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Mitwirkende Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Abteilung für klinische und experimentelle Medizin, Universität von Catania, Catania, 95123, Italien; 2 Zentrum für experimentelle Onkologie und Hämatologie, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco“, Catania, 95123, Italien;3 Medizinische Onkologie, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco“, Catania, 95123, Italien;4 Medizinische Genetik, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italien;5 Medicine Genetics, ASP, Syrakus, 96100, Italien;6 Abteilung für Biomedizinische und Biotechnologische Wissenschaften, Universität Catania, Medizinische Genetik, Catania, Italien, 95123;7Oasi Research Institute-IRCCS, Troina, 94018, Italien Kommunikation: Stefania Stella, Tel. +39 095 378 1946, E-Mail [email protected];[email protected] Zweck: Keimbahnmutationen in BRCA1 und BRCA2 sowie etablierter Brustkrebs (BC), Eierstockkrebs (OC) und andere, die mit einem lebenslangen Krebsrisiko verbunden sind. Tests auf das BRCA-Gen sind von entscheidender Bedeutung für die Beurteilung des individuellen Risikos sowie für die Suche nach Präventionsmethoden bei gesunden Trägern und der Anpassung von Behandlungen bei Krebspatienten. Die Prävalenz von BRCA1- und BRCA2-Veränderungen variiert stark zwischen den geografischen Regionen, und obwohl Daten zu BRCA-pathogenen Varianten in sizilianischen Familien vorliegen, zielen Studien speziell auf die Bevölkerung ab s in Ostsizilien fehlen. Ziel unserer Studie war es, die Inzidenz und Verteilung von BRCA-pathogenen Keimbahnveränderungen in einer Kohorte von BC-Patienten aus Ostsizilien zu untersuchen und ihre Assoziation mit spezifischen BC-Merkmalen mittels Sequenzierung der nächsten Generation zu bewerten CA1-Veränderungen sind bei dreifach negativen BC-Patienten weit verbreitet, wohingegen BRCA2-Mutationen bei luminalen BC-Patienten häufiger vorkommen. Im Vergleich zu Nicht-Trägern hatten Probanden mit BRCA1-Varianten einen signifikant höheren Tumorgrad und Proliferationsindex. Schlussfolgerungen: Unsere Ergebnisse bieten einen Überblick über den BRCA-Mutationsstatus bei BC-Patienten aus Ostsizilien und bestätigen die Rolle der NGS-Analyse bei der Identifizierung von Patienten mit erblichem BC. Insgesamt stimmen diese Daten mit früheren Beweisen überein, die ein BRCA-Screening zur ordnungsgemäßen Prävention und Behandlung von Krebs unterstützen bei Mutationsträgern.
Brustkrebs (BC) ist die häufigste bösartige Erkrankung weltweit und die tödlichste Krebserkrankung bei Frauen.1 Die biologischen Merkmale, die die Prognose und das klinische Verhalten von BC bestimmen, wurden im Laufe der Zeit ausführlich untersucht und teilweise aufgeklärt. Tatsächlich werden derzeit mehrere Ersatzmarker verwendet, um BC in verschiedene molekulare Subtypen zu klassifizieren. Dabei handelt es sich um Östrogen- (ER) und/oder Progesteronrezeptor (PgR), Amplifikation des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2), Proliferationsindex Ki-67 und Tumor Grad (G).2 Die Kombination dieser Variablen identifizierte die folgenden BC-Kategorien: 1) Luminaltumoren, die ER- und/oder PgR-Expression zeigten, machten 75 % der BCs aus. Diese Tumoren wurden weiter unterteilt in Luminal A, wenn Ki-67 unter 20 % und HER2-negativ war, und Luminal B, wenn Ki-67 gleich oder über 20 % war und eine HER2-Amplifikation vorlag, unabhängig vom Proliferationsindex;2) HER2+-Tumoren, die ER- und PgR-negativ sind, aber eine HER2-Amplifikation zeigen. Diese Gruppe macht 10 % aller Brusttumoren aus;3) Dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), der keine ER- und PgR-Expression und keine HER2-Amplifikation zeigt, macht etwa 15 % der Brustkrebserkrankungen aus.2-4
