Nahrungssuche und Lebensverlaufsmerkmale sind eng mit der Aufnahme und Verteilung von Nährstoffen verknüpft. Um Defizite bestimmter Nährstoffe in verschiedenen Lebensstadien auszugleichen, können Insekten diese Nährstoffe durch zusätzliche Nahrung aufnehmen, beispielsweise durch die Aufnahme von Wirbeltiersekreten in einem als „Puddles“ bezeichneten Prozess. Die Mücke Anopheles arabiani scheint unterernährt zu sein und benötigt daher Nährstoffe sowohl für den Stoffwechsel als auch für die Fortpflanzung. Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob die Agitation von Kuhurin zur Nährstoffaufnahme bei Anopheles arabiensis die Lebensverlaufsmerkmale verbessert.
Stellen Sie sicher, dass es sicher ist. arabiensis wurde vom Geruch frischen, 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden alten Kuhurins angezogen. Wirtssuchende und blutgefütterte (48 Stunden nach der Blutmahlzeit) Weibchen wurden mit einem Y-Rohr-Olfaktometer gemessen und trächtige Weibchen wurden auf einen Laichtest untersucht. Eine kombinierte chemische und elektrophysiologische Analyse wurde dann verwendet, um bioaktive Verbindungen im Kuhurin aller vier Altersklassen zu identifizieren. Synthetische Mischungen bioaktiver Verbindungen wurden in Y-Rohr- und Feldversuchen bewertet. Um Kuhurin und seinen wichtigsten stickstoffhaltigen Bestandteil Harnstoff als potenzielle Ergänzungsnahrung für Malariaüberträger zu untersuchen, wurden Fütterungsparameter und Lebensverlaufsmerkmale gemessen. Der Anteil weiblicher Mücken und die Menge des absorbierten Kuhurins und Harnstoffs wurden beurteilt. Nach der Fütterung wurden die Weibchen auf Überleben, Fesselflug und Fortpflanzung untersucht.
Suchen Sie nach Blut und Nahrung des Wirtes. In Labor- und Feldstudien wurden Araber vom natürlichen und synthetischen Geruch frischen und gealterten Kuhurins angezogen. Trächtige Weibchen reagierten an Laichplätzen gleichgültig auf Kuhurin. Wirtssuchende und blutsaugende Weibchen absorbieren aktiv Kuhurin und Harnstoff und verteilen diese Ressourcen entsprechend den lebensgeschichtlichen Kompromissen als Funktion des physiologischen Zustands für Flucht, Überleben oder Fortpflanzung.
Anopheles arabinis erfasst und verteilt Kuhurin zur Verbesserung der Lebensverlaufseigenschaften. Die zusätzliche Fütterung mit Kuhurin beeinflusst die Vektorkapazität direkt durch Erhöhung der täglichen Überlebensrate und der Vektordichte und indirekt durch Veränderung der Flugaktivität und sollte daher in zukünftigen Modellen berücksichtigt werden.
Die Nahrungssuche und -verteilung von Insekten sind eng mit der Nahrungsaufnahme und den Lebensverlaufsmerkmalen verknüpft [1,2,3]. Insekten können Nahrung auswählen und aufnehmen sowie je nach Nahrungsverfügbarkeit und Nährstoffbedarf kompensatorische Nahrungsaufnahme durchführen [1, 3]. Die Nährstoffverteilung hängt vom Lebensverlauf ab und kann zu unterschiedlichen Anforderungen an Nahrungsqualität und -quantität in verschiedenen Lebensstadien von Insekten führen [1, 2]. Um Defizite bestimmter Nährstoffe auszugleichen, können Insekten diese durch zusätzliche Nahrung aufnehmen, beispielsweise durch Schlamm, verschiedene Exkremente und Sekrete von Wirbeltieren sowie Aas, ein Prozess, der als Pfützen bezeichnet wird [2]. Obwohl hauptsächlich eine Vielzahl von Schmetterlings- und Mottenarten beschrieben wurden, kommen Wasserstellen auch in anderen Insektenordnungen vor, und die Anziehung zu diesen Ressourcen und deren Nahrungsaufnahme können erhebliche Auswirkungen auf die Gesundheit und andere Lebensverlaufsmerkmale haben [2, 4, 5, 6], 7]. Die Malariamücke Anopheles gambiae sensu lato (sl) schlüpft als „unterernährtes“ adultes Tier [8]. Daher kann das Gießen eine wichtige Rolle bei den Lebensverlaufsmerkmalen spielen, dieses Verhalten wurde bisher jedoch vernachlässigt. Der Einsatz von Bewegung als Mittel zur Steigerung der Nährstoffaufnahme dieses wichtigen Vehikels verdient Aufmerksamkeit, da dies bedeutende epidemiologische Konsequenzen haben kann.
Die Stickstoffaufnahme erwachsener weiblicher Anopheles-Mücken ist aufgrund geringer Kalorienreserven aus dem Larvenstadium und einer ineffizienten Nutzung der Blutmahlzeit begrenzt [9]. Weibliche Anopheles gambiae sl kompensieren dies typischerweise durch zusätzliche Blutmahlzeiten [10, 11], wodurch mehr Menschen einem Infektionsrisiko ausgesetzt und Mücken einem höheren Risiko der Prädation ausgesetzt werden. Alternativ können Mücken durch zusätzliche Fütterung mit Wirbeltierexkrementen stickstoffhaltige Verbindungen aufnehmen, die ihre Anpassungsfähigkeit und Flugmanövrierfähigkeit verbessern, wie bei anderen Insekten gezeigt wurde [2]. In diesem Zusammenhang ist die starke und ausgeprägte Anziehungskraft einer der Geschwisterarten innerhalb des gambischen sl-Artenkomplexes, Anopheles arabinis, auf frischen und gealterten Kuhurin [12,13,14] interessant. Anopheles arabinis bevorzugt opportunistische Wirte und ist dafür bekannt, sich mit Rindern zu vergesellschaften und sich von ihnen zu ernähren. Kuhurin ist eine Ressource, die reich an stickstoffhaltigen Verbindungen ist, wobei Harnstoff 50-95 % der Gesamtstickstoff in frischem Urin [15, 16]. Wenn Kuhurin altert, nutzen Mikroorganismen diese Ressourcen, um die Komplexität stickstoffhaltiger Verbindungen innerhalb von 24 Stunden zu reduzieren [15]. Durch den schnellen Anstieg des Ammoniaks, der mit einem Rückgang des organischen Stickstoffs einhergeht, gedeihen alkalophile Mikroorganismen (von denen viele für Mücken giftige Verbindungen produzieren) [15]. Dies können weibliche Ann. arabiensis sein, die bevorzugt von Urin angezogen werden, der 24 Stunden oder weniger alt ist [13, 14].
In dieser Studie wurde nach Wirts- und blutgespeisten Ans gesucht. Während seines ersten Gonadotropinzyklus wurde die Aufnahme von Stickstoffverbindungen, einschließlich Harnstoff, durch Urinvermischung bei arabiensis untersucht. Anschließend wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um zu untersuchen, wie weibliche Mücken diese potenzielle Nährstoffquelle für ein verbessertes Überleben, eine bessere Fortpflanzung und eine bessere Nahrungssuche aufteilen. Schließlich wurde der Geruch von frischem und gealtertem Kuhurin untersucht, um festzustellen, ob dieser zuverlässige Hinweise auf Wirts- und blutgespeiste An lieferte. Bei der Suche nach dieser potenziellen Nährstoffquelle entdeckte arabiensis chemische Zusammenhänge hinter der beobachteten unterschiedlichen Attraktivität. Synthetische Geruchsmischungen aus flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs), die in 24 Stunden gealtertem Urin identifiziert wurden, wurden unter Feldbedingungen weiter ausgewertet, wodurch die unter Laborbedingungen erzielten Ergebnisse erweitert und die Wirkung des Geruchs von Rinderurin auf verschiedene physiologische Zustände demonstriert wurden. Anziehung von Mücken. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen, dass An. arabiensis nimmt im Urin von Wirbeltieren vorkommende stickstoffhaltige Verbindungen auf und verteilt sie, um die Lebensverlaufsmerkmale zu beeinflussen. Diese Ergebnisse werden im Kontext potenzieller epidemiologischer Folgen und ihrer Verwendung zur Vektorüberwachung und -kontrolle diskutiert.
Anopheles arabicans (Dongola-Stamm) wurden bei 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12:12-stündigen Hell-Dunkel-Rhythmus gehalten. Die Larven wurden in Plastikschalen (20 cm × 18 cm × 7 cm) mit destilliertem Wasser aufgezogen und mit Tetramin®-Fischfutter (Tetra Werke, Melle, DE) gefüttert. Die Puppen wurden in 30-ml-Bechern (Nolato Hertila, Åstorp, SE) gesammelt und anschließend in Bugdorm-Käfige (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) überführt, um das Schlüpfen der adulten Tiere zu ermöglichen. Den adulten Tieren wurde bis zum vierten Tag nach dem Schlüpfen (dpe) eine 10%ige Saccharoselösung ad libitum zur Verfügung gestellt. Ab diesem Zeitpunkt wurde den wirtssuchenden Weibchen unmittelbar vor dem Experiment Futter angeboten oder sie wurden über Nacht mit destilliertem Wasser ausgehungert, wie beschrieben. unten. Weibchen, die für Flugrohrexperimente verwendet wurden, wurden nur 4–6 Stunden lang mit Wasser ad libitum ausgehungert. Um blutsaugende Mücken für nachfolgende Bioassays vorzubereiten, wurden 4 dpe-Weibchen mithilfe eines Membranfütterungssystems (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK) mit defibrotischem Schafblut (Håtunalab, Bro, SE) versorgt. Vollständig verstopfte Weibchen wurden dann in einzelne Käfige überführt und erhielten entweder direkt Nahrung, wie unten beschrieben, oder 3 Tage lang vor den unten beschriebenen Experimenten 10 % Saccharose ad libitum. Letztere Weibchen wurden für Flugrohr-Bioassays verwendet und ins Labor überführt, wo sie 4–6 Stunden vor dem Experiment destilliertes Wasser ad libitum erhielten.
Fütterungstests wurden verwendet, um den Urin- und Harnstoffverbrauch bei erwachsenen An.Arab-Weibchen zu quantifizieren. Wirtssuchende und blutgefütterte Weibchen erhielten 48 Stunden lang eine Diät mit 1 % verdünntem frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Harnstoffkonzentrationen und zwei Kontrollen (10 % Saccharose und Wasser). Zusätzlich wurde der Diät Lebensmittelfarbe (1 mg ml-1 Xylolcyanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) hinzugefügt und in einer 4 × 4-Matrix in 250 µl-Mikrozentrifugenröhrchen (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Abbildung 1A) bereitgestellt. Bis zum Rand füllen (~300 µl). Um Konkurrenz zwischen Mücken und mögliche Auswirkungen der Farbstofffarbe zu vermeiden, setzen Sie 10 Mücken in eine große Petrischale (12 cm Durchmesser und 6 cm Höhe; Semadeni, Ostermundigen, CH; Abbildung 1A) in völlige Dunkelheit bei 25 ± 2 cm² °C und 65 ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit. Diese Experimente wurden 5 bis 10 Mal wiederholt. Nach der Verabreichung der Nahrung wurden die Mücken bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert.
Suchen Sie nach Rinderurin und Harnstoff, der vom Wirt und den blutsaugenden weiblichen Anopheles arabianus absorbiert wird. Im Fütterungsversuch (A) erhielten weibliche Mücken eine Nahrung aus frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Harnstoffkonzentrationen, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O). Wirtssuchende (B) und blutgespeiste (C) Weibchen absorbierten mehr Saccharose als jede andere getestete Nahrung. Beachten Sie, dass wirtssuchende Weibchen 72-Stunden-Kuhurin weniger absorbierten als 168-Stunden-Kuhurin (B). Der mittlere Gesamtstickstoffgehalt (± Standardabweichung) des Urins ist im Einschub dargestellt. Wirtssuchende (D, F) und blutsaugende (E, G) Weibchen nehmen Harnstoff dosisabhängig auf. Die mittleren inhalierten Volumina (D, E) mit unterschiedlichen Buchstabennamen unterschieden sich signifikant voneinander (einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Analyse; p < 0,05). Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler von der Mittelwert (BE). Die gerade gestrichelte Linie stellt die log-lineare Regressionslinie dar (F, G)
Um die aufgenommene Nahrung freizusetzen, wurden die Mücken einzeln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 230 µl destilliertem Wasser gegeben und das Gewebe mit einem Einwegstößel und einem kabellosen Motor (VWR International, Lund, SE) aufgebrochen. Anschließend wurde 10 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand (200 µl) wurde auf eine 96-Well-Mikroplatte (Sigma-Aldrich) überführt und die Absorption (λ620) mit einem spektrophotometerbasierten Mikroplatten-Reader (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) bestimmt. Alternativ wurden die Mücken in 1 ml destilliertem Wasser zermahlen, wovon 900 µl in eine Küvette zur spektrophotometrischen Analyse (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE) überführt wurden. Zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme wurde eine Standardkurve durch serielle Verdünnung erstellt, um 0,2 µl bis 2,4 µl 1 mg ml-1 Xylolcyanid. Anschließend wurde die optische Dichte bekannter Farbstoffkonzentrationen verwendet, um die von jeder Mücke aufgenommene Nahrungsmenge zu bestimmen.
Die Volumendaten wurden mittels einer univariaten Varianzanalyse (ANOVA) und anschließenden post-hoc Paarvergleichen nach Tukey analysiert (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Lineare Regressionsanalysen beschrieben die konzentrationsabhängige Harnstoffaufnahme und verglichen die Reaktionen zwischen wirtssuchenden und blutsaugenden Mücken (GraphPad Prism v8.0.0 für Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Etwa 20 µl Urinproben aus jeder Altersgruppe wurden an Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 Mesh, Sigma Aldrich) gebunden und in Zinnkapseln (8 mm × 5 mm) eingekapselt. Die Kapseln wurden in die Verbrennungskammer eines CHNS/O-Analysators (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) eingesetzt, um den Stickstoffgehalt in frischem und gealtertem Urin gemäß dem Protokoll des Herstellers zu bestimmen. Der Gesamtstickstoff (g N l-1) wurde anhand bekannter Harnstoffkonzentrationen, die als Standard verwendet wurden, quantifiziert.
Um den Einfluss der Ernährung auf das Überleben wirtssuchender und blutsaugender Weibchen zu beurteilen, wurden Mücken einzeln in große Petrischalen (12 cm Durchmesser und 6 cm Höhe; Semadeni) mit einem netzbedeckten Loch im Deckel (3 cm Durchmesser) zur Belüftung und Nahrungsversorgung gesetzt. Die Ernährung wurde direkt nach 4 Tagen pro Woche bereitgestellt und umfasste 1 % verdünnten frischen und gealterten Kuhurin, vier Harnstoffkonzentrationen und zwei Kontrollen, 10 % Saccharose und Wasser. Jede Ernährung wurde auf einen Dentaltampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) pipettiert, der in eine 5-ml-Spritze (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE) eingeführt wurde, der Kolben entfernt und auf eine Petrischale gelegt (Abbildung 1).1A). Ändern Sie Ihre Ernährung täglich. Pflegen Sie das Labor wie oben beschrieben. Überlebende Mücken wurden zweimal täglich gezählt, während tote Mücken verworfen wurden, bis die letzte Mücke starb (n = 40 pro Behandlung). Überleben von Die Anzahl der mit unterschiedlicher Nahrung gefütterten Mücken wurde mithilfe von Kaplan-Meyer-Überlebenskurven und Log-Rank-Tests statistisch analysiert, um die Überlebensverteilung zwischen den Nahrungen zu vergleichen (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Eine spezielle Mückenflugmühle nach Attisano et al. [17], hergestellt aus 5 mm dicken, durchsichtigen Acrylplatten (10 cm breit x 10 cm lang x 10 cm hoch) ohne Vorder- und Rückplatten (Abb. 3: oben). Eine Schwenkanordnung mit einem vertikalen Rohr aus einer Gaschromatographiesäule (0,25 mm Innendurchmesser; 7,5 cm Länge), dessen Enden an eine Insektennadel geklebt sind, die zwischen einem Paar Neodym-Magneten im Abstand von 9 cm aufgehängt ist. Ein horizontales Rohr aus dem gleichen Material (6,5 cm Länge) teilte das vertikale Rohr und bildete einen befestigten Arm und einen Arm, der ein kleines Stück Aluminiumfolie als lichtunterbrechendes Signal trug.
24 Stunden lang ausgehungerte Weibchen erhielten 30 Minuten lang die oben genannte Diät, bevor sie fixiert wurden. Vollständig gefütterte weibliche Mücken wurden dann einzeln 2–3 Minuten lang auf Eis betäubt und mit Bienenwachs an Insektenstiften (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) befestigt und dann an die Arme der horizontalen Röhren gebunden. Fliegende Mühle. Die Umdrehungen pro Flug wurden von einem speziell angefertigten Datenlogger aufgezeichnet und dann mit der Software PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE) gespeichert und angezeigt. Die Flugmühle wurde in einen klimatisierten Raum (12 h:12 h, Licht: Dunkelheit, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relative Luftfeuchtigkeit) gestellt.
Um das Muster der Flugaktivität zu visualisieren, wurden die gesamte geflogene Distanz (m) und die Gesamtzahl der aufeinanderfolgenden Flugaktivitäten pro Stunde über einen Zeitraum von 24 Stunden berechnet. Darüber hinaus wurden die durchschnittlichen Flugdistanzen der einzelnen Weibchen über die verschiedenen Behandlungen hinweg verglichen und mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und der Post-hoc-Analyse von Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) analysiert, wobei die durchschnittliche Distanz als abhängige Variable und die Behandlung als unabhängiger Faktor betrachtet wurde. Darüber hinaus wird die durchschnittliche Anzahl der Runden in 10-Minuten-Schritten berechnet.
Um den Einfluss der Ernährung auf die Reproduktionsleistung von An. arabiensis zu beurteilen, wurden sechs Weibchen (4 dpe) nach der Blutentnahme direkt in Bugdorm-Käfige (30 cm × 30 cm × 30 cm) überführt und erhielten dann 48 Stunden lang die oben beschriebene Versuchsnahrung. Anschließend wurde die Nahrung entfernt und am dritten Tag wurden für 48 Stunden Laichnäpfe (30 ml; Nolato Hertila) mit 20 ml destilliertem Wasser bereitgestellt, die alle 24 Stunden gewechselt wurden. Jede Nahrungskur wurde 20-50 Mal wiederholt. Die Eier wurden für jeden Versuchskäfig gezählt und dokumentiert. Teilproben der Eier wurden verwendet, um die mittlere Größe und Längenvariation einzelner Eier (n ≥ 200 pro Nahrung) zu bestimmen. Dazu wurde ein Dialux-20-Mikroskop (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) verwendet, das mit einer Leica Camera (DFC) 320 R2 ausgestattet war. Leica Microsystems Ltd., DE). Die restlichen Eier wurden 24 Stunden lang in einem klimatisierten Raum unter Standardaufzuchtbedingungen aufbewahrt und eine Teilprobe frisch geschlüpfter Larven im ersten Stadium (n ≥ 200 pro Diät) wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Anzahl der Eier und die Größe der Eier und Larven wurden zwischen den Behandlungen verglichen und mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und der Post-hoc-Analyse von Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) durchgeführt.
Aus Proben von Zebu-Rindern der Rasse Arsi wurden flüchtige Bestandteile im Kopfraum von frischem (1 Stunde nach der Probenahme), 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden altem Urin gewonnen. Der Einfachheit halber wurden die Urinproben frühmorgens gesammelt, während die Kühe noch im Stall waren. Es wurden Urinproben von 10 Tieren gesammelt und 100–200 ml jeder Probe wurden in einzelne Polyamid-Backbeutel (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH und Co., Minden, DE) in 3-l-Polyamid-Fässern mit Deckel aus Vinylchlorid überführt. Aus jeder Rinderurinprobe wurden flüchtige Bestandteile im Kopfraum entweder direkt (frisch) oder nach Reifung bei Raumtemperatur für 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden gesammelt, d. h. jede Urinprobe war repräsentativ für die jeweilige Altersgruppe.
Zur Sammlung flüchtiger Bestandteile im Headspace wurde ein geschlossenes Kreislaufsystem verwendet, um einen mit Aktivkohle gefilterten Gasstrom (100 ml min-1) mithilfe einer Membran-Vakuumpumpe (KNF Neuberger, Freiburg, DE) 2,5 Stunden lang durch einen Polyamidbeutel zur Adsorptionssäule zu leiten. Zur Kontrolle wurde die Headspace-Sammlung aus einem leeren Polyamidbeutel durchgeführt. Die Adsorptionssäule bestand aus einem Teflonschlauch (5,5 cm x 3 mm Innendurchmesser) mit 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) zwischen Glaswollestopfen. Vor Gebrauch wurde die Säule mit 1 ml redestilliertem n-Hexan (Merck, Darmstadt, DE) und 1 ml Pentan (99,0 % reines Lösungsmittel, GC-Qualität, Sigma Aldrich) gespült. Die adsorbierten flüchtigen Bestandteile wurden mit 400 μl Pentan eluiert. Die Headspace-Sammlungen wurden gepoolt und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. zur weiteren Analyse.
Verhaltensreaktionen von wirtssuchenden und blutsaugenden An. Flüchtige Headspace-Extrakte aus frischem sowie 24 h, 72 h und 168 h altem Urin wurden mit einem Glasröhren-Olfaktometer auf flüchtige Extrakte von Arabidopsis-Mücken untersucht [18]. Die Experimente wurden während ZT 13-15 durchgeführt, der Hauptperiode von Ans Heimsuchaktivität. Arab [19]. Ein Glasröhren-Olfaktometer (80 cm × 9,5 cm Innendurchmesser) wurde von oben mit 3 ± 1 lx rotem Licht beleuchtet. Ein mit Aktivkohle gefilterter und befeuchteter Luftstrom (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relative Luftfeuchtigkeit) passierte den Bioassay mit 30 cm s-1. Die Luft wird durch eine Reihe von Edelstahlsieben geleitet, wodurch eine laminare Strömung und eine gleichmäßige Fahnenstruktur entstehen. DAB Dental AB), aufgehängt an einer 5 cm langen Spule am windzugewandten Ende des Olfaktometers, wobei der Stimulator alle 5 Minuten gewechselt wurde. Für die Analyse wurden 10 μl jedes Extrakts im Headspace, verdünnt 1:10, als Stimulus verwendet. Die gleiche Menge Pentan diente als Kontrolle. Einzelne wirtssuchende oder blutsaugende Mücken wurden 2–3 Stunden vor Versuchsbeginn in einzelne Freilassungskäfige gesetzt. Der Freilassungskäfig wurde auf der windabgewandten Seite des Olfaktometers platziert, und die Mücken konnten sich 1 Minute lang akklimatisieren. Anschließend wurde das Absperrventil des Käfigs geöffnet, um die Mücken freizulassen. Die Anziehungskraft der Behandlung oder Kontrolle wurde als Anteil der Mücken analysiert, die innerhalb von 5 Minuten nach der Freilassung mit der Quelle in Kontakt kamen. Jeder flüchtige Extrakt im Headspace und jede Kontrolle wurden mindestens 30-mal repliziert, und um die Auswirkungen eines einzelnen Tages zu vermeiden, wurde an jedem Versuchstag die gleiche Anzahl an Behandlungen und Kontrollen getestet. Ans.Arabic- und Headspace-Sets wurden mithilfe einer nominalen logistischen Regression analysiert, gefolgt von paarweisen Vergleichen für ungerade Verhältnisse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Ans Laichverhalten. Headspace-Extrakte aus frischem und gealtertem Kuhurin wurden in Bugdorm-Käfigen (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science) analysiert. Plastikbecher (30 ml; Nolato Hertila), gefüllt mit 20 ml destilliertem Wasser, dienten als Laichsubstrat und wurden in gegenüberliegenden Ecken des Käfigs im Abstand von 24 cm aufgestellt. Die Behandlungsbecher wurden mit 10 μl jedes Headspace-Extrakts in einer 1:10-Verdünnung angepasst. Die Kontrollbecher wurden mit der gleichen Menge Pentan angepasst. Behandlungs- und Kontrollbecher wurden zwischen den Experimenten ausgetauscht, um Positionseffekte zu berücksichtigen. Zehn blutgefütterte Weibchen wurden in den Versuchskäfigen zwischen ZT 9 und 11 freigelassen und die Eier in den Bechern 24 Stunden später gezählt. Die Formel zur Berechnung des Laichindex lautet: (Anzahl der im Behandlungsbecher abgelegten Eier – Anzahl der im Kontrollbecher abgelegten Eier)/(Gesamtzahl der abgelegten Eier). Jede Behandlung wurde 8 mal wiederholt.
Die Gaschromatographie- und Elektronenstrahlmusterdetektionsanalyse (GC-EAD) von weiblichen An. arabiensis-Arten wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [20]. Kurz gesagt wurden frische flüchtige Headspace-Extrakte mit einem Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) getrennt, der mit einer HP-5-Säule (30 m × 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 μm Filmdicke, Agilent Technologies) ausgestattet war. und alternder Urin. Wasserstoff wurde als mobile Phase mit einer durchschnittlichen linearen Flussrate von 45 cm s-1 verwendet. Jede Probe (2 μl) wurde 30 Sekunden lang im Splitless-Modus bei einer Eingangstemperatur von 225 °C injiziert. Die GC-Ofentemperatur wurde von 35 °C (3 Minuten Haltezeit) bis 300 °C (10 Minuten Haltezeit) bei 10 °C min-1 programmiert. Im GC-Abflussteiler wurden 4 psi Stickstoff hinzugefügt und 1:1 in einem Gerstel 3D/2-Kreuzstück mit geringem Totvolumen (Gerstel, Mülheim, DE) zwischen dem Flammenionisationsdetektor und dem EAD aufgeteilt. Die GC-Abflusskapillare für den EAD wurde durch eine Gerstel ODP-2-Transferleitung, die der GC-Ofentemperatur plus 5 °C folgt, in ein Glasrohr (10 cm × 8 mm) geleitet, wo sie mit kohlegefilterter, befeuchteter Luft (1,5 l min-1) gemischt wurde. Die Antenne wurde 0,5 cm vom Auslass des Röhrchens entfernt platziert. Jede einzelne Mücke entsprach einem Replikat und bei wirtssuchenden Mücken wurden mindestens drei Replikate an Urinproben jeden Alters durchgeführt.
Identifizierung bioaktiver Verbindungen in Headspace-Sammlungen von frischem und gealtertem Rinderurin mittels eines kombinierten GC- und Massenspektrometers (GC-MS; 6890 GC und 5975 MS; Agilent Technologies) zur Auslösung von Antennenreaktionen in der GC-EAD-Analyse, die im Elektronenstoßionisationsmodus bei 70 eV betrieben wird. Der GC war mit einer HP-5MS UI-beschichteten Quarzglas-Kapillarsäule (60 m × 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 μm Filmdicke) ausgestattet, die Helium als mobile Phase mit einer durchschnittlichen linearen Flussrate von 35 cm s-1 verwendete. Eine 2-μl-Probe wurde mit den gleichen Injektoreinstellungen und der gleichen Ofentemperatur wie für die GC-EAD-Analyse injiziert. Die Verbindungen wurden anhand ihrer Retentionszeit (Kovát-Index) und Massenspektren im Vergleich zur benutzerdefinierten Bibliothek und der NIST14-Bibliothek (Agilent) identifiziert. Die identifizierten Verbindungen wurden durch Injektion authentischer Standards bestätigt (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2).Zur Quantifizierung wurde Heptylacetat (10 ng, 99,8 % chemische Reinheit, Aldrich) als externer Standard injiziert.
Bewertung der Wirksamkeit einer synthetischen Geruchsmischung aus bioaktiven Verbindungen, die in frischem und gealtertem Urin identifiziert wurden, um wirtssuchende und blutsaugende Ans. arabiensis anzulocken, unter Verwendung desselben Olfaktometers und Protokolls wie oben. Synthetische Mischungen ahmten die Zusammensetzung und die Anteile der Verbindungen in gemischten flüchtigen Headspace-Extrakten aus frischem, 24-Stunden-, 48-Stunden-, 72-Stunden- und 168-Stunden-Urin nach (Abbildung 5D-G; Zusätzliche Datei 1: Tabelle S2). Für die Analyse wurden 10 μl einer 1:100-Verdünnung der vollsynthetischen Mischung mit einer Gesamtfreisetzungsrate von ca. 140-2400 ng h-1 verwendet, um die Attraktivität für Wirts- und blutsaugende Mücken zu bewerten. Anschließend wurde der Test mit vollständigen Mischungen durchgeführt, wobei subtraktive Mischungen einzelner Verbindungen der vollständigen Mischung entfernt wurden. Seek-Reaktionen von Wirts- und blutgespeisten Ans. Arab im Vergleich zu synthetischen und subtraktiven Mischungen wurden analysiert mithilfe einer nominalen logistischen Regression, gefolgt von paarweisen Vergleichen für ungerade Verhältnisse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Um zu beurteilen, ob Kuhurin als Wirtshabitat-Signal für Malariamücken dienen kann, wurden frischer und gealterter Kuhurin, der wie oben beschrieben gesammelt wurde, sowie Wasser in 3-Liter-Eimer (100 ml) mit Maschen gefüllt und in Köderfallen (BG-HDT-Version; BioGents, Regensburg, DE) gestellt. Zehn Fallen wurden im Abstand von 50 m auf Weiden, 400 m von einer Dorfgemeinschaft (Silay, Äthiopien, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) ohne Viehbesatz entfernt, auf permanenten Brutplätzen und in Dörfern aufgestellt. Fünf Fallen wurden beheizt, um die Anwesenheit eines Wirtes zu simulieren, während fünf Fallen unbeheizt blieben. Jeder Behandlungsort wurde jede Nacht für insgesamt fünf Nächte gewechselt. Die Anzahl der in mit Urin unterschiedlichen Alters als Köder versehenen Fallen gefangenen Mücken wurde mittels logistischer Regression mit einer Beta-Binomialverteilung (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) verglichen.
In einem von Malaria betroffenen Dorf nahe der Stadt Maki in der Region Oromia in Äthiopien (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Abbildung 6A). Die Studie wurde zwischen Mitte August und Mitte September vor der jährlichen Insektizidbehandlung in Innenräumen und während einer langen Regenzeit durchgeführt. Für die Studie wurden fünf Häuserpaare (20–50 m voneinander entfernt) am Rande des Dorfes ausgewählt (Abb. 6A). Die Auswahl der Häuser erfolgte nach folgenden Kriterien: Keine Tiere im Haus erlaubt, kein Kochen im Haus (mit Brennholz oder Holzkohle) erlaubt (zumindest während des Versuchszeitraums) und maximal zwei Bewohner in den Häusern, die ohne Insektizide schliefen. unter dem behandelten Moskitonetz. Die ethische Genehmigung wurde vom Institutional Research Ethics Review Board (IRB/022/2016) der Fakultät für Naturwissenschaften (CNS-IRB) der Universität Addis Abeba gemäß den in der Deklaration von Helsinki des Weltärztebundes festgelegten Richtlinien erteilt. Die Zustimmung jedes Haushaltsvorstands wurde mit Unterstützung von Mitarbeitern der Gesundheitsberatung eingeholt. Der gesamte Prozess wird von den lokalen Verwaltungen auf Distrikt- und Gemeindeebene („Kebele“) gebilligt. Das Versuchsdesign folgte einem 2 × 2 großen lateinischen Quadrat, bei dem synthetische Mischungen und Kontrollen in der ersten Nacht gepaarten Häusern zugewiesen und in der nächsten Versuchsnacht zwischen den Häusern getauscht wurden. Dieser Prozess wurde zehnmal wiederholt. Um die Mückenaktivität in ausgewählten Häusern abzuschätzen, wurden die CDC-Fallen zusätzlich so aufgestellt, dass sie fünf aufeinanderfolgende Nächte lang zu Beginn, in der Mitte und am Ende des Feldversuchs zur gleichen Tageszeit liefen.
Eine synthetische Mischung mit sechs bioaktiven Verbindungen wurde in Heptan (97,0 % Lösungsmittel, GC-Qualität, Sigma Aldrich) gelöst und mithilfe eines Baumwolldochtspenders mit einer Menge von 140 ng/h freigesetzt [20]. Der Dochtspender ermöglichte die Freisetzung aller Verbindungen in konstanten Mengen während des 12-stündigen Experiments. Heptan diente als Kontrolle. Das Fläschchen wurde neben dem Eingang der Lichtfalle der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Abbildung 6A) aufgehängt. Die Fallen wurden 0,8 – 1 m über dem Boden in der Nähe des Fußendes des Bettes aufgehängt, und ein Freiwilliger schlief unter einem unbehandelten Moskitonetz. Die Fallen wurden zwischen 18:00 und 06:30 Uhr bedient. Die nach Geschlecht und physiologischem Status (ungefüttert, gefüttert, halbschwanger und trächtig [21]) gefangenen Mücken wurden anschließend mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) untersucht, um die morphologisch als A. gambiae identifizierte Art zu identifizieren. sl. Mitglieder des Komplexes [23]. In der Feldstudie wurde der Fallenfang in Paarhäusern mithilfe eines nominalen logistischen Anpassungsmodells analysiert, wobei die Anziehungskraft die abhängige Variable und die Behandlung (synthetische Mischung vs. Kontrolle) der feste Effekt war (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Hier berichten wir über die χ2- und p-Werte des Likelihood-Ratio-Tests.
Bewerten Sie, ob es sicher ist. arabiensis konnte Urin, seine Hauptstickstoffquelle, Harnstoff, durch direkte Fütterung innerhalb von 48 Stunden nach der Verabreichung für 4 Tage nach (dpe) Fütterungsversuche mit wirtssuchenden und blutgesaugten Weibchen aufnehmen (Abb. 1A). Sowohl wirtssuchende als auch blutsaugende Weibchen absorbierten signifikant mehr Saccharose als jede andere Nahrung oder Wasser (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 bzw. F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; Abb. 1B,C). Darüber hinaus aßen wirtssuchende Weibchen nach 72 Stunden weniger Urin als nach 168 Stunden (Abb. 1B). Bei Angebot einer harnstoffhaltigen Nahrung absorbierten wirtssuchende Weibchen eine signifikant größere Menge Harnstoff bei 2,69 mM im Vergleich zu allen anderen Konzentrationen und Wasser, während sie nicht von 10% Saccharose (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Abbildung 1D). Dies stand im Gegensatz zur Reaktion der mit Blut gefütterten Weibchen, die typischerweise signifikant mehr harnstoffhaltige Nahrung als Wasser aufnahmen, wenn auch signifikant weniger als 10% Saccharose (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Abbildung 1E). Darüber hinaus absorbierten phlebotomierte Weibchen beim Vergleich der beiden physiologischen Zustände mehr Harnstoff als wirtssuchende Weibchen bei den niedrigsten Konzentrationen, und diese Weibchen absorbierten ähnliche Mengen Harnstoff bei höheren Konzentrationen (F(1,953)= 78,82, p < 0,0001; Abb. 1F, G). Während die Aufnahme aus einer harnstoffhaltigen Nahrung optimale Werte zu haben schien (Abb. 1D,E), waren Weibchen in beiden physiologischen Zuständen in der Lage modulieren die absorbierte Harnstoffmenge über den gesamten Bereich der Harnstoffkonzentrationen in einer log-linearen Weise (Abb. 1F, G). In ähnlicher Weise scheinen Mücken ihre Stickstoffaufnahme durch Regulierung der absorbierten Urinmenge zu kontrollieren, da sich die Stickstoffmenge im Urin in der absorbierten Menge widerspiegelt (Abbildung 1B, C und B, Einschübe).
Um die Auswirkungen von Urin und Harnstoff auf das Überleben wirtssuchender und blutsaugender Mücken zu beurteilen, wurden Weibchen mit Urin aller vier Altersstufen (frisch, 24 h, 72 h und 168 h nach der Ablagerung) und einer Reihe von Harnstoffkonzentrationen gefüttert. Als Kontrolle dienten destilliertes Wasser und 10 % Saccharose (Abbildung 2A). Diese Überlebensanalyse zeigte, dass die Ernährung einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben bei wirtssuchenden Weibchen (Urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Abb. 2B, C) und blutgespeisten Weibchen (Urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Abbildung 2D,E). In allen Experimenten hatten Weibchen, die mit Urin, Harnstoff und Wasser gefüttert wurden, signifikant niedrigere Überlebensraten als Weibchen, die eine Saccharose-Diät erhielten (Abbildung 2B-E). Wirtssuchende Weibchen, die mit frischem und abgestandenem Urin gefüttert wurden, zeigten unterschiedliche Überlebensraten, wobei diejenigen, die mit 72 Stunden abgestandenem Urin gefüttert wurden (p = 0,016), die niedrigste Überlebenswahrscheinlichkeit hatten (Abbildung 2B). Darüber hinaus überlebten wirtssuchende Weibchen, die mit 135 mM Harnstoff gefüttert wurden, länger als die Wasserkontrollgruppe (p < 0,04) (Abbildung 2C). Im Vergleich zu Wasser überlebten Frauen, die mit frischem Urin und 24-Stunden-Urin gefüttert wurden, länger (p = 0,001 bzw. p = 0,012; Abbildung 2D), während Frauen, die mit 72-Stunden-Urin gefüttert wurden, länger überlebten als diejenigen, die mit frischem Urin und 24 Stunden gealtertem Urin gefüttert wurden 0,0001 bzw. p = 0,013; Abbildung 2D). Bei der Fütterung mit 135 mM Harnstoff überlebten mit Blut ernährte Weibchen länger als bei allen anderen Konzentrationen von Harnstoff und Wasser (p < 0,013; Abbildung 2E).
Überleben von Wirts- und blutsaugenden weiblichen Anopheles arabinis, die sich von Kuhurin und Harnstoff ernähren. Im Bioassay (A) erhielten weibliche Mücken eine Nahrung aus frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Konzentrationen von Harnstoff, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O). Das Überleben der wirtssuchenden (B, C) und blutsaugenden (D, E) Mücken wurde alle 12 Stunden aufgezeichnet, bis alle Weibchen, die sich von Urin (B, D) und Harnstoff (C, E) sowie den Kontrollgruppen Saccharose und Wasser ernährt hatten, tot waren.
Die im Flugmühlentest über einen Zeitraum von 24 Stunden ermittelte Gesamtdistanz und Rundenzahl unterschieden sich zwischen wirtssuchenden und blutsaugenden Mücken, die insgesamt eine geringere Flugaktivität zeigten (Abb. 3). Wirtssuchende Mücken, die frischen und gealterten Urin oder Saccharose und Wasser lieferten, zeigten unterschiedliche Flugmuster (Abb. 3): Weibchen, die sich von frischem Urin ernährten, waren im Morgengrauen aktiver, während Weibchen, die sich von 24 bzw. 168 Stunden altem Urin ernährten, andere Flugmuster zeigten und überwiegend tagaktiv waren. Weibliche Mücken, die Saccharose oder 72-Stunden-Urin lieferten, waren während des gesamten 24-Stunden-Zeitraums aktiv, während Weibchen, die Wasser lieferten, in der Mitte des Zeitraums aktiver waren. Mit Saccharose ernährte Mücken zeigten spät in der Nacht und früh am Morgen die höchsten Aktivitätsgrade, während die Aktivität derjenigen, die 72 Stunden alten Urin zu sich nahmen, innerhalb von 24 Stunden stetig abnahm (Abbildung 3).
Flugverhalten von blutsaugenden weiblichen Anopheles arabinis, die sich von Kuhurin und Harnstoff ernähren. Im Flugmühlentest wurden weibliche Stechmücken, die sich von frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Konzentrationen von Harnstoff, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O) ernährten, an horizontalen, frei rotierenden Armen befestigt (oben). Für wirtssuchende (links) und blutsaugende (rechts) Weibchen wurden die Gesamtdistanz und die Anzahl der Flüge pro Stunde für jede Nahrung über einen Zeitraum von 24 Stunden aufgezeichnet (dunkel: grau; hell: weiß). Die durchschnittliche Distanz und die durchschnittliche Anzahl der Flüge sind rechts neben dem Diagramm der zirkadianen Aktivität dargestellt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Statistische Analyse siehe Text.
Im Allgemeinen folgte die Flugaktivität wirtssuchender Weibchen einem ähnlichen Muster wie die Flugdistanz über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die mittlere Flugdistanz wurde signifikant durch die aufgenommene Nahrung beeinflusst (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001). Wirtssuchende Weibchen, die 72 Stunden Urin zu sich nahmen, flogen signifikant größere Distanzen als alle anderen Nahrungen (p < 0,0001). Mit Saccharose gefütterte Mücken flogen länger als mit frischem (p = 0,022) oder 24 Stunden altem Urin (p = 0,022) gefütterte Mücken. Im Gegensatz zum Flugaktivitätsmuster, das durch die Urindiät beschrieben wurde, zeigten mit Harnstoff gefütterte wirtssuchende Weibchen eine anhaltende Flugaktivität über einen Zeitraum von 24 Stunden, die ihren Höhepunkt in der zweiten Hälfte der Dunkelphase erreichte (Abb. 3). Obwohl die Aktivitätsmuster ähnlich waren, erhöhte sich die mittlere Flugdistanz bei wirtssuchenden Weibchen, die Harnstoff gefüttert wurden, signifikant, abhängig von der aufgenommenen Konzentration (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Wirtssuchende Weibchen, denen Harnstoff in beliebiger Konzentration verabreicht wurde, flogen länger als Weibchen, denen entweder Wasser oder Saccharose verabreicht wurde (p < 0,03).
Die allgemeine Flugaktivität blutsaugender Mücken war bei allen Diäten stabil und blieb über 24 Stunden hinweg bestehen, mit erhöhter Urinaktivität während der zweiten Hälfte der Dunkelperiode bei Weibchen, die mit Wasser gefüttert wurden, sowie bei Weibchen, die frisch gefüttert wurden und 24 Stunden alt waren (Bild 3). Während die Urindiät die mittlere Flugdistanz bei mit Blut gefütterten Weibchen signifikant beeinflusste (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), war dies bei der Harnstoffdiät nicht der Fall (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). Mit anderem Urin und Kontrolldiät (frisch, p = 0,0091; 72 Stunden, p = 0,0022; 168 Stunden, p = 0,001; Saccharose, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Die Auswirkungen der Fütterung mit Urin und Harnstoff auf die Reproduktionsparameter wurden in Bioassays zur Eiablage bewertet (Abbildung 4A) und anhand der Anzahl der von jedem Weibchen gelegten Eier, der Eigröße und der frisch geschlüpften Larven im ersten Stadium untersucht. Die Anzahl der gelegten Eier bei mit Urin gefütterten arabischen Weibchen variierte je nach Ernährung (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Abbildung 4B). Weibchen, die 24 Stunden lang mit Urin und Blut gefüttert wurden, legten signifikant mehr Eier als Weibchen, die andere Urindiäten erhielten, und ähnelten denen, die mit Saccharose gefüttert wurden (Abbildung 4B). Ebenso variierte die Größe der von mit Urin gefütterten Weibchen gelegten Eier je nach Ernährung (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), wobei mit 24 Stunden lang mit Urin und Saccharose gefütterte Weibchen signifikant größere Eier legten als mit Wasser gefütterte Weibchen, während die Eier von Weibchen, die 168 Stunden lang mit Urin waren signifikant kleiner (Abb. 4C). Darüber hinaus hatte die Urindiät einen signifikanten Einfluss auf die Larvengröße (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), wobei aus Eiern von 24 und 72 Stunden alten, mit Urin gefütterten Weibchen signifikant größere Larven schlüpften als aus Eiern von mit Wasser und 168 Stunden alten, mit Urin gefütterten Weibchen (Abb. 4D).
Reproduktionsleistung weiblicher Anopheles arabinis-Mücken, die sich von Kuhurin und Harnstoff ernähren. Blutgenährte weibliche Mücken wurden 48 Stunden lang mit einer Diät aus frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Harnstoffkonzentrationen, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O) gefüttert, bevor sie in Bioassays eingesetzt wurden und nach 48 Stunden Eiablagesubstrate erhielten (A). Die Anzahl der Eier (B, E), die Größe der Eier (C, F) und die Größe der Larven (D, G) wurden signifikant durch die bereitgestellte Diät (Kuhurin: BD; Harnstoff: EG) beeinflusst. Die Mittelwerte für jeden Parameter, die mit unterschiedlichen Buchstabennamen gemessen wurden, unterschieden sich signifikant voneinander (einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Analyse; p < 0,05). Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar
Als wichtigster stickstoffhaltiger Bestandteil des Urins hatte Harnstoff, wenn er bluternährten Weibchen als Nahrung verabreicht wurde, in allen Studien einen signifikanten Einfluss auf die Fortpflanzungsparameter. Die Anzahl der Eier, die mit Harnstoff gefütterte Weibchen nach einer Blutmahlzeit legten, hing von der Harnstoffkonzentration ab (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001). Weibchen, die mit Harnstoffkonzentrationen zwischen 134 µM und 1,34 mM gefüttert wurden, legten mehr Eier (Abbildung 4E). Weibchen, die mit Harnstoffkonzentrationen von 134 µM oder mehr gefüttert wurden, legten größere Eier als Weibchen, die mit Wasser gefüttert wurden (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Abbildung 4F), und die Larvengröße war, obwohl sie bei Müttern durch ähnliche Harnstoffkonzentrationen beeinflusst wurde, variabler (Abbildung 4G).
Die allgemeine Anziehungskraft auf wirtssuchende Rinderurin-Kopfraumextrakte. Die im Glasröhren-Olfaktometer (Abb. 5A) untersuchte Arabiensis wurde signifikant durch das Alter des Urins beeinflusst (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Abb. 5B). Eine Post-hoc-Analyse zeigte, dass der Geruch von abgestandenem Urin nach 24 Stunden eine signifikant höhere Attraktivität verursachte als alle anderen Behandlungen (72 Stunden: p = 0,0060, 168 Stunden: p = 0,012, Pentan: p = 0,00070), mit Ausnahme des Geruchs von frischem Urin (p = 0,13; Abbildung 5B). Obwohl die allgemeine Anziehungskraft von Uringeruch auf blutsaugende Mücken nicht signifikant unterschiedlich war (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Abb. 5C), erwiesen sich diese Weibchen als signifikant attraktiver für flüchtige Kopfraumextrakte. verglichen mit 72 Stunden altem Urin im Vergleich zu Kontrollpersonen (p = 0,0066; Abbildung 5C).
Verhaltensreaktionen auf natürliche und synthetische Kuhuringerüche bei der Suche nach Wirt und blutsaugenden Anopheles arabianus. Schematische Darstellung des Glasröhren-Olfaktometers (A). Anziehung flüchtiger Extrakte aus frischem und gealtertem Kuhurin durch Wirts- (B) und blutsaugende (C) Mücken. Die Tentakelreaktion des Herrn An. Dargestellt sind Extrakte aus frischem (D), 24 Stunden (E), 72 Stunden (F) und 168 Stunden (G) gealtertem Kuhurin. Die Elektronenantennendetektionskurven (EAD) zeigen Spannungsänderungen als Reaktion auf bioaktive Verbindungen im Kopfraum, die aus dem Gaschromatographen eluiert und von einem Flammenionisationsdetektor (FID) detektiert wurden. Der Maßstab stellt die Reaktionsamplitude (mV) gegenüber der Retentionszeit (s) dar. Die Eigenschaften und Freisetzungsraten (µg h-1) der biologisch aktiven Verbindungen werden angezeigt. Ein einzelnes Sternchen (*) kennzeichnet eine gleichbleibend niedrige Amplitude. Doppelte Sternchen (**) zeigen nicht reproduzierbare Reaktionen an.Finden Sie den Wirt (H) und den blutsaugenden (I) An.arabiensis hat unterschiedliche Reize für synthetische Mischungen aus frischem und gealtertem Kuhuringeruch.Die mittleren Anteile der Mücken, die von verschiedenen Buchstabennamen angezogen wurden, unterschieden sich signifikant voneinander (einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Analyse; p < 0,05).Fehlerbalken stellen den Standardfehler der Skala dar
Bei weiblichen Ann.arabiensis wurde 72 Stunden und 120 Stunden nach der Blutmahlzeit während des Laichens keine Präferenz für flüchtige Headspace-Extrakte aus frischem und gealtertem Kuhurin im Vergleich zu Pentan-Kontrollen gezeigt (χ2 = 3,07, p > 0,05; Zusätzliche Datei 1: Abb. S1).
Bei weiblichen Ann. arabiensis wurden durch GC-EAD- und GC-MS-Analysen acht, sechs, drei und drei bioaktive Verbindungen identifiziert (Abbildung 5D-G). Obwohl Unterschiede in der Anzahl der Verbindungen beobachtet wurden, die elektrophysiologische Reaktionen hervorriefen, waren die meisten dieser Verbindungen in jedem flüchtigen Headspace-Extrakt vorhanden, der aus frischem und gealtertem Urin gesammelt wurde. Daher wurden für jeden Extrakt nur Verbindungen in die weiteren Analysen einbezogen, die eine physiologische Reaktion der weiblichen Antennen über dem Schwellenwert hervorriefen.
Die Gesamtfreisetzungsrate flüchtiger bioaktiver Verbindungen in der Headspace-Sammlung stieg von 29 µg h-1 in frischem Urin auf 242 µg h-1 in 168 Stunden altem Urin, hauptsächlich aufgrund von Anstiegen bei p-Kresol und m-Formaldehyd sowie Phenol. Im Gegensatz dazu nahmen die Freisetzungsraten anderer Verbindungen wie 2-Cyclohexen-1-on und Decanal mit zunehmendem Alter des Urins ab, was mit der beobachteten Abnahme der Signalintensität (Häufigkeit) im Chromatogramm (Abb. 5D-G, linkes Feld) und den physiologischen Reaktionen auf diese Verbindungen (Abb. 5D-G, rechtes Feld) korrelierte.
Insgesamt wies die synthetische Mischung ein ähnliches natürliches Verhältnis bioaktiver Verbindungen auf, die in flüchtigen Extrakten aus frischem und gealtertem Urin identifiziert wurden (Abb. 5D–G), und schien bei der Suche nach einem Wirt (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Abb. 5H) oder blutsaugenden Mücken (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Abb. 5I) keine nennenswerte Anziehungskraft auszuüben. Allerdings zeigten nachträgliche paarweise Vergleiche zwischen den Behandlungen, dass wirtssuchende Mücken im Vergleich zu Pentan-Kontrollen eine signifikante Anziehungskraft auf die synthetische Mischung aus 24 Stunden gealtertem Urin hatten (p = 0,0086; Abbildung 5H).
Um die Rolle einzelner Komponenten in synthetischen Mischungen aus 24 Stunden altem Urin zu beurteilen, wurden sechs subtraktive Mischungen im Y-Rohr-Test mit vollständigen Mischungen verglichen, aus denen einzelne Verbindungen entfernt wurden. Bei wirtssuchenden Mücken hatte das Entfernen einzelner Verbindungen aus der vollständigen Mischung einen signifikanten Effekt auf die Verhaltensreaktionen (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2A), alle subtraktiven Mischungen waren attraktiver als vollständig gemischt. Im Gegensatz dazu hatte das Entfernen einzelner Verbindungen aus der vollständig synthetischen Mischung keine Auswirkungen auf die Verhaltensreaktionen blutsaugender Mücken (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), mit Ausnahme von Decanal, das im Vergleich zur vollständigen Mischung zu geringeren Anziehungskräften führte (p = 0,022; Zusätzliche Datei 1: Abbildung S2B).
In einem von Malaria betroffenen Dorf in Äthiopien wurde die Wirksamkeit einer synthetischen Mischung aus 24-Stunden-Kuhurin zur Anlockung von Mücken unter Feldbedingungen zehn Nächte lang untersucht (Abb. 6A). Insgesamt wurden 4.861 Mücken gefangen und identifiziert, davon 45,7 % Anthropus.gambiae sl, 18,9 % Anopheles pharoensis und 35,4 % Culex spp. (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Anopheles arabinis ist das einzige Mitglied des An.Gambian-Artenkomplexes, das durch PCR-Analyse identifiziert wurde. Durchschnittlich wurden 320 Mücken pro Nacht gefangen, wobei Fallen mit synthetischen Ködern mehr Mücken fingen als gepaarte Fallen ohne Mischung (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). In jeder der fünf Kontrollnächte wurden zu Beginn, in der Mitte und am Ende der Versuch. In jedem Fallenpaar wurde eine ähnliche Anzahl von Mücken gefangen, was darauf hindeutet, dass es zwischen den Häusern keine Verzerrung gibt (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) und dass während des Untersuchungszeitraums keine Populationsabnahme stattgefunden hat. Im Vergleich zu den Kontrollfallen war die Zahl der in den Fallen mit der synthetischen Mischung gefangenen Mücken signifikant erhöht: Wirtssuche (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), kürzlich erfolgte Blutaufnahme (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) und Schwangerschaft (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Dies spiegelt sich auch in der Gesamtzahl der gefangenen Mücken wider: Wirtssuche > blutsaugend > schwanger > halbschwanger > männlich.
Feldbewertung der Wirksamkeit einer 24-stündigen Geruchsmischung aus synthetischem Kuhurin. Feldversuche wurden in Süd-Zentral-Äthiopien (Karte), nahe der Stadt Maki (Einschub), durchgeführt. Dabei wurde eine Lichtfalle der Centers for Disease Control (CDC) (rechts) in gepaarten Häusern mit lateinischem Quadratdesign (Luftbild) verwendet (A). Mit synthetischen Geruchsködern versehene CDC-Fotofallen locken weibliche Anopheles arabesques (B) an und fangen sie, nicht jedoch Anopheles farroes (C). Dieser Effekt ist physiologisch zustandsabhängig. Darüber hinaus fingen diese Fallen signifikant mehr Wirtsmücken der Art Culex (D) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Balken auf der linken Seite stellen den durchschnittlichen Selektionsindex der in Paaren von Fallen mit Geruchsköder (grün) und Kontrollfallen (offen) gefangenen Mücken dar (N = 10), während die Balken auf der rechten Seite den durchschnittlichen Selektionsindex in Paaren von Kontrollfallen (offen; N = 5) darstellen. ).Sternchen zeigen statistische Signifikanzniveaus an (*p = 0,01 und ***p < 0,0001)
Die drei Arten wurden in Fallen mit synthetischen Mischungen unterschiedlich gefangen. Bei der Wirtssuche (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), der Blutsaugung (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) und der Trächtigkeit (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) wurde eine .arabiensis in der Falle gefangen, die die synthetische Mischung freisetzte (Abb. 6B), während die Menge an An.Pharoensis sich nicht unterschied (Abb. 6C). Bei Culex wurde im Vergleich zu Kontrollfallen nur in Fallen mit synthetischem Köder ein signifikanter Anstieg der Anzahl wirtssuchender Mücken festgestellt (χ2(1, 1319) = 12,6, p = 0,0004; Abb. 6D).
Mithilfe von Köderfallen, die außerhalb potenzieller Wirte zwischen Brutstätten und ländlichen Gemeinden in Äthiopien aufgestellt wurden, wurde untersucht, ob Malariamücken den Geruch von Kuhurin als Hinweis auf ihren Wirtslebensraum nutzen. Ohne Wirtshinweise, Hitze und mit oder ohne Kuhuringeruch wurden keine Mücken gefangen (Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Bei hohen Temperaturen und Kuhuringeruch wurden jedoch weibliche Malariamücken angelockt und gefangen, wenn auch in geringer Zahl und unabhängig vom Alter des Urins (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Im Gegensatz dazu wurden in Wasserkontrollen bei hohen Temperaturen keine Malariamücken gefangen (Zusatzdatei 1: Abbildung S3).
Malaria-Mücken nehmen stickstoffhaltige Verbindungen durch kompensatorisches Fressen von Kuhurin (z. B. Pfützen) auf und verteilen diese, um ihre Lebensgeschichte zu verbessern, ähnlich wie andere Insekten [2, 4, 24, 25, 26]. Kuhurin ist eine leicht verfügbare, erneuerbare Ressource, die eng mit Ruheplätzen für Malariaüberträger verbunden ist, wie z. B. Kuhställen und hoher Vegetation in der Nähe von ländlichen Wohnstätten und Laichplätzen. Weibliche Mücken orten diese Ressource durch Geruch und können die Aufnahme stickstoffhaltiger Verbindungen im Urin, einschließlich Harnstoff, dem wichtigsten Stickstoffbestandteil im Urin, regulieren [15, 16]. Abhängig vom physiologischen Zustand der weiblichen Mücke werden Nährstoffe im Urin verteilt, um die Flugaktivität und das Überleben wirtssuchender weiblicher Mücken sowie das Überleben und die Fortpflanzungsmerkmale blutgespeister Individuen während des ersten gonadotropen Zyklus zu verbessern. Daher spielt die Urinmischung eine wichtige Rolle bei der Ernährung von Malariaüberträgern, die wie unterernährte erwachsene Mücken geschlossen sind [8], da sie weiblichen Mücken die Aufnahme wichtiger stickstoffhaltiger Verbindungen ermöglicht. durch Fütterung mit geringem Risiko.Diese Erkenntnis hat erhebliche epidemiologische Konsequenzen, da die Lebenserwartung, Aktivität und Reproduktionsleistung der Weibchen steigt, was sich alles auf die Vektorkapazität auswirkt.Darüber hinaus könnte dieses Verhalten das Ziel zukünftiger Vektormanagementprogramme sein.