Tak, fordi du besøger Nature.com. Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). For at sikre løbende support viser vi desuden webstedet uden typografier og JavaScript.
Viser en karrusel med tre slides på én gang. Brug knapperne Forrige og Næste til at navigere gennem tre slides ad gangen, eller brug skyderknapperne i slutningen til at navigere gennem tre slides ad gangen.
Porøse silicapartikler blev fremstillet ved sol-gel-metoden med nogle modifikationer for at opnå bredporede partikler. Disse partikler blev derivatiseret med N-phenylmaleimid-methylvinylisocyanat (PMI) og styren via reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) polymerisation for at producere N-phenylmaleimid-interkalerede polyamider. Styren (PMP) stationær fase. Smalborede rustfri stålkolonner (100 × 1,8 mm indre diameter) blev pakket med en opslæmningspakning. PMP-kolonnens kromatografiske ydeevne blev evalueret for at separere en blanding af syntetiske peptider bestående af fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-aminosyre-enkephalin) og tryptisk hydrolysat af humant serumalbumin (HAS). Under optimale elueringsbetingelser nåede det teoretiske antal plader med en blanding af peptider 280.000 plader/kvm. Ved sammenligning af separationsydelsen af ​​den udviklede kolonne med den kommercielle Ascentis Express RP-Amide-kolonne blev det observeret, at separationseffektiviteten af ​​PMP-kolonnen var bedre end den kommercielle kolonne med hensyn til separationseffektivitet og opløsning.
Den biofarmaceutiske industri er blevet et voksende globalt marked med en betydelig stigning i markedsandele i de senere år. Med den eksplosive vækst i den biofarmaceutiske industri1,2,3 er der et stort behov for peptid- og proteinanalyse. Ud over målpeptidet dannes forskellige urenheder under peptidsyntesen, så kromatografisk oprensning er nødvendig for at opnå den ønskede renhed af peptidet. Analyse og karakterisering af proteiner i kropsvæsker, væv og celler er en ekstremt udfordrende opgave på grund af det store antal potentielt detekterbare arter, der er til stede i en enkelt prøve. Selvom massespektrometri er et effektivt værktøj til sekventering af peptider og proteiner, vil separationen være utilfredsstillende, hvis sådanne prøver introduceres direkte i massespektrometeret. Dette problem kan løses ved at udføre væskekromatografi (LC) før MS-analyse, hvilket vil reducere mængden af ​​analytter, der kommer ind i massespektrometeret på et givet tidspunkt4,5,6. Derudover kan analytter koncentreres i et smalt område under flydende faseseparation, hvorved disse analytter koncentreres og følsomheden af ​​MS-detektion øges. Væskekromatografi (LC) har gjort betydelige fremskridt i løbet af det seneste årti og er blevet en udbredt metode til proteomisk analyse7,8,9,10.
Omvendt fasevæskekromatografi (RP-LC) anvendes i vid udstrækning til at oprense og separere blandinger af peptider ved hjælp af octadecylmodificeret silica (ODS) som stationær fase11,12,13. På grund af deres komplekse struktur og amfotere natur14,15 kan RP-stationære faser imidlertid ikke give en tilfredsstillende separation af peptider og proteiner. Derfor kræver analysen af ​​peptider og proteiner med polære og ikke-polære fragmenter specielt designede stationære faser for at interagere og tilbageholde disse analytter16. Blandet kromatografi, som tilbyder multimodale interaktioner, kan være et alternativ til RP-LC til at separere peptider, proteiner og andre komplekse blandinger. Adskillige stationære faser af blandet type blev fremstillet, og søjler fyldt med disse stationære faser blev brugt til at separere peptider og proteiner17,18,19,20,21. På grund af tilstedeværelsen af ​​polære og ikke-polære grupper er blandede stationære faser (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polær interkalering/RPLC) egnede til separation af peptider og proteiner22,23,24,25,26,27,28. Polære interkalerede stationære faser med kovalent bundne polære grupper udviser gode separationsevner og unik selektivitet for polære og ikke-polære analytter, fordi separationen afhænger af interaktionen mellem analytten og den stationære fase (multimodale interaktioner29,30,31,32). For nylig opnåede Zhang et al.30 behenyl-terminerede stationære faser af polyaminer og separerede med succes kulbrinter, antidepressiva, flavonoider, nukleosider, østrogener og nogle andre analytter. Det polært indlejrede stationære materiale har både polære og ikke-polære grupper, så det kan bruges til at separere peptider og proteiner i hydrofobe og hydrofile dele. Polære inline-kolonner (f.eks. C18-kolonner med amid inline) fås under handelsnavnet Ascentis Express RP-Amide-kolonner, men disse kolonner er kun blevet brugt til analyse af amin 33.
I den aktuelle undersøgelse blev en polær indlejret stationær fase (N-phenylmaleimid, indlejret polystyren) fremstillet og evalueret for peptidseparation og tryptisk HSA-spaltning. Følgende strategi blev anvendt til at fremstille den stationære fase. Porøse silicapartikler blev fremstillet i henhold til procedurerne beskrevet i vores tidligere publikationer, med nogle ændringer i fremstillingsskemaerne 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Forholdene mellem urinstof, polyethylenglycol (PEG), TMOS og vandig eddikesyre blev justeret for at opnå silicapartikler med store porestørrelser. Dernæst blev en ny phenylmaleimid-methylvinylisocyanatligand syntetiseret, og dens derivatiserede silicapartikler blev anvendt til at fremstille polære indlejrede stationære faser. Den opnåede stationære fase blev pakket i en rustfri stålsøjle (indre diameter 100 × 1,8 mm) i henhold til et optimeret pakningsskema. Pakning af søjlen understøttes af mekanisk vibration for at sikre et ensartet lag i søjlen. Den pakkede søjle blev evalueret for separation af en blanding af peptider bestående af fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkephalin-peptid) og tryptiske hydrolysater af humant serumalbumin (HSA). Det blev observeret, at peptidblandingen og HSA-tryptisk fordøjelse adskiltes med god opløsning og effektivitet. Separationseffektiviteten af ​​PMP-søjlen blev sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-søjlen. Det blev observeret, at peptider og proteiner har god opløsning og høj separationseffektivitet på PMP-søjlen, og separationseffektiviteten af ​​PMP-søjlen er højere end den for Ascentis Express RP-Amide-søjlen.
PEG (polyethylenglycol), urinstof, eddikesyre, trimethoxyorthosilicat (TMOS), trimethylchlorosilan (TMCS), trypsin, humant serumalbumin (HSA), ammoniumchlorid, urinstof, hexamethylmethacryloyldisilazan (HMDS), methacryloylchlorid (MC), styren, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxid (BPO), acetonitril (ACN) til HPLC, methanol, 2-propanol og acetone. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
En blanding af urinstof (8 g), polyethylenglycol (8 g) og 8 ml 0,01 N eddikesyre blev omrørt i 10 minutter, og 24 ml TMOS blev tilsat under isafkøling. Reaktionsblandingen blev opvarmet ved 40 °C i 6 timer og derefter ved 120 °C i 8 timer i en autoklav af rustfrit stål. Vandet blev dekanteret, og resten blev tørret ved 70 °C i 12 timer. De tørrede bløde blokke blev glatmalet og kalcineret i en ovn ved 550 °C i 12 timer. Tre batcher blev fremstillet og karakteriseret for at teste reproducerbarheden af ​​partikelstørrelser, porestørrelse og overfladeareal.
Polær gruppe og stationær fase for polystyrenkæder. Fremstillingsproceduren er beskrevet nedenfor.
N-phenylmaleimid (200 mg) og methylvinylisocyanat (100 mg) blev opløst i vandfri toluen, og derefter blev 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) tilsat reaktionskolben for at opnå en copolymer af phenylmaleimid og methylvinylisocyanat (PMCP). Blandingen blev opvarmet ved 60 °C i 3 timer, filtreret og tørret i en ovn ved 40 °C i 3 timer.
Tørrede silicapartikler (2 g) blev dispergeret i tør toluen (100 ml), omrørt og sonikeret i 10 minutter i en 500 ml rundbundet kolbe. PMCP (10 mg) blev opløst i toluen og tilsat dråbevis til reaktionskolben via en tilsætningstragt. Blandingen blev tilbagesvalet ved 100 °C i 8 timer, filtreret, vasket med acetone og tørret ved 60 °C i 3 timer. Derefter blev silicapartiklerne associeret med PMCP (100 g) opløst i toluen (200 ml), og 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) blev tilsat dertil i nærvær af 100 μl dibutyltindilaurat som katalysator. Blandingen blev omrørt ved 50 °C i 8 timer, filtreret og tørret ved 50 °C i 3 timer.
Styren (1 ml), benzoylperoxid BPO (0,5 ml) og silicapartikler bundet til TEMPO-PMCP (1,5 g) blev dispergeret i toluen og renset med nitrogen. Polymerisationen af ​​styren blev udført ved 100 °C i 12 timer. Det resulterende produkt blev vasket med methanol og tørret natten over ved 60 °C. Det generelle reaktionsskema er vist i figur et.
Prøverne blev afgasset ved 393 K i 1 time, indtil et resttryk på mindre end 10–3 Torr blev opnået. Mængden af ​​N2 adsorberet ved relativt tryk P/P0 = 0,99 blev brugt til at bestemme det samlede porevolumen. Morfologien af ​​rene og ligandbundne silicapartikler blev undersøgt ved hjælp af et scanningselektronmikroskop (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Tørre prøver (ren silica og ligandbundne silicapartikler) blev placeret på aluminiumstænger ved hjælp af kulstoftape. Guld blev aflejret på prøven ved hjælp af en Q150T-sputteringsanordning, og et 5 nm tykt Au-lag blev aflejret på prøven. Dette forbedrer effektiviteten af ​​lavspændingsprocessen og giver fin koldsprøjtning. Elementaranalyse blev udført ved hjælp af en Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementarsammensætningsanalysator. En Malvern-partikelstørrelsesanalysator (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 blev brugt til at bestemme partikelstørrelsesfordelingen. Ubelagte silicapartikler og ligandbundne silicapartikler (5 mg hver) blev dispergeret i 5 ml isopropanol, sonikeret i 10 minutter, omrørt i 5 minutter og placeret på en Mastersizer optisk bænk. Termogravimetrisk analyse udføres med en hastighed på 5 °C pr. minut i temperaturområdet fra 30 til 800 °C.
Glasfiberforede, smalle rustfri stålsøjler med dimensionerne (ID 100 × 1,8 mm) blev pakket ved hjælp af opslæmningsfyldningsmetode efter samme procedure som i reference 31. Rustfri stålsøjle (glasfiberforet, ID 100 × 1,8 mm) og et udløb indeholdende en 1 µm fritte blev forbundet til en opslæmningspakkemaskine (Alltech Deerfield, IL, USA). Forbered en suspension af den stationære fase ved at suspendere 150 mg af den stationære fase i 1,2 ml methanol og tilføre den til en reservoirsøjle. Methanol blev brugt som opslæmningsopløsningsmiddel og kontrolopløsningsmiddel. Pak søjlen ved at anvende en tryksekvens på 100 MP i 10 min, 80 MP i 15 min og 60 MP i 30 min. Pakningsprocessen anvendte to gaskromatografisøjlevibratorer (Alltech, Deerfield, IL, USA) til mekanisk vibration for at sikre ensartet kolonnepakning. Luk opslæmningspakkeren, og slip trykket langsomt for at forhindre beskadigelse af strengen. Kolonnen blev frakoblet opslæmningsdysen, og en anden fitting blev fastgjort til indløbet og forbundet til LC-systemet for at teste dens funktion.
En specialfremstillet MLC blev konstrueret ved hjælp af en LC-pumpe (10AD Shimadzu, Japan), en sampler med en 50 nL injektionsløjfe (Valco (USA) C14 W.05), en membranafgasser (Shimadzu DGU-14A) og et UV-VIS kapillærvindue. Detektorenhed (UV-2075) og emaljeret mikrokolonne. Brug meget smalle og korte forbindelsesrør for at minimere effekten af ​​yderligere kolonneekspansion. Efter fyldning af kolonnen installeres et kapillærrør (50 µm id 365) ved udløbet af 1/16″ reducerende overgang og et kapillærrør (50 µm) installeres ved reducerende overgang. Dataindsamling og kromatogrambehandling udføres ved hjælp af Multichro 2000-softwaren. Ved 254 nm blev UV-absorbansen af ​​de pågældende analytter overvåget ved 0. Kromatografiske data blev analyseret ved hjælp af OriginPro8 (Northampton, MA).
Humant serumalbumin, frysetørret pulver, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg blandet med trypsin (1,5 mg), 4,0 M urinstof (1 ml) og 0,2 M ammoniumbicarbonat (1 ml). Opløsningen blev omrørt i 10 minutter og holdt i et vandbad ved 37°C i 6 timer, hvorefter den blev afkølet med 1 ml 0,1% TFA. Filtrer opløsningen og opbevar den under 4°C.
Separation af en blanding af peptider og tryptisk fordøjet HSA på en PMP-søjle blev evalueret separat. Kontroller den tryptiske hydrolyse af en blanding af peptider og HSA separeret af en PMP-søjle, og sammenlign resultaterne med en Ascentis Express RP-Amid-søjle. Antallet af teoretiske plader beregnes ved hjælp af følgende ligning:
SEM-billeder af rene silicapartikler og ligandbundne silicapartikler er vist i figur 2. SEM-billeder af rene silicapartikler (A, B) viser en sfærisk form, hvor partiklerne er aflange eller har uregelmæssig symmetri sammenlignet med vores tidligere undersøgelser. Overfladen af ​​de silicapartikler, der er bundet af liganden (C, D), er glattere end overfladen af ​​rene silicapartikler, hvilket kan skyldes polystyrenkæderne, der dækker overfladen af ​​silicapartiklerne.
Skanningselektronmikroskopiske billeder af rene silicapartikler (A, B) og ligandbundne silicapartikler (C, D).
Partikelstørrelsesfordelingen af ​​rene silicapartikler og ligandbundne silicapartikler er vist i figur 2.3(A). Volumetriske partikelstørrelsesfordelingskurver viste, at silicapartikelstørrelsen steg efter kemisk modifikation (figur 3A). Dataene for silicapartikelstørrelsesfordeling fra den aktuelle undersøgelse og den tidligere undersøgelse er sammenlignet i tabel 1(A). Den volumetriske partikelstørrelse d(0,5) af PMP var 3,36 µm sammenlignet med en ad(0,5)-værdi på 3,05 µm i vores tidligere undersøgelse (polystyrenbundne silicapartikler)34. På grund af ændringen i forholdet mellem PEG, urinstof, TMOS og eddikesyre i reaktionsblandingen var partikelstørrelsesfordelingen af ​​denne batch smallere sammenlignet med vores tidligere undersøgelse. Partikelstørrelsen af ​​PMP-fasen er lidt større end den af ​​den polystyrenbundne silicapartikelfase, som vi undersøgte tidligere. Det betyder, at overfladefunktionaliseringen af ​​silicapartikler med styren kun afsatte et polystyrenlag (0,97 µm) på silicaoverfladen, mens lagtykkelsen i PMP-fasen var 1,38 µm.
Partikelstørrelsesfordeling (A) og porestørrelsesfordeling (B) af rene silicapartikler og ligandbundne silicapartikler.
Porestørrelsen, porevolumenet og overfladearealet af de silicapartikler, der blev anvendt i denne undersøgelse, er vist i tabel 1 (B). PSD-profilerne af rene silicapartikler og ligandbundne silicapartikler er vist i figur 3 (B). Resultaterne var sammenlignelige med vores tidligere undersøgelse34. Porestørrelserne af rene og ligandbundne silicapartikler var henholdsvis 310 Å og 241 Å, hvilket indikerer, at porestørrelsen faldt med 69 Å efter kemisk modifikation, som vist i tabel 1 (B), og forskydningskurven er vist i figur 3. Det specifikke overfladeareal af silicapartikler i den aktuelle undersøgelse er 116 m2/g, hvilket er sammenligneligt med vores tidligere undersøgelse (124 m2/g). Som vist i tabel 1 (B) faldt overfladearealet (m2/g) af silicapartikler efter kemisk modifikation også fra 116 m2/g til 105 m2/g.
Resultaterne af elementaranalysen af ​​den stationære fase er præsenteret i tabel 2. Kulstofindholdet i den nuværende stationære fase er 6,35 %, hvilket er lavere end i vores tidligere undersøgelse (silicapartikler forbundet med polystyren, henholdsvis 7,93 %35 og 10,21 %)42. Kulstofindholdet i den nuværende stationære fase er vist nedenfor, da nogle polære ligander såsom phenylmaleimidmethylvinylisocyanat (PCMP) og 4-hydroxy-TEMPO er blevet anvendt ud over styren i fremstillingen af ​​SP. Vægtprocenten af ​​nitrogen i den nuværende stationære fase er 2,21 % sammenlignet med 0,1735 og 0,85 % i tidligere undersøgelser42. Dette betyder, at den nuværende stationære fase har en høj vægtprocent af nitrogen på grund af phenylmaleimidet. Tilsvarende har produkterne (4) og (5) et kulstofindhold på henholdsvis 2,7 % og 2,9 %, mens slutproduktet (6) har et kulstofindhold på 6,35 %, som vist i tabel 2. Termogravimetrisk analyse (TGA) blev anvendt på den stationære fase af PMP til at teste for vægttab, og TGA-kurven er vist i figur 4. TGA-kurven viser et vægttab på 8,6 %, hvilket er i god overensstemmelse med kulstofindholdet (6,35 %), da liganderne ikke kun indeholder C1, men også N2, O2 og H2.
Liganden phenylmaleimid-methylvinylisocyanat blev valgt til at modificere overfladen af ​​silicapartiklerne på grund af dens polære phenylmaleimid- og vinylisocyanatgrupper. Vinylisocyanatgrupper kan reagere yderligere med styren ved levende radikalpolymerisation. Den anden grund er at indsætte en gruppe, der har moderate interaktioner med analytten og ingen stærke elektrostatiske interaktioner mellem analytten og den stationære fase, da phenylmaleimiddelen ikke har nogen virtuel ladning ved normal pH. Polariteten af ​​den stationære fase kan styres af den optimale mængde styren og reaktionstiden for den frie radikalpolymerisation. Det sidste trin i reaktionen (fri radikalpolymerisation) er kritisk, da det ændrer polariteten af ​​den stationære fase. Elementaranalyse blev udført for at kontrollere kulstofindholdet i disse stationære faser. Det er blevet observeret, at en forøgelse af mængden af ​​styren og reaktionstiden øger kulstofindholdet i den stationære fase og omvendt. SP'er fremstillet med forskellige koncentrationer af styren har forskellige kulstofbelastninger. Tilsvarende blev disse stationære faser placeret på rustfri stålsøjler, og deres kromatografiske egenskaber (selektivitet, opløsning, N-værdi osv.) blev kontrolleret. Baseret på disse eksperimenter blev en optimeret sammensætning til fremstilling af den stationære PMP-fase valgt for at give kontrolleret polaritet og god retention af analytten.
PMP-kolonnen blev også evalueret til analyse af fem blandinger af peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkephalin) ved anvendelse af den mobile fases kapacitet. 60/40 (v/v) ACN/vand (0,1% TFA) ved en flowhastighed på 80 µl/min. Under optimale elueringsbetingelser (200.000 plader/m²) er antallet af teoretiske plader (N) pr. kolonne (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. N-værdierne for de tre PMP-kolonner er vist i tabel 3, og kromatogrammerne er vist i figur 5A. Hurtig analyse ved høj flowhastighed (700 µl/min) på en PMP-kolonne, fem peptider elueret inden for et minut, fremragende N-værdi på 13.500 ± 330 pr. kolonne (100 x 1,8 mm diameter), svarende til 135.000 plader/m² (fig. 5B). Tre kolonner af samme størrelse (indre diameter 100 x 1,8 mm) blev fyldt med tre forskellige batcher af PMP stationær fase for at teste reproducerbarheden. Analytter blev registreret for hver kolonne ved at separere den samme testblanding på hver kolonne under anvendelse af optimale elueringsbetingelser, antal teoretiske plader N og retentionstid. Reproducerbarhedsdataene for PMP-kolonnerne er vist i tabel 4. Reproducerbarheden af ​​PMP-kolonnen korrelerede godt med meget lave %RSD-værdier som vist i tabel 3.
Separation af peptidblandinger på en PMP-søjle (B) og en Ascentis Express RP-Amid-søjle (A), mobil fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP-søjledimensioner (100 x 1,8 mm id), analyse. Elueringsrækkefølge for forbindelser: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) og 5 (leucinsyre-enkephalin).
En PMP-søjle (indre diameter 100 x 1,8 mm) blev evalueret til separation af tryptisk hydrolysat af humant serumalbumin ved hjælp af HPLC. Kromatogrammet i figur 6 viser, at prøverne er godt adskilte med meget god opløsning. HSA-opløsninger blev analyseret ved hjælp af en flowhastighed på 100 μl/min, en mobil fase på 70/30 acetonitril/vand og 0,1% TFA. Spaltningen af ​​HSA blev opdelt i 17 toppe, som vist i kromatogrammet (fig. 6), svarende til 17 peptider. Separationseffektiviteten af ​​individuelle toppe fra HSA-hydrolysatet blev beregnet, og værdierne er vist i tabel 5.
HSA-tryptiske hydrolysater blev separeret på en PMP-søjle (indre diameter 100 x 1,8 mm), flowhastighed (100 μl/min), mobil fase 60/40 acetonitril/vand og 0,1% TFA.
hvor L er kolonnelængden, η er viskositeten af ​​den mobile fase, ΔP er kolonnens modtryk, og u er den lineære hastighed af den mobile fase. PMP-kolonnens permeabilitet var 2,5 × 10-14 m2, flowhastigheden var 25 µl/min, 60/40 v/v blev anvendt. ACN/vand. PMP-kolonnens permeabilitet (ID 100 × 1,8 mm) var den samme som i vores tidligere Ref. 34-undersøgelse. Permeabiliteten af ​​en kolonne fyldt med overfladisk porøse partikler er 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 for 5 µm partikler43. Derfor er PMP-fasens permeabilitet den samme som permeabiliteten af ​​kerne-skal-partikler med en størrelse på 5 μm.
hvor Wx er massen af ​​den kolonne fyldt med chloroform, Wy er massen af ​​den kolonne fyldt med methanol, og ρ er opløsningsmidlets densitet. Densiteten af ​​methanol (ρ = 0,7866) og chloroform (ρ = 1,484). Den samlede porøsitet af silica-C18-partikelkolonnen (100 × 1,8 mm ID)34 og vores tidligere undersøgte C18-urea31-kolonne var henholdsvis 0,63 og 0,55. Dette betyder, at tilstedeværelsen af ​​urinstofligander reducerer permeabiliteten af ​​den stationære fase. På den anden side er den samlede porøsitet af PMP-kolonnen (indre diameter 100 × 1,8 mm) 0,60. PMP-kolonner er mindre permeable end kolonner pakket med C18-bundne silicapartikler, fordi C18-liganderne i stationære faser af C18-typen er bundet til silicapartiklerne i lineære kæder, mens der i stationære faser af polystyrentypen dannes en relativt tyk polymer omkring partiklerne. lag A. I et typisk eksperiment beregnes kolonneporøsiteten som følger:
Fig. 7A og B viser Van Deemter-plot for en PMP-kolonne (id 100 x 1,8 mm) og en Ascentis Express RP-Amid-kolonne (id 100 x 1,8 mm) under de samme elueringsbetingelser, 60/40 ACN/H2O og 0,1% TFA 20 µl/min til 800 µl/min på begge kolonner. De minimale HETP-værdier ved den optimale flowhastighed (80 µl/min) var henholdsvis 2,6 µm og 3,9 µm for PMP-kolonnen og Ascentis Express RP-Amid-kolonnen. HETP-værdierne viser, at separationseffektiviteten for PMP-kolonnen (100 x 1,8 mm id) er meget højere end for den kommercielt tilgængelige Ascentis Express RP-Amid-kolonne (100 x 1,8 mm id). Van Deemter-grafen i figur 7(A) viser, at faldet i N-værdi ikke er signifikant højere med stigende flow sammenlignet med vores tidligere undersøgelse. Den højere separationseffektivitet af PMP-kolonnen (id 100 × 1,8 mm) sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen er baseret på den forbedrede partikelform og -størrelse samt den sofistikerede kolonnepakningsprocedure, der anvendes i det nuværende arbejde34.
(A) Van Deemter-plot (HETP vs. lineær fasehastighed) opnået på en PMP-søjle (id 100 x 1,8 mm) i 60/40 ACN/H2O med 0,1% TFA. (B) Van Deemter-plot (HETP versus lineær fasehastighed) opnået på en Ascentis Express RP-Amid-søjle (id 100 x 1,8 mm) i 60/40 ACN/H2O med 0,1% TFA.
En polær stationær fase af interkaleret polystyren blev fremstillet og evalueret til separation af en blanding af syntetiske peptider og tryptisk hydrolysat af humant serumalbumin (HSA) i højtydende væskekromatografi. Den kromatografiske ydeevne af PMP-søjler til peptidblandinger er fremragende med hensyn til separationseffektivitet og opløsning. Den forbedrede separationseffektivitet af PMP-søjler skyldes flere årsager, såsom silicapartikelstørrelse og porestørrelse, kontrolleret syntese af stationære faser og komplekse søjlepakningsmaterialer. Ud over den høje separationseffektivitet er en anden fordel ved denne stationære fase det lave søjlemodtryk ved høje strømningshastigheder. PMP-søjler er meget reproducerbare og kan bruges til at analysere blandinger af peptider og tryptisk fordøjelse af forskellige proteiner. Vi har til hensigt at bruge denne søjle til separation af bioaktive forbindelser fra naturprodukter, ekstrakter af lægeplanter og svampe i væskekromatografi. I fremtiden vil PMP-søjler også blive evalueret til separation af proteiner og monoklonale antistoffer.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøgelse af omvendt fasekromatografiske peptidseparationssystemer del I: Udvikling af en protokol til kolonnekarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøgelse af omvendt fasekromatografiske peptidseparationssystemer del I: Udvikling af en protokol til kolonnekarakterisering.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., og Petersson, P. Undersøgelse af peptidseparationssystemer ved omvendt fasekromatografi, del I: Udvikling af en protokol til kolonnekarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøgelse af omvendt fasekromatografiske peptidseparationssystemer del I: Udvikling af en protokol for kolonnekarakteristika. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøgelse af omvendt fasekromatografiske peptidseparationssystemer del I: Udvikling af en protokol for kolonnekarakteristika.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., og Petersson, P. Undersøgelse af peptidseparationssystemer ved omvendt fasekromatografi, del I: Udvikling af en protokol til kolonnekarakterisering.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Metoder til at skabe forbedrede aktive peptider til behandling af infektionssygdomme. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetiske terapeutiske peptider: Videnskab og marked. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetiske terapeutiske peptider: Videnskab og marked.Vliege P, Lisowski V, Martinez J og Chreschatyski M. Syntetiske terapeutiske peptider: videnskab og marked.Vliege P, Lisowski V, Martinez J og Khreschatsky M. Syntetiske terapeutiske peptider: videnskab og marked. lægemiddelforskning. Today 15 (1-2), 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avanceret proteomisk væskekromatografi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avanceret proteomisk væskekromatografi.Se F., Smith RD og Shen Yu. Avanceret proteomisk væskekromatografi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avanceret proteinsammensætning 液相色谱。Se F., Smith RD og Shen Yu. Avanceret proteomisk væskekromatografi.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avanceret væskekromatografi-massespektrometri er i stand til at kombinere bredt funderet metabolomik og proteomik. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC's rolle i farmaceutisk udvikling. Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC's rolle i farmaceutisk udvikling.Chesnut, SM og Salisbury, JJ. UHPLC's rolle i farmaceutisk udvikling.Chesnut, SM og Salisbury, JJ. UHPLC's rolle i lægemiddeludvikling. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grundlæggende og praktiske aspekter af ultrahøjtryksvæskekromatografi til hurtige separationer. Wu, N. & Clausen, AM Grundlæggende og praktiske aspekter af ultrahøjtryksvæskekromatografi til hurtige separationer.Wu, N. og Clausen, AM. Grundlæggende og praktiske aspekter af højtryksvæskekromatografi til hurtig separation. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Grundlæggende og praktiske aspekter af ultrahøjtryksvæskekromatografi til hurtig separation.Wu, N. og Clausen, AM. Grundlæggende og praktiske aspekter af højtryksvæskekromatografi til hurtig separation.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Anvendelse af ultralydsvæskekromatografi i farmaceutisk udvikling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Anvendelse af ultralydsvæskekromatografi i farmaceutisk udvikling.Ren, SA og Chelischeff, P. Brugen af ​​ultrahøjtydende væskekromatografi i farmaceutisk udvikling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA og Chelischeff, P. Anvendelse af ultralydsvæskekromatografi i lægemiddeludvikling.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. En monolitisk makroporøs hydrogel udvundet af en olie-i-vand-emulsion med en høj intern fase til effektiv oprensning af enterovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Væskekromatografiens rolle i proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Væskekromatografiens rolle i proteomik.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. og Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. og Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomik.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nye tendenser inden for omvendt fase væskekromatografisk separation af terapeutiske peptider og proteiner: Teori og anvendelser. & Guillarme, D. Nye tendenser inden for omvendt fase væskekromatografisk separation af terapeutiske peptider og proteiner: Teori og anvendelser. & Guillarme, D. фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nye tendenser inden for separation af terapeutiske peptider og proteiner ved omvendt fasevæskekromatografi: teori og anvendelser. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.og Guillarmé, D. Nye tendenser inden for separation af terapeutiske peptider og proteiner ved omvendt fasevæskekromatografi: teori og anvendelser.J. Pharm. Biomedicinsk Videnskab. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Todimensionel separation af peptider ved hjælp af RP-RP-HPLC-systemet med forskellig pH i første og anden separationsdimension. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Todimensionel separation af peptider ved hjælp af RP-RP-HPLC-systemet med forskellig pH i første og anden separationsdimension.Gilar M., Olivova P., Dali AE og Gebler JK Todimensionel separation af peptider ved hjælp af RP-RP-HPLC-systemet med forskellig pH i den første og anden separationsdimension.Gilar M., Olivova P., Dali AE og Gebler JK Todimensionel separation af peptider ved hjælp af forskellige pH-værdier i den første og anden separationsdimension ved hjælp af RP-RP-HPLC-systemet. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Undersøgelse af masseoverførsel og kinetiske egenskaber ved højtydende kromatografikolonner pakket med fuldt porøse og overfladisk porøse C18-partikler mindre end 2 µm. J. Sept Science. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nylige tendenser og analytiske udfordringer inden for isolering, identifikation og validering af plantebaserede bioaktive peptider. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomisk landskab i livets rige. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Efterbehandling af terapeutiske peptider ved præparativ væskekromatografi. Molecules (Basel, Schweiz) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode kromatografi og dens anvendelser på biopolymerer. Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode kromatografi og dens anvendelser på biopolymerer.Yang, Yu. og Geng, X. Mixed mode kromatografi og dens anvendelse på biopolymerer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Mixed mode kromatografi og dens anvendelse i biopolymerer.Yang, Yu. og Gene, X. Mixed mode kromatografi og dens anvendelse på biopolymerer.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).