Tak fordi du besøgte Nature.com.Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse.For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer).I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Der er behov for et pålideligt in vitro-system, der nøjagtigt kan gengive hjertets fysiologiske miljø til lægemiddeltestning.Den begrænsede tilgængelighed af humane hjertevævskultursystemer har ført til unøjagtige fortolkninger af hjertemedicinske virkninger.Her har vi udviklet en hjertevævskulturmodel (CTCM), der elektromekanisk stimulerer hjerteskiver og gennemgår fysiologisk stræk under de systoliske og diastoliske faser af hjertecyklussen.Efter 12 dages dyrkning forbedrede denne tilgang delvist levedygtigheden af ​​hjertesektioner, men bevarede ikke fuldt ud deres strukturelle integritet.Derfor fandt vi efter lille molekylescreening, at tilsætningen af ​​100 nM triiodothyronin (T3) og 1 μM dexamethason (Dex) til vores medium opretholdt mikrostrukturen af ​​sektionerne i 12 dage.I kombination med T3/Dex-behandling opretholdt CTCM-systemet transkriptionsprofiler, levedygtighed, metabolisk aktivitet og strukturel integritet på samme niveau som frisk hjertevæv i 12 dage.Derudover inducerer overdreven strækning af hjertevæv i kultur hypertrofisk hjertesignalering, hvilket giver bevis for CTCM's evne til at efterligne hypertrofiske tilstande induceret af hjertestrækning.Som konklusion kan CTCM modellere hjertets fysiologi og patofysiologi i kultur over lange perioder, hvilket muliggør pålidelig lægemiddelscreening.
Forud for klinisk forskning er der brug for pålidelige in vitro-systemer, der nøjagtigt kan reproducere det fysiologiske miljø i det menneskelige hjerte.Sådanne systemer bør efterligne ændret mekanisk stræk, hjertefrekvens og elektrofysiologiske egenskaber.Dyremodeller bruges almindeligvis som en screeningsplatform for hjertefysiologi med begrænset pålidelighed til at afspejle virkningerne af lægemidler i det menneskelige hjerte1,2.I sidste ende er Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) en model, der er meget følsom og specifik for forskellige terapeutiske og farmakologiske indgreb, som nøjagtigt gengiver det menneskelige hjertes fysiologi og patofysiologi3.Fraværet af et sådant system begrænser opdagelsen af ​​nye behandlinger for hjertesvigt4,5 og har ført til lægemiddelkardiotoksicitet som en væsentlig årsag til at forlade markedet6.
I løbet af det seneste årti er otte ikke-kardiovaskulære lægemidler blevet trukket tilbage fra klinisk brug, fordi de forårsager forlængelse af QT-intervallet, hvilket fører til ventrikulære arytmier og pludselig død7.Der er således et stigende behov for pålidelige prækliniske screeningsstrategier til at vurdere kardiovaskulær effekt og toksicitet.Den nylige brug af human-inducerede pluripotente stamcelle-afledte cardiomyocytter (hiPS-CM) i lægemiddelscreening og toksicitetstest giver en delvis løsning på dette problem.Imidlertid er den umodne natur af hiPS-CM'er og manglen på multicellulær kompleksitet af hjertevæv store begrænsninger af denne metode.Nylige undersøgelser har vist, at denne begrænsning delvist kan overvindes ved at bruge tidlig hiPS-CM til at danne hjertevævshydrogeler kort efter starten af ​​spontane sammentrækninger og gradvist øge elektrisk stimulering over tid.Imidlertid mangler disse hiPS-CM mikrovæv de modne elektrofysiologiske og kontraktile egenskaber af det voksne myokardium.Derudover har humant hjertevæv en mere kompleks struktur, der består af en heterogen blanding af forskellige celletyper, herunder endotelceller, neuroner og stromale fibroblaster, forbundet med specifikke sæt ekstracellulære matrixproteiner.Denne heterogenitet af ikke-kardiomyocytpopulationer11,12,13 i det voksne pattedyrs hjerte er en væsentlig barriere for modellering af hjertevæv ved hjælp af individuelle celletyper.Disse store begrænsninger understreger vigtigheden af ​​at udvikle metoder til dyrkning af intakt myokardievæv under fysiologiske og patologiske forhold.
Dyrkede tynde (300 µm) sektioner af det menneskelige hjerte har vist sig at være en lovende model af intakt humant myokardium.Denne metode giver adgang til et komplet 3D multicellulært system, der ligner menneskeligt hjertevæv.Indtil 2019 var brugen af ​​dyrkede hjertesektioner dog begrænset af den korte (24 timer) kulturoverlevelse.Dette skyldes en række faktorer, herunder manglen på fysisk-mekanisk stræk, luft-væske-grænsefladen og brugen af ​​simple medier, der ikke understøtter hjertevævets behov.I 2019 påviste flere forskergrupper, at inkorporering af mekaniske faktorer i hjertevævskultursystemer kan forlænge kulturliv, forbedre hjerteekspression og efterligne hjertepatologi.To elegante undersøgelser 17 og 18 viser, at enakset mekanisk belastning har en positiv effekt på hjertefænotypen under dyrkning.Disse undersøgelser brugte imidlertid ikke den dynamiske tredimensionelle fysisk-mekaniske belastning af hjertecyklussen, da hjertesektioner blev belastet med enten isometriske trækkræfter 17 eller lineær auxotonisk belastning 18 .Disse metoder til vævsstrækning resulterede i undertrykkelse af mange hjertegener eller overekspression af gener forbundet med unormale strækresponser.Især Pitoulis et al.19 udviklet et dynamisk hjerteskivekulturbad til genopbygning af hjertecyklus ved hjælp af krafttransducerfeedback og spændingsdrev.Selvom dette system giver mulighed for mere nøjagtig in vitro hjertecyklusmodellering, begrænser metodens kompleksitet og lave gennemstrømning anvendelsen af ​​dette system.Vores laboratorium har for nylig udviklet et forenklet dyrkningssystem ved hjælp af elektrisk stimulering og et optimeret medium til at opretholde levedygtigheden af ​​sektioner af svine- og humant hjertevæv i op til 6 dage20,21.
I det nuværende manuskript beskriver vi en hjertevævskulturmodel (CTCM) ved hjælp af sektioner af svinehjertet, der inkorporerer humorale signaler til at rekapitulere tredimensionel hjertefysiologi og patofysiologisk udspilning under hjertecyklussen.Denne CTCM kan øge nøjagtigheden af ​​præklinisk lægemiddelforudsigelse til et niveau, der aldrig før er opnået, ved at levere et omkostningseffektivt hjertesystem med midt-gennemstrømning, der efterligner pattedyrs hjertes fysiologi/patofysiologi til præklinisk lægemiddeltestning.
Hæmodynamiske mekaniske signaler spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af ​​kardiomyocytfunktionen in vitro 22,23,24.I det nuværende manuskript har vi udviklet en CTCM (Figur 1a), der kan efterligne det voksne hjertemiljø ved at inducere både elektrisk og mekanisk stimulering ved fysiologiske frekvenser (1,2 Hz, 72 slag i minuttet).For at undgå overdreven vævsstrækning under diastole blev en 3D-printenhed brugt til at øge vævsstørrelsen med 25 % (fig. 1b).Elektrisk pacing induceret af C-PACE-systemet blev timet til at starte 100 ms før systole ved hjælp af et dataopsamlingssystem til fuldt ud at reproducere hjertecyklussen.Vævskultursystemet bruger en programmerbar pneumatisk aktuator (LB Engineering, Tyskland) til cyklisk at udvide en fleksibel silikonemembran for at forårsage ekspansion af hjerteskiverne i det øvre kammer.Systemet var forbundet til en ekstern luftledning gennem en tryktransducer, som gjorde det muligt nøjagtigt at justere trykket (± 1 mmHg) og tiden (± 1 ms) (fig. 1c).
a Fastgør vævssektionen til 7 mm-støtteringen, vist i blåt, inde i enhedens dyrkningskammer.Kulturkammeret er adskilt fra luftkammeret med en tynd fleksibel silikonemembran.Placer en pakning mellem hvert kammer for at forhindre lækager.Enhedens låg indeholder grafitelektroder, der giver elektrisk stimulering.b Skematisk repræsentation af storvævsanordningen, styreringen og støtteringen.Vævssnittene (brune) placeres på den overdimensionerede enhed med styreringen placeret i rillen på yderkanten af ​​enheden.Brug guiden til forsigtigt at placere støtteringen belagt med vævsakrylklæbemiddel over sektionen af ​​hjertevæv.c Graf, der viser tidspunktet for elektrisk stimulation som en funktion af luftkammertrykket styret af en programmerbar pneumatisk aktuator (PPD).En dataindsamlingsanordning blev brugt til at synkronisere elektrisk stimulering ved hjælp af tryksensorer.Når trykket i dyrkningskammeret når den indstillede tærskel, sendes et pulssignal til C-PACE-EM for at udløse elektrisk stimulation.d Billede af fire CTCM'er placeret på en inkubatorhylde.Fire enheder er forbundet til én PPD via et pneumatisk kredsløb, og tryksensorer er indsat i den hæmostatiske ventil for at overvåge trykket i det pneumatiske kredsløb.Hver enhed indeholder seks vævssektioner.
Ved at bruge en enkelt pneumatisk aktuator var vi i stand til at styre 4 CTCM-enheder, som hver kunne indeholde 6 vævssnit (fig. 1d).I CTCM omdannes lufttrykket i luftkammeret til synkront tryk i væskekammeret og inducerer fysiologisk udvidelse af hjerteskiven (figur 2a og supplerende film 1).Evaluering af vævsstrækning ved 80 mm Hg.Kunst.viste strækning af vævssnit med 25 % (fig. 2b).Denne procentvise strækning har vist sig at svare til en fysiologisk sarkomerlængde på 2,2-2,3 µm for normal hjertesektionskontraktilitet17,19,25.Vævsbevægelse blev vurderet ved hjælp af brugerdefinerede kameraindstillinger (Supplerende figur 1).Amplituden og hastigheden af ​​vævsbevægelsen (fig. 2c, d) svarede til stræk under hjertecyklussen og tid under systole og diastole (fig. 2b).Stræk og hastighed af hjertevæv under kontraktion og afslapning forblev konstant i 12 dage i kultur (fig. 2f).For at evaluere effekten af ​​elektrisk stimulation på kontraktilitet under dyrkning udviklede vi en metode til bestemmelse af aktiv deformitet ved hjælp af en skyggealgoritme (Supplerende Fig. 2a,b) og var i stand til at skelne mellem deformiteter med og uden elektrisk stimulation.Den samme del af hjertet (fig. 2f).I det bevægelige område af snittet (R6-9) var spændingen under elektrisk stimulation 20 % højere end i fravær af elektrisk stimulation, hvilket indikerer bidraget fra elektrisk stimulering til kontraktil funktion.
Repræsentative spor af luftkammertryk, væskekammertryk og vævsbevægelsesmålinger bekræfter, at kammertrykket ændrer væskekammertrykket, hvilket forårsager en tilsvarende bevægelse af vævsskiven.b Repræsentative spor af procent strækning (blå) af vævssnit svarende til procent strækning (orange).c Den målte bevægelse af hjerteskiven er i overensstemmelse med den målte bevægelseshastighed.(d) Repræsentative baner for cyklisk bevægelse (blå linje) og hastighed (orange stiplet linje) i et udsnit af hjertet.e Kvantificering af cyklustid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), sammentrækningstid (n = 19 skiver pr. gruppe), afspændingstid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), vævsbevægelse (n = 25 ).skiver)/gruppe fra forskellige grise), maksimal systolisk hastighed (n = 24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskellige grise) og maksimal afslapningshastighed (n=24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskellige grise).Two-tailed Student's t-test viste ingen signifikant forskel i nogen parameter.f Repræsentative stammeanalysespor af vævssnit med (rød) og uden (blå) elektrisk stimulering, ti regionale områder af vævssnit fra samme sektion.De nederste paneler viser kvantificeringen af ​​den procentvise forskel i belastning i vævssnit med og uden elektrisk stimulering i ti områder fra forskellige sektioner. (n = 8 skiver/gruppe fra forskellige grise, Two-tailed Student t-test udføres; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 skiver/gruppe fra forskellige grise, Two-tailed Student t-test udføres; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,5p<0,01,01,*). (n = 8 sektioner/gruppe fra forskellige grise, to-halede Students t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sektioner/gruppe, fra forskellige grise, to-halede Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.
I vores tidligere statiske biomimetiske hjerteskivekultursystem [20, 21] opretholdt vi levedygtigheden, funktionen og den strukturelle integritet af hjerteskiver i 6 dage ved at anvende elektrisk stimulering og optimere mediesammensætningen.Men efter 10 dage faldt disse tal markant.Vi vil henvise til sektioner dyrket i vores tidligere statiske biomimetiske kultursystem 20, 21 kontrolbetingelser (Ctrl), og vi vil bruge vores tidligere optimerede medium som MC-betingelser og kultur under samtidig mekanisk og elektrisk stimulering (CTCM).hedder .Først bestemte vi, at mekanisk stimulering uden elektrisk stimulation var utilstrækkelig til at opretholde vævslevedygtighed i 6 dage (Supplerende Fig. 3a,b).Interessant nok forblev levedygtigheden af ​​12-dages hjertesektioner den samme som i friske hjertesektioner under MS-betingelser, men ikke under Ctrl-betingelser, som vist ved MTT-analyse (fig. 1).3a).Dette tyder på, at mekanisk stimulering og simulering af hjertecyklussen kan holde vævssektioner levedygtige i dobbelt så lang tid som rapporteret i vores tidligere statiske dyrkningssystem.Vurdering af den strukturelle integritet af vævssnit ved immunmærkning af hjertetroponin T og connexin 43 viste imidlertid, at connexin 43-ekspression var signifikant højere i MC-væv på dag 12 end i kontroller på samme dag.Ensartet connexin 43-ekspression og Z-skive-dannelse blev imidlertid ikke fuldt ud opretholdt (fig. 3b).Vi bruger en kunstig intelligens (AI)-ramme til at kvantificere vævsstrukturel integritet26, en billedbaseret deep learning-pipeline baseret på troponin-T og connexin-farvning43 for automatisk at kvantificere den strukturelle integritet og fluorescens af hjerteskiver med hensyn til lokaliseringsstyrke.Denne metode bruger et Convolutional Neural Network (CNN) og en dyb læringsramme til pålideligt at kvantificere den strukturelle integritet af hjertevæv på en automatiseret og upartisk måde, som beskrevet i referencen.26. MC-væv viste forbedret strukturel lighed med dag 0 sammenlignet med statiske kontrolsektioner.Derudover afslørede Massons trichromfarvning en signifikant lavere procentdel af fibrose under MS-betingelser sammenlignet med kontrolbetingelser på dag 12 af dyrkning (fig. 3c).Mens CTCM øgede levedygtigheden af ​​hjertevævssektioner på dag 12 til et niveau svarende til det for frisk hjertevæv, forbedrede det ikke signifikant den strukturelle integritet af hjertesektionerne.
et søjlediagram viser kvantificering af MTT-levedygtigheden af ​​friske hjerteskiver (D0) eller hjerteskiverkulturer i 12 dage enten i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skiver, #0pVAs,#0 er udført på én måde ANO-svin,#0; 01 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). et søjlediagram viser kvantificering af MTT-levedygtigheden af ​​friske hjerteskiver (D0) eller hjerteskiverkultur i 12 dage, enten i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) udførelse af en vejs ANO-/#-gruppe, <0p-udsnit, #0p; 001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl).histogrammet viser kvantificeringen af ​​levedygtigheden af ​​MTT friske hjertesektioner (D0) eller dyrkning af hjertesektioner i 12 dage i enten statisk kultur (D12 kontrol) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol). ) ), 12 (D12 MC) sektioner/gruppe udført i en VA-testsektion ANO;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切牄切刅版(D2)天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测踎D 0；测踯；#0，测踎D#0#0. ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心不脏別片 片(D0 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**phistogram, der viser kvantificeringen af ​​MTT-levedygtighed i friske hjertesektioner (D0) eller hjertesektioner dyrket i 12 dage i statisk kultur (D12-kontrol) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrol)), 12 (D12 MC) sektioner/gruppe, envejs ANOVA'er;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 sammenlignet med D0, **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl).b Troponin-T (grøn), connexin 43 (rød) og DAPI (blå) i frisk isolerede hjertesektioner (D0) eller hjertesektioner dyrket under statiske betingelser (Ctrl) eller CTCM-betingelser (MC) i 12 dage) af repræsentative immunfluorescensbilleder (blank skala = 100 µm). Kunstig intelligens kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe hver fra forskellige gris, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og D1200 < 10. Kunstig intelligens kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe hver fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og D1000 < 10.Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 согов) (D12 согов) (D12 согов) (D12 согов) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 og ****p < 0,0001 по сравни). Kvantificering af den strukturelle integritet af hjertevæv ved kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/grupper fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; ####p < 0,0001 vs. med D0 og D****01 sammenlignet med D0 og D****01).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/grupper af hver af forskellige gris, envejs ANOI-test .#0VA 甸#0; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/grupper hver af de forskellige grise, envejs .#0#0VA test <0 ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D512 Ctrl) , 7 (D512 Ctrl) аждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравницения). Kunstig intelligens til at kvantificere den strukturelle integritet af hjertevæv (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/gruppe hver af forskellige grise, envejs ANOVA-test; ####p<0,0001 vs. .D0 til sammenligning med D****001).Ctrl. c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) for hjerteskiver farvet med Massons trichrome-farve (Skala blot = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe hver fra forskellige gris, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og 100p < D0 og 100 Ctrl). c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) for hjerteskiver farvet med Massons trichrome-farve (Skala blot = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe hver fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0,0001***p < D0 og D0,01***1). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных тримихром штаб без покрытия = 500 mkm) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностороюний p. p. D0 og ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) af hjertesektioner farvet med Massons trichrome-farve (ucoated skala = 500 µm) (n = 10 sektioner/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og D***p Ctrl sammenlignet med D0 og D0***p Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裼=15Ｚn切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，D0 相比，01 比，02 Ctrl <0.***p . C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸庰 帺壸庰度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 p.0##Anova 浵１ 0##D相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) og количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмный я шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью одногонфа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) af hjertesektioner farvet med Massons trichrome-farve (blank = 500 µm) (n = 10 sektioner/gruppe, hver fra en anden gris, testet ved envejsanalyse af varians ;### # p < 0,0001 sammenlignet med D0,10***p < D0, Ctrl***p < D0, Ctrl***).Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.
Vi antog, at ved at tilføje små molekyler til dyrkningsmediet kunne kardiomyocytintegriteten forbedres og fibroseudvikling reduceres under CTCM-dyrkning.Vi screenede derfor for små molekyler ved hjælp af vores statiske kontrolkulturer20,21 på grund af det lille antal forvirrende faktorer.Dexamethason (Dex), triiodothyronin (T3) og SB431542 (SB) blev valgt til denne skærm.Disse små molekyler er tidligere blevet brugt i hiPSC-CM kulturer til at inducere modning af kardiomyocytter ved at øge sarkomerlængde, T-tubuli og ledningshastighed.Derudover er både Dex (et glukokortikoid) og SB kendt for at undertrykke inflammation29,30.Derfor testede vi, om inklusion af en eller en kombination af disse små molekyler ville forbedre den strukturelle integritet af hjertesektioner.Til indledende screening blev dosis af hver forbindelse valgt baseret på de koncentrationer, der almindeligvis anvendes i cellekulturmodeller (1 μM Dex27, 100 nM T327 og 2,5 μM SB31).Efter 12 dages dyrkning resulterede kombinationen af ​​T3 og Dex i optimal kardiomyocytstrukturel integritet og minimal fibrøs remodellering (Supplerende figurer 4 og 5).Derudover frembragte anvendelse af dobbelt eller dobbelt disse koncentrationer af T3 og Dex skadelige virkninger sammenlignet med normale koncentrationer (Supplerende Fig. 6a,b).
Efter indledende screening udførte vi en head-to-head sammenligning af 4 dyrkningsbetingelser (figur 4a): Ctrl: hjertesektioner dyrket i vores tidligere beskrevne statiske kultur ved hjælp af vores optimerede medium;20.21 TD: T3 og Ctrl s Tilføjet Dex onsdag;MC: hjertesektioner dyrket i CTCM ved hjælp af vores tidligere optimerede medium;og MT: CTCM med T3 og Dex tilføjet til mediet.Efter 12 dages dyrkning forblev levedygtigheden af ​​MS- og MT-væv den samme som i friske væv vurderet ved MTT-assay (fig. 4b).Interessant nok resulterede tilføjelsen af ​​T3 og Dex til transwell-kulturer (TD) ikke i en signifikant forbedring af levedygtigheden sammenlignet med Ctrl-betingelser, hvilket indikerer en vigtig rolle for mekanisk stimulering i opretholdelsen af ​​levedygtigheden af ​​hjertesektioner.
et eksperimentelt designdiagram, der afbilder de fire dyrkningsbetingelser, der bruges til at evaluere virkningerne af mekanisk stimulering og T3/Dex-tilskud på medium i 12 dage. b Søjlediagram viser kvantificering af levedygtighed 12 dage efter dyrkning i alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) udskæringer ANO-svin,# er udført på en anden måde ANO-svin,#, # test. 001, ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). b Søjlediagram viser kvantificering af levedygtighed 12 dage efter dyrkning i alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) udskæringer ANO-svin,# er udført på en anden måde ANO-svin,#, # test. 001, ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. ования (контроль, TD, MC og MT) for сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 сров (D12) пуров (D12) т разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 og **p < 0,01 p < 0,01). b Søjlediagrammet viser kvantificeringen af ​​levedygtighed 12 dage efter dyrkning i alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) sektioner fra forskellige sektioner/# pig, # 0p, # 0; 001, ###p < 0,001 vs. D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). b. MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，，，，，，，，，#**#p < 0.0与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC og MT) по сравнению со свежезц (1) (1) D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), af разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; #с###p <0,#01p <0,#01p <0,#01p с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram, der viser alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), fra forskellige grise 12 (D12 MC) sektioner/gruppe, envejs ANOVAp1<.0#0#0, #0#0#0, #.0p#0, #.0## **p<0,01 vs. kontrol D12). c Søjlediagram viser kvantificeringen af ​​glukoseflux 12 dage efter dyrkning i alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ###p < 0,001, sammenlignet med 1,0.1***p < D0.1***p < D0 og D0,1***). c Søjlediagram viser kvantificeringen af ​​glukoseflux 12 dage efter dyrkning i alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ###p < 0,001, sammenlignet med 1,0.1***p < D0.1***p < D0 og D0,1***). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированис во 4висовис ания (контроль, TD, MC og MT) på сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разноных сердца, ся тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram viser kvantificering af glukoseflux 12 dage efter dyrkning under alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 6 snit/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og 1201 sammenlignet med D0 og ***p <Ctrl). c.通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与***D0 盌，与***D0 盌相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 条件 切 片 切 片 切 片 切养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， , ， ， 卌 ， ， 缌 AN测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивированив 4для культивированив рования (контроль, TD, MC og MT). роведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram, der viser kvantificering af glukoseflux 12 dage efter dyrkning for alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 6 sektioner/gruppe, fra forskellige grise, unilaterale. Blev der udført ANOVA-tests, ###p < 0,0,1 p < 0,0,1 p < 0,001 sammenlignet med D 0,1 p < 0,001 sammenlignet med D 0,001).d Stammeanalyseplot af friskt (blåt), dag 12 MC (grønt) og dag 12 MT (rødt) væv ved ti regionale vævssnitpunkter (n = 4 skiver/gruppe, envejs ANOVA-test; der var ingen signifikant forskel mellem grupperne).Vulkanplot, der viser differentielt udtrykte gener i friske hjertesektioner (D0) sammenlignet med hjertesektioner dyrket under statiske forhold (Ctrl) eller under MT-betingelser (MT) i 10-12 dage.f Heatmap over sarkomergener for hjertesektioner dyrket under hver af dyrkningsbetingelserne.Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.
Metabolisk afhængighed af skiftet fra fedtsyreoxidation til glykolyse er et kendetegn for kardiomyocytdedifferentiering.Umodne kardiomyocytter bruger primært glucose til ATP-produktion og har hypoplastiske mitokondrier med få cristae5,32.Glucoseudnyttelsesanalyser viste, at under MC- og MT-betingelser svarede glucoseudnyttelsen til den i dag 0-væv (figur 4c).Imidlertid viste Ctrl-prøver en signifikant stigning i glukoseudnyttelse sammenlignet med frisk væv.Dette indikerer, at kombinationen af ​​CTCM og T3/Dex forbedrer vævets levedygtighed og bevarer den metaboliske fænotype af 12-dages dyrkede hjertesektioner.Derudover viste stammeanalyse, at stammeniveauer forblev de samme som i frisk hjertevæv i 12 dage under MT- og MS-betingelser (fig. 4d).
For at analysere den overordnede indvirkning af CTCM og T3/Dex på det globale transkriptionelle landskab af hjerteskivevæv udførte vi RNAseq på hjerteskiver fra alle fire forskellige kulturbetingelser (Supplerende data 1).Interessant nok viste MT-sektioner høj transkriptionel lighed med frisk hjertevæv, med kun 16 differentielt udtrykt ud af 13.642 gener.Men som vi viste tidligere, viste Ctrl-skiver 1229 differentielt udtrykte gener efter 10-12 dage i kultur (fig. 4e).Disse data blev bekræftet af qRT-PCR af hjerte- og fibroblastgener (Supplerende Fig. 7a-c).Interessant nok viste Ctrl-sektionerne nedregulering af hjerte- og cellecyklusgener og aktivering af inflammatoriske genprogrammer.Disse data tyder på, at dedifferentiering, som normalt forekommer efter langvarig dyrkning, er fuldstændig svækket under MT-betingelser (Supplerende Fig. 8a,b).Omhyggelig undersøgelse af sarkomergener viste, at kun under MT-betingelser bevares generne, der koder for sarcomeren (fig. 4f) og ionkanalen (supplerende fig. 9), hvilket beskytter dem mod undertrykkelse under Ctrl-, TD- og MC-betingelser.Disse data viser, at med en kombination af mekanisk og humoral stimulering (T3/Dex), kan hjerteskive-transkriptomet forblive svarende til friske hjerteskiver efter 12 dage i kultur.
Disse transkriptionsfund understøttes af det faktum, at den strukturelle integritet af kardiomyocytter i hjertesektioner bedst bevares under MT-betingelser i 12 dage, som vist af intakt og lokaliseret connexin 43 (fig. 5a).Desuden var fibrose i hjertesektioner under MT-betingelser signifikant reduceret sammenlignet med Ctrl og i lighed med friske hjertesektioner (fig. 5b).Disse data viser, at kombinationen af ​​mekanisk stimulering og T3/Dex-behandling effektivt bevarer hjertestrukturen i hjertesektioner i kultur.
a Repræsentative immunfluorescensbilleder af troponin-T (grøn), connexin 43 (rød) og DAPI (blå) i friskisolerede hjertesektioner (D0) eller dyrket i 12 dage i alle fire hjertesektionskulturbetingelser (skalabjælke = 100 µm).). Kvantificering af kunstig intelligens af hjertevævets strukturelle integritet (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0.001 sammenlignet med D0.0001 sammenlignet med D0,0. 12 Ctrl). Kunstig intelligens kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; #### p < 0,00001 sammenlignet med D0,0,01 og *p < eller D0,0. 12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 Ctrl), D = 7 (D12, Ctrl) 2 MT) срезов/группу fra разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 p. внению с D12 Ctrl). Kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet ved hjælp af kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sektioner/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; #### p < 0,0001 p < 0,0001 sammenlignet med D01,00 og D****01 sammenlignet med D02,0 og D****0. Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 咼片忇䡌缌忄ﺛ衉缌忇ﺛ工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，渔****p < 0,0000 Ctrl对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 t12 d12 mc 廒智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 缌 0.0**** 1 Ctrl 0.0****相比).Kvantificering af den strukturelle integritet af hjertevæv ved hjælp af kunstig intelligens i forskellige grise (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sektioner/gruppe) med en envejs ANOVA-test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering for hjerteskiver farvet med Masson's trichrome-farve (Skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, test udføres en-vejs ANO.##, <1NO.##, sammenlignet med <1NO.##; p < 0,001 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering for hjerteskiver farvet med Masson's trichrome-farve (Skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, test udføres en-vejs ANO.##, <1NO.##, sammenlignet med <1NO.##; p < 0,001 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красналасная ( = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одни0##; 1 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering af hjertesektioner farvet med Masson's trichrome-farve (skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner/gruppe fra forskellige grise, udført envejs ANOVA <.***0pVA <.***0pVA, #***0pVA, #***0pVA, #***0pVA; 01 eller ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm！D（10n（10n和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分渔；渔；缛0#***#p000 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 μ（n = 0,0（n trl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差刼．#渞#0； 0#渞#0； ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Маснашения (маснашения = 5 массона) n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; ####p < 0,0 p < 0,0 *** 001 eller ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering af hjertesektioner farvet med Massons trichrom (skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner fra forskellige grise/gruppe, én ANOVA-metode; 0#.#0,01, ***0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 eller 1 p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl).Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.
Endelig blev CTCM's evne til at efterligne hjertehypertrofi vurderet ved at øge hjertevævsstrækningen.I CTCM steg det maksimale luftkammertryk fra 80 mmHg til 80 mmHg.Kunst.(normal stræk) op til 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Dette svarer til en stigning på 32 % i stræk (fig. 6b), som tidligere blev vist som den tilsvarende procentvise strækning, der kræves til hjertesektioner for at opnå en sarkomerlængde svarende til den, der ses ved hypertrofi.Stræk og hastighed af hjertevæv under kontraktion og afslapning forblev konstant i seks dages dyrkning (fig. 6c).Hjertevæv fra MT-tilstande blev udsat for normale stræk- (MT (Normal)) eller overstræk-tilstande (MT (OS)) i seks dage.Allerede efter fire dage i kultur var den hypertrofiske biomarkør NT-ProBNP signifikant forhøjet i mediet under MT (OS) betingelser sammenlignet med MT (normale) betingelser (fig. 7a).Derudover, efter seks dages dyrkning, steg cellestørrelsen i MT (OS) (fig. 7b) signifikant sammenlignet med sektioner af MT-hjerte (normal).Derudover var NFATC4 nuklear translokation signifikant øget i overstrakt væv (fig. 7c).Disse resultater viser den progressive udvikling af patologisk ombygning efter hyperdistension og understøtter konceptet om, at CTCM-enheden kan bruges som en platform til at studere stræk-induceret hjertehypertrofi-signalering.
Repræsentative spor af luftkammertryk, væskekammertryk og vævsbevægelsesmålinger bekræfter, at kammertrykket ændrer væskekammertrykket, hvilket forårsager en tilsvarende bevægelse af vævsskiven.b Repræsentative kurver for strækprocent og strækhastighed for normalt strakte (orange) og overstrakte (blå) vævssnit.c Søjlediagram, der viser cyklustid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), sammentrækningstid (n = 18-19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), afslapningstid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise) ), amplitude af vævsbevægelse (n = 14 skiver/gruppe, hastighed, fra forskellige stykker/gruppe, hastighed fra forskellige stykker/gruppe, 4 stykker/gruppe), forskellige grise) og maksimal afslapningshastighed (n = 14 (D0), 15 (D6) ) sektioner/grupper) fra forskellige grise), viste to-halede Student's t-test ingen signifikant forskel i nogen parameter, hvilket indikerer, at disse parametre forblev konstante under 6 dages dyrkning med overspænding.Fejlbjælker repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.
en Søjlediagram kvantificering af NT-ProBNP koncentration i dyrkningsmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normal stræk (Norm) eller overstrækning (OS) betingelser (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, < 0-vejs stræk sammenlignet med ANOpVA. en søjlegraf-kvantificering af NT-ProBNP-koncentration i dyrkningsmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normal stræk (Norm) eller overstrækning (OS) betingelser (n​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige A**pVAs <0-vejs stræk, sammenlignet med 0-vejs).Kvantitativt histogram af NT-ProBNP-koncentration i dyrkningsmedium fra hjerteskiver dyrket under betingelser med normal MT-strækning (norm) eller overstrækning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4).MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, to-faktor analyse af variance udføres;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 sammenlignet med normal stræk). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 文御罢庌 浢庌(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方与缛**析，p < 0,01）. a Kvantificering af NT-ProBNP koncentration i hjerteskiver dyrket under MT normal stræk (Norm) eller overstretch (OS) forhold (n​=4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) fra forskellige 猪暄切䉇幏双幏喑发弥动; **sammenlignet med normal strækning, p < 0,01).histogram Kvantificering af NT-ProBNP-koncentrationer i hjerteskiver dyrket under betingelser med normal MT-strækning (norm) eller overstrækning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, to-vejs variansanalyse;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 sammenlignet med normal stræk). b Repræsentative billeder for hjerteskiver farvet med troponin-T og WGA (venstre) og cellestørrelseskvantificering (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskellige skiver fra forskellige grise, Two-tailed Student t-test sammenlignes med normal 0; ****001 stræk). b Repræsentative billeder for hjerteskiver farvet med troponin-T og WGA (venstre) og cellestørrelseskvantificering (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskellige skiver fra forskellige grise, Two-tailed Student t-test er udført 0; ****001 stræk 0; ****001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) og количествениногос права) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- провохдит entа; ****p < 0,0001 for сравнению с нормальным растяжением). b Repræsentative billeder af hjertesektioner farvet med troponin-T og AZP (venstre) og cellestørrelseskvantificering (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskellige snit fra forskellige grise, to-halet Students t-test blev udført med normal t-test ****0p < 0; b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性 3（n 3 ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有鸎帎季生比,****p < 0,0001). b Repræsentative billeder af hjerteskiver farvet med calcarein-T og WGA (venstre) og cellestørrelse (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 fra 10 forskellige skiver (D6 MTNorm)) Celler/组，两方法有埾学组，两方法有埾学甛４part. 1). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная (крашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная (количественая (крашенных) n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) fra 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двустороСние критер,0,0p ****; сравнению с нормальным растяжением). b Repræsentative billeder af hjertesnit farvet med troponin-T og AZP (venstre) og kvantificering af cellestørrelse (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) fra 10 forskellige snit fra forskellige grise) Celler/gruppe, to-halet kriterium Elevens t;****p < 0,0001 sammenlignet med normal stamme). c Repræsentative billeder for dag 0 og dag 6 MTOS-hjerteskiver immunmærket for troponin-T og NFATC4 og kvantificering af translokationen af ​​NFATC4 til kernerne af CM'er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, To-halet Student 0; 5-p-test udføres. c Repræsentative billeder for dag 0 og dag 6 MTOS-hjerteskiver immunmærket for troponin-T og NFATC4 og kvantificering af translokationen af ​​NFATC4 til kernerne af CM'er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise , To-halet Student .0p- test er udført. 0p-). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 og 6 дней MTOS, иммуномеченых тропонина-Т и NFATC4, og косванич ции NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выдуполняется та; *p < 0,05). c Repræsentative billeder for hjertesektioner ved 0 og 6 dages MTOS, immunmærket for troponin-T og NFATC4, og kvantificering af NFATC4-translokation i kernen af ​​kavernøse celler (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise) udførte to-halede Student's;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性；媌的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学锟「t 0；0)「t . c Repræsentative billeder af calcanin-T- og NFATC4-immunmærkning 第0天和第6天MTOS-hjerteskiver og NFATC4 fra forskellige NFATC4-易位至CM-cellekerner-mængde化 (n = 4 (D0), 缶 缇, 缇, 缇, 缌 , 刻 , 缌 , 刻 , 缌 , 刻 , 缌尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS på 0 og 6 день for иммуномаркировки тропониностином-Т и NFATC4 коцичи ции NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий срез/группа, два- хвостатый t-критерий t-критерий Стьююd * Стьюю 5). c Repræsentative billeder af MTOS hjerteskiver på dag 0 og 6 for troponin-T og NFATC4 immunmærkning og kvantificering af NFATC4 translokation i kernen af ​​CM fra forskellige grise (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe, to-halede t - kriterium. * Student <'t -s;5p).Fejlbjælker repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse.
Translationel kardiovaskulær forskning kræver cellulære modeller, der nøjagtigt gengiver hjertemiljøet.I denne undersøgelse blev der udviklet og karakteriseret et CTCM-apparat, der kan stimulere ultratynde dele af hjertet.CTCM-systemet inkluderer fysiologisk synkroniseret elektromekanisk stimulering og T3- og Dex-væskeberigelse.Når svinehjertesektioner blev udsat for disse faktorer, forblev deres levedygtighed, strukturelle integritet, metaboliske aktivitet og transskriptionelle ekspression den samme som i frisk hjertevæv efter 12 dages dyrkning.Derudover kan overdreven strækning af hjertevæv forårsage hypertrofi af hjertet forårsaget af hyperekstension.Samlet set understøtter disse resultater den kritiske rolle af fysiologiske dyrkningsbetingelser i opretholdelsen af ​​en normal hjertefænotype og giver en platform for lægemiddelscreening.
Mange faktorer bidrager til at skabe et optimalt miljø for kardiomyocytters funktion og overlevelse.De mest åbenlyse af disse faktorer er relateret til (1) intercellulære interaktioner, (2) elektromekanisk stimulering, (3) humorale faktorer og (4) metaboliske substrater.Fysiologiske celle-til-celle-interaktioner kræver komplekse tredimensionelle netværk af flere celletyper understøttet af en ekstracellulær matrix.Sådanne komplekse cellulære interaktioner er vanskelige at rekonstruere in vitro ved co-kultur af individuelle celletyper, men kan let opnås ved hjælp af den organotypiske natur af hjertesektioner.
Mekanisk stræk og elektrisk stimulering af kardiomyocytter er afgørende for at opretholde hjertefænotype33,34,35.Mens mekanisk stimulering er blevet brugt i vid udstrækning til hiPSC-CM-konditionering og modning, har flere elegante undersøgelser for nylig forsøgt mekanisk stimulering af hjerteskiver i kultur ved hjælp af enakset belastning.Disse undersøgelser viser, at 2D enakset mekanisk belastning har en positiv effekt på hjertets fænotype under dyrkning.I disse undersøgelser blev sektioner af hjertet enten belastet med isometriske trækkræfter17, lineær auxotonisk belastning18, eller hjertecyklussen blev genskabt ved hjælp af krafttransducerfeedback og spændingsdrev.Disse metoder anvender imidlertid enakset vævsstrækning uden miljøoptimering, hvilket resulterer i undertrykkelse af mange hjertegener eller overekspression af gener forbundet med unormale strækresponser.CTCM beskrevet her giver en 3D elektromekanisk stimulus, der efterligner den naturlige hjertecyklus med hensyn til cyklustid og fysiologisk stræk (25 % stræk, 40 % systole, 60 % diastole og 72 slag i minuttet).Selvom denne tredimensionelle mekaniske stimulering alene ikke er tilstrækkelig til at opretholde vævsintegritet, er en kombination af humoral og mekanisk stimulering ved hjælp af T3/Dex påkrævet for at opretholde vævets levedygtighed, funktion og integritet tilstrækkeligt.
Humorale faktorer spiller en vigtig rolle i at modulere den voksne hjertefænotype.Dette blev fremhævet i HiPS-CM undersøgelser, hvor T3 og Dex blev tilsat til dyrkningsmedier for at accelerere cellemodning.T3 kan påvirke transporten af ​​aminosyrer, sukkerarter og calcium gennem cellemembraner36.Derudover fremmer T3 MHC-α-ekspression og MHC-β-nedregulering, hvilket fremmer dannelsen af ​​hurtige twitch-myofibriller i modne kardiomyocytter sammenlignet med langsom twitch-myofibriller i føtal CM.T3-mangel hos hypothyreoideapatienter resulterer i tab af myofibrillære bånd og en reduceret hastighed af tonusudvikling37.Dex virker på glukokortikoidreceptorer og har vist sig at øge myokardiekontraktiliteten i isolerede perfunderede hjerter;38 denne forbedring menes at være relateret til effekten på calciumaflejringsdrevet entry (SOCE) 39,40.Derudover binder Dex til dets receptorer, hvilket forårsager en bred intracellulær respons, der undertrykker immunfunktion og inflammation30.
Vores resultater indikerer, at fysisk mekanisk stimulation (MS) forbedrede den samlede kulturpræstation sammenlignet med Ctrl, men mislykkedes i at opretholde levedygtighed, strukturel integritet og hjerteekspression over 12 dage i kultur.Sammenlignet med Ctrl forbedrede tilføjelse af T3 og Dex til CTCM (MT) kulturer levedygtigheden og opretholdt lignende transkriptionsprofiler, strukturel integritet og metabolisk aktivitet med frisk hjertevæv i 12 dage.Ved at kontrollere graden af ​​vævsstrækning blev der desuden skabt en hyperekstension-induceret hjertehypertrofimodel ved brug af STCM, hvilket illustrerer STCM-systemets alsidighed.Det skal bemærkes, at selvom hjerteombygning og fibrose sædvanligvis involverer intakte organer, hvis cirkulerende celler kan give de passende cytokiner såvel som fagocytose og andre omdannelsesfaktorer, kan dele af hjertet stadig efterligne den fibrotiske proces som reaktion på stress og traumer.ind i myofibroblaster.Dette er tidligere blevet evalueret i denne hjerteskivemodel.Det skal bemærkes, at CTCM-parametre kan moduleres ved at ændre tryk/elektrisk amplitude og frekvens for at simulere mange tilstande såsom takykardi, bradykardi og mekanisk cirkulationsstøtte (mekanisk ubelastet hjerte).Dette gør systemet til et medium gennemløb til narkotikatestning.CTCM's evne til at modellere overanstrengelsesinduceret hjertehypertrofi baner vejen for at teste dette system til personlig terapi.Som konklusion viser den foreliggende undersøgelse, at mekanisk stræk og humoral stimulering er afgørende for at opretholde kulturen af ​​hjertevævssektioner.
Selvom de her præsenterede data tyder på, at CTCM er en meget lovende platform til modellering af intakt myokardium, har denne kulturmetode nogle begrænsninger.Den største begrænsning af CTCM-kultur er, at den pålægger skiverne kontinuerlige dynamiske mekaniske belastninger, hvilket udelukker evnen til aktivt at overvåge hjerteskivekontraktioner under hver cyklus.Desuden er muligheden for at evaluere systolisk funktion uden for dyrkningssystemer ved hjælp af traditionelle kraftsensorer begrænset på grund af den lille størrelse af hjertesektioner (7 mm).I det nuværende manuskript overvinder vi delvist denne begrænsning ved at evaluere optisk spænding som en indikator for kontraktil funktion.Denne begrænsning vil dog kræve yderligere arbejde og kan løses i fremtiden ved at introducere metoder til optisk overvågning af funktionen af ​​hjerteskiver i kultur, såsom optisk kortlægning ved hjælp af calcium og spændingsfølsomme farvestoffer.En anden begrænsning ved CTCM er, at arbejdsmodellen ikke manipulerer fysiologisk stress (preload og afterload).I CTCM blev tryk induceret i modsatte retninger for at reproducere 25% fysiologisk stræk i diastole (fuld stræk) og systole (længde af kontraktion under elektrisk stimulation) i meget store væv.Denne begrænsning bør fjernes i fremtidige CTCM-designs ved passende tryk på hjertevævet fra begge sider og ved at anvende de nøjagtige tryk-volumenforhold, der forekommer i hjertekamrene.
Den overstræk-inducerede ombygning rapporteret i dette manuskript er begrænset til at efterligne hypertrofiske hyperstretch-signaler.Således kan denne model hjælpe i studiet af stræk-induceret hypertrofisk signalering uden behov for humorale eller neurale faktorer (som ikke eksisterer i dette system).Yderligere undersøgelser er nødvendige for at øge mangfoldigheden af ​​CTCM, for eksempel vil samdyrkning med immunceller, cirkulerende plasmahumorale faktorer og innervation ved samdyrkning med neuronale celler forbedre mulighederne for sygdomsmodellering med CTCM.
Tretten grise blev brugt i denne undersøgelse.Alle dyreprocedurer blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og blev godkendt af University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee.Aortabuen blev fastspændt, og hjertet blev perfunderet med 1 L steril kardioplegi (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/ml heparin, pH op til 7,4); hjerterne blev konserveret i iskold kardioplegisk opløsning indtil transport til laboratoriet på is, som normalt er <10 min. hjerterne blev konserveret i iskold kardioplegisk opløsning indtil transport til laboratoriet på is, som normalt er <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. hjerter blev opbevaret i iskold kardioplegisk opløsning indtil transport til laboratoriet på is, hvilket normalt tager <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。送将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。送 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Hold hjerter på is kardioplegi indtil transport til laboratoriet på is, normalt <10 min.
CTCM-enheden blev udviklet i SolidWorks computer-aided design (CAD) software.Kulturkamrene, skillevæggene og luftkamrene er lavet af CNC klar akrylplast.Back-up-ringen med en diameter på 7 mm er lavet af polyethylen med høj densitet (HDPE) i midten og har en O-ringsrille til at rumme den silikone O-ring, der bruges til at forsegle mediet nedenunder.En tynd silicamembran adskiller dyrkningskammeret fra separationspladen.Silikonemembranen er laserskåret af 0,02" tyk silikoneplade og har en hårdhed på 35A.De nederste og øverste silikonepakninger er laserskåret af 1/16" tyk silikoneplade og har en hårdhed på 50A.316L rustfri stålskruer og vingemøtrikker bruges til at fastgøre blokken og skabe en lufttæt forsegling.
Et dedikeret printkort (PCB) er designet til at blive integreret med C-PACE-EM-systemet.De schweiziske maskinstik på printet er forbundet med grafitelektroder med sølvbelagte kobbertråde og bronze 0-60 skruer skruet ind i elektroderne.Printpladen placeres i dækslet på 3D-printeren.
CTCM-enheden styres af en programmerbar pneumatisk aktuator (PPD), der skaber et kontrolleret cirkulationstryk svarende til en hjertecyklus.Når trykket inde i luftkammeret stiger, udvider den fleksible silikonemembran sig opad, hvilket tvinger mediet under vævsstedet.Vævsområdet vil derefter blive strakt ved denne udstødning af væske, hvilket efterligner den fysiologiske udvidelse af hjertet under diastole.På toppen af ​​afslapning blev elektrisk stimulation påført gennem grafitelektroder, hvilket reducerede trykket i luftkammeret og forårsagede sammentrækning af vævssnit.Inde i røret er en hæmostatisk ventil med en tryksensor til at registrere trykket i luftsystemet.Trykket, der registreres af tryksensoren, påføres en dataopsamler, der er tilsluttet den bærbare computer.Dette muliggør kontinuerlig overvågning af trykket inde i gaskammeret.Da det maksimale kammertryk var nået (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), blev dataindsamlingsenheden beordret til at sende et signal til C-PACE-EM-systemet for at generere et bifasisk spændingssignal i 2 ms, indstillet til 4 V.
Hjertesektioner blev opnået, og dyrkningsbetingelser i 6 brønde blev udført som følger: Overfør de høstede hjerter fra overføringsbeholderen til en bakke indeholdende kold (4°C) kardioplegi.Den venstre ventrikel blev isoleret med et sterilt blad og skåret i stykker på 1-2 cm3.Disse vævsblokke blev fastgjort til vævsunderstøtninger med vævsklæbemiddel og anbragt i et vibrerende mikrotomvævsbad indeholdende Tyrodes opløsning og kontinuerligt iltet (3 g/L 2,3-butandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 mM), (0,447 mM g), (10 mM lucose, D1000 g), (1,0 mM lucose, D1,0 g) 0,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M opløsning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M opløsning), op til 1 L ddH2O).Den vibrerende mikrotom blev indstillet til at skære 300 µm tykke skiver ved en frekvens på 80 Hz, en horisontal vibrationsamplitude på 2 mm og en fremføringshastighed på 0,03 mm/s.Vævsbadet blev omgivet af is for at holde opløsningen kølig, og temperaturen blev holdt ved 4°C.Overfør vævssektioner fra mikrotombadet til et inkubationsbad indeholdende kontinuerligt oxygeneret Tyrode-opløsning på is, indtil der er opnået nok sektioner til én dyrkningsplade.Til transwell-kulturer blev vævssnit fastgjort til sterile 6 mm brede polyurethanunderstøtninger og anbragt i 6 ml optimeret medium (199 medium, 1x ITS-supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisk og 2X antibiotikum-antisvamp).Elektrisk stimulation (10 V, frekvens 1,2 Hz) blev påført vævssektionerne gennem C-Pace.For TD-betingelser blev frisk T3 og Dex tilsat ved 100 nM og 1 μM ved hvert mediumskift.Mediet er mættet med ilt før udskiftning 3 gange om dagen.Vævssnit blev dyrket i en inkubator ved 37°C og 5% CO2.
Til CTCM-kulturer blev vævssnit placeret på en specialfremstillet 3D-printer i en petriskål indeholdende modificeret Tyrodes opløsning.Enheden er designet til at øge størrelsen af ​​hjertets skive med 25% af støtteringens areal.Dette gøres for at hjertets sektioner ikke strækker sig efter at være blevet overført fra Tyrodes opløsning til mediet og under diastolen.Ved anvendelse af histoakryllim blev 300 µm tykke sektioner fikseret på en støttering med en diameter på 7 mm.Efter fastgørelse af vævssektionerne til støtteringen, skær de overskydende vævssektioner af og placer de vedhæftede vævssektioner tilbage i badet med Tyrode-opløsning på is (4°C), indtil der er forberedt nok sektioner til én enhed.Den samlede behandlingstid for alle enheder bør ikke overstige 2 timer.Efter at 6 vævssektioner var blevet fastgjort til deres støtteringe, blev CTCM-anordningen samlet.CTCM-kulturkammeret er forfyldt med 21 ml præ-oxygeneret medium.Overfør vævssektionerne til dyrkningskammeret og fjern forsigtigt eventuelle luftbobler med en pipette.Vævssektionen føres derefter ind i hullet og presses forsigtigt på plads.Sæt til sidst elektrodehætten på enheden og overfør enheden til inkubatoren.Tilslut derefter CTCM til luftslangen og C-PACE-EM-systemet.Den pneumatiske aktuator åbner, og luftventilen åbner CTCM.C-PACE-EM-systemet blev konfigureret til at levere 4 V ved 1,2 Hz under bifasisk pacing i 2 ms.Mediet blev skiftet to gange om dagen, og elektroderne blev skiftet en gang om dagen for at undgå ophobning af grafit på elektroderne.Om nødvendigt kan vævssektioner fjernes fra deres kulturbrønde for at udstøde eventuelle luftbobler, der måtte være faldet under dem.Til MT-behandlingsbetingelser blev T3/Dex tilsat frisk med hvert mediumskift med 100 nM T3 og 1 μM Dex.CTCM-anordningerne blev dyrket i en inkubator ved 37°C og 5% CO2.
For at opnå strakte baner af hjerteskiver blev der udviklet et særligt kamerasystem.Et spejlreflekskamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) blev brugt med et Navitar Zoom 7000 18-108 mm makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA).Visualisering blev udført ved stuetemperatur efter at have erstattet mediet med frisk medium.Kameraet er placeret i en vinkel på 51°, og video optages med 30 billeder i sekundet.Først blev open source-software (MUSCLEMOTION43) brugt med Image-J til at kvantificere bevægelsen af ​​hjerteskiver.Masken blev skabt ved hjælp af MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) for at definere områder af interesse for bankende hjerteskiver for at undgå støj.Manuelt segmenterede masker påføres alle billeder i en rammesekvens og sendes derefter til MUSCLEMOTION plug-in'et.Muscle Motion bruger den gennemsnitlige intensitet af pixels i hver frame til at kvantificere dens bevægelse i forhold til referencerammen.Data blev registreret, filtreret og brugt til at kvantificere cyklustiden og vurdere vævsstrækningen under hjertecyklussen.Den optagede video blev efterbehandlet ved hjælp af et første-ordens nulfase digitalt filter.For at kvantificere vævsstrækning (peak-to-peak) blev top-to-peak-analyse udført for at skelne mellem toppe og lavpunkter i det registrerede signal.Derudover udføres detrend ved hjælp af et 6. ordens polynomium for at eliminere signaldrift.Programkode blev udviklet i MATLAB til at bestemme global vævsbevægelse, cyklustid, afspændingstid og kontraktionstid (Supplerende programkode 44).
Til belastningsanalyse, ved hjælp af de samme videoer oprettet til mekanisk strækvurdering, sporede vi først to billeder, der repræsenterede bevægelsestoppe (de højeste (øverste) og laveste (nederste) bevægelsespunkter) ifølge MUSCLEMOTION-softwaren.Vi segmenterede derefter vævsområderne og anvendte en form for skyggealgoritme til det segmenterede væv (Supplerende Fig. 2a).Det segmenterede væv blev derefter opdelt i ti underflader, og spændingen på hver overflade blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, hvor Sup og Sdown er afstandene af formen fra henholdsvis stoffets top- og bundskygger (Supplerende Fig. .2b).
Hjertesnit blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 48 timer.Fixerede væv blev dehydreret i 10% og 20% ​​saccharose i 1 time, derefter i 30% saccharose natten over.Sektionerne blev derefter indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT-forbindelse) og gradvist frosset i et isopentan/tørisbad.Opbevar OCT-indlejringsblokke ved -80 °C indtil adskillelse.Objektglassene blev forberedt som sektioner med en tykkelse på 8 μm.
For at fjerne OCT fra hjertesektioner skal du opvarme objektglassene på en varmeblok ved 95 °C i 5 min.Tilsæt 1 ml PBS til hvert objektglas og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, gennemtrænge derefter sektionerne ved at indstille 0,1 % Triton-X i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.For at forhindre uspecifikke antistoffer i at binde til prøven, tilsæt 1 ml 3 % BSA-opløsning til objektglassene og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.BSA'en blev derefter fjernet, og objektglassene blev vasket med PBS.Marker hver prøve med en blyant.Primære antistoffer (fortyndet 1:200 i 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) og troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) blev tilsat i løbet af 90 minutter, derefter fortyndet i 1% af influenza: BSA 1 mo. eller 488 (Thermo Scientific; #A16079), mod kanin Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) i yderligere 90 minutter. Vasket 3 gange med PBS For at skelne målfarvning fra baggrund brugte vi kun det sekundære antistof som kontrol. Til sidst blev DAPI tilsat i en nuklear shield og v stabored. med neglelak -x forstørrelse) og Keyence mikroskop med 40x forstørrelse.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ved 5 μg/ml i PBS blev brugt til WGA-farvning og påført faste sektioner i 30 minutter ved stuetemperatur.Objektglassene blev derefter vasket med PBS, og Sudan black blev tilsat til hvert objektglas og inkuberet i 30 minutter.Objektglassene blev derefter vasket med PBS, og vectashield-indlejringsmedium blev tilsat.Objektglassene blev visualiseret på et Keyence-mikroskop ved 40x forstørrelse.
OCT blev fjernet fra prøverne som beskrevet ovenfor.Efter fjernelse af OCT, nedsænk objektglassene i Bouins opløsning natten over.Objektglassene blev derefter skyllet med destilleret vand i 1 time og derefter anbragt i en Bibrich-aloe-syrefuchsin-opløsning i 10 minutter.Derefter blev objektglassene vasket med destilleret vand og anbragt i en opløsning af 5 % phosphomolybdæn/5 % phosphowolframsyre i 10 minutter.Overfør objektglassene direkte i den anilinblå opløsning i 15 minutter uden at skylle dem.Derefter blev objektglassene vasket med destilleret vand og anbragt i en 1 % eddikesyreopløsning i 2 minutter.Objektglassene blev tørret i 200 N ethanol og overført til xylen.Farvede objektglas blev visualiseret ved hjælp af et Keyence-mikroskop med et 10x objektiv.Fibrosearealprocenten blev kvantificeret ved hjælp af Keyence Analyzer-software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalognummer V13154, i henhold til producentens protokol med nogle modifikationer.Især blev et kirurgisk stempel med en diameter på 6 mm brugt til at sikre ensartet vævsstørrelse under MTT-analyse.Væv blev individuelt udpladet i brøndene på en 12-brønds plade indeholdende MTT-substrat ifølge producentens protokol.Sektionerne inkuberes ved 37°C i 3 timer, og det levende væv metaboliserer MTT-substratet til dannelse af en lilla formazanforbindelse.Udskift MTT-opløsningen med 1 ml DMSO og inkuber ved 37 °C i 15 minutter for at ekstrahere lilla formazan fra hjertesektioner.Prøver blev fortyndet 1:10 i DMSO i 96-brønds klare bundplader og lilla farveintensitet målt ved 570 nm under anvendelse af en Cytation-pladelæser (BioTek).Aflæsninger blev normaliseret til vægten af ​​hver skive af hjertet.
Hjerteskivemedier blev erstattet med medier indeholdende 1 μCi/ml [5-3H]-glukose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) til glukoseudnyttelsesanalyse som tidligere beskrevet.Efter 4 timers inkubation tilsættes 100 µl medium til et åbent mikrocentrifugerør indeholdende 100 µl 0,2 N HCl.Derefter blev røret anbragt i et scintillationsrør indeholdende 500 μl dH2O for at fordampe [3H]2O i 72 timer ved 37°C.Fjern derefter mikrocentrifugerøret fra scintillationsrøret og tilsæt 10 ml scintillationsvæske.Scintillationstællinger blev udført under anvendelse af en Tri-Carb 2900TR væskescintillationsanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Glucoseudnyttelse blev derefter beregnet under hensyntagen til [5-3H]-glucosespecifik aktivitet, ufuldstændig ligevægt og baggrund, fortynding af [5-3H]-til umærket glucose og scintillationstællereffektivitet.Dataene er normaliseret til massen af ​​sektioner af hjertet.
Efter vævshomogenisering i Trizol blev RNA isoleret fra hjertesektioner ved hjælp af Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 i henhold til producentens protokol.RNAsec-bibliotekets forberedelse, sekventering og dataanalyse blev udført som følger:
1 μg RNA pr. prøve blev brugt som udgangsmateriale til fremstilling af RNA-biblioteket.Sekvenseringsbiblioteker blev genereret ved hjælp af NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) efter producentens anbefalinger, og indekskoder blev tilføjet til attributsekvenserne for hver prøve.Kort fortalt blev mRNA oprenset fra totalt RNA under anvendelse af magnetiske perler bundet med poly-T-oligonukleotider.Fragmentering udføres under anvendelse af divalente kationer ved høj temperatur i NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Første streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse af tilfældige hexamer primere og M-MuLV revers transkriptase (RNase H-).Den anden streng cDNA syntetiseres derefter under anvendelse af DNA-polymerase I og RNase H. De resterende udhæng omdannes til stumpe ender ved exonuklease/polymerase-aktivitet.Efter adenylering af 3'-enden af ​​DNA-fragmentet fastgøres en NEBNext Adapter med en hårnålesløjfestruktur til den for at forberede den til hybridisering.Til selektion af cDNA-fragmenter med foretrukken længde 150-200 bp.biblioteksfragmenter blev oprenset under anvendelse af AMPure XP-systemet (Beckman Coulter, Beverly, USA).Derefter blev 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) med størrelsesvalgt cDNA ligeret med en adapter brugt i 15 minutter ved 37°C og derefter i 5 minutter ved 95°C før PCR.PCR blev derefter udført under anvendelse af Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universelle PCR-primere og Index (X)-primere.Til sidst blev PCR-produkter oprenset (AMPure XP-system) og bibliotekskvalitet vurderet på et Agilent Bioanalyzer 2100-system.cDNA-biblioteket blev derefter sekventeret under anvendelse af en Novaseq-sekventeringsanordning.Rå billedfiler fra Illumina blev konverteret til rå læsninger ved hjælp af CASAVA Base Calling.Rådata gemmes i FASTQ(fq)-formatfiler, der indeholder læsesekvenser og tilsvarende basiskvaliteter.Vælg HISAT2 for at matche filtrerede sekventeringslæsninger til Sscrofa11.1-referencegenomet.Generelt understøtter HISAT2 genomer af enhver størrelse, inklusive genomer større end 4 milliarder baser, og standardværdier er indstillet for de fleste parametre.Splejsningslæsninger fra RNA Seq-data kan effektivt justeres ved hjælp af HISAT2, det hurtigste system, der er tilgængeligt i øjeblikket, med samme eller bedre nøjagtighed end nogen anden metode.
Overfloden af ​​transkripter afspejler direkte niveauet af genekspression.Genekspressionsniveauer vurderes ved den overflod af transkripter (sekventeringstal) forbundet med genomet eller exonerne.Antallet af aflæsninger er proportionalt med genekspressionsniveauer, genlængde og sekventeringsdybde.FPKM (fragmenter pr. tusinde basepar af transkript sekventeret pr. million basepar) blev beregnet, og P-værdier for differentiel ekspression blev bestemt ved hjælp af DESeq2-pakken.Vi beregnede derefter den falske opdagelsesrate (FDR) for hver P-værdi ved hjælp af Benjamini-Hochberg-metoden9 baseret på den indbyggede R-funktion "p.adjust".
RNA isoleret fra hjertesektioner blev omdannet til cDNA i en koncentration på 200 ng/μl under anvendelse af SuperScript IV Vilo Master mix fra Thermo (Thermo, kat. nr. 11756050).Kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse af en Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-brønds transparent reaktionsplade (Thermo, kat. nr. 4483319) og mikroamp optisk klæbemiddel (Thermo, kat. nr. 4311971).Reaktionsblandingen bestod af 5 µl Taqman Fast Advanced Master-blanding (Thermo, kat. nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer og 3,5 µl H2O blandet pr. brønd.Standard qPCR-cyklusser blev kørt, og CT-værdier blev målt ved hjælp af et Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR-instrument (384-brønds modul; produkt # A28135).Taqman primere blev købt fra Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss8906_01s), 8906_08m1 (Ss890608m1) mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) var gennormaliseret til husholdningsværdien af ​​GDHAP.
Mediefrigivelse af NT-ProBNP blev vurderet ved hjælp af NT-ProBNP-kittet (svin) (kat. nr. MBS2086979, MyBioSource) i henhold til producentens protokol.Kort fortalt blev 250 µl af hver prøve og standard tilsat i to eksemplarer til hver brønd.Umiddelbart efter tilsætning af prøven tilsættes 50 µl assayreagens A til hver brønd.Ryst forsigtigt pladen og forsegl med tætningsmiddel.Derefter blev tabletterne inkuberet ved 37°C i 1 time.Aspirer derefter opløsningen og vask brøndene 4 gange med 350 µl 1X vaskeopløsning, inkuber vaskeopløsningen i 1-2 minutter hver gang.Tilsæt derefter 100 µl assayreagens B pr. brønd og forsegl med pladeforseglingsmiddel.Tabletten blev forsigtigt rystet og inkuberet ved 37°C i 30 minutter.Aspirer opløsningen og vask brøndene 5 gange med 350 µl 1X vaskeopløsning.Tilsæt 90 µl substratopløsning til hver brønd og forsegl pladen.Inkuber pladen ved 37°C i 10-20 minutter.Tilsæt 50 µl stopopløsning til hver brønd.Pladen blev straks målt under anvendelse af en Cytation (BioTek) pladelæser indstillet til 450 nm.
Effektanalyser blev udført for at vælge de gruppestørrelser, som vil give >80 % effekt til at detektere en 10 % absolut ændring i parameteren med en 5 % Type I fejlrate. Effektanalyser blev udført for at vælge de gruppestørrelser, som vil give >80 % effekt til at detektere en 10 % absolut ændring i parameteren med en 5 % Type I fejlrate. Анализ мощности был выполнен for выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности for обнаружения 10% afgift тра с 5% частотой ошибок типа I. Effektanalyse blev udført for at vælge gruppestørrelser, der ville give >80 % effekt til at detektere 10 % absolut parameterændring med en 5 % Type I fejlrate.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚄嚻进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％秄秄嚰嚄嚻 Был проведен анализ мощности for выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности for обнаружения параметров и 5% частоты ошибок типа I. En effektanalyse blev udført for at vælge en gruppestørrelse, der ville give >80 % effekt til at detektere 10 % absolut parameterændring og 5 % type I fejlrate.Vævssektioner blev tilfældigt udvalgt før eksperimentet.Alle analyser var tilstandsblinde, og prøver blev først afkodet, efter at alle data var blevet analyseret.GraphPad Prism-software (San Diego, CA) blev brugt til at udføre alle statistiske analyser. For alle statistikker blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05. For alle statistikker blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. For alle statistikker blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. For alle statistikker blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05.Two-tailed Student's t-test blev udført på dataene med kun 2 sammenligninger.En- eller to-vejs ANOVA blev brugt til at bestemme signifikans mellem flere grupper.Ved udførelse af post hoc-tests blev Tukeys korrektion anvendt for at tage højde for flere sammenligninger.RNAsec-data har særlige statistiske overvejelser ved beregning af FDR og p.adjust som beskrevet i afsnittet Metoder.
For mere information om undersøgelsesdesign, se Nature Research Report-abstraktet, der er knyttet til denne artikel.