Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com.Die von Ihnen verwendete Browserversion bietet eingeschränkte CSS-Unterstützung.Für ein optimales Erlebnis empfehlen wir die Verwendung eines aktualisierten Browsers (oder die Deaktivierung des Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer).Um weiterhin Support zu gewährleisten, werden wir die Website in der Zwischenzeit ohne Stile und JavaScript rendern.
Liquid Biopsy (LB) ist ein Konzept, das im biomedizinischen Bereich schnell an Popularität gewinnt.Das Konzept basiert hauptsächlich auf dem Nachweis von Fragmenten zirkulierender extrazellulärer DNA (ccfDNA), die nach dem Zelltod in verschiedenen Geweben überwiegend als kleine Fragmente freigesetzt werden.Ein kleiner Teil dieser Fragmente stammt aus fremden (fremden) Geweben oder Organismen.In der aktuellen Arbeit haben wir dieses Konzept auf Muscheln angewendet, eine Wächterart, die für ihre hohe Meerwasserfiltrationskapazität bekannt ist.Wir nutzen die Fähigkeit von Muscheln, als natürliche Filter zu fungieren, um DNA-Fragmente aus der Umwelt aus verschiedenen Quellen einzufangen und so Informationen über die Artenvielfalt mariner Küstenökosysteme bereitzustellen.Unsere Ergebnisse zeigen, dass Muschelhämolymphe DNA-Fragmente enthält, deren Größe stark variiert und zwischen 1 und 5 kb liegt.Die Shotgun-Sequenzierung zeigte, dass eine große Anzahl von DNA-Fragmenten fremden mikrobiellen Ursprungs sind.Darunter fanden wir DNA-Fragmente von Bakterien, Archaeen und Viren, darunter Viren, von denen bekannt ist, dass sie eine Vielzahl von Wirten infizieren, die häufig in Meeresökosystemen an der Küste vorkommen.Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das auf Muscheln angewandte LB-Konzept eine reichhaltige, aber noch unerforschte Wissensquelle über die mikrobielle Vielfalt in marinen Küstenökosystemen darstellt.
Die Auswirkungen des Klimawandels (CC) auf die Biodiversität mariner Ökosysteme sind ein schnell wachsendes Forschungsgebiet.Die globale Erwärmung verursacht nicht nur erhebliche physiologische Belastungen, sondern verschiebt auch die evolutionären Grenzen der thermischen Stabilität von Meeresorganismen, beeinträchtigt den Lebensraum einer Reihe von Arten und veranlasst sie, nach günstigeren Bedingungen zu suchen [1, 2].CC beeinflusst nicht nur die Artenvielfalt von Metazoen, sondern stört auch das empfindliche Gleichgewicht der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Mikroben.Diese mikrobielle Dysbakteriose stellt eine ernsthafte Bedrohung für Meeresökosysteme dar, da sie Meeresorganismen anfälliger für infektiöse Krankheitserreger macht [3, 4].Es wird angenommen, dass SS eine wichtige Rolle bei Massensterben spielt, was ein ernstes Problem für das Management globaler Meeresökosysteme darstellt [5, 6].Angesichts der wirtschaftlichen, ökologischen und ernährungsphysiologischen Auswirkungen vieler Meeresarten ist dies ein wichtiges Thema.Dies gilt insbesondere für Muscheln, die in den Polarregionen leben, wo die Auswirkungen von CK unmittelbarer und schwerwiegender sind [6, 7].Tatsächlich sind Muscheln wie Mytilus spp.werden häufig zur Überwachung der Auswirkungen von CC auf Meeresökosysteme eingesetzt.Es überrascht nicht, dass eine relativ große Anzahl von Biomarkern entwickelt wurde, um ihren Gesundheitszustand zu überwachen, wobei häufig ein zweistufiger Ansatz verwendet wird, der funktionelle Biomarker umfasst, die auf enzymatischer Aktivität oder zellulären Funktionen wie Zelllebensfähigkeit und phagozytischer Aktivität basieren [8].Zu diesen Methoden gehört auch die Messung der Konzentration spezifischer Druckindikatoren, die sich nach der Aufnahme großer Mengen Meerwasser in Weichteilen ansammeln.Die hohe Filtrationskapazität und das halboffene Kreislaufsystem von Muscheln bieten jedoch die Möglichkeit, mithilfe des Konzepts der Flüssigbiopsie (LB), einem einfachen und minimalinvasiven Ansatz zur Patientenbehandlung, neue Hämolymph-Biomarker zu entwickeln.Blutproben [9, 10].Obwohl im menschlichen LB mehrere Arten zirkulierender Moleküle zu finden sind, basiert dieses Konzept in erster Linie auf der DNA-Sequenzanalyse von zirkulierenden extrazellulären DNA-Fragmenten (ccfDNA) im Plasma.Tatsächlich ist das Vorhandensein zirkulierender DNA im menschlichen Plasma seit Mitte des 20. Jahrhunderts bekannt [11], doch erst in den letzten Jahren hat das Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden zu einer klinischen Diagnose auf Basis von ccfDNA geführt.Das Vorhandensein dieser zirkulierenden DNA-Fragmente ist teilweise auf die passive Freisetzung genomischer DNA (nuklear und mitochondrial) nach dem Zelltod zurückzuführen. Bei gesunden Personen ist die Konzentration von ccfDNA normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann jedoch bei Patienten, die an verschiedenen Pathologien leiden oder Stress ausgesetzt sind, um das Fünf- bis Zehnfache erhöht sein, was zu Gewebeschäden führt. Bei gesunden Personen ist die Konzentration von ccfDNA normalerweise niedrig (<10 ng/ml), kann jedoch bei Patienten, die an verschiedenen Pathologien leiden oder Stress ausgesetzt sind, um das Fünf- bis Zehnfache erhöht sein, was zu Gewebeschäden führt. Bei einer höheren Konzentration von weniger als einem Jahr (<10 ng/ml) kann das Gerät in 5–10 Schritten mit einer klaren Pathologie oder darüber hinaus durchgeführt werden ющихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Bei gesunden Menschen ist die cccDNA-Konzentration normalerweise niedrig (<10 ng/ml), bei Patienten mit verschiedenen Pathologien oder unter Stress, der zu Gewebeschäden führt, kann sie jedoch um das Fünf- bis Zehnfache ansteigen.5- 10 Tage, 从而导致组织损伤.在 健康 个体 中, ccfdna 的 浓度 较 低 (（<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或 承受 压力 患者 中 可增加 5-10 倍, 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Die Konzentration der ccfDNA-Konzentration beträgt nur wenige (<10 ng/ml) in mehreren Jahren, Sie können sie jedoch nicht in 5-10 Abschnitten von Patienten mit verschiedenen Pathologien oder Stress untersuchen. Es handelt sich dabei um eine weitere Person. Die ccfDNA-Konzentrationen sind bei gesunden Personen normalerweise niedrig (<10 ng/ml), können aber bei Patienten mit verschiedenen Pathologien oder Stress um das 5- bis 10-fache erhöht sein, was zu Gewebeschäden führen kann.Die Größe von ccfDNA-Fragmenten variiert stark, liegt jedoch normalerweise zwischen 150 und 200 bp.[12].Die Analyse selbst gewonnener ccfDNA, d. h. ccfDNA aus normalen oder transformierten Wirtszellen, kann zur Erkennung genetischer und epigenetischer Veränderungen im nuklearen und/oder mitochondrialen Genom verwendet werden und hilft Ärzten so bei der Auswahl spezifischer molekularer Therapien [13].Allerdings kann ccfDNA aus fremden Quellen gewonnen werden, beispielsweise aus fötalen Zellen während der Schwangerschaft oder aus transplantierten Organen [14,15,16,17].ccfDNA ist auch eine wichtige Informationsquelle zum Nachweis des Vorhandenseins von Nukleinsäuren eines infektiösen Erregers (fremd), was den nicht-invasiven Nachweis weit verbreiteter Infektionen ermöglicht, die nicht durch Blutkulturen identifiziert werden, und eine invasive Biopsie von infiziertem Gewebe vermeidet [18].Jüngste Studien haben tatsächlich gezeigt, dass menschliches Blut eine reichhaltige Informationsquelle enthält, die zur Identifizierung viraler und bakterieller Krankheitserreger verwendet werden kann, und dass etwa 1 % der im menschlichen Plasma gefundenen ccfDNA ausländischen Ursprungs ist [19].Diese Studien zeigen, dass die Artenvielfalt des zirkulierenden Mikrobioms eines Organismus mithilfe einer ccfDNA-Analyse beurteilt werden kann.Bis vor kurzem wurde dieses Konzept jedoch ausschließlich beim Menschen und in geringerem Umfang auch bei anderen Wirbeltieren verwendet [20, 21].
In der vorliegenden Arbeit nutzen wir das LB-Potenzial, um die ccfDNA von Aulacomya atra zu analysieren, einer südlichen Art, die häufig auf den subantarktischen Kerguelen-Inseln vorkommt, einer Inselgruppe auf einem großen Plateau, die sich vor 35 Millionen Jahren gebildet hat.Vulkanausbruch.Mithilfe eines In-vitro-Versuchssystems haben wir herausgefunden, dass DNA-Fragmente im Meerwasser schnell von Muscheln aufgenommen werden und in das Hämolymphkompartiment gelangen.Shotgun-Sequenzierung hat gezeigt, dass die ccfDNA der Muschelhämolymphe DNA-Fragmente eigenen und fremden Ursprungs enthält, darunter symbiotische Bakterien und DNA-Fragmente aus Biomen, die typisch für kalte vulkanische Meeresküstenökosysteme sind.Hämolymph-ccfDNA enthält auch virale Sequenzen, die von Viren mit unterschiedlichen Wirtsbereichen stammen.Wir fanden auch DNA-Fragmente von vielzelligen Tieren wie Knochenfischen, Seeanemonen, Algen und Insekten.Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das LB-Konzept erfolgreich auf marine Wirbellose angewendet werden kann, um ein reichhaltiges genomisches Repertoire in marinen Ökosystemen zu erzeugen.
Erwachsene (55–70 mm lang) Mytilus platensis (M. platensis) und Aulacomya atra (A. atra) wurden an den felsigen Gezeitenküsten von Port-au-France (049°21,235 S, 070°13,490 E) gesammelt.Kerguelen-Inseln im Dezember 2018. Andere ausgewachsene Miesmuscheln (Mytilus spp.) wurden von einem kommerziellen Lieferanten (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Kanada) bezogen und in einen temperaturkontrollierten (4 °C) belüfteten Tank mit 10–20 l künstlicher Salzlake (32‰) gegeben.(künstliches Meersalz Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Für jedes Experiment wurden die Länge und das Gewicht der einzelnen Muscheln gemessen.
Ein kostenloses Open-Access-Protokoll für dieses Programm ist online verfügbar (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Kurz gesagt, LB-Hämolymphe wurde wie beschrieben aus den Abduktorenmuskeln gesammelt [22].Die Hämolymphe wurde durch 3-minütige Zentrifugation bei 1200 × g geklärt, der Überstand wurde bis zur Verwendung eingefroren (-20 °C).Zur Isolierung und Reinigung von cfDNA wurden Proben (1,5–2,0 ml) aufgetaut und mit dem NucleoSnap cfDNA-Kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet.ccfDNA wurde bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.In einigen Experimenten wurde ccfDNA mit dem QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada) isoliert und gereinigt.Gereinigte DNA wurde mit einem Standard-PicoGreen-Assay quantifiziert.Die Fragmentverteilung der isolierten ccfDNA wurde durch Kapillarelektrophorese unter Verwendung eines Agilent 2100 Bioanalyzers (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) unter Verwendung eines High Sensitivity DNA Kit analysiert.Der Assay wurde mit 1 µl der ccfDNA-Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Für die Sequenzierung von Hämolymph-ccfDNA-Fragmenten erstellte Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) Shotgun-Bibliotheken unter Verwendung des Illumina DNA Mix-Kits des Illumina MiSeq PE75-Kits.Es wurde ein Standardadapter (BioO) verwendet.Rohdatendateien sind im NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 und SRR8924809) verfügbar.Die grundlegende Lesequalität wurde mit FastQC bewertet [23].Trimmomatic [24] wurde zum Clipping von Adaptern und zum Lesen schlechter Qualität verwendet.Shotgun-Reads mit gepaarten Enden wurden FLASH zu längeren Single-Reads mit einer Mindestüberlappung von 20 bp zusammengeführt, um Fehlanpassungen zu vermeiden [25]. Zusammengeführte Lesevorgänge wurden mit BLASTN unter Verwendung einer zweischaligen NCBI-Taxonomiedatenbank (e-Wert < 1e−3 und 90 % Homologie) annotiert, und die Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST durchgeführt (26). Zusammengeführte Lesevorgänge wurden mit BLASTN unter Verwendung einer zweischaligen NCBI-Taxonomiedatenbank (e-Wert < 1e−3 und 90 % Homologie) annotiert, und die Maskierung von Sequenzen mit geringer Komplexität wurde mit DUST durchgeführt (26). Die allgemeinen Anforderungen wurden mit BLASTN auf der Grundlage der Datenbanken dieser neuen NCBI-Modelle (Bewertungen von < 1e-3 und 90 % aktuell) bewertet маскирование последовательностей низкой сложности выполнено выполнено использованием DUST [26]. Gepoolte Lesevorgänge wurden mit BLASTN unter Verwendung der NCBI-Muscheltaxonomiedatenbank (e-Wert < 1e-3 und 90 % Homologie) annotiert, und eine Sequenzmaskierung mit geringer Komplexität wurde mit DUST durchgeführt (26).使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数,并使用DUST [26] 进行低复杂度序列的掩蔽.使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数, 并 使用 Staub [26] 进行复杂度 序列 的。掩蔽Die allgemeinen Richtlinien wurden mit BLASTN über die Verwendung wirtschaftlicher Datenbanken in NCBI (Bewertungen <1e-3 und 90) erstellt % гомологии), маскирование последовательностей низкой сложности выполнено выполнено использованием DUST [26]. Gepoolte Lesevorgänge wurden mit BLASTN unter Verwendung der NCBI-Muscheltaxonomiedatenbank (e-Wert <1e-3 und 90 % Homologie) annotiert, und eine Sequenzmaskierung mit geringer Komplexität wurde mit DUST durchgeführt (26).Die Lesevorgänge wurden in zwei Gruppen eingeteilt: im Zusammenhang mit Muschelsequenzen (hier als Selbstlesevorgänge bezeichnet) und nicht im Zusammenhang (Nicht-Selbstlesevorgänge).Zwei Gruppen wurden mithilfe von MEGAHIT separat zusammengestellt, um Contigs zu generieren [27].In der Zwischenzeit wurde die taxonomische Verteilung der Messwerte außerirdischer Mikrobiome mithilfe von Kraken2 [28] klassifiziert und durch ein Krona-Kreisdiagramm auf Galaxy grafisch dargestellt [29, 30].Die optimalen Kilometer wurden aus unseren vorläufigen Experimenten mit km-59 ermittelt. Selbst-Contigs wurden dann durch Abgleich mit BLASTN (Muschel-NCBI-Datenbank, e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) für eine abschließende Anmerkung identifiziert. Selbst-Contigs wurden dann durch Abgleich mit BLASTN (Muschel-NCBI-Datenbank, e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) für eine abschließende Anmerkung identifiziert. Bei diesen neuen Krankheiten handelte es sich um Identifizierungsdaten, die mit der BLASTN-Zulassung (aufgrund dieser neuen niederländischen Mollusken NCBI, mit einer Genauigkeit von <1e-10 und 60 %) ausgestattet sind окончательной аннотации. Selbst-Contigs wurden dann durch Abgleich mit BLASTN (NCBI-Muscheldatenbank, e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) für die endgültige Annotation identifiziert.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Es handelte sich dabei um identifizierte, einheitliche Datensätze für die Erstellung von Annotationen, die mit BLASTN erstellt wurden (basierend auf NCBI für zweitgrößte Mollusken, nur <1 e-10 und Homologie 60 %). Anschließend wurden Selbst-Contigs für die endgültige Annotation durch Abgleich mit BLASTN (NCBI-Muscheldatenbank, e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) identifiziert. Parallel dazu wurden Nicht-Selbstgruppen-Contigs mit BLASTN (nt NCBI-Datenbank, e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) annotiert. Parallel dazu wurden Nicht-Selbstgruppen-Contigs mit BLASTN (nt NCBI-Datenbank, e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie) annotiert. Parallel dazu wurden verschiedene Gruppenkontingente mit BLASTN kommentiert (ab 1999 mit NCBI, Bewertung e <1e-10 und 60 %). Parallel dazu wurden fremde Gruppen-Contigs mit BLASTN (NT NCBI-Datenbank, e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) annotiert.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群.平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群. Parallel dazu sind die Tiere, die nicht von der Gruppe unterschieden werden, mit der BLASTN-Gruppe bekannt geworden (nach Angaben von NCBI mit einer Genauigkeit von <1e-10 und einer Homologie von 60 %). Parallel dazu wurden Nicht-Selbstgruppen-Contigs mit BLASTN (nt NCBI-Datenbank, e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie) annotiert. BLASTX wurde auch an Nicht-Selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-Protein-NCBI-Datenbanken durchgeführt (e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie). BLASTX wurde auch an Nicht-Selbst-Contigs unter Verwendung der nr- und RefSeq-Protein-NCBI-Datenbanken durchgeführt (e-Wert < 1e−10 und 60 % Homologie). BLASTX wurde auch auf mehreren Kontinenten getestet und basiert auf der Grundlage von Weißbuch Nr. und RefSeq NCBI (Bewertung von <1e-10 und 60 %). BLASTX wurde auch an Nicht-Selbst-Contigs unter Verwendung der NCBI-Proteindatenbanken nr und RefSeq durchgeführt (e-Wert < 1e-10 und 60 % Homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% 同源性）。 BLASTX wurde auf mehreren Servern mit einer Kapazität von 100 % und RefSeq NCBI verwendet (Wert <1e-10 und 60 %). BLASTX wurde auch an Nicht-Selbst-Contigs unter Verwendung der NCBI-Proteindatenbanken nr und RefSeq durchgeführt (e-Wert <1e-10 und 60 % Homologie).Die BLASTN- und BLASTX-Pools von Nicht-Selbst-Contigs stellen die endgültigen Contigs dar (siehe Zusatzdatei).
Die für die PCR verwendeten Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt.Taq-DNA-Polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) wurde zur Amplifikation der ccfDNA-Zielgene verwendet.Die folgenden Reaktionsbedingungen wurden verwendet: Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, 95 °C für 1 Minute, eingestellte Annealing-Temperatur für 1 Minute, Elongation bei 72 °C für 1 Minute, 35 Zyklen und schließlich 72 °C innerhalb von 10 Minuten..PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in Agarosegelen (1,5 %) mit SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) bei 95 V aufgetrennt.
Muscheln (Mytilus spp.) wurden in 500 ml sauerstoffhaltigem Meerwasser (32 PSU) 24 Stunden lang bei 4 °C akklimatisiert.Plasmid-DNA, die ein Insert enthält, das für die cDNA-Sequenz von menschlichem Galectin-7 kodiert (NCBI-Zugangsnummer L07769), wurde in einer Endkonzentration von 190 μg/μl in das Fläschchen gegeben.Als Kontrolle dienten Muscheln, die unter den gleichen Bedingungen ohne DNA-Zugabe inkubiert wurden.Der dritte Kontrolltank enthielt DNA ohne Muscheln.Um die Qualität der DNA im Meerwasser zu überwachen, wurden zum angegebenen Zeitpunkt Meerwasserproben (20 μl; drei Wiederholungen) aus jedem Tank entnommen.Zur Rückverfolgbarkeit der Plasmid-DNA wurden LB-Muscheln zu den angegebenen Zeiten geerntet und mittels qPCR und ddPCR analysiert.Aufgrund des hohen Salzgehalts von Meerwasser wurden Aliquots vor allen PCR-Tests in Wasser in PCR-Qualität (1:10) verdünnt.
Die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) wurde unter Verwendung des BioRad QX200-Protokolls (Mississauga, Ontario, Kanada) durchgeführt.Verwenden Sie das Temperaturprofil, um die optimale Temperatur zu bestimmen (Tabelle S1).Die Tropfen wurden mit einem QX200-Tropfengenerator (BioRad) erzeugt.ddPCR wurde wie folgt durchgeführt: 95 °C für 5 Minuten, 50 Zyklen von 95 °C für 30 Sekunden und einer bestimmten Annealing-Temperatur für 1 Minute und 72 °C für 30 Sekunden, 4 °C für 5 Minuten und 90 °C innerhalb von 5 Minuten.Die Anzahl der Tropfen und positiven Reaktionen (Anzahl der Kopien/µl) wurden mit einem QX200-Tropfenlesegerät (BioRad) gemessen.Proben mit weniger als 10.000 Tröpfchen wurden verworfen.Die Musterkontrolle wurde nicht jedes Mal durchgeführt, wenn ddPCR ausgeführt wurde.
qPCR wurde unter Verwendung von Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australien) und LGALS7-spezifischen Primern durchgeführt.Alle quantitativen PCRs wurden in 20 µl mit dem QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN) durchgeführt.qPCR wurde mit einer 15-minütigen Inkubation bei 95 °C gestartet, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 10 Sekunden und bei 60 °C für 60 Sekunden mit einer Datenerfassung.Schmelzkurven wurden durch aufeinanderfolgende Messungen bei 95 °C für 5 s, 65 °C für 60 s und 97 °C am Ende der qPCR erstellt.Mit Ausnahme der Kontrollproben wurde jede qPCR dreifach durchgeführt.
Da Muscheln für ihre hohe Filtrationsrate bekannt sind, haben wir zunächst untersucht, ob sie im Meerwasser vorhandene DNA-Fragmente filtern und zurückhalten können.Uns interessierte auch, ob sich diese Fragmente in ihrem halboffenen Lymphsystem ansammeln.Wir haben dieses Problem experimentell gelöst, indem wir den Verbleib löslicher DNA-Fragmente verfolgt haben, die in Miesmuschelbecken hinzugefügt wurden.Um die Verfolgung von DNA-Fragmenten zu erleichtern, verwendeten wir fremde (nicht eigene) Plasmid-DNA, die das menschliche Galectin-7-Gen enthielt.ddPCR verfolgt Plasmid-DNA-Fragmente in Meerwasser und Muscheln.Unsere Ergebnisse zeigen, dass, wenn die Menge an DNA-Fragmenten im Meerwasser in Abwesenheit von Muscheln über die Zeit (bis zu 7 Tage) relativ konstant blieb, diese Menge in Gegenwart von Muscheln innerhalb von 8 Stunden fast vollständig verschwand (Abb. 1a,b).Fragmente exogener DNA konnten innerhalb von 15 Minuten leicht in intravalvulärer Flüssigkeit und Hämolymphe nachgewiesen werden (Abb. 1c).Diese Fragmente konnten noch bis zu 4 Stunden nach der Exposition nachgewiesen werden.Diese Filteraktivität in Bezug auf DNA-Fragmente ist vergleichbar mit der Filteraktivität von Bakterien und Algen [31].Diese Ergebnisse legen nahe, dass Muscheln fremde DNA filtern und in ihren Flüssigkeitskompartimenten ansammeln können.
Relative Konzentrationen von Plasmid-DNA im Meerwasser in Anwesenheit (A) oder Abwesenheit (B) von Muscheln, gemessen durch ddPCR.In A werden die Ergebnisse als Prozentsätze ausgedrückt, wobei die Ränder der Kästchen das 75. und 25. Perzentil darstellen.Die angepasste logarithmische Kurve wird in Rot angezeigt und der grau schattierte Bereich stellt das 95 %-Konfidenzintervall dar.In B stellt die rote Linie den Mittelwert und die blaue Linie das 95 %-Konfidenzintervall für die Konzentration dar.C Anreicherung von Plasmid-DNA in der Hämolymphe und Klappenflüssigkeit von Muscheln zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von Plasmid-DNA.Die Ergebnisse werden als absolute nachgewiesene Kopien/ml (±SE) dargestellt.
Als nächstes untersuchten wir den Ursprung von ccfDNA in Muscheln, die aus Muschelbänken auf den Kerguelen-Inseln gesammelt wurden, einer abgelegenen Inselgruppe mit begrenztem anthropogenen Einfluss.Zu diesem Zweck wurde cccDNA aus Muschelhämolymphen isoliert und mit Methoden gereinigt, die üblicherweise zur Reinigung menschlicher cccDNA verwendet werden (32, 33).Wir fanden heraus, dass die durchschnittlichen Hämolymph-ccfDNA-Konzentrationen in Muscheln im niedrigen Mikrogramm-pro-ml-Hämolymphbereich liegen (siehe Tabelle S2, Ergänzende Informationen).Dieser Konzentrationsbereich ist viel größer als bei gesunden Menschen (geringe Nanogramm pro Milliliter), aber in seltenen Fällen, bei Krebspatienten, kann der ccfDNA-Spiegel mehrere Mikrogramm pro Milliliter erreichen [34, 35].Eine Analyse der Größenverteilung der Hämolymph-ccfDNA zeigte, dass diese Fragmente stark in der Größe variieren und zwischen 1000 und 1000 bp liegen.bis zu 5000 bp (Abb. 2).Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem auf Siliziumdioxid basierenden QIAamp Investigator Kit erzielt, einer in der Forensik häufig verwendeten Methode zur schnellen Isolierung und Reinigung genomischer DNA aus DNA-Proben mit geringer Konzentration, einschließlich ccfDNA [36].
Repräsentatives ccfDNA-Elektrophoregramm der Muschelhämolymphe.Extrahiert mit dem NucleoSnap Plasma Kit (oben) und dem QIAamp DNA Investigator Kit.B Violindiagramm, das die Verteilung der Hämolymph-ccfDNA-Konzentrationen (± SE) in Muscheln zeigt.Die schwarzen und roten Linien stellen den Median bzw. das erste und dritte Quartil dar.
Ungefähr 1 % der ccfDNA bei Menschen und Primaten stammt aus einer fremden Quelle [21, 37].Angesichts des halboffenen Kreislaufsystems von Muscheln, des mikrobenreichen Meerwassers und der Größenverteilung der ccfDNA von Muscheln stellten wir die Hypothese auf, dass die ccfDNA der Muschelhämolymphe einen reichen und vielfältigen Pool mikrobieller DNA enthalten könnte.Um diese Hypothese zu testen, haben wir Hämolymph-ccfDNA aus Aulacomya atra-Proben sequenziert, die auf den Kerguelen-Inseln gesammelt wurden. Dies ergab über 10 Millionen Lesevorgänge, von denen 97,6 % die Qualitätskontrolle bestanden.Die Messwerte wurden dann mithilfe der BLASTN- und NCBI-Muscheldatenbanken nach eigenen und nicht-eigenen Quellen klassifiziert (Abb. S1, Zusatzinformationen).
Beim Menschen kann sowohl nukleare als auch mitochondriale DNA in den Blutkreislauf freigesetzt werden [38].Allerdings war es in der vorliegenden Studie nicht möglich, die nukleare genomische DNA von Muscheln im Detail zu beschreiben, da das A. atra-Genom weder sequenziert noch beschrieben wurde.Mithilfe der Muschelbibliothek konnten wir jedoch eine Reihe von ccfDNA-Fragmenten unseres eigenen Ursprungs identifizieren (Abb. S2, Zusatzinformationen).Wir haben auch das Vorhandensein von DNA-Fragmenten unseres eigenen Ursprungs durch gezielte PCR-Amplifikation der sequenzierten A. atra-Gene bestätigt (Abb. 3).Da das mitochondriale Genom von A. atra in öffentlichen Datenbanken verfügbar ist, kann man in ähnlicher Weise Hinweise auf das Vorhandensein mitochondrialer ccfDNA-Fragmente in der Hämolymphe von A. atra finden.Das Vorhandensein mitochondrialer DNA-Fragmente wurde durch PCR-Amplifikation bestätigt (Abb. 3).
In der Hämolymphe von A. atra (rote Punkte – Lagernummer: SRX5705969) und M. platensis (blaue Punkte – Lagernummer: SRX5705968) waren verschiedene mitochondriale Gene vorhanden, die durch PCR amplifiziert wurden.Abbildung angepasst von Breton et al., 2011 B Amplifikation des Hämolymphüberstands von A. atra. Auf FTA-Papier gespeichert.Verwenden Sie einen 3-mm-Stanzer, um ihn direkt in das PCR-Röhrchen mit dem PCR-Mix zu geben.
Angesichts des reichlichen Mikrobengehalts im Meerwasser konzentrierten wir uns zunächst auf die Charakterisierung mikrobieller DNA-Sequenzen in der Hämolymphe.Dazu nutzen wir zwei unterschiedliche Strategien.Die erste Strategie nutzte Kraken2, ein algorithmusbasiertes Sequenzklassifizierungsprogramm, das mikrobielle Sequenzen mit einer Genauigkeit identifizieren kann, die mit BLAST und anderen Tools vergleichbar ist [28].Es wurde festgestellt, dass mehr als 6719 Messwerte bakteriellen Ursprungs waren, während 124 bzw. 64 von Archaeen bzw. Viren stammten (Abb. 4).Die am häufigsten vorkommenden bakteriellen DNA-Fragmente waren Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) und Bacteroidetes (17 %) (Abb. 4a).Diese Verteilung steht im Einklang mit früheren Studien zum Mikrobiom der Meeresblaumuschel [39, 40].Gammaproteobakterien waren die Hauptklasse der Proteobakterien (44 %), darunter viele Vibrionales (Abb. 4b).Die ddPCR-Methode bestätigte das Vorhandensein von Vibrio-DNA-Fragmenten in der ccfDNA der A. atra-Hämolymphe (Abb. 4c) [41].Um weitere Informationen über den bakteriellen Ursprung von ccfDNA zu erhalten, wurde ein zusätzlicher Ansatz gewählt (Abb. S2, Ergänzende Informationen). In diesem Fall wurden überlappende Lesevorgänge als Paired-End-Lesevorgänge zusammengestellt und unter Verwendung von BLASTN und einem e-Wert von 1e−3 und einem Cutoff mit >90 % Homologie als selbst (Muscheln) oder nicht selbst stammend klassifiziert. In diesem Fall wurden überlappende Lesevorgänge als Paired-End-Lesevorgänge zusammengestellt und unter Verwendung von BLASTN und einem e-Wert von 1e−3 und einem Cutoff mit >90 % Homologie als selbst (Muscheln) oder nicht selbst stammend klassifiziert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Prüfungen aufgrund der Prüfung von Konsortialverträgen und der Klassifikation nach dem Grundsatz der Zweitbestimmung (Zweitbestimmung) durchgeführt Erfolgsquote bei der Verwendung von BLASTN und 1e-3-Zinsen sowie eine gesundheitsschädliche Abweichung von > 90 %. In diesem Fall wurden überlappende Lesevorgänge als gepaarte Lesevorgänge erfasst und mithilfe von BLASTN und einem e-Wert von 1e-3 sowie einem Cutoff mit >90 % Homologie als nativ (zweischalig) oder nicht original klassifiziert.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下, 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数, 使用 使用 使用 Blastn 和 1e-3 的 的 值 和> 90 %同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 Zu diesem Zeitpunkt waren die Prüfungen aufgrund der Prüfung von Vertrags- und Klassifizierungsverträgen nach dem Grundsatz der Zweitbestimmung (zweijährige Mollusken) oder in anderen Fällen erforderlich Erfolgsaussichten bei der Verwendung von Schall und BLASTN und 1e-3 und mehr als 90 %. In diesem Fall wurden überlappende Lesevorgänge als gepaarte Lesevorgänge erfasst und mithilfe von e BLASTN- und 1e-3-Werten und einem Homologieschwellenwert von > 90 % als eigene (Muscheln) oder nicht originale Lesevorgänge klassifiziert.Da das A. atra-Genom noch nicht sequenziert wurde, verwendeten wir die De-novo-Assemblierungsstrategie des MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS)-Assemblers.Insgesamt wurden 147.188 Contigs als abhängige (Muscheln) Herkunft identifiziert.Diese Contigs wurden dann mithilfe von BLASTN und BLASTX mit E-Werten von 1e-10 explodiert.Mit dieser Strategie konnten wir 482 nicht-zweischalige Fragmente identifizieren, die in der ccfDNA von A. atra vorhanden sind.Mehr als die Hälfte (57 %) dieser DNA-Fragmente stammten von Bakterien, hauptsächlich von Kiemensymbionten, einschließlich sulfotrophen Symbionten, und von Kiemensymbionten Solemya velum (Abb. 5).
Relative Häufigkeit auf Typebene.B Mikrobielle Vielfalt von zwei Hauptstämmen (Firmicutes und Proteobacteria).Repräsentative Amplifikation von ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmente des 16S-rRNA-Gens (blau) in drei Atra-Hämolymphen.
Insgesamt wurden 482 gesammelte Contigs analysiert.Allgemeines Profil der taxonomischen Verteilung metagenomischer Contig-Annotationen (Prokaryoten und Eukaryoten).B Detaillierte Verteilung der durch BLASTN und BLASTX identifizierten bakteriellen DNA-Fragmente.
Die Kraken2-Analyse zeigte auch, dass ccfDNA von Muscheln archaische DNA-Fragmente enthielt, darunter DNA-Fragmente von Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) und Thaurmarcheota (11 %) (Abb. 6a).Das Vorhandensein von DNA-Fragmenten aus Euryarchaeota und Crenarchaeota, die zuvor in der mikrobiellen Gemeinschaft kalifornischer Muscheln gefunden wurden, sollte keine Überraschung sein [42].Obwohl Euryarchaeota oft mit extremen Bedingungen in Verbindung gebracht wird, ist mittlerweile anerkannt, dass sowohl Euryarchaeota als auch Crenarcheota zu den häufigsten Prokaryoten in der marinen kryogenen Umgebung gehören [43, 44].Das Vorhandensein methanogener Mikroorganismen in Muscheln ist nicht überraschend, wenn man bedenkt, dass jüngste Berichte über umfangreiche Methanlecks aus Bodenlecks auf dem Kerguelen-Plateau [45] und eine mögliche mikrobielle Methanproduktion vor der Küste der Kerguelen-Inseln beobachtet wurden [46].
Unsere Aufmerksamkeit richtete sich dann auf die Messwerte von DNA-Viren.Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Off-Target-Studie zum Virusgehalt von Muscheln.Wie erwartet fanden wir DNA-Fragmente von Bakteriophagen (Caudovirales) (Abb. 6b).Die am weitesten verbreitete virale DNA stammt jedoch von einem Stamm von Nukleozytoviren, auch bekannt als das Nuclear Cytoplasmic Large DNA Virus (NCLDV), das das größte Genom aller Viren aufweist.Innerhalb dieses Stammes gehören die meisten DNA-Sequenzen zu den Familien Mimimidoviridae (58 %) und Poxviridae (21 %), zu deren natürlichen Wirten Wirbeltiere und Arthropoden gehören, während ein kleiner Teil dieser DNA-Sequenzen zu bekannten virologischen Algen gehört.Infiziert marine eukaryotische Algen.Die Sequenzen wurden auch vom Pandora-Virus gewonnen, dem Riesenvirus mit der größten Genomgröße aller bekannten Virusgattungen.Interessanterweise war der Bereich der Wirte, von denen bekannt war, dass sie mit dem Virus infiziert waren, wie durch Hämolymph-ccfDNA-Sequenzierung bestimmt, relativ groß (Abbildung S3, ergänzende Informationen).Dazu gehören Viren, die Insekten wie Baculoviridae und Iridoviridae infizieren, sowie Viren, die Amöben, Algen und Wirbeltiere infizieren.Wir haben auch Sequenzen gefunden, die zum Genom des Pithovirus sibericum passen.Pitoviren (auch „Zombieviren“ genannt) wurden erstmals aus 30.000 Jahre altem Permafrost in Sibirien isoliert [47].Daher stimmen unsere Ergebnisse mit früheren Berichten überein, die zeigen, dass nicht alle modernen Arten dieser Viren ausgestorben sind [48] und dass diese Viren möglicherweise in abgelegenen subarktischen Meeresökosystemen vorkommen.
Schließlich testeten wir, ob wir DNA-Fragmente von anderen mehrzelligen Tieren finden konnten.Insgesamt 482 ausländische Contigs wurden von BLASTN und BLASTX mit nt-, nr- und RefSeq-Bibliotheken (Genom und Protein) identifiziert.Unsere Ergebnisse zeigen, dass unter den fremden Fragmenten der ccfDNA mehrzelliger Tiere die DNA von Knochenknochen überwiegt (Abb. 5).Es wurden auch DNA-Fragmente von Insekten und anderen Arten gefunden.Ein relativ großer Teil der DNA-Fragmente wurde nicht identifiziert, möglicherweise aufgrund der Unterrepräsentation einer großen Anzahl mariner Arten in Genomdatenbanken im Vergleich zu terrestrischen Arten [49].
In der vorliegenden Arbeit wenden wir das LB-Konzept auf Muscheln an und argumentieren, dass die Hämolymph-ccfDNA-Schusssequenzierung Einblick in die Zusammensetzung mariner Küstenökosysteme geben kann.Insbesondere fanden wir heraus, dass 1) Muschelhämolymphe relativ hohe Konzentrationen (Mikrogrammwerte) relativ großer (~1–5 kb) zirkulierender DNA-Fragmente enthält;2) Diese DNA-Fragmente sind sowohl unabhängig als auch nicht unabhängig. 3) Unter den fremden Quellen dieser DNA-Fragmente fanden wir bakterielle, archaische und virale DNA sowie DNA anderer mehrzelliger Tiere;4) Die Anreicherung dieser fremden ccfDNA-Fragmente in der Hämolymphe erfolgt schnell und trägt zur internen Filteraktivität von Muscheln bei.Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass das Konzept der LB, das bisher hauptsächlich im Bereich der Biomedizin angewendet wurde, eine reichhaltige, aber unerforschte Wissensquelle birgt, die genutzt werden kann, um die Interaktion zwischen Sentinel-Arten und ihrer Umwelt besser zu verstehen.
Zusätzlich zu Primaten wurde über die Isolierung von ccfDNA bei Säugetieren berichtet, darunter Mäuse, Hunde, Katzen und Pferde [50, 51, 52].Unseres Wissens nach ist unsere Studie jedoch die erste, die über den Nachweis und die Sequenzierung von ccfDNA in Meeresarten mit einem offenen Zirkulationssystem berichtet.Dieses anatomische Merkmal und die Filterfähigkeit von Muscheln könnten zumindest teilweise die unterschiedlichen Größenmerkmale zirkulierender DNA-Fragmente im Vergleich zu anderen Arten erklären.Beim Menschen sind die meisten im Blut zirkulierenden DNA-Fragmente kleine Fragmente mit einer Größe von 150 bis 200 bp.mit einem maximalen Peak von 167 bp [34, 53].Ein kleiner, aber bedeutender Teil der DNA-Fragmente ist zwischen 300 und 500 bp groß, und etwa 5 % sind länger als 900 bp.[54].Der Grund für diese Größenverteilung liegt darin, dass die Hauptquelle für ccfDNA im Plasma das Ergebnis des Zelltods ist, entweder durch Zelltod oder durch Nekrose zirkulierender hämatopoetischer Zellen bei gesunden Personen oder durch Apoptose von Tumorzellen bei Krebspatienten (bekannt als zirkulierende Tumor-DNA)., ctDNA).Die Größenverteilung der Hämolymph-ccfDNA, die wir in Muscheln fanden, lag zwischen 1000 und 5000 bp, was darauf hindeutet, dass die ccfDNA der Muschel einen anderen Ursprung hat.Dies ist eine logische Hypothese, da Muscheln ein halboffenes Gefäßsystem haben und in marinen Gewässern leben, die hohe Konzentrationen an mikrobieller genomischer DNA enthalten.Tatsächlich haben unsere Laborexperimente mit exogener DNA gezeigt, dass Muscheln DNA-Fragmente im Meerwasser ansammeln, diese nach zellulärer Aufnahme zumindest nach einigen Stunden abgebaut und/oder freigesetzt und/oder in verschiedenen Organisationen gelagert werden.Angesichts der Seltenheit von Zellen (sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen) wird die Verwendung intravalvulärer Kompartimente die Menge an ccfDNA sowohl aus eigenen als auch aus fremden Quellen reduzieren.In Anbetracht der Bedeutung der angeborenen Immunität von Muscheln und der großen Anzahl zirkulierender Phagozyten stellten wir außerdem die Hypothese auf, dass sogar fremde ccfDNA in zirkulierenden Phagozyten angereichert ist, die bei Aufnahme von Mikroorganismen und/oder Zelltrümmern fremde DNA ansammeln.Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die ccfDNA der zweischaligen Hämolymphe ein einzigartiger Speicher für molekulare Informationen ist und ihren Status als Wächterart stärkt.
Unsere Daten zeigen, dass die Sequenzierung und Analyse von aus Bakterien stammenden ccfDNA-Fragmenten der Hämolymphe wichtige Informationen über die Bakterienflora des Wirts und die im umgebenden Meeresökosystem vorhandenen Bakterien liefern kann.Schusssequenzierungstechniken haben Sequenzen des kommensalen Bakteriums A. atra gill aufgedeckt, die bei Verwendung herkömmlicher 16S-rRNA-Identifizierungsmethoden übersehen worden wären, was teilweise auf eine Verzerrung der Referenzbibliothek zurückzuführen ist.Tatsächlich zeigte unsere Verwendung von LB-Daten, die von M. platensis in derselben Muschelschicht in Kerguelen gesammelt wurden, dass die Zusammensetzung der Kiemen-assoziierten Bakteriensymbionten für beide Muschelarten gleich war (Abb. S4, Zusatzinformationen).Diese Ähnlichkeit zweier genetisch unterschiedlicher Muscheln spiegelt möglicherweise die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaften in den kalten, schwefelhaltigen und vulkanischen Ablagerungen von Kerguelen wider [55, 56, 57, 58].Bei der Muschelernte in bioturbierten Küstengebieten [59], beispielsweise an der Küste von Port-au-France, wurde ein höherer Gehalt an schwefelreduzierenden Mikroorganismen gut beschrieben.Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die kommensale Muschelflora durch horizontale Übertragung beeinträchtigt wird [60, 61].Weitere Forschung ist erforderlich, um den Zusammenhang zwischen der Meeresumwelt, der Meeresbodenoberfläche und der Zusammensetzung symbiotischer Bakterien in Muscheln zu bestimmen.Diese Studien laufen derzeit.
Die Länge und Konzentration der Hämolymph-ccfDNA, ihre einfache Reinigung und die hohe Qualität, die eine schnelle Shotgun-Sequenzierung ermöglicht, sind einige der vielen Vorteile der Verwendung von Muschel-ccfDNA zur Bewertung der Biodiversität in marinen Küstenökosystemen.Dieser Ansatz ist besonders effektiv zur Charakterisierung viraler Gemeinschaften (Virome) in einem bestimmten Ökosystem [62, 63].Im Gegensatz zu Bakterien, Archaeen und Eukaryoten enthalten virale Genome keine phylogenetisch konservierten Gene wie 16S-Sequenzen.Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Flüssigbiopsien von Indikatorarten wie Muscheln verwendet werden können, um eine relativ große Anzahl von ccfDNA-Virusfragmenten zu identifizieren, von denen bekannt ist, dass sie Wirte infizieren, die typischerweise in Meeresökosystemen an der Küste leben.Dazu gehören Viren, von denen bekannt ist, dass sie Protozoen, Arthropoden, Insekten, Pflanzen und bakterielle Viren (z. B. Bakteriophagen) infizieren.Eine ähnliche Verteilung wurde gefunden, als wir das Hämolymph-ccfDNA-Virom von Miesmuscheln (M. platensis) untersuchten, das in derselben Muschelschicht in Kerguelen gesammelt wurde (Tabelle S2, ergänzende Informationen).Die Shotgun-Sequenzierung von ccfDNA ist in der Tat ein neuer Ansatz, der bei der Untersuchung des Viroms von Menschen oder anderen Arten an Bedeutung gewinnt [21, 37, 64].Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Untersuchung doppelsträngiger DNA-Viren, da unter allen doppelsträngigen DNA-Viren kein einzelnes Gen konserviert ist, was die vielfältigste und breiteste Virenklasse in Baltimore darstellt [65].Obwohl die meisten dieser Viren nicht klassifiziert sind und möglicherweise Viren aus einem völlig unbekannten Teil der Virenwelt umfassen [66], haben wir festgestellt, dass die Virome und Wirtsbereiche der Muscheln A. atra und M. platensis zwischen den beiden Arten liegen.ähnlich (siehe Abbildung S3, zusätzliche Informationen).Diese Ähnlichkeit ist nicht überraschend, da sie möglicherweise auf eine mangelnde Selektivität bei der Aufnahme der in der Umwelt vorhandenen DNA zurückzuführen ist.Zukünftige Studien mit gereinigter RNA sind derzeit erforderlich, um das RNA-Virom zu charakterisieren.
In unserer Studie verwendeten wir eine sehr strenge Pipeline, die an die Arbeit von Kowarski und Kollegen angelehnt war [37], die eine zweistufige Löschung gepoolter Reads und Contigs vor und nach dem Zusammenbau nativer ccfDNA verwendete, was zu einem hohen Anteil nicht kartierter Reads führte.Daher können wir nicht ausschließen, dass einige dieser nicht kartierten Lesevorgänge dennoch ihren eigenen Ursprung haben, vor allem weil wir kein Referenzgenom für diese Muschelart haben.Wir haben diese Pipeline auch verwendet, weil wir uns Sorgen über die Chimären zwischen Eigen- und Fremd-Lesevorgängen und die vom Illumina MiSeq PE75 generierten Leselängen machten.Ein weiterer Grund für die meisten unerforschten Messwerte ist, dass viele der Meeresmikroben, insbesondere in abgelegenen Gebieten wie Kerguelen, nicht kommentiert wurden.Wir verwendeten Illumina MiSeq PE75 und gingen davon aus, dass die Länge der ccfDNA-Fragmente der menschlichen ccfDNA ähnelt.Für zukünftige Studien empfehlen wir angesichts unserer Ergebnisse, die zeigen, dass Hämolymph-ccfDNA längere Lesevorgänge aufweist als Menschen und/oder Säugetiere, die Verwendung einer Sequenzierungsplattform, die besser für längere ccfDNA-Fragmente geeignet ist.Durch diese Vorgehensweise wird es viel einfacher, mehr Hinweise für eine tiefergehende Analyse zu identifizieren.Der Erhalt der derzeit nicht verfügbaren vollständigen Kerngenomsequenz von A. atra würde auch die Unterscheidung von ccfDNA aus eigenen und fremden Quellen erheblich erleichtern.Da sich unsere Forschung auf die Möglichkeit konzentriert hat, das Konzept der Flüssigbiopsie auf Muscheln anzuwenden, hoffen wir, dass bei der Verwendung dieses Konzepts in zukünftigen Forschungen neue Werkzeuge und Pipelines entwickelt werden, um das Potenzial dieser Methode zur Untersuchung der mikrobiellen Vielfalt von Muscheln zu erhöhen.Meeresökosystem.
Als nicht-invasiver klinischer Biomarker sind erhöhte ccfDNA-Spiegel im menschlichen Plasma mit verschiedenen Krankheiten, Gewebeschäden und Stresszuständen verbunden [67,68,69].Dieser Anstieg ist mit der Freisetzung von DNA-Fragmenten eigenen Ursprungs nach einer Gewebeschädigung verbunden.Diesem Problem begegneten wir mittels akutem Hitzestress, bei dem Muscheln kurzzeitig einer Temperatur von 30 °C ausgesetzt wurden.Wir haben diese Analyse in drei unabhängigen Experimenten an drei verschiedenen Muschelarten durchgeführt.Allerdings konnten wir nach akutem Hitzestress keine Veränderung der ccfDNA-Spiegel feststellen (siehe Abbildung S5, zusätzliche Informationen).Diese Entdeckung könnte zumindest teilweise die Tatsache erklären, dass Muscheln über ein halboffenes Kreislaufsystem verfügen und aufgrund ihrer hohen Filteraktivität große Mengen fremder DNA ansammeln.Andererseits sind Muscheln, wie viele Wirbellose, möglicherweise resistenter gegen stressbedingte Gewebeschäden, wodurch die Freisetzung von ccfDNA in ihrer Hämolymphe begrenzt wird (70, 71).
Bisher konzentrierte sich die DNA-Analyse der Biodiversität in aquatischen Ökosystemen hauptsächlich auf die Metabarcodierung von Umwelt-DNA (eDNA).Allerdings ist diese Methode in der Biodiversitätsanalyse meist eingeschränkt, wenn Primer verwendet werden.Die Verwendung der Shotgun-Sequenzierung umgeht die Einschränkungen der PCR und die voreingenommene Auswahl von Primersätzen.Somit kommt unsere Methode in gewisser Weise der kürzlich verwendeten Hochdurchsatz-eDNA-Shotgun-Sequenzierungsmethode näher, die in der Lage ist, fragmentierte DNA direkt zu sequenzieren und fast alle Organismen zu analysieren [72, 73].Es gibt jedoch eine Reihe grundlegender Probleme, die LB von Standard-eDNA-Methoden unterscheiden.Der Hauptunterschied zwischen eDNA und LB besteht natürlich in der Verwendung natürlicher Filterwirte.Über die Verwendung von Meeresspezies wie Schwämmen und Muscheln (Dresseina spp.) als natürlicher Filter für die Untersuchung von eDNA wurde berichtet [74, 75].In der Studie von Dreissena wurden jedoch Gewebebiopsien verwendet, aus denen DNA extrahiert wurde.Die Analyse von ccfDNA aus LB erfordert keine Gewebebiopsie, keine spezielle und manchmal teure Ausrüstung und Logistik im Zusammenhang mit eDNA oder Gewebebiopsie.Tatsächlich haben wir kürzlich berichtet, dass ccfDNA aus LB mit FTA-Unterstützung ohne Aufrechterhaltung einer Kühlkette gelagert und analysiert werden kann, was eine große Herausforderung für die Forschung in abgelegenen Gebieten darstellt [76].Die Extraktion von ccfDNA aus Flüssigbiopsien ist ebenfalls einfach und liefert hochwertige DNA für die Shotgun-Sequenzierung und PCR-Analyse.Dies ist angesichts einiger technischer Einschränkungen, die mit der eDNA-Analyse verbunden sind, ein großer Vorteil [77].Die Einfachheit und die geringen Kosten der Probenahmemethode eignen sich auch besonders für Langzeitüberwachungsprogramme.Ein weiteres bekanntes Merkmal von Muscheln ist neben ihrer hohen Filterfähigkeit die chemische Mucopolysaccharid-Zusammensetzung ihres Schleims, die die Aufnahme von Viren fördert [78, 79].Dies macht Muscheln zu einem idealen natürlichen Filter zur Charakterisierung der Artenvielfalt und der Auswirkungen des Klimawandels in einem bestimmten aquatischen Ökosystem.Obwohl das Vorhandensein von vom Wirt stammenden DNA-Fragmenten als Einschränkung der Methode im Vergleich zu eDNA angesehen werden kann, sind die Kosten, die mit der Verwendung einer solchen nativen ccfDNA im Vergleich zu eDNA verbunden sind, angesichts der großen Menge an Informationen, die für Gesundheitsstudien verfügbar sind, gleichzeitig verständlich.Offset-Host.Dazu gehört das Vorhandensein viraler Sequenzen, die in das Genom des Wirtswirts integriert sind.Dies ist besonders wichtig für Muscheln, da in Muscheln horizontal übertragene leukämische Retroviren vorhanden sind (80, 81).Ein weiterer Vorteil von LB gegenüber eDNA besteht darin, dass es die phagozytische Aktivität zirkulierender Blutzellen in der Hämolymphe nutzt, die Mikroorganismen (und ihre Genome) verschlingt.Die Phagozytose ist die Hauptfunktion der Blutzellen in Muscheln [82].Schließlich nutzt die Methode die hohe Filterkapazität von Muscheln (durchschnittlich 1,5 l/h Meerwasser) und die zweitägige Zirkulation, die die Durchmischung verschiedener Meerwasserschichten erhöht und die Erfassung heterologer eDNA ermöglicht.[83, 84].Daher ist die ccfDNA-Analyse von Muscheln angesichts der ernährungsphysiologischen, wirtschaftlichen und ökologischen Auswirkungen von Muscheln ein interessanter Weg.Ähnlich wie die Analyse von LB beim Menschen eröffnet diese Methode auch die Möglichkeit, genetische und epigenetische Veränderungen in der Wirts-DNA als Reaktion auf exogene Substanzen zu messen.Beispielsweise können Sequenzierungstechnologien der dritten Generation in Betracht gezogen werden, um eine genomweite Methylierungsanalyse in nativer ccfDNA mithilfe von Nanoporensequenzierung durchzuführen.Dieser Prozess sollte durch die Tatsache erleichtert werden, dass die Länge der Muschel-ccfDNA-Fragmente ideal mit Long-Read-Sequenzierungsplattformen kompatibel ist, die eine genomweite DNA-Methylierungsanalyse aus einem einzigen Sequenzierungslauf ermöglichen, ohne dass chemische Transformationen erforderlich sind.85,86] Dies ist eine interessante Möglichkeit, da gezeigt wurde, dass DNA-Methylierungsmuster eine Reaktion auf Umweltstress widerspiegeln und über viele Generationen hinweg bestehen bleiben.Daher kann es wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen liefern, die die Reaktion nach Exposition gegenüber Klimawandel oder Schadstoffen steuern [87].Der Einsatz von LB ist jedoch nicht ohne Einschränkungen möglich.Dies erfordert natürlich das Vorhandensein von Indikatorarten im Ökosystem.Wie oben erwähnt, erfordert die Verwendung von LB zur Bewertung der Biodiversität eines bestimmten Ökosystems auch eine strenge Bioinformatik-Pipeline, die das Vorhandensein von DNA-Fragmenten aus der Quelle berücksichtigt.Ein weiteres großes Problem ist die Verfügbarkeit von Referenzgenomen für Meeresarten.Es besteht die Hoffnung, dass Initiativen wie das Marine Mammal Genomes Project und das kürzlich eingerichtete Fish10k-Projekt [88] eine solche Analyse in Zukunft erleichtern werden.Die Anwendung des LB-Konzepts auf marine Filterorganismen ist auch mit den neuesten Fortschritten in der Sequenzierungstechnologie kompatibel und eignet sich daher gut für die Entwicklung von Multi-Ohm-Biomarkern, um wichtige Informationen über die Gesundheit mariner Lebensräume als Reaktion auf Umweltstress zu liefern.
Genomsequenzierungsdaten wurden im NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 unter Bioprojects SRR8924808 hinterlegt.
Brierley AS, Kingsford MJ Auswirkungen des Klimawandels auf Meereslebewesen und Ökosysteme.Cole Biologie.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Berücksichtigen Sie die kombinierten Auswirkungen des Klimawandels und anderer lokaler Stressfaktoren auf die Meeresumwelt.allgemeines wissenschaftliches Umfeld.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Wissenschaft vom ersten März.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Reduzierte Hitzetoleranz unter wiederholten Hitzestressbedingungen erklärt die hohe Sommersterblichkeit von Miesmuscheln.Wissenschaftlicher Bericht 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Jüngste Veränderungen in der Häufigkeit, den Ursachen und dem Ausmaß des Tiersterbens.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Mehrere nicht artspezifische Krankheitserreger könnten zum Massensterben von Pinna nobilis geführt haben.Leben.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Mögliche Auswirkungen des Klimawandels auf zoonotische Krankheiten in der Arktis.Int J Zirkumpolare Gesundheit.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Miesmuscheln (Mytilus edulis spp.) als Signalorganismen bei der Überwachung der Küstenverschmutzung: eine Übersicht.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integration der Flüssigbiopsie in die Krebsbehandlung.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Flüssigbiopsie-Reifung: Ermöglicht die Zirkulation der Tumor-DNA.Nat Rev Krebs.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinsäuren im menschlichen Plasma.Sitzungsprotokolle der Tochtergesellschaften von Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Eine neue Rolle für zellfreie DNA als molekularer Marker für die Krebsbehandlung.Quantifizierung der biomolaren Analyse.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Flüssigbiopsie kommt in die Klinik – Umsetzungsprobleme und zukünftige Herausforderungen.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW und andere.Fötale DNA ist im mütterlichen Plasma und Serum vorhanden.Lanzette.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Untersuchung des Schwangerschaftsverlaufs und seiner Komplikationen mithilfe zirkulierender extrazellulärer RNA im Blut von Frauen während der Schwangerschaft.Dopädiatrie.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Flüssigbiopsie: Zellfreie Spender-DNA wird zum Nachweis allogener Läsionen in einem Nierentransplantat verwendet.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovationen in der Pränataldiagnostik: Sequenzierung des mütterlichen Plasmagenoms.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Schneller Erregernachweis mit metagenomischer Sequenzierung infizierter Körperflüssigkeiten der nächsten Generation.Nat-Medizin.2021;27:115-24.