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Kürzlich wurde eine chemiefreie antimikrobielle Plattform auf Basis von Nanotechnologie unter Verwendung künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) entwickelt. EWNS haben eine hohe Oberflächenladung und sind mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gesättigt, die mit einer Reihe von Mikroorganismen, einschließlich lebensmittelbedingter Krankheitserreger, interagieren und diese inaktivieren können. Hier wird gezeigt, dass ihre Eigenschaften während der Synthese fein abgestimmt und optimiert werden können, um ihr antibakterielles Potenzial weiter zu steigern. Die EWNS-Laborplattform wurde entwickelt, um die Eigenschaften von EWNS durch Änderung der Syntheseparameter fein abzustimmen. Charakterisierung der EWNS-Eigenschaften (Ladung, Größe und ROS-Gehalt) mittels moderner Analysemethoden. Darüber hinaus wurden sie auf ihr mikrobielles Inaktivierungspotenzial gegenüber lebensmittelbedingten Mikroorganismen wie Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum und Saccharomyces cerevisiae untersucht. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Eigenschaften von EWNS während der Synthese fein abgestimmt werden können, was zu einer exponentiellen Steigerung der Inaktivierungseffizienz führt. Insbesondere erhöhte sich die Oberflächenladung um den Faktor vier und die Anzahl der reaktiven Sauerstoffspezies nahm zu. Die mikrobielle Entfernungsrate war mikrobiell abhängig und lag nach einer 45-minütigen Exposition gegenüber einer Aerosoldosis von 40.000 #/cc EWNS zwischen 1,0 und 3,8 log.
Mikrobielle Kontamination ist die Hauptursache für lebensmittelbedingte Erkrankungen, die durch die Aufnahme von Krankheitserregern oder deren Toxinen verursacht werden. Allein in den USA verursachen lebensmittelbedingte Erkrankungen jährlich etwa 76 Millionen Erkrankungen, 325.000 Krankenhauseinweisungen und 5.000 Todesfälle1. Darüber hinaus schätzt das US-Landwirtschaftsministerium (USDA), dass der erhöhte Konsum von Frischwaren für 48 % aller gemeldeten lebensmittelbedingten Erkrankungen in den USA verantwortlich ist2. Die Kosten für Erkrankungen und Todesfälle durch lebensmittelbedingte Krankheitserreger in den USA sind sehr hoch und werden von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) auf über 15,6 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt3.
Derzeit werden chemische4, strahlenbasierte5 und thermische6 antimikrobielle Interventionen zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit meist nur an begrenzten kritischen Kontrollpunkten (CCPs) entlang der Produktionskette (normalerweise nach der Ernte und/oder während der Verpackung) und nicht kontinuierlich durchgeführt. Daher besteht die Gefahr einer Kreuzkontamination. 7. Eine bessere Kontrolle von durch Lebensmittel verursachten Krankheiten und Lebensmittelverderb erfordert antimikrobielle Interventionen, die potenziell über den gesamten Erzeugerbereich hinweg angewendet werden können und gleichzeitig die Umweltbelastung und die Kosten reduzieren.
Kürzlich wurde eine chemikalienfreie, nanotechnologiebasierte antimikrobielle Plattform entwickelt, die mithilfe künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) Bakterien auf Oberflächen und in der Luft inaktivieren kann. EWNS wurden mithilfe von zwei parallelen Verfahren synthetisiert: Elektrospray und Wasserionisation (Abb. 1a). Frühere Studien haben gezeigt, dass EWNS einzigartige physikalische und biologische Eigenschaften besitzen8,9,10. EWNS besitzen durchschnittlich 10 Elektronen pro Struktur und eine durchschnittliche Nanogröße von 25 nm (Abb. 1b,c)8,9,10. Zudem hat die Elektronenspinresonanz (ESR) gezeigt, dass EWNS große Mengen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) enthalten, hauptsächlich Hydroxyl- (OH•) und Superoxidradikale (O2-) (Abb. 1c)8. EVNS sind lange Zeit in der Luft und können mit in der Luft schwebenden und auf Oberflächen vorhandenen Mikroorganismen kollidieren, wobei sie ihre ROS-Fracht freisetzen und die Mikroorganismen inaktivieren (Abb. 1d). Diese frühen Studien zeigten auch, dass EWNS mit verschiedenen gramnegativen und grampositiven Bakterien, einschließlich Mykobakterien, auf Oberflächen und in der Luft interagieren und diese inaktivieren können. Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass die Inaktivierung durch eine Zerstörung der Zellmembran verursacht wurde. Darüber hinaus haben akute Inhalationsstudien gezeigt, dass hohe EWNS-Dosen keine Lungenschäden oder Entzündungen verursachen 8 .
(a) Elektrospray entsteht, wenn zwischen einem Kapillarröhrchen mit Flüssigkeit und einer Gegenelektrode Hochspannung angelegt wird. (b) Die Anwendung von hohem Druck führt zu zwei verschiedenen Phänomenen: (i) Elektrospray von Wasser und (ii) Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (Ionen), die in den EWNS eingeschlossen werden. (c) Die einzigartige Struktur der EWNS. (d) Aufgrund ihrer Nanoskala sind EWNS hochmobil und können mit luftübertragenen Krankheitserregern interagieren.
Die Fähigkeit der antimikrobiellen EWNS-Plattform, lebensmittelbedingte Mikroorganismen auf der Oberfläche frischer Lebensmittel zu inaktivieren, wurde kürzlich ebenfalls nachgewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Oberflächenladung von EWNS in Kombination mit einem elektrischen Feld für eine gezielte Verabreichung genutzt werden kann. Darüber hinaus waren vorläufige Ergebnisse für Bio-Tomaten nach einer 90-minütigen Exposition bei einer EWNS von etwa 50.000 #/cm3 ermutigend, wobei verschiedene lebensmittelbedingte Mikroorganismen wie E. coli und Listeria 11 beobachtet wurden. Darüber hinaus zeigten vorläufige organoleptische Tests keine sensorischen Effekte im Vergleich zu Kontrolltomaten. Obwohl diese ersten Inaktivierungsergebnisse selbst bei sehr niedrigen EWNS-Dosen von 50.000 #/cc für Anwendungen in der Lebensmittelsicherheit ermutigend sind, ist es klar, dass ein höheres Inaktivierungspotenzial vorteilhafter wäre, um das Infektions- und Verderbrisiko weiter zu senken.
Wir konzentrieren unsere Forschung auf die Entwicklung einer EWNS-Generierungsplattform, um die Syntheseparameter zu optimieren und die physikochemischen Eigenschaften der EWNS zu verbessern und so ihr antibakterielles Potenzial zu steigern. Die Optimierung konzentrierte sich insbesondere auf die Erhöhung der Oberflächenladung (zur Verbesserung der gezielten Abgabe) und des ROS-Gehalts (zur Verbesserung der Inaktivierungseffizienz). Die Charakterisierung der optimierten physikochemischen Eigenschaften (Größe, Ladung und ROS-Gehalt) erfolgt mittels moderner Analysemethoden und unter Verwendung gängiger Lebensmittelmikroorganismen wie E. coli.
EVNS wurde durch gleichzeitiges Elektrospraying und Ionisierung von hochreinem Wasser (18 MΩ cm–1) synthetisiert. Der elektrische Zerstäuber 12 wird typischerweise zur Zerstäubung von Flüssigkeiten und zur Synthese von Polymer- und Keramikpartikeln 13 sowie Fasern 14 kontrollierter Größe verwendet.
Wie in früheren Veröffentlichungen 8, 9, 10, 11 ausführlich beschrieben, wurde in einem typischen Experiment eine Hochspannung zwischen einer Metallkapillare und einer geerdeten Gegenelektrode angelegt. Während dieses Prozesses treten zwei verschiedene Phänomene auf: i) Elektrospray und ii) Wasserionisierung. Ein starkes elektrisches Feld zwischen den beiden Elektroden führt dazu, dass sich an der Oberfläche des kondensierten Wassers negative Ladungen aufbauen, was zur Bildung von Taylor-Kegeln führt. Dadurch bilden sich hochgeladene Wassertropfen, die gemäß der Rayleigh-Theorie weiter in kleinere Partikel zerfallen16. Gleichzeitig führen starke elektrische Felder dazu, dass sich einige Wassermoleküle spalten und Elektronen abstreifen (ionisieren), was zur Bildung einer großen Menge reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)17 führt. Gleichzeitig erzeugte ROS18 wurden in EWNS eingekapselt (Abb. 1c).
Abb. 2a zeigt das EWNS-Erzeugungssystem, das in dieser Studie entwickelt und für die EWNS-Synthese verwendet wurde. Gereinigtes Wasser aus einer geschlossenen Flasche wurde durch einen Teflonschlauch (2 mm Innendurchmesser) in eine 30G-Edelstahlnadel (Metallkapillare) geleitet. Der Wasserfluss wird durch den Luftdruck in der Flasche gesteuert, wie in Abbildung 2b dargestellt. Die Nadel ist auf einer Teflonkonsole montiert und kann manuell auf einen bestimmten Abstand von der Gegenelektrode eingestellt werden. Die Gegenelektrode ist eine polierte Aluminiumscheibe mit einem Loch in der Mitte zur Probenentnahme. Unter der Gegenelektrode befindet sich ein Aluminium-Probenahmetrichter, der über einen Probenentnahmeanschluss mit dem Rest des Versuchsaufbaus verbunden ist (Abb. 2b). Um Ladungsaufbau zu vermeiden, der den Probenehmerbetrieb stören könnte, sind alle Probenehmerkomponenten elektrisch geerdet.
(a) Engineered Water Nanostructure Generation System (EWNS). (b) Querschnitt des Probenehmers und des Elektrosprays mit Darstellung der wichtigsten Parameter. (c) Versuchsaufbau zur Bakterieninaktivierung.
Das oben beschriebene EWNS-Erzeugungssystem ermöglicht die Änderung wichtiger Betriebsparameter zur Feinabstimmung der EWNS-Eigenschaften. Die angelegte Spannung (V), der Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode (L) und der Wasserdurchfluss (φ) durch die Kapillare werden angepasst, um die EWNS-Eigenschaften zu optimieren. Symbole zur Darstellung verschiedener Kombinationen: [V (kV), L (cm)]. Der Wasserdurchfluss wird angepasst, um einen stabilen Taylor-Kegel mit einem bestimmten Wert von [V, L] zu erhalten. Für diese Studie wurde der Öffnungsdurchmesser der Gegenelektrode (D) auf 0,5 Zoll (1,29 cm) festgelegt.
Aufgrund der eingeschränkten Geometrie und Asymmetrie kann die elektrische Feldstärke nicht aus ersten Prinzipien berechnet werden. Stattdessen wurde die Software QuickField™ (Svendborg, Dänemark)19 zur Berechnung des elektrischen Felds verwendet. Da das elektrische Feld nicht einheitlich ist, wurde der Wert des elektrischen Felds an der Spitze der Kapillare als Referenzwert für verschiedene Konfigurationen verwendet.
Während der Studie wurden verschiedene Kombinationen aus Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode hinsichtlich der Taylor-Kegel-Bildung, der Taylor-Kegel-Stabilität, der EWNS-Produktionsstabilität und der Reproduzierbarkeit bewertet. Verschiedene Kombinationen sind in der Ergänzungstabelle S1 dargestellt.
Der Ausgang des EWNS-Erzeugungssystems wurde direkt an einen Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Modell 3936, TSI, Shoreview, MN) zur Messung der Partikelanzahlkonzentration sowie an ein Aerosol-Faraday-Elektrometer (TSI, Modell 3068B, Shoreview, MN) angeschlossen. ) für Aerosolströme wurde wie in unserer früheren Veröffentlichung beschrieben gemessen. Sowohl das SMPS als auch das Aerosolelektrometer entnahmen Proben bei einem Fluss von 0,5 l/min (Gesamtprobenfluss 1 l/min). Die Partikelanzahlkonzentration und der Aerosolfluss wurden 120 Sekunden lang gemessen. Die Messung wird 30-mal wiederholt. Basierend auf den Strommessungen wird die gesamte Aerosolladung berechnet und die durchschnittliche EWNS-Ladung für eine gegebene Gesamtzahl ausgewählter EWNS-Partikel geschätzt. Die durchschnittlichen Kosten von EWNS können mit Gleichung (1) berechnet werden:
Dabei ist IEl der gemessene Strom, NSMPS die mit dem SMPS gemessene digitale Konzentration und φEl die Durchflussrate pro Elektrometer.
Da die relative Luftfeuchtigkeit (RH) die Oberflächenladung beeinflusst, wurden Temperatur und (RH) während des Experiments konstant bei 21 °C bzw. 45 % gehalten.
Zur Messung der Größe und Lebensdauer der EWNS wurden Rasterkraftmikroskopie (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornien) und die AC260T-Sonde (Olympus, Tokio, Japan) verwendet. Die AFM-Scanfrequenz betrug 1 Hz, der Scanbereich 5 μm × 5 μm und die Scanlinien 256. Alle Bilder wurden mit der Asylum-Software einer Bildausrichtung erster Ordnung unterzogen (Maskenbereich 100 nm, Schwellenwert 100 pm).
Der Testtrichter wurde entfernt und die Glimmeroberfläche für eine Mittelungszeit von 120 s in einem Abstand von 2,0 cm von der Gegenelektrode platziert, um eine Partikelagglomeration und Bildung unregelmäßiger Tröpfchen auf der Glimmeroberfläche zu vermeiden. EWNS wurde direkt auf die Oberfläche von frisch geschnittenem Glimmer gesprüht (Ted Pella, Redding, CA). Bild der Glimmeroberfläche unmittelbar nach dem AFM-Sputtern. Der Kontaktwinkel der Oberfläche von frisch geschnittenem, unverändertem Glimmer liegt nahe 0°, sodass sich EVNS in Form einer Kuppel auf der Glimmeroberfläche verteilt. Durchmesser (a) und Höhe (h) der diffundierenden Tröpfchen wurden direkt anhand der AFM-Topographie gemessen und mithilfe unserer zuvor validierten Methode zur Berechnung des gewölbten Diffusionsvolumens von EWNS verwendet. Unter der Annahme, dass die integrierten EWNS das gleiche Volumen haben, kann der äquivalente Durchmesser mithilfe von Gleichung (2) berechnet werden:
Auf der Grundlage unserer zuvor entwickelten Methode wurde eine Elektronenspinresonanz (ESR)-Spinfalle verwendet, um das Vorhandensein kurzlebiger radikalischer Zwischenprodukte in EWNS zu erkennen. Aerosole wurden durch einen 650 μm Midget-Sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) geleitet, der eine 235 mM Lösung von DEPMPO (5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrrolin-N-oxid) (Oxis International Inc.), Portland, Oregon) enthielt. Alle ESR-Messungen wurden mit einem Bruker EMX-Spektrometer (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) und einer Flachbildzelle durchgeführt. Die Software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) wurde zum Sammeln und Analysieren der Daten verwendet. Die Bestimmung der Eigenschaften der ROS wurde nur für einen Satz von Betriebsbedingungen [-6,5 kV, 4,0 cm] durchgeführt. Die EWNS-Konzentrationen wurden unter Berücksichtigung der EWNS-Verluste im Impaktor mithilfe des SMPS gemessen.
Die Ozonwerte wurden mit einem 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co) überwacht8,9,10.
Für alle EWNS-Eigenschaften wird der Mittelwert als Messwert und die Standardabweichung als Messfehler verwendet. Es wurden T-Tests durchgeführt, um die Werte der optimierten EWNS-Attribute mit den entsprechenden Werten des Basis-EWNS zu vergleichen.
Abbildung 2c zeigt ein zuvor entwickeltes und charakterisiertes „Pull“-System zur elektrostatischen Abscheidung (EPES), das für die gezielte Abgabe von EWNS an der Oberfläche verwendet werden kann. EPES verwendet EVNS-Ladungen, die unter dem Einfluss eines starken elektrischen Felds direkt an die Oberfläche des Ziels „gelenkt“ werden können. Einzelheiten des EPES-Systems werden in einer aktuellen Veröffentlichung von Pyrgiotakis et al. 11 vorgestellt. EPES besteht aus einer 3D-gedruckten PVC-Kammer mit konischen Enden und enthält in der Mitte zwei parallele Metallplatten aus rostfreiem Stahl (Edelstahl 304, verspiegelt) im Abstand von 15,24 cm. Die Platten wurden an eine externe Hochspannungsquelle (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) angeschlossen, die untere Platte wurde immer mit positiver Spannung verbunden und die obere Platte immer mit Masse (schwebende Masse). Die Kammerwände sind mit Aluminiumfolie bedeckt, die elektrisch geerdet ist, um Partikelverlust zu vermeiden. Die Kammer verfügt über eine abgedichtete Ladetür an der Vorderseite, die es ermöglicht, Testoberflächen auf Kunststoffständer zu legen, die sie über die untere Metallplatte heben, um Hochspannungsstörungen zu vermeiden.
Die Ablagerungseffizienz von EWNS in EPES wurde gemäß einem zuvor entwickelten Protokoll berechnet, das in der ergänzenden Abbildung S111 detailliert beschrieben ist.
Als Kontrollkammer wurde eine zweite zylindrische Strömungskammer in Reihe mit dem EPES-System geschaltet, in der ein dazwischenliegender HEPA-Filter zur Entfernung von EWNS eingesetzt wurde. Wie in Abbildung 2c dargestellt, wurde das EWNS-Aerosol durch zwei eingebaute Kammern gepumpt. Der Filter zwischen Kontrollraum und EPES entfernt alle verbleibenden EWNS, wodurch Temperatur (T), relative Luftfeuchtigkeit (RH) und Ozonwerte gleich blieben.
Es wurde festgestellt, dass wichtige durch Lebensmittel übertragene Mikroorganismen frische Lebensmittel verunreinigen, wie z. B. E. coli (ATCC Nr. 27325), Fäkalindikator, Salmonella enterica (ATCC Nr. 53647), durch Lebensmittel übertragener Krankheitserreger, Listeria harmless (ATCC Nr. 33090), Surrogat für pathogene Listeria monocytogenes, abgeleitet von ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC Nr. 4098), ein Ersatz für Verderbnishefe, und ein resistenteres inaktiviertes Bakterium, Mycobacterium paralucky (ATCC Nr. 19686).
Kaufen Sie im Supermarkt verschiedene Kisten Bio-Kirschtomaten und lagern Sie diese bis zum Gebrauch (bis zu drei Tage) bei 4 °C im Kühlschrank. Die Versuchstomaten hatten alle die gleiche Größe, etwa einen halben Zoll Durchmesser.
Die Protokolle für Kultur, Inokulation, Exposition und Koloniezählung sind in unserer vorherigen Veröffentlichung und in den ergänzenden Daten detailliert beschrieben. Die Wirksamkeit von EWNS wurde durch 45-minütige Exposition inokulierter Tomaten gegenüber 40.000 #/cm³ bewertet. Kurz gesagt wurden drei Tomaten verwendet, um die überlebenden Mikroorganismen zum Zeitpunkt t = 0 min zu bewerten. Drei Tomaten wurden in EPES platziert und EWNS bei 40.000 #/cc ausgesetzt (EWNS-exponierte Tomaten), die restlichen drei wurden in die Kontrollkammer gegeben (Kontrolltomaten). Eine zusätzliche Verarbeitung der Tomaten in beiden Gruppen wurde nicht durchgeführt. EWNS-exponierte Tomaten und Kontrolltomaten wurden nach 45 Minuten entfernt, um die Wirkung von EWNS zu bewerten.
Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte gemäß dem in den ergänzenden Daten beschriebenen Protokoll.
Die Inaktivierungsmechanismen wurden durch Sedimentation bestrahlter EWNS-Proben (45 Min. bei 40.000 #/cm3 EWNS-Aerosolkonzentration) und unbestrahlter Proben der harmlosen Bakterien E. coli, Salmonella enterica und Lactobacillus untersucht. Die Partikel wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in 2,5 % Glutaraldehyd, 1,25 % Paraformaldehyd und 0,03 % Pikrinsäure in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,4) fixiert. Nach dem Waschen 2 Stunden lang mit 1 % Osmiumtetroxid (OsO4)/1,5 % Kaliumferrocyanid (KFeCN6) nachfixiert, dreimal in Wasser gewaschen und 1 Stunde in 1 % Uranylacetat inkubiert, dann zweimal in Wasser gewaschen und dann 10 Minuten lang in 50 %, 70 %, 90 % und 100 % Alkohol dehydriert. Die Proben wurden anschließend eine Stunde lang in Propylenoxid gelegt und mit einer 1:1-Mischung aus Propylenoxid und TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA) imprägniert. Die Proben wurden in TAAB Epon eingebettet und 48 Stunden bei 60 °C polymerisiert. Das ausgehärtete Granulat wurde geschnitten und mittels TEM mit einem konventionellen Transmissionselektronenmikroskop JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan) mit einer AMT 2k CCD-Kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA) visualisiert.
Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Zu jedem Zeitpunkt wurden dreifach Bakterien ausgesät, was insgesamt neun Datenpunkte pro Punkt ergab. Der Durchschnitt dieser Daten wurde als Bakterienkonzentration für den jeweiligen Mikroorganismus verwendet. Die Standardabweichung wurde als Messfehler verwendet. Alle Punkte zählen.
Der Logarithmus der Abnahme der Bakterienkonzentration im Vergleich zu t = 0 min wurde mit folgender Formel berechnet:
Dabei ist C0 die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt 0 (d. h. nachdem die Oberfläche getrocknet ist, aber bevor sie in die Kammer gelegt wurde) und Cn die Bakterienkonzentration auf der Oberfläche nach n Minuten Einwirkung.
Um den natürlichen Abbau der Bakterien während der 45-minütigen Exposition zu berücksichtigen, wurde die Log-Reduktion im Vergleich zur Kontrolle nach 45 Minuten ebenfalls wie folgt berechnet:
Dabei ist Cn die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt n und Cn-Kontrolle die Konzentration der Kontrollbakterien zum Zeitpunkt n. Die Daten werden als Log-Reduktion im Vergleich zur Kontrolle (keine EWNS-Exposition) dargestellt.
Während der Studie wurden mehrere Kombinationen aus Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode im Hinblick auf Taylor-Kegel-Bildung, Taylor-Kegel-Stabilität, EWNS-Produktionsstabilität und Reproduzierbarkeit bewertet. Verschiedene Kombinationen sind in der Ergänzungstabelle S1 dargestellt. Zwei Fälle mit stabilen und reproduzierbaren Eigenschaften (Taylor-Kegel, EWNS-Erzeugung und Stabilität über die Zeit) wurden für eine umfassende Studie ausgewählt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse für Ladung, Größe und ROS-Gehalt in beiden Fällen. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 zusammengefasst. Als Referenz enthalten sowohl Abbildung 3 als auch Tabelle 1 die Eigenschaften der zuvor synthetisierten, nicht optimierten EWNS8, 9, 10, 11 (Basis-EWNS). Berechnungen der statistischen Signifikanz unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests sind in der Ergänzungstabelle S2 erneut veröffentlicht. Zusätzliche Daten umfassen außerdem Studien zur Auswirkung des Durchmessers des Probenahmelochs der Gegenelektrode (D) und des Abstands zwischen Erdungselektrode und Spitze (L) (Ergänzende Abbildungen S2 und S3).
(ac) Größenverteilung gemessen mit AFM. (df) Oberflächenladungscharakteristik. (g) ROS-Charakterisierung des EPR.
Wichtig ist auch, dass unter allen oben genannten Bedingungen der gemessene Ionisierungsstrom zwischen 2 und 6 μA und die Spannung zwischen -3,8 und -6,5 kV lag. Dies führte zu einem Stromverbrauch von weniger als 50 mW für dieses einzelne EWNS-Kontaktmodul der Generation. Obwohl EWNS unter hohem Druck synthetisiert wurde, waren die Ozonwerte sehr niedrig und überstiegen nie 60 ppb.
Ergänzende Abbildung S4 zeigt die simulierten elektrischen Felder für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] bzw. [-3,8 kV, 0,5 cm]. Für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] ergeben sich Feldberechnungen von 2 × 105 V/m bzw. 4,7 × 105 V/m. Dies entspricht dem Erwartungswert, da im zweiten Fall das Spannungs-Abstands-Verhältnis deutlich höher ist.
Abb. 3a,b zeigt den mit dem AFM8 gemessenen EWNS-Durchmesser. Die berechneten durchschnittlichen EWNS-Durchmesser betrugen 27 nm bzw. 19 nm für die Schemata [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm]. Für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] betragen die geometrischen Standardabweichungen der Verteilungen 1,41 bzw. 1,45, was auf eine enge Größenverteilung hindeutet. Sowohl die mittlere Größe als auch die geometrische Standardabweichung liegen mit 25 nm bzw. 1,41 sehr nahe an der Basis-EWNS. Abb. 3c zeigt die Größenverteilung der Basis-EWNS, gemessen mit derselben Methode unter denselben Bedingungen.
Abb. 3d,e zeigt die Ergebnisse der Ladungscharakterisierung. Die Daten sind Durchschnittsmessungen von 30 gleichzeitigen Messungen von Konzentration (#/cm3) und Strom (I). Die Analyse zeigt, dass die durchschnittliche Ladung auf den EWNS 22 ± 6 e- und 44 ± 6 e- für [-6,5 kV, 4,0 cm] bzw. [-3,8 kV, 0,5 cm] beträgt. Sie haben signifikant höhere Oberflächenladungen im Vergleich zum Basis-EWNS (10 ± 2 e-), doppelt so hoch wie im Szenario [-6,5 kV, 4,0 cm] und viermal so hoch wie im Szenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Abbildung 3f zeigt die Ladungsdaten für das Basis-EWNS.
Aus den Konzentrationskarten der EWNS-Zahl (Ergänzende Abbildungen S5 und S6) ist ersichtlich, dass das Szenario [-6,5 kV, 4,0 cm] deutlich mehr Partikel aufweist als das Szenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Bemerkenswert ist auch, dass die EWNS-Zahlenkonzentration bis zu 4 Stunden lang überwacht wurde (Ergänzende Abbildungen S5 und S6), wobei die EWNS-Generationsstabilität in beiden Fällen die gleichen Konzentrationen der Partikelanzahl aufwies.
Abb. 3g zeigt das EPR-Spektrum nach Abzug der optimierten EWNS-Kontrolle (Hintergrund) bei [-6,5 kV, 4,0 cm]. Die ROS-Spektren wurden auch mit dem Baseline-EWNS-Szenario in einer zuvor veröffentlichten Arbeit verglichen. Die Anzahl der mit Spinfallen reagierenden EWNS wurde mit 7,5 × 104 EWNS/s berechnet, was dem zuvor veröffentlichten Baseline-EWNS8 ähnelt. Die EPR-Spektren zeigten deutlich das Vorhandensein von zwei ROS-Typen, wobei O2- die vorherrschende Spezies war und OH• weniger häufig vorkam. Darüber hinaus zeigte ein direkter Vergleich der Peakintensitäten, dass die optimierten EWNS einen signifikant höheren ROS-Gehalt im Vergleich zu den Baseline-EWNS aufwiesen.
Abb. 4 zeigt die Abscheidungseffizienz von EWNS in EPES. Die Daten sind ebenfalls in Tabelle I zusammengefasst und mit den ursprünglichen EWNS-Daten verglichen. In beiden Fällen von EUNS liegt die Abscheidung selbst bei einer niedrigen Spannung von 3,0 kV nahe 100 %. Typischerweise reichen 3,0 kV für eine 100%ige Abscheidung aus, unabhängig von der Änderung der Oberflächenladung. Unter den gleichen Bedingungen betrug die Abscheidungseffizienz von Baseline-EWNS aufgrund ihrer geringeren Ladung (durchschnittlich 10 Elektronen pro EWNS) nur 56 %.
Abb. 5 und Tabelle 2 fassen den Inaktivierungswert von Mikroorganismen zusammen, die auf der Oberfläche von Tomaten inokuliert wurden, nachdem sie 45 Minuten lang im optimalen Modus (-6,5 kV, 4,0 cm) etwa 40.000 #/cm3 EWNS ausgesetzt waren. Inokulierte E. coli und Lactobacillus innocuous zeigten während der 45-minütigen Exposition eine signifikante Reduktion um 3,8 Log-Stufen. Unter den gleichen Bedingungen verringerte sich die Inaktivierung von S. enterica um 2,2 Log-Stufen, während die von S. cerevisiae und M. parafortutum um 1,0 Log-Stufen abnahmen.
Die Elektronenmikroskopiebilder (Abbildung 6) zeigen die physikalischen Veränderungen, die durch EWNS an harmlosen Escherichia coli-, Streptococcus- und Lactobacillus-Zellen hervorgerufen werden und zu deren Inaktivierung führen. Die Kontrollbakterien wiesen intakte Zellmembranen auf, während die exponierten Bakterien beschädigte Außenmembranen aufwiesen.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Kontroll- und exponierten Bakterien zeigten Membranschäden.
Die Daten zu den physikochemischen Eigenschaften der optimierten EWNS zeigen insgesamt, dass deren Eigenschaften (Oberflächenladung und ROS-Gehalt) im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten EWNS-Basisdaten8,9,10,11 deutlich verbessert wurden. Andererseits blieb ihre Größe im Nanometerbereich, sehr ähnlich zu den zuvor berichteten Ergebnissen, sodass sie für lange Zeit in der Luft verbleiben konnten. Die beobachtete Polydispersität lässt sich durch Änderungen der Oberflächenladung erklären, die die Größe der EWNS bestimmen, die Zufälligkeit des Rayleigh-Effekts und potenzielle Koaleszenz. Wie jedoch von Nielsen et al. 22 ausführlich beschrieben, verringert eine hohe Oberflächenladung die Verdunstung, indem sie effektiv die Oberflächenenergie/-spannung des Wassertropfens erhöht. In unserer vorherigen Veröffentlichung8 wurde diese Theorie für Mikrotröpfchen 22 und EWNS experimentell bestätigt. Ladungsverlust im Laufe der Zeit kann sich ebenfalls auf die Größe auswirken und zur beobachteten Größenverteilung beitragen.
Darüber hinaus beträgt die Ladung pro Struktur je nach Situation etwa 22–44 e-, was deutlich höher ist als bei den grundlegenden EWNS, die eine durchschnittliche Ladung von 10 ± 2 Elektronen pro Struktur aufweisen. Es ist jedoch zu beachten, dass dies die durchschnittliche Ladung von EWNS ist. Seto et al. haben gezeigt, dass die Ladung inhomogen ist und einer logarithmischen Normalverteilung folgt21. Im Vergleich zu unseren früheren Arbeiten verdoppelt die Verdoppelung der Oberflächenladung die Abscheidungseffizienz im EPES-System auf nahezu 100 %11.