Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Fuglenes frugtbarhed afhænger af deres evne til at opbevare nok levedygtige sædceller i en længere periode i sædopbevaringsrørene (SST).Den nøjagtige mekanisme, hvorved spermatozoer kommer ind, opholder sig i og forlader SST, er fortsat kontroversiel.Sæden fra sharkasi-høns viste en høj tendens til agglutination og dannede mobile filamentøse bundter indeholdende mange celler.På grund af vanskeligheden ved at observere sædcellers motilitet og adfærd i et uigennemsigtigt æggeleder, brugte vi en mikrofluidisk enhed med et mikrokanaltværsnit svarende til sædceller til at studere sædcellers agglutination og motilitet.Denne undersøgelse diskuterer, hvordan sædbundter dannes, hvordan de bevæger sig, og deres mulige rolle i forlængelse af sædophold i SST.Vi undersøgte sædhastighed og rheologisk adfærd, når væskeflow blev genereret i en mikrofluidisk kanal ved hydrostatisk tryk (flowhastighed = 33 µm/s).Sædcellerne har en tendens til at svømme mod strømmen (positiv rheologi), og hastigheden af ​​sædbundtet er væsentligt reduceret sammenlignet med enkelte sædceller.Spermbundter er blevet observeret at bevæge sig i en spiral og øges i længde og tykkelse, efterhånden som flere enkelt sædceller rekrutteres. Spermbundter blev observeret nærme sig og klæbe til sidevæggene af de mikrofluidiske kanaler for at undgå at blive fejet med væskestrømningshastighed > 33 µm/s. Spermbundter blev observeret nærme sig og klæbe til sidevæggene af de mikrofluidiske kanaler for at undgå at blive fejet med væskestrømningshastighed > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных, микрофлюидных, микрофлюидных етания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Spermbundter er blevet observeret at nærme sig og klæbe til sidevæggene af de mikrofluidiske kanaler for at undgå at blive fejet væk ved væskestrømningshastigheder >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速>/33 sサs33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостног, боковым стенкам микрожидкостног метания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Spermbundter er blevet observeret at nærme sig og klæbe til sidevæggene af mikrofluidkanalen for at undgå at blive fejet væk af væskestrøm ved >33 µm/s.Scanning og transmissionselektronmikroskopi afslørede, at sædbundterne blev understøttet af rigeligt tæt materiale.De opnåede data viser Sharkazi-kyllingesædens unikke mobilitet samt sædcellers evne til at agglutinere og danne mobile bundter, hvilket bidrager til en bedre forståelse af langtidsopbevaring af sædceller i SMT.
For at opnå befrugtning hos mennesker og de fleste dyr skal sæd og æg ankomme til befrugtningsstedet på det rigtige tidspunkt.Derfor skal parring ske før eller på tidspunktet for ægløsning.På den anden side opbevarer nogle pattedyr, såsom hunde, såvel som ikke-pattedyrarter, såsom insekter, fisk, krybdyr og fugle, sædceller i deres reproduktionsorganer i længere tid, indtil deres æg er klar til befrugtning (asynkron befrugtning 1 ).Fugle er i stand til at opretholde levedygtigheden af ​​sædceller, der er i stand til at befrugte æg i 2-10 uger2.
Dette er en unik egenskab, der adskiller fugle fra andre dyr, da det giver stor sandsynlighed for befrugtning efter en enkelt insemination i flere uger uden samtidig parring og ægløsning.Det vigtigste sædopbevaringsorgan, kaldet sædopbevaringsrøret (SST), er placeret i de indre slimhindefolder ved den uterovaginale forbindelse.Til dato er de mekanismer, hvorved sæd kommer ind, opholder sig og forlader sædbanken, ikke fuldt ud forstået.På baggrund af tidligere undersøgelser er der fremsat mange hypoteser, men ingen af ​​dem er blevet bekræftet.
Forman4 antog, at spermatozoer opretholder deres ophold i SST-hulrummet gennem kontinuerlig oscillerende bevægelse mod retningen af ​​væskestrømning gennem proteinkanaler placeret på SST-epitelceller (rheologi).ATP er udtømt på grund af den konstante flagellære aktivitet, der er nødvendig for at holde sæden i SST-lumen, og motiliteten falder til sidst, indtil sæden føres ud af sædbanken af ​​væskestrømmen og begynder en ny rejse ned ad den stigende æggeleder for at befrugte sæden.Æg (Forman4).Denne model for sædopbevaring understøttes af påvisning ved immuncytokemi af aquaporin 2, 3 og 9 til stede i SST-epitelceller.Til dato mangler der undersøgelser af kyllingesæd-reologi og dens rolle i SST-opbevaring, vaginal sædselektion og sædkonkurrence.Hos kyllinger kommer sædcellerne ind i skeden efter naturlig parring, men mere end 80 % af sædcellerne udstødes fra skeden kort efter parring.Dette tyder på, at skeden er det primære sted for sædselektion hos fugle.Derudover er det blevet rapporteret, at mindre end 1% af sædceller befrugtet i skeden ender i SSTs2.Ved kunstig befrugtning af kyllinger i skeden har antallet af spermatozoer, der når SST, en tendens til at stige 24 timer efter insemination.Indtil videre er mekanismen for sædselektion under denne proces uklar, og sædmotilitet kan spille en vigtig rolle i SST-spermoptagelsen.På grund af æggeledernes tykke og uigennemsigtige vægge er det vanskeligt direkte at overvåge sædmotiliteten i fuglenes æggeledere.Derfor mangler vi grundlæggende viden om, hvordan sædceller overgår til SST efter befrugtning.
