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Die Flüssigbiopsie (LB) ist ein Konzept, das in der Biomedizin schnell an Popularität gewinnt. Das Konzept basiert hauptsächlich auf dem Nachweis von Fragmenten zirkulierender extrazellulärer DNA (ccfDNA), die nach Zelltod in verschiedenen Geweben hauptsächlich als kleine Fragmente freigesetzt werden. Ein kleiner Teil dieser Fragmente stammt aus fremden (fremden) Geweben oder Organismen. In unserer aktuellen Arbeit haben wir dieses Konzept auf Muscheln angewendet, eine Sentinel-Art, die für ihre hohe Meerwasserfiltrationskapazität bekannt ist. Wir nutzen die Fähigkeit der Muscheln, als natürliche Filter zu fungieren, um Umwelt-DNA-Fragmente aus einer Vielzahl von Quellen einzufangen und so Informationen über die Artenvielfalt mariner Küstenökosysteme zu gewinnen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Hämolymphe von Muscheln DNA-Fragmente enthält, die in ihrer Größe stark variieren, von 1 bis 5 kb. Die Shotgun-Sequenzierung zeigte, dass eine große Anzahl von DNA-Fragmenten fremden mikrobiellen Ursprungs sind. Darunter fanden wir DNA-Fragmente von Bakterien, Archaeen und Viren, darunter Viren, von denen bekannt ist, dass sie eine Vielzahl von Wirten infizieren, die häufig in küstennahen Meeresökosystemen vorkommen. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das auf Muscheln angewandte LB-Konzept eine reichhaltige, aber bislang unerforschte Wissensquelle über die mikrobielle Vielfalt in marinen Küstenökosystemen darstellt.
Die Auswirkungen des Klimawandels (Klimawandel) auf die Biodiversität mariner Ökosysteme sind ein stark wachsendes Forschungsgebiet. Die globale Erwärmung verursacht nicht nur erhebliche physiologische Belastungen, sondern verschiebt auch die evolutionären Grenzen der thermischen Stabilität mariner Organismen, beeinträchtigt den Lebensraum zahlreicher Arten und veranlasst diese, nach günstigeren Bedingungen zu suchen [1, 2]. Neben den Auswirkungen auf die Biodiversität der Metazoen stört der Klimawandel auch das empfindliche Gleichgewicht der Wirt-Mikroben-Interaktionen. Diese mikrobielle Dysbakteriose stellt eine ernsthafte Bedrohung für marine Ökosysteme dar, da sie marine Organismen anfälliger für infektiöse Krankheitserreger macht [3, 4]. Es wird angenommen, dass Klimawandel eine wichtige Rolle beim Massensterben spielt, was ein ernstes Problem für das Management globaler mariner Ökosysteme darstellt [5, 6]. Angesichts der wirtschaftlichen, ökologischen und ernährungsphysiologischen Auswirkungen auf viele marine Arten ist dies ein wichtiges Thema. Dies gilt insbesondere für Muscheln in den Polarregionen, wo die Auswirkungen des Klimawandels unmittelbarer und schwerwiegender sind [6, 7]. Tatsächlich werden Muscheln wie Mytilus spp. häufig verwendet, um die Auswirkungen von CC auf marine Ökosysteme zu überwachen. Es überrascht nicht, dass relativ viele Biomarker entwickelt wurden, um ihren Gesundheitszustand zu überwachen, wobei häufig ein zweistufiger Ansatz mit funktionellen Biomarkern auf Basis enzymatischer Aktivität oder zellulärer Funktionen wie Zelllebensfähigkeit und phagozytischer Aktivität verwendet wird [8]. Diese Methoden umfassen auch die Messung der Konzentration spezifischer Druckindikatoren, die sich nach der Absorption großer Mengen Meerwasser in Weichteilen ansammeln. Die hohe Filtrationskapazität und das halboffene Kreislaufsystem von Muscheln bieten jedoch eine Möglichkeit, neue Hämolymph-Biomarker mithilfe des Konzepts der Flüssigbiopsie (LB) zu entwickeln, einem einfachen und minimal invasiven Ansatz zur Patientenbehandlung. Blutproben [9, 10]. Obwohl in der menschlichen LB mehrere Arten zirkulierender Moleküle gefunden werden können, basiert dieses Konzept hauptsächlich auf der DNA-Sequenzanalyse zirkulierender extrazellulärer DNA-Fragmente (ccfDNA) im Plasma. Tatsächlich ist das Vorhandensein zirkulierender DNA im menschlichen Plasma seit Mitte des 20. Jahrhunderts bekannt [11]. Doch erst in den letzten Jahren ermöglichte die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden die klinische Diagnose auf Basis von ccfDNA. Das Vorhandensein dieser zirkulierenden DNA-Fragmente ist teilweise auf die passive Freisetzung genomischer DNA (nukleär und mitochondrial) nach Zelltod zurückzuführen. Bei gesunden Personen ist die Konzentration von ccfDNA normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann jedoch bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen oder unter Stress um das 5- bis 10-fache erhöht sein, was zu Gewebeschäden führt. Bei gesunden Personen ist die Konzentration von ccfDNA normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann jedoch bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen oder unter Stress um das 5- bis 10-fache erhöht sein, was zu Gewebeschäden führt. Bei einer höheren Konzentration von weniger als einem Jahr (<10 ng/ml) kann es sich nicht innerhalb von 5–10 Schritten auf eine bestimmte Pathologie auswirken подVERгающихся Streß, vor dem Ende des Prozesses. Bei gesunden Menschen ist die Konzentration von cccDNA normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann jedoch bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen oder unter Stress, der zu Gewebeschäden führt, um das 5- bis 10-fache ansteigen.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/ml）在 健康 个体 中, ccfdna 的 浓度 较 低 (（<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中可 增加 5-10 倍, 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Die Konzentration der ccfDNA-Konzentration beträgt nur wenige (<10 ng/ml) in mehreren Jahren, Sie können sie jedoch nicht in 5–10 Abschnitten von Patienten mit verschiedenen Pathologien oder anderen Patienten auflisten Stress, das приводит к повреждению тканей. Bei gesunden Personen sind die ccfDNA-Konzentrationen normalerweise niedrig (<10 ng/ml), können jedoch bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen oder Stress um das 5- bis 10-fache erhöht sein, was zu Gewebeschäden führt.Die Größe von ccfDNA-Fragmenten variiert stark, liegt aber normalerweise zwischen 150 und 200 bp. [12]. Durch die Analyse selbst gewonnener ccfDNA, d. h. ccfDNA aus normalen oder transformierten Wirtszellen, können genetische und epigenetische Veränderungen im Kerngenom und/oder mitochondrialen Genom erkannt werden, was Klinikern bei der Auswahl spezifischer, molekular zielgerichteter Therapien hilft [13]. Allerdings kann ccfDNA auch aus fremden Quellen gewonnen werden, beispielsweise aus fötalen Zellen während der Schwangerschaft oder aus transplantierten Organen [14,15,16,17]. ccfDNA ist außerdem eine wichtige Informationsquelle für den Nachweis von Nukleinsäuren eines (fremden) Infektionserregers, was einen nicht-invasiven Nachweis weit verbreiteter Infektionen ermöglicht, die durch Blutkulturen nicht identifiziert werden können, wodurch eine invasive Biopsie infizierten Gewebes vermieden wird [18]. Jüngste Studien haben tatsächlich gezeigt, dass menschliches Blut eine reichhaltige Informationsquelle zur Identifizierung viraler und bakterieller Krankheitserreger enthält und dass etwa 1 % der im menschlichen Plasma gefundenen ccfDNA fremden Ursprungs ist [19]. Diese Studien zeigen, dass die Biodiversität des zirkulierenden Mikrobioms eines Organismus mittels ccfDNA-Analyse beurteilt werden kann. Bis vor kurzem wurde dieses Konzept jedoch ausschließlich beim Menschen und in geringerem Umfang auch bei anderen Wirbeltieren angewendet [20, 21].
In der vorliegenden Arbeit nutzen wir das LB-Potenzial, um die ccfDNA von Aulacomya atra zu analysieren, einer südlichen Art, die häufig auf den subantarktischen Kerguelen-Inseln vorkommt, einer Inselgruppe auf einem großen Plateau, das vor 35 Millionen Jahren nach einem Vulkanausbruch entstand. Mithilfe eines In-vitro-Experimentiersystems fanden wir heraus, dass DNA-Fragmente im Meerwasser schnell von Muscheln aufgenommen werden und in die Hämolymphe gelangen. Shotgun-Sequenzierung hat gezeigt, dass die ccfDNA der Muschelhämolymphe DNA-Fragmente eigenen und fremden Ursprungs enthält, darunter DNA-Fragmente symbiotischer Bakterien und DNA-Fragmente aus Biomen, die typisch für kalte vulkanische marine Küstenökosysteme sind. Die ccfDNA der Hämolymphe enthält auch virale Sequenzen von Viren mit unterschiedlichen Wirtsbereichen. Wir fanden auch DNA-Fragmente von mehrzelligen Tieren wie Knochenfischen, Seeanemonen, Algen und Insekten. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das LB-Konzept erfolgreich auf marine Wirbellose angewendet werden kann, um ein reichhaltiges genomisches Repertoire in marinen Ökosystemen zu generieren.
Erwachsene (55–70 mm lang) Miesmuscheln vom Typ Mytilus platensis (M. platensis) und Aulacomya atra (A. atra) wurden im Dezember 2018 an den felsigen Gezeitenküsten von Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E) auf den Kerguelen-Inseln gesammelt. Weitere erwachsene Miesmuscheln (Mytilus spp.) wurden von einem gewerblichen Lieferanten (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) bezogen und in einen temperaturgeregelten (4 °C), belüfteten Tank mit 10–20 l 32 ‰ künstlicher Salzlake (künstliches Meersalz, Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA) gegeben. Bei jedem Experiment wurden Länge und Gewicht der einzelnen Schalen gemessen.
Ein kostenloses Open-Access-Protokoll für dieses Programm ist online verfügbar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Kurz gesagt wurde LB-Hämolymphe wie beschrieben aus den Abduktorenmuskeln gesammelt [22]. Die Hämolymphe wurde durch Zentrifugation bei 1200×g für 3 Minuten geklärt, der Überstand wurde bis zur Verwendung eingefroren (-20°C). Zur Isolierung und Reinigung von cfDNA wurden Proben (1,5–2,0 ml) aufgetaut und mit dem NucleoSnap cfDNA-Kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet. ccfDNA wurde bis zur weiteren Analyse bei -80°C gelagert. In einigen Experimenten wurde ccfDNA mit dem QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) isoliert und gereinigt. Gereinigte DNA wurde mit einem standardmäßigen PicoGreen-Test quantifiziert. Die Fragmentverteilung der isolierten ccfDNA wurde mittels Kapillarelektrophorese mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) und einem High Sensitivity DNA Kit analysiert. Die Analyse erfolgte mit 1 µl der ccfDNA-Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Für die Sequenzierung von Hämolymph-ccfDNA-Fragmenten präparierte Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) Shotgun-Bibliotheken mit dem Illumina DNA Mix Kit des Illumina MiSeq PE75 Kits. Ein Standardadapter (BioO) wurde verwendet. Rohdaten sind im NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 und SRR8924809) verfügbar. Die grundlegende Lesequalität wurde mit FastQC [23] bewertet. Trimmomatic [24] wurde zum Beschneiden von Adaptern und qualitativ schlechten Reads verwendet. Shotgun-Reads mit gepaarten Enden wurden mittels FLASH zu längeren Einzelreads mit einer Mindestüberlappung von 20 bp zusammengeführt, um Fehlpaarungen zu vermeiden [25]. Zusammengeführte Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung einer NCBI-Taxonomiedatenbank für Muscheln (e-Wert < 1e−3 und 90 % Homologie) annotiert, und die Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST [26] durchgeführt. Zusammengeführte Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung einer NCBI-Taxonomiedatenbank für Muscheln (e-Wert < 1e−3 und 90 % Homologie) annotiert, und die Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST [26] durchgeführt. Allgemeine Informationen wurden mit BLASTN über die Verwendung von Datenbanken dieser neuen NCBI-Modelle (Ergebnisse e < 1e-3 y.) erstellt 90 % Homologie), a Die nachträgliche Maskierung wurde häufig mit der Staubentfernung durchgeführt [26]. Die gepoolten Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung der NCBI-Taxonomiedatenbank für Muscheln (e-Wert < 1e-3 und 90 % Homologie) annotiert, und eine Sequenzmaskierung mit geringer Komplexität wurde mit DUST [26] durchgeführt.使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数，并使用DUST [26]进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数, 并 使用 Staub [26]进行 复杂度 序列 的。掩蔽 掩蔽 掩蔽Die allgemeinen Datenschutzbestimmungen wurden mit BLASTN über die Verwendung wirtschaftlicher Datenbanken von NCBI (Bewertung e <1e-3) bewertet und 90 % Homologie), Die Maskierung nach kurzer Zeit wurde häufig mit der Verwendung von Staub durchgeführt [26]. Die gepoolten Reads wurden mit BLASTN unter Verwendung der taxonomischen NCBI-Datenbank für Muscheln (e-Wert <1e-3 und 90 % Homologie) annotiert, und eine Sequenzmaskierung mit geringer Komplexität wurde mit DUST durchgeführt [26].Die Reads wurden in zwei Gruppen unterteilt: solche mit Bezug zu Muschelsequenzen (hier Self-Reads genannt) und solche ohne Bezug (Non-Self-Reads). Zwei Gruppen wurden separat mit MEGAHIT zusammengestellt, um Contigs zu generieren [27]. Gleichzeitig wurde die taxonomische Verteilung der Alien-Mikrobiom-Reads mit Kraken2 [28] klassifiziert und grafisch in einem Krona-Kreisdiagramm auf Galaxy [29, 30] dargestellt. Die optimalen kmer wurden in unseren Vorversuchen als kmer-59 ermittelt. Selbst-Contigs wurden dann durch Ausrichtung mit BLASTN (Muschel-NCBI-Datenbank, E-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) für eine endgültige Annotation identifiziert. Selbst-Contigs wurden dann durch Ausrichtung mit BLASTN (Muschel-NCBI-Datenbank, E-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) für eine endgültige Annotation identifiziert. Bei diesen neuen Krankheiten handelt es sich um Identifizierungsdaten, die mit BLASTN verbunden sind (basierend auf den zweitgrößten NCBI-Verkäufern mit einer Klassifizierung von <1e-10 und 100 %). 60%) окончательной аннотации. Zur endgültigen Annotation wurden dann Selbst-Contigs durch Abgleich mit BLASTN (NCBI-Muscheldatenbank, E-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) identifiziert.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 %同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Es handelte sich dabei um Identifizierungs- und Vergleichskonten für die Einbeziehung von BLASTN-Anfragen (auf der Grundlage dieser NCBI-Angaben für zweitgrößte Mollusken, Konzentration e <1e-10 und Homologie 60 %). Anschließend wurden Selbst-Contigs zur endgültigen Annotation durch Abgleich mit BLASTN (NCBI-Muscheldatenbank, E-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) identifiziert. Parallel dazu wurden Nichtselbstgruppen-Contigs mit BLASTN (nt NCBI-Datenbank, e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) annotiert. Parallel dazu wurden Nichtselbstgruppen-Contigs mit BLASTN (nt NCBI-Datenbank, e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) annotiert. Parallel dazu wurden verschiedene Gruppenkontingente mit BLASTN kommentiert (ab 1999 mit NCBI, Bewertung e <1e-10 und 60 %). Parallel dazu wurden Fremdgruppen-Contigs mit BLASTN (NT NCBI-Datenbank, e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) annotiert.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Parallel dazu wurden keine Kommentare zur Gruppe veröffentlicht, die mit BLASTN (auf der Grundlage von NCBI mit einer Bewertung von <1e-10 und Homologie) verknüpft wurden 60 %). Parallel dazu wurden Nicht-Selbstgruppen-Contigs mit BLASTN (nt NCBI-Datenbank, e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) annotiert. BLASTX wurde auch an Fremd-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-Protein-NCBI-Datenbanken durchgeführt (e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie). BLASTX wurde auch an Fremd-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-Protein-NCBI-Datenbanken durchgeführt (e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie). BLASTX wurde auch auf mehreren Kontinenten getestet und basiert auf der Grundlage von Weißbuch Nr. und RefSeq NCBI (Bewertung von <1e-10 und 60 %). BLASTX wurde auch an Nicht-Selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-NCBI-Proteindatenbanken durchgeführt (e-Wert < 1e-10 und 60 % Homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX wurde auf mehreren Servern mit einer Kapazität von 100 % und RefSeq NCBI verwendet (Wert <1e-10 und 60 %). BLASTX wurde auch an Nicht-Selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-NCBI-Proteindatenbanken durchgeführt (e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie).Die BLASTN- und BLASTX-Pools von Nicht-Selbst-Contigs stellen die endgültigen Contigs dar (siehe Zusatzdatei).
Die für die PCR verwendeten Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt. Taq-DNA-Polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) wurde zur Amplifikation der ccfDNA-Zielgene verwendet. Folgende Reaktionsbedingungen wurden angewendet: Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, 95 °C für 1 Minute, eingestellte Annealing-Temperatur für 1 Minute, Elongation bei 72 °C für 1 Minute, 35 Zyklen und schließlich 72 °C innerhalb von 10 Minuten. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in Agarosegelen (1,5 %) mit SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) bei 95 V getrennt.
Miesmuscheln (Mytilus spp.) wurden 24 Stunden lang bei 4 °C in 500 ml sauerstoffangereichertem Meerwasser (32 PSU) akklimatisiert. Plasmid-DNA mit einem Insert, das für die humane Galectin-7-cDNA-Sequenz (NCBI-Zugangsnummer L07769) kodiert, wurde dem Fläschchen in einer Endkonzentration von 190 μg/μl hinzugefügt. Als Kontrolle dienten unter denselben Bedingungen inkubierte Miesmuscheln ohne DNA-Zugabe. Der dritte Kontrollbehälter enthielt DNA ohne Muscheln. Um die DNA-Qualität im Meerwasser zu überwachen, wurden zu den angegebenen Zeitpunkten aus jedem Behälter Meerwasserproben (20 μl; drei Wiederholungen) entnommen. Zur Rückverfolgbarkeit der Plasmid-DNA wurden LB-Muscheln zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet und mittels qPCR und ddPCR analysiert. Aufgrund des hohen Salzgehalts des Meerwassers wurden Aliquots vor allen PCR-Untersuchungen mit Wasser in PCR-Qualität (1:10) verdünnt.
Die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) wurde unter Verwendung des BioRad QX200-Protokolls (Mississauga, Ontario, Kanada) durchgeführt. Verwenden Sie das Temperaturprofil, um die optimale Temperatur zu bestimmen (Tabelle S1). Tropfen wurden mit einem QX200-Tropfengenerator (BioRad) erzeugt. Die ddPCR wurde wie folgt durchgeführt: 95 °C für 5 Min, 50 Zyklen mit 95 °C für 30 s und einer gegebenen Annealing-Temperatur für 1 Min und 72 °C für 30 s, 4 °C für 5 Min und 90 °C innerhalb von 5 Minuten. Die Anzahl der Tropfen und positiven Reaktionen (Anzahl der Kopien/µl) wurden unter Verwendung eines QX200-Tropfenlesers (BioRad) gemessen. Proben mit weniger als 10.000 Tröpfchen wurden verworfen. Eine Musterkontrolle wurde nicht bei jedem ddPCR-Durchlauf durchgeführt.
Die qPCR wurde mit Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) und LGALS7-spezifischen Primern durchgeführt. Alle quantitativen PCRs wurden in 20 µl mit dem QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) durchgeführt. Die qPCR begann mit einer 15-minütigen Inkubation bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 10 Sekunden und bei 60 °C für 60 Sekunden mit einer Datenerfassung. Schmelzkurven wurden durch aufeinanderfolgende Messungen bei 95 °C für 5 Sekunden, 65 °C für 60 Sekunden und 97 °C am Ende der qPCR erstellt. Jede qPCR wurde, mit Ausnahme der Kontrollproben, dreifach durchgeführt.
Da Muscheln für ihre hohe Filtrationsrate bekannt sind, untersuchten wir zunächst, ob sie im Meerwasser vorhandene DNA-Fragmente filtern und zurückhalten können. Außerdem interessierte uns, ob sich diese Fragmente in ihrem halboffenen Lymphsystem ansammeln. Wir lösten diese Frage experimentell, indem wir das Schicksal löslicher DNA-Fragmente verfolgten, die wir den Miesmuschelbecken zusetzten. Zur leichteren Verfolgung der DNA-Fragmente verwendeten wir fremde (nicht körpereigene) Plasmid-DNA, die das menschliche Galectin-7-Gen enthielt. Mittels ddPCR lassen sich Plasmid-DNA-Fragmente in Meerwasser und Muscheln verfolgen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Menge der DNA-Fragmente im Meerwasser, die in Abwesenheit von Muscheln über einen längeren Zeitraum (bis zu 7 Tage) relativ konstant blieb, in Anwesenheit von Muscheln innerhalb von 8 Stunden fast vollständig verschwand (Abb. 1a,b). Fragmente exogener DNA konnten innerhalb von 15 Minuten problemlos in der intravalvulären Flüssigkeit und der Hämolymphe nachgewiesen werden (Abb. 1c). Diese Fragmente waren auch noch bis zu 4 Stunden nach der Exposition nachweisbar. Diese Filteraktivität in Bezug auf DNA-Fragmente ist vergleichbar mit der Filteraktivität von Bakterien und Algen [31]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Muscheln fremde DNA in ihren Flüssigkeitskompartimenten filtern und anreichern können.
Relative Konzentrationen von Plasmid-DNA in Meerwasser in Anwesenheit (A) oder Abwesenheit (B) von Muscheln, gemessen mittels ddPCR. In A werden die Ergebnisse als Prozentsätze angegeben, wobei die Grenzen der Kästchen das 75. und 25. Perzentil darstellen. Die angepasste logarithmische Kurve ist rot dargestellt, der grau schattierte Bereich stellt das 95%-Konfidenzintervall dar. In B stellt die rote Linie den Mittelwert und die blaue Linie das 95%-Konfidenzintervall für die Konzentration dar. C Anreicherung von Plasmid-DNA in der Hämolymphe und der Klappenflüssigkeit von Muscheln zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von Plasmid-DNA. Die Ergebnisse werden als absolute Kopienzahl (±SE)/ml angegeben.
Als nächstes untersuchten wir den Ursprung der ccfDNA in Muscheln, die wir aus Muschelbänken der Kerguelen-Inseln, einer abgelegenen Inselgruppe mit geringem anthropogenen Einfluss, gesammelt hatten. Zu diesem Zweck wurde cccDNA aus Muschelhämolymphen isoliert und mit Methoden gereinigt, die üblicherweise zur Reinigung menschlicher cccDNA verwendet werden [32, 33]. Wir fanden heraus, dass die durchschnittlichen Hämolymphen-ccfDNA-Konzentrationen in Muscheln im niedrigen Mikrogramm-pro-ml-Bereich liegen (siehe Tabelle S2, Ergänzende Informationen). Dieser Konzentrationsbereich ist viel größer als bei gesunden Menschen (niedrige Nanogramm pro Milliliter), aber in seltenen Fällen, bei Krebspatienten, kann der ccfDNA-Spiegel mehrere Mikrogramm pro Milliliter erreichen [34, 35]. Eine Analyse der Größenverteilung der Hämolymphen-ccfDNA zeigte, dass diese Fragmente stark in der Größe variieren und zwischen 1000 bp und 5000 bp liegen (Abb. 2). Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem auf Silica basierenden QIAamp Investigator Kit erzielt, einer in der Forensik häufig verwendeten Methode zur schnellen Isolierung und Reinigung genomischer DNA aus DNA-Proben mit geringer Konzentration, einschließlich ccfDNA [36].
Repräsentatives ccfDNA-Elektrophoregramm der Muschelhämolymphe. Extrahiert mit dem NucleoSnap Plasma Kit (oben) und dem QIAamp DNA Investigator Kit. B Violinendiagramm zeigt die Verteilung der Hämolymphe-ccfDNA-Konzentrationen (±SE) in Muscheln. Die schwarzen und roten Linien stellen den Median bzw. das erste und dritte Quartil dar.
Etwa 1 % der ccfDNA bei Menschen und Primaten hat eine fremde Quelle [21, 37]. Angesichts des halboffenen Kreislaufsystems von Muscheln, des mikrobenreichen Meerwassers und der Größenverteilung der Muschel-ccfDNA vermuteten wir, dass die Hämolymphe-ccfDNA von Muscheln einen reichen und vielfältigen Pool mikrobieller DNA enthalten könnte. Um diese Hypothese zu überprüfen, sequenzierten wir Hämolymphe-ccfDNA aus Aulacomya-atra-Proben von den Kerguelen-Inseln und erhielten über 10 Millionen Reads, von denen 97,6 % die Qualitätskontrolle bestanden. Die Reads wurden anschließend anhand der Muscheldatenbanken BLASTN und NCBI nach eigenen und fremden Quellen klassifiziert (Abb. S1, Ergänzende Informationen).
Beim Menschen kann sowohl nukleäre als auch mitochondriale DNA in den Blutkreislauf freigesetzt werden [38]. In der vorliegenden Studie war es jedoch nicht möglich, die nukleäre genomische DNA von Muscheln im Detail zu beschreiben, da das Genom von A. atra weder sequenziert noch beschrieben wurde. Mithilfe der Muschelbibliothek konnten wir jedoch eine Reihe von ccfDNA-Fragmenten eigenen Ursprungs identifizieren (Abb. S2, ergänzende Informationen). Wir bestätigten das Vorhandensein von DNA-Fragmenten eigenen Ursprungs auch durch gezielte PCR-Amplifikation der sequenzierten A. atra-Gene (Abb. 3). Da das mitochondriale Genom von A. atra in öffentlichen Datenbanken verfügbar ist, kann man ebenso Hinweise auf das Vorhandensein mitochondrialer ccfDNA-Fragmente in der Hämolymphe von A. atra finden. Das Vorhandensein mitochondrialer DNA-Fragmente wurde durch PCR-Amplifikation bestätigt (Abb. 3).
Verschiedene mitochondriale Gene waren in der Hämolymphe von A. atra (rote Punkte – Lagernummer: SRX5705969) und M. platensis (blaue Punkte – Lagernummer: SRX5705968) vorhanden, amplifiziert mittels PCR. Abbildung adaptiert von Breton et al., 2011 B Amplifikation des Hämolymphüberstands von A. atra. Auf FTA-Papier gelagert. Mit einem 3-mm-Stanzer direkt in das PCR-Röhrchen mit dem PCR-Mix geben.
Angesichts des hohen mikrobiellen Gehalts im Meerwasser konzentrierten wir uns zunächst auf die Charakterisierung mikrobieller DNA-Sequenzen in der Hämolymphe. Dazu verwendeten wir zwei verschiedene Strategien. Die erste Strategie verwendete Kraken2, ein algorithmusbasiertes Sequenzklassifizierungsprogramm, das mikrobielle Sequenzen mit einer mit BLAST und anderen Tools vergleichbaren Genauigkeit identifizieren kann [28]. Mehr als 6719 Reads wurden als bakteriellen Ursprungs bestimmt, während 124 und 64 von Archaeen bzw. Viren stammten (Abb. 4). Die am häufigsten vorkommenden bakteriellen DNA-Fragmente waren Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) und Bacteroidetes (17 %) (Abb. 4a). Diese Verteilung steht im Einklang mit früheren Studien zum Mikrobiom der marinen Miesmuschel [39, 40]. Gammaproteobacteria waren die Hauptklasse der Proteobacteria (44 %), darunter viele Vibrionales (Abb. 4b). Die ddPCR-Methode bestätigte das Vorhandensein von Vibrio-DNA-Fragmenten in der ccfDNA der A. atra-Hämolymphe (Abb. 4c) [41]. Um weitere Informationen über den bakteriellen Ursprung der ccfDNA zu erhalten, wurde ein zusätzlicher Ansatz verfolgt (Abb. S2, Ergänzende Informationen). In diesem Fall wurden überlappende Reads als Paired-End-Reads zusammengestellt und mithilfe von BLASTN und einem E-Wert von 1e−3 und einem Cutoff mit >90 % Homologie als selbst (Muscheln) oder nicht selbst stammend klassifiziert. In diesem Fall wurden überlappende Reads als Paired-End-Reads zusammengestellt und mithilfe von BLASTN und einem E-Wert von 1e−3 und einem Cutoff mit >90 % Homologie als selbst (Muscheln) oder nicht selbst stammend klassifiziert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Prüfungen nach der Prüfung der Vertragsparteien und nach der Klassifizierung (Zweitbestimmung) durchgeführt Mollusken) oder bei der Herstellung mit der Verwendung von BLASTN und der Empfindlichkeit von 1e-3 und der Abweichung von der Gesundheit> 90 %. In diesem Fall wurden überlappende Reads als Paired-Ended-Reads gesammelt und mithilfe von BLASTN und einem E-Wert von 1e-3 und einem Cutoff mit >90 % Homologie als nativ (zweischalig) oder nicht-original klassifiziert.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90 %同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下, 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数, 使用 使用 使用 Blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Zu diesem Zeitpunkt wurden die Prüfungen aufgrund der Prüfung von Konzessionsverträgen und Klassifizierungen nach der Rechtsgrundlage (zweitrangige Mollusken) durchgeführt. oder Nicht erforderlich bei der Herstellung mit der Verwendung von BLASTN und 1e-3 und mehr als 90 %. In diesem Fall wurden überlappende Reads als Paired-Ended-Reads gesammelt und mithilfe von e BLASTN- und 1e-3-Werten und einem Homologieschwellenwert von >90 % als eigene (Muscheln) oder nicht originale Reads klassifiziert.Da das Genom von A. atra noch nicht sequenziert wurde, verwendeten wir die De-novo-Assemblierungsstrategie des MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-Assemblers. Insgesamt wurden 147.188 Contigs als abhängig (muschelartig) vom Ursprung identifiziert. Diese Contigs wurden anschließend mit BLASTN und BLASTX mit E-Werten von 1e-10 explodiert. Diese Strategie ermöglichte es uns, 482 nichtmuschelartige Fragmente in der ccfDNA von A. atra zu identifizieren. Mehr als die Hälfte (57 %) dieser DNA-Fragmente stammte aus Bakterien, hauptsächlich aus Kiemensymbionten, einschließlich sulfotropher Symbionten, und aus dem Kiemensymbionten Solemya velum (Abb. 5).
Relative Häufigkeit auf Typebene. B Mikrobielle Diversität zweier Hauptstämme (Firmicutes und Proteobacteria). Repräsentative Amplifikation von ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmente des 16S rRNA-Gens (blau) in drei Atra-Hämolymphen.
Insgesamt wurden 482 gesammelte Contigs analysiert. Allgemeines Profil der taxonomischen Verteilung metagenomischer Contig-Annotationen (Prokaryoten und Eukaryoten). B Detaillierte Verteilung der mit BLASTN und BLASTX identifizierten bakteriellen DNA-Fragmente.
Die Kraken2-Analyse zeigte auch, dass die ccfDNA der Muscheln archaeale DNA-Fragmente enthielt, darunter DNA-Fragmente von Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) und Thaurmarcheota (11 %) (Abb. 6a). Das Vorhandensein von DNA-Fragmenten von Euryarchaeota und Crenarchaeota, die zuvor in der mikrobiellen Gemeinschaft kalifornischer Muscheln gefunden wurden, sollte nicht überraschen [42]. Obwohl Euryarchaeota oft mit extremen Bedingungen in Verbindung gebracht wird, ist mittlerweile anerkannt, dass sowohl Euryarchaeota als auch Crenarcheota zu den häufigsten Prokaryoten in der marinen kryogenen Umwelt gehören [43, 44]. Das Vorhandensein methanogener Mikroorganismen in Muscheln ist angesichts der jüngsten Berichte über umfangreiche Methanlecks aus Bodenlecks auf dem Kerguelen-Plateau [45] und einer möglichen mikrobiellen Methanproduktion vor der Küste der Kerguelen-Inseln [46] nicht überraschend.
Unsere Aufmerksamkeit richtete sich dann auf Messungen von DNA-Viren. Unseres Wissens ist dies die erste Off-Target-Studie zum Virengehalt von Muscheln. Wie erwartet fanden wir DNA-Fragmente von Bakteriophagen (Caudovirales) (Abb. 6b). Die häufigste virale DNA stammt jedoch aus einem Stamm von Nukleocytoviren, auch bekannt als nukleär-zytoplasmatisches Groß-DNA-Virus (NCLDV), das das größte Genom aller Viren besitzt. Innerhalb dieses Stammes gehören die meisten DNA-Sequenzen zu den Familien Mimimidoviridae (58 %) und Poxviridae (21 %), deren natürliche Wirte Wirbeltiere und Arthropoden sind, während ein kleiner Teil dieser DNA-Sequenzen zu bekannten virologischen Algen gehört. Infiziert marine eukaryotische Algen. Die Sequenzen wurden auch vom Pandora-Virus gewonnen, dem Riesenvirus mit der größten Genomgröße aller bekannten Virengattungen. Interessanterweise war das Spektrum der nachweislich mit dem Virus infizierten Wirte, wie durch Hämolymph-ccfDNA-Sequenzierung ermittelt, relativ groß (Abbildung S3, Ergänzende Informationen). Es umfasst Viren, die Insekten wie Baculoviridae und Iridoviridae infizieren, sowie Viren, die Amöben, Algen und Wirbeltiere infizieren. Wir fanden auch Sequenzen, die mit dem Genom des Pithovirus sibericum übereinstimmen. Pitoviren (auch bekannt als „Zombieviren“) wurden erstmals aus 30.000 Jahre altem Permafrost in Sibirien isoliert [47]. Unsere Ergebnisse stehen daher im Einklang mit früheren Berichten, die zeigen, dass nicht alle modernen Arten dieser Viren ausgestorben sind [48] und dass diese Viren in entlegenen subarktischen Meeresökosystemen vorkommen könnten.
Abschließend prüften wir, ob wir DNA-Fragmente von anderen mehrzelligen Tieren finden konnten. Insgesamt wurden 482 fremde Contigs mittels BLASTN und BLASTX mit nt-, nr- und RefSeq-Bibliotheken (genomisch und Protein) identifiziert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass unter den fremden ccfDNA-Fragmenten mehrzelliger Tiere die DNA von Knochenknochen überwiegt (Abb. 5). Auch DNA-Fragmente von Insekten und anderen Arten wurden gefunden. Ein relativ großer Teil der DNA-Fragmente wurde nicht identifiziert, möglicherweise aufgrund der Unterrepräsentation einer großen Anzahl mariner Arten in genomischen Datenbanken im Vergleich zu terrestrischen Arten [49].
In der vorliegenden Arbeit wenden wir das LB-Konzept auf Muscheln an und argumentieren, dass die Sequenzierung von Hämolymphe-ccfDNA Einblicke in die Zusammensetzung mariner Küstenökosysteme geben kann. Insbesondere fanden wir heraus, dass 1) die Hämolymphe von Muscheln relativ hohe Konzentrationen (Mikrogramm-Werte) relativ großer (~1-5 kb) zirkulierender DNA-Fragmente enthält; 2) diese DNA-Fragmente sowohl unabhängig als auch nicht-unabhängig sind; 3) unter den fremden Quellen dieser DNA-Fragmente fanden wir bakterielle, archäische und virale DNA sowie DNA anderer mehrzelliger Tiere; 4) die Anreicherung dieser fremden ccfDNA-Fragmente in der Hämolymphe erfolgt schnell und trägt zur internen Filteraktivität von Muscheln bei. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das LB-Konzept, das bisher hauptsächlich im Bereich der Biomedizin angewendet wurde, eine reichhaltige, aber unerforschte Wissensquelle kodiert, die genutzt werden kann, um die Interaktion zwischen Sentinel-Arten und ihrer Umwelt besser zu verstehen.
Außer bei Primaten wurde über die Isolierung von ccfDNA auch bei Säugetieren wie Mäusen, Hunden, Katzen und Pferden berichtet [50, 51, 52]. Unseres Wissens ist unsere Studie jedoch die erste, die über den Nachweis und die Sequenzierung von ccfDNA bei Meeresspezies mit offenem Kreislaufsystem berichtet. Diese anatomische Besonderheit und die Filterfähigkeit von Muscheln könnten zumindest teilweise die unterschiedlichen Größenmerkmale zirkulierender DNA-Fragmente im Vergleich zu anderen Spezies erklären. Beim Menschen sind die meisten im Blut zirkulierenden DNA-Fragmente klein und haben eine Größe von 150 bis 200 bp mit einem Maximum von 167 bp [34, 53]. Ein kleiner, aber signifikanter Anteil der DNA-Fragmente ist zwischen 300 und 500 bp groß und etwa 5 % sind länger als 900 bp [54]. Der Grund für diese Größenverteilung liegt darin, dass die Hauptquelle von ccfDNA im Plasma als Folge von Zelltod auftritt, entweder aufgrund von Zelltod oder aufgrund von Nekrose zirkulierender hämatopoetischer Zellen bei gesunden Personen oder aufgrund von Apoptose von Tumorzellen bei Krebspatienten (bekannt als zirkulierende Tumor-DNA, ctDNA). Die Größenverteilung der Hämolymphe-ccfDNA, die wir in Muscheln fanden, variierte zwischen 1000 und 5000 bp, was nahelegt, dass die Muschel-ccfDNA einen anderen Ursprung hat. Dies ist eine logische Hypothese, da Muscheln ein halboffenes Gefäßsystem haben und in marinen Wasserumgebungen leben, die hohe Konzentrationen mikrobieller genomischer DNA enthalten. Tatsächlich haben unsere Laborexperimente mit exogener DNA gezeigt, dass Muscheln DNA-Fragmente im Meerwasser ansammeln, zumindest werden diese nach einigen Stunden nach zellulärer Aufnahme abgebaut und/oder freigesetzt und/oder in verschiedenen Organisationen gespeichert. Angesichts der Seltenheit von Zellen (sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen) reduziert die Verwendung intravalvulärer Kompartimente die Menge an ccfDNA aus körpereigenen und fremden Quellen. Angesichts der Bedeutung der angeborenen Immunität von Muscheln und der großen Anzahl zirkulierender Phagozyten stellten wir die Hypothese auf, dass selbst fremde ccfDNA in zirkulierenden Phagozyten angereichert ist, die nach Aufnahme von Mikroorganismen und/oder Zelltrümmern fremde DNA akkumulieren. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Hämolymph-ccfDNA von Muscheln ein einzigartiger Speicher molekularer Informationen ist und ihren Status als Sentinel-Spezies untermauert.
Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Sequenzierung und Analyse von bakteriellen Hämolymph-ccfDNA-Fragmenten wichtige Informationen über die bakterielle Wirtsflora und die im umgebenden marinen Ökosystem vorhandenen Bakterien liefern kann. Shot-Sequenzierungstechniken haben Sequenzen des kommensalen Bakteriums A. atra gill enthüllt, die bei Verwendung herkömmlicher 16S-rRNA-Identifizierungsmethoden übersehen worden wären, teilweise aufgrund einer Referenzbibliotheksverzerrung. Tatsächlich zeigte unsere Verwendung von LB-Daten, die von M. platensis in derselben Muschelschicht auf Kerguelen gesammelt wurden, dass die Zusammensetzung der kiemenassoziierten bakteriellen Symbionten bei beiden Muschelarten dieselbe war (Abb. S4, ergänzende Informationen). Diese Ähnlichkeit zweier genetisch unterschiedlicher Muscheln könnte die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften in den kalten, schwefelhaltigen und vulkanischen Ablagerungen von Kerguelen widerspiegeln [55, 56, 57, 58]. Erhöhte Konzentrationen schwefelreduzierender Mikroorganismen wurden bei der Muschelernte in bioturbierten Küstengebieten [59], wie beispielsweise an der Küste von Port-au-France, gut beschrieben. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die kommensale Muschelflora durch horizontale Übertragung beeinträchtigt wird [60, 61]. Weitere Forschung ist erforderlich, um den Zusammenhang zwischen der Meeresumwelt, der Meeresbodenoberfläche und der Zusammensetzung symbiotischer Bakterien in Muscheln zu bestimmen. Diese Studien laufen derzeit.
Die Länge und Konzentration der Hämolymphen-ccfDNA, ihre einfache Aufreinigung und ihre hohe Qualität, die eine schnelle Shotgun-Sequenzierung ermöglicht, sind einige der vielen Vorteile der Verwendung von Muschel-ccfDNA zur Beurteilung der Biodiversität in marinen Küstenökosystemen. Dieser Ansatz ist besonders effektiv für die Charakterisierung viraler Gemeinschaften (Virome) in einem bestimmten Ökosystem [62, 63]. Im Gegensatz zu Bakterien, Archaeen und Eukaryoten enthalten virale Genome keine phylogenetisch konservierten Gene wie 16S-Sequenzen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Flüssigbiopsien von Indikatorarten wie Muscheln verwendet werden können, um relativ viele ccfDNA-Virusfragmente zu identifizieren, von denen bekannt ist, dass sie Wirte infizieren, die typischerweise in küstennahen Meeresökosystemen vorkommen. Dazu gehören Viren, die bekanntermaßen Protozoen, Arthropoden, Insekten, Pflanzen und bakterielle Viren (z. B. Bakteriophagen) infizieren. Eine ähnliche Verteilung wurde festgestellt, als wir das Hämolymph-ccfDNA-Virom von Miesmuscheln (M. platensis) untersuchten, die in derselben Muschelschicht auf Kerguelen gesammelt wurden (Tabelle S2, ergänzende Informationen). Die Shotgun-Sequenzierung von ccfDNA ist tatsächlich ein neuer Ansatz, der in der Untersuchung des Viroms von Menschen oder anderen Spezies an Bedeutung gewinnt [21, 37, 64]. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Untersuchung von Viren mit doppelsträngiger DNA, da bei allen Viren mit doppelsträngiger DNA, die die vielfältigste und breiteste Virenklasse in Baltimore darstellen, kein einzelnes Gen konserviert ist [65]. Obwohl die meisten dieser Viren nicht klassifiziert sind und Viren aus einem völlig unbekannten Teil der Virenwelt umfassen könnten [66], stellten wir fest, dass die Virome und Wirtsbereiche der Muscheln A. atra und M. platensis in ähnlicher Weise zwischen die beiden Arten fallen (siehe Abbildung S3, ergänzende Informationen). Diese Ähnlichkeit ist nicht überraschend, da sie einen Mangel an Selektivität bei der Aufnahme von in der Umwelt vorhandener DNA widerspiegeln könnte. Zur Charakterisierung des RNA-Viroms sind derzeit weitere Studien mit gereinigter RNA erforderlich.
In unserer Studie verwendeten wir eine sehr strenge Pipeline, die aus der Arbeit von Kowarski und Kollegen [37] adaptiert wurde. Diese nutzten eine zweistufige Deletion gepoolter Reads und Contigs vor und nach der Assemblierung nativer ccfDNA, was zu einem hohen Anteil nicht kartierter Reads führte. Wir können daher nicht ausschließen, dass einige dieser nicht kartierten Reads dennoch einen eigenen Ursprung haben, vor allem, weil uns kein Referenzgenom für diese Muschelart fehlt. Wir verwendeten diese Pipeline auch, weil uns die Chimären zwischen eigenen und fremden Reads sowie die durch Illumina MiSeq PE75 generierten Read-Längen Sorgen bereiteten. Ein weiterer Grund für die Mehrzahl nicht kartierter Reads ist, dass ein Großteil der Meeresmikroben, insbesondere in abgelegenen Gebieten wie Kerguelen, nicht annotiert wurde. Wir verwendeten Illumina MiSeq PE75 und gingen davon aus, dass die ccfDNA-Fragmentlängen denen der menschlichen ccfDNA ähneln. Da unsere Ergebnisse zeigen, dass Hämolymphen-ccfDNA längere Leseabschnitte aufweist als die von Menschen und/oder Säugetieren, empfehlen wir für zukünftige Studien die Verwendung einer Sequenzierungsplattform, die sich besser für längere ccfDNA-Fragmente eignet. Dieses Vorgehen wird die Identifizierung weiterer Hinweise für eine tiefergehende Analyse deutlich erleichtern. Die derzeit nicht verfügbare vollständige Kerngenomsequenz von A. atra würde zudem die Unterscheidung von ccfDNA aus körpereigenen und körperfremden Quellen erheblich erleichtern. Da sich unsere Forschung auf die Anwendung des Konzepts der Flüssigbiopsie auf Muscheln konzentriert hat, hoffen wir, dass mit der Anwendung dieses Konzepts in zukünftigen Forschungsarbeiten neue Werkzeuge und Pipelines entwickelt werden, um das Potenzial dieser Methode zur Erforschung der mikrobiellen Diversität von Muscheln und des marinen Ökosystems zu erweitern.
Erhöhte ccfDNA-Plasmaspiegel im menschlichen Körper werden als nicht-invasiver klinischer Biomarker mit verschiedenen Erkrankungen, Gewebeschäden und Stress assoziiert [67,68,69]. Dieser Anstieg ist mit der Freisetzung von DNA-Fragmenten eigenen Ursprungs nach Gewebeschädigung verbunden. Wir untersuchten dieses Problem mithilfe von akutem Hitzestress, bei dem Muscheln kurzzeitig einer Temperatur von 30 °C ausgesetzt wurden. Wir führten diese Analyse in drei unabhängigen Experimenten an drei verschiedenen Muschelarten durch. Wir stellten jedoch keine Veränderung der ccfDNA-Werte nach akutem Hitzestress fest (siehe Abbildung S5, zusätzliche Informationen). Diese Entdeckung könnte zumindest teilweise erklären, warum Muscheln ein halboffenes Kreislaufsystem besitzen und aufgrund ihrer hohen Filteraktivität große Mengen fremder DNA ansammeln. Andererseits könnten Muscheln, wie viele wirbellose Tiere, resistenter gegen stressbedingte Gewebeschäden sein und dadurch die Freisetzung von ccfDNA in ihre Hämolymphe begrenzen [70, 71].
Bisher konzentrierte sich die DNA-Analyse der Biodiversität in aquatischen Ökosystemen hauptsächlich auf das Metabarcoding von Umwelt-DNA (eDNA). Diese Methode stößt jedoch bei der Biodiversitätsanalyse üblicherweise an ihre Grenzen, wenn Primer verwendet werden. Der Einsatz der Shotgun-Sequenzierung umgeht die Einschränkungen der PCR und die verzerrte Auswahl von Primer-Sets. Daher ähnelt unsere Methode in gewisser Weise der kürzlich verwendeten Hochdurchsatz-eDNA-Shotgun-Sequenzierungsmethode, mit der fragmentierte DNA direkt sequenziert und nahezu alle Organismen analysiert werden können [72, 73]. Es gibt jedoch eine Reihe grundlegender Aspekte, die LB von Standard-eDNA-Methoden unterscheiden. Der Hauptunterschied zwischen eDNA und LB ist natürlich die Verwendung natürlicher Filterwirte. Über die Verwendung mariner Arten wie Schwämme und Muscheln (Dresseina spp.) als natürliche Filter zur Untersuchung von eDNA wurde berichtet [74, 75]. In Dreissenas Studie wurden jedoch Gewebebiopsien verwendet, aus denen DNA extrahiert wurde. Die Analyse von ccfDNA aus LB erfordert keine Gewebebiopsie, keine spezielle und manchmal teure Ausrüstung und keine mit eDNA oder Gewebebiopsie verbundene Logistik. Tatsächlich haben wir kürzlich berichtet, dass ccfDNA aus LB mit FTA-Unterstützung ohne Aufrechterhaltung einer Kühlkette gelagert und analysiert werden kann, was eine große Herausforderung für die Forschung in abgelegenen Gebieten darstellt [76]. Die Extraktion von ccfDNA aus Flüssigbiopsien ist ebenfalls einfach und liefert qualitativ hochwertige DNA für die Shotgun-Sequenzierung und PCR-Analyse. Dies ist ein großer Vorteil angesichts einiger technischer Einschränkungen, die mit der eDNA-Analyse verbunden sind [77]. Die Einfachheit und die geringen Kosten der Probenahmemethode eignen sich zudem besonders für Langzeitüberwachungsprogramme. Neben ihrer hohen Filterfähigkeit ist ein weiteres bekanntes Merkmal von Muscheln die chemische Mukopolysaccharidzusammensetzung ihres Schleims, die die Absorption von Viren fördert [78, 79]. Dies macht Muscheln zu einem idealen natürlichen Filter für die Charakterisierung der Biodiversität und der Auswirkungen des Klimawandels in einem bestimmten aquatischen Ökosystem. Obwohl das Vorhandensein von aus dem Wirt stammenden DNA-Fragmenten als Einschränkung der Methode im Vergleich zu eDNA angesehen werden kann, sind die Kosten, die mit dem Besitz einer solchen nativen ccfDNA im Vergleich zu eDNA verbunden sind, gleichzeitig angesichts der enormen Menge an Informationen verständlich, die für Gesundheitsstudien zur Verfügung stehen. Dazu gehört das Vorhandensein von viralen Sequenzen, die in das Genom des Wirts integriert sind. Dies ist angesichts des Vorhandenseins horizontal übertragener Leukämie-Retroviren in Muscheln besonders wichtig [80, 81]. Ein weiterer Vorteil von LB gegenüber eDNA besteht darin, dass es die phagozytische Aktivität zirkulierender Blutzellen in der Hämolymphe ausnutzt, die Mikroorganismen (und deren Genome) verschlingt. Phagozytose ist die Hauptfunktion von Blutzellen in Muscheln [82]. Schließlich macht sich die Methode die hohe Filterkapazität von Muscheln (durchschnittlich 1,5 l/h Meerwasser) und die zweitägige Zirkulation zunutze, die die Durchmischung verschiedener Meerwasserschichten verstärkt und so die Erfassung heterologer eDNA ermöglicht. [83, 84]. Angesichts der ernährungsphysiologischen, wirtschaftlichen und ökologischen Auswirkungen von Muscheln ist die Analyse von Muschel-ccfDNA daher ein interessanter Ansatz. Ähnlich wie die Analyse von menschlichem LB eröffnet diese Methode die Möglichkeit, genetische und epigenetische Veränderungen der Wirts-DNA als Reaktion auf exogene Substanzen zu messen. Beispielsweise sind Sequenzierungstechnologien der dritten Generation denkbar, um mittels Nanoporensequenzierung genomweite Methylierungsanalysen in nativer ccfDNA durchzuführen. Dieser Prozess dürfte dadurch erleichtert werden, dass die Länge der Muschel-ccfDNA-Fragmente ideal mit Sequenzierungsplattformen mit langen Leselängen kompatibel ist, die eine genomweite DNA-Methylierungsanalyse in einem einzigen Sequenzierungslauf ohne chemische Transformationen ermöglichen. [85,86] Dies ist eine interessante Möglichkeit, da gezeigt wurde, dass DNA-Methylierungsmuster eine Reaktion auf Umweltstress widerspiegeln und über viele Generationen hinweg bestehen bleiben. Daher kann sie wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen liefern, die die Reaktion nach der Exposition gegenüber Klimawandel oder Schadstoffen steuern [87]. Die Anwendung von LB ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Selbstverständlich erfordert sie das Vorhandensein von Indikatorarten im Ökosystem. Wie bereits erwähnt, erfordert die Verwendung von LB zur Bewertung der Biodiversität eines bestimmten Ökosystems zudem eine rigorose bioinformatische Analyse, die das Vorhandensein von DNA-Fragmenten aus der Quelle berücksichtigt. Ein weiteres großes Problem ist die Verfügbarkeit von Referenzgenomen für marine Arten. Es besteht die Hoffnung, dass Initiativen wie das Marine Mammal Genomes Project und das kürzlich ins Leben gerufene Fish10k-Projekt [88] solche Analysen in Zukunft erleichtern werden. Die Anwendung des LB-Konzepts auf marine Filtrierer ist zudem mit den neuesten Fortschritten der Sequenzierungstechnologie kompatibel und eignet sich daher gut für die Entwicklung von Multi-Ohm-Biomarkern, die wichtige Informationen über den Gesundheitszustand mariner Lebensräume als Reaktion auf Umweltstress liefern.
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