Unter diesen BC-Subtypen stellen der Tumorgrad und der Proliferationsindex Querschnittsbiomarker dar, die direkt und unabhängig mit der Tumoraggressivität und -prognose verbunden sind.5,6
Zusätzlich zu den oben genannten biologischen Merkmalen hat die Rolle vererbter genetischer Veränderungen, die zur Entwicklung von BC führen, in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen.7 Etwa jeder zehnte Brusttumor wird aufgrund von Keimbahnveränderungen in bestimmten Genen vererbt.8 Zwei große epidemiologische Studien mit mehr als 180.000 Frauen haben kürzlich eine Gruppe von acht Genen identifiziert (d. h. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C, und RAD51D), die hauptsächlich für erbliches BC verantwortlich sind. Unter diesen Genen zeigten BRCA1 und BRCA2 (im Folgenden als BRCA1/2 bezeichnet) die stärkste Korrelation mit der Entwicklung von Brusttumoren.9-12 Tatsächlich erhöhen BRCA1/2-Keimbahnmutationen das lebenslange Risiko für BC sowie andere bösartige Erkrankungen, einschließlich Eierstock-, Prostata-, Bauchspeicheldrüsen-, Darm- und Melanomerkrankungen. Im Alter von 13 bis 80 Jahren ist das kumulativ Die Inzidenz von BC beträgt 72 % bei Frauen mit einer BRCA1-pathogenen Variante (PV) und 69 % bei Frauen mit einer BRCA2-PV.14
Insbesondere legt eine aktuelle Veröffentlichung nahe, dass das BC-Risiko von der Art der PV abhängt. Tatsächlich sind auffällige Missense-Varianten, insbesondere im BRCA1-Gen, im Vergleich zu pathogenen Trunkierungsvarianten mit einem verringerten BC-Risiko verbunden, insbesondere bei älteren Frauen.15
Das Vorhandensein von BRCA1- oder BRCA2-PV war mit unterschiedlichen biologischen und klinisch-pathologischen Merkmalen verbunden.16,17 BRCA1-assoziierte BCs sind in der Regel klinisch aggressiv, schlecht differenziert und stark proliferativ treten normalerweise bei älteren Erwachsenen auf.16-18 Insbesondere erhöhen Mutationen in BRCA1 und BRCA2 die Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Behandlungen, einschließlich Platinsalzen und gezielten Arzneimitteln wie Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren (PARPi).19,20
In den letzten Jahren hat die Implementierung von Next-Generation-Sequencing (NGS) in der klinischen Praxis es immer mehr BC-Patienten ermöglicht, sich molekularen Tests auf Krebsanfälligkeitssyndrome, einschließlich BRCA1/2, zu unterziehen.21 Gleichzeitig wurden Definitionen auf der Grundlage präziser Kriterien in Bezug auf Familiengeschichte, demografische und klinisch-pathologische Merkmale erstellt, um Personen besser zu identifizieren, die für BRCA1/2-Tests würdig sind.22,23 In diesem Zusammenhang häufen sich Belege für das BRCA1/2-Screening in bestimmten Populationen, die Unterschiede zwischen verschiedenen Bevölkerungsgruppen hervorheben geografische Regionen.24–27 Obwohl es Berichte über die BC-Kohorte in Westsizilien gibt, sind weniger Daten zum BRCA1/2-Screening in der Bevölkerung im Osten Siziliens verfügbar.28,29
Wir beschreiben hier die Ergebnisse des Keimbahn-BRCA1/2-Screenings bei BC-Patienten aus Ostsizilien und korrelieren das Vorhandensein von BRCA1- oder BRCA2-Mutationen weiter mit den wichtigsten klinisch-pathologischen Merkmalen dieser Tumoren.
Eine retrospektive Studie wurde im „Zentrum für experimentelle Onkologie und Hämatologie“ im Policlinico Hospital durchgeführt. Helsinki und alle Teilnehmer gaben vor der molekularen Analyse eine schriftliche Einverständniserklärung ab.
Histologische und biologische Merkmale (ER, PgR, HER2-Status, Ki-67 und Grad) von BC wurden anhand von Kernbiopsien oder chirurgischen Proben beurteilt, wobei nur aggressive Tumorkomponenten berücksichtigt wurden. Basierend auf diesen Merkmalen wurden BCs wie folgt klassifiziert: Luminal A (ER+ und/oder PgR+, HER2-, Ki-67<20 %), Luminal B (ER+ und/oder PgR+, HER2-, Ki-67≥20 %), Luminal B-HER 2+ (ER und/oder PgR+, HER2+), HER2+ (ER und PgR-, HER2+) oder dreifach negativ (ER und PgR-, HER2-).
Vor der Beurteilung des BRCA1- und BRCA2-Mutationsstatus führte ein multidisziplinäres Team, bestehend aus einem Onkologen, einem Genetiker und einem Psychologen, bei jedem Patienten eine tumorgenetische Beratung durch, um das Vorhandensein von BRCA1 und/oder BRCA1 festzustellen.oder Personen mit einem hohen PV-Risiko im BRCA2-Gen. Die Patientenauswahl erfolgte gemäß den Richtlinien der Italienischen Gesellschaft für Medizinische Onkologie (AIOM) und lokalen sizilianischen Empfehlungen.30,31 Zu diesen Kriterien gehören: (i) Familiengeschichte bekannter pathogener Varianten in Anfälligkeitsgenen (z. B. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN);(ii) Männer mit BC;(iii) diejenigen mit BC und OC;(iv) Frauen mit BC <36 Jahren, TNBC <60 Jahren oder bilateralem BC <50 Jahren;(v) persönliche Krankengeschichte von BC < 50 Jahren und mindestens einem Verwandten ersten Grades: (a) BC < 50 Jahre;(b) nicht schleimiges und nicht grenzwertiges OC jeden Alters;(c) bilaterales BC;(d) männlicher BC;(e) Bauchspeicheldrüsenkrebs;(f) Prostatakrebs;(vi) zwei oder mehr persönliche Vorgeschichte von BC > 50 Jahren und familiäre Vorgeschichte von BC, OC oder Bauchspeicheldrüsenkrebs bei Verwandten, die miteinander verwandt sind ersten Grades (einschließlich Verwandter, mit denen sie verwandt ersten Grades ist);(vii) Persönliche Vorgeschichte von OC und mindestens einem Verwandten ersten Grades: (a) BC <50 Jahre;(b) NOC;(c) bilaterales BC;(d) männlicher BC;(vii) weiblich mit hochgradigem serösem OC.
Von jedem Patienten wurde eine periphere Blutprobe von 20 ml entnommen und in EDTA-Röhrchen (BD Biosciences) gesammelt. Genomische DNA wurde aus 0,7 ml Vollblutproben mit dem QIAsymphony DSP DNA Midi Kit Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Italien) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und durch ein Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) geleitet. Quantifizierung durchführen.Die Zielanreicherung und die Bibliotheksvorbereitung werden vom Oncomine™ BRCA Research Assay Chef durchgeführt, der zum Laden in das Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit zur automatisierten Bibliotheksvorbereitung gemäß den Anweisungen des Herstellers bereit ist. Das Kit besteht aus zwei Multiplex-PCR-Primerpools, die zur Untersuchung aller BRCA1- (NM_007300.3) und BRCA2-Gene (NM_000059.3) verwendet werden können. Kurz gesagt, 15 µL von jedem verdünnt Proben-DNA (10 ng) wurde zur Bibliotheksvorbereitung auf Barcode-Platten gegeben und alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien wurden auf das Ion Chef™-Instrument geladen. Anschließend wurden auf dem Ion Chef™-Instrument eine automatisierte Bibliotheksvorbereitung und ein Barcode-Probenbibliotheks-Pooling durchgeführt. Die Anzahl der vorbereiteten Bibliotheken wurde dann mit einem Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Schließlich werden die Bibliotheken in äquimolaren Verhältnissen in Ion Chef™-Bibliotheksprobenröhrchen (Barcode) kombiniert Röhrchen) und auf das Ion Chef™-Instrument geladen. Die Sequenzierung wurde mit einem Ion Torrent S5-Instrument (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung eines Ion 510-Chips (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit Amplicon Suite (SmartSeq srl) und der Ion Reporter-Software durchgeführt.
Die gesamte Variantennomenklatur folgte den aktuellen Richtlinien des Human Genome Variation Consortium, die online verfügbar sind (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Die klinische Bedeutung von BRCA1/2-Varianten wurde anhand der Klassifizierung des Internationalen Konsortiums ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) und der Konsultation verschiedener Datenbanken wie ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOV definiert D und UMD. Die Klassifizierung umfasst fünf verschiedene Risikokategorien: gutartig (Kategorie I), wahrscheinlich gutartig (Kategorie II), Variante mit unsicherer Bedeutung (VUS, Kategorie III), wahrscheinlich pathogen (Kategorie IV) und pathogen (Kategorie V). VarSome analysierte auch die Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinstruktur und -funktion, ein informatives Tool mit Zugriff auf 30 Datenbanken.32
Um jedem VUS eine potenzielle klinische Bedeutung zuzuordnen, wurden die folgenden Algorithmen zur rechnerischen Proteinvorhersage verwendet: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) und Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varianten klassifiziert als Klasse 1 und 2 galten als Wildtyp.
Die Sanger-Sequenzierung bestätigte das Vorhandensein jeder pathogenen Variante. Kurz gesagt wurde für jede erkannte Variante ein Paar spezifischer Primer unter Verwendung der BRCA1- und BRCA2-Genreferenzsequenzen (NG_005905.2, NM_007294.3 bzw. NG_012772.3, NM_000059.3) entworfen. Daher wurde eine gezielte PCR durchgeführt, gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung.
Patienten, die negativ auf das BRCA1/2-Gen getestet wurden, wurden durch Multiplex-Ligation-abhängige Sondenamplifikation (MLPA) gemäß den Anweisungen des Herstellers getestet, um das Vorhandensein großer genomischer Umlagerungen (LGR) zu beurteilen. DNA-Proben werden kurzzeitig denaturiert und es werden bis zu 60 BRCA1- und BRCA2-Gen-spezifische Sonden verwendet, die jeweils eine spezifische DNA-Sequenz mit einer Länge von etwa 60 Nukleotiden nachweisen. Sondenamplifikationsprodukte, bestehend aus einem einzigartigen Satz von PCR-Amplifikaten, wurden verwendet anschließend analysiert durch Kapillarelektrophorese und durch die Cofalyser.Net-Software in Verbindung mit den entsprechenden chargenspezifischen Cofalyser-Tabellen (www.mrcholland.com).
Ausgewählte klinisch-pathologische Variablen (histologischer Grad und Ki-67 %-Proliferationsindex) waren mit dem Vorhandensein von BRCA1/2 PV verbunden, berechnet mit der Prism-Software Version 8.4 unter Verwendung des exakten Fisher-Tests unter der Annahme, dass ein p-Wert <0,05 signifikant ist.
Zwischen Januar 2017 und März 2021 wurden 455 Patienten auf Keimbahn-BRCA1/2-Mutationen untersucht. Mutationstests wurden im Zentrum für experimentelle Onkologie und Hämatologie des Policlinico-Krankenhauses durchgeführt ), das Rodolico von Catania – San Marco“, insgesamt 389 Patienten. Es gab Brustkrebs, 37 Eierstockkrebs, 16 Bauchspeicheldrüsenkrebs, 8 Prostatakrebs und 5 Melanome.Die Verteilung der Patienten nach Krebsart und Analyseergebnissen ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm mit einem Überblick über die Studie. Patienten mit Brust-, Melanom-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata- oder Eierstocktumoren wurden auf Mutationen in den BRCA1- und BRCA2-Genen getestet.
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante;VUS, Variante mit ungewisser Bedeutung;WT, Wildtyp-BRCA1/2-Sequenz.
Wir haben unsere Studien gezielt auf Brustkrebskohorten konzentriert. Die Patientinnen hatten ein Durchschnittsalter von 49 Jahren (Bereich 23–89) und waren überwiegend weiblich (n = 376 oder 97 %).
Von diesen Probanden hatten 64 (17 %) BRCA1/2-Mutationen und waren alle weiblich. 35 (9 %) hatten PV und 29 (7,5 %) hatten VUS. Siebzehn (48,6 %) der 35 pathogenen Varianten traten in BRCA1 und 18 (51,4 %) in BRCA2 auf, während 5 VUS in BRCA1 (17,2 %) und 24 (82,8 %) in BRCA2 auftraten (Abbildungen 1 und 2). 2).LGR war in der MLPA-Analyse nicht vorhanden.
Abbildung 2. Analyse von BRCA1- und BRCA2-Mutationen bei 389 Brustkrebspatientinnen. (A) Verteilung pathogener Varianten (PV) (rot), Varianten unsicherer Signifikanz (VUS) (orange) und WT (blau) bei 389 Brustkrebspatientinnen;(B) 389 Brustkrebspatientinnen. Fünfunddreißig (9 %) hatten BRCA1/2-pathogene Varianten (PVs). Davon waren 17 (48,6 %) BRCA1-PV-Träger (dunkelrot) und 18 (51,4 %) BRCA2-Träger (hellrot);(C) 29 (7,5 %) der 389 Probanden trugen VUS, 5 (17,2 %) BRCA1-Gene (dunkelorange) und 24 (82,8 %) BRCA2-Gene (hellorange).
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante;VUS, Variante mit ungewisser Bedeutung;WT, Wildtyp-BRCA1/2-Sequenz.
Als nächstes untersuchten wir die Prävalenz molekularer BC-Subtypen bei Patienten mit BRCA1/2-PV. Die Verteilung umfasste 2 (5,7 %) Luminal-A-, 15 (42,9 %) Luminal-B-, 3 (8,6 %) luminal-B-HER2+-, 2 (5,7 %) HER2+- und 13 (37,1 %) TNBC-Patienten. Von den BRCA1-positiven Patienten hatten 5 (29,4 %) Luminal-B-BC, 2 ( 11,8 % hatten eine HER2+-Erkrankung und 10 (58,8 %) hatten TNBC. Tumoren ohne BRCA1-Mutationen waren entweder Luminal-A- oder Luminal-B-HER2+-Tumoren (Abbildung 3). In der BRCA2-positiven Untergruppe waren 10 (55,6 %) Tumoren luminal B-HER2+, 3 (16,7 %) TNBC und 2 (11,1 %). Lumen A (Abbildung 3). In dieser Gruppe waren keine HER2+-Tumoren vorhanden. Daher sind BRCA1-Mutationen bei TNBC-Patienten vorherrschend, während BRCA2-Veränderungen bei Lumen B-Patienten vorherrschen.
Abbildung 3 Prävalenz von Brustkrebs-Subtypen bei Patientinnen mit pathogenen Varianten in BRCA1 und BRCA2. Histogramme, die die Verteilung von BRCA1- (dunkelrot) und BRCA2- (hellrot) PVs unter molekularen Subtypen von Brustkrebspatientinnen zeigen. Die in jedem Kästchen angegebenen Zahlen stellen den Prozentsatz der Patientinnen mit BRCA1- und BRCA2-PV für jeden Brustkrebs-Subtyp dar.
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante;HER2+, humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 positiv;TNBC, dreifach negativer Brustkrebs.
Anschließend untersuchten wir den Typ und die Genlokalisation von BRCA1- und BRCA2-PVs. In BRCA1 PV beobachteten wir 7 Einzelnukleotidvarianten (SNVs), 6 Deletionen, 3 Duplikationen und 1 Insertion. Lediglich eine Mutation (c.5522delG) stellt eine neue Entdeckung dar. Die bei beiden Probanden am häufigsten nachgewiesene BRCA1-PV war c.5035_5039delCTAAT. Diese Veränderung beinhaltet eine Deletion von fünf Nukleotiden (CTAAT). ) im BRCA1-Exon 15, was zur Substitution der Aminosäure Leucin durch Tyrosin am Codon 1679 führte und aufgrund einer Verschiebung des Translationsrahmens mit einem vorhergesagten alternativen Stoppcodon zu einer vorzeitigen Proteinkürzung führte. Alle anderen Änderungen wurden nur in einem Fall nachgewiesen. Bemerkenswerterweise befand sich eines der gemeldeten PVs in der Konsensusregion der Spleißstelle (c.4357+1G>T) (Tabelle 1).
In Bezug auf BRCA2 PV beobachteten wir 6 Deletionen, 6 SNVs und 2 Duplikationen. Keine der gefundenen Veränderungen ist neu. In unserer Population traten drei Mutationen erneut auf, c.428dup und c.8487+1G>A, die bei drei Probanden beobachtet wurden, gefolgt von c.5851_5854delAGTT, das in zwei Fällen gefunden wurde. Die c.428dup-Veränderung beinhaltet eine Wiederholung von C in Exon 5 von BRCA2, Es wird vorhergesagt, dass sie ein verkürztes, nicht funktionelles Protein kodiert. Die c.8487+1G>A-Mutation tritt in der Intronregion des BRCA2-Introns 19 (± 1,2) auf und beeinflusst die Spleißkonsensussequenz, was zu einem veränderten Spleißen führt, was zu abnormalem oder fehlendem Protein führt. Die pathogene Variante c.5851_5854delAGTT ist auf eine 4-Nukleotid-Deletion an den Nukleotidpositionen 5851 bis 5854 zurückzuführen Es kodiert Exon 10 des BRCA2-Gens und führt zu einer Verschiebung des Translationsrahmens mit einem vorhergesagten alternativen Stoppcodon (p.S1951WfsTer). Bemerkenswerterweise wurden, wie bereits berichtet, beide Veränderungen c.631G>A und c.7008-2A>T bei demselben Patienten nachgewiesen.34 Die erste Mutation beinhaltet den Ersatz von Adenosin (A) in BRCA2-Exon 7 durch ein Guanin (G) enthaltendes Nukleotid, was zu einer Änderung von Valin zu führt Isoleucin am Codon 211, Isoleucin-Aminosäure, ist eine Aminosäure mit sehr ähnlichen Eigenschaften. Diese Änderung wirkt sich auf das normale mRNA-Spleißen aus. Die zweite Variante befindet sich in einer intronischen Region und führt zu einer doppelten Substitution von A durch Thymin (T) vor Exon 13 des für BRCA2 kodierenden Gens. Die Änderung c.7008-2A>T kann mehrere Transkripte unterschiedlicher Länge erzeugen. Darüber hinaus sind in der Gruppe der BRCA2-PVs 4 von 18 Änderungen (22,2 %) waren intronisch.
Anschließend kartierten wir schädliche BRCA1/2-Mutationen in funktionellen Domänen und Proteinbindungsregionen (Abb. 4). Im BRCA1-Gen befanden sich 50 % der PVs in der Brustkrebs-Clusterregion (BCCR), während 22 % der Mutationen in der Eierstockkrebs-Clusterregion (OCCR) lokalisiert waren (Abb. 4A). Bei BRCA2 PV befanden sich 35,7 % der Varianten in der BCCR-Region und 42,8 % der Mutationen befanden sich im OCCR (Abb. 4B). Als nächstes beurteilten wir die Position von PV innerhalb der BRCA1- und BRCA2-Proteindomänen. Für das BRCA1-Protein fanden wir drei PVs in den Loop- und Coiled-Coil-Domänen und zwei Mutationen in der BRCT-Domäne (Abb. 4A). Für das BRCA2-Protein wurden 4 PVs auf die BRC-Wiederholungsdomäne abgebildet, während 3 intronische und 3 exonische Veränderungen im Oligo/Oligosaccharid nachgewiesen wurden. Bindungsdomänen (OB) und Turmdomänen (T) (Abbildung 4B).
Abbildung 4 Schematische Darstellung der BRCA1- und BRCA2-Proteine ​​und Lokalisierung pathogener Varianten. Diese Abbildung zeigt die Verteilung der pathogenen Varianten BRCA1 (A) und BRCA2 (B) bei Brustkrebspatientinnen. Exonische Mutationen sind blau dargestellt, während intronische Varianten orange dargestellt sind. Die Balkenhöhe stellt die Anzahl der Fälle dar. Die BRCA1- und BRCA2-Proteine ​​und ihre funktionellen Domänen werden angegeben. (A) Das BRCA1-Protein enthält eine Schleifendomäne (RING) und eine Kernlokalisierungssequenz (NLS), eine Spule ed-Coil-Domäne, eine SQ/TQ-Cluster-Domäne (SCD) und eine BRCA1-C-terminale Domäne (BRCT).(B) Das BRCA2-Protein enthält acht BRC-Wiederholungen, eine DNA-Bindungsdomäne mit einer helikalen Domäne (Helical), drei Oligonukleotid-/Oligosaccharid-Bindungsfalten (OB), eine Turmdomäne (T) und ein NLS auf der C-Seite. Bereiche, die als Breast Cancer Cluster Region (BCCR) und Ovarian Cancer Cluster Region (OCCR) bezeichnet werden. werden unten angezeigt.*Stellt Mutationen dar, die Stoppcodons bestimmen.
Anschließend untersuchten wir klinisch-pathologische Merkmale von BC, die möglicherweise mit dem Vorhandensein von BRCA1/2 PV korrelieren. Für 181 BRCA1/2-negative Patienten (Nicht-Träger) und alle Träger (n = 35) lagen vollständige klinische Aufzeichnungen vor. Es bestand eine Korrelation zwischen der Tumorproliferationsrate und dem Grad.
Wir berechneten die Verteilung von Ki-67 basierend auf dem Median unserer Kohorte (25 %, Bereich <10–90 %). Probanden mit Ki-67 < 25 % wurden als „niedriges Ki-67“ definiert, während Personen mit Werten ≥ 25 % als „hohes Ki-67“ galten. Signifikante Ki-67-Unterschiede (p<0,01) wurden zwischen Nicht-Trägern und BRCA1-PV-Trägern gefunden (Abb. 5A).
Abbildung 5 Korrelation von Ki-67 mit der Gradverteilung bei Brustkrebsfrauen mit und ohne BRCA1- und BRCA2-PVs. (A) Boxplot, das die mittleren Ki-67-Werte bei 181 Nicht-Träger-BC-Patienten im Vergleich zu BRCA1- (18) oder BRCA2- (17) PV-Patienten zeigt. P-Werte unter 0,5 wurden als statistisch signifikant angesehen. (B) Histogramm, das die Zuordnung von BC-Krebspatienten in histologische Gradgruppen (G2 und G3) gemäß BRCA1 darstellt und BRCA2-Mutationsstatus (WT-Probanden, BRCA1- und BRCA2-PV-Träger).
Ebenso untersuchten wir, ob der Tumorgrad mit dem Vorhandensein von BRCA1/2 PV korreliert. Da G1 BC in unserer Population fehlte, teilten wir die Patienten in zwei Gruppen (G2 oder G3) ein. In Übereinstimmung mit den Ki-67-Ergebnissen ergab die Analyse eine statistisch signifikante Korrelation zwischen Tumorgrad und BRCA1-Mutation, mit einem höheren Anteil an G3-Tumoren bei BRCA1-Trägern im Vergleich zu Nicht-Trägern (p<0,005) (Abbildung 5B).
Fortschritte in der DNA-Sequenzierungstechnologie haben beispiellose Fortschritte bei BRCA1/2-Gentests ermöglicht, mit entscheidenden Auswirkungen für Patienten mit einer Krebserkrankung in der Familienanamnese. Bis heute wurden etwa 20.000 BRCA1/2-Varianten identifiziert und gemäß der American Society of Medical Genetics 35 und dem ENIGMA-System klassifiziert.35,36 Es ist bekannt, dass das BRCA1/2-Mutationsspektrum je nach geografischer Region stark variiert.37 Innerhalb Italiens variiert die BRCA1/2-Rate stark Die PVs lagen zwischen 8 % und 37 %, was eine große Variabilität innerhalb des Landes zeigt.38,39 Mit einer Bevölkerung von fast 5 Millionen ist Sizilien gemessen an der Einwohnerzahl die fünftgrößte Region Italiens. Obwohl Daten zur Verbreitung von BRCA1/2 im Westen Siziliens vorliegen, gibt es im östlichen Teil der Insel keine umfassenden Belege.
Unsere Studie ist einer der ersten Berichte über die Inzidenz von BRCA1/2 PV bei BC-Patienten in Ostsizilien.28 Wir haben unsere Analyse auf BC konzentriert, da dies bei weitem die häufigste Erkrankung in unserer Kohorte ist.
Beim Testen von 389 BC-Patienten trugen 9 % BRCA1/2-PVs, gleichmäßig verteilt zwischen BRCA1 und BRCA2. Diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die zuvor in der italienischen Bevölkerung berichtet wurden.28 Interessanterweise waren 3 % (13/389) unserer Kohorte männlich. Diese Rate ist höher als erwartet für männlichen Brustkrebs (1 % aller BCs),40 was unsere Auswahl der Populationen basierend auf dem BRCA1/2-Mutationsrisiko widerspiegelt. Allerdings entwickelte keiner dieser Männer einen BRCA 1/2 PV, daher waren sie Kandidaten für eine weitere molekulare Analyse, um das Vorhandensein weniger häufiger Mutationen wie PALB2, RAD51C und D und andere auszuschließen. Bei 7 % der Probanden, bei denen BRCA2-VUS offensichtlich war, wurden Varianten mit ungewisser Signifikanz ermittelt. Auch dieses Ergebnis stimmt mit bereits vorhandenen Beweisen überein.28,41,42
Als wir die Verteilung der molekularen BC-Subtypen bei BRCA1/2-Mutantenfrauen analysierten, bestätigten wir bekannte Zusammenhänge zwischen TNBC und BRCA1 PV (58,8 %) und zwischen luminalem B BC und BRCA2 PV (55,6 %).16,43 Die luminalen A- und HER2+-Tumoren bei BRCA1- und BRCA2-PV-Trägern stimmen mit vorhandenen Literaturdaten überein.16,43
Anschließend konzentrieren wir uns auf die Art und den Standort des BRCA1/2-PV. In unserer Kohorte war der häufigste BRCA1-PV c.5035_5039delCTAAT. Obwohl Incorvaia et al.haben diese Variante in ihrer sizilianischen Kohorte nicht beschrieben, andere Autoren haben sie als Keimbahn-BRCA1-PV beschrieben.34 In unserer Kohorte wurden mehrere BRCA1-PVs gefunden – z. B. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA und c.5266dupC – die in Sizilien beobachtet wurden.28 Davon zwei BRCA1-Gründermutationen (c.181T>G und c.5266dupC ) kommen häufig bei aschkenasischen Juden in Ost- und Mitteleuropa (Polen, Tschechien, Slowenien, Österreich, Ungarn, Weißrussland und Deutschland) vor 44,45 und wurden in den Vereinigten Staaten und Argentinien kürzlich als „wiederkehrende Keimbahnvariante“ bei italienischen Patienten mit BC und OC definiert. Die 34c.514del-Variante wurde zuvor bei 8 Brustkrebspatientinnen aus Nordsizilien in Palermo und Messina identifiziert. Interessanterweise sogar Incorvaia et al.fanden die c.3253dupA-Variante in einigen Familien in Catania.28 Die repräsentativsten BRCA2-PVs sind c.428dup, c.5851_5854delAGTT und die intronische Variante c.8487+1G>A, über die ausführlicher berichtet wurde 28 bei einem Patienten in Palermo mit c.428dup, c.5851_5854delAGTT. PV wurde in Haushalten im Nordwesten Siziliens, hauptsächlich in Trapani, beobachtet und Palermo-Regionen, während c.5851_5854delAGTT PV in Haushalten im Nordwesten Siziliens beobachtet wurde. