Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden typografier og JavaScript.
Der er behov for et pålideligt in vitro-system, der nøjagtigt kan reproducere hjertets fysiologiske miljø til lægemiddeltestning. Den begrænsede tilgængelighed af humane hjertevævskultursystemer har ført til unøjagtige fortolkninger af hjertelægemidlers virkninger. Her har vi udviklet en hjertevævskulturmodel (CTCM), der elektromekanisk stimulerer hjerteskiver og undergår fysiologisk strækning under de systoliske og diastoliske faser af hjertecyklussen. Efter 12 dages dyrkning forbedrede denne tilgang delvist levedygtigheden af ​​hjertesektionerne, men bevarede ikke fuldt ud deres strukturelle integritet. Derfor fandt vi efter screening af små molekyler, at tilsætningen af ​​100 nM triiodothyronin (T3) og 1 μM dexamethason (Dex) til vores medium opretholdt sektionernes mikrostruktur i 12 dage. I kombination med T3/Dex-behandling opretholdt CTCM-systemet transkriptionelle profiler, levedygtighed, metabolisk aktivitet og strukturel integritet på samme niveau som frisk hjertevæv i 12 dage. Derudover inducerer overdreven strækning af hjertevæv i kultur hypertrofisk hjertesignalering, hvilket giver bevis for CTCM's evne til at efterligne hypertrofiske tilstande induceret af hjertestrækning. Afslutningsvis kan CTCM modellere hjertets fysiologi og patofysiologi i kultur over lange perioder, hvilket muliggør pålidelig lægemiddelscreening.
Før klinisk forskning er der behov for pålidelige in vitro-systemer, der nøjagtigt kan reproducere det fysiologiske miljø i det menneskelige hjerte. Sådanne systemer bør efterligne ændret mekanisk strækning, hjertefrekvens og elektrofysiologiske egenskaber. Dyremodeller bruges almindeligvis som en screeningsplatform for hjertefysiologi med begrænset pålidelighed til at afspejle virkningerne af lægemidler i det menneskelige hjerte1,2. I sidste ende er den ideelle hjertevævskultureksperimentelle model (CTCM) en model, der er yderst følsom og specifik for forskellige terapeutiske og farmakologiske interventioner, og som nøjagtigt reproducerer det menneskelige hjertes fysiologi og patofysiologi3. Fraværet af et sådant system begrænser opdagelsen af ​​nye behandlinger for hjertesvigt4,5 og har ført til lægemiddelkardiotoksicitet som en væsentlig årsag til at forlade markedet6.
I løbet af det seneste årti er otte ikke-kardiovaskulære lægemidler blevet trukket tilbage fra klinisk brug, fordi de forårsager QT-intervalforlængelse, hvilket fører til ventrikulære arytmier og pludselig død7. Der er derfor et stigende behov for pålidelige prækliniske screeningsstrategier til at vurdere kardiovaskulær effekt og toksicitet. Den nylige anvendelse af humant inducerede pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (hiPS-CM) i lægemiddelscreening og toksicitetstestning giver en delvis løsning på dette problem. Imidlertid er den umodne natur af hiPS-CM og manglen på multicellulær kompleksitet i hjertevæv væsentlige begrænsninger ved denne metode. Nylige undersøgelser har vist, at denne begrænsning delvist kan overvindes ved at bruge tidlig hiPS-CM til at danne hjertevævshydrogeler kort efter starten af ​​spontane sammentrækninger og gradvist øge den elektriske stimulering over tid. Disse hiPS-CM-mikrovæv mangler dog de modne elektrofysiologiske og kontraktile egenskaber hos det voksne myokardium. Derudover har humant hjertevæv en mere kompleks struktur, der består af en heterogen blanding af forskellige celletyper, herunder endotelceller, neuroner og stromale fibroblaster, der er forbundet af specifikke sæt af ekstracellulære matrixproteiner. Denne heterogenitet af ikke-kardiomyocytpopulationer11,12,13 i det voksne pattedyrs hjerte er en væsentlig barriere for modellering af hjertevæv ved hjælp af individuelle celletyper. Disse væsentlige begrænsninger understreger vigtigheden af ​​at udvikle metoder til dyrkning af intakt myokardievæv under fysiologiske og patologiske forhold.
Dyrkede tynde (300 µm) snit af det menneskelige hjerte har vist sig at være en lovende model for intakt humant myokardium. Denne metode giver adgang til et komplet 3D multicellulært system svarende til menneskeligt hjertevæv. Indtil 2019 var brugen af ​​dyrkede hjertesnit dog begrænset af den korte (24 timer) kulturoverlevelse. Dette skyldes en række faktorer, herunder manglen på fysisk-mekanisk strækning, luft-væske-grænsefladen og brugen af ​​simple medier, der ikke understøtter hjertevævets behov. I 2019 demonstrerede flere forskningsgrupper, at inkorporering af mekaniske faktorer i hjertevævskultursystemer kan forlænge kulturens levetid, forbedre hjertets ekspression og efterligne hjertets patologi. To elegante studier 17 og 18 viser, at enakset mekanisk belastning har en positiv effekt på hjertets fænotype under dyrkning. Disse studier anvendte dog ikke den dynamiske tredimensionelle fysisk-mekaniske belastning af hjertecyklussen, da hjertesnit blev belastet med enten isometriske trækkræfter 17 eller lineær auxotonisk belastning 18. Disse metoder til vævsstrækning resulterede i undertrykkelse af mange hjertegener eller overekspression af gener forbundet med unormale strækresponser. Især udviklede Pitoulis et al. 19 et dynamisk hjerteskivekulturbad til rekonstruktion af hjertecyklus ved hjælp af krafttransducerfeedback og spændingsdrev. Selvom dette system muliggør mere præcis in vitro-hjertecyklusmodellering, begrænser metodens kompleksitet og lave gennemløb anvendelsen af ​​dette system. Vores laboratorium har for nylig udviklet et forenklet kultursystem ved hjælp af elektrisk stimulering og et optimeret medium til at opretholde levedygtigheden af ​​sektioner af svine- og menneskehjertevæv i op til 6 dage 20,21.
I det aktuelle manuskript beskriver vi en hjertevævskulturmodel (CTCM) ved hjælp af sektioner af svinehjertet, der inkorporerer humorale signaler for at rekapitulere tredimensionel hjertefysiologi og patofysiologisk udspiling under hjertecyklussen. Denne CTCM kan øge nøjagtigheden af ​​præklinisk lægemiddelforudsigelse til et niveau, der aldrig før er opnået, ved at levere et omkostningseffektivt hjertesystem med mellemstor gennemløbskapacitet, der efterligner fysiologien/patofysiologien i pattedyrs hjerte til præklinisk lægemiddeltestning.
Hæmodynamiske mekaniske signaler spiller en afgørende rolle i at opretholde kardiomyocytfunktionen in vitro 22,23,24. I det aktuelle manuskript har vi udviklet en CTCM (figur 1a), der kan efterligne det voksne hjertemiljø ved at inducere både elektrisk og mekanisk stimulering ved fysiologiske frekvenser (1,2 Hz, 72 slag i minuttet). For at undgå overdreven vævsstrækning under diastole blev en 3D-printenhed brugt til at øge vævsstørrelsen med 25% (fig. 1b). Elektrisk pacing induceret af C-PACE-systemet blev timet til at starte 100 ms før systole ved hjælp af et dataopsamlingssystem for fuldt ud at reproducere hjertecyklussen. Vævskultursystemet bruger en programmerbar pneumatisk aktuator (LB Engineering, Tyskland) til cyklisk at udvide en fleksibel silikonemembran for at forårsage ekspansion af hjerteskiverne i det øvre kammer. Systemet var forbundet til en ekstern luftledning gennem en tryktransducer, hvilket gjorde det muligt nøjagtigt at justere trykket (± 1 mmHg) og tiden (± 1 ms) (fig. 1c).
a Fastgør vævssektionen til den 7 mm støttering, vist med blåt, inde i enhedens kulturkammer. Kulturkammeret er adskilt fra luftkammeret af en tynd, fleksibel silikonemembran. Placer en pakning mellem hvert kammer for at forhindre lækager. Låget på enheden indeholder grafitelektroder, der giver elektrisk stimulering. b Skematisk gengivelse af den store vævsenhed, føringsringen og støtteringen. Vævssektionerne (brune) placeres på den overdimensionerede enhed med føringsringen placeret i rillen på enhedens yderkant. Brug føringen til forsigtigt at placere støtteringen belagt med vævsakrylklæbemiddel over hjertevævssektionen. c Graf, der viser tiden for elektrisk stimulering som funktion af luftkammertrykket styret af en programmerbar pneumatisk aktuator (PPD). En dataopsamlingsenhed blev brugt til at synkronisere elektrisk stimulering ved hjælp af tryksensorer. Når trykket i kulturkammeret når den indstillede tærskel, sendes et pulssignal til C-PACE-EM for at udløse elektrisk stimulering. d Billede af fire CTCM'er placeret på en inkubatorhylde. Fire enheder er forbundet til én PPD via et pneumatisk kredsløb, og tryksensorer er indsat i den hæmostatiske ventil for at overvåge trykket i det pneumatiske kredsløb. Hver enhed indeholder seks vævssektioner.
Ved hjælp af en enkelt pneumatisk aktuator var vi i stand til at styre 4 CTCM-enheder, som hver kunne indeholde 6 vævssektioner (fig. 1d). I CTCM omdannes lufttrykket i luftkammeret til synkront tryk i væskekammeret og inducerer fysiologisk ekspansion af hjerteskiven (figur 2a og supplerende film 1). Evaluering af vævsstrækning ved 80 mm Hg. Art. viste en strækning af vævssektioner på 25% (fig. 2b). Denne procentvise strækning har vist sig at svare til en fysiologisk sarkomerlængde på 2,2-2,3 µm for normal hjertesektionens kontraktilitet17,19,25. Vævsbevægelse blev vurderet ved hjælp af brugerdefinerede kameraindstillinger (supplerende figur 1). Amplituden og hastigheden af ​​vævsbevægelsen (fig. 2c, d) svarede til strækningen under hjertecyklussen og tiden under systole og diastole (fig. 2b). Strækning og hastighed af hjertevæv under kontraktion og relaksation forblev konstant i 12 dage i kultur (fig. 2f). For at evaluere effekten af ​​elektrisk stimulering på kontraktilitet under dyrkning udviklede vi en metode til bestemmelse af aktiv deformitet ved hjælp af en skyggealgoritme (supplerende figur 2a, b) og var i stand til at skelne mellem deformiteter med og uden elektrisk stimulering. Den samme del af hjertet (figur 2f). I det bevægelige område af snittet (R6-9) var spændingen under elektrisk stimulering 20 % højere end i fravær af elektrisk stimulering, hvilket indikerer bidraget fra elektrisk stimulering til kontraktil funktion.
Repræsentative spor af luftkammertryk, væskekammertryk og vævsbevægelsesmålinger bekræfter, at kammertrykket ændrer væskekammertrykket, hvilket forårsager en tilsvarende bevægelse af vævsskiven. b Repræsentative spor af procentvis strækning (blå) af vævssektioner svarende til procentvis strækning (orange). c Den målte bevægelse af hjerteskiven er i overensstemmelse med den målte bevægelseshastighed. (d) Repræsentative baner for cyklisk bevægelse (blå linje) og hastighed (orange stiplet linje) i en hjerteskive. e Kvantificering af cyklustid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), kontraktionstid (n = 19 skiver pr. gruppe), relaksationstid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), vævsbevægelse (n = 25 skiver)/gruppe fra forskellige grise), peak systolisk hastighed (n = 24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskellige grise) og peak relaksationshastighed (n=24(D0), 25(D12) skiver/gruppe fra forskellige grise). Tosidet Student's t-test viste ingen signifikant forskel i nogen parameter. Repræsentative tøjningsanalysespor af vævssnit med (rød) og uden (blå) elektrisk stimulering, ti regionale områder af vævssnit fra samme snit. De nederste paneler viser kvantificeringen af ​​den procentvise forskel i tøjning i vævssnit med og uden elektrisk stimulering i ti områder fra forskellige snit. (n = 8 skiver/gruppe fra forskellige grise, tosidet Student t-test udføres; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 skiver/gruppe fra forskellige grise, tosidet Student t-test udføres; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, ***p<0,01,01,5p<0,01,01,*). (n = 8 sektioner/gruppe fra forskellige grise, tosidet Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01＀0,5） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sektioner/gruppe, fra forskellige grise, tosidet Student's t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen.
I vores tidligere statiske biomimetiske hjerteskivekultursystem [20, 21] opretholdt vi levedygtigheden, funktionen og den strukturelle integritet af hjerteskiver i 6 dage ved at anvende elektrisk stimulering og optimere mediets sammensætning. Efter 10 dage faldt disse tal dog kraftigt. Vi vil referere til sektioner dyrket i vores tidligere statiske biomimetiske kultursystem 20, 21 kontrolbetingelser (Ctrl), og vi vil bruge vores tidligere optimerede medium som MC-betingelser og kultur under samtidig mekanisk og elektrisk stimulering (CTCM). kaldet . Først fastslog vi, at mekanisk stimulering uden elektrisk stimulering var utilstrækkelig til at opretholde vævslevedygtighed i 6 dage (Supplerende Fig. 3a, b). Interessant nok forblev levedygtigheden af ​​12-dages hjertesektioner den samme som i friske hjertesektioner under MS-betingelser, men ikke under Ctrl-betingelser, som vist ved MTT-analyse (Fig. 1). 3a). Dette antyder, at mekanisk stimulering og simulering af hjertecyklussen kan holde vævssektioner levedygtige dobbelt så længe som rapporteret i vores tidligere statiske kultursystem. Vurdering af den strukturelle integritet af vævssnit ved immunmærkning af kardiel troponin T og connexin 43 viste imidlertid, at connexin 43-ekspressionen var signifikant højere i MC-væv på dag 12 end i kontrolgruppen samme dag. Imidlertid blev den ensartede connexin 43-ekspression og Z-skivedannelse ikke fuldt ud opretholdt (fig. 3b). Vi bruger en kunstig intelligens (AI) ramme til at kvantificere vævets strukturelle integritet26, en billedbaseret deep learning pipeline baseret på troponin-T og connexin-farvning43 til automatisk at kvantificere den strukturelle integritet og fluorescens af hjerteskiver med hensyn til lokaliseringsstyrke. Denne metode bruger et Convolutional Neural Network (CNN) og en deep learning ramme til pålideligt at kvantificere den strukturelle integritet af hjertevæv på en automatiseret og upartisk måde, som beskrevet i referencen.26. MC-væv viste forbedret strukturel lighed til dag 0 sammenlignet med statiske kontrolsnit. Derudover afslørede Massons trikromfarvning en signifikant lavere procentdel af fibrose under MS-betingelser sammenlignet med kontrolbetingelser på dag 12 af dyrkningen (fig. 3c). Mens CTCM øgede levedygtigheden af ​​hjertevævssektioner på dag 12 til et niveau svarende til frisk hjertevæv, forbedrede det ikke hjertesektionernes strukturelle integritet signifikant.
Et søjlediagram viser kvantificering af MTT-levedygtigheden af ​​friske hjerteskiver (D0) eller hjerteskiverkultur i 12 dage enten i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). Et søjlediagram viser kvantificering af MTT-levedygtigheden af ​​friske hjerteskiver (D0) eller hjerteskiverkultur i 12 dage enten i statisk kultur (D12 Ctrl) eller i CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl).Histogrammet viser kvantificeringen af ​​levedygtigheden af ​​MTT-friske hjertesektioner (D0) eller kultur af hjertesektioner i 12 dage i enten statisk kultur (D12-kontrol) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrol). ) ), 12 (D12 MC) sektioner/gruppe fra forskellige grise, hvor der udføres en envejs ANOVA-test;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/绑卌AN，进测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，##与D， Ctrl###p < 0,0001D相比，**p.)Histogram, der viser kvantificeringen af ​​MTT-levedygtighed i friske hjertesektioner (D0) eller hjertesektioner dyrket i 12 dage i statisk kultur (D12-kontrol) eller CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-kontrol)), 12 (D12 MC) sektioner/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 sammenlignet med D0, **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl).b Troponin-T (grøn), connexin 43 (rød) og DAPI (blå) i frisk isolerede hjertesektioner (D0) eller hjertesektioner dyrket under statiske forhold (Ctrl) eller CTCM-forhold (MC) i 12 dage) af repræsentative immunofluorescensbilleder (blank skala = 100 µm). Kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet ved hjælp af kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe fra hver forskellig gris, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet ved hjælp af kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe fra hver forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 с 12), 7 (D12 сов) fra разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet ved hjælp af kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/grupper fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; ####p < 0,0001 vs. med D0 og ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/grupper hver af forskellige gris, en-vejs ANOVA-test .#0VA-test .##0;##;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skiver/gruppe hver af de forskellige grise, envejs ANOVA-test <0#0p <0#;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7) (D12), MC (D512 Ctrl), срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. Ctrl). Kunstig intelligens til at kvantificere den strukturelle integritet af hjertevæv (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sektioner/gruppe af hver forskellige grise, envejs ANOVA-test; ####p<0,0001 vs. .D0 Til sammenligning ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) for hjerteskiver farvet med Massons trikromfarvning (Scale bar = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe fra hver forskellig gris, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) for hjerteskiver farvet med Massons trikromfarvning (Scale bar = 500 µm) (n = 10 skiver/gruppe fra hver forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) og количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихмных (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонется односторон те 0,#0 NOVA p.0,#0NOVA; сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) af hjertesektioner farvet med Massons trikromfarvning (ubelagt skala = 500 µm) (n = 10 sektioner/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=尺0）（裸=尺0）（裸=尺0） 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 缎***02D <0．***02D Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸庰庣 裸壸庣裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单ﵛ 单 向 A#nova 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) og количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихмный (чистая шкала = 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощогруппа дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Repræsentative billeder (venstre) og kvantificering (højre) af hjertesektioner farvet med Massons trikromfarvning (blank = 500 µm) (n = 10 sektioner/gruppe, hver fra en forskellig gris, testet ved envejs variansanalyse; ### # p < 0,0001 sammenlignet med D0, ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl).Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen.
Vi fremsatte den hypotese, at ved at tilsætte små molekyler til dyrkningsmediet kunne kardiomyocytternes integritet forbedres og fibroseudviklingen reduceres under CTCM-dyrkning. Vi screenede derfor for små molekyler ved hjælp af vores statiske kontrolkulturer20,21 på grund af det lille antal forstyrrende faktorer. Dexamethason (Dex), triiodothyronin (T3) og SB431542 (SB) blev valgt til denne screening. Disse små molekyler er tidligere blevet brugt i hiPSC-CM-kulturer til at inducere modning af kardiomyocytter ved at øge sarkomerlængden, T-tubuli og ledningshastigheden. Derudover er både Dex (et glukokortikoid) og SB kendt for at undertrykke inflammation29,30. Derfor testede vi, om inkluderingen af ​​et eller en kombination af disse små molekyler ville forbedre den strukturelle integritet af hjertesektioner. Til den indledende screening blev dosis af hver forbindelse valgt baseret på de koncentrationer, der almindeligvis anvendes i cellekulturmodeller (1 μM Dex27, 100 nM T327 og 2,5 μM SB31). Efter 12 dages dyrkning resulterede kombinationen af ​​T3 og Dex i optimal strukturel integritet af kardiomyocytterne og minimal fibrøs ombygning (supplerende figur 4 og 5). Derudover medførte brugen af ​​dobbelte eller dobbelt så høje koncentrationer af T3 og Dex skadelige virkninger sammenlignet med normale koncentrationer (supplerende figur 6a,b).
Efter den indledende screening udførte vi en direkte sammenligning af 4 kulturbetingelser (figur 4a): Ctrl: hjertesektioner dyrket i vores tidligere beskrevne statiske kultur ved hjælp af vores optimerede medium; 20.21 TD: T3 og Ctrl s tilsat Dex onsdag; MC: hjertesektioner dyrket i CTCM ved hjælp af vores tidligere optimerede medium; og MT: CTCM med T3 og Dex tilsat mediet. Efter 12 dages dyrkning forblev levedygtigheden af ​​MS- og MT-væv den samme som i frisk væv vurderet ved MTT-assay (fig. 4b). Interessant nok resulterede tilsætningen af ​​T3 og Dex til transwell-kulturer (TD) ikke i en signifikant forbedring af levedygtigheden sammenlignet med Ctrl-betingelser, hvilket indikerer en vigtig rolle for mekanisk stimulering i at opretholde levedygtigheden af ​​hjertesektioner.
Et eksperimentelt designdiagram, der viser de fire kulturbetingelser, der blev brugt til at evaluere virkningerne af mekanisk stimulering og T3/Dex-tilskud på medium i 12 dage. b Søjlediagrammet viser kvantificering af levedygtighed 12 dage efter dyrkning under alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). b Søjlediagrammet viser kvantificering af levedygtighed 12 dage efter dyrkning under alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку. культивирования (контроль, TD, MC og MT) til сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD), MT 122 TD, og ​​D122 TD, og ​​D122 срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравни; с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Søjlediagrammet viser kvantificeringen af ​​levedygtighed 12 dage efter dyrkning under alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), 12 (D12 MC) sektioner/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 og **p < 0,01 sammenlignet med D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (150)、12 150)぀和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001， 0##1， 0.0#1，相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC og MT) по сравнению со свежезц (0) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0 ##00#p сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram, der viser alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD og D12 MT), fra forskellige grise 12 (D12 MC) sektioner/gruppe, envejs ANOVA-test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrol D12). c Søjlediagrammet viser kvantificeringen af ​​glukoseflux 12 dage efter dyrkning under alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Søjlediagrammet viser kvantificeringen af ​​glukoseflux 12 dage efter dyrkning under alle 4 dyrkningsbetingelser (Ctrl, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjerteskiver (D0) (n = 6 skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4висованис культивирования (контроль, TD, MC og MT) på сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/грезовированию, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogrammet viser kvantificering af glukoseflux 12 dage efter dyrkning under alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 6 sektioner/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; ###p < 0,001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001 sammenlignet med D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹养吐12，吐天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0，D < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切缌 切 片 切 片 切 片 切培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования культивирования (контроль, TD, MC og MT) på сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрапа, срезов, срезовирования односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram, der viser kvantificering af glukoseflux 12 dage efter dyrkning for alle 4 dyrkningsbetingelser (kontrol, TD, MC og MT) sammenlignet med friske hjertesektioner (D0) (n = 6 sektioner/gruppe, fra forskellige grise, unilaterale hvor ANOVA-tests blev udført, ###p < 0,001 sammenlignet med D0, ***p < 0,001 sammenlignet med D12 (kontrol).d Stammeanalyseplots af frisk (blå), dag 12 MC (grøn) og dag 12 MT (rød) væv ved ti regionale vævssnitpunkter (n = 4 skiver/gruppe, envejs ANOVA-test; der var ingen signifikant forskel mellem grupperne). e Vulkanplot, der viser differentielt udtrykte gener i friske hjertesnit (D0) sammenlignet med hjertesnit dyrket under statiske forhold (Ctrl) eller under MT-forhold (MT) i 10-12 dage. f Varmekort over sarkomergener for hjertesnit dyrket under hver af dyrkningsbetingelserne. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen.
Metabolisk afhængighed af skiftet fra fedtsyreoxidation til glykolyse er et kendetegn ved kardiomyocyt-dedifferentiering. Umodne kardiomyocytter bruger primært glukose til ATP-produktion og har hypoplastiske mitokondrier med få cristae5,32. Analyser af glukoseudnyttelse viste, at glukoseudnyttelsen under MC- og MT-forhold var den samme som i dag 0-væv (figur 4c). Ctrl-prøver viste dog en signifikant stigning i glukoseudnyttelse sammenlignet med frisk væv. Dette indikerer, at kombinationen af ​​CTCM og T3/Dex forbedrer vævslevedygtigheden og bevarer den metaboliske fænotype af 12-dages dyrkede hjertesektioner. Derudover viste belastningsanalyse, at belastningsniveauerne forblev de samme som i frisk hjertevæv i 12 dage under MT- og MS-forhold (fig. 4d).
For at analysere den samlede indvirkning af CTCM og T3/Dex på det globale transkriptionelle landskab af hjertevæv, udførte vi RNAseq på hjertevæv fra alle fire forskellige dyrkningsbetingelser (Supplerende data 1). Interessant nok viste MT-sektioner høj transkriptionel lighed med frisk hjertevæv, med kun 16 differentielt udtrykte gener ud af 13.642. Men som vi tidligere viste, viste Ctrl-sektioner 1229 differentielt udtrykte gener efter 10-12 dage i kultur (fig. 4e). Disse data blev bekræftet ved qRT-PCR af hjerte- og fibroblastgener (supplerende fig. 7a-c). Interessant nok viste Ctrl-sektionerne nedregulering af hjerte- og cellecyklusgener og aktivering af inflammatoriske genprogrammer. Disse data tyder på, at dedifferentiering, som normalt forekommer efter langvarig dyrkning, er fuldstændigt dæmpet under MT-betingelser (supplerende fig. 8a,b). En grundig undersøgelse af sarkomergener viste, at kun under MT-betingelser bevares generne, der koder for sarkomeren (fig. 4f) og ionkanalen (supplerende fig. 9), hvilket beskytter dem mod undertrykkelse under Ctrl-, TD- og MC-betingelser. Disse data viser, at med en kombination af mekanisk og humoral stimulering (T3/Dex) kan hjerteskivetranskriptomet forblive lig friske hjerteskiver efter 12 dage i kultur.
Disse transkriptionelle fund understøttes af det faktum, at kardiomyocytters strukturelle integritet i hjertesektioner bedst bevares under MT-forhold i 12 dage, som vist ved intakt og lokaliseret connexin 43 (fig. 5a). Derudover var fibrose i hjertesektioner under MT-forhold signifikant reduceret sammenlignet med Ctrl og svarende til friske hjertesektioner (fig. 5b). Disse data viser, at kombinationen af ​​mekanisk stimulering og T3/Dex-behandling effektivt bevarer hjertestrukturen i hjertesektioner i kultur.
Repræsentative immunofluorescensbilleder af troponin-T (grøn), connexin 43 (rød) og DAPI (blå) i frisk isolerede hjertesektioner (D0) eller dyrket i 12 dage under alle fire hjertesektioners kulturbetingelser (skalalinje = 100 µm). Kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet ved hjælp af kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet ved hjælp af kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 TD), (D12 TD), (D12, 5, 5, 12, 2, 2). MC og D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantificering af hjertevævets strukturelle integritet ved hjælp af kunstig intelligens (n ​​= 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sektioner/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udført; #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 帒*p <0,0*p <0,0*p <0. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 t12 ） ， d12 mc 廒人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p ，p < 0,05**** p < 0,05 0,0001 与D12 Ctrl 相比).Kvantificering af den strukturelle integritet af hjertevæv ved hjælp af kunstig intelligens hos forskellige grise (n = 7 (D0 og D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC og D12 MT) sektioner/gruppe) med en envejs ANOVA-test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 sammenlignet med D0 og *p < 0,05 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering for hjerteskiver farvet med Massons trikromfarvning (skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering for hjerteskiver farvet med Massons trikromfarvning (skalalinje = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) skiver/gruppe fra forskellige grise, envejs ANOVA-test udføres; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0 og ***p < 0,001, eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красиамасная ( линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, вединсолня ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering af hjertesektioner farvet med Massons trikromfarvning (skala bjælke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner/gruppe fra forskellige grise, udført envejs ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 og ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm = 010n D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方垕因素方垷分 1.#0##1与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 μ（n = 0（n 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；00000D <.0##相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Маснашения = 5. maj мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один-способ ANOVA; #0п,#000 с D0, ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Repræsentative billeder og kvantificering af hjertesektioner farvet med Massons trikrom (skala bjælke = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD og D12 MC), 9 (D12 MT) sektioner fra forskellige grise/gruppe, én ANOVA-metode; ####p < 0,0001 sammenlignet med D0, ***p < 0,001 eller ****p < 0,0001 sammenlignet med D12 Ctrl).Fejllinjer repræsenterer middelværdien ± standardafvigelsen.
Endelig blev CTCM's evne til at efterligne hjertehypertrofi vurderet ved at øge hjertevævsstrækningen. I CTCM steg det maksimale luftkammertryk fra 80 mmHg til 80 mmHg Art. (normal strækning) op til 140 mmHg Art. (fig. 6a). Dette svarer til en stigning på 32% i strækning (fig. 6b), hvilket tidligere blev vist som den tilsvarende procentvise strækning, der kræves for hjertesektioner for at opnå en sarkomerlængde svarende til den, der ses ved hypertrofi. Strækning og hastighed af hjertevæv under kontraktion og relaksation forblev konstant i seks dages dyrkning (fig. 6c). Hjertevæv fra MT-forhold blev udsat for normal strækning (MT (Normal)) eller overstrækningsforhold (MT (OS)) i seks dage. Allerede efter fire dage i dyrkning var den hypertrofiske biomarkør NT-ProBNP signifikant forhøjet i mediet under MT (OS)-forhold sammenlignet med MT (normale) forhold (fig. 7a). Derudover steg cellestørrelsen i MT (OS) (fig. 7b) signifikant efter seks dages dyrkning sammenlignet med sektioner af MT-hjerte (normalt). Derudover var NFATC4-nuklear translokation signifikant forøget i overstrakt væv (fig. 7c). Disse resultater viser den progressive udvikling af patologisk remodellering efter hyperdistension og understøtter konceptet om, at CTCM-enheden kan bruges som en platform til at studere strækinduceret hjertehypertrofisignalering.
Repræsentative spor af målinger af luftkammertryk, væskekammertryk og vævsbevægelse bekræfter, at kammertrykket ændrer væskekammertrykket, hvilket forårsager en tilsvarende bevægelse af vævsskiven. b Repræsentative strækprocent- og strækhastighedskurver for normalt strakte (orange) og overstrakte (blå) vævssnit. c Søjlediagram, der viser cyklustid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), kontraktionstid (n = 18-19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise), relaksationstid (n = 19 skiver pr. gruppe, fra forskellige grise)), amplitude af vævsbevægelse (n = 14 skiver/gruppe, fra forskellige grise), peak systolisk hastighed (n = 14 skiver/gruppe, fra forskellige grise) og peak relaksationshastighed (n = 14 (D0), 15 (D6)) snit/grupper) fra forskellige grise), tosidet Student's t-test viste ingen signifikant forskel i nogen parameter, hvilket indikerer, at disse parametre forblev konstante i løbet af 6 dages dyrkning med overspænding. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse.
en søjlediagramkvantificering af NT-ProBNP-koncentration i kulturmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normale strækningsbetingelser (Norm) eller overstrækningsbetingelser (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise. Tovejs ANOVA udføres; **p < 0,01 sammenlignet med normal strækning). En søjlediagramkvantificering af NT-ProBNP-koncentration i kulturmedier fra hjerteskiver dyrket under MT normale stræknings- (Norm) eller overstræknings- (OS) betingelser (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise. Tovejs ANOVA udføres; **p < 0,01 sammenlignet med normal strækning).Kvantitativt histogram af NT-ProBNP-koncentration i dyrkningsmedium fra hjerteskiver dyrket under betingelser med normal MT-strækning (norm) eller overstrækning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm og D4).MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, tofaktorvariansanalyse udføres;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 sammenlignet med normal strækning). en 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01）. a Kvantificering af NT-ProBNP-koncentration i hjerteskiver dyrket under MT normal stretch (Norm) eller overstretch (OS) forhold (n​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) fra forskellige猪的切片/组，可以双向方方发发动 **sammenlignet med normal strækning, p < 0,01).histogram Kvantificering af NT-ProBNP-koncentrationer i hjerteskiver dyrket under betingelser med normal MT-strækning (norm) eller overstrækning (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) og D4 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, tovejs variansanalyse;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 sammenlignet med normal strækning). b Repræsentative billeder af hjerteskiver farvet med troponin-T og WGA (venstre) og kvantificering af cellestørrelse (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskellige skiver fra forskellige grise, tosidet Student t-test udføres; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal strækning). b Repræsentative billeder af hjerteskiver farvet med troponin-T og WGA (venstre) og kvantificering af cellestørrelse (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskellige skiver fra forskellige grise, tosidet Student t-test udføres; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal strækning). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т og АЗП (слева) og количественинегого клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, двх-из t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Repræsentative billeder af hjertesektioner farvet med troponin-T og AZP (venstre) og kvantificering af cellestørrelse (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celler/gruppe fra 10 forskellige sektioner fra forskellige grise, tosidet Student's t-test blev udført; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal belastning). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性 3（n MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甌检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Repræsentative billeder af hjerteskiver farvet med calcarein-T og WGA (venstre) og cellestørrelse (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 fra 10 forskellige skiver (D6 MTNorm)) Celler/celle, standardudvikling t-test; sammenlignet med normal strækning, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) og количественная (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/групэпа, двустикронид; ****p < 0,0001 i forhold til kendskabskontrol). b Repræsentative billeder af hjertesektioner farvet med troponin-T og AZP (venstre) og kvantificering af cellestørrelse (højre) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) fra 10 forskellige sektioner fra forskellige grise) Celler/gruppe, tosidet kriterium Student's t; ****p < 0,0001 sammenlignet med normal belastning). c Repræsentative billeder for dag 0 og dag 6 MTOS-hjerteskiver immunmærket for troponin-T og NFATC4 og kvantificering af translokationen af ​​NFATC4 til kernerne i CM'er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, tosidet Student t-test udføres; *p < 0,05). c Repræsentative billeder for dag 0 og dag 6 MTOS-hjerteskiver immunmærket for troponin-T og NFATC4 og kvantificering af translokationen af ​​NFATC4 til kernerne i CM'er (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise, tosidet Student t-test udføres; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 og 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, og ковленич транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свистоняней , выпус t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Repræsentative billeder af hjertesektioner ved 0 og 6 dages MTOS, immunmærket for troponin-T og NFATC4, og kvantificering af NFATC4-translokation i kernen af ​​kavernøse celler (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe fra forskellige grise) udført tosidet Student's t-test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量匀MT 匀3D (n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Repræsentative billeder af calcanin-T- og NFATC4-immunmærkning 第0天和第6天MTOS-hjerteskiver og NFATC4 fra forskellige NFATC4-易位至CM-cellekerne-mængde化 (n = 4 (D0), 缤 刻 , 3 (D6 , )时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS på 0 og 6 dage til иммуномаркировки тропониностином-Т и NFATC4 og коцичи транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критеритер, 0). c Repræsentative billeder af MTOS-hjerteskiver på dag 0 og 6 for troponin-T- og NFATC4-immunmærkning og kvantificering af NFATC4-translokation i kernen af ​​CM fra forskellige grise (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skiver/gruppe, tosidet t-kriterium Student's; *p < 0,05).Fejllinjer repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse.
Translationel kardiovaskulær forskning kræver cellulære modeller, der nøjagtigt reproducerer det kardiale miljø. I dette studie blev en CTCM-enhed udviklet og karakteriseret, som kan stimulere ultratynde sektioner af hjertet. CTCM-systemet inkluderer fysiologisk synkroniseret elektromekanisk stimulering og T3- og Dex-væskeberigelse. Når svinehjertesektioner blev udsat for disse faktorer, forblev deres levedygtighed, strukturelle integritet, metaboliske aktivitet og transkriptionelle ekspression den samme som i frisk hjertevæv efter 12 dages dyrkning. Derudover kan overdreven strækning af hjertevæv forårsage hypertrofi af hjertet forårsaget af hyperekstension. Samlet set understøtter disse resultater den kritiske rolle, som fysiologiske dyrkningsbetingelser spiller i at opretholde en normal kardiel fænotype, og de giver en platform for lægemiddelscreening.
Mange faktorer bidrager til at skabe et optimalt miljø for kardiomyocytters funktion og overlevelse. De mest åbenlyse af disse faktorer er relateret til (1) intercellulære interaktioner, (2) elektromekanisk stimulering, (3) humorale faktorer og (4) metaboliske substrater. Fysiologiske celle-til-celle-interaktioner kræver komplekse tredimensionelle netværk af flere celletyper understøttet af en ekstracellulær matrix. Sådanne komplekse cellulære interaktioner er vanskelige at rekonstruere in vitro ved samkultur af individuelle celletyper, men kan let opnås ved hjælp af hjertesektioners organotypiske natur.
Mekanisk strækning og elektrisk stimulering af kardiomyocytter er afgørende for at opretholde kardiale fænotyper33,34,35. Mens mekanisk stimulering har været meget anvendt til hiPSC-CM-konditionering og -modning, har adskillige elegante studier for nylig forsøgt mekanisk stimulering af hjerteskiver i kultur ved hjælp af uniaksial belastning. Disse studier viser, at 2D uniaksial mekanisk belastning har en positiv effekt på hjertets fænotype under dyrkning. I disse studier blev sektioner af hjertet enten belastet med isometriske trækkræfter17, lineær auxotonisk belastning18, eller hjertecyklussen blev genskabt ved hjælp af krafttransducerfeedback og spændingsdrev. Disse metoder bruger dog uniaksial vævsstrækning uden miljøoptimering, hvilket resulterer i undertrykkelse af mange hjertegener eller overekspression af gener forbundet med unormale strækningsresponser. Den CTCM, der beskrives her, giver en 3D elektromekanisk stimulus, der efterligner den naturlige hjertecyklus med hensyn til cyklustid og fysiologisk strækning (25% strækning, 40% systole, 60% diastole og 72 slag i minuttet). Selvom denne tredimensionelle mekaniske stimulering alene ikke er tilstrækkelig til at opretholde vævsintegritet, er en kombination af humoral og mekanisk stimulering ved hjælp af T3/Dex nødvendig for at opretholde vævslevedygtighed, funktion og integritet på tilstrækkelig vis.
Humorale faktorer spiller en vigtig rolle i moduleringen af ​​den voksne hjertefænotype. Dette blev fremhævet i HiPS-CM-studier, hvor T3 og Dex blev tilsat kulturmedier for at accelerere cellemodning. T3 kan påvirke transporten af ​​aminosyrer, sukkerarter og calcium på tværs af cellemembraner36. Derudover fremmer T3 MHC-α-ekspression og MHC-β-nedregulering, hvilket fremmer dannelsen af ​​hurtige myofibriller i modne kardiomyocytter sammenlignet med langsomme myofibriller i føtal CM. T3-mangel hos patienter med hypothyroidisme resulterer i tab af myofibrillære bånd og en reduceret hastighed af tonusudvikling37. Dex virker på glukokortikoidreceptorer og har vist sig at øge myokardiekontraktiliteten i isolerede perfunderede hjerter;38 denne forbedring menes at være relateret til effekten på calcium deposit-driven entry (SOCE)39,40. Derudover binder Dex sig til sine receptorer, hvilket forårsager en bred intracellulær respons, der undertrykker immunfunktion og inflammation30.
Vores resultater indikerer, at fysisk mekanisk stimulering (MS) forbedrede den samlede kulturpræstation sammenlignet med Ctrl, men ikke opretholdt levedygtighed, strukturel integritet og hjerteekspression over 12 dage i kultur. Sammenlignet med Ctrl forbedrede tilsætning af T3 og Dex til CTCM (MT) kulturer levedygtigheden og opretholdt lignende transkriptionsprofiler, strukturel integritet og metabolisk aktivitet med frisk hjertevæv i 12 dage. Derudover blev der ved at kontrollere graden af ​​vævsstrækning skabt en hyperekstension-induceret hjertehypertrofimodel ved hjælp af STCM, hvilket illustrerer STCM-systemets alsidighed. Det skal bemærkes, at selvom hjerteremodellering og fibrose normalt involverer intakte organer, hvis cirkulerende celler kan levere de passende cytokiner samt fagocytose og andre remodelleringsfaktorer, kan sektioner af hjertet stadig efterligne den fibrotiske proces som reaktion på stress og traumer ind i myofibroblaster. Dette er tidligere blevet evalueret i denne hjerteskivemodel. Det skal bemærkes, at CTCM-parametre kan moduleres ved at ændre tryk/elektrisk amplitude og frekvens for at simulere mange tilstande såsom takykardi, bradykardi og mekanisk kredsløbsstøtte (mekanisk ubelastet hjerte). Dette gør systemet til et middelstort system til lægemiddeltestning. CTCM's evne til at modellere overanstrengelsesinduceret hjertehypertrofi baner vejen for at teste dette system til personlig behandling. Afslutningsvis viser den foreliggende undersøgelse, at mekanisk stræk og humoral stimulering er afgørende for at opretholde kulturen af ​​hjertevævssektioner.
Selvom de data, der præsenteres her, tyder på, at CTCM er en meget lovende platform til modellering af intakt myokardium, har denne dyrkningsmetode nogle begrænsninger. Den primære begrænsning ved CTCM-dyrkning er, at den påfører skiverne kontinuerlige dynamiske mekaniske belastninger, hvilket udelukker muligheden for aktivt at overvåge hjerteskivernes kontraktioner under hver cyklus. Derudover er evnen til at evaluere systolisk funktion uden for kultursystemer ved hjælp af traditionelle kraftsensorer begrænset på grund af den lille størrelse af hjertesektionerne (7 mm). I det aktuelle manuskript overvinder vi delvist denne begrænsning ved at evaluere optisk spænding som en indikator for kontraktil funktion. Denne begrænsning vil dog kræve yderligere arbejde og kan muligvis løses i fremtiden ved at introducere metoder til optisk overvågning af funktionen af ​​hjerteskiver i kultur, såsom optisk kortlægning ved hjælp af calcium og spændingsfølsomme farvestoffer. En anden begrænsning ved CTCM er, at arbejdsmodellen ikke manipulerer fysiologisk stress (forbelastning og efterbelastning). I CTCM blev tryk induceret i modsatte retninger for at reproducere 25% fysiologisk strækning i diastole (fuld strækning) og systole (kontraktionslængde under elektrisk stimulering) i meget store væv. Denne begrænsning bør fjernes i fremtidige CTCM-designs ved tilstrækkeligt tryk på hjertevævet fra begge sider og ved at anvende de præcise tryk-volumen-forhold, der forekommer i hjertets kamre.
Den overstræk-inducerede remodellering, der rapporteres i dette manuskript, er begrænset til at efterligne hypertrofiske hyperstræksignaler. Denne model kan således hjælpe i studiet af stræk-induceret hypertrofisk signalering uden behov for humorale eller neurale faktorer (som ikke findes i dette system). Yderligere undersøgelser er nødvendige for at øge multipliciteten af ​​CTCM, for eksempel vil samdyrkning med immunceller, humorale faktorer i cirkulerende plasma og innervation, når samdyrkning med neuronale celler vil forbedre mulighederne for sygdomsmodellering med CTCM.
Tretten grise blev anvendt i dette studie. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og blev godkendt af University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee. Aortabuen blev afklemt, og hjertet blev perfunderet med 1 liter steril kardioplegi (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparin, pH op til 7,4); Hjerterne blev opbevaret i iskold kardioplegisk opløsning indtil transport til laboratoriet på is, hvilket normalt er <10 min. Hjerterne blev opbevaret i iskold kardioplegisk opløsning indtil transport til laboratoriet på is, hvilket normalt er <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обанично <10мно. Hjerterne blev opbevaret i iskold kardioplegisk opløsning indtil transport til laboratoriet på is, hvilket normalt tager <10 minutter.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。送将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10。送 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Hold hjerterne på is ved kardioplegi indtil transport til laboratoriet på is, normalt <10 min.
CTCM-enheden blev udviklet i SolidWorks computerstøttet design (CAD) software. Kulturkamrene, skillevæggene og luftkamrene er lavet af CNC klar akrylplast. Den 7 mm diameter store backup-ring er lavet af højdensitetspolyethylen (HDPE) i midten og har en o-ringsrille til at rumme silikone-o-ringen, der bruges til at forsegle mediet nedenunder. En tynd silicamembran adskiller kulturkammeret fra separationspladen. Silikonemembranen er laserskåret ud af en 0,02" tyk silikoneplade og har en hårdhed på 35A. De nederste og øverste silikonepakninger er laserskåret ud af en 1/16" tyk silikoneplade og har en hårdhed på 50A. 316L rustfri stålskruer og vingemøtrikker bruges til at fastgøre blokken og skabe en lufttæt forsegling.
Et dedikeret printkort (PCB) er designet til at blive integreret med C-PACE-EM-systemet. Swiss Machine-stikkontakterne på printkortet er forbundet til grafitelektroder med forsølvede kobbertråde og bronze 0-60 skruer, der er skruet ind i elektroderne. Printkortet er placeret i 3D-printerens dæksel.
CTCM-enheden styres af en programmerbar pneumatisk aktuator (PPD), der skaber et kontrolleret kredsløbstryk svarende til en hjertecyklus. Når trykket inde i luftkammeret stiger, udvider den fleksible silikonemembran sig opad, hvilket tvinger mediet ind under vævsområdet. Vævsområdet vil derefter blive strakt ved denne udstødning af væsken, hvilket efterligner hjertets fysiologiske ekspansion under diastolen. Ved toppen af ​​afslapningen blev der anvendt elektrisk stimulering via grafitelektroder, hvilket reducerede trykket i luftkammeret og forårsagede sammentrækning af vævssektionerne. Inde i røret er der en hæmostatisk ventil med en tryksensor til at detektere trykket i luftsystemet. Trykket, der registreres af tryksensoren, påføres en dataopsamler, der er tilsluttet den bærbare computer. Dette muliggør kontinuerlig overvågning af trykket inde i gaskammeret. Når det maksimale kammertryk blev nået (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), blev dataopsamlingsenheden beordret til at sende et signal til C-PACE-EM-systemet for at generere et tofaset spændingssignal i 2 ms, indstillet til 4 V.
Hjertesnit blev udtaget, og dyrkningsbetingelserne i 6 brønde blev udført som følger: De høstede hjerter blev overført fra overførselsbeholderen til en bakke indeholdende kold (4° C) kardioplegi. Venstre ventrikel blev isoleret med et sterilt blad og skåret i stykker på 1-2 cm3. Disse vævsblokke blev fastgjort til vævsstøtter med vævsklæber og placeret i et vibrerende mikrotomvævsbad indeholdende Tyrodes opløsning og kontinuerligt iltet (3 g/L 2,3-butandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M opløsning), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M opløsning), op til 1 L ddH2O). Den vibrerende mikrotom blev indstillet til at skære 300 µm tykke skiver med en frekvens på 80 Hz, en horisontal vibrationsamplitude på 2 mm og en fremføringshastighed på 0,03 mm/s. Vævsbadet var omgivet af is for at holde opløsningen kølig, og temperaturen blev holdt ved 4°C. Overfør vævssektionerne fra mikrotombadet til et inkubationsbad indeholdende kontinuerligt iltet Tyrode-opløsning på is, indtil der var tilstrækkeligt med sektioner til én dyrkningsplade. For transwell-kulturer blev vævssektionerne fastgjort til sterile 6 mm brede polyurethanunderlag og placeret i 6 ml optimeret medium (199 medium, 1x ITS-tilskud, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisk og 2X antibiotisk-svampemiddel). Elektrisk stimulering (10 V, frekvens 1,2 Hz) blev påført vævssektionerne via C-Pace. For TD-betingelser blev frisk T3 og Dex tilsat ved 100 nM og 1 μM ved hvert medieskift. Mediet mættes med ilt før udskiftning 3 gange dagligt. Vævssektionerne blev dyrket i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
Til CTCM-kulturer blev vævssektioner placeret på en specialfremstillet 3D-printer i en petriskål indeholdende modificeret Tyrodes opløsning. Enheden er designet til at øge størrelsen af ​​hjertesnittet med 25 % af støtteringens areal. Dette gøres for at forhindre, at hjertesektionerne strækker sig efter overførsel fra Tyrodes opløsning til mediet og under diastolen. Ved hjælp af histoacryllim blev sektioner med en tykkelse på 300 µm fastgjort på en støttering med en diameter på 7 mm. Efter at vævssektionerne var fastgjort til støtteringen, afskæres de overskydende vævssektioner, og de fastgjorte vævssektioner placeres tilbage i badet med Tyrode-opløsning på is (4 °C), indtil der er forberedt nok sektioner til én enhed. Den samlede behandlingstid for alle enheder bør ikke overstige 2 timer. Efter at 6 vævssektioner var fastgjort til deres støtteringe, blev CTCM-enheden samlet. CTCM-kulturkammeret er forfyldt med 21 ml præ-oxygeneret medium. Overfør vævssektionerne til kulturkammeret, og fjern forsigtigt eventuelle luftbobler med en pipette. Vævssektionen føres derefter ind i hullet og presses forsigtigt på plads. Til sidst sættes elektrodehætten på enheden, og enheden overføres til inkubatoren. Tilslut derefter CTCM'en til luftslangen og C-PACE-EM-systemet. Den pneumatiske aktuator åbner, og luftventilen åbner CTCM'en. C-PACE-EM-systemet blev konfigureret til at levere 4 V ved 1,2 Hz under bifasisk pacing i 2 ms. Mediet blev skiftet to gange om dagen, og elektroderne blev skiftet en gang om dagen for at undgå ophobning af grafit på elektroderne. Om nødvendigt kan vævssektionerne fjernes fra deres dyrkningsbrønde for at udvise eventuelle luftbobler, der måtte være faldet ned under dem. Ved MT-behandling blev T3/Dex tilsat frisk ved hvert medieskift med 100 nM T3 og 1 μM Dex. CTCM-enhederne blev dyrket i en inkubator ved 37°C og 5% CO2.
For at opnå strakte baner af hjerteskiver blev der udviklet et specielt kamerasystem. Et spejlreflekskamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) blev brugt med et Navitar Zoom 7000 18-108 mm makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA). Visualisering blev udført ved stuetemperatur efter udskiftning af mediet med nyt medium. Kameraet er placeret i en vinkel på 51°, og video optages med 30 billeder i sekundet. Først blev open source-software (MUSCLEMOTION43) brugt med Image-J til at kvantificere bevægelsen af ​​hjerteskiverne. Masken blev oprettet ved hjælp af MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) for at definere interesseområder for bankende hjerteskiver for at undgå støj. Manuelt segmenterede masker anvendes på alle billeder i en billedsekvens og sendes derefter til MUSCLEMOTION-plugin'et. Muscle Motion bruger den gennemsnitlige intensitet af pixels i hver ramme til at kvantificere dens bevægelse i forhold til referencerammen. Data blev registreret, filtreret og brugt til at kvantificere cyklustid og vurdere vævsstrækning under hjertecyklussen. Den optagede video blev efterbehandlet ved hjælp af et digitalt filter af første orden nulfase. For at kvantificere vævsstrækning (peak-to-peak) blev der udført peak-to-peak-analyse for at skelne mellem toppe og dale i det optagede signal. Derudover udføres detrending ved hjælp af et 6. ordens polynomium for at eliminere signaldrift. Programkode blev udviklet i MATLAB for at bestemme global vævsbevægelse, cyklustid, relaksationstid og kontraktionstid (Supplerende programkode 44).
Til tøjningsanalyse tegnede vi først to billeder, der repræsenterede bevægelsestoppe (de højeste (øvre) og laveste (nedre) bevægelsespunkter) i henhold til MUSCLEMOTION-softwaren, ved hjælp af de samme videoer, der er lavet til mekanisk strækningsvurdering. Vi segmenterede derefter vævsområderne og anvendte en form for skyggealgoritme på det segmenterede væv (supplerende figur 2a). Det segmenterede væv blev derefter opdelt i ti underflader, og spændingen på hver overflade blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: Tøjning = (Sup-Sdown)/Sdown, hvor Sup og Sdown er afstandene mellem formen og henholdsvis stoffets øverste og nederste skygger (supplerende figur 2b).
Hjertesnit blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 48 timer. Fikserede væv blev dehydreret i 10% og 20% ​​sukrose i 1 time og derefter i 30% sukrose natten over. Snittene blev derefter indlejret i OCT-forbindelse (optimal cutting temperature compound) og gradvist frosset i et isopentan/tørisbad. Opbevar OCT-indlejringsblokkene ved -80 °C indtil adskillelse. Objektglassene blev fremstillet som snit med en tykkelse på 8 μm.
For at fjerne OCT fra hjertesektioner, opvarm objektglassene på en varmeblok ved 95 °C i 5 minutter. Tilsæt 1 ml PBS til hvert objektglas og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, og permeer derefter sektionerne ved at sætte 0,1% Triton-X i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. For at forhindre uspecifikke antistoffer i at binde til prøven, tilsæt 1 ml 3% BSA-opløsning til objektglassene og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. BSA'en blev derefter fjernet, og objektglassene blev vasket med PBS. Marker hver prøve med en blyant. Primære antistoffer (fortyndet 1:200 i 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) og troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) blev tilsat over 90 minutter, derefter sekundære antistoffer (fortyndet 1:200 i 1% BSA) mod mus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), mod kanin Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) i yderligere 90 minutter. Vasket 3 gange med PBS. For at skelne målfarvning fra baggrund anvendte vi kun det sekundære antistof som kontrol. Endelig blev DAPI-nuklearfarvning tilsat, og præparaterne blev placeret i et Vectashield (Vector Laboratories) og forseglet med neglelak. (-x forstørrelse) og et Keyence-mikroskop med 40x forstørrelse.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ved 5 μg/ml i PBS blev anvendt til WGA-farvning og påført fikserede snit i 30 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene blev derefter vasket med PBS, og Sudansort blev tilsat hvert objektglas og inkuberet i 30 minutter. Objektglassene blev derefter vasket med PBS, og Vectashield-indlejringsmedium blev tilsat. Objektglassene blev visualiseret på et Keyence-mikroskop ved 40x forstørrelse.
OCT blev fjernet fra prøverne som beskrevet ovenfor. Efter fjernelse af OCT blev objektglassene nedsænket i Bouins opløsning natten over. Objektglassene blev derefter skyllet med destilleret vand i 1 time og derefter placeret i en Bibrich aloe vera-syre-fuchsinopløsning i 10 minutter. Derefter blev objektglassene vasket med destilleret vand og placeret i en opløsning af 5% phosphomolybdæn/5% phosphowolframsyre i 10 minutter. Uden skylning blev objektglassene overført direkte til anilinblåt-opløsningen i 15 minutter. Derefter blev objektglassene vasket med destilleret vand og placeret i en 1% eddikesyreopløsning i 2 minutter. Objektglassene blev tørret i 200 N ethanol og overført til xylen. Farvede objektglas blev visualiseret ved hjælp af et Keyence-mikroskop med et 10x objektiv. Fibrosearealprocenten blev kvantificeret ved hjælp af Keyence Analyzer-softwaren.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalognummer V13154, i henhold til producentens protokol med nogle ændringer. Især blev en kirurgisk stempel med en diameter på 6 mm anvendt for at sikre ensartet vævsstørrelse under MTT-analysen. Væv blev individuelt udpladet i brøndene i en 12-brønds plade indeholdende MTT-substrat i henhold til producentens protokol. Snittene inkuberes ved 37° C i 3 timer, og det levende væv metaboliserer MTT-substratet til dannelse af en lilla formazanforbindelse. Erstat MTT-opløsningen med 1 ml DMSO og inkuber ved 37° C i 15 minutter for at ekstrahere lilla formazan fra hjertesnit. Prøverne blev fortyndet 1:10 i DMSO i 96-brønds plader med klar bund, og den lilla farveintensitet blev målt ved 570 nm ved hjælp af en Cytation-pladelæser (BioTek). Aflæsningerne blev normaliseret til vægten af ​​hver skive af hjertet.
Hjerteskivemedier blev erstattet med medier indeholdende 1 μCi/ml [5-3H]-glukose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) til glukoseudnyttelsesassay som tidligere beskrevet. Efter 4 timers inkubation tilsættes 100 µl medium til et åbent mikrocentrifugerør indeholdende 100 µl 0,2 N HCl. Derefter blev røret placeret i et scintillationsrør indeholdende 500 μl dH2O for at fordampe [3H]2O i 72 timer ved 37°C. Fjern derefter mikrocentrifugerøret fra scintillationsrøret, og tilsæt 10 ml scintillationsvæske. Scintillationstællinger blev udført ved hjælp af en Tri-Carb 2900TR væskescintillationsanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Glukoseudnyttelsen blev derefter beregnet under hensyntagen til [5-3H]-glukosespecifik aktivitet, ufuldstændig ligevægt og baggrund, fortynding af [5-3H]-til umærket glukose og scintillationstællerens effektivitet. Dataene er normaliseret til massen af ​​hjertesektioner.
Efter vævshomogenisering i Trizol blev RNA isoleret fra hjertesektioner ved hjælp af Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 i henhold til producentens protokol. RNAsec-biblioteksforberedelse, sekventering og dataanalyse blev udført som følger:
1 μg RNA pr. prøve blev anvendt som udgangsmateriale til fremstilling af RNA-biblioteket. Sekventeringsbiblioteker blev genereret ved hjælp af NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit til Illumina (NEB, USA) i henhold til producentens anbefalinger, og indekskoder blev tilføjet til attributsekvenserne for hver prøve. Kort fortalt blev mRNA oprenset fra total RNA ved hjælp af magnetiske perler bundet med poly-T-oligonukleotider. Fragmentering udføres ved hjælp af divalente kationer ved høj temperatur i NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Første streng cDNA blev syntetiseret ved hjælp af tilfældige hexamerprimere og M-MuLV reverse transkriptase (RNase H-). Den anden streng cDNA syntetiseres derefter ved hjælp af DNA polymerase I og RNase H. De resterende overhæng omdannes til stumpe ender ved exonuklease/polymeraseaktivitet. Efter adenylering af 3'-enden af ​​DNA-fragmentet fastgøres en NEBNext Adapter med en hårnåleløkkestruktur til den for at forberede den til hybridisering. Til udvælgelse af cDNA-fragmenter med en foretrukken længde på 150-200 bp. Biblioteksfragmenter blev oprenset ved hjælp af AMPure XP-systemet (Beckman Coulter, Beverly, USA). Derefter blev 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) med størrelsesselekteret cDNA ligeret med en adapter anvendt i 15 minutter ved 37°C og derefter i 5 minutter ved 95°C før PCR. PCR blev derefter udført ved hjælp af Phusion High-Fidelity DNA-polymerase, universelle PCR-primere og Index (X)-primere. Endelig blev PCR-produkterne oprenset (AMPure XP-system), og bibliotekets kvalitet blev vurderet på et Agilent Bioanalyzer 2100-system. cDNA-biblioteket blev derefter sekventeret ved hjælp af en Novaseq-sequencer. Rå billedfiler fra Illumina blev konverteret til rå aflæsninger ved hjælp af CASAVA Base Calling. Rå data gemmes i FASTQ(fq)-formatfiler, der indeholder aflæsningssekvenser og tilsvarende basekvaliteter. Vælg HISAT2 for at matche filtrerede sekventeringsaflæsninger med Sscrofa11.1-referencegenomet. Generelt understøtter HISAT2 genomer af enhver størrelse, inklusive genomer større end 4 milliarder baser, og standardværdier er fastsat for de fleste parametre. Splejsningslæsninger fra RNA Seq-data kan effektivt justeres ved hjælp af HISAT2, det hurtigste system, der er tilgængeligt i øjeblikket, med samme eller bedre nøjagtighed end nogen anden metode.
Transkripternes mængde afspejler direkte niveauet af genekspression. Genekspressionsniveauer vurderes ud fra mængden af ​​transkripter (sekventeringsantal) forbundet med genomet eller exonerne. Antallet af aflæsninger er proportionalt med genekspressionsniveauer, genlængde og sekventeringsdybde. FPKM (fragmenter pr. tusind basepar af sekventeret transkript pr. million basepar) blev beregnet, og P-værdier for differentiel ekspression blev bestemt ved hjælp af DESeq2-pakken. Vi beregnede derefter falsk opdagelsesraten (FDR) for hver P-værdi ved hjælp af Benjamini-Hochberg-metoden9 baseret på den indbyggede R-funktion "p.adjust".
RNA isoleret fra hjertesektioner blev omdannet til cDNA i en koncentration på 200 ng/μl ved hjælp af SuperScript IV Vilo Master mix fra Thermo (Thermo, kat. nr. 11756050). Kvantitativ RT-PCR blev udført ved hjælp af en Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-brønds transparent reaktionsplade (Thermo, kat. nr. 4483319) og microamp optisk klæbemiddel (Thermo, kat. nr. 4311971). Reaktionsblandingen bestod af 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat. nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer og 3,5 µl H2O blandet pr. brønd. Standard qPCR-cyklusser blev kørt, og CT-værdier blev målt ved hjælp af et Applied Biosystems Quantstudio 5 realtids-PCR-instrument (384-brøndsmodul; produkt nr. A28135). Taqman-primere blev købt fra Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT-værdierne for alle prøver blev normaliseret til housekeeping-genet GAPDH.
Mediefrigivelse af NT-ProBNP blev vurderet ved hjælp af NT-ProBNP-kittet (gris) (katalognr. MBS2086979, MyBioSource) i henhold til producentens protokol. Kort fortalt blev 250 µl af hver prøve og standard tilsat i duplikat til hver brønd. Umiddelbart efter tilsætning af prøven tilsættes 50 µl assayreagens A til hver brønd. Ryst forsigtigt pladen og forsegl den med forseglingsmiddel. Derefter blev tabletterne inkuberet ved 37°C i 1 time. Aspirer derefter opløsningen, og vask brøndene 4 gange med 350 µl 1X vaskeopløsning, idet vaskeopløsningen inkuberes i 1-2 minutter hver gang. Tilsæt derefter 100 µl assayreagens B pr. brønd, og forsegl med pladeforsegling. Tabletten blev forsigtigt rystet og inkuberet ved 37°C i 30 minutter. Aspirer opløsningen, og vask brøndene 5 gange med 350 µl 1X vaskeopløsning. Tilsæt 90 µl substratopløsning til hver brønd, og forsegl pladen. Inkuber pladen ved 37°C i 10-20 minutter. Tilsæt 50 µl stopopløsning til hver brønd. Pladen blev straks målt ved hjælp af en Cytation (BioTek) pladelæser indstillet til 450 nm.
Der blev udført styrkeanalyser for at vælge de gruppestørrelser, der vil give >80 % styrke til at detektere en absolut ændring i parameteren på 10 % med en type I-fejlrate på 5 %. Der blev udført styrkeanalyser for at vælge de gruppestørrelser, der vil give >80 % styrke til at detektere en absolut ændring i parameteren på 10 % med en type I-fejlrate på 5 %. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности for обнаружения 10% параметра с 5% частотой ошибок типа I. Der blev udført en styrkeanalyse for at udvælge gruppestørrelser, der ville give >80 % styrke til at detektere 10 % absolut parameterændring med en type I-fejlrate på 5 %.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности for выбора размера группы, который обеспечил бы 80% мощности for обнаружения изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. En styrkeanalyse blev udført for at vælge en gruppestørrelse, der ville give >80 % styrke til at detektere 10 % absolut parameterændring og 5 % type I-fejlrate.Vævssektioner blev tilfældigt udvalgt før eksperimentet. Alle analyser var konditionsblinde, og prøverne blev først afkodet efter at alle data var blevet analyseret. GraphPad Prism-software (San Diego, CA) blev brugt til at udføre alle statistiske analyser. For al statistik blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05. For al statistik blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. For al statistik blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. For al statistik blev p-værdier betragtet som signifikante ved værdier <0,05.Der blev udført en tosidet Student's t-test på dataene med kun 2 sammenligninger. Envejs- eller tovejs-ANOVA blev brugt til at bestemme signifikans mellem flere grupper. Ved udførelse af post hoc-tests blev Tukey's korrektion anvendt for at tage højde for multiple sammenligninger. RNAsec-data har særlige statistiske overvejelser ved beregning af FDR og p.adjust som beskrevet i afsnittet Metoder.
For mere information om studiedesign, se Nature Research Report-resuméet, der er linket til denne artikel.