Einige Themen zur LC-Fehlerbehebung sind nie veraltet, da es in der LC-Praxis immer wieder Probleme gibt, auch wenn sich die Instrumententechnologie im Laufe der Zeit verbessert. Es gibt viele Möglichkeiten, wie in einem LC-System Probleme auftreten und zu einer schlechten Peakform führen können. Wenn Probleme im Zusammenhang mit der Peakform auftreten, vereinfacht eine kurze Liste möglicher Ursachen die Fehlerbehebung.
Es hat Spaß gemacht, diese Kolumne „LC-Fehlerbehebung“ zu schreiben und jeden Monat über neue Themen nachzudenken, denn manche Themen kommen nie aus der Mode. Während im Bereich der Chromatographieforschung bestimmte Themen oder Ideen obsolet werden, da sie durch neuere und bessere Ideen ersetzt werden, ist dies im Bereich der Fehlerbehebung seit dem Erscheinen des ersten Artikels zur Fehlerbehebung in dieser Zeitschrift (damals das LC Journal) im Jahr 1983 der Fall (1), da einige Themen immer noch relevant sind. In den letzten Jahren habe ich mich in mehreren Abschnitten zur LC-Fehlerbehebung auf aktuelle Trends konzentriert, die die Flüssigkeitschromatographie (LC) beeinflussen (z. B. den relativen Vergleich unseres Verständnisses der Auswirkungen von Druck auf die Retention [2] Neue Fortschritte), unsere Interpretation von LC-Ergebnissen und die Fehlerbehebung mit modernen LC-Geräten. In der Folge dieses Monats setze ich meine Serie (3) fort, die im Dezember 2021 begann und sich auf einige der wichtigsten Themen der LC-Fehlerbehebung konzentrierte – Elemente, die für jeden Troubleshooter von Bedeutung sind, unabhängig vom Alter des von uns verwendeten Systems. Das Kernthema der Diese Serie ist höchst relevant für das berühmte Wanddiagramm „LC Troubleshooting Guide“ (4) des LCGC, das in vielen Laboren hängt. Im dritten Teil dieser Serie habe ich mich auf Probleme im Zusammenhang mit der Peakform oder den Peakeigenschaften konzentriert. Unglaublicherweise listet das Wanddiagramm 44 verschiedene mögliche Ursachen für eine schlechte Peakform auf! Wir können nicht alle diese Probleme in einem Artikel im Detail betrachten, deshalb werde ich mich in diesem ersten Teil zu diesem Thema auf einige der Probleme konzentrieren, die mir am häufigsten begegnen. Ich hoffe, dass junge und alte LC-Benutzer einige hilfreiche Tipps und Hinweise zu diesem wichtigen Thema finden.
Ich ertappe mich dabei, auf Fragen zur Fehlerbehebung immer häufiger mit „alles ist möglich“ zu antworten. Diese Antwort mag bei schwer zu interpretierenden Beobachtungen einfach erscheinen, aber ich halte sie oft für angebracht. Da es viele mögliche Ursachen für eine schlechte Spitzenform gibt, ist es wichtig, unvoreingenommen zu bleiben, wenn man überlegt, was das Problem sein könnte, und in der Lage zu sein, potenzielle Ursachen zu priorisieren, um mit unseren Fehlerbehebungsbemühungen zu beginnen, wobei wir uns auf die gängigsten Möglichkeiten konzentrieren. Dieser Punkt ist sehr wichtig.
Ein wichtiger Schritt bei jeder Fehlersuche – der meiner Meinung nach jedoch unterschätzt wird – ist das Erkennen eines Problems, das gelöst werden muss. Das Erkennen eines Problems bedeutet oft, dass das Ergebnis des Geräts von unseren Erwartungen abweicht, die auf Theorie, empirischem Wissen und Erfahrung beruhen (5). Die hier erwähnte „Peakform“ bezieht sich nicht nur auf die Form des Peaks (symmetrisch, asymmetrisch, glatt, flauschig, Vorderkante, Tailing usw.), sondern auch auf seine Breite. Unsere Erwartungen an die tatsächliche Peakform sind einfach. Die Theorie (6) unterstützt die Lehrbucherwartung, dass die chromatographischen Peaks in den meisten Fällen symmetrisch sein und der Form einer Gauß-Verteilung entsprechen sollten, wie in Abbildung 1a dargestellt. Was wir von Peakbreiten erwarten, ist ein komplexeres Thema, das wir in einem zukünftigen Artikel behandeln werden. Die anderen Peakformen in Abbildung 1 zeigen einige der anderen Möglichkeiten, die beobachtet werden könnten – mit anderen Worten, einige der Möglichkeiten, wie etwas schiefgehen könnte. Im weiteren Verlauf dieses In diesem Teil werden wir uns die Zeit nehmen, einige konkrete Beispiele für Situationen zu besprechen, die zu diesen Formtypen führen können.
Manchmal werden Peaks im Chromatogramm, in dem sie eigentlich eluiert werden sollten, überhaupt nicht beobachtet. Das obige Wanddiagramm zeigt, dass das Fehlen eines Peaks (vorausgesetzt, die Probe enthält den Zielanalyten tatsächlich in einer Konzentration, bei der die Detektorreaktion ausreichen sollte, um ihn über dem Rauschen zu erkennen) normalerweise auf ein Problem mit dem Gerät oder falsche Bedingungen in der mobilen Phase zurückzuführen ist (sofern sie überhaupt beobachtet werden). Peaks sind normalerweise zu „schwach“). Eine kurze Liste potenzieller Probleme und Lösungen in dieser Kategorie finden Sie in Tabelle I.
Wie oben erwähnt, ist die Frage, wie viel Peakverbreiterung toleriert werden sollte, bevor man darauf achtet und versucht, sie zu beheben, ein komplexes Thema, das ich in einem zukünftigen Artikel behandeln werde. Meiner Erfahrung nach geht eine signifikante Peakverbreiterung oft mit einer signifikanten Änderung der Peakform einher, und ein Peaktailing kommt häufiger vor als ein Vorpeak oder eine Aufspaltung. Allerdings werden auch die nominell symmetrischen Peaks verbreitert, was verschiedene Gründe haben kann:
Jedes dieser Probleme wurde in früheren Ausgaben von Troubleshooting LC ausführlich besprochen. Interessierte Leser finden in diesen Artikeln Informationen zu den Ursachen und möglichen Lösungen. Weitere Details.
Peak-Tailing, Peak-Fronting und Splitting können allesamt durch chemische oder physikalische Phänomene verursacht werden und die Liste der möglichen Lösungen für diese Probleme variiert stark, je nachdem, ob es sich um ein chemisches oder physikalisches Problem handelt. Oftmals können Sie durch den Vergleich der verschiedenen Peaks in einem Chromatogramm wichtige Hinweise darauf finden, welcher der Übeltäter ist. Wenn alle Peaks in einem Chromatogramm ähnliche Formen aufweisen, ist die Ursache höchstwahrscheinlich nicht physikalischer Natur. Wenn nur ein oder wenige Peaks betroffen sind, der Rest aber normal aussieht, ist die Ursache höchstwahrscheinlich chemisch.
Die chemischen Ursachen des Peaktailings sind zu komplex, um sie hier kurz zu erörtern. Interessierte Leser werden für eine ausführlichere Diskussion auf die aktuelle Ausgabe von „LC Troubleshooting“ verwiesen (10). Ein einfacher Versuch besteht jedoch darin, die Masse des injizierten Analyten zu reduzieren und zu beobachten, ob sich die Peakform verbessert. Wenn dies der Fall ist, ist dies ein guter Hinweis darauf, dass das Problem eine „Massenüberladung“ ist. In diesem Fall muss die Methode auf die Injektion kleiner Analytmassen beschränkt werden, oder die chromatographischen Bedingungen müssen so geändert werden, dass auch bei der Injektion größerer Massen gute Peakformen erzielt werden können.
Es gibt auch viele mögliche physikalische Gründe für Peak-Tailing. Leser, die an einer detaillierten Diskussion der Möglichkeiten interessiert sind, werden auf eine andere aktuelle Ausgabe von „LC Troubleshooting“ (11) verwiesen. Eine der häufigsten physikalischen Ursachen für Peak-Tailing ist eine schlechte Verbindung an einem Punkt zwischen Injektor und Detektor (12). Ein extremes Beispiel ist in Abbildung 1d dargestellt, die ich vor einigen Wochen in meinem Labor erhalten habe. In diesem Fall bauten wir ein System mit einem neuen Injektionsventil, das wir zuvor noch nicht verwendet hatten, und installierten eine Injektionsschleife für ein kleines Volumen mit einer Ferrule, die auf eine Edelstahlkapillare aufgeformt war. Nach einigen ersten Fehlersuchversuchen stellten wir fest, dass die Öffnungstiefe im Stator des Injektionsventils viel größer war als wir es gewohnt waren, was zu einem großen Totvolumen am Boden der Öffnung führte. Dieses Problem lässt sich leicht lösen, indem wir die Injektionsschleife durch ein anderes Rohr ersetzen. Wir können die Ferrule in die richtige Position bringen, um das Totvolumen am Boden der Öffnung zu beseitigen.
Peakfronten wie in Abbildung 1e können auch durch physikalische oder chemische Probleme verursacht werden. Eine häufige physikalische Ursache für die Vorderkante ist eine unzureichende Packung des Partikelbetts der Säule oder eine Neuanordnung der Partikel im Laufe der Zeit. Wie bei Peak-Tailing, das durch dieses physikalische Phänomen verursacht wird, lässt sich dies am besten beheben, indem die Säule ausgetauscht und weitergearbeitet wird. Grundsätzlich entstehen Peakformen an der Vorderkante chemischen Ursprungs oft durch sogenannte „nichtlineare“ Retentionsbedingungen. Unter idealen (linearen) Bedingungen ist die von der stationären Phase zurückgehaltene Analytmenge (daher der Retentionsfaktor) linear von der Analytkonzentration in der Säule abhängig. Chromatografisch bedeutet dies, dass mit zunehmender injizierter Analytmasse der Peak höher, aber nicht breiter wird. Dieser Zusammenhang wird unterbrochen, wenn das Retentionsverhalten nichtlinear ist und die Peaks mit zunehmender Masse nicht nur höher, sondern auch breiter werden. Darüber hinaus bestimmen nichtlineare Formen die Form der chromatographischen Peaks, was zu Vorder- oder Hinterkanten führt. Wie bei der Massenüberladung, die Peak-Tailing verursacht, (10) Eine durch nichtlineare Retention verursachte Peakführung kann auch durch eine Reduzierung der injizierten Analytmasse diagnostiziert werden. Verbessert sich die Peakform, muss die Methode so modifiziert werden, dass die Injektionsqualität, die die Spitzenkante verursacht, nicht überschritten wird, oder die chromatographischen Bedingungen müssen geändert werden, um dieses Verhalten zu minimieren.
Manchmal beobachten wir etwas, das wie ein „geteilter“ Peak aussieht, wie in Abbildung 1f gezeigt. Der erste Schritt zur Lösung dieses Problems besteht darin, festzustellen, ob die Peakform auf eine teilweise Koelution zurückzuführen ist (d. h. das Vorhandensein zweier unterschiedlicher, aber dicht beieinander eluierender Verbindungen). Wenn tatsächlich zwei verschiedene Analyten dicht beieinander eluieren, muss ihre Auflösung verbessert werden (z. B. durch Erhöhung der Selektivität, Retention oder Plattenzahl), und die scheinbar „geteilten“ Peaks hängen mit physikalischen Problemen zusammen. Die Leistung hat nichts mit der Säule selbst zu tun. Der wichtigste Hinweis für diese Entscheidung ist oft, ob alle Peaks im Chromatogramm geteilte Formen aufweisen oder nur ein oder zwei. Wenn es nur ein oder zwei sind, handelt es sich wahrscheinlich um ein Koelutionsproblem; wenn alle Peaks geteilt sind, handelt es sich wahrscheinlich um ein physikalisches Problem, das höchstwahrscheinlich mit der Säule selbst zusammenhängt.
Geteilte Peaks, die mit den physikalischen Eigenschaften der Säule selbst zusammenhängen, sind in der Regel auf teilweise verstopfte Einlass- oder Auslassfritten oder eine Neuanordnung von Partikeln in der Säule zurückzuführen, wodurch die mobile Phase in bestimmten Bereichen der Säulenkanalformation schneller fließt als die mobile Phase in anderen Regionen (11). Teilweise verstopfte Fritten können manchmal durch eine Umkehrung des Flusses durch die Säule gereinigt werden. Meiner Erfahrung nach ist dies jedoch in der Regel eher eine kurzfristige als eine langfristige Lösung. Bei modernen Säulen ist dies oft fatal, wenn sich die Partikel innerhalb der Säule rekombinieren. An diesem Punkt ist es am besten, die Säule auszutauschen und fortzufahren.
Der Peak in Abbildung 1g, der ebenfalls aus einem aktuellen Fall in meinem eigenen Labor stammt, zeigt normalerweise an, dass das Signal so hoch ist, dass es das obere Ende des Reaktionsbereichs erreicht hat. Bei optischen Absorptionsdetektoren (in diesem Fall UV-vis) absorbiert der Analyt bei sehr hoher Analytkonzentration den größten Teil des Lichts, das durch die Detektordurchflusszelle gelangt, sodass nur sehr wenig Licht zum Erfassen übrig bleibt. Unter diesen Bedingungen wird das elektrische Signal des Fotodetektors stark von verschiedenen Rauschquellen wie Streulicht und „Dunkelstrom“ beeinflusst, wodurch das Signal sehr „unscharf“ erscheint und unabhängig von der Analytkonzentration ist. In diesem Fall lässt sich das Problem häufig leicht lösen, indem das Injektionsvolumen des Analyten reduziert wird – durch Reduzierung des Injektionsvolumens, Verdünnung der Probe oder beides.
In der Chromatographieschule verwenden wir das Detektorsignal (d. h. die y-Achse im Chromatogramm) als Indikator für die Analytkonzentration in der Probe. Daher erscheint es seltsam, ein Chromatogramm mit einem Signal unter Null zu sehen, da die einfache Interpretation darin besteht, dass dies auf eine negative Analytkonzentration hinweist – was natürlich physikalisch nicht möglich ist. Meiner Erfahrung nach werden negative Spitzen am häufigsten bei der Verwendung optischer Absorptionsdetektoren (z. B. UV-vis) beobachtet.
In diesem Fall bedeutet ein negativer Peak einfach, dass die von der Säule eluierten Moleküle unmittelbar vor und nach dem Peak weniger Licht absorbieren als die mobile Phase selbst. Dies kann beispielsweise bei relativ niedrigen Detektionswellenlängen (<230 nm) und Zusatzstoffen der mobilen Phase auftreten, die den größten Teil des Lichts bei diesen Wellenlängen absorbieren. Solche Zusatzstoffe können Lösungsmittelkomponenten der mobilen Phase wie Methanol oder Pufferkomponenten wie Acetat oder Formiat sein. Man kann negative Peaks tatsächlich verwenden, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen und genaue quantitative Informationen zu erhalten, sodass es keinen grundsätzlichen Grund gibt, sie per se zu vermeiden (diese Methode wird manchmal als „indirekte UV-Detektion“ bezeichnet) (13). Wenn wir negative Peaks jedoch im Fall der Absorptionsdetektion wirklich vollständig vermeiden möchten, besteht die beste Lösung darin, eine andere Detektionswellenlänge zu verwenden, sodass der Analyt mehr absorbiert als die mobile Phase, oder die Zusammensetzung der mobilen Phase so zu ändern, dass sie weniger Licht absorbiert als die Analyten.
Negative Peaks können auch bei der Brechungsindexdetektion (RI) auftreten, wenn der Brechungsindex anderer Komponenten als des Analyten in der Probe, beispielsweise der Lösungsmittelmatrix, vom Brechungsindex der mobilen Phase abweicht. Dies geschieht auch bei der UV-Vis-Detektion, dieser Effekt ist jedoch im Vergleich zur RI-Detektion tendenziell abgeschwächt. In beiden Fällen können negative Peaks minimiert werden, indem die Zusammensetzung der Probenmatrix besser an die der mobilen Phase angepasst wird.
In Teil drei zum grundlegenden Thema der LC-Fehlerbehebung habe ich Situationen besprochen, in denen die beobachtete Peakform von der erwarteten oder normalen Peakform abweicht. Eine effektive Fehlerbehebung bei solchen Problemen beginnt mit der Kenntnis der erwarteten Peakformen (basierend auf Theorie oder Erfahrung mit vorhandenen Methoden), sodass Abweichungen von diesen Erwartungen offensichtlich sind. Probleme mit der Peakform haben viele verschiedene mögliche Ursachen (zu breit, Nachlauf, Vorderkante usw.). In diesem Teil bespreche ich ausführlich einige der Gründe, die mir am häufigsten begegnen. Die Kenntnis dieser Details bietet einen guten Ausgangspunkt für die Fehlersuche, erfasst jedoch nicht alle Möglichkeiten. Leser, die an einer ausführlicheren Liste der Ursachen und Lösungen interessiert sind, können das Wanddiagramm „LC-Fehlerbehebungshandbuch“ des LCGC zu Rate ziehen.
(4) LCGC-Wanddiagramm „LC Troubleshooting Guide“.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Datenanalyse und Signalverarbeitung in der Chromatographie (Elsevier, New York, NY, 1998), S. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF und Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.