Rheologi er for nylig blevet anerkendt som en vigtig faktor, der kontrollerer sædtransport i pattedyrets kønsorganer.Baseret på bevægelige spermatozoers evne til at migrere modstrøm, brugte Zaferani et al8 et corra-mikrofluidisk system til passivt at isolere bevægelige spermatozoer fra indkapslede sædprøver.Denne type sædsortering er afgørende for medicinsk infertilitetsbehandling og klinisk forskning og foretrækkes frem for traditionelle metoder, der er tids- og arbejdskrævende og kan kompromittere sædmorfologi og strukturel integritet.Til dato er der dog ikke udført undersøgelser af virkningen af ​​sekreter fra kyllingers kønsorganer på sædmotilitet.
Uanset mekanismen, der holder sæd opbevaret i SST, har mange efterforskere observeret, at residente spermatozoer agglutinerer head-to-head i SST af kyllinger 9, 10, vagtler 2 og kalkuner 11 for at danne agglutinerede sædbundter.Forfatterne foreslår, at der er en sammenhæng mellem denne agglutination og langtidsopbevaring af spermatozoer i SST.
Tingari og Lake12 rapporterede en stærk sammenhæng mellem spermatozoer i den sædmodtagende kirtel på kyllingen og stillede spørgsmålstegn ved, om fuglespermatozoer agglutinerer på samme måde som pattedyrsspermatozoer.De mener, at de dybe forbindelser mellem sædceller i sædlederen kan skyldes stress forårsaget af tilstedeværelsen af ​​et stort antal sædceller i et lille rum.
Ved evaluering af spermatozoers adfærd på friske hængende objektglas kan der ses forbigående tegn på agglutination, især i kanterne af sæddråberne.Imidlertid blev agglutination ofte forstyrret af rotationsvirkningen forbundet med kontinuerlig bevægelse, hvilket forklarer den forbigående karakter af dette fænomen.Forskerne bemærkede også, at når fortyndingsmidlet blev tilsat sæden, opstod der aflange "trådlignende" celleaggregater.
Tidlige forsøg på at efterligne en spermatozoon blev gjort ved at fjerne en tynd tråd fra en hængende dråbe, hvilket resulterede i en aflang sædlignende vesikel, der stak ud fra sæddråben.Spermatozoerne stillede sig straks på en parallel måde i vesiklen, men hele enheden forsvandt hurtigt på grund af 3D-begrænsningen.For at studere spermatozoagglutination er det derfor nødvendigt at observere sædcellers motilitet og adfærd direkte i isolerede sædopbevaringstubuli, hvilket er svært at opnå.Derfor er det nødvendigt at udvikle et instrument, der efterligner spermatozoer for at understøtte undersøgelser af sædmotilitet og agglutinationsadfærd.Brillard et al13 rapporterede, at den gennemsnitlige længde af sædopbevaringsrør hos voksne kyllinger er 400-600 µm, men nogle SST'er kan være så lange som 2000 µm.Mero og Ogasawara14 opdelte sædkirtlerne i forstørrede og ikke-forstørrede sædopbevaringstubuli, som begge havde samme længde (~500 µm) og halsbredde (~38 µm), men den gennemsnitlige lumendiameter af tubuli var 56,6 og 56,6 µm..11,2 μm, henholdsvis.I den aktuelle undersøgelse brugte vi en mikrofluidisk enhed med en kanalstørrelse på 200 µm × 20 µm (B × H), hvis tværsnit er noget tæt på det for den forstærkede SST.Derudover undersøgte vi sædmotilitet og agglutinationsadfærd i flydende væske, hvilket er i overensstemmelse med Foremans hypotese om, at væske produceret af SST-epitelceller holder sædceller i lumen i en modstrøms (reologisk) retning.
Formålet med denne undersøgelse var at overvinde problemerne med at observere sædcellers motilitet i æggelederen og at undgå vanskelighederne med at studere sædcellers rheologi og adfærd i et dynamisk miljø.En mikrofluidisk enhed blev brugt, der skaber hydrostatisk tryk for at simulere sædmotilitet i kønsorganerne på en kylling.
Når en dråbe af en fortyndet sædprøve (1:40) blev fyldt i mikrokanalanordningen, kunne to typer sædmotilitet identificeres (isoleret sæd og bundet sæd).Derudover havde sædceller en tendens til at svømme mod strømmen (positiv rheologi; video 1, 2). Selvom sædbundter havde lavere hastighed end ensomme sædceller (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​sædceller, der viste positiv rheotaxis (p < 0,001; tabel 2). Selvom sædbundter havde lavere hastighed end ensomme sædceller (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​sædceller, der viste positiv rheotaxis (p < 0,001; tabel 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), ливетич озоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Selvom spermatozobundterne havde en lavere hastighed end enkelt spermatozoer (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​spermatozoer, der viste positiv rheotaxis (p < 0,001; tabel 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳显示阳分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 澧 倧倲 礧 阾倧 示分比 （p <0,001； 2。。。。。。））)) Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0.001), они увелитичи положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Selvom hastigheden af ​​sædbundter var lavere end for enkelte sædceller (p < 0,001), øgede de procentdelen af ​​sædceller med positiv rheologi (p < 0,001; tabel 2).Positiv rheologi for enkelte spermatozoer og totter er estimeret til henholdsvis ca. 53 % og 85 %.
Det er blevet observeret, at spermatozoer fra sharkasi-kyllinger umiddelbart efter ejakulation danner lineære bundter, bestående af snesevis af individer.Disse totter øges i længde og tykkelse over tid og kan forblive in vitro i flere timer, før de forsvinder (video 3).Disse filamentøse bundter er formet som echidna spermatozoer, der dannes for enden af ​​epididymis.Sharkashi-hønsæd har vist sig at have en høj tendens til at agglutinere og danne et netbundt på mindre end et minut efter opsamling.Disse bjælker er dynamiske og i stand til at klæbe til nærliggende vægge eller statiske objekter.Selvom sædbundter reducerer sædcellernes hastighed, er det klart, at makroskopisk øger de deres linearitet.Længden af ​​bundterne varierer afhængigt af antallet af sæd, der er indsamlet i bundter.To dele af bundtet blev isoleret: den indledende del, inklusive det frie hoved af den agglutinerede sæd, og den terminale del, inklusive halen og hele den distale ende af sæden.Ved hjælp af et højhastighedskamera (950 fps) blev frie hoveder af agglutinerede spermatozoer observeret i den indledende del af bundtet, ansvarlige for bundtets bevægelse på grund af deres oscillerende bevægelse, idet de trak de resterende ind i bundtet med en spiralformet bevægelse (video 4).I lange totter er det imidlertid blevet observeret, at nogle frie sædhoveder klæber til kroppen, og den endelige del af totten fungerer som skovle for at hjælpe med at fremdrive totten.
Mens sædbundterne i en langsom væskestrøm bevæger sig parallelt med hinanden, begynder de dog at overlappe hinanden og holde sig til alt, hvad der er stille, for ikke at blive skyllet væk af strømmen, når strømningshastigheden øges.Bundterne dannes, når en håndfuld sædceller nærmer sig hinanden, de begynder at bevæge sig synkront og vikler sig om hinanden, for derefter at holde sig til et klæbrigt stof.Figur 1 og 2 viser, hvordan sæden nærmer sig hinanden og danner et kryds, når halerne vikler sig om hinanden.
Forskerne anvendte hydrostatisk tryk for at skabe væskestrøm i en mikrokanal for at studere sædcellers reologi.En mikrokanal med en størrelse på 200 µm × 20 µm (B × H) og en længde på 3,6 µm blev anvendt.Brug mikrokanaler mellem beholderne med sprøjter monteret i enderne.Madfarve blev brugt til at gøre kanalerne mere synlige.
Bind forbindelseskabler og tilbehør til væggen.Videoen er taget med et fasekontrastmikroskop.Med hvert billede præsenteres fasekontrastmikroskopi og kortlægningsbilleder.(A) Forbindelsen mellem to strømme modstår strømmen på grund af spiralformet bevægelse (rød pil).(B) Forbindelsen mellem rørbundtet og kanalvæggen (røde pile), samtidig forbindes de med to andre bundter (gule pile).(C) Sædbundter i mikrofluidkanalen begynder at forbinde sig med hinanden (røde pile), og danner et net af sædbundter.(D) Dannelse af et netværk af sædbundter.
Når en dråbe fortyndet sperm blev fyldt i den mikrofluidiske enhed, og der blev skabt en strømning, blev sædstrålen observeret at bevæge sig mod strømmens retning.Bundterne passer tæt mod mikrokanalernes vægge, og de frie hoveder i den indledende del af bundterne passer tæt mod dem (video 5).De holder sig også til stationære partikler på deres vej, såsom affald, for at modstå at blive fejet væk af strømmen.Over tid bliver disse totter lange filamenter, der fanger andre enkelte spermatozoer og kortere totter (video 6).Efterhånden som strømmen begynder at aftage, begynder lange linjer af sperm at danne et netværk af spermlinjer (video 7; figur 2).
Ved høj strømningshastighed (V > 33 µm/s) øges trådens spiralbevægelser som et forsøg på at fange mange individuelle sæddannende bundter bedre modstå strømmens drivende kraft. Ved høj strømningshastighed (V > 33 µm/s) øges trådens spiralbevægelser som et forsøg på at fange mange individuelle sæddannende bundter bedre modstå strømmens drivende kraft. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку оспони пость отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Ved høje strømningshastigheder (V > 33 µm/s) øges de spiralformede bevægelser af strengene, da de forsøger at fange mange individuelle spermatozoer, der danner bundter, der bedre er i stand til at modstå strømmens drivende kraft.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形丐束的在高流速好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形仲 坟 形仲 坟 形更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 mkm/s) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захн сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Ved høje strømningshastigheder (V > 33 µm/s) øges den spiralformede bevægelse af filamenterne i et forsøg på at fange mange individuelle spermatozodannende bundter for bedre at modstå strømmens afdriftskræfter.De forsøgte også at fastgøre mikrokanaler til sidevæggene.
Spermbundter blev identificeret som klynger af sædhoveder og krøllede haler ved hjælp af lysmikroskopi (LM).Spermbundter med forskellige aggregater er også blevet identificeret som snoede hoveder og flagellære aggregater, multiple fusionerede spermhaler, spermhoveder fastgjort til en hale og spermhoveder med bøjede kerner som multiple fusionerede kerner.transmissionselektronmikroskopi (TEM).Scanningelektronmikroskopi (SEM) viste, at sædbundterne var beklædte aggregater af spermhoveder, og spermaggregaterne viste et fastgjort netværk af omviklede haler.
Morfologien og ultrastrukturen af ​​spermatozoer, dannelsen af ​​spermatozobundter blev undersøgt ved hjælp af lysmikroskopi (halvt snit), scanningselektronmikroskopi (SEM) og transmissionselektronmikroskopi (TEM), spermudstrygninger blev farvet med acridinorange og undersøgt ved hjælp af epifluorescensmikroskopi.
