos kyllinger og kalkuner migrerer ved aktiv bevægelse fra vaginalindgangen, hvor de opbevares, til den utero-vaginale overgang, hvor de opbevares. Denne bevægelse er dog ikke nødvendig mellem den utero-vaginale overgang og infundibulum, fordi sædcellerne transporteres ved passiv forskydning. Med kendskab til disse tidligere anbefalinger og resultaterne opnået i den aktuelle undersøgelse kan det antages, at sædcellernes evne til at bevæge sig opstrøms (reologi) er en af ​​​​de egenskaber, som selektionsprocessen er baseret på. Dette bestemmer sædcellernes passage gennem vagina og deres indtrængen i CCT til opbevaring. Som Forman4 foreslog, kan dette også lette processen med, at sædceller trænger ind i SST og dens habitat i en periode og derefter forlader den, når deres hastighed begynder at aftage.
På den anden side foreslog Matsuzaki og Sasanami21, at fuglesædceller undergår motilitetsændringer fra dvale til motilitet i de mandlige og kvindelige reproduktionskanaler. Hæmning af den residente sædmotilitet i SST er blevet foreslået som en forklaring på den lange opbevaringstid for sædceller og derefter foryngelse efter at have forladt SST. Under hypoksiske forhold rapporterede Matsuzaki et al.1 høj produktion og frigivelse af laktat i SST, hvilket kan føre til hæmning af den residente sædmotilitet. I dette tilfælde afspejles vigtigheden af ​​sædreologi i selektionen og absorptionen af ​​sædceller og ikke i deres opbevaring.
Sædcellernes agglutinationsmønster betragtes som en plausibel forklaring på den lange opbevaringsperiode for sædceller i SST'en, da dette er et almindeligt mønster for sædretention hos fjerkræ2,22,23. Bakst et al.2 observerede, at de fleste sædceller klæbede til hinanden og dannede fascikulære aggregater, og enkelte sædceller blev sjældent fundet i vagtel-CCM. På den anden side observerede Wen et al.24 flere spredte sædceller og færre sædcellernes totter i SST'ens lumen hos kyllinger. Baseret på disse observationer kan det antages, at tilbøjeligheden til sædcellernes agglutination varierer mellem fugle og mellem sædceller i samme ejakulat. Derudover foreslog Van Krey et al.9, at tilfældig dissociation af agglutinerede sædceller er ansvarlig for den gradvise penetration af sædceller ind i æggelederens lumen. Ifølge denne hypotese bør sædceller med lavere agglutinationskapacitet udstødes fra SST'en først. I denne sammenhæng kan sædcellernes evne til at agglutinere være en faktor, der påvirker resultatet af sædkonkurrence hos beskidte fugle. Derudover gælder det, at jo længere den agglutinerede sædcelle dissocierer, desto længere opretholdes fertiliteten.
Selvom spermatozoaggregering og aggregering i bundter er blevet observeret i adskillige studier2,22,24, er de ikke blevet beskrevet i detaljer på grund af kompleksiteten af ​​deres kinematiske observation i SST. Der er gjort adskillige forsøg på at studere sædagglutination in vitro. Omfattende, men forbigående aggregering blev observeret, da den tynde tråd blev fjernet fra den dinglende frødråbe. Dette fører til, at en aflang boble stikker ud fra dråben og imiterer sædkirtlen. På grund af 3D-begrænsninger og korte dryptørringstider forfaldt hele blokken hurtigt9. I den aktuelle undersøgelse var vi i stand til at beskrive, hvordan disse totter dannes, og hvordan de bevæger sig, ved hjælp af Sharkashi-kyllinger og mikrofluidiske chips. Sædbundter blev dannet umiddelbart efter sædopsamling og bevægede sig i en spiral, hvilket udviste positiv reologi, når de var til stede i flowet. Desuden er det, når det ses makroskopisk, blevet observeret, at sædbundter øger lineariteten af ​​motiliteten sammenlignet med isolerede spermatozoer. Dette tyder på, at sædagglutination kan forekomme før SST-penetration, og at sædproduktionen ikke er begrænset til et lille område på grund af stress, som tidligere foreslået (Tingari og Lake12). Under totdannelse svømmer sædcellerne synkront, indtil de danner en forbindelse, hvorefter deres haler vikler sig om hinanden, og sædcellens hoved forbliver frit, men halen og den distale del af sædcellen klæber sammen med et klæbrigt stof. Derfor er det frie hoved af ligamentet ansvarlig for bevægelsen og trækker resten af ​​ligamentet med sig. Scanningselektronmikroskopi af sædbundterne viste fastgjorte sædhoveder dækket af en masse klæbrigt materiale, hvilket tyder på, at sædhovederne var fastgjort i hvilebundter, hvilket kan være sket efter at have nået opbevaringsstedet (SST).
Når en sædudstryg farves med acridinorange, kan ekstracellulært klæbende materiale omkring sædcellerne ses under et fluorescerende mikroskop. Dette stof gør det muligt for sædbundterne at klæbe til og hænge fast på omgivende overflader eller partikler, så de ikke driver med den omgivende strøm. Vores observationer viser således den rolle, spermatozoernes adhæsion spiller i form af mobile bundter. Deres evne til at svømme mod strømmen og klæbe til nærliggende overflader gør det muligt for sædcellerne at forblive længere i sædcellemembranen.
Rothschild25 brugte et hæmocytometrikamera til at studere den flydende fordeling af kvægsæd i en dråbe suspension ved at tage fotomikrografer gennem et kamera med både vertikal og horisontal optisk akse i mikroskopet. Resultaterne viste, at sædcellerne blev tiltrukket af kammerets overflade. Forfatterne antyder, at der kan være hydrodynamiske interaktioner mellem sædcellerne og overfladen. I betragtning af dette, sammen med Sharkashi-kyllingesæds evne til at danne klæbrige totter, kan det øge sandsynligheden for, at sæd klæber til SST-væggen og opbevares i lange perioder.
Bccetti og Afzeliu26 rapporterede, at sædcelleglycokalyxen er nødvendig for genkendelse og agglutination af gameter. Forman10 observerede, at hydrolyse af α-glykosidbindinger i glykoprotein-glykolipidbelægninger ved behandling af fuglesæd med neuraminidase resulterede i reduceret fertilitet uden at påvirke sædmotiliteten. Forfatterne antyder, at effekten af ​​neuraminidase på glykokalyxen forringer sædbindingen ved utero-vaginalforbindelsen og derved reducerer fertiliteten. Deres observationer kan ikke ignorere muligheden for, at neuraminidasebehandling kan reducere genkendelse af sædceller og oocytter. Forman og Engel10 fandt, at fertiliteten blev reduceret, når høns blev insemineret intravaginalt med sæd behandlet med neuraminidase. IVF med neuraminidasebehandlet sæd påvirkede dog ikke fertiliteten sammenlignet med kontrolkyllinger. Forfatterne konkluderede, at ændringer i glykoprotein-glykolipid-belægningen omkring sædmembranen reducerede sædcellernes evne til at befrugte ved at forringe optagelsen af ​​sædceller ved den utero-vaginale overgang, hvilket igen øgede sædtabet på grund af hastigheden af ​​den utero-vaginale overgang, men ikke påvirker genkendelsen af ​​sædceller og æg.
Hos kalkuner fandt Bakst og Bauchan 11 små vesikler og membranfragmenter i lumen af ​​SST og observerede, at nogle af disse granuler var fusioneret med sædmembranen. Forfatterne antyder, at disse forhold kan bidrage til langtidsopbevaring af sædceller i SST. Forskerne specificerede dog ikke kilden til disse partikler, om de udskilles af CCT-epitelceller, produceres og udskilles af det mandlige reproduktionssystem eller produceres af selve sædcellen. Disse partikler er også ansvarlige for agglutination. Grützner et al.27 rapporterede, at epididymale epitelceller producerer og udskiller et specifikt protein, der er nødvendigt for dannelsen af ​​enkeltporede sædkanaler. Forfatterne rapporterer også, at spredningen af ​​disse bundter afhænger af interaktionen mellem epididymale proteiner. Nixon et al.28 fandt, at adnexa udskiller et protein, det sure cysteinrige osteonektin; SPARC er involveret i dannelsen af ​​sædtotter hos kortnæbbede echidner og næbdyr. Spredningen af ​​disse stråler er forbundet med tabet af dette protein.
I den aktuelle undersøgelse viste ultrastrukturel analyse ved hjælp af elektronmikroskopi, at sædcellerne hæftede til en stor mængde tæt materiale. Disse stoffer menes at være ansvarlige for den agglutination, der kondenserer mellem og omkring de adhærerende hoveder, men i lavere koncentrationer i haleområdet. Vi antager, at dette agglutinerende stof udskilles fra det mandlige reproduktionssystem (epididymis eller sædleder) sammen med sæd, da vi ofte observerer sæd, der adskiller sig fra lymfe og sædplasma under ejakulation. Det er blevet rapporteret, at når fuglesædceller passerer gennem epididymis og sædleder, undergår de modningsrelaterede ændringer, der understøtter deres evne til at binde proteiner og erhverve plasma-lemma-associerede glykoproteiner. Persistensen af ​​disse proteiner på residente sædmembraner i SST antyder, at disse proteiner kan påvirke erhvervelsen af ​​sædmembranstabilitet 30 og bestemme deres fertilitet 31. Ahammad et al32 rapporterede, at sædceller fra forskellige dele af det mandlige reproduktionssystem (fra testiklerne til den distale sædleder) viste en progressiv stigning i levedygtighed under flydende opbevaringsforhold, uanset opbevaringstemperatur, og levedygtigheden hos kyllinger stiger også i æggelederne efter kunstig insemination.
Sharkashi-høns sædbundter har andre karakteristika og funktioner end andre arter såsom myrepindsvin, næbdyr, skovmus, hjorterotter og marsvin. Hos sharkasi-høns reducerede dannelsen af ​​sædbundter deres svømmehastighed sammenlignet med enkeltsædceller. Disse bundter øgede dog procentdelen af ​​rheologisk positive sædceller og øgede sædcellernes evne til at stabilisere sig i et dynamisk miljø. Vores resultater bekræfter således det tidligere forslag om, at sædagglutination i SST er forbundet med langvarig sædopbevaring. Vi antager også, at sædcellers tilbøjelighed til at danne totter kan kontrollere hastigheden af ​​sædtab i SST, hvilket kan ændre resultatet af sædkonkurrence. Ifølge denne antagelse frigiver sædceller med lav agglutinationskapacitet SST først, mens sædceller med høj agglutinationskapacitet producerer det meste af afkommet. Dannelsen af ​​enkeltporede sædbundter er gavnlig og påvirker forældre-barn-forholdet, men bruger en anden mekanisme. Hos myrepindsvin og næbdyr er sædcellerne arrangeret parallelt med hinanden for at øge strålens fremadrettede hastighed. Bundter af myrepindsvin bevæger sig omkring tre gange hurtigere end enkeltstående sædceller. Det menes, at dannelsen af ​​sådanne sædtotter hos myrepindsvin er en evolutionær tilpasning for at opretholde dominans, da hunnerne er promiskuøse og normalt parrer sig med flere hanner. Derfor konkurrerer sædceller fra forskellige ejakulater hårdt om befrugtningen af ​​ægget.
Agglutinerede sædceller fra sharkasi-kyllinger er lette at visualisere ved hjælp af fasekontrastmikroskopi, hvilket anses for at være fordelagtigt, fordi det muliggør nem undersøgelse af sædcellernes adfærd in vitro. Mekanismen, hvorved dannelsen af ​​sædtotter fremmer reproduktion hos sharkasi-kyllinger, er også forskellig fra den, der ses hos nogle placentapattedyr, der repræsenterer kooperativ sædadfærd, såsom skovmus, hvor nogle sædceller når æggene og hjælper andre beslægtede individer med at nå og beskadige deres æg. at bevise sig selv. altruistisk adfærd. Selvbefrugtning 34. Et andet eksempel på kooperativ adfærd hos sædceller blev fundet hos hjortemus, hvor sædceller var i stand til at identificere og kombinere med de mest genetisk beslægtede sædceller og danne kooperative grupper for at øge deres hastighed sammenlignet med ubeslægtede sædceller 35.
Resultaterne opnået i denne undersøgelse modsiger ikke Fomans teori om langtidsopbevaring af sædceller i SWS. Forskerne rapporterer, at sædceller fortsætter med at bevæge sig i strømmen af ​​epitelceller, der beklæder SST'en, i en længere periode, og efter en vis periode er sædcellernes energilagre udtømte, hvilket resulterer i et fald i hastigheden, hvilket tillader udstødning af stoffer med lav molekylvægt. Spermiens energi udstødes med væskestrømmen fra SST'ens lumen til æggelederens hulrum. I den aktuelle undersøgelse observerede vi, at halvdelen af ​​de enkelte sædceller viste evnen til at svømme mod strømmende væsker, og deres adhæsion i bundtet øgede deres evne til at vise positiv reologi. Desuden er vores data i overensstemmelse med Matsuzaki et al.1, der rapporterede, at øget laktatsekretion i SST kan hæmme den residente sædmotilitet. Vores resultater beskriver dog dannelsen af ​​sædcellernes motile ligamenter og deres reologiske adfærd i nærvær af et dynamisk miljø i en mikrokanal i et forsøg på at belyse deres adfærd i SST. Fremtidig forskning kan fokusere på at bestemme den kemiske sammensætning og oprindelsen af ​​det agglutinerende middel, hvilket utvivlsomt vil hjælpe forskere med at udvikle nye måder at opbevare flydende sæd og øge fertilitetsvarigheden.
Femten 30 uger gamle barhalsede han-sharkasi (homozygot dominant; NaNa) blev udvalgt som sæddonorer i undersøgelsen. Fuglene blev opdrættet på forskningsfjerkræfarmen ved Fakultetet for Landbrug, Ashit Universitet, Ashit Governorate, Egypten. Fuglene blev anbragt i individuelle bure (30 x 40 x 40 cm), udsat for et lysprogram (16 timers lys og 8 timers mørke) og fodret med en diæt indeholdende 160 g råprotein, 2800 kcal metaboliserbar energi, 35 g calcium hver og 5 gram tilgængeligt fosfor pr. kilogram diæt.
Ifølge data 36, ​​37 blev sæd fra hanner indsamlet ved hjælp af mavemassage. I alt 45 sædprøver blev indsamlet fra 15 mænd over 3 dage. Sæd (n = 15/dag) blev straks fortyndet 1:1 (v:v) med Belsville Poultry Semen Diluent, som indeholder kaliumdiphosphat (1,27 g), mononatriumglutamatmonohydrat (0,867 g), fruktose (0,5 d), vandfrit natriumacetat (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethan (0,195 g), kaliumcitratmonohydrat (0,064 g), kaliummonofosfat (0,065 g), magnesiumchlorid (0,034 g) og H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritet 333 mOsm/kg38. Fortyndede sædprøver blev først undersøgt under et lysmikroskop for at sikre god sædkvalitet (fugtighed) og derefter opbevaret i et vandbad ved 37 °C indtil brug inden for en halv time efter indsamling.
Sædcellernes kinematik og reologi beskrives ved hjælp af et system af mikrofluidiske anordninger. Sædprøver blev yderligere fortyndet til 1:40 i Beltsville Avian Semen Diluent, fyldt i en mikrofluidisk anordning (se nedenfor), og de kinetiske parametre blev bestemt ved hjælp af et Computerized Semen Analysis (CASA) system, der tidligere var udviklet til mikrofluidisk karakterisering, om mobiliteten af ​​sædceller i flydende medier (Institut for Mekanik, Det Tekniske Fakultet, Assiut Universitet, Egypten). Plugin'et kan downloades på: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Kurvehastighed (VCL, μm/s), lineær hastighed (VSL, μm/s) og gennemsnitlig banehastighed (VAP, μm/s) blev målt. Videoer af sædceller blev taget ved hjælp af et inverteret Optika XDS-3 faset kontrastmikroskop (med 40x objektiv) forbundet til et Tucson ISH1000 kamera ved 30 fps i 3 s. Brug CASA-softwaren til at studere mindst tre områder og 500 sædbaner pr. prøve. Den optagede video blev behandlet ved hjælp af en hjemmelavet CASA. Definitionen af ​​motilitet i CASA-plugin'et er baseret på sædcellernes svømmehastighed sammenlignet med strømningshastigheden og inkluderer ikke andre parametre såsom side-til-side bevægelse, da dette har vist sig at være mere pålideligt i væskestrømning. Reologisk bevægelse beskrives som sædcellers bevægelse mod væskestrømningsretningen. Sædceller med reologiske egenskaber blev divideret med antallet af motile sædceller; sædceller, der var i hvile, og konvektivt bevægende sædceller blev ekskluderet fra optællingen.
Alle anvendte kemikalier blev indkøbt fra Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egypten), medmindre andet er angivet. Enheden blev fremstillet som beskrevet af El-sherry et al. 40 med nogle ændringer. Materialerne til fremstilling af mikrokanalerne omfattede glasplader (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativ resist (MicroChem, Newton, CA), diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) og polyacetone. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanalerne fremstilles ved hjælp af blød litografi. Først blev en klar beskyttende ansigtsmaske med det ønskede mikrokanaldesign trykt på en højopløsningsprinter (Prismatic, Cairo, Egypten og Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masterne blev lavet ved hjælp af glasplader som substrater. Pladerne blev renset i acetone, isopropanol og deioniseret vand og derefter belagt med et 20 µm lag SU8-25 ved spincoating (3000 rpm, 1 min). SU-8-lagene blev derefter forsigtigt tørret (65 °C, 2 min og 95 °C, 10 min) og eksponeret for UV-stråling i 50 sekunder. Eftereksponering bages ved 65 °C og 95 °C i 1 min og 4 min for at tværbinde de eksponerede SU-8-lag, efterfulgt af fremkaldelse i diacetonalkohol i 6,5 min. Vaflerne hårdbages (200 °C i 15 min) for yderligere at størkne SU-8-laget.
PDMS blev fremstillet ved at blande monomeren og hærderen i et vægtforhold på 10:1, derefter afgasset i en vakuumekssikkator og hældt på SU-8 hovedrammen. PDMS'en blev hærdet i en ovn (120 °C, 30 min), hvorefter kanalerne blev skåret ud, adskilt fra masteren og perforeret for at tillade rør at blive fastgjort ved indløb og udløb af mikrokanalen. Endelig blev PDMS-mikrokanaler permanent fastgjort til mikroskopglas ved hjælp af en bærbar koronaprocessor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) som beskrevet andetsteds. Den mikrokanal, der blev anvendt i denne undersøgelse, måler 200 µm × 20 µm (B × H) og er 3,6 cm lang.
Væskestrømmen induceret af hydrostatisk tryk inde i mikrokanalen opnås ved at holde væskeniveauet i indløbsreservoiret over højdeforskellen Δh39 i udløbsreservoiret (fig. 1).
hvor f er friktionskoefficienten, defineret som f = C/Re for laminar strømning i en rektangulær kanal, hvor C er en konstant afhængig af kanalens aspektforhold, L er mikrokanalens længde, Vav er den gennemsnitlige hastighed inde i mikrokanalen, Dh er kanalens hydrauliske diameter, g – tyngdeaccelerationen. Ved hjælp af denne ligning kan den gennemsnitlige kanalhastighed beregnes ved hjælp af følgende ligning: