Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden typografier og JavaScript.
Nye immunologiske og massespektrometriske metoder til kompleks analyse af persistente oligosaccharider i majsstøv forbehandlet med AFEX. Lignocellulosebiomasse er et bæredygtigt alternativ til fossile brændstoffer og anvendes i vid udstrækning til at udvikle bioteknologier til produktion af produkter som fødevarer, foder, brændstoffer og kemikalier. Nøglen til disse teknologier er udviklingen af ​​omkostningskonkurrencedygtige processer til omdannelse af komplekse kulhydrater, der findes i plantecellevægge, til simple sukkerarter såsom glukose, xylose og arabinose. Fordi lignocellulosebiomasse er meget stædig, skal den underkastes termokemiske behandlinger (f.eks. ammoniakfibereksfoliering (AFEX), fortyndede syrer (DA), ioniske væsker (IL)) og biologiske behandlinger (f.eks. enzymatisk hydrolyse og mikrobiel fermentering) i kombination for at opnå det ønskede produkt. Når kommercielle svampeenzymer anvendes i hydrolyseprocessen, er imidlertid kun 75-85% af de dannede opløselige sukkerarter monosaccharider, og de resterende 15-25% er opløselige, vanskelige oligosaccharider, som ikke altid er tilgængelige for mikroorganismer. Tidligere har vi med succes isoleret og renset opløselige, stædige oligosaccharider ved hjælp af en kombination af kulstof- og diatoméjordseparation og størrelseseksklusionskromatografi, og også undersøgt deres enzymhæmmende egenskaber. Vi har fundet ud af, at oligosaccharider indeholdende methylerede uronsyresubstitutioner med højere polymerisationsgrad (DP) er vanskeligere at bearbejde med kommercielle enzymblandinger end oligosaccharider med lav DP og neutrale oligosaccharider. Her rapporterer vi brugen af ​​flere yderligere metoder, herunder glykanprofilering ved hjælp af monoklonale antistoffer (mAb'er) specifikke for plantebiomasseglykaner til at karakterisere glykanbindinger i plantecellevægge og enzymatiske hydrolysater, matrixassisteret laserdesorptionionisering, time-of-flight massespektrometri. MALDI-TOF-MS) bruger strukturinformative diagnostiske toppe opnået ved spektroskopi efter sekundær henfald af negative ioner, gaskromatografi og massespektrometri (GC-MS) til at karakterisere oligosaccharidbindinger med og uden derivatisering. På grund af den lille størrelse af oligosaccharider (DP 4-20) er disse molekyler vanskelige at bruge til mAb-binding og karakterisering. For at overvinde dette problem anvendte vi en ny biotinkonjugationsbaseret oligosaccharidimmobiliseringsmetode, der med succes mærkede størstedelen af ​​lav-DP-opløselige oligosaccharider på mikropladeoverfladen, som derefter blev brugt i et højkapacitets mAb-system til specifik ligeringsanalyse. Denne nye metode vil fremme udviklingen af ​​mere avancerede højkapacitets glykomassays i fremtiden, som kan bruges til at isolere og karakterisere oligosaccharider, der findes i biomarkører, til diagnostiske formål.
Lignocellulosebiomasse, der består af landbrugs-, skovbrugs-, græs- og træmaterialer, er et potentielt råmateriale til produktion af biobaserede produkter, herunder fødevarer, foder, brændstof og kemiske prækursorer, til at producere produkter med højere værdi1. Kulhydrater (såsom cellulose og hemicellulose), der findes i plantecellevægge, depolymeriseres til monosaccharider ved kemisk behandling og biotransformation (såsom enzymatisk hydrolyse og mikrobiel fermentering). Almindelige forbehandlinger omfatter ammoniakfiberekspansion (AFEX), fortyndet syre (DA), ionisk væske (IL) og dampeksplosion (SE), som bruger en kombination af kemikalier og varme til at reducere lignocelluloseproduktionen ved at åbne plantecellevægge3,4. Enzymatisk hydrolyse udføres ved en høj faststofmængde ved hjælp af kommercielle aktive kulhydratholdige enzymer (CAZymer) og mikrobiel fermentering ved hjælp af transgene gær eller bakterier til at producere biobaserede brændstoffer og kemikalier6.
CAZymer i kommercielle enzymer er sammensat af en kompleks blanding af enzymer, der synergistisk spalter komplekse kulhydrat-sukkerbindinger for at danne monosaccharider2,7. Som vi tidligere rapporterede, gør det komplekse netværk af aromatiske polymerer af lignin med kulhydrater dem meget vanskelige at håndtere, hvilket fører til ufuldstændig sukkeromdannelse, hvor 15-25% af kønsoligosacchariderne akkumuleres, som ikke produceres under enzymatisk hydrolyse af den forbehandlede biomasse. Dette er et almindeligt problem med forskellige biomasseforbehandlingsmetoder. Nogle årsager til denne flaskehals inkluderer enzymhæmning under hydrolyse eller fravær eller lave niveauer af essentielle enzymer, der er nødvendige for at bryde sukkerbindinger i plantebiomasse. Forståelse af sammensætningen og de strukturelle egenskaber ved sukkerarter, såsom sukkerbindingerne i oligosaccharider, vil hjælpe os med at forbedre sukkeromdannelsen under hydrolyse, hvilket gør bioteknologiske processer omkostningskonkurrencedygtige med olieafledte produkter.
Bestemmelse af kulhydraters struktur er udfordrende og kræver en kombination af metoder såsom væskekromatografi (LC)11,12, kernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR)13, kapillærelektroforese (CE)14,15,16 og massespektrometri (MS)17. ,atten. MS-metoder såsom time-of-flight-massespektrometri med laserdesorption og ionisering ved hjælp af en matrix (MALDI-TOF-MS) er en alsidig metode til at identificere kulhydratstrukturer. For nylig er kollisionsinduceret dissociation (CID) tandem MS af natriumionaddukter blevet mest anvendt til at identificere fingeraftryk svarende til oligosaccharidbindingspositioner, anomere konfigurationer, sekvenser og forgreningspositioner 20, 21.
Glykananalyse er et fremragende værktøj til dybdegående identifikation af kulhydratbindinger22. Denne metode bruger monoklonale antistoffer (mAb'er) rettet mod plantecellevægsglycan som sonder til at forstå komplekse kulhydratbindinger. Mere end 250 mAb'er er tilgængelige på verdensplan, designet mod forskellige lineære og forgrenede oligosaccharider ved hjælp af forskellige saccharider24. Adskillige mAb'er er blevet brugt i vid udstrækning til at karakterisere strukturen, sammensætningen og modifikationerne af plantecellevæggen, da der er betydelige forskelle afhængigt af plantecelletype, organ, alder, udviklingsstadium og vækstmiljø25,26. For nylig er denne metode blevet brugt til at forstå vesikelpopulationer i plante- og dyresystemer og deres respektive roller i glykantransport som bestemt af subcellulære markører, udviklingsstadier eller miljømæssige stimuli, og til at bestemme enzymatisk aktivitet. Nogle af de forskellige strukturer af glykaner og xylaner, der er blevet identificeret, omfatter pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucaner (XylG), blandede bindingsglukaner (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronsyre-arabinoxylan (GArbX) og arabino-galactan (ArbG)29.
Trods al denne forskningsindsats har kun få undersøgelser fokuseret på arten af ​​oligosakkaridakkumulering under hydrolyse med høj faststofbelastning (HSL), herunder frigivelse af oligosakkarid, ændringer i oligomere kædelængder under hydrolyse, forskellige polymerer med lav DP og deres kurver. 30,31,32. Selvom glykananalyse har vist sig at være et nyttigt værktøj til en omfattende analyse af glykanstrukturen, er det vanskeligt at evaluere vandopløselige oligosakkarider med lav DP ved hjælp af antistofmetoder. Mindre DP-oligosakkarider med en molekylvægt på mindre end 5-10 kDa binder ikke til ELISA-plader 33, 34 og vaskes væk før tilsætning af antistof.
Her demonstrerer vi for første gang et ELISA-assay på avidin-coatede plader ved hjælp af monoklonale antistoffer, der kombinerer en et-trins biotinyleringsprocedure for opløselige refraktære oligosaccharider med glycomanalyse. Vores tilgang til glycomanalyse blev valideret ved MALDI-TOF-MS og GC-MS-baseret analyse af komplementære oligosaccharidbindinger ved hjælp af trimethylsilyl (TMS)-derivatisering af hydrolyserede sukkersammensætninger. Denne innovative tilgang kan udvikles som en højkapacitetsmetode i fremtiden og finde bredere anvendelse inden for biomedicinsk forskning35.
Posttranslationelle modifikationer af enzymer og antistoffer, såsom glycosylering,36 påvirker deres biologiske aktivitet. For eksempel spiller ændringer i glycosylering af serumproteiner en vigtig rolle i inflammatorisk arthritis, og ændringer i glycosylering bruges som diagnostiske markører37. Forskellige glykaner er blevet rapporteret i litteraturen som værende let forekommende i en række forskellige sygdomme, herunder kroniske inflammatoriske sygdomme i mave-tarmkanalen og leveren, virusinfektioner, æggestokke-, bryst- og prostatakræft38,39,40. Forståelse af glykanernes struktur ved hjælp af antistofbaserede glykan-ELISA-metoder vil give yderligere sikkerhed i sygdomsdiagnosen uden brug af komplekse MS-metoder.
Vores tidligere undersøgelse viste, at genstridige oligosaccharider forblev uhydrolyserede efter forbehandling og enzymatisk hydrolyse (figur 1). I vores tidligere publicerede arbejde udviklede vi en fastfaseekstraktionsmetode med aktivt kul til at isolere oligosaccharider fra AFEX-forbehandlet majsstoverhydrolysat (ACSH)8. Efter indledende ekstraktion og separation blev oligosacchariderne yderligere fraktioneret ved størrelseseksklusionskromatografi (SEC) og opsamlet i rækkefølge efter molekylvægt. Sukkermonomerer og oligomerer frigivet fra forskellige forbehandlinger blev analyseret ved sukkersammensætningsanalyse. Ved sammenligning af indholdet af sukkeroligomerer opnået ved forskellige forbehandlingsmetoder er tilstedeværelsen af ​​genstridige oligosaccharider et almindeligt problem i omdannelsen af ​​biomasse til monosaccharider og kan føre til en reduktion i sukkerudbyttet på mindst 10-15 % og endda op til 18 %. Denne metode anvendes til yderligere storskalaproduktion af oligosaccharidfraktioner. Den resulterende ACH og dens efterfølgende fraktioner med forskellige molekylvægte blev brugt som eksperimentelt materiale til karakterisering af oligosaccharider i dette arbejde.
Efter forbehandling og enzymatisk hydrolyse forblev persistente oligosaccharider uhydrolyseret. Her er (A) en oligosaccharidseparationsmetode, hvor oligosaccharider isoleres fra AFEX-forbehandlet majsstoverhydrolysat (ACSH) ved hjælp af et pakket leje af aktivt kul og diatoméjord; (B) Metode til separation af oligosaccharider. Oligosacchariderne blev yderligere separeret ved størrelseseksklusionskromatografi (SEC); (C) Saccharidmonomerer og oligomerer frigivet fra forskellige forbehandlinger (fortyndet syre: DA, ionisk væske: IL og AFEX). Enzymatiske hydrolysebetingelser: højt tørstofindhold på 25% (w/w) (ca. 8% glucanindhold), 96 timers hydrolyse, 20 mg/g kommerciel enzymindhold (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1-forhold) og (D) Sukkermonomerer og oligomerer af glukose, xylose og arabinose frigivet fra AFEX-forbehandlet majsstover (ACS).
Glykananalyse har vist sig at være et nyttigt værktøj til en omfattende strukturel analyse af glykaner i ekstrakter isoleret fra faste biomasserester. Vandopløselige saccharider er dog underrepræsenteret ved brug af denne traditionelle metode41, fordi oligosaccharider med lav molekylvægt er vanskelige at immobilisere på ELISA-plader og vaskes ud før tilsætning af antistof. Derfor blev en et-trins biotinyleringsmetode anvendt til at coate opløselige, ikke-kompatible oligosaccharider på avidin-coatede ELISA-plader til antistofbinding og karakterisering. Denne metode blev testet ved hjælp af vores tidligere producerede ACSH og en fraktion baseret på dens molekylvægt (eller polymerisationsgrad, DP). Et-trins biotinylering blev anvendt til at øge oligosaccharidbindingsaffiniteten ved at tilsætte biotin-LC-hydrazid til den reducerende ende af kulhydratet (fig. 2). I opløsning reagerer hemiacetalgruppen ved den reducerende ende med hydrazidgruppen i biotin-LC-hydrazid for at danne en hydrazonbinding. I nærvær af reduktionsmidlet NaCNBH3 reduceres hydrazonbindingen til et stabilt biotinyleret slutprodukt. Med modifikationen af ​​den sukkerreducerende ende blev binding af lav-DP-oligosaccharider til ELISA-plader mulig, og i vores undersøgelse blev dette udført på avidin-coatede plader ved hjælp af glykan-målrettede mAbs.
Screening af monoklonale antistoffer baseret på ELISA for biotinylerede oligosaccharider. Her (A) kombineres biotinylering af oligosaccharider og efterfølgende ELISA-screening med glykan-målrettede mAb'er på NeutrAvidin-coatede plader, og (B) viser en et-trins procedure til biotinylering af reaktionsprodukter.
Avidin-coatede plader med oligosaccharid-konjugerede antistoffer blev derefter tilsat primære og sekundære antistoffer og vasket i et lys- og tidsfølsomt medium. Efter fuldstændig antistofbinding tilsættes TMB-substrat for at inkubere pladen. Reaktionen blev endelig stoppet med svovlsyre. De inkuberede plader blev analyseret ved hjælp af en ELISA-læser for at bestemme bindingsstyrken af ​​hvert antistof for at detektere antistofspecifik tværbinding. For detaljer og parametre for eksperimentet, se det tilsvarende afsnit "Materialer og metoder".
Vi demonstrerer anvendeligheden af ​​denne nyudviklede metode til specifikke anvendelser ved at karakterisere de opløselige oligosaccharider, der findes i ACSH, såvel som i rå og rensede oligosaccharidfraktioner isoleret fra lignocellulosehydrolysater. Som vist i figur 3 er de mest almindelige epitopsubstituerede xylaner identificeret i ACSH ved hjælp af bioacylerede glycomassaymetoder normalt uronsyre (U) eller methyluronsyre (MeU) og pektinsyrearabinogalactaner. De fleste af dem blev også fundet i vores tidligere undersøgelse af analysen af ​​glykaner fra ikke-hydrolyserede faste stoffer (UHS)43.
Detektion af genstridige oligosaccharidepitoper ved hjælp af et monoklonalt antistof rettet mod cellevægsglykanen. Den "neutrale" fraktion er ACN-fraktionen, og den "sure" fraktion er FA-fraktionen. Lysere røde farver på varmekortet indikerer et højere epitopindhold, og lysere blå farver indikerer en blank baggrund. Farveværdierne på skalaen er baseret på rå OD-værdier for formuleringer N=2. De vigtigste epitoper, der genkendes af antistofferne, er vist til højre.
Disse ikke-cellulosestrukturer kunne ikke spaltes af de mest almindelige cellulaser og hemicellulaser i den testede kommercielle enzymblanding, som inkluderer de mest almindeligt anvendte kommercielle enzymer. Derfor er nye hjælpeenzymer nødvendige til deres hydrolyse. Uden de nødvendige ikke-cellulose-tilbehørsenzymer forhindrer disse ikke-cellulosebindinger fuldstændig omdannelse til monosaccharider, selvom deres modersukkerpolymerer hydrolyseres i vid udstrækning til kortere fragmenter og opløses ved hjælp af kommercielle enzymblandinger.
Yderligere undersøgelser af signalfordeling og dens bindingsstyrke viste, at bindingsepitoper var lavere i sukkerfraktioner med høj DP (A, B, C, DP op til 20+) end i fraktioner med lav DP (D, E, F, DP) i dimerer (fig. 1). Syrefragmenter er mere almindelige i ikke-celluloseepitoper end i neutrale fragmenter. Disse fænomener er i overensstemmelse med det mønster, der blev observeret i vores tidligere undersøgelse, hvor høj DP- og syregrupper var mere resistente over for enzymatisk hydrolyse. Derfor kan tilstedeværelsen af ​​ikke-celluloseglycanepitoper og U- og MeU-substitutioner i høj grad bidrage til oligosaccharidernes stabilitet. Det skal bemærkes, at bindings- og detektionseffektivitet kan være problematisk for oligosaccharider med lav DP, især hvis epitopen er et dimert eller trimert oligosaccharid. Dette kan testes ved hjælp af kommercielle oligosaccharider af forskellig længde, der hver kun indeholder én epitop, der binder til et specifikt mAb.
Brugen af ​​strukturspecifikke antistoffer afslørede således visse typer af genstridige bindinger. Afhængigt af den anvendte type antistof, det passende ligeringsmønster og styrken af ​​det signal, det producerer (mest og mindst rigeligt), kan nye enzymer identificeres og tilsættes semi-kvantitativt til enzymblandingen for en mere fuldstændig glykokonvertering. Med analysen af ​​ACSH-oligosaccharider som eksempel kan vi oprette en database med glykanbindinger for hvert biomassemateriale. Det skal bemærkes her, at antistoffernes forskellige affinitet bør tages i betragtning, og hvis deres affinitet er ukendt, vil dette skabe visse vanskeligheder ved sammenligning af signalerne fra forskellige antistoffer. Derudover kan sammenligning af glykanbindinger fungere bedst mellem prøver for det samme antistof. Disse genstridige bindinger kan derefter linkes til CAZyme-databasen, hvorfra vi kan identificere enzymer, vælge kandidatenzymer og teste for bindingsbrydende enzymer eller udvikle mikrobielle systemer til at udtrykke disse enzymer til brug i bioraffinaderier44.
For at evaluere, hvordan immunologiske metoder supplerer alternative metoder til karakterisering af oligosaccharider med lav molekulær vægt, der findes i lignocellulosehydrolysater, udførte vi MALDI (fig. 4, S1-S8) og analyse af TMS-afledte saccharider baseret på GC-MS på den samme oligosacchariddel (fig. 5). MALDI bruges til at sammenligne, om massefordelingen af ​​oligosaccharidmolekyler matcher den tilsigtede struktur. Fig. 4 viser MS af de neutrale komponenter ACN-A og ACN-B. ACN-A-analyse bekræftede en række pentosesukkerarter fra DP 4-8 (fig. 4) til DP 22 (fig. S1), hvis vægte svarer til MeU-xylan-oligosaccharider. ACN-B-analyse bekræftede pentose- og glucoxylan-serien med DP 8-15. I supplerende materiale, såsom figur S3, viser FA-C-surmolekylets massefordelingskort en række (Me)U-substituerede pentosesukkerarter med en DP på ​​8-15, der er konsistente med de substituerede xylaner, der findes i ELISA-baseret mAb-screening. Epitoperne er konsistente.
MALDI-MS-spektrum af opløselige, ikke-kompatible oligosaccharider til stede i ACS. Her (A) ACN-A lavvægtsfraktioner indeholdende methyleret uronsyre (DP 4-8) substituerede med glucuroxylan-oligosaccharider og (B) ACN-B xylan og methylerede uronsyre-oligosaccharider substitueret med glucuroxylan (DP 8-15).
Analyse af sammensætningen af ​​glykanresten i refraktære oligosaccharider. Her (A) TMS-saccharidsammensætning af forskellige oligosaccharidfraktioner opnået ved hjælp af GC-MS-analyse. (B) Strukturer af forskellige TMS-afledte sukkerarter til stede i oligosaccharider. ACN – acetonitrilfraktion indeholdende neutrale oligosaccharider og FA – ferulinsyrefraktion indeholdende syre-oligosaccharider.
En anden interessant konklusion blev draget fra LC-MS-analysen af ​​oligosaccharidfraktionen, som vist i figur S9 (metoder kan ses i det elektroniske supplerende materiale). Fragmenter af hexose- og -OAc-grupper blev gentagne gange observeret under ligering af ACN-B-fraktionen. Dette fund bekræfter ikke kun den fragmentering, der blev observeret i glycome- og MALDI-TOF-analyse, men giver også ny information om potentielle kulhydratderivater i forbehandlet lignocellulosebiomasse.
Vi udførte også glykansammensætningsanalyse af oligosaccharidfraktioner ved hjælp af TMS-glykanderivatisering. Ved hjælp af GC-MS bestemte vi sammensætningen af ​​neurale (ikke-derivative) og sure sukkerarter (GluA og GalA) i oligosaccharidfraktionen (fig. 5). Glucuronsyre findes i de sure komponenter C og D, mens galacturonsyre findes i de sure komponenter A og B, som begge er komponenter med høj DP i sure sukkerarter. Disse resultater bekræfter ikke kun vores ELISA- og MALDI-data, men er også i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser af oligosaccharidakkumulering. Derfor mener vi, at moderne immunologiske metoder, der bruger biotinylering af oligosaccharider og efterfølgende ELISA-screening, er tilstrækkelige til at detektere opløselige, genstridige oligosaccharider i forskellige biologiske prøver.
Da ELISA-baserede mAb-screeningsmetoder er blevet valideret af flere forskellige metoder, ønskede vi at undersøge potentialet i denne nye kvantitative metode yderligere. To kommercielle oligosaccharider, xylohexasaccharid-oligosaccharid (XHE) og 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), blev købt og testet ved hjælp af en ny mAb-tilgang rettet mod cellevægsglycanen. Figur 6 viser en lineær korrelation mellem det biotinylerede bindingssignal og logaritmisk koncentration af oligosaccharidkoncentrationen, hvilket antyder en mulig Langmuir-adsorptionsmodel. Blandt mAb'erne korrelerede CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 og CCRC-M151 med XHE, og CCRC-M108, CCRC-M109 og LM11 korrelerede med A2XX over et område fra 1 nm til 100 nano. På grund af den begrænsede tilgængelighed af antistoffer under eksperimentet blev der udført begrænsede eksperimenter med hver oligosaccharidkoncentration. Det skal bemærkes her, at nogle antistoffer reagerer meget forskelligt på det samme oligosaccharid som substrat, formodentlig fordi de binder til lidt forskellige epitoper og kan have meget forskellige bindingsaffiniteter. Mekanismerne og implikationerne for nøjagtig epitopidentifikation vil være langt mere komplekse, når den nye mAb-tilgang anvendes på rigtige prøver.
To kommercielle oligosaccharider blev anvendt til at bestemme detektionsområdet for forskellige glykan-målrettede mAb'er. Her indikerer lineære korrelationer med logaritmisk koncentration af oligosaccharidkoncentration Langmuir-adsorptionsmønstre for (A) XHE med mAb og (B) A2XX med mAb. De tilsvarende epitoper indikerer strukturerne af de kommercielle oligosaccharider, der blev anvendt som substrater i assayet.
Brugen af ​​glykan-målrettede monoklonale antistoffer (glykokomisk analyse eller ELISA-baseret mAb-screening) er et effektivt værktøj til dybdegående karakterisering af de fleste af de vigtigste cellevægsglykaner, der udgør plantebiomasse. Klassisk glykananalyse karakteriserer dog kun større cellevægsglykaner, da de fleste oligosaccharider ikke immobiliseres effektivt på ELISA-plader. I denne undersøgelse blev AFEX-forbehandlet majsstøv enzymatisk hydrolyseret ved et højt tørstofindhold. Sukkeranalyse blev brugt til at bestemme sammensætningen af ​​​​genstridige cellevægskulhydrater i hydrolysatet. mAb-analyse af mindre oligosaccharider i hydrolysater er imidlertid undervurderet, og yderligere værktøjer er nødvendige for effektivt at immobilisere oligosaccharider på ELISA-plader.
Vi rapporterer her en ny og effektiv oligosaccharid-immobiliseringsmetode til mAb-screening ved at kombinere oligosaccharidbiotinylering efterfulgt af ELISA-screening på NeutrAvidin™-coatede plader. De immobiliserede biotinylerede oligosaccharider udviste tilstrækkelig affinitet for antistoffet til at muliggøre hurtig og effektiv detektion af genstridige oligosaccharider. Analyse af sammensætningen af ​​disse genstridige oligosaccharider baseret på massespektrometri bekræftede resultaterne af denne nye tilgang til immunscreening. Disse undersøgelser viser således, at kombinationen af ​​oligosaccharidbiotinylering og ELISA-screening med glykan-målrettede monoklonale antistoffer kan bruges til at detektere tværbindinger i oligosaccharider og kan anvendes i vid udstrækning i andre biokemiske undersøgelser, der karakteriserer strukturen af ​​oligosaccharider.
Denne biotinbaserede glykanprofileringsmetode er den første rapport, der er i stand til at undersøge de genstridige kulhydratbindinger i opløselige oligosaccharider i plantebiomasse. Dette hjælper med at forstå, hvorfor nogle dele af biomasse er så genstridige, når det kommer til produktion af biobrændstof. Denne metode udfylder et vigtigt hul i glykomanalysemetoder og udvider dens anvendelse til en bredere vifte af substrater ud over planteoligosaccharider. I fremtiden kan vi bruge robotteknologi til biotinylering og anvende den metode, vi har udviklet til højkapacitetsanalyse af prøver ved hjælp af ELISA.
Majsstrå (CS) dyrket fra Pioneer 33A14 hybridfrø blev høstet i 2010 fra Kramer Farms i Ray, Colorado. Med tilladelse fra grundejeren kan denne biomasse bruges til forskning. Prøverne blev opbevaret tørt < 6% fugtighed i lynlåsposer ved stuetemperatur. Prøverne blev opbevaret tørt < 6% fugtighed i lynlåsposer ved stuetemperatur. Besparelser på systemer til dækning < 6 % i dækning af elektricitetsteknologi. Prøverne blev opbevaret tørt ved <6% luftfugtighed i lynlåsposer ved stuetemperatur.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Optimal drift i forbindelse med sikringsanlæg < 6 %. Prøverne opbevares i lynlåsposer ved stuetemperatur med en luftfugtighed på < 6%.Undersøgelsen overholdt lokale og nationale retningslinjer. Sammensætningsanalyse blev udført ved hjælp af NREL-protokollen. Sammensætningen viste sig at indeholde 31,4% glucan, 18,7% xylan, 3,3% arabinan, 1,2% galactan, 2,2% acetyl, 14,3% lignin, 1,7% protein og 13,4% aske.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) er en kompleks blanding af cellulase, β-glucosidase og Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) fra Novozymes (Franklinton, NC, USA)). Multifect Pectinase® (72 mg protein/ml), en kompleks blanding af pektin-nedbrydende enzymer, blev doneret af DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Enzymproteinkoncentrationer blev bestemt ved at estimere proteinindholdet (og fratrække bidraget af ikke-proteinnitrogen) ved hjælp af Kjeldahl-nitrogenanalyse (AOAC-metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Diatoméjord 545 blev købt fra EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivt kul (DARCO, 100 mesh granulat), Avicel (PH-101), bøgexylan og alle andre kemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-forbehandling blev udført på GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Forbehandlingen blev udført ved 140 °C i 15 minutter. 46 opholdstid ved et 1:1 forhold mellem vandfri ammoniak og biomasse ved 60 % (w/w) belastning i en rustfri stål benchtop batchreaktor (Parr Instruments Company). Det tog 30 minutter. Reaktoren blev bragt til 140 °C, og ammoniakken blev hurtigt frigivet, hvilket tillod biomassen hurtigt at vende tilbage til stuetemperatur. Sammensætningen af ​​AFEX-forbehandlet majsstøv (ACS) svarede til sammensætningen af ​​ubehandlet majsstøv (UT-CS).
ACSH med højt tørstofindhold 25% (w/w) (ca. 8% dextranbelastning) blev fremstillet som udgangsmateriale til storskalaproduktion af oligosaccharider. Enzymatisk hydrolyse af ACS blev udført ved hjælp af en kommerciel enzymblanding, herunder Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (i forbehandlet biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan og Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg protein/g dextran. Enzymatisk hydrolyse blev udført i en 5-liters bioreaktor med et arbejdsvolumen på 3 liter, pH 4,8, 50°C og 250 rpm. Efter hydrolyse i 96 timer blev hydrolysatet opsamlet ved centrifugering ved 6000 rpm i 30 minutter og derefter ved 14000 rpm i 30 minutter for at fjerne uhydrolyserede faste stoffer. Hydrolysatet blev derefter sterilfiltreret gennem et 0,22 mm filterbægerglas. Det filtrerede hydrolysat blev opbevaret i sterile flasker ved 4°C og derefter fraktioneret på kul.
Analyse af sammensætningen af ​​ekstraktbaserede biomasseprøver i henhold til NREL's laboratorieanalyseprocedurer: forberedelse af prøver til sammensætningsanalyse (NREL/TP-510-42620) og bestemmelse af strukturelle kulhydrater og lignin i biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosaccharidanalyse af hydrolysatstrømmen blev udført på en 2 ml skala ved hjælp af en autoklavebaseret syrehydrolysemetode. Bland hydrolysatprøven med 69,7 µl 72% svovlsyre i et 10 ml skruelågkulturrør og inkuber i 1 time på en bordplade ved 121 °C, afkøl på is og filtrer over i et højtydende væskekromatografi (HPLC) hætteglas. Koncentrationen af ​​oligosaccharider blev bestemt ved at subtrahere koncentrationen af ​​monosaccharider i den ikke-hydrolyserede prøve fra den samlede sukkerkoncentration i den syrehydrolyserede prøve.
Glukose-, xylose- og arabinosekoncentrationer i den syrehydrolyserede biomasse blev analyseret ved hjælp af et Shimadzu HPLC-system udstyret med en autosampler, kolonnevarmer, isokratisk pumpe og brydningsindeksdetektor på en Bio-Rad Aminex HPX-87H-søjle. Søjlen blev holdt ved 50 °C og elueret med 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 i vand.
Hydrolysatsupernatanten blev fortyndet og analyseret for monomer- og oligosaccharidindhold. Monomere sukkerarter opnået efter enzymatisk hydrolyse blev analyseret ved HPLC udstyret med en Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-søjle og en askebeskyttelsessøjle. Søjletemperaturen blev holdt ved 80 °C, vand blev anvendt som mobil fase med en flowhastighed på 0,6 ml/min. Oligosaccharider blev bestemt ved hydrolyse i fortyndet syre ved 121 °C i henhold til metoderne beskrevet i ref. 41, 48, 49.
Saccharidanalyse blev udført på rå, AFEX-forbehandlede og alle ikke-hydrolyserede biomasserester (inklusive produktion af serielle cellevægsekstrakter og deres mAb-screening) ved hjælp af tidligere beskrevne procedurer 27, 43, 50, 51. Til glykomanalyse fremstilles alkoholuopløselige rester af plantecellevægsmateriale fra biomasserester og underkastes seriel ekstraktion med stadig mere aggressive reagenser såsom ammoniumoxalat (50 mM), natriumcarbonat (50 mM og 0,5% w/v), CON. (1M og 4M, begge med 1% w/v natriumborhydrid) og syreklorit som tidligere beskrevet 52,53. Ekstrakterne blev derefter underkastet ELISA mod et komplekst panel af mAb50'er rettet mod cellevægsglycanen, og mAb-bindingsreaktionerne blev præsenteret som et varmekort. mAb'er rettet mod plantecellevægsglycan blev købt fra laboratorielagre (CCRC-, JIM- og MAC-serien).
Biotinylering af oligosaccharider i ét trin. Konjugeringen af ​​kulhydrater med biotin-LC-hydrazid blev udført ved hjælp af følgende procedure. Biotin-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO, 70 μl) ved kraftig omrøring og opvarmning ved 65°C i 1 minut. Iseddikesyre (30 μl) blev tilsat, og blandingen blev hældt på natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 μmol) og fuldstændigt opløst efter opvarmning ved 65°C i ca. 1 minut. Derefter blev 5 til 8 μl af reaktionsblandingen tilsat det tørrede oligosaccharid (1-100 nmol) for at opnå et 10 gange eller mere molært overskud af mærket i forhold til den reducerende ende. Reaktionen blev udført ved 65°C i 2 timer, hvorefter prøverne straks blev oprenset. Der blev ikke anvendt natriumcyanoborhydrid i mærkningsforsøgene uden reduktion, og prøverne blev reageret ved 65 °C i 2,5 timer.
ELISA-coating og vask af prøver af biotinylerede oligosaccharider. 25 μl biotinylerede prøver (100 μl af hver koncentreret prøve fortyndet i 5 ml 0,1 M Tris-bufferopløsning (TBS)) blev tilsat til hver brønd i den avidin-coatede plade. Kontrolbrønde blev coatet med 50 μl biotin i en koncentration på 10 μg/ml i 0,1 M TBS. Deioniseret vand blev brugt som coating til blindmålinger. Tabletten blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur i mørke. Vask pladen 3 gange med 0,1% skummetmælk i 0,1 M TBS ved hjælp af program nr. 11 til Grenier flat 3A.
Tilsætning og vask af primære antistoffer. Tilsæt 40 ​​µl primært antistof til hver brønd. Inkuber mikropladen i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Pladerne blev derefter vasket 3 gange med 0,1% mælk i 0,1M TBS ved hjælp af vaskeprogram #11 til Grenier Flat 3A.
Tilsæt sekundært antistof og vask. Tilsæt 50 µl mus/rotte sekundært antistof (fortyndet 1:5000 i 0,1% mælk i 0,1 M TBS) til hver brønd. Inkuber mikropladen i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Mikropladerne blev derefter vasket 5 gange med 0,1% mælk i 0,1 M TBS ved hjælp af Grenier Flat 5A pladevaskeprogram #12.
Tilsætning af substrat. Tilsæt 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) til basissubstratet (ved at tilsætte 2 dråber buffer, 3 dråber TMB og 2 dråber hydrogenperoxid til 15 ml deioniseret vand). Forbered TMB-substratet og vortex-bland før brug. Inkuber mikropladen ved stuetemperatur i 30 minutter. I mørke.
Færdiggør trinnet og aflæs tabletten. Tilsæt 50 µl 1 N svovlsyre til hver brønd og registrer absorbansen fra 450 til 655 nm ved hjælp af en ELISA-aflæser.
Forbered 1 mg/ml opløsninger af disse analytter i deioniseret vand: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonsyre (GalA), glucuronsyre (GlcA), mannose, glucose, galactose, laktose, N-acetylmannosamin (manNAc), N-acetylglucosamin (glcNAc), N-acetylgalactosamin (galNAc), inositol (intern standard). To standarder blev fremstillet ved at tilsætte de 1 mg/ml sukkeropløsninger, der er vist i tabel 1. Prøverne fryses og frysetørres ved -80° C, indtil alt vand er fjernet (normalt ca. 12-18 timer).
Tilsæt 100-500 µg prøve til skruelågsrør på en analysevægt. Registrer den tilsatte mængde. Det er bedst at opløse prøven i en specifik koncentration af opløsningsmiddel og tilsætte den til røret som en flydende aliquot. Brug 20 µl 1 mg/ml inositol som intern standard for hvert prøverør. Mængden af ​​intern standard, der tilsættes prøven, skal være den samme som mængden af ​​intern standard, der tilsættes standardrøret.
Tilsæt 8 ml vandfri methanol til et hætteglas med skruelåg. Derefter tilsættes 4 ml 3 N methanolisk HCl-opløsning, lukkes og rystes. Denne proces bruger ikke vand.
Tilsæt 500 µl 1 M HCl-metanolopløsning til oligosaccharidprøverne og standard TMS-rør. Prøverne blev inkuberet natten over (168 timer) ved 80° C i en termisk blok. Tør metanolyseproduktet ved stuetemperatur ved hjælp af en tørremanifold. Tilsæt 200 µl MeOH og tør igen. Denne proces gentages to gange. Tilsæt 200 µl methanol, 100 µl pyridin og 100 µl eddikesyreanhydrid til prøven og bland godt. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 30 minutter og tør dem. Tilsæt 200 µl methanol og tør igen.
Tilsæt 200 µl Tri-Sil, og varm røret op i 20 minutter. Opvarm til 80 °C, og afkøl derefter til stuetemperatur. Brug en tørremanifold til at tørre prøven yderligere til et volumen på ca. 50 µl. Det er vigtigt at bemærke, at vi ikke lod prøverne tørre helt.
Tilsæt 2 ml hexan og bland godt ved vortexing. Fyld spidserne af Pasteur-pipetter (5-8 mm) med et stykke glasuld ved at indsætte glasulden oven på en pipette med en diameter på 5-3/4 tommer. Prøverne blev centrifugeret ved 3000 g i 2 minutter. Eventuelle uopløselige rester udfældes. Tør prøven til 100-150 µl. Et volumen på ca. 1 μl blev injiceret i GC-MS ved en starttemperatur på 80 °C og en starttid på 2,0 minutter (Tabel 2).