Sædudstrygningsfarvning med acridin orange (fig. 3B) viste, at sædhovederne var klistret sammen og dækket med sekretorisk materiale, hvilket førte til dannelsen af ​​store totter (fig. 3D).Sædbundterne bestod af sædaggregater med et netværk af vedhæftede haler (fig. 4A-C).Sædbundter er sammensat af halerne af mange sædceller, der sidder sammen (fig. 4D).Hemmeligheder (fig. 4E,F) dækkede hovederne af sædbundter.
Dannelse af spermatozobundtet Ved hjælp af fasekontrastmikroskopi og sædpræparater farvet med acridin orange, viste det sig, at spermatozoernes hoveder klæber sammen.(A) Tidlig dannelse af sædklynger begynder med en sædcelle (hvid cirkel) og tre sædceller (gul cirkel), hvor spiralen starter ved halen og ender ved hovedet.(B) Mikrofotografi af en sædpræparat farvet med acridin orange, der viser vedhæftende sædhoveder (pile).Udledningen dækker hovedet/hovederne.Forstørrelse × 1000. (C) Udvikling af en stor stråle, der transporteres af flow i en mikrofluidisk kanal (ved hjælp af et højhastighedskamera ved 950 fps).(D) Mikrografi af en sædpræparat farvet med acridin orange, der viser store totter (pile).Forstørrelse: ×200.
Scanningelektronmikrografi af en spermstråle og en spermudstrygning farvet med acridin orange.(A, B, D, E) er digitale farvescanningselektronmikrofotografier af spermatozoer, og C og F er mikrofotografier af acridin-orangefarvede spermudstrygninger, der viser vedhæftning af multiple spermatozoer, der omslutter det kaudale væv.(AC) Spermaggregater er vist som et netværk af vedhæftede haler (pile).(D) Adhæsion af flere spermatozoer (med klæbende stof, lyserødt omrids, pil), der vikler sig rundt om halen.(E og F) Spermhovedaggregater (pointers) dækket med klæbende materiale (pointers).Spermatozoerne dannede bundter med flere hvirvellignende strukturer (F).(C) ×400 og (F) ×200 forstørrelser.
Ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi fandt vi ud af, at sædbundter havde fastgjorte haler (fig. 6A, C), hoveder fastgjort til haler (fig. 6B) eller hoveder fastgjort til haler (fig. 6D).Sædcellernes hoveder i bundtet er buede og præsenterer i sektion to nukleare områder (fig. 6D).I incisionsbundtet havde spermatozoerne et snoet hoved med to nukleare områder og multiple flagelområder (fig. 5A).
Digitalt farveelektronmikrografi, der viser forbindelseshalerne i sædbundtet og det agglutinerende materiale, der forbinder sædhovederne.(A) Vedhæftet hale af et stort antal spermatozoer.Læg mærke til, hvordan halen ser ud i både portræt (pil) og landskab (pil) projektioner.(B) Sædens hoved (pil) er forbundet med halen (pil).(C) Adskillige sædhaler (pile) er fastgjort.(D) Agglutinationsmateriale (AS, blå) forbinder fire spermhoveder (lilla).
Scanningelektronmikroskopi blev brugt til at detektere spermhoveder i spermbundter dækket med sekreter eller membraner (figur 6B), hvilket indikerer, at spermbundterne var forankret af ekstracellulært materiale.Det agglutinerede materiale blev koncentreret i spermhovedet (vandmandehovedlignende samling; fig. 5B) og ekspanderet distalt, hvilket gav et strålende gult udseende under fluorescensmikroskopi, når det blev farvet med acridinorange (fig. 6C).Dette stof er tydeligt synligt under et scanningsmikroskop og betragtes som et bindemiddel.Halvtynde snit (fig. 5C) og sædpræparater farvet med acridin orange viste sædbundter indeholdende tætpakkede hoveder og krøllede haler (fig. 5D).
Forskellige mikrofotografier, der viser aggregering af sædhoveder og foldede haler ved hjælp af forskellige metoder.(A) Tværsnits digitalt farvetransmissionselektronmikrofotografi af et sædbundt, der viser et oprullet sædhoved med en todelt kerne (blå) og flere flagelære dele (grøn).(B) Digitalt farvescanningselektronmikrografi, der viser en klynge af vandmand-lignende spermhoveder (pile), der ser ud til at være dækket.(C) Halvtyndt snit, der viser aggregerede spermhoveder (pile) og krøllede haler (pile).(D) Mikrografi af en spermudstrygning farvet med acridin orange, der viser aggregater af spermhoveder (pile) og krøllede vedhæftende haler (pile).Bemærk, at et klæbrigt stof (S) dækker hovedet af sædcellerne.(D) × 1000 forstørrelse.
Ved anvendelse af transmissionselektronmikroskopi (fig. 7A) blev det også bemærket, at spermhovederne var snoet, og kernerne havde en spiralform, som bekræftet af spermudstrygninger farvet med acridin orange og undersøgt ved hjælp af fluorescensmikroskopi (fig. 7B).
(A) Digital farvetransmissionselektronmikrograf og (B) Acridin-orangefarvet spermudstrygning, der viser oprullede hoveder og fastgørelse af spermhoveder og -haler (pile).(B) × 1000 forstørrelse.
Et interessant fund er, at Sharkazis sperm samler sig og danner mobile filamentøse bundter.Egenskaberne af disse bundter giver os mulighed for at forstå deres mulige rolle i absorption og opbevaring af spermatozoer i SST.
Efter parring kommer sædcellerne ind i skeden og gennemgår en intens udvælgelsesproces, hvilket resulterer i, at kun et begrænset antal sædceller kommer ind i SST15,16.Til dato er mekanismerne, hvorved sæd kommer ind og ud af SST, uklare.Hos fjerkræ opbevares spermatozoer i SST i en længere periode på 2 til 10 uger, afhængigt af arten6.Der er stadig uenighed om sædens tilstand under opbevaring i SST.Er de i bevægelse eller i hvile?Med andre ord, hvordan bevarer sædceller deres position i SST så længe?
Forman4 foreslog, at SST-residens og ejektion kunne forklares i form af sædmotilitet.Forfatterne antager, at sædceller bevarer deres position ved at svømme mod væskestrømmen, der skabes af SST-epitelet, og at sædceller udstødes fra SST, når deres hastighed falder under det punkt, hvor de begynder at bevæge sig baglæns på grund af mangel på energi.Zaniboni5 bekræftede tilstedeværelsen af ​​aquaporiner 2, 3 og 9 i den apikale del af SST-epitelceller, som indirekte kan understøtte Foremans sædopbevaringsmodel.I den aktuelle undersøgelse fandt vi ud af, at næsten halvdelen af ​​Sharkashis spermatozoer viser positiv rheologi i den strømmende væske, og at agglutinerede spermbundter øger antallet af spermatozoer, der viser positiv rheologi, selvom agglutination bremser dem.Hvordan sædceller bevæger sig op ad fuglens æggeleder til stedet for befrugtning er ikke fuldt ud forstået.Hos pattedyr trækker follikulærvæsken kemoat til sædceller.Imidlertid menes kemoattraktanter at lede spermatozoer til at nærme sig lange afstande7.Derfor er andre mekanismer ansvarlige for sædtransport.Sædcellens evne til at orientere sig og flyde mod æggeledervæsken, der frigives efter parring, er blevet rapporteret at være en væsentlig faktor i målretningen af ​​sæd hos mus.Parker 17 foreslog, at spermatozoer krydser æggelederne ved at svømme mod ciliærstrømmen i fugle og krybdyr.Selvom det ikke er blevet eksperimentelt påvist i fugle, var Adolphi18 den første til at opdage, at fuglesæd giver positive resultater, når et tyndt lag væske mellem et dækglas og objektglas dannes med en strimmel filterpapir.Rheologi.Hino og Yanagimachi [19] placerede et museovarie-tubal-uterin-kompleks i en perfusionsring og injicerede 1 µl blæk i landtangen for at visualisere væskestrømmen i æggelederne.De bemærkede en meget aktiv bevægelse af sammentrækning og afspænding i æggelederen, hvor alle blækkuglerne støt bevægede sig mod æggelederens ampul.Forfatterne understreger vigtigheden af ​​strømning af tubal væske fra de nedre til de øvre æggeledere for sædløftning og befrugtning.Brillard20 rapporterede, at hos kyllinger og kalkuner migrerer sædceller ved aktiv bevægelse fra den vaginale indgang, hvor de opbevares, til den utero-vaginale forbindelse, hvor de opbevares.Denne bevægelse er dog ikke nødvendig mellem den uterovaginale forbindelse og infundibulum, fordi sædcellerne transporteres ved passiv forskydning.Ved at kende disse tidligere anbefalinger og resultaterne opnået i den aktuelle undersøgelse, kan det antages, at sædcellers evne til at bevæge sig opstrøms (rheologi) er en af ​​de egenskaber, som udvælgelsesprocessen er baseret på.Dette bestemmer passagen af ​​spermatozoer gennem skeden og deres indtræden i CCT til opbevaring.Som Forman4 foreslog, kan dette også lette processen med sæd, der trænger ind i SST og dens habitat i en periode og derefter forlader den, når deres hastighed begynder at aftage.
På den anden side foreslog Matsuzaki og Sasanami 21, at fuglespermatozoer undergår motilitetsændringer fra dvale til motilitet i de mandlige og kvindelige reproduktive kanaler.Hæmning af hjemmehørende spermmotilitet i SST er blevet foreslået for at forklare den lange opbevaringstid af sperm og derefter foryngelse efter at have forladt SST.Under hypoxiske forhold, Matsuzaki et al.1 rapporterede høj produktion og frigivelse af laktat i SST, hvilket kan føre til hæmning af hjemmehørende spermmotilitet.I dette tilfælde afspejles vigtigheden af ​​sædreologi i udvælgelsen og absorptionen af ​​sædceller og ikke i deres opbevaring.
Sæd-agglutinationsmønsteret anses for at være en plausibel forklaring på den lange opbevaringsperiode af sæd i SST, da dette er et almindeligt mønster for sædretention hos fjerkræ2,22,23.Bakst et al.2 observerede, at de fleste spermatozoer klæbede til hinanden og dannede fascikulære aggregater, og enkelte spermatozoer blev sjældent fundet i vagtel CCM.På den anden side har Wen et al.24 observerede flere spredte spermatozoer og færre spermatozoer i SST-lumen hos kyllinger.På baggrund af disse observationer kan det antages, at tilbøjeligheden til sæd-agglutination er forskellig mellem fugle og mellem sædceller i samme ejakulat.Derudover har Van Krey et al.9 foreslog, at tilfældig dissociation af agglutinerede spermatozoer er ansvarlig for den gradvise indtrængning af spermatozoer i lumen af ​​æggelederen.Ifølge denne hypotese bør sædceller med lavere agglutinationsevne udstødes fra SST først.I denne sammenhæng kan sædcellers evne til at agglutinere være en faktor, der påvirker resultatet af sædkonkurrence hos snavsede fugle.Hertil kommer, at jo længere den agglutinerede sperm dissocierer, jo længere opretholdes fertiliteten.
Selvom spermatozoaggregering og aggregering i bundter er blevet observeret i flere undersøgelser2,22,24, er de ikke blevet beskrevet i detaljer på grund af kompleksiteten af ​​deres kinematiske observation inden for SST.Der er gjort adskillige forsøg på at studere sæd-agglutination in vitro.Omfattende, men forbigående aggregering blev observeret, når den tynde tråd blev fjernet fra den dinglende frødråbe.Dette fører til det faktum, at en langstrakt boble stikker ud fra dråben og efterligner sædkirtlen.På grund af 3D-begrænsninger og korte dryptørretider faldt hele blokken hurtigt i forfald9.I den aktuelle undersøgelse, ved hjælp af Sharkashi-kyllinger og mikrofluidchips, var vi i stand til at beskrive, hvordan disse totter dannes, og hvordan de bevæger sig.Sædbundter dannede sig umiddelbart efter sædopsamling og viste sig at bevæge sig i en spiral og viste positiv rheologi, når de var til stede i strømmen.Når makroskopisk set er sædbundter desuden blevet observeret at øge lineariteten af ​​motilitet sammenlignet med isolerede spermatozoer.Dette tyder på, at sæd-agglutination kan forekomme før SST-penetration, og at sædproduktionen ikke er begrænset til et lille område på grund af stress som tidligere foreslået (Tingari og Lake12).Under tottdannelse svømmer sædcellerne synkront, indtil de danner et kryds, derefter vikler deres haler sig om hinanden og sædcellernes hoved forbliver fri, men halen og den distale del af sæden klæber sammen med et klæbrigt stof.Derfor er det frie hoved af ledbåndet ansvarlig for bevægelsen, og trækker resten af ​​ledbåndet.Scanningelektronmikroskopi af sædbundterne viste fastgjorte sædhoveder dækket med en masse klæbrigt materiale, hvilket tyder på, at sædhovederne var fæstnet i hvilebundter, hvilket kan være sket efter at have nået opbevaringsstedet (SST).
Når en sædpræparat farves med acridinorange, kan ekstracellulært klæbende materiale omkring sædcellerne ses under et fluorescerende mikroskop.Dette stof tillader sædbundter at klæbe til og klamre sig til eventuelle omgivende overflader eller partikler, så de ikke driver med den omgivende strøm.Således viser vores observationer rollen af ​​spermatozoadhæsion i form af mobile bundter.Deres evne til at svømme mod strømmen og holde sig til nærliggende overflader gør det muligt for sædceller at blive længere i SST.
Rothschild25 brugte et hæmocytometrikamera til at studere den flydende fordeling af kvægsæd i en dråbe suspension og tog mikrofotografier gennem et kamera med både lodret og vandret optisk akse af mikroskopet.Resultaterne viste, at spermatozoerne blev tiltrukket af overfladen af ​​kammeret.Forfatterne foreslår, at der kan være hydrodynamiske interaktioner mellem sæden og overfladen.Når dette tages i betragtning, sammen med Sharkashi-kyllingesædens evne til at danne klæbrige totter, kan det øge sandsynligheden for, at sæd vil klæbe til SST-væggen og opbevares i lange perioder.
Bccetti og Afzeliu26 rapporterede, at sperm glycocalyx er nødvendig for genkendelse af kønsceller og agglutination.Forman10 observerede, at hydrolyse af α-glykosidbindinger i glycoprotein-glycolipidbelægninger ved behandling af fuglesæd med neuraminidase resulterede i reduceret fertilitet uden at påvirke sædmotiliteten.Forfatterne foreslår, at virkningen af ​​neuraminidase på glycocalyx svækker sædsekvestrering ved den utero-vaginale forbindelse og derved reducere fertiliteten.Deres observationer kan ikke ignorere muligheden for, at neuraminidasebehandling kan reducere sæd- og oocytgenkendelse.Forman og Engel10 fandt, at fertiliteten blev nedsat, når høns blev insemineret intravaginalt med sæd behandlet med neuraminidase.IVF med neuraminidase-behandlet sæd påvirkede imidlertid ikke fertiliteten sammenlignet med kontrolkyllinger.Forfatterne konkluderede, at ændringer i glycoprotein-glycolipid-belægningen omkring sædmembranen reducerede sædcellers evne til at befrugte ved at forringe sekvestrering af sæd i det utero-vaginale kryds, hvilket igen øgede sædtab på grund af hastigheden af ​​den utero-vaginale overgang, men ikke påvirker sæd og æggenkendelse.
Hos kalkuner fandt Bakst og Bauchan 11 små vesikler og membranfragmenter i lumen af ​​SST og observerede, at nogle af disse granula var smeltet sammen med sædmembranen.Forfatterne foreslår, at disse forhold kan bidrage til langtidsopbevaring af spermatozoer i SST.Forskerne har dog ikke specificeret kilden til disse partikler, om de udskilles af CCT-epitelceller, produceres og udskilles af det mandlige reproduktionssystem eller produceres af sæden selv.Disse partikler er også ansvarlige for agglutination.Grützner et al27 rapporterede, at epididymale epitelceller producerer og udskiller et specifikt protein, der er påkrævet for dannelsen af ​​enkelt-pore sædkanaler.Forfatterne rapporterer også, at spredningen af ​​disse bundter afhænger af interaktionen af ​​epididymale proteiner.Nixon et al28 fandt, at adnexa udskiller et protein, det sure cysteinrige osteonectin;SPARC er involveret i dannelsen af ​​sædtopper i kortnæbbede echidnas og næbdyr.Spredningen af ​​disse stråler er forbundet med tabet af dette protein.
I den aktuelle undersøgelse viste ultrastrukturel analyse ved hjælp af elektronmikroskopi, at spermatozoerne klæbte til en stor mængde tæt materiale.Disse stoffer menes at være ansvarlige for agglutinationen, der kondenserer mellem og omkring de vedhæftede hoveder, men ved lavere koncentrationer i haleregionen.Vi antager, at dette agglutinerende stof udskilles fra det mandlige reproduktionssystem (epididymis eller vas deferens) sammen med sæd, da vi ofte observerer sæd, der skilles fra lymfe- og sædplasma under ejakulation.Det er blevet rapporteret, at når fuglespermatozoer passerer gennem epididymis og vas deferens, gennemgår de modningsrelaterede ændringer, der understøtter deres evne til at binde proteiner og erhverve plasmalemma-associerede glycoproteiner.Vedvarenheden af ​​disse proteiner på residente spermmembraner i SST antyder, at disse proteiner kan påvirke erhvervelsen af ​​spermmembranstabilitet 30 og bestemme deres fertilitet 31 .Ahammad et al32 rapporterede, at spermatozoer opnået fra forskellige dele af hankøns reproduktionssystem (fra testiklerne til de distale vas deferens) viste en progressiv stigning i levedygtighed under væskeopbevaringsbetingelser, uanset opbevaringstemperatur, og levedygtigheden hos kyllinger øges også i æggelederne efter kunstig insemination.
Sharkashi-kyllingespermtotter har andre egenskaber og funktioner end andre arter såsom echidnas, næbdyr, skovmus, hjorterotter og marsvin.Hos sharkasi-kyllinger reducerede dannelsen af ​​spermatozobundter deres svømmehastighed sammenlignet med enkelte spermatozoer.Disse bundter øgede dog procentdelen af ​​rheologisk positive spermatozoer og øgede spermatozoernes evne til at stabilisere sig selv i et dynamisk miljø.Således bekræfter vores resultater det tidligere forslag om, at sæd-agglutination i SST er forbundet med langtidsopbevaring af sæd.Vi antager også, at sædcellernes tilbøjelighed til at danne totter kan styre hastigheden af ​​sædtab i SST, hvilket kan ændre resultatet af sædkonkurrence.Ifølge denne antagelse frigiver sædceller med lav agglutinationskapacitet SST først, mens sædceller med høj agglutinationsevne producerer det meste af afkommet.Dannelsen af ​​enkeltporede sædbundter er gavnlig og påvirker forældre-barn-forholdet, men bruger en anden mekanisme.Hos echidnas og næbdyr er spermatozoerne arrangeret parallelt med hinanden for at øge strålens fremadgående hastighed.Bunter af echidnas bevæger sig omkring tre gange hurtigere end enkelte spermatozoer.Det menes, at dannelsen af ​​sådanne sædtopper i echidnas er en evolutionær tilpasning til at opretholde dominans, da hunnerne er promiskuøse og normalt parrer sig med flere hanner.Derfor konkurrerer spermatozoer fra forskellige ejakulater indædt om befrugtningen af ​​ægget.
Agglutinerede spermatozoer fra sharkasi-kyllinger er nemme at visualisere ved hjælp af fasekontrastmikroskopi, hvilket anses for fordelagtigt, fordi det tillader let undersøgelse af spermatozoers adfærd in vitro.Mekanismen, hvorved dannelsen af ​​sædtosser fremmer reproduktionen hos sharkasi-kyllinger, er også forskellig fra den, der ses hos nogle placentale pattedyr, der repræsenterer samarbejdsvillig sperm-adfærd, såsom skovmus, hvor nogle spermatozoer når æggene og hjælper andre relaterede individer med at nå og beskadige deres æg.at bevise dig selv.altruistisk adfærd.Selvbefrugtning 34. Et andet eksempel på samarbejdsadfærd i spermatozoer blev fundet hos hjortemus, hvor spermatozoer var i stand til at identificere og kombinere med de mest genetisk beslægtede spermatozoer og danne samarbejdsgrupper for at øge deres hastighed sammenlignet med ikke-beslægtede spermatozoer35.
Resultaterne opnået i denne undersøgelse modsiger ikke Fomans teori om langtidsopbevaring af spermatozoer i SWS.Forskerne rapporterer, at sædceller fortsætter med at bevæge sig i strømmen af ​​epitelceller, der beklæder SST i en længere periode, og efter en vis periode er sædcellernes energilagre udtømt, hvilket resulterer i et fald i hastigheden, hvilket tillader udstødelse af stoffer med lille molekylvægt.energi af spermatozoer med strømmen af ​​væske fra lumen af ​​SST. Kaviteten af ​​æggelederen.I den aktuelle undersøgelse observerede vi, at halvdelen af ​​de enkelte sædceller viste evnen til at svømme mod strømmende væsker, og deres adhæsion i bundtet øgede deres evne til at vise positiv rheologi.Desuden er vores data i overensstemmelse med dem fra Matsuzaki et al.1, der rapporterede, at øget laktatsekretion i SST kan hæmme resident spermmotilitet.Vores resultater beskriver imidlertid dannelsen af ​​sædbevægelige ledbånd og deres rheologiske adfærd i nærværelse af et dynamisk miljø inden for en mikrokanal i et forsøg på at belyse deres adfærd i SST.Fremtidig forskning kan fokusere på at bestemme den kemiske sammensætning og oprindelse af agglutineringsmidlet, hvilket utvivlsomt vil hjælpe forskere med at udvikle nye måder at opbevare flydende sæd på og øge varigheden af ​​fertiliteten.
Femten 30 uger gamle barnakkede hansharkasi (homozygot dominant; Na Na) blev udvalgt som sæddonorer i undersøgelsen.Fuglene blev opdrættet på forskningsfjerkræfarmen ved Fakultetet for Landbrug, Ashit University, Ashit Governorate, Egypten.Fuglene blev anbragt i individuelle bure (30 x 40 x 40 cm), udsat for et lysprogram (16 timers lys og 8 timers mørke) og fodret med en kost indeholdende 160 g råprotein, 2800 kcal metaboliserbar energi, 35 g calcium hver.5 gram tilgængeligt fosfor per kilogram kost.
Ifølge data 36, ​​37 blev sæd indsamlet fra mænd ved mavemassage.I alt 45 sædprøver blev indsamlet fra 15 mænd over 3 dage.Sæd (n = 15/dag) blev straks fortyndet 1:1 (v:v) med Belsville Poultry Semen Diluent, som indeholder kaliumdiphosphat (1,27 g), mononatriumglutamatmonohydrat (0,867 g), fructose (0,5 d) vandfrit natrium.acetat (0,43 g), tris(hydroxymethyl)aminomethan (0,195 g), kaliumcitratmonohydrat (0,064 g), kaliummonophosphat (0,065 g), magnesiumchlorid (0,034 g) og H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritet 3 kg/m3 mOsm3 kg.Fortyndede sædprøver blev først undersøgt under et lysmikroskop for at sikre god sædkvalitet (fugt) og derefter opbevaret i et vandbad ved 37°C indtil brug inden for en halv time efter opsamling.
Kinematik og rheologi af sædceller er beskrevet ved hjælp af et system af mikrofluidiske enheder.Sædprøver blev yderligere fortyndet til 1:40 i Beltsville Avian Semen Diluent, fyldt i en mikrofluidisk enhed (se nedenfor), og kinetiske parametre blev bestemt ved anvendelse af et computeriseret sædanalysesystem (CASA) tidligere udviklet til mikrofluidikkarakterisering.om mobiliteten af ​​sædceller i flydende medier (Institut for Mekanisk Teknik, Det Tekniske Fakultet, Assiut University, Egypten).Pluginnet kan downloades på: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Kurvehastighed (VCL, μm/s), lineær hastighed (VSL, μm/s) og gennemsnitlig banehastighed (VAP, μm/s) blev målt.Videoer af spermatozoer blev taget ved hjælp af et omvendt Optika XDS-3 fasekontrastmikroskop (med 40x objektiv) forbundet til et Tucson ISH1000-kamera ved 30 fps i 3 sek.Brug CASA-softwaren til at studere mindst tre områder og 500 sædbaner pr. prøve.Den optagede video blev behandlet ved hjælp af en hjemmelavet CASA.Definitionen af ​​motilitet i CASA plug-in'et er baseret på sædens svømmehastighed sammenlignet med flowhastigheden, og inkluderer ikke andre parametre såsom side-til-side bevægelse, da dette har vist sig at være mere pålideligt i væskeflow.Rheologisk bevægelse beskrives som sædcellers bevægelse mod væskestrømmens retning.Spermatozoer med rheologiske egenskaber blev divideret med antallet af bevægelige spermatozoer;spermatozoer, der var i hvile og konvektivt bevægede spermatozoer, blev udelukket fra tællingen.
Alle anvendte kemikalier blev opnået fra Elgomhoria Pharmaceuticals (Cairo, Egypten), medmindre andet er angivet.Indretningen blev fremstillet som beskrevet af El-sherry et al.40 med nogle ændringer.Materialerne, der blev brugt til at fremstille mikrokanalerne, omfattede glasplader (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativ resist (MicroChem, Newton, CA), diacetone alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland) og polyacetone.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanaler fremstilles ved hjælp af blød litografi.Først blev en klar beskyttende ansigtsmaske med det ønskede mikrokanaldesign printet på en højopløsningsprinter (Prismatic, Cairo, Egypt og Pacific Arts and Design, Markham, ON).Mestrene blev lavet med glasplader som underlag.Pladerne blev renset i acetone, isopropanol og deioniseret vand og derefter belagt med et 20 µm lag SU8-25 ved spincoating (3000 rpm, 1 min).SU-8-lagene blev derefter forsigtigt tørret (65°C, 2 min og 95°C, 10 min) og udsat for UV-stråling i 50 s.Bages efter eksponering ved 65°C og 95°C i 1 min og 4 min for at tværbinde eksponerede SU-8 lag, efterfulgt af udvikling i diacetone alkohol i 6,5 min.Bag vaflerne hårdt (200°C i 15 min) for yderligere at størkne SU-8-laget.
PDMS blev fremstillet ved at blande monomeren og hærderen i et vægtforhold på 10:1, derefter afgasset i en vakuumekssikkator og hældt på SU-8 hovedrammen.PDMS blev hærdet i en ovn (120°C, 30 min), derefter blev kanalerne skåret ud, adskilt fra masteren og perforeret for at tillade rør at blive fastgjort ved indløbet og udløbet af mikrokanalen.Endelig blev PDMS-mikrokanaler permanent fastgjort til objektglas ved hjælp af en bærbar corona-processor (Electro-Technic Products, Chicago, IL) som beskrevet andetsteds.Mikrokanalen brugt i denne undersøgelse måler 200 µm × 20 µm (B × H) og er 3,6 cm lang.
Væskestrømmen induceret af hydrostatisk tryk inde i mikrokanalen opnås ved at holde væskeniveauet i indløbsreservoiret over højdeforskellen Δh39 i udløbsreservoiret (fig. 1).
hvor f er friktionskoefficienten, defineret som f = C/Re for laminær strømning i en rektangulær kanal, hvor C er en konstant afhængig af kanalens aspektforhold, L er længden af ​​mikrokanalen, Vav er gennemsnitshastigheden inde i mikrokanalen, Dh er kanalens hydrauliske diameter, g – tyngdeacceleration.Ved hjælp af denne ligning kan den gennemsnitlige kanalhastighed beregnes ved hjælp af følgende ligning: