Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) er en bælgplante, der bruges til fødevareproduktion og jordforbedring.Den globale udvidelse af NLL som afgrøde har tiltrukket mange patogene svampe, herunder lupin anthracnose, som forårsager den ødelæggende anthracnose sygdom.To alleler, Lanr1 og AnMan, som giver øget resistens, er blevet brugt i NLL-avl, men de underliggende molekylære mekanismer forbliver ukendte.I denne undersøgelse blev Lanr1- og AnMan-markørerne brugt til at screene europæiske NLL-prøver.Test af vaccinen i et kontrolleret miljø bekræftede effektiviteten af ​​begge resistente donorer.Differentiel genekspressionsprofilering blev udført på repræsentative resistente og modtagelige linjer.Anthracnose-resistens var forbundet med overekspression af genontologiske udtryk "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" og "GO:0015979 Photosynthesis".Derudover viste Lanr1(83A:476)-linjen signifikant transkriptom-omprogrammering hurtigt efter inokulering, mens de andre linjer viste en forsinkelse i denne respons med omkring 42 timer.Forsvarsreaktioner er forbundet med TIR-NBS, CC-NBS-LRR og NBS-LRR generne, 10 proteiner involveret i patogenese, lipidoverførselsproteiner, endoglucan-1,3-β-glucosidase, glycinrige cellevægsproteiner og gener fra reaktiv iltvej.Tidlige reaktioner på 83A:476, herunder omhyggelig undertrykkelse af gener forbundet med fotosyntese, faldt sammen med vellykket beskyttelse under den vegetative vækstfase af svampebiologi, hvilket tyder på, at en effektor udløser immunitet.Mandeloop-reaktionen bremses, ligesom det overordnede vandrette træk.
Smalbladet lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) er et proteinrigt korn med oprindelse i det vestlige middelhavsområde1,2.Det dyrkes i øjeblikket som en fødevareafgrøde til dyr og mennesker.Det betragtes også som grøngødning i sædskiftesystemer på grund af nitrogenfiksering af symbiotiske nitrogenfikserende bakterier og generel forbedring af jordstrukturen.NLL har gennemgået en hurtig domesticeringsproces i det sidste århundrede og er stadig under højt avlstryk3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Med den udbredte dyrkning af NLL udviklede rækken af ​​patogene svampe nye landbrugsnicher og forårsagede nye afgrødeødelæggende sygdomme. Det mest bemærkelsesværdige for lupinavlere og -opdrættere var udseendet af anthracnose, forårsaget af den patogene svamp, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Det mest bemærkelsesværdige for lupinavlere og -opdrættere var udseendet af anthracnose, forårsaget af den patogene svamp, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогного вызванного патогного патогного патогнобирг , Feiler & Hagedorn13. Mest bemærkelsesværdig for lupinavlere og -opdrættere var fremkomsten af ​​anthracnose forårsaget af den patogene svamp Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由県它是由県它是由眅, Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眵它是由眵Håret. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенболется ) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Mest slående for lupinavlere og -opdrættere er fremkomsten af ​​anthracnose forårsaget af den patogene svamp Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.De tidligste rapporter om sygdommen kom fra Brasilien og USA, med typiske symptomer, der dukkede op i henholdsvis 1912 og 1929.Imidlertid blev patogenet efter omkring 30 år udpeget som Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf af Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stenemand) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld i målrettet morfologi. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .og H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.og H. Schlenk, .Foreløbig sygdomsfænotypning udført i midten af ​​det 20. århundrede viste en vis resistens i NLL og gul lupin (L. luteus L.) accessioner, men alle testede hvid lupin (L. albus L.) accessioner var meget modtagelige15,16.Undersøgelser har vist, at udviklingen af ​​anthracnose er forbundet med øget nedbør (luftfugtighed) og temperatur (i området 12-28°C), hvilket fører til en krænkelse af modstandsevnen ved højere temperaturer17, 18. Faktisk var den tid, det krævede for konidier at spire og sygdommen at begynde, fire gange kortere ved 24°C (12 timer) høj luftfugtighed end ved 12 timer (12 timer) høj luftfugtighed.Den igangværende globale opvarmning har således ført til spredning af anthracnose.Sygdommen blev dog observeret i Frankrig (1982) og Ukraine (1983) som en varsel om en forestående trussel, men blev tilsyneladende ignoreret af lupinindustrien på det tidspunkt20,21.Et par år senere spredte denne ødelæggende sygdom sig over hele verden og ramte også store lupinproducerende lande som Australien, Polen og Tyskland22,23,24.Efter et anthracnoseudbrud i midten af ​​1990'erne resulterede omfattende screening i identifikation af flere resistente donorer i NLL19-prøver.NLL-resistens over for anthracnose styres af to separate dominante alleler, der findes i forskellige kimplasmakilder: Lanr1 i sorten Tanjil og Wonga og AnMan i kultivaren.Mandalay 25, 26. Disse alleler komplementerer de molekylære markører, der understøtter udvælgelsen af ​​resistent kimplasma i avlsprogrammer25,26,27,28,29,30.Den resistente avlslinje 83A:476, der bærer Lanr1-allelen, blev krydset med den modtagelige vilde linje P27255 for at opnå en RIL-population, der adskilte sig for anthracnose-resistens, hvilket gjorde det muligt at tildele Lanr1-locuset til kromosom NLL-1131, 32, 33. Alignering af NLL-1131-1131, 32, 33. Alignering af en flanke-markør-resistens-lignende struktur til en lænke-markør-rammestruktur. LL afslørede placeringen af ​​alle tre alleler på det samme kromosom (NLL-11), men i forskellige positioner29,34,35.Men på grund af det lille antal RIL'er og den store genetiske afstand mellem markører og tilsvarende alleler, kan der ikke drages pålidelige konklusioner om deres underliggende gener.På den anden side er brugen af ​​omvendt genetik i lupiner vanskelig på grund af deres meget lave regenereringspotentiale, hvilket gør genetisk manipulation besværlig37.
Udviklingen af ​​domesticeret kimplasma, der bærer den ønskede allel i homozygot tilstand, såsom 83A:476 (Lanr1) og Mandelup (AnMan), har åbnet døren til at studere anthracnose-resistens i lyset af tilstedeværelsen af ​​modsatrettede kombinationer af alleler i vilde populationer.Muligheder for molekylære mekanismer.Sammenlign forsvarsresponser genereret af specifikke genotyper.Denne undersøgelse evaluerede det tidlige transkriptomrespons af NLL på C. lupini-vaccination.Først blev et europæisk NLL-kimplasmapanel indeholdende 215 linjer screenet ved anvendelse af molekylære markører, der markerer Lanr1- og AnMan-allelerne.Anthracnose-fænotypebestemmelse blev derefter udført på 50 NLL-linjer, tidligere udvalgt til molekylære markører, under kontrollerede forhold.Baseret på disse eksperimenter blev fire linjer, der adskiller sig i anthracnose-resistens og Lanr1/AnMan-allelsammensætning, udvalgt til differentiel forsvarsgenekspressionsprofilering ved hjælp af to komplementære tilgange: high-throughput RNA-sekventering og real-time PCR-kvantificering.
Screening af et sæt af NLL-kimplasma (N = 215) med markører Lanr1 (Anseq3 og Anseq4) og AnMan (Anseq4) og AnMan (AnManM1) viste, at kun én linje (95726, nær Salamanca-b) forstærker "resistens"-allelen for alle markørers allele for alle markører, mens "preceptible markører" (8) 73,5%) linjer.Tretten linjer producerede to "resistente" alleler af Lanr1-markøren, og 8 linjer producerede "resistente" alleler af Lanr1.markør."Resistens"-allelen af ​​AnMan-markøren (Supplerende tabel S1).To linjer var heterozygote for Anseq3-markøren og en heterozygot for AnManM1-markøren.42 linjer (19,5%) bar modsatte faser af Anseq3- og Anseq4-allelerne, hvilket indikerer en høj frekvens af rekombination mellem disse to loci.Anthracnose-fænotyper under kontrollerede forhold (Supplerende Tabel S2) afslørede variabilitet i de testede genotypers resistens, hvilket blev afspejlet i sværhedsgraden af ​​anthracnose.Forskelle i gennemsnitsscore varierede fra 1,8 (moderat resistent) til 6,9 (følsom), og plantevægtsforskelle varierede fra 0,62 (følsom) til 4,45 g (resistent). Der var en signifikant korrelation mellem værdier observeret i to replikationer af eksperimentet (0,51 for sygdomssværhedsscore, P = 0,00017 og 0,61 for plantevægt, P < 0,0001) samt mellem disse to parametre (- 0,59 og - 0,77, P < 0,0001). Der var en signifikant korrelation mellem værdier observeret i to gentagelser af eksperimentet (0,51 for sygdomssværhedsscore, P = 0,00017 og 0,61 for plantevægt, P < 0,0001) samt mellem disse to parametre (- 0,59 og - 0,77, P < 0,001). Выявлена ​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эксперимента = 0,51 tilskud 0,00017 og 0,61 til массы растения, P < 0,0001), а также между этими двумя параметрами (-0,59 og -0,77, 0,00 < 0,01)). Der blev fundet en signifikant sammenhæng mellem værdierne observeret i to gentagelser af forsøget (0,51 for sygdomssværhedsscore, P = 0,00017 og 0,61 for plantevægt, P < 0,0001), samt mellem disse to parametre (- 0,59 og -0,77, P < 0,000)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分,7︺0,0,7物重量为0,61，P < 0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和-0,77，P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 为庈度 诟 5. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（，，和 0.59.和– 0,59 和-0,77，P < 0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях (оценколе тяжях, 5,0, 0, 0, 0, 0 0017 и масса растения 0,61, P <0,0001), и между этими двумя параметрами (-0,59 og -0,0001) 0,77, P <0,0001. Der var en signifikant sammenhæng mellem værdierne observeret i to eksemplarer (sygdomssværhedsgrad 0,51, P = 0,00017 og plantevægt 0,61, P < 0,0001) og mellem disse to parametre (-0,59 og -0,0001) 0,77, P<0,001. ).Typiske symptomer, der ses hos modtagelige planter, omfatter knæk og vridning af stilken, der ligner en "hyrdebue"-struktur, efterfulgt af ovale læsioner med orange/lyserøde sporozoitter (Supplerende Fig. 1).Australske accessioner, der bærer generne Lanr1 (83A:476 og Tanjil) og AnMan (Mandelup), er moderat resistente, 0,0331 og 0,0036.Nogle linjer, der også bærer "resistente" Lanr1- og/eller AnMan-alleler, viser symptomer på sygdommen.
Interessant nok afslørede nogle få NLL-linjer, der manglede enhver "resistent" markørallel, et højt niveau af anthracnose-resistens (sammenlignelig med eller højere end for Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-værdi < 0,0001 for begge parametre), Bojar (P-værdi < 0,0001 for score og 0,001 B-plantevægt) (0,001 B-0, 0,001) og 0,001 B-plantevægt (0,001). 1 for score og ikke-signifikant for vægt). Interessant nok afslørede nogle få NLL-linjer, der manglede enhver "resistent" markørallel, et højt niveau af anthracnose-resistens (sammenlignelig med eller højere end for Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-værdi < 0,0001 for begge parametre), Bojar (P-værdi < 0,0001 for score og 0,001 B-plantevægt) (0,001 B-0, 0,001) og 0,001 B-plantevægt (0,001). 1 for score og ikke-signifikant for vægt). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллелясти, покасусаливыки антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таких как Boregine (frivilligt P <0,0001 метобих), 0,0001 til оценки og 0,001 для массы растения) og популяции B-549/79b (nedlagt P <0,0001 til оценки и незначимы). Interessant nok viste flere NLL-linjer, der manglede enhver 'resistent' markørallel, et højt niveau af resistens over for anthracnose (sammenlignelig med eller højere end for Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-værdi < 0,0001 for begge parametre), Bojar (P-værdi < 0,0001 for evaluering af 0,0001 for evaluering af 0,001 for 001 og B-9b) og B-9b-værdi og B-9b-værdi og B-9b-værdi. .0001 til evaluering og ikke signifikant for vægt).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的瀅疽1基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值高高. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. Det er interessant, at nogle NLL-systemer, der ikke har nogen "antigeniske" markører, udviser høj horisontal resistens (svarende til Lanr1- eller AnMan-gener eller højere), såsom Boregine (begge parametre P < 0,0001), Bojar (P-værdi < 0,0001, plantevægt 0,001) og stamme B-549/79b, ikke signifikant vægt. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», покасазалич антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (snaчение P обоих параметрнаов <0,000чен), Boregine (p. а растения 0,001) og популяция B-549/79b (оценка P-значение <0,0001, масса незначительна). Interessant nok viste nogle NLL-linjer, der manglede nogen "resistens"-markør-alleler, høje niveauer af anthracnose-resistens (sammenlignelig med eller højere end Lanr1- eller AnMan-genotyper), såsom Boregine (P-værdi for begge parametre <0,0001), Bojar (P-værdi < 0,0001, plantevægt 0,00b 9) og B-90b-værdi 0,00b-9 (0,00b-9) og population. 1, vægt ikke signifikant).Dette fænomen antyder muligheden for en ny genetisk resistenskilde, hvilket forklarer den observerede mangel på korrelation mellem markørgenotyper og sygdomsfænotyper (P-værdier fra ~0,42 til ~0,98).Kolmogorov-Smirnov-testen viste således, at dataene om anthracnose-resistens var tilnærmelsesvis normalfordelt for score (P-værdier 0,25 og 0,11) og plantemasse (P-værdier 0,47 og 0,55), hvilket tyder på, at jeg antager, at flere alleler end Lanr1 og AnMan er involveret.
Baseret på resultaterne af anthracnose-resistensscreening blev 4 linjer udvalgt til transkriptomanalyse: 83A:476, Boregine, Mandelup og Population 22660. Disse linjer blev gentestet for miltbrandresistens i inokuleringseksperimenter ved RNA-sekventering, forudsat at de var de samme som i den forrige test.Scoreværdierne var som følger: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) og befolkning 22660 (6,11 ± 1,29).
Illumina NovaSeq 6000-protokollen opnåede et gennemsnit på 40,5 Mread-par pr. prøve (29,7 til 54,4 Mreads) (Supplerende tabel S3).Justeringsscore i referencesekvensen varierede fra 75,5 % til 88,6 %.Den gennemsnitlige korrelation af læst tællingsdata mellem eksperimentelle varianter mellem biologiske replikater varierede fra 0,812 til 0,997 (gennemsnit 0,959). Ud af de 35.170 analyserede gener afslørede 2917 ingen ekspression, og de andre 4785 gener blev udtrykt på ubetydeligt niveau (basismiddelværdi < 5). Ud af de 35.170 analyserede gener afslørede 2917 ingen ekspression, og de andre 4785 gener blev udtrykt på ubetydeligt niveau (basismiddelværdi < 5). Fra 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов экспрессировались зовое среднее <5). Ud af de 35.170 analyserede gener viste 2917 ingen ekspression, og de resterende 4785 gener blev udtrykt på et ubetydeligt niveau (basismiddelværdi <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可箳帡庡庡啥忽值< 5).35.170 Fra 35 170 årlige beløb 2917 nе экспрессировались. нее значение <5). Af de 35.170 analyserede gener blev 2917 ikke udtrykt, og de resterende 4785 gener havde ubetydelig ekspression (basismiddelværdi <5).Således var antallet af gener, der blev betragtet som udtrykt (basemiddel ≥ 5) under eksperimentet 27.468 (78,1%) (Supplerende tabel S4).
Fra det første tidspunkt reagerede alle NLL-linjer på inokuleringen af ​​C. lupini (stamme Col-08) ved at omprogrammere transkriptomet (tabel 1), men der blev observeret signifikante forskelle mellem linjerne.Således viste resistenslinjen 83A:476 (som bærer Lanr1-genet) signifikant transkriptom-omprogrammering på det første tidspunkt (6 hpi) med en 31-69 gange stigning i antallet af isolerede op- og ned-gener sammenlignet med andre tidspunkter på dette tidspunkt.Derudover var denne top kortvarig, da ekspressionen af ​​kun nogle få gener forblev væsentligt ændret på det andet tidspunkt (12 hpi).Interessant nok undergik Boregine, som også viste et højt niveau af resistens i grafttesten, ikke så massiv transskriptionel omprogrammering under eksperimentet.Imidlertid var antallet af differentielt udtrykte gener (DEG) det samme for Boregine og 83A:476 ved 12 HPI.Både Mandelup og population 22660 viste DEG-toppe på det sidste tidspunkt (48 l/s), hvilket indikerer en relativ forsinkelse i forsvarets reaktioner.
Fordi 83A:476 gennemgik massiv transkriptom-omprogrammering som svar på C. lupini ved 6 HPI sammenlignet med alle andre linjer, var ~91% af de observerede DEG'er på dette tidspunkt afstamningsspecifikke (fig. 1).Der var dog en vis overlapning i tidlige svar mellem undersøgelseslinjerne, da 68,5 %, 50,9 % og 52,6 % DEG i henholdsvis Boregine, Mandelup og population 22660 overlappede med dem, der blev fundet i 83A:476 på visse tidspunkter.Disse DEG'er tegnede sig dog kun for en lille brøkdel (0,97-1,70%) af alle DEG'er, der i øjeblikket detekteres ved hjælp af 83A:476.Derudover var 11 grader fra alle linjer sammenhængende på dette tidspunkt (Supplerende tabeller S4-S6), inklusive almindelige komponenter i planteforsvarsreaktioner: lipidoverførselsprotein (TanjilG_32225), endoglucan-1,3-β-glucosidenzym (TanjilG_23388) (TanjilG_23388_stress-in TanjilG24), to stress-in Tanjil-proteiner som T2AMJ824 og T2AMJ824. G_31531), basisk latexprotein (TanjilG_32352) og to glycinrige strukturelle cellevægsproteiner (TanjilG_19701 og TanjilG_19702).Der var også et relativt højt overlap i transkriptomresponser mellem 83A:476 og Boregine ved 24 HPI (i alt 16-38% DEG) og mellem Mandelup og Population 22660 ved 48 HPI (i alt 14-20% DEG).
Venn-diagram, der viser antallet af differentielt udtrykte gener (DEG) i smalbladet lupin (NLL) linjer podet med Colletotrichum lupini (stamme Col-08 opnået fra lupinmarker i Wierzhenice, Polen, 1999).De analyserede NLL-linjer var: 83A:476 (resistent, bærende Lanr1-allelen), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærende AnMan-allelen) og population 22660 (meget modtagelig).Forkortelsen hpi står for timer efter vaccination.Nulværdier er blevet fjernet for at forenkle grafen.
Sættet af overudtrykte gener ved 6 hpi blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​kanoniske R-gendomæner (Supplerende tabel S7).Denne undersøgelse afslørede transkriptominduktion af klassiske sygdomsresistensgener med NBS-LRR-domæner kun ved 83A:476.Dette sæt bestod af et TIR-NBS-LRR-gen (tanjilg_05042), fem CC-NBS-LRR-gener (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 og tanjilg_16162) og Four NBS-LR, NLG_1BS, 1BS, 1BS, 1BS 16162) samt Fire NBS-Lrr (tanjilg_16162) og Fire NBS-LRR (TANJILG_16162).Alle disse gener har kanoniske domæner arrangeret i konserverede sekvenser.Ud over NBS-LRR-domænegenerne blev adskillige RLL-kinaser aktiveret ved 6 hpi, nemlig en i Boregine (TanjilG_19877), to i Mandelup (TanjilG_07141 og TanjilG_19877) og i populationen 22660 (Tanjil01_4 og 36ilG 2 i TanjilG_07) to i Tanjil01_4 og 391A 2 i TanjilG_07. :476.
Gener med signifikant ændret ekspression som reaktion på inokulering med C. lupini (stamme Col-08) blev udsat for Gene Ontology (GO) berigelsesanalyse (Supplerende tabel S8). Det hyppigst overrepræsenterede biologiske procesudtryk var "GO:0006952 forsvarsrespons", som optrådte i 6 ud af 16 (tid × linje) kombinationer med høj signifikans (P værdi < 0,001) (fig. 2). Det hyppigst overrepræsenterede biologiske procesudtryk var "GO:0006952 forsvarsrespons", som optrådte i 6 ud af 16 (tid × linje) kombinationer med høj signifikans (P værdi < 0,001) (fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитнетый, 6 повятный» из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Det hyppigst overrepræsenterede biologiske procesudtryk var 'GO:0006952 forsvarsrespons', som optrådte i 6 af 16 (tid × linie) kombinationer med høj signifikans (P værdi < 0,001) (fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现圴圴圴庴庴庐缄组纐＄终个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Det mest repræsentative biologiske procesudtryk er "GO:0006952 forsvarsrespons", som optræder i 6 af de 16 (时间×线) kombinationer, med høj signifikans (P-værdi < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», колсяз 16 колся з 16 инаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). Det hyppigst overrepræsenterede biologiske procesudtryk var 'GO:0006952 Defence Response', som optrådte i 6 ud af 16 kombinationer (tid × linje) med høj signifikans (P-værdi < 0,001) (fig. 2).Dette udtryk var overrepræsenteret på to tidspunkter i 83A: 476 og Boregine (6 og 24 hpi) og på et tidspunkt i Mandelup og Population 22660 (henholdsvis 12 og 6 hpi).Dette er et forventet resultat, der fremhæver den svampedræbende respons af de resistente linjer.Derudover reagerede 83A:476 på C. lupini ved hurtigt at inducere gener relateret til det oxidative udbrud repræsenteret af udtrykket "GO:0055114 redoxproces", hvilket indikerer et specifikt forsvarsrespons, mens Boregine afslørede specifikke forsvarsresponser, relateret til udtrykket 'GO'.:0006950 Stressrespons”.Population 22660 aktiverede den horisontale resistensrespons, der involverede sekundære metabolitter, hvilket fremhævede det overdrevne antal udtryk "GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis" og "GO:0006722 Process of triterpene metabolism" (begge termer tilhører det samme sæt gener), under hensyntagen til termen, resultaterne af GO2-berigelsesreaktionen, GO2, 6-befolkningsberigelse, 0. Derudover inkluderer tidlig reaktion 83A:476 (6 hpi) og forsinket reaktion Mandelup og Population 22660 udtrykket GO:0015979 'fotosyntese' og andre relaterede biologiske processer.
De bioprocesgenontologiske termer, der er udvalgt i annoteringen af ​​differentielt udtrykte gener under transkriptomresponser af smalbladet lupin (NLL) inokuleret med miltbrandlupin (Col-08-stamme opnået fra lupinfelter i Wierzhenice, Polen, i 1999) er stærkt overdrevne.De analyserede NLL-linjer var: 83A:476 (resistent, bærende den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, ukendt genetisk baggrund), Mandelup (moderat resistent, bærende den homozygote AnMan-allel) og population 22660 (modtagelig).
Fordi denne undersøgelse havde til formål at identificere gener, der bidrager til anthracnose-resistens, blev generne tildelt udtrykkene GO "GO: 0006952 Defensive responses" og "GO: 0055114 Redox-processer" analyseret med cut-offs, da baseline betyder ≥ 30 med mindst én linje.× tidspunkt, der kombinerer statistisk signifikante værdier af log2 (fold ændring).Antallet af gener, der opfylder disse kriterier, var 65 for GO:0006952 og 524 for GO:0055114.
83A:476 afslørede to DEG-toppe annoteret med udtrykket GO:0006952, den første ved 6 gener pr. tomme (64 gener, op- og nedregulering) og den anden ved 24 gener pr. tomme (15 gener, kun op-regulering).Boregine viste også, at GO:0006952 toppede på samme tidspunkt, men med mindre DEG (11 og 8) og præferenceaktivering.Mandeloop viste to toppe af GO:0006952 ved 12 og 48 HPI, begge med 12 gener (det første med aktiverende gener og det andet med kun suppressive gener), mens 22660-populationen ved 6 HPI (13 gener) havde en større overvægt af stigningstoppen.regulering.Det skal bemærkes, at 96,4% af GO:0006952 DEG i disse toppe havde den samme type respons (op eller ned), hvilket indikerer et signifikant overlap i forsvarsresponser på trods af forskelle i antallet af involverede gener.Den største gruppe af sekvenser relateret til udtrykket GO:0006952 koder for Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-lignende), som hører til klasse 10 patogenese-associeret protein (PR-10) proteinklad og kerneproteinlatexen.lignende (MLP-lignende) protein) protein (fig. 3).De to grupper adskilte sig i karakteren af ​​udtryk og retningen af ​​responsen.Generne, der koder for SAM22-lignende proteiner, viste konsistent og signifikant induktion på tidlige tidspunkter (6 eller 12 hpi) og reagerede generelt ikke ved slutningen af ​​eksperimentet (48 hpi), mens MLP-lignende proteiner viste koordination ved 6 hpi.hpi.83A:476 og Mandelup med 48 hk/in, næsten alle andre datapunkter reagerede ikke.Derudover fulgte forskelle i ekspressionsprofiler af SAM22-lignende proteingener observeret variabilitet i anthracnoseresistens, da mere resistente linjer havde flere tidspunkter, der signifikant inducerede disse gener end mere modtagelige gener.Et andet LlR18A/B-lignende PR-10-gen viste et meget lignende ekspressionsmønster til det SAM22-lignende proteingen.
Hovedkomponenterne i den biologiske procesterm "GO:0006952 Defense Response" og ekspressionsmønstrene for kandidatgener for Lanr1- og AnMan-allelerne blev identificeret.Log2-skalaen repræsenterer log2-værdier (fold ændring) mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrol (sham-inokulerede) planter på samme tidspunkt.Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærende den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærende den homozygote AnMan-allel) og Population 22660 (modtagelig).
Derudover blev ekspressionsprofilerne for RNA-seq-kandidatgener Lanr1 (TanjilG_05042) og AnMan (TanjilG_12861) evalueret (fig. 3).TanjilG_05042-genet viste en signifikant respons (aktivering) ved 83A:476 kun på det første tidspunkt (6 hpi), mens TanjilG_12861 kun var signifikant i Mandeloop på to tidspunkter: 6 hpi (nedregulering) og 24 hpi (6 hpi).Med.).justerbar) ).
De mest overudtrykte gener i udtrykket GO:0055114 "redoxproces" var gener, der koder for cytokrom P450-proteiner og peroxidase (fig. 4).For prøver isoleret fra 83A:476 ved 6 HPI blev maksimale eller minimale log2 (fold ændring) værdier (for 86,6% af generne) generelt observeret mellem inokulerede og kontrolplanter, hvilket fremhæver den høje respons af denne genotype på inokulering af sex.83A:476 viste den mest signifikante GO: 0055114 DEG ved 6 hpi (503 gener), mens resten af ​​linjerne ved 48 hpi (Boregine, 31 gener; Mandelup, 85 gener; og Population 22660, 78 gener)).I de fleste gener fra GO:0055114-familien blev der observeret to typer reaktioner på vaccination (aktivering og hæmning).Interessant nok antyder op til 97,6% af de DEG'er, der er identificeret til udtrykket GO: 0055114 i Mandelupe ved 48 hk disse observationer, at på trods af den markant mindre skala (dvs. antallet af muterede redoxgener, 85 versus 503), er mønsteret af forsinket transkriptomrespons fra mandeloup til antracnose den tidlige respons på 83a: 476.I Boregine og Population 22660 er denne konvergens lavere på henholdsvis 51,6 % og 75,6 %.
Udtryksmønstrene for hovedkomponenterne i udtrykket for den biologiske proces "GO:0055114 Redox-proces" blev afsløret.Log2-skalaen repræsenterer log2-værdier (fold ændring) mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrol (sham-inokulerede) planter på samme tidspunkt.Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærende den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærende den homozygote AnMan-allel) og Population 22660 (modtagelig).
83A:476 Transkriptomiske reaktioner på inokulering med C. lupini (stamme Col-08) inkluderede også koordineret lyddæmpning af gener, der tilskrives udtrykket GO:0015979 "fotosyntese" og andre relaterede biologiske processer (FIG. 5).Dette GO:0015979 DEG sæt indeholdt 105 gener, der var signifikant undertrykt ved 6 hpi ved 83A:476.I denne undergruppe blev 37 gener også nedreguleret i Mandelup ved 48 HPI og 35 på samme tidspunkt i 22660-populationen, inklusive 19 DEG fælles for begge genotyper.Ingen DEG'er relateret til term GO: 0015979 blev signifikant aktiveret i nogen kombination (linje x tid).
Udtryksmønstrene for hovedkomponenterne i udtrykket for den biologiske proces "GO:0015979 Fotosyntese" blev afsløret.Log2-skalaen repræsenterer log2-værdier (fold ændring) mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker, Wizhenica, Polen, 1999) og kontrol (sham-inokulerede) planter på samme tidspunkt.Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærende den homozygote Lanr1-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt), Mandelup (moderat resistent, bærende den homozygote AnMan-allel) og Population 22660 (modtagelig).
Baseret på resultaterne af differentiel ekspressionsanalyse og formentlig involveret i forsvarsresponser mod patogene svampe, blev dette sæt af syv gener udvalgt til kvantificering af ekspressionsprofiler ved real-time PCR (Supplerende Tabel S9).
Det formodede proteingen TanjilG_10657 blev signifikant induceret i alle undersøgte linjer og tidspunkter sammenlignet med kontrolplanter (efterlignende) (supplerende tabeller S10, S11).Derudover viste ekspressionsprofilen for TanjilG_10657 en stigende tendens i løbet af eksperimentet for alle linjer.Population 22660 viste den højeste følsomhed af TanjilG_10657 over for podning med 114 gange aktivering og det højeste relative ekspressionsniveau (4,4 ± 0,4) ved 24 HPI (fig. 6a).PR10 LlR18A-proteingenet TanjilG_27015 viste også aktivering på tværs af alle linjer og tidspunkter med statistisk signifikans ved de fleste datapunkter (fig. 6b).I lighed med TanjilG_10657 blev det højeste relative ekspressionsniveau af TanjilG_27015 observeret i den 22660 inokulerede population ved 24 HPI (19,5 ± 2,4).Det sure endochitinase-gen TanjilG_04706 var signifikant opreguleret i alle linjer og på alle tidspunkter bortset fra Boregine 6 hpi (fig. 6c).Det blev kraftigt induceret ved det første tidspunkt (6 HPI) ved 83A:476 (med 10,5 gange) og moderat forøget i andre linjer (med 6,6-7,5 gange).Under eksperimentet forblev udtrykket af TanjilG_04706 på lignende niveauer i 83A:476 og Boregine, mens det i Mandelup og Population 22660 steg signifikant og nåede relativt høje værdier (henholdsvis 5,9 ± 1,5 og 6,2 ± 1,5).Det endoglucan-1,3-β-glucosidase-lignende gen TanjilG_23384 viste høj aktivering på de første to tidspunkter (6 og 12 hpi) i alle linjer undtagen population 22660 (fig. 6d).De højeste relative ekspressionsniveauer af TanjilG_23384 blev observeret på det andet tidspunkt (12 hpi) i Mandelup (2,7 ± 0,3) og 83A:476 (1,5 ± 0,1).Ved 24 HPI var TanjilG_23384-ekspression relativt lav i alle undersøgte linjer (fra 0,04 ± 0,009 til 0,44 ± 0,12).
Ekspressionsprofiler af udvalgte gener (ag) afsløret ved kvantitativ PCR.Tallene 6, 12 og 24 repræsenterer timer efter vaccination.LanDExH7 og LanTUB6 generne blev brugt til normalisering, og LanTUB6 blev brugt til inter-serie kalibrering.Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen baseret på tre biologiske replikater, som hver er gennemsnittet af tre tekniske replikater. Den statistiske signifikans af forskelle i ekspressionsniveauerne mellem de inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået i 1999 fra lupinfeltet i Wierzenica, Polen) og kontrol- (mock-inokulerede) planter er markeret over datapunkterne (*P-værdi < 0,05, **P.-værdi ≤ .0). Den statistiske signifikans af forskelle i ekspressionsniveauerne mellem de inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået i 1999 fra lupinfeltet i Wierzenica, Polen) og kontrol- (mock-inokulerede) planter er markeret over datapunkterne (*P-værdi < 0,05, **P.-værdi ≤ .0). Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, 9 пгв 9. juli. юпина в Верженице, Польша) og контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данными (*0,0 p. 0,5 p. **) ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Statistisk signifikante forskelle i ekspressionsniveauer mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået i 1999 fra en lupinmark i Wierzhenice, Polen) og kontrol (sham-inokulerede) planter er noteret over datapunkterne (*P-værdi < 0,05, **P-værdi ≤,*** 0,0,0).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（騡种缉（騡种缉接水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值) ≤ 0,0)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 撌 鯹煤照 缈平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤。01)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полнюсч Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над тонтрольными (ложно инокулированными) растениями отмечены над точными (p. начение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Statistisk signifikante forskelle i ekspressionsniveauer mellem inokulerede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker i Verzhenice, Polen, i 1999) og kontrol (sham-inokulerede) planter er noteret over datapunkterne (*P værdi < 0,05, **P-værdi ≤ 0,0 e, 0, 0).De analyserede NLL-linjer var: 83A:476 (resistent, bærende den homozygote Lanr1-allel), Mandelup (moderat resistent, bærende den homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, ukendt genetisk baggrund) og population 22660 (modtagelig).
Kandidatgenet TanjilG_05042 på Lanr1-locuset viste et markant anderledes ekspressionsmønster fra profilerne opnået fra RNA-seq-undersøgelser (fig. 6e).Signifikant aktivering af dette gen blev observeret i Mandelup og 22660-populationen (henholdsvis op til 39,7 og 11,7 gange), hvilket resulterede i relativt høje ekspressionsniveauer (op til henholdsvis 1,4 ± 0,14 og 7,2 ± 1,3).83A:476 afslørede også en vis opregulering af TanjilG_05042-genet (op til 3,8 gange), men de opnåede relative ekspressionsniveauer (0,044 ± 0,002) var mere end 30 gange lavere end de observerede i Mandelup og 22660-populationen.analyseret ved qPCR viste signifikante forskelle i ekspressionsniveauer mellem genotyper i mock-vaccinerede (kontrol) varianter, og nåede en 58-fold forskel mellem populationerne 22660 og 83A:476, såvel som mellem populationerne 22660 og 22660. En to gange forskel blev opnået mellem Boregine og Mandalup.
Kandidatgenet ved AnMan-locuset, TanjilG_12861, blev aktiveret som reaktion på vaccination i 83A:476 og Mandelup, var neutralt i 22660-populationen og blev nedreguleret i Boregine (fig. 6f).Den relative ekspression af TanjilG_12861-genet var den højeste i inokuleret 83A: 476 (0,14±0,01).17,4 kDa klasse I varmechokproteingenet TanjilG_05080 HSP17.4 viste lavere relative ekspressionsniveauer i alle undersøgte stammer og tidspunkter (fig. 6g).Den højeste værdi blev observeret ved 24 HPI i 22660-populationen (0,14 ± 0,02, en otte gange stigning i respons på vaccination).
Sammenligning af genekspressionsprofiler (fig. 7) afslørede en høj korrelation mellem TanjilG_10657 og fire andre gener: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,6G_0, og 4 = 0,80) (9).Sådanne resultater kan indikere samregulering af disse gener under forsvarsreaktioner.TanjilG_12861- og TanjilG_23384-generne viste forskellige ekspressionsprofiler med lavere Pearson-korrelationskoefficientværdier (fra henholdsvis 0,08 til 0,43 og -0,19 til 0,28) sammenlignet med andre gener.
Korrelationer mellem genekspressionsprofiler blev påvist ved anvendelse af kvantitativ PCR.Følgende smalbladede lupinlinjer blev analyseret: 83A:476 (resistent, bærende den homozygote Lanr1-allel), Mandelup (moderat resistent, bærende den homozygote AnMan-allel), Boregine (resistent, genetisk baggrund ukendt) og Population 22660 (modtagelig).Tre tidspunkter blev beregnet (6, 12 og 24 timer efter podning), inklusive podede (Colletotrichum lupini, stamme Col-08, opnået fra lupinmarker i Wierzhenice, Polen, i 1999) og kontrolplanter (sham-inokulerede).Skalaen viser værdien af ​​Pearson-korrelationskoefficienten.
Baseret på data opnået ved 6 hestekræfter pr. tomme blev WGCNA udført på 9981 DEG identificeret ved at sammenligne podede og kontrolplanter for at fokusere på tidlige forsvarsresponser (Supplerende tabel S12).Der blev fundet 22 genmoduler (klynger) med korrelerede (positive eller negative) ekspressionsprofiler mellem genotyper og eksperimentelle varianter. I gennemsnit var genekspressionsniveauerne faldende i rækkefølgen 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i begge varianter var denne tendens dog stærkere i kontrolplanter). I gennemsnit var genekspressionsniveauerne faldende i rækkefølgen 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i begge varianter var denne tendens dog stærkere i kontrolplanter). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 (в обоих вариантах, боих вариантах, боих вариантах, ла сильнее у контрольных растений). Genekspressionsniveauer faldt i gennemsnit i størrelsesordenen 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i begge varianter var denne tendens dog stærkere i kontrolplanter).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> befolkning 22660 的 顺序 下降 （， ， 県 圿在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。…… В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Befolkning 22660 ильнее у контрольных растений). Genekspressionsniveauer faldt i gennemsnit i serien 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (i begge varianter var denne tendens dog stærkere i kontrolplanter).Vaccination resulterede i opregulering af genekspression, især i modul 18, 19, 14, 6 og 1 (i faldende virkningsrækkefølge), negativ regulering (f.eks. modul 9 og 20) eller med neutrale effekter (f.eks. modul 11, 22, 8 og 13).GO-termberigelsesanalyse (Supplerende Tabel S13) afslørede "GO: 0006952 Beskyttende responser" for det inokulerede modul (18) med maksimal aktivering, herunder gener analyseret af qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_j755, TanjilG_1055, samt de fleste inculate_1055) fotosyntesemoduler (9).Modul 18-koncentrator (fig. 8) blev identificeret som TanjilG_26536-genet, der koder for det PR-10-lignende LlR18B-protein, og modul 9-koncentrator blev identificeret som TanjilG_28955-genet, der koder for fotosystem II PsbQ-proteinet.Et kandidat-anthracnose-resistensgen Lanr1, TanjilG_05042, blev fundet i modul 22 (fig. 9) og er forbundet med udtrykkene "GO:0044260 Cellulære makromolekylære metaboliske processer" og "GO:0006355 Transkriptionel regulering, DNA-skabelon", der bærer Tangen212G_hubben.genet koder for varmestress transkriptionsfaktor A-4a (HSFA4a).
Vægtet netværksanalyse af gen-co-ekspression af moduler med overrepræsenterede biologiske procestermer "GO: 0006952 Defence responses".Ligering blev forenklet for at fremhæve de fire gener analyseret med qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 og TanjilG_27015).
Vægtet netværksanalyse af gen-co-ekspression af et modul med en overrepræsenteret biologisk procesterm "GO: 0006355: Transcriptional Regulation, DNA-templating" og bærende et kandidat anthracnose-resistensgen Lanr1 TanjilG_05042.Ligering blev forenklet for at isolere TanjilG_05042-genet og det centrale TanjilG_01212-gen.
Anthracnose-resistensscreening indsamlet i Australien viste, at de fleste af de tidligt frigivne kultivarer var modtagelige;Kalya, Coromup og Mandelup er blevet beskrevet som moderat resistente, mens Wonga, Tanjil og 83A:476 er blevet beskrevet som meget resistente26,27,31.havde den samme modstandsallel, betegnet Lanr1, og Coromup og Mandelup havde en anden allel, betegnet AnMan10, 26, 39, mens Kalya videregav en anden allel., Lanr2.Screening for anthracnose-resistens i Tyskland resulterede i identifikation af en resistent linje Bo7212 med en anden kandidatallel end Lanr1, betegnet LanrBo36.
Vores undersøgelse afslørede en meget lav frekvens (ca. 6%) af Lanr1-allelen i den testede kimplasma.Denne observation er i overensstemmelse med resultaterne af screening af østeuropæisk kimplasma ved hjælp af Anseq3- og Anseq4-markørerne, som viste, at Lanr1-allelen kun er til stede i to hviderussiske linjer.Dette tyder på, at Lanr1-allelen endnu ikke er meget udbredt af lokale avlsprogrammer, i modsætning til i Australien, hvor den er en af ​​nøgleallelerne for markør-assisteret avl.Dette kan skyldes det lavere niveau af resistens leveret af Lanr1-allelen under europæiske feltforhold sammenlignet med den australske rapport.Derudover har undersøgelser af anthracnose i områder med høj nedbør i Australien vist, at resistensresponser medieret af Lanr1-allelen muligvis ikke er effektive under vejrforhold, der favoriserer vækst og hurtig udvikling af patogenet19,42.Faktisk blev nogle symptomer på anthracnose i denne undersøgelse også observeret i genotyper, der bærer Lanr1-allelen, hvilket tyder på, at resistens kan forsvinde under optimale betingelser for udvikling af C. lupini.Derudover er falsk positive fortolkninger af tilstedeværelsen af ​​Anseq3- og Anseq4-markører, som er ca. 1 cM fra Lanr1-locuset, mulige 28,30,43.
Vores undersøgelse viste, at 83A:476, der bærer Lanr1-allelen, reagerede på C. lupini-podning med storstilet transkriptom-omprogrammering på det første analyserede tidspunkt (6 hpi), mens der i Mandelup, der bærer AnMan-allelen, blev observeret transkriptomiske reaktioner meget senere.(fra 24 til 48 hk).Disse tidsmæssige variationer i forsvarsreaktioner er forbundet med forskelle i sygdomssymptomer, hvilket fremhæver vigtigheden af ​​tidlig patogengenkendelse for en vellykket reaktion på resistens.For at inficere plantevæv skal miltbrandsporer gennemgå flere udviklingsstadier på værtsoverfladen, herunder spiring, celledeling og dannelse af et appressorium.Et vedhæng er en infektiøs struktur, der hæfter til overfladen af ​​værten og letter indtrængning i værtsvævene.Sporer af C. gloeosporioides i ærteekstrakt viste således den første deling af kernen efter 75-90 minutters inkubation, dannelsen af ​​et kimrør efter 90-120 minutter og suppression efter 4 timer 45 .Mango C. gloeosporioides viste mere end 40 % konidiespiring efter 3 timers inkubation og ca. 20 % dannelse af apressorer efter 4 timer.Det virulensassocierede CAP20-gen af ​​C. gloeosporioides viste transkriptionel aktivitet i epifytdannende konidier efter 3,5 timers inkubation i avocadooverfladevoks med høje koncentrationer af CAP20-protein efter 4 timer og 46 minutter.Tilsvarende blev aktiviteten af ​​melaninbiosyntesegener i C. trifolii induceret under en 2-timers inkubation efterfulgt af dannelsen af ​​et appressorium efter 1 time.Undersøgelser af bladvæv har vist, at jordbær podet med C. acutatum har første suppression ved 8 hpi, mens tomater podet med C. coccodes har første suppression ved 4 hpi48,49.stort set i overensstemmelse med tidsskalaen for Colletotrichum spp.infektiøs proces.Hurtige forsvarsresponser på 83A:476 tyder på involvering af planteresistens og effektor-udløste immunitet (ETI) gener i denne linje, mens Mandelups forsinkede responser understøtter den mikroassocierede molekylære mønster-udløste immunitet (MTI) hypotese 50. Tidlige responser på 83A: 476 og Mandelup.Den delvise overlapning mellem op- eller nedregulerede gener i forsinket respons understøtter også dette koncept, da ETI ofte anses for at være en accelereret og forstærket MTI-respons, der kulminerer i programmeret celledød på infektionsstedet, kendt som anafylaktisk shock 51,52.
De fleste af generne, der tilskrives det overrepræsenterede udtryk Gene Ontology GO:0006952 "Defense Response" er de 11 homologer af det stress-inducerede faste-besked 22-protein (svarende til SAM22) og de syv store latex-protein-lignende (MLP'er).-lignende proteiner 31, 34, 43 og 423 viste sekvenslighed.SAM22-lignende gener viste signifikant aktivering, der varede længere, hvilket viste øgede niveauer af anthracnoseresistens (83A:476 og Boregine).Imidlertid blev MLP-lignende gener kun nedreguleret i linjer, der bærer kandidat-resistensallelen (83A:476/Lanr1 ved 6 hpi og Mandelup/AnMan ved 24 hpi).Det skal bemærkes, at alle identificerede SAM22-lignende homologer stammer fra en genklynge, der spænder over ca. 105 kb, mens MLP-lignende gener stammer fra separate områder af genomet.Koordineret aktivering af sådanne SAM22-lignende gener blev også fundet i vores tidligere undersøgelse af NLL-resistens over for Diaporthetoxica-podning, hvilket tyder på, at de er involveret i de horisontale komponenter af forsvarsresponsen.Denne konklusion understøttes også af rapporter om en positiv respons af SAM22-lignende gener på skade eller behandling med salicylsyre, svampeinducere eller hydrogenperoxid.
MLP-lignende gener har vist sig at reagere på forskellige abiotiske og biotiske belastninger, herunder bakterielle, virale og patogene svampeinfektioner i mange plantearter55.Reaktionsretningerne på visse interaktioner mellem planter og patogener varierede fra stærkt stigende (dvs. under angreb af bomuld med Verticillium dahliae) til signifikant faldende (dvs. efter infektion af æbletræ med Alternaria spp.)56,57.Signifikant nedregulering af det MLP-lignende 423-gen er blevet observeret under avocadoforsvar mod F. niger-infektion og under infektion af æbletræet Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola og Alternaria alternata er æblepatotyper58,59.Derudover havde æblekalli, der overudtrykte det MLP-lignende 423-gen, lavere ekspression af resistensassocierede gener og var mere modtagelige for svampeinfektion59.Efter Fusarium oxysporum f blev det MLP-lignende 423-gen også undertrykt i resistent almindelig bønnekimplasma.cn.Bønneinfektion 60.
Andre medlemmer af PR-10-familien identificeret i vores RNA-seq-undersøgelse var LlR18A- og LlR18B-generne som reaktion på opregulering, såvel som det opregulerede (1 gen) eller nedregulerede (3 gener) gen for lipidoverførselsproteinet DIR1..Derudover fremhæver WGCNA LlR18B-genet som et knudepunkt i dette modul, som er meget modtageligt for vaccination og bærer adskillige beskyttende responsgener.LlR18A- og LlR18B-generne blev induceret i gule lupinblade som reaktion på patogene bakterier, såvel som i NLL-stængler efter D. toxica-podning, mens rishomologen af ​​disse gener, RSOsPR10, hurtigt blev induceret af en svampeinfektion, der formodentlig var involveret i den ikke-specifikke D. 1-genet for jasmonsyre-genet 532, IR, 532,6,6. id-transportproteiner, der er nødvendige for indtræden af ​​systemisk erhvervet resistens (SAR).Med udviklingen af ​​beskyttende reaktioner transporteres DIR1-proteinet fra infektionens fokus gennem floemet for at inducere SAR i fjerne organer.Interessant nok blev TanjilG_02313 DIR1-genet signifikant induceret på det første tidspunkt i linje 84A:476 og Population 22660, men anthracnose-resistens udviklede sig kun med succes i linje 84A:476.Dette kan indikere en vis subfunktionalisering af DIR1-genet i NLL, da de resterende tre homologer kun reagerede på inokulering i 83A:476-linjen ved 6 hpi, og denne respons var rettet nedad.
I vores undersøgelse var de mest almindelige komponenter svarende til den biologiske proces kaldet "GO:0055114 Redox-processen" cytochrom P450-protein, peroxidase, linolsyre 9S-/13S-lipoxygenase og 1-aminocyclopropan-1-carboxylsyreoxidase.Derudover definerer vores WGCNA HSFA4a-homologen som en hub, der bærer moduler såsom Lanr1-resistensgenkandidaten TanjilG_05042.HSFA4a er en komponent i den redoxafhængige regulering af nuklear transkription i planter.
Cytokrom P450-proteiner er oxidoreduktaser, der katalyserer NADPH og/eller O2-afhængige hydroxyleringsreaktioner i primær og sekundær metabolisme, herunder metabolismen af ​​xenobiotika, samt hormoner, fedtsyrer, steroler, cellevægskomponenter, biopolymerer og biosyntesen af ​​beskyttende forbindelser 69. I vores var40-plante funktion var logchrom-in-69 i vores P50-studie reduceret. 2 (fold ændring) til 5,7 på grund af et stort antal ændrede homologer (37) og forskelle i responsmønstre mellem specifikke gener, hvilket afspejler en opadgående revision..Kun at bruge RNA-seq-data til at belyse den formodede biologiske funktion af NLL-generne i en så stor protein-superfamilie ville være meget spekulativt.Det er dog værd at bemærke, at nogle cytokrom P450-gener er forbundet med øget resistens over for patogene svampe eller bakterier, herunder et bidrag til allergiske reaktioner69,70,71.
Klasse III peroxidaser er multifunktionelle planteenzymer involveret i en lang række metaboliske processer under plantevækst og -udvikling, såvel som som reaktion på miljøbelastninger såsom saltholdighed, tørke, høj lysintensitet og patogenangreb72.Peroxidaser er involveret i interaktionen mellem flere plantearter med Anthracis, herunder Stylosanthes humilis og C. gloeosporioides, Lens culinaris og C. truncatum, Phaseolus vulgaris og C. lindemuthianum, Cucumis sativus og C. lagenarium73,74,75,76.Reaktionen er meget hurtig, nogle gange endda ved 4 HPI, før svampen trænger ind i plantevævet73.Peroxidasegenet reagerede også på D. toxica NLL-podning.Ud over deres typiske funktioner til at regulere oxidativt udbrud eller eliminere oxidativt stress, kan peroxidaser interferere med patogenvækst ved at skabe fysiske barrierer baseret på cellevægsforstærkning under lignificering, underenhed eller tværbinding af specifikke forbindelser.Denne funktion kan i silico tilskrives TanjilG_03329-genet, der koder for en formodet lignindannende anionperoxidase, der var signifikant opreguleret i vores undersøgelse i den 83A:476-resistente linje ved 6 HPI, men ikke i andre stammer og tidspunkter, der ikke reagerede.
9S-/13S-lipoxygenase af linolsyre er det første trin i den oxidative vej af lipidbiosyntese78.Produkterne af denne vej har flere funktioner i planteforsvar, herunder cellevægsstyrkelse gennem dannelse af callose- og pektinaflejringer og regulering af oxidativt stress gennem produktion af reaktive oxygenarter79,80,81,82,83.I den foreliggende undersøgelse blev ekspressionen af ​​linolsyre 9S-/13S-lipoxygenase ændret i alle stammer, men i den modtagelige population 22660 var opregulering fremherskende på forskellige tidspunkter, mens det i stammer, der bærer resistent Lanr1 og AnMan-allelen, understreger diversificeringen af ​​oxylipin-lagene mellem disse genotypiske reaktioner.
1-aminocyclopropan-1-carboxylatoxidase (ACO) homologen var signifikant opreguleret (9 gener) eller nedreguleret (2 gener) ved inokulering med lupin.Med to undtagelser forekom alle disse svar ved 6 hk.ved 83A:476.Den enzymatiske reaktion medieret af ACO-proteiner er det hastighedsbegrænsende trin i ethylenproduktion og er derfor stærkt reguleret84.Ethylen er et plantehormon, der spiller en række roller i regulering af planteudvikling og respons på abiotiske og biotiske stressforhold.Induktionen af ​​ACO-transkription og aktivering af ethylensignalvejen er involveret i at øge risresistensen over for den hemibiotrofiske svamp oryzae oryzae ved at regulere produktionen af ​​reaktive oxygenarter og phytoalexiner.En meget lignende bladinfektionsproces fundet mellem M. oryzae og C. lupini88,89, på baggrund af en signifikant opregulering af ACO-homologer i 83A:476-linjen rapporteret i denne undersøgelse, ændrer muligheden for at give resistens over for NLL anthracnose Ethylen et signalerende centralt trin i molekylære veje.
I denne undersøgelse blev storstilet undertrykkelse af mange gener forbundet med fotosyntese observeret ved 6 hpi i 83A:476 og ved 48 hpi i Mandeloop og 22660-populationen.Omfanget og progressionen af ​​disse ændringer er proportional med niveauet.Anthracnose-resistens blev observeret i dette eksperiment.For nylig er stærk og tidlig undertrykkelse af fotosyntese-relaterede transkripter blevet rapporteret i flere modeller af plante-patogen-interaktioner, herunder patogene bakterier og svampe.Hastværk (fra 2 HPI i nogle interaktioner) og global undertrykkelse af gener forbundet med fotosyntese som reaktion på infektion kan udløse planteimmunitet baseret på udbredelsen af ​​reaktive oxygenarter og deres interaktion med salicylsyrevejen for at mediere allergiske reaktioner 90,94.
Som konklusion inkluderer forsvarsresponsmekanismer foreslået for den mest resistente afstamning (83A:476) hurtig patogengenkendelse af R-genet (formodentlig TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) og allergisk respons-medieret salicylsyre- og ethylensignalering, efterfulgt af etablering af langtrækkende SAR.handlingen understøttes af DIR-1-proteinet.Det skal bemærkes, at den biotrofiske periode for C. lupini-infektion er meget kort (ca. 2 dage), efterfulgt af nekrotisk vækst95.Overgangen mellem disse stadier kan være forbundet med nekrose og ekspression af ethylen-inducerbare proteiner, der virker som triggere for overfølsomhedsreaktioner i værtsplanter.Derfor er tidsvinduet for vellykket indfangning af C. lupini på det biotrofiske stadium meget snævert.Omprogrammeringen af ​​gener forbundet med redox og fotosyntese observeret i 83A:476 ved 6 hpi er i overensstemmelse med udviklingen af ​​svampehyfer og varsler udviklingen af ​​et vellykket beskyttende respons på det biotrofiske stadium.De transkriptomiske responser fra Mandelup og 22660-populationen kan være for forsinket til at fange svampen, før der skiftes til nekrotisk vækst, men Mandelup kan være mere effektiv end 22660-populationen, fordi den relativt hurtige regulering af PR-10-proteinet fremmer horisontal resistens.
ETI, drevet af det kanoniske R-gen, ser ud til at være en almindelig mekanisme for bønneresistens over for anthracnose.I modelbælgplanten Medicago truncatula er resistens over for anthracnose således tildelt af RCT1-genet, et medlem af TIR-NBS-LRR97 plante R-genklassen.Dette gen giver også bredspektret anthracnose-resistens i lucerne, når det overføres til modtagelige planter.I den almindelige bønne (P. vulgaris) er mere end to dusin anthracnose-resistensgener blevet identificeret til dato.Nogle af disse gener findes i områder, der mangler nogen kanoniske R-gener, men mange andre er placeret i kanterne af kromosomer, der bærer NBS-LRR-genklyngen, inklusive TIR-NBS-LRRs99.Den genomomfattende SSR-undersøgelse bekræftede også sammenhængen mellem NBS-LRR-genet og anthracnoseresistens i den almindelige bønne.Det kanoniske R-gen blev også fundet i den genomiske region, der bærer det vigtigste anthracnose-resistenslocus i hvid lupin 101.
Vores arbejde viser, at en øjeblikkelig resistensreaktion, aktiveret på et tidligt stadie af planteinfektion (helst senest 12 hpi), effektivt beskytter smalbladet lupin mod anthracnose forårsaget af den patogene svamp Collelotrichum lupini.Ved hjælp af høj gennemløbssekventering demonstrerede vi differentielle ekspressionsprofiler af anthracnose-resistensgener i NLL-planter medieret af Lanr1- og AnMan-resistensgenerne.Succesfuldt forsvar involverer omhyggeligt design af generne for proteiner involveret i redox, fotosyntese og patogenese inden for få timer efter plantens første kontakt med et patogen.Lignende beskyttende reaktioner, men forsinket i tid, er meget mindre effektive til at beskytte planter mod sygdomme.Miltbrandresistens medieret af Lanr1-genet ligner den typiske hurtige respons af R-genet (effektor-udløst immunitet), mens AnMan-genet højst sandsynligt giver en horisontal respons (immunitet udløst af et mikrobe-associeret molekylært mønster), hvilket giver et moderat niveau af bæredygtighed.
De 215 NLL-linjer, der blev brugt til at screene for anthracnosemarkører, bestod af 74 kultivarer, 60 linjer opnået ved krydsning eller avl, 5 mutanter og 76 vilde eller originale kimplasmer.Linjerne kom fra 17 lande, hovedsageligt fra Polen (58), Spanien (47), Tyskland (27), Australien (26), Rusland (19), Hviderusland (7), Italien (5) og andre linjer.fra 10 lande.Sættet indeholder også reference-resistente linjer: 83A:476, Tanjil, Wonga, der bærer Lanr1-allelen, og Mandelup, der bærer AnMan-allelen.Linjerne blev hentet fra European Lupin Genetic Resource Database vedligeholdt af Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen (Supplerende Tabel S1).
Planterne blev dyrket under kontrollerede forhold (fotoperiode 16 timer, temperatur 25°C om dagen og 18°C ​​om natten).To biologiske replikater blev analyseret.DNA blev isoleret fra tre uger gamle blade under anvendelse af DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge protokollen.Kvaliteten og koncentrationen af ​​det isolerede DNA blev vurderet ved spektrofotometriske metoder (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).AnManM1-markøren, der markerer anthracnose-resistensgenet AnMan (afledt af cv. Mandelup) og markørerne Anseq3 og Anseq4, der flankerer genet Lanr1 (afledt fra cv. Tanjil), blev analyseret 11,26,28.Homozygoter for den resistente allel blev scoret som "1", følsomme - som "0", og heterozygoter - som 0,5.
Baseret på resultaterne af screening for markører AnManM1, AnSeq3 og AnSeq4 og tilgængeligheden af ​​frø til endelige opfølgningsforsøg, blev 50 NLL-linjer udvalgt til anthracnose-resistensfænotyping.Analysen blev udført i to eksemplarer i et computerstyret drivhus med en 14 timers fotoperiode med et temperaturområde på 22°C om dagen og 19°C om natten.Frø ridses (afskæring af frøskallen på modsatte side af embryoet med et skarpt blad) før såning for at forhindre frøhvile på grund af at frøskallen er for hård og for at sikre ensartet spiring.Planter blev dyrket i potter (11 × 11 × 21 cm) med steril jord (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warszawa, Polen).Podning blev udført med Colletotrichum lupini Col-08-stammen, dyrket i 1999 af stængler fra smalbladede lupinplanter dyrket på en mark i Verzhenitsa, Storpolen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ E 05″).Få et område.Isolaterne blev dyrket i SNA-medium ved 20°C under sort lys i 21 dage for at inducere sporulering.Fire uger efter såning, hvor planterne havde nået 4-6 bladstadiet, blev podet udført ved sprøjtning med en suspension af konidier i en koncentration på 0,5 x 106 konidier pr. ml.Efter podning blev planterne holdt i mørke i 24 timer ved en luftfugtighed på ca. 98% og en temperatur på 25°C for at lette spiringen af ​​konidier og infektionsprocessen.Planterne blev derefter dyrket under en 14-timers fotoperiode ved 22°C dag/19°C nat og 70% luftfugtighed.Sygdomsscoren blev lavet 22 dage efter podning og varierede fra 0 (immun) til 9 (meget modtagelig) afhængigt af tilstedeværelsen eller fraværet af nekrotiske læsioner på stængler og blade.Derudover blev planternes vægt efter scoring målt.Relationer mellem markørgenotyper og sygdomsfænotyper blev beregnet som punkt to-sekvens korrelationer (fravær af heterozygote markører i sættet af linjer til analyse af anthracnose resistens fænotypen).