Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com. Die von Ihnen verwendete Browserversion bietet eingeschränkte Unterstützung für CSS. Für ein optimales Erlebnis empfehlen wir Ihnen, einen aktualisierten Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren). Um weiterhin Unterstützung zu gewährleisten, zeigen wir die Website in der Zwischenzeit ohne Stile und JavaScript an.
Die Morphogenese des menschlichen Darms etabliert Kryptazotten-Merkmale der 3D-Epithel-Mikroarchitektur und der räumlichen Organisation. Diese einzigartige Struktur ist erforderlich, um die Darmhomöostase aufrechtzuerhalten, indem sie die Stammzellnische in der Basalkrypta vor exogenen mikrobiellen Antigenen und ihren Metaboliten schützt. Darüber hinaus präsentieren Darmzotten und sekretierender Schleim funktionell differenzierte Epithelzellen mit einer Schutzbarriere auf der Darmschleimhautoberfläche. Daher ist die Wiederherstellung von 3D-Epithelstrukturen von entscheidender Bedeutung für den Aufbau von In-vitro-Darmmodelle. Insbesondere kann der organische mimetische Darm-on-a-Chip eine spontane 3D-Morphogenese des Darmepithels mit verbesserten physiologischen Funktionen und Biomechanik induzieren. Hier stellen wir ein reproduzierbares Protokoll zur robusten Induktion der Darmmorphogenese im Darm auf einem Mikrofluidik-Chip sowie in einem eingebetteten Transwell-Hybridchip bereit. Wir beschreiben detaillierte Methoden zur Geräteherstellung und Kultivierung von Caco-2- oder intestinalen organoiden Epithelzellen in herkömmlichen Umgebungen sowie auf einem Mikrofluidische Plattform, Induktion der 3D-Morphogenese und Charakterisierung etablierter 3D-Epithelien unter Verwendung mehrerer Bildgebungsmodalitäten. Dieses Protokoll erreicht die Regeneration der funktionellen Darmmikroarchitektur durch die Steuerung des basolateralen Flüssigkeitsflusses für 5 Tage. Unsere In-vitro-Morphogenesemethode nutzt physiologisch relevante Scherspannung und mechanische Bewegung und erfordert keine komplexe Zelltechnik oder -manipulation, die andere bestehende Techniken übertreffen könnte. Wir gehen davon aus, dass unser vorgeschlagenes Protokoll weitreichende Auswirkungen auf die biomedizinische Forschungsgemeinschaft haben könnte, indem es eine Methode bereitstellt zur Regeneration von 3D-Darmepithelschichten in vitro für biomedizinische, klinische und pharmazeutische Anwendungen.
Experimente zeigen, dass intestinale epitheliale Caco-2-Zellen, die in Darm-on-a-Chip-1,2,3,4,5 oder zweischichtigen mikrofluidischen Geräten6,7 kultiviert werden, in vitro eine spontane 3D-Morphogenese durchlaufen können, ohne den zugrunde liegenden Mechanismus klar zu verstehen. In unserer aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass die Entfernung basolateral sezernierter Morphogenantagonisten aus Kulturgeräten notwendig und ausreichend ist, um die 3D-Epithelmorphogenese in vitro zu induzieren, was von Caco-2 und dem Patienten nachgewiesen wurde -abgeleitete Darmorganoide.Epithelzellen wurden validiert. In dieser Studie konzentrierten wir uns speziell auf die Zellproduktion und Konzentrationsverteilung eines starken Wnt-Antagonisten, Dickkopf-1 (DKK-1), in Darm-on-a-Chip- und modifizierten mikrofluidischen Geräten mit Transwell-Einsätzen, genannt „Hybrid Chip“. Chip-Darm hemmt die Morphogenese oder stört die vorstrukturierte 3D-Epithelschicht, was darauf hindeutet, dass antagonistischer Stress während der Kultur für die intestinale Morphogenese in vitro verantwortlich ist. Daher besteht ein praktischer Ansatz zur Erzielung einer robusten Morphogenese an der Epithelschnittstelle darin, die Konzentrationen von Wnt-Antagonisten im basolateralen Kompartiment durch aktives Spülen (z. B. in Darm-on-a-Chip- oder Hybrid-on-a-Chip-Plattformen) oder Diffusion zu entfernen oder minimal aufrechtzuerhalten. Basolaterale Medien (z. B. von Transwell-Einsätzen in große basolaterale Reservoirs in Bohrlöchern).
In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Methode zur Herstellung von Darm-on-a-Chip-Mikrogeräten und Transwell-insertierbaren Hybridchips (Schritte 1-5) zur Kultur von Darmepithelzellen auf Polydimethylsiloxan (PDMS)-basierten porösen Membranen (Schritte 6A, 7A, 8, 9) oder Polyestermembranen von Transwell-Einsätzen (Schritte 6B, 7B, 8, 9) und zur induzierten 3D-Morphogenese in vitro (Schritt 10) bereit ).Wir haben auch zelluläre und molekulare Merkmale identifiziert, die auf eine gewebespezifische Histogenese und abstammungsabhängige Zelldifferenzierung hinweisen, indem wir mehrere Bildgebungsmodalitäten angewendet haben (Schritte 11–24). Wir induzieren die Morphogenese mithilfe menschlicher Darmepithelzellen wie Caco-2 oder Darmorganoiden in zwei Kulturformaten mit technischen Details, einschließlich Oberflächenmodifikation poröser Membranen, Schaffung von 2D-Monoschichten sowie intestinaler biochemischer und Reproduktion der biomechanischen Mikroumgebung.in vitro. Um die 3D-Morphogenese aus 2D-Epithelmonoschichten zu induzieren, haben wir Morphogenantagonisten in beiden Kulturformen entfernt, indem wir das Medium in das basolaterale Kompartiment der Kultur fließen ließen. Abschließend stellen wir die Nützlichkeit einer regenerierbaren 3D-Epithelschicht dar, die zur Modellierung von morphogenabhängigem Epithelwachstum, longitudinalen Wirt-Mikrobiom-Kokulturen, Pathogeninfektionen, entzündlichen Verletzungen, Funktionsstörungen der Epithelbarriere und probiotischen Therapien verwendet werden kann Beispielhafte Einflüsse.
Unser Protokoll kann für ein breites Spektrum von Wissenschaftlern in der Grundlagenforschung (z. B. Darmschleimhautbiologie, Stammzellbiologie und Entwicklungsbiologie) und angewandten Forschung (z. B. präklinische Arzneimitteltests, Krankheitsmodellierung, Tissue Engineering und Gastroenterologie) von großem Nutzen sein. Aufgrund der Reproduzierbarkeit und Robustheit unseres Protokolls zur Induktion der 3D-Morphogenese des Darmepithels in vitro gehen wir davon aus, dass unsere technische Strategie an Zielgruppen weitergegeben werden kann, die die Dynamik von untersuchen Zellsignalisierung während der Darmentwicklung, Regeneration oder Homöostase. Darüber hinaus ist unser Protokoll nützlich für die Untersuchung von Infektionen durch verschiedene Infektionserreger wie Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 oder Vibrio cholerae.Zielgruppen für Krankheitspathologie und Pathogenese sind ebenfalls nützlich. Die Verwendung eines On-Chip-Darmmikrophysiologiesystems kann eine longitudinale Co-Kultur 10 und eine anschließende Beurteilung der Abwehr des Wirts, der Immunantworten und der Reparatur von pathogenbedingten Verletzungen im Magen-Darm-Trakt (GI) 11 ermöglichen. Andere GI-Erkrankungen im Zusammenhang mit Leaky-Gut-Syndrom, Zöliakie, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Pouchitis oder Reizdarmsyndrom können simuliert werden, wenn 3D-Darmepithelschichten am Patienten erstellt werden Aufgrund der 3D-Darmepithelschichten umfassen diese Erkrankungen Zottenatrophie, Kryptaverkürzung, Schleimhautschädigung oder beeinträchtigte Epithelbarriere. Biopsie oder aus Stammzellen gewonnene Darmorganoide12,13. Um die höhere Komplexität der Krankheitsumgebung besser zu modellieren, können Leser erwägen, krankheitsrelevante Zelltypen, wie z.gewebespezifische Immunzellen, 5.
Da die 3D-Mikrostruktur des Epithels ohne den Schnittprozess fixiert und visualisiert werden kann, könnten Betrachter, die sich mit räumlicher Transkriptomik und hochauflösender oder superauflösender Bildgebung beschäftigen, an unserer Kartierung der räumlich-zeitlichen Dynamik von Genen und Proteinen in Epithelnischen interessiert sein.Interessiert an Technologie. Reaktion auf mikrobielle oder Immunreize. Darüber hinaus kann in der 3D-Darmschleimhautschicht durch Co-Kultivierung verschiedener mikrobieller Arten, mikrobieller Gemeinschaften oder fäkaler Mikrobiota, insbesondere im Darm-on-a-Chip, ein longitudinaler Wirt-Mikrobiom-Crosstalk 10, 14 etabliert werden, der die Darmhomöostase koordiniert.in der Plattform. Dieser Ansatz ist besonders attraktiv für Zielgruppen, die Schleimhautimmunologie, Gastroenterologie, menschliches Mikrobiom, Kulturomik und klinische Mikrobiologie studieren und zuvor nicht kultivierte Darmmikrobiota im Labor kultivieren möchten. Wenn unser In-vitro-Morphogeneseprotokoll an skalierbare Kulturformate angepasst werden kann, wie z. B. Multiwell-Einsätze in 24-, 96- oder 384-Well-Platten, die basolaterale Kompartimente kontinuierlich auffüllen, kann das Protokoll auch an diejenigen weitergegeben werden, die sich entwickeln pharmazeutische, biomedizinische oder Hochdurchsatz-Screening- oder Validierungsplattformen für die Lebensmittelindustrie. Als Grundsatzbeweis haben wir kürzlich die Machbarkeit eines Multiplex-Hochdurchsatz-Morphogenesesystems demonstriert, das auf ein 24-Well-Plattenformat skalierbar ist. Darüber hinaus wurden mehrere Organ-on-a-Chip-Produkte kommerzialisiert16,17,18. Daher kann die Validierung unserer In-vitro-Morphogenesemethode beschleunigt und möglicherweise von vielen Forschungslabors und der Industrie übernommen werden oder Regierungs- und Aufsichtsbehörden, um die zelluläre Neuprogrammierung der In-vitro-Darmmorphogenese auf transkriptomischer Ebene zu verstehen, um Arzneimittel oder Biotherapeutika zu testen. Die Absorption und der Transport von Arzneimittelkandidaten wurden mithilfe von 3D-Darmsurrogaten oder mithilfe benutzerdefinierter oder kommerzieller Organ-on-a-Chip-Modelle bewertet, um die Reproduzierbarkeit des Darmmorphogeneseprozesses zu bewerten.
Eine begrenzte Anzahl humanrelevanter experimenteller Modelle wurde zur Untersuchung der intestinalen Epithelmorphogenese verwendet, hauptsächlich aufgrund des Mangels an umsetzbaren Protokollen zur Induktion der 3D-Morphogenese in vitro. Tatsächlich basiert ein Großteil des aktuellen Wissens über die Darmmorphogenese auf Tierstudien (z. B. Zebrafisch20, Mäuse21 oder Hühner22). Sie sind jedoch arbeits- und kostenintensiv, können ethisch fragwürdig sein und, was am wichtigsten ist, sie bestimmen menschliche Entwicklungsprozesse nicht genau. Diese Modelle sind auch in ihrer Fähigkeit, auf mehrfach skalierbare Weise getestet zu werden, sehr begrenzt. Daher übertrifft unser Protokoll zur Regeneration von 3D-Gewebestrukturen in vitro sowohl In-vivo-Tiermodelle als auch andere traditionelle statische 2D-Zellkulturmodelle. Wie bereits beschrieben, ermöglichte uns die Verwendung von 3D-Epithelstrukturen, die räumliche Lokalisierung differenzierter Zellen in der Krypta-Zotten-Achse als Reaktion auf verschiedene Schleimhaut- oder Immunreize zu untersuchen. 3D-Epithelschichten können einen Raum bieten, um zu untersuchen, wie mikrobielle Zellen um die Bildung räumlicher Nischen konkurrieren und ökologische Evolution als Reaktion auf Wirtsfaktoren (z. B. innere versus äußere Schleimschichten, Sekretion von IgA und antimikrobiellen Peptiden). Darüber hinaus kann uns die 3D-Epithelmorphologie ermöglichen zu verstehen, wie die Darmmikrobiota ihre Gemeinschaften strukturiert und synergetisch mikrobielle Metaboliten (z. B. kurzkettige Fettsäuren) produziert, die die Zellorganisation und Stammzellnischen in den Basalkrypten formen. Diese Merkmale können nur gezeigt werden, wenn 3D-Epithelschichten in vitro etabliert werden.
Zusätzlich zu unserer Methode zur Erstellung von 3D-Darmepithelstrukturen gibt es mehrere In-vitro-Methoden. Die intestinale Organoidkultur ist eine hochmoderne Tissue-Engineering-Technik, die auf der Kultivierung von Darmstammzellen unter spezifischen Morphogenbedingungen basiert.23,24,25 exogene Antigene ist begrenzt.Der Zugang zu Organoidlumen kann mithilfe eines Mikroinjektors verbessert werden,26,27. Diese Methode ist jedoch invasiv und arbeitsintensiv und erfordert spezielle Kenntnisse zur Durchführung. Darüber hinaus spiegeln herkömmliche Organoidkulturen, die in Hydrogelgerüsten unter statischen Bedingungen gehalten werden, die aktive In-vivo-Biomechanik nicht genau wider.
Andere von mehreren Forschungsgruppen verwendete Ansätze nutzen vorstrukturierte 3D-Hydrogelgerüste, um die Darmepithelstruktur nachzuahmen, indem sie isolierte menschliche Darmzellen auf der Geloberfläche kultivieren. Stellen Sie Hydrogelgerüste unter Verwendung von 3D-gedruckten, mikrogefrästen oder lithographisch gefertigten Formen her Stromazellen im Gerüst. Die Natur vorstrukturierter Gerüste kann jedoch die Darstellung des spontanen morphogenetischen Prozesses selbst verhindern. Diese Modelle bieten auch keinen dynamischen luminalen oder interstitiellen Fluss, da ihnen die Flüssigkeitsscherspannung fehlt, die Darmzellen benötigen, um Morphogenese zu durchlaufen und physiologische Funktion zu erlangen. In einer anderen aktuellen Studie wurden Hydrogelgerüste in einer mikrofluidischen Plattform verwendet und Darmepithelstrukturen mithilfe von Laserätztechniken strukturiert. Darmorganoide von Mäusen folgen geätzten Mustern, um Darm zu bilden Röhrenförmige Strukturen und der intraluminale Flüssigkeitsfluss können mithilfe eines Mikrofluidikmoduls rekapituliert werden. Dieses Modell weist jedoch weder spontane morphogenetische Prozesse auf noch umfasst es mechanobiologische Bewegungen des Darms. 3D-Drucktechniken derselben Gruppe konnten Miniatur-Darmröhren mit spontanen morphogenetischen Prozessen erstellen. Trotz der komplexen Herstellung verschiedener Darmsegmente innerhalb der Röhre fehlen diesem Modell auch luminaler Flüssigkeitsfluss und mechanische Verformung. Darüber hinaus kann die Bedienbarkeit des Modells eingeschränkt sein, insbesondere nach Abschluss des Bioprinting-Prozesses, was experimentell störend ist Bedingungen oder Zell-zu-Zell-Interaktionen. Stattdessen bietet unser vorgeschlagenes Protokoll spontane Darmmorphogenese, physiologisch relevante Scherspannung, Biomechanik, die die Darmmotilität nachahmt, Zugänglichkeit unabhängiger apikaler und basolateraler Kompartimente und die Wiederherstellung komplexer biologischer Mikroumgebungen mit Modularität. Daher kann unser In-vitro-3D-Morphogeneseprotokoll einen ergänzenden Ansatz zur Bewältigung der Herausforderungen bestehender Methoden bieten.
Unser Protokoll konzentriert sich ausschließlich auf die 3D-Epithelmorphogenese, wobei nur Epithelzellen in Kultur sind und keine anderen Arten von umgebenden Zellen wie mesenchymale Zellen, Endothelzellen und Immunzellen vorhanden sind. Wie bereits beschrieben, ist der Kern unseres Protokolls die Induktion der Epithelmorphogenese durch Entfernen von Morphogeninhibitoren, die auf der basolateralen Seite des eingeführten Mediums abgesondert werden Die wellenförmige 3D-Epithelschicht, zusätzliche biologische Komplexitäten wie epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen33,34, die Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM)35 und, in unserem Modell, Krypta-Zotten-Merkmale, die Stammzellnischen in basalen Krypten vermitteln, müssen noch weiter berücksichtigt werden. Stromazellen (z. B. Fibroblasten) im Mesenchym spielen eine Schlüsselrolle bei der Produktion von ECM-Proteinen und der Regulierung der Darmmorphogenese in vivo35,37. 38. Die Hinzufügung von mesenchymalen Zellen zu unserem Modell verbesserte den morphogenetischen Prozess und die Effizienz der Zellanheftung. Die Endothelschicht (d. h. Kapillaren oder Lymphgefäße) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des molekularen Transports39 und der Rekrutierung von Immunzellen40 in der Mikroumgebung des Darms. Darüber hinaus sind Gefäßkomponenten, die zwischen Gewebemodellen verbunden werden können, eine Voraussetzung, wenn Gewebemodelle zur Demonstration von Interaktionen zwischen mehreren Organen entworfen werden sollen. Daher müssen möglicherweise Endothelzellen einbezogen werden, um ein genaueres Modell zu erstellen physiologische Merkmale mit Auflösung auf Organebene. Vom Patienten stammende Immunzellen sind auch für die Darstellung angeborener Immunantworten, die Antigenpräsentation, den angeborenen adaptiven Immun-Crosstalk und die gewebespezifische Immunität im Zusammenhang mit der Nachahmung von Darmerkrankungen unerlässlich.
Die Verwendung von Hybridchips ist einfacher als die von Darm-on-a-Chip, da der Geräteaufbau einfacher ist und die Verwendung von Transwell-Einsätzen eine skalierbare Kultivierung von Darmepithel ermöglicht. Im Handel erhältliche Transwell-Einsätze mit Polyestermembranen sind jedoch nicht elastisch und können keine peristaltischen Bewegungen simulieren. Darüber hinaus blieb das apikale Kompartiment des im Hybridchip platzierten Transwell-Einsatzes stationär und es gab keine Scherspannung auf der apikalen Seite. Offensichtlich ermöglichen die statischen Eigenschaften im apikalen Kompartiment selten eine Langzeit- Begriff bakterielle Kokultur in Hybridchips. Während wir bei Verwendung von Hybridchips die 3D-Morphogenese in Transwell-Einsätzen robust induzieren können, kann der Mangel an physiologisch relevanter Biomechanik und apikalem Flüssigkeitsfluss die Machbarkeit von Hybridchipplattformen für potenzielle Anwendungen einschränken.
Vollständige Rekonstruktionen der menschlichen Krypta-Zotten-Achse in Darm-on-a-Chip- und Hybrid-on-a-Chip-Kulturen sind noch nicht vollständig etabliert. Da die Morphogenese von einer epithelialen Monoschicht ausgeht, weisen 3D-Mikroarchitekturen nicht unbedingt eine morphologische Ähnlichkeit mit Krypten in vivo auf. Obwohl wir die proliferierende Zellpopulation in der Nähe der basalen Kryptadomäne im mikrotechnisch hergestellten 3D-Epithel charakterisierten, waren die Krypta- und Zottenregionen nicht eindeutig dem bogenförmig.Obwohl höhere obere Kanäle auf dem Chip zu einer größeren Höhe des mikrotechnisch hergestellten Epithels führen, ist die maximale Höhe immer noch auf ~300–400 µm begrenzt. Die tatsächliche Tiefe menschlicher Darmkrypten im Dünn- und Dickdarm beträgt ~135 µm bzw. ~400 µm, und die Höhe der Dünndarmzotten beträgt ~600 µm41.
Aus bildgebender Sicht ist die hochauflösende In-situ-Bildgebung von 3D-Mikroarchitekturen möglicherweise auf den Darm auf einem Chip beschränkt, da der erforderliche Arbeitsabstand von der Objektivlinse zur Epithelschicht in der Größenordnung von einigen Millimetern liegt Bei jeder Schicht ist es äußerst schwierig, die obere Schicht zu öffnen oder zu entfernen, um die Oberflächenstruktur der Epithelschicht zu untersuchen, beispielsweise mithilfe eines Rasterelektronenmikroskops (REM).
Die Hydrophobie von PDMS war ein begrenzender Faktor in mikrofluidischen Studien, die sich mit hydrophoben kleinen Molekülen befassten, da PDMS solche hydrophoben Moleküle unspezifisch adsorbieren kann. Alternativen zu PDMS können mit anderen Polymermaterialien in Betracht gezogen werden. Alternativ kann eine Oberflächenmodifikation von PDMS (z. B. Beschichtung mit lipophilen Materialien 42 oder Polyethylenglykol 43) in Betracht gezogen werden, um die Adsorption hydrophober Moleküle zu minimieren.
Schließlich wurde unsere Methode im Hinblick auf die Bereitstellung eines Hochdurchsatz-Screenings oder einer „einheitlichen“ benutzerfreundlichen Versuchsplattform nicht gut charakterisiert. Das aktuelle Protokoll erfordert eine Spritzenpumpe pro Mikrogerät, was Platz in einem CO2-Inkubator einnimmt und groß angelegte Experimente verhindert. Diese Einschränkung kann durch die Skalierbarkeit innovativer Kulturformate (z. B. 24-Well-, 96-Well- oder 384-Well-poröse Einsätze, die eine kontinuierliche Auffüllung und Entfernung von ermöglichen) erheblich verbessert werden basolaterale Medien).
Um die 3D-Morphogenese des menschlichen Darmepithels in vitro zu induzieren, verwendeten wir ein mikrofluidisches Chip-Darmgerät, das zwei parallele Mikrokanäle und eine elastische poröse Membran dazwischen enthält, um eine Lumen-Kapillar-Schnittstelle zu schaffen. Wir demonstrieren auch die Verwendung eines einkanaligen mikrofluidischen Geräts (Hybridchip), das einen kontinuierlichen basolateralen Fluss unter polarisierten Epithelschichten ermöglicht, die auf Transwell-Einsätzen gewachsen sind. Auf beiden Plattformen kann die Morphogenese verschiedener menschlicher Darmepithelzellen durch gerichtete Manipulation des Flusses demonstriert werden um Morphogenantagonisten aus dem basolateralen Kompartiment zu entfernen. Das gesamte experimentelle Verfahren (Abbildung 1) besteht aus fünf Teilen: (i) Mikrofabrikation des Darmchips oder Transwell-insertierbaren Hybridchips (Schritte 1-5; Kasten 1), (ii) Vorbereitung von Darmepithelzellen (Caco-2-Zellen) oder menschlichen Darmorganoiden;Kästchen 2–5), (iii) Kultur von Darmepithelzellen auf Darmchips oder Hybridchips (Schritte 6–9), (iv) Induktion der 3D-Morphogenese in vitro (Schritt 10) und (v) zur Charakterisierung der 3D-Epithelmikrostruktur (Schritte 11–24). Schließlich wurde eine geeignete Kontrollgruppe (weiter unten besprochen) entworfen, um die Wirksamkeit der In-vitro-Morphogenese durch Vergleich der Epithelmorphogenese mit räumlichen, zeitlichen, bedingte oder prozedurale Kontrollen.
Wir haben zwei verschiedene Kulturplattformen verwendet: Darm-on-a-Chip mit geraden Kanälen oder nichtlinearen gewundenen Kanälen oder Hybridchips mit Transwell (TW)-Einsätzen in einem Mikrofluidikgerät, hergestellt wie in Kasten 1 und Schritt 1 bis 5 beschrieben „Morphogenese“ zeigt die Gesamtschritte, in denen Caco-2- oder Organoid-abgeleitete Epithelzellen auf einem Darmchip oder auf Transwell-Einsätzen eines Hybridchips kultiviert werden, gefolgt von der Induktion der 3D-Morphogenese und der Bildung einer charakterisierten Epithelstruktur Krankheitsmodellierung. Immunfluoreszenzbilder in „Zelldifferenzierung“ zeigen Kerne, F-Aktin und MUC2, die in der auf dem Darmchip erzeugten 3D-Caco-2-Epithelschicht exprimiert werden „Microbe Co-Cultures“ zeigt repräsentative Wirt-Mikrobiom-Kokulturen im Darm auf einem Chip. Das linke Feld zeigt die Kokultur von E. coli, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert, mit mikrotechnisch hergestellten 3D-Caco-2-Epithelzellen. Das rechte Feld zeigt die Lokalisierung von GFP E. coli, kokultiviert mit 3D-Caco-2-Epithelzellen, gefolgt von einer Immunfluoreszenzfärbung mit F-Aktin (rot) und Kernen (blau). Krankheit Die Modellierung veranschaulicht einen gesunden und durchlässigen Darm bei Darmentzündungschips unter physiologischer Belastung mit bakteriellen Antigenen (z. B. Lipopolysaccharid, LPS) und Immunzellen (z. B. PBMC);grün).Caco-2-Zellen wurden kultiviert, um eine 3D-Epithelschicht zu bilden.Maßstabsbalken, 50 µm.Bilder in der unteren Reihe: „Differenzierung von Zellen“, angepasst mit Genehmigung aus Referenz.2.Oxford University Press;Wiedergabe mit Genehmigung aus Ref. 5.NAS;„Wirt-Mikrobe-Co-Kultur“, angepasst mit Genehmigung aus Lit. 3.NAS;„Krankheitsmodellierung“, angepasst mit Genehmigung aus Referenz.5.NAS.
Sowohl Darm-on-Chip- als auch Hybrid-Chips wurden unter Verwendung von PDMS-Nachbildungen hergestellt, die durch weiche Lithographie1,44 aus Siliziumformen entnommen und mit SU-8 strukturiert wurden. Das Design der Mikrokanäle in jedem Chip wird unter Berücksichtigung von Hydrodynamik wie Scherspannung und hydrodynamischem Druck bestimmt1,4,12. Das ursprüngliche Darm-on-a-Chip-Design (Extended Data Abb. 1a), das aus zwei nebeneinander liegenden parallelen geraden Mikrokanälen bestand, hat sich zu einem komplexen Darm-on-Chip-Design entwickelt (Extended Data Abb. 1a), das aus zwei nebeneinander liegenden parallelen geraden Mikrokanälen bestand. a-Chip (Extended Data Abb. 1b), der ein Paar gekrümmter Mikrokanäle enthält, um eine längere Verweilzeit der Flüssigkeit, nichtlineare Strömungsmuster und eine mehrachsige Verformung kultivierter Zellen zu induzieren (Abb. 2a–f) 12. Wenn komplexere Darmbiomechaniken nachgebildet werden müssen, können komplexe Darm-on-a-Chips gewählt werden. Wir haben gezeigt, dass der gewundene Darm-Chip auch die 3D-Morphogenese in einem ähnlichen Zeitrahmen mit einem ähnlichen Grad an Epithel stark induziert Wachstum im Vergleich zum ursprünglichen Darm-Chip, unabhängig vom kultivierten Zelltyp. Um die 3D-Morphogenese zu induzieren, sind daher lineare und komplexe On-Chip-Darmdesigns austauschbar. PDMS-Repliken, die auf Silikonformen mit SU-8-Mustern ausgehärtet wurden, zeigten nach dem Entformen negative Merkmale (Abb.2a).Um den Darm auf einem Chip herzustellen, wurde die vorbereitete obere PDMS-Schicht nacheinander mit einem porösen PDMS-Film verbunden und dann durch irreversibles Bonden mit einem Corona-Behandlungsgerät an der unteren PDMS-Schicht ausgerichtet (Abb. 2b–f). Zur Herstellung von Hybridchips wurden gehärtete PDMS-Repliken auf Glasobjektträger geklebt, um einkanalige Mikrofluidikgeräte zu erstellen, die Transwell-Einsätze aufnehmen konnten (Abb. 2h und erweiterte Daten, Abb. 2). Der Bindungsprozess wird durch Behandlung der Oberflächen des PD durchgeführt MS-Replika und Glas mit Sauerstoffplasma oder Koronabehandlung. Nach der Sterilisation des mikrogefertigten Geräts, das am Silikonschlauch befestigt ist, war der Geräteaufbau bereit für die Durchführung der 3D-Morphogenese des Darmepithels (Abbildung 2g).
a, Schematische Darstellung der Herstellung von PDMS-Teilen aus SU-8-gemusterten Silikonformen. Die ungehärtete PDMS-Lösung wurde auf eine Silikonform gegossen (links), bei 60 °C ausgehärtet (Mitte) und entformt (rechts). Das entformte PDMS wurde in Stücke geschnitten und zur weiteren Verwendung gereinigt.b, Foto der Silikonform, die zur Herstellung der PDMS-Oberschicht verwendet wurde.c, Foto der Silikonform, die zur Herstellung der porösen PDMS-Membran verwendet wurde.d, Eine Reihe von Fotos der oberen und unteren PDMS-Komponenten und das zusammengebaute Darmgerät auf dem Chip.e, Schematische Darstellung der Ausrichtung der oberen, Membran- und unteren PDMS-Komponenten. Jede Schicht wird durch Plasma- oder Koronabehandlung irreversibel verbunden.f, Schematische Darstellung des hergestellten Darmgeräts auf einem Chip mit übereinanderliegenden gewundenen Mikrokanälen und Vakuumkammern.g, Aufbau eines Darmgeräts auf einem Chip für mikrofluidische Zellkultur. Der hergestellte Darm auf einem Chip, zusammengesetzt aus einem Silikonschlauch und einer Spritze, wurde auf ein Deckglas gelegt. Das Chipgerät wurde auf den Deckel eines platziert 150-mm-Petrischale zur Verarbeitung. Das Bindemittel wird zum Verschließen des Silikonschlauchs verwendet .Sonst.
In diesem Protokoll wurden die Caco-2-Zelllinie und Darmorganoide als Epithelquellen verwendet (Abb. 3a). Beide Zelltypen wurden unabhängig voneinander kultiviert (Kasten 2 und Kasten 5) und zur Aussaat der ECM-beschichteten Mikrokanäle von On-Chip-Darm- oder Transwell-Einsätzen verwendet. Wenn die Zellen konfluent sind (>95 % Abdeckung in Flaschen), werden routinemäßig kultivierte Caco-2-Zellen (zwischen Passagen 10 und 50) in T-Kolben geerntet Bereiten Sie dissoziierte Zellsuspensionen durch Trypsinisierungsflüssigkeit vor (Kasten 2). Menschliche Darmorganoide aus Darmbiopsien oder chirurgischen Resektionen wurden in Matrigel-Gerüstkuppeln in 24-Well-Platten kultiviert, um die strukturelle Mikroumgebung zu unterstützen. Medium, das essentielle Morphogene (wie Wnt, R-Spondin und Noggin) und Wachstumsfaktoren enthielt, die wie in Kasten 3 beschrieben hergestellt wurden, wurde jeden zweiten Tag ergänzt, bis die Organoide einen Durchmesser von ~500 µm erreichten. Vollständig Gewachsene Organoide werden geerntet und in einzelne Zellen dissoziiert, um sie auf den Darm oder Transwell-Einsätze auf einem Chip auszusäen (Kasten 5). Wie wir bereits berichtet haben, kann nach Krankheitstyp12,13 (z. B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Darmkrebs oder normaler Spender), Läsionsort (z. B. Läsion versus nicht-läsionierter Bereich) und gastrointestinaler Lage im Trakt (z. B. Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Blinddarm, Dickdarm) unterschieden werden oder Rektum). In Box 5 stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Kultivierung von Dickdarmorganoiden (Koloiden) bereit, die typischerweise höhere Konzentrationen an Morphogenen erfordern als Dünndarmorganoide.
a, Arbeitsablauf für die Induktion der Darmmorphogenese im Darmchip. In diesem Protokoll werden humanes Caco-2-Darmepithel und Darmorganoide verwendet, um die 3D-Morphogenese zu demonstrieren. Die isolierten Epithelzellen wurden in das vorbereitete Darm-on-a-Chip-Gerät ausgesät (Chipvorbereitung). Sobald die Zellen ausgesät (gesät) und an der porösen PDMS-Membran am Tag 0 (D0) befestigt (angehängt) wurden, wird der apikale (AP) Fluss initiiert und für die ersten 2 Tage aufrechterhalten (Fluss, AP, D0-D2).Basolateraler (BL) Fluss wird auch zusammen mit zyklischen Streckbewegungen (Streckung, Fluss, AP und BL) initiiert, wenn eine vollständige 2D-Monoschicht gebildet wird.Darm-3D-Morphogenese erfolgte spontan nach 5 Tagen mikrofluidischer Kultur (Morphogenese, D5).Phasenkontrastbilder zeigen repräsentative Morphologie von Caco-2-Zellen bei jedem experimentellen Schritt oder Zeitpunkt (Balkendiagramm, 100 µm).Vier schematische Diagramme, die die entsprechenden Kaskaden veranschaulichen der Darmmorphogenese (oben rechts). Die gestrichelten Pfeile im Schema stellen die Richtung des Flüssigkeitsflusses dar.b, REM-Bild, das die Oberflächentopologie des etablierten 3D-Caco-2-Epithels zeigt (links). Der Einschub, der den vergrößerten Bereich hervorhebt (weißer gestrichelter Kasten), zeigt die regenerierten Mikrovilli auf der 3D-Caco-2-Schicht (rechts).c, Horizontale Frontalansicht von etabliertem Caco-2 3D, Claudin (ZO-1, rot) und kontinuierlichen Bürstensaummembranen mit der Bezeichnung F -Aktin (grün) und Kerne (blau) Konfokale Immunfluoreszenz-Visualisierung von Epithelzellen auf Darmchips. Pfeile, die auf das mittlere Schema zeigen, zeigen die Position der Fokusebene für jede konfokale Ansicht an. d, Zeitverlauf morphologischer Veränderungen in auf einem Chip kultivierten Organoiden, erhalten durch Phasenkontrastmikroskopie an den Tagen 3, 7, 9, 11 und 13. Der Einschub (oben rechts) zeigt die starke Vergrößerung des bereitgestellten Bilds. e, DIC-Mikrofotografie des im Darm etablierten organoiden 3D-Epithels auf einem am Tag 7.f aufgenommenen Schnitt. Überlagerte Immunfluoreszenzbilder, die Marker für Stammzellen zeigen (LGR5;Magenta), Becherzellen (MUC2; grün), F-Actin (grau) und Kerne (Cyan), die 3 Tage lang auf Darmchips gezüchtet wurden (links) bzw. 13 Tage lang (Mitte) Organoide auf der Epithelschicht. Siehe auch Abbildung 3 der erweiterten Daten, die die LGR5-Signalisierung ohne MUC2-Signalisierung hervorhebt. Fluoreszenzbilder, die die epitheliale Mikrostruktur (rechts) des 3D-Organoidepithels zeigen, das im Darm auf einem Chip durch Färben des Plasmas etabliert wurde Membran mit CellMask-Farbstoff (rechts) am 13. Tag der Kultur. Maßstabsbalken ist 50 μm, sofern nicht anders angegeben.b Nachdruck mit Genehmigung aus Referenz.2.Oxford University Press;c Angepasst mit Genehmigung von Referenz.2.Oxford University Press;e und f wurden mit Genehmigung durch Verweis angepasst.12 Unter der Creative Commons-Lizenz CC BY 4.0.
Im Darm auf einem Chip ist es notwendig, die hydrophobe Oberfläche der porösen PDMS-Membran für eine erfolgreiche ECM-Beschichtung zu modifizieren. In diesem Protokoll wenden wir zwei verschiedene Methoden an, um die Hydrophobie von PDMS-Membranen zu modifizieren. Für die Kultivierung von Caco-2-Zellen reichte die Oberflächenaktivierung durch UV-/Ozonbehandlung allein aus, um die Hydrophobie der PDMS-Oberfläche zu reduzieren, das ECM zu beschichten und Caco-2-Zellen an der PDMS-Membran zu befestigen. Die mikrofluidische Kultur von organoidem Epithel erfordert jedoch eine chemische Oberflächenfunktionalität Nach der Oberflächenmodifikation wurden ECM-Proteine ​​so abgeschieden, dass sie die funktionalisierte PDMS-Oberfläche bedecken, und dann in das isolierte organoide Epithel eingeführt. Nach der Anheftung der Zellen beginnt die mikrofluidische Zellkultur damit, nur das Medium in den oberen Mikrokanal zu perfundieren, bis die Zellen eine vollständige Monoschicht bilden, während der untere Mikrokanal statische Bedingungen aufrechterhält. Diese optimierte Methode zur Oberflächenaktivierung und ECM-Beschichtung ermöglicht die Anbringung von Organoidepithel, um die 3D-Morphogenese auf der PDMS-Oberfläche zu induzieren.
Transwell-Kulturen erfordern außerdem eine ECM-Beschichtung vor der Zellaussaat;Transwell-Kulturen erfordern jedoch keine komplexen Vorbehandlungsschritte, um die Oberfläche poröser Einsätze zu aktivieren. Beim Züchten von Caco-2-Zellen auf Transwell-Einsätzen beschleunigt die ECM-Beschichtung auf porösen Einsätzen die Anlagerung dissoziierter Caco-2-Zellen (<1 Stunde) und die Bildung einer Tight-Junction-Barriere (<1-2 Tage). Um Organoide auf Transwell-Einsätzen zu kultivieren, werden isolierte Organoide auf ECM-beschichteten Einsätzen ausgesät, an der Membranoberfläche befestigt (<3 h) und so lange aufrechterhalten, bis sich die Organoide bilden eine vollständige Monoschicht mit Barriereintegrität. Transwell-Kulturen werden in 24-Well-Platten ohne Verwendung von Hybridchips durchgeführt.
In-vitro-3D-Morphogenese kann durch Anwendung eines Flüssigkeitsflusses auf die basolaterale Seite einer etablierten Epithelschicht eingeleitet werden. Im Darm auf einem Chip begann die Epithelmorphogenese, als das Medium in die oberen und unteren Mikrokanäle perfundiert wurde (Abb. 3a). Wie bereits beschrieben, ist es wichtig, einen Flüssigkeitsfluss in das untere (basolaterale) Kompartiment einzuführen, um gerichtete sezernierte Morphogeninhibitoren kontinuierlich zu entfernen. Um den an porösen Membranen gebundenen Zellen ausreichend Nährstoffe und Serum bereitzustellen und Lumen zu erzeugen Bei Scherbeanspruchung wenden wir typischerweise einen Dual-Flow im Darm auf einem Chip an. Bei Hybrid-Chips wurden Transwell-Einsätze mit Epithel-Monoschichten in die Hybrid-Chips eingefügt. Anschließend wurde das Medium durch den Mikrokanal unter die basolaterale Seite des porösen Transwell-Einsatzes aufgetragen. Die intestinale Morphogenese erfolgte 3–5 Tage nach Beginn des basolateralen Flusses in beiden Kulturplattformen.
The morphological features of microengineered 3D epithelial layers can be analyzed by applying various imaging modalities, including phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, or immunofluorescence confocal microscopy (Figures 3 and 4).Phase contrast or DIC imaging can be easily performed at any time during culture to monitor the shape and protrusion of 3D epithelial layers.Due to the optical transparency of PDMS and polyester films, both the gut-on-a-chip and hybrid chip platforms can provide real-time in situ imaging without the need for sectioning or disassembly of the device.When performing immunofluorescence imaging (Figures 1, 3c, f and 4b, c), cells are typically fixed with 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), followed by Triton X-100 and 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), in order.Depending on the cell type, different fixatives, permeabilizers, and blocking agents can be used.Primary antibodies targeting lineage-dependent cell or region markers are used to highlight cells immobilized in situ on the chip, followed by secondary antibodies along with a counterstain dye targeting either nucleus (eg, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) or F-actin (eg, fluorescently labeled phalloidin).Fluorescence-based live imaging can also be performed in situ to detect mucus production (Fig.1, „Zelldifferenzierung“ und „Darmphysiologie“), zufällige Kolonisierung mikrobieller Zellen (Abb. 1, „Wirt-Mikroben-Kokultur“), die Rekrutierung von Immunzellen (Abb. 1, „Krankheitsmodellierung“) oder die Konturen der 3D-Epithelmorphologie (Abb. 3c, f und 4b, c). Bei der Modifizierung des Darms auf dem Chip, um die obere Schicht von der unteren Mikrokanalschicht zu trennen, wie in Ref. beschrieben. Wie in 2 gezeigt, können die 3D-Epithelmorphologie sowie die Mikrovilli am apikalen Bürstensaum durch REM visualisiert werden (Abb. 3b). Die Expression von Differenzierungsmarkern kann durch quantitative PCR5- oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung beurteilt werden. In diesem Fall werden 3D-Schichten von Epithelzellen, die in Darmchips oder Hybridchips gezüchtet wurden, durch Trypsinisierung geerntet und dann für die molekulare oder genetische Analyse verwendet.
a, Arbeitsablauf für die Induktion der Darmmorphogenese in einem Hybridchip. In diesem Protokoll werden Caco-2 und Darmorganoide verwendet, um die 3D-Morphogenese in einer Hybridchipplattform zu demonstrieren. Dissoziierte Epithelzellen wurden in vorbereitete Transwell-Einsätze ausgesät (TW-Vorbereitung; siehe Abbildung unten). Sobald die Zellen ausgesät (gesät) und an Polyestermembranen in Transwell-Einsätzen befestigt waren, wurden alle Zellen unter statischen Bedingungen kultiviert (TW-Kultur). Nach 7 Tagen wurde ein einzelner Transwell-Einsatz mit a Eine 2D-Monoschicht von Epithelzellen wurde in einen Hybridchip integriert, um einen basolateralen Fluss (Flow, BL) einzuleiten, der letztendlich zur Erzeugung einer 3D-Epithelschicht (Morphogenese) führte. Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen, die morphologische Merkmale menschlicher Organepithelzellen aus dem aufsteigenden Dickdarm eines normalen Spenders (C103-Linie) bei jedem experimentellen Schritt oder Zeitpunkt zeigen. Die Schemata in den oberen Schichten veranschaulichen die experimentelle Konfiguration für jeden Schritt Oide Epithelzellen mit konfokalen Mikroskopieansichten von oben nach unten, aufgenommen an verschiedenen Z-Positionen (oben, in der Mitte und unten);siehe rechtes Schema und entsprechende gepunktete Linien).zeigten offensichtliche morphologische Merkmale. F-Actin (Cyan), Kern (Grau). c, Fluoreszenz-Konfokalmikroskopaufnahmen (3D-Winkelansicht) von Organoid-abgeleiteten Epithelzellen, kultiviert in statischem Transwell (TW; Einschub in das weiße gestrichelte Kästchen) im Vergleich zum Hybridchip (größte vollständige Aufnahme), wobei jeweils 2D- und 3D-Morphologie verglichen wurden. Ein Paar vertikaler 2D-Querschnittansichten (Einschub in der oberen rechten Ecke; „XZ“) zeigen ebenfalls 2D und 3 D-Merkmale.Maßstabsbalken, 100 µm.c Nachdruck mit Genehmigung aus Referenz.4.Sonst.
Kontrollen können hergestellt werden, indem die gleichen Zellen (Caco-2 oder intestinale organoide Epithelzellen) unter herkömmlichen statischen Kulturbedingungen in zweidimensionalen Monoschichten kultiviert werden. Insbesondere kann es aufgrund der begrenzten Volumenkapazität der Mikrokanäle (d. h. ~4 µL im oberen Kanal des ursprünglichen Darm-Chip-Designs) zu Nährstoffmangel kommen. Daher kann auch die Epithelmorphologie vor und nach der Anwendung des basolateralen Flusses verglichen werden.
Der Soft-Lithographie-Prozess sollte in einem Reinraum durchgeführt werden. Für jede Schicht auf dem Chip (obere und untere Schicht und Membranen) und Hybridchips wurden unterschiedliche Fotomasken verwendet und auf separaten Siliziumwafern hergestellt, da die Höhen der Mikrokanäle unterschiedlich waren. Die Zielhöhen der oberen und unteren Mikrokanäle des Darms auf dem Chip betragen 500 µm bzw. 200 µm. Die Zielkanalhöhe des Hybridchips beträgt 200 µm.
Legen Sie einen 3-Zoll-Siliziumwafer in eine Schüssel mit Aceton. Schwenken Sie die Platte vorsichtig 30 Sekunden lang und trocknen Sie den Wafer dann an der Luft. Übertragen Sie den Wafer mit IPA auf einen Teller und drehen Sie ihn dann 30 Sekunden lang, um ihn zu reinigen.
Optional kann eine Piranha-Lösung (Mischung aus Wasserstoffperoxid und konzentrierter Schwefelsäure, 1:3 (Vol./Vol.)) verwendet werden, um die Entfernung organischer Rückstände von der Siliziumwaferoberfläche zu maximieren.
Piranha-Lösung ist extrem ätzend und erzeugt Hitze. Es sind zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen erforderlich. Lassen Sie die Lösung zur Abfallentsorgung abkühlen und füllen Sie sie in einen sauberen, trockenen Abfallbehälter. Verwenden Sie Sekundärbehälter und kennzeichnen Sie Abfallbehälter ordnungsgemäß. Bitte befolgen Sie die Sicherheitsrichtlinien der Einrichtung für detailliertere Verfahren.
Dehydrieren Sie die Wafer, indem Sie sie 10 Minuten lang auf eine 200 °C heiße Platte legen. Nach der Dehydrierung wurde der Wafer zum Abkühlen fünfmal an der Luft geschüttelt.
Gießen Sie ca. 10 g Fotolack SU-8 2100 in die Mitte des gereinigten Siliziumwafers. Verteilen Sie den Fotolack mit einer Pinzette gleichmäßig auf dem Wafer. Legen Sie den Wafer gelegentlich auf eine 65 °C heiße Platte, damit der Fotolack weniger klebrig ist und sich leichter verteilen lässt. Legen Sie den Wafer nicht direkt auf die heiße Platte.
SU-8 wurde durch Schleuderbeschichtung gleichmäßig auf dem Wafer verteilt. Programmieren Sie eine eingehende Rotation des SU-8 für 5–10 s, um sich mit 500 U/min und einer Beschleunigung von 100 U/min/s auszubreiten. Stellen Sie den Hauptspin für die Strukturierung mit einer Dicke von 200 µm auf 1.500 U/min ein oder erreichen Sie eine Dicke von 250 µm (was eine Höhe von 500 µm für die obere Schicht des Darms auf dem Chip ergibt; siehe „Kritische Schritte“ unten), eingestellt auf einen Beschleunigung von 300 U/min/s 30 Sekunden bei 1.200 U/min.
Die Hauptschleudergeschwindigkeit kann entsprechend der Zieldicke des SU-8-Musters auf dem Siliziumwafer angepasst werden.
Um SU-8-Muster mit einer Höhe von 500 µm für die obere Schicht des Darms auf dem Chip herzustellen, wurden die Schleuderbeschichtungs- und Soft-Bake-Schritte dieser Box (Schritte 7 und 8) nacheinander wiederholt (siehe Schritt 9), um zwei Schichten von 250 µm zu erzeugen. Eine dicke Schicht SU-8, die durch UV-Belichtung in Schritt 12 dieser Box geschichtet und verbunden werden kann, wodurch eine Schicht mit einer Höhe von 500 µm entsteht.
Backen Sie die mit SU-8 beschichteten Wafer sanft, indem Sie die Wafer 5 Minuten lang vorsichtig auf eine Heizplatte bei 65 °C legen, dann die Einstellung auf 95 °C umstellen und weitere 40 Minuten lang inkubieren.
Um eine Höhe des SU-8-Musters von 500 μm im oberen Mikrokanal zu erreichen, wiederholen Sie die Schritte 7 und 8, um zwei 250 μm dicke SU-8-Schichten zu erzeugen.
Führen Sie mit dem UV Mask Aligner einen Lampentest gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um die Belichtungszeit des Wafers zu berechnen. (Belichtungszeit, ms) = (Belichtungsdosis, mJ/cm2)/(Lampenleistung, mW/cm2).
Nachdem Sie die Belichtungszeit bestimmt haben, legen Sie die Fotomaske auf den Maskenhalter des UV-Maskenausrichters und platzieren Sie die Fotomaske auf dem SU-8-beschichteten Wafer.
Platzieren Sie die bedruckte Oberfläche der Fotomaske direkt auf der SU-8-beschichteten Seite des Siliziumwafers, um die UV-Streuung zu minimieren.
Belichten Sie den SU-8-beschichteten Wafer und die Fotomaske für die vorgegebene Belichtungszeit vertikal mit 260 mJ/cm2 UV-Licht (siehe Schritt 10 dieses Kastens).
Nach der UV-Belichtung wurden SU-8-beschichtete Siliziumwafer auf jeder Heizplatte 5 Minuten lang bei 65 °C und 15 Minuten lang bei 95 °C gebacken, um Muster mit einer Höhe von 200 μm herzustellen. Verlängern Sie die Nachbackzeit bei 95 °C auf 30 Minuten, um Muster mit einer Höhe von 500 μm herzustellen.
Der Entwickler wird in eine Glasschale gegossen und der gebackene Wafer wird in die Schale gelegt. Das Volumen des SU-8-Entwicklers kann je nach Größe der Glasplatte variieren. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend SU-8-Entwickler verwenden, um unbelichtetes SU-8 vollständig zu entfernen. Wenn Sie beispielsweise eine Glasschale mit 150 mm Durchmesser und einem Fassungsvermögen von 1 l verwenden, verwenden Sie etwa 300 ml SU-8-Entwickler. Entwickeln Sie die Form 25 Minuten lang unter gelegentlicher sanfter Drehung.
Spülen Sie die entwickelte Form mit ca. 10 ml frischem Entwickler aus, gefolgt von IPA, indem Sie die Lösung mit einer Pipette aufsprühen.
Legen Sie den Wafer in einen Plasmareiniger und setzen Sie ihn 1,5 Minuten lang Sauerstoffplasma (Atmosphärengas, Zieldruck 1 × 10−5 Torr, Leistung 125 W) aus.
Legen Sie den Wafer in einen Vakuumexsikkator mit einem Objektträger aus Glas. Wafer und Objektträger können nebeneinander platziert werden. Wenn der Vakuumexsikkator durch eine Platte in mehrere Schichten unterteilt ist, legen Sie die Objektträger in die untere Kammer und die Wafer in die obere Kammer. Geben Sie 100 μl Trichlor(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl)silanlösung auf einen Objektträger aus Glas und legen Sie zur Silanisierung Vakuum an.
Tauen Sie ein Fläschchen mit gefrorenen Caco-2-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf und übertragen Sie die aufgetauten Zellen dann in einen T75-Kolben mit 15 ml 37 °C vorgewärmtem Caco-2-Medium.
Um Caco-2-Zellen bei ~90 % Konfluenz zu passieren, erwärmen Sie zunächst Caco-2-Medium, PBS und 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
Saugen Sie das Medium durch Vakuumansaugung ab. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 ml warmem PBS, indem Sie die Vakuumansaugung wiederholen und frisches PBS hinzufügen.