Einige Themen zur LC-Fehlerbehebung sind nie veraltet, da es in der LC-Praxis Probleme gibt, auch wenn sich die Gerätetechnologie mit der Zeit verbessert. Es gibt viele Möglichkeiten, wie Probleme in einem LC-System auftreten und zu einer schlechten Peakform führen können. Wenn Probleme im Zusammenhang mit der Peakform auftreten, hilft eine kurze Liste möglicher Ursachen für diese Ergebnisse, unsere Erfahrung bei der Fehlerbehebung zu vereinfachen.
Es hat Spaß gemacht, diese Kolumne „LC-Fehlerbehebung“ zu schreiben und jeden Monat über Themen nachzudenken, denn einige Themen kommen nie aus der Mode. Während im Bereich der Chromatographieforschung bestimmte Themen oder Ideen obsolet werden, weil sie durch neuere und bessere Ideen ersetzt werden, habe ich mich auf dem Gebiet der Fehlerbehebung seit dem Erscheinen des ersten Artikels zur Fehlerbehebung in dieser Zeitschrift (dem damaligen LC Journal) im Jahr 1983 (1) darauf konzentriert, dass einige Themen immer noch relevant sind. In den letzten Jahren habe ich mich auf mehrere LC-Fehlerbehebungen konzentriert Abschnitte zu aktuellen Trends, die sich auf die Flüssigkeitschromatographie (LC) auswirken (z. B. der relative Vergleich unseres Verständnisses der Auswirkung von Druck auf die Retention [2] Neue Fortschritte) Unsere Interpretation von LC-Ergebnissen und wie man Fehler mit modernen LC-Instrumenten behebt. In der Ausgabe dieses Monats setze ich meine Serie (3) fort, die im Dezember 2021 begann und sich auf einige der „Leben und Tod“-Themen der LC-Fehlerbehebung konzentrierte – Elemente, die für jede Fehlerbehebung hilfreich sind, sind unerlässlich, unabhängig vom Alter des Systems, das wir verwenden. Der Kern Das Thema dieser Serie ist von großer Bedeutung für die berühmte LCGC-Wandtafel „LC Troubleshooting Guide“ (4), die in vielen Labors hängt. Für den dritten Teil dieser Serie habe ich mich entschieden, mich auf Probleme im Zusammenhang mit Peakform oder Peakeigenschaften zu konzentrieren. Unglaublicherweise listet die Wandtafel 44 verschiedene potenzielle Ursachen für eine schlechte Peakform auf! Wir können nicht alle diese Probleme im Detail in einem Artikel behandeln, deshalb werde ich mich in dieser ersten Folge zu diesem Thema auf einige der Probleme konzentrieren, die ich am häufigsten sehe. Ich hoffe, junge und alte LC Benutzer finden einige hilfreiche Tipps und Erinnerungen zu diesem wichtigen Thema.
Fragen zur Fehlerbehebung beantworte ich zunehmend mit „Alles ist möglich“. Diese Antwort mag einfach erscheinen, wenn man Beobachtungen betrachtet, die schwer zu interpretieren sind, aber ich finde sie oft angemessen. Da es viele mögliche Ursachen für eine schlechte Peakform gibt, ist es wichtig, unvoreingenommen zu sein, wenn man überlegt, was das Problem sein könnte, und in der Lage zu sein, potenzielle Ursachen zu priorisieren, um mit der Fehlerbehebung zu beginnen und uns auf die häufigsten Möglichkeiten zu konzentrieren. Dieser Punkt ist sehr wichtig.möglich.
Ein wichtiger Schritt bei jeder Fehlerbehebungsübung – der meiner Meinung nach jedoch unterschätzt wird – besteht darin, zu erkennen, dass es ein Problem gibt, das gelöst werden muss. Zu erkennen, dass es ein Problem gibt, bedeutet oft zu erkennen, dass das, was mit dem Werkzeug passiert, von unseren Erwartungen abweicht, die auf Theorie, empirischem Wissen und Erfahrung basieren (5). Die „Peak-Form“, auf die hier Bezug genommen wird, bezieht sich tatsächlich nicht nur auf die Form des Peaks (symmetrisch, asymmetrisch, glatt, flauschig, Vorderkante, Tailing usw.), sondern auch auf die Breite. Unsere Erwartungen für die tatsächliche Peakform sind einfach. Theorie (6) stützt gut die Lehrbucherwartung, dass die chromatographischen Peaks in den meisten Fällen symmetrisch sein und der Form einer Gaußschen Verteilung entsprechen sollten, wie in Abbildung 1a gezeigt. Was wir von Peakbreiten erwarten, ist ein komplexeres Thema, und wir werden dieses Thema in einem zukünftigen Artikel diskutieren. Die anderen Peakformen in Abbildung 1 zeigen einige der anderen Möglichkeiten, die beobachtet werden könnten – mit anderen Worten, einige der Möglichkeiten, wie etwas schief gehen könnte. Im Rest dieser Folge werden wir Ich werde mir die Zeit nehmen, einige konkrete Beispiele für Situationen zu besprechen, die zu diesen Formtypen führen können.
Manchmal werden im Chromatogramm dort, wo sie voraussichtlich eluiert werden, überhaupt keine Peaks beobachtet. Das obige Wanddiagramm zeigt, dass das Fehlen eines Peaks (vorausgesetzt, die Probe enthält tatsächlich den Zielanalyten in einer Konzentration, die dafür sorgen sollte, dass die Detektorreaktion ausreicht, um ihn über dem Rauschen zu erkennen) normalerweise mit einem Instrumentenproblem oder falschen Bedingungen der mobilen Phase zusammenhängt (sofern überhaupt beobachtet).Spitzen, meist zu „schwach“). Eine kurze Liste potenzieller Probleme und Lösungen in dieser Kategorie finden Sie in Tabelle I.
Wie oben erwähnt, ist die Frage, wie viel Peakverbreiterung toleriert werden sollte, bevor man darauf achtet und versucht, sie zu beheben, ein komplexes Thema, das ich in einem zukünftigen Artikel diskutieren werde. Meine Erfahrung ist, dass eine signifikante Peakverbreiterung oft mit einer signifikanten Änderung der Peakform einhergeht und Peaktailing häufiger vorkommt als Vorpeak oder Aufspaltung. Allerdings werden auch die nominell symmetrischen Peaks verbreitert, was verschiedene Ursachen haben kann:
Jedes dieser Probleme wurde in früheren Ausgaben von Troubleshooting LC ausführlich besprochen. Leser, die sich für diese Themen interessieren, können in diesen früheren Artikeln Informationen zu den Grundursachen und möglichen Lösungen für diese Probleme finden.Mehr Details.
Peak-Tailing, Peak-Fronting und Splitting können alle durch chemische oder physikalische Phänomene verursacht werden, und die Liste möglicher Lösungen für diese Probleme variiert stark, je nachdem, ob es sich um ein chemisches oder physikalisches Problem handelt. Durch den Vergleich der verschiedenen Peaks in einem Chromatogramm können Sie häufig wichtige Hinweise darauf finden, wer der Schuldige ist. Wenn alle Peaks in einem Chromatogramm ähnliche Formen aufweisen, ist die Ursache höchstwahrscheinlich nicht physikalisch. Wenn nur einer oder mehrere Peaks betroffen sind, der Rest aber gut aussieht, ist die Ursache höchstwahrscheinlich chemisch.
Die chemischen Ursachen für Peak Tailing sind zu komplex, um sie hier kurz zu diskutieren. Der interessierte Leser wird für eine ausführlichere Diskussion auf die aktuelle Ausgabe von „LC Troubleshooting“ verwiesen (10). Ein einfacher Versuch besteht jedoch darin, die Masse des injizierten Analyten zu reduzieren und zu sehen, ob sich die Peakform verbessert. Wenn ja, dann ist dies ein guter Hinweis darauf, dass das Problem eine „Massenüberladung“ ist. In diesem Fall muss die Methode auf die Injektion kleiner Analytmassen beschränkt werden, oder die chromatographischen Bedingungen müssen geändert werden, damit ein guter Peak entsteht Formen können auch mit größeren eingespritzten Massen erhalten werden.
Es gibt auch viele mögliche physikalische Gründe für Peak Tailing. Leser, die an einer detaillierten Diskussion der Möglichkeiten interessiert sind, werden auf eine andere aktuelle Ausgabe von „LC Troubleshooting“ (11) verwiesen. Eine der häufigeren physikalischen Ursachen für Peak Tailing ist eine schlechte Verbindung an einem Punkt zwischen Injektor und Detektor (12). Ein extremes Beispiel ist in Abbildung 1d dargestellt, die ich vor ein paar Wochen in meinem Labor aufgenommen habe wurde auf eine Kapillare aus rostfreiem Stahl geformt. Nach einigen anfänglichen Versuchen zur Fehlerbehebung stellten wir fest, dass die Anschlusstiefe im Stator des Injektionsventils viel tiefer war als wir es gewohnt waren, was zu einem großen Totvolumen am Boden des Anschlusses führte. Dieses Problem lässt sich leicht lösen, indem die Injektionsschleife durch ein anderes Rohr ersetzt wird. Wir können die Zwinge in die richtige Position bringen, um das Totvolumen am Boden des Anschlusses zu beseitigen.
Peakfronten wie die in Abbildung 1e gezeigten können auch durch physikalische oder chemische Probleme verursacht werden. Eine häufige physikalische Ursache für die Vorderkante ist, dass das Partikelbett der Säule nicht gut gepackt ist oder dass sich die Partikel im Laufe der Zeit neu organisiert haben. Wie bei Peaktailing, das durch dieses physikalische Phänomen verursacht wird, besteht die beste Möglichkeit, dieses Problem zu beheben, darin, die Säule auszutauschen und weiterzumachen. Grundsätzlich ergeben sich Spitzenformen an der Vorderkante mit chemischem Ursprung oft aus sogenannten „nichtlinearen“ Retentionsbedingungen. Unter idealen (linearen) Bedingungen ist die Menge des zurückgehaltenen Analyten gleich durch die stationäre Phase (daher der Retentionsfaktor) hängt linear mit der Konzentration des Analyten in der Säule zusammen. Chromatographisch bedeutet dies, dass der Peak mit zunehmender Masse des in die Säule injizierten Analyten höher, aber nicht breiter wird. Diese Beziehung wird unterbrochen, wenn das Retentionsverhalten nichtlinear ist und die Peaks nicht nur höher, sondern auch breiter werden, je mehr Masse injiziert wird. Darüber hinaus bestimmen nichtlineare Formen die Form von chromatographischen Peaks, was zu Vorder- oder Hinterkanten führt. Wie bei der Massenüberladung, die einen Peak verursacht Tailing (10), Peak-Voreilung aufgrund nichtlinearer Retention kann auch durch Reduzierung der injizierten Analytmasse diagnostiziert werden. Wenn sich die Peakform verbessert, muss die Methode so geändert werden, dass die Injektionsqualität, die die Vorderkante verursacht, nicht überschritten wird, oder die chromatographischen Bedingungen müssen geändert werden, um dieses Verhalten zu minimieren.
Manchmal beobachten wir etwas, das wie ein „gespaltener“ Peak aussieht, wie in Abbildung 1f dargestellt. Der erste Schritt zur Lösung dieses Problems besteht darin, festzustellen, ob die Peakform auf eine teilweise Koelution zurückzuführen ist (d. h. das Vorhandensein zweier unterschiedlicher, aber nahe beieinander eluierender Verbindungen). Wenn es tatsächlich zwei verschiedene Analyten gibt, die nahe beieinander eluieren, dann geht es darum, ihre Auflösung zu verbessern (z. B. durch Erhöhung der Selektivität, Retention oder Plattenzahl), und die scheinbaren „gespaltenen“ Peaks haben mit der physikalischen Leistung nichts mit der Säule zu tun Der wichtigste Hinweis für diese Entscheidung ist oft, ob alle Peaks im Chromatogramm geteilte Formen aufweisen oder nur einer oder zwei. Wenn es nur ein oder zwei sind, handelt es sich wahrscheinlich um ein Koelutionsproblem;Wenn alle Peaks geteilt sind, handelt es sich wahrscheinlich um ein physikalisches Problem, das höchstwahrscheinlich mit der Säule selbst zusammenhängt.
Geteilte Peaks, die mit den physikalischen Eigenschaften der Säule selbst zusammenhängen, sind in der Regel auf teilweise verstopfte Einlass- oder Auslassfritten oder auf eine Reorganisation von Partikeln in der Säule zurückzuführen, wodurch die mobile Phase in bestimmten Bereichen der Säulenkanalbildung schneller fließen kann als die mobile Phase in anderen Bereichen (11). Teilweise verstopfte Fritten können manchmal durch Umkehren des Flusses durch die Säule entfernt werden;Meiner Erfahrung nach handelt es sich hierbei jedoch in der Regel eher um eine kurzfristige als um eine langfristige Lösung. Bei modernen Säulen kann dies oft fatal sein, wenn sich die Partikel innerhalb der Säule rekombinieren. An diesem Punkt ist es am besten, die Säule auszutauschen und fortzufahren.
Der Peak in Abbildung 1g, ebenfalls aus einem aktuellen Fall in meinem eigenen Labor, zeigt normalerweise an, dass das Signal so hoch ist, dass es das obere Ende des Antwortbereichs erreicht hat. Bei optischen Absorptionsdetektoren (in diesem Fall UV-Vis) absorbiert der Analyt bei sehr hoher Analytkonzentration den größten Teil des Lichts, das durch die Durchflusszelle des Detektors gelangt, sodass nur sehr wenig Licht detektiert werden kann. Unter diesen Bedingungen wird das elektrische Signal vom Fotodetektor stark durch verschiedene Rauschquellen wie Streulicht und „Dunkelstrom“ beeinflusst Das Signal sieht sehr „unscharf“ aus und ist unabhängig von der Analytkonzentration.Wenn dies geschieht, lässt sich das Problem oft leicht lösen, indem man das Injektionsvolumen des Analyten reduziert – indem man das Injektionsvolumen verringert, die Probe verdünnt oder beides.
In der Chromatographieschule verwenden wir das Detektorsignal (d. h. die y-Achse im Chromatogramm) als Indikator für die Analytkonzentration in der Probe. Daher erscheint es seltsam, ein Chromatogramm mit einem Signal unter Null zu sehen, da die einfache Interpretation darin besteht, dass dies auf eine negative Analytkonzentration hinweist – was physikalisch natürlich nicht möglich ist. Meiner Erfahrung nach werden negative Peaks am häufigsten beobachtet, wenn optische Absorptionsdetektoren (z. B. UV-Vis) verwendet werden.
In diesem Fall bedeutet ein negativer Peak lediglich, dass die aus der Säule eluierenden Moleküle weniger Licht absorbieren als die mobile Phase selbst unmittelbar vor und nach dem Peak. Dies kann beispielsweise bei Verwendung relativ niedriger Detektionswellenlängen (<230 nm) und bei Verwendung von Additiven für die mobile Phase auftreten, die den größten Teil des Lichts bei diesen Wellenlängen absorbieren. Solche Additive können Lösungsmittelkomponenten der mobilen Phase wie Methanol oder Pufferkomponenten wie Acetat oder Formiat sein. Man kann tatsächlich negative Peaks verwenden, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen und genaue quantitative Informationen zu erhalten, es gibt also keinen grundsätzlichen Grund, sie zu vermeiden per se (diese Methode wird manchmal als „indirekte UV-Detektion“ bezeichnet) (13). Wenn wir jedoch wirklich negative Peaks ganz vermeiden wollen, besteht die beste Lösung im Fall der Absorptionsdetektion darin, eine andere Detektionswellenlänge zu verwenden, sodass der Analyt mehr absorbiert als die mobile Phase, oder die Zusammensetzung der mobilen Phase so zu ändern, dass sie weniger Licht absorbieren als die Analyten.
Negative Peaks können auch bei der Brechungsindex-Detektion (RI) auftreten, wenn der Brechungsindex anderer Komponenten als des Analyten in der Probe, wie z. B. der Lösungsmittelmatrix, vom Brechungsindex der mobilen Phase abweicht. Dies geschieht auch bei der UV-Vis-Detektion, aber dieser Effekt wird im Vergleich zur RI-Detektion tendenziell abgeschwächt. In beiden Fällen können negative Peaks minimiert werden, indem die Zusammensetzung der Probenmatrix besser an die der mobilen Phase angepasst wird.
Im dritten Teil zum grundlegenden Thema der LC-Fehlerbehebung habe ich Situationen besprochen, in denen die beobachtete Peakform von der erwarteten oder normalen Peakform abweicht. Eine wirksame Fehlerbehebung bei solchen Problemen beginnt mit der Kenntnis der erwarteten Peakformen (basierend auf der Theorie oder früheren Erfahrungen mit vorhandenen Methoden), sodass Abweichungen von diesen Erwartungen offensichtlich sind. Probleme mit der Peakform haben viele verschiedene mögliche Ursachen (zu breit, Tailing, Vorderkante usw.). In diesem Teil bespreche ich ausführlich einige der Gründe, die ich am häufigsten sehe. Die Kenntnis dieser Details ist ein guter Ausgangspunkt Fehlerbehebung, erfasst jedoch nicht alle Möglichkeiten. Leser, die an einer ausführlicheren Liste der Ursachen und Lösungen interessiert sind, können sich das LCGC-Wanddiagramm „LC Troubleshooting Guide“ ansehen.
(4) LCGC-Wanddiagramm „LC Troubleshooting Guide“. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), S. 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF und Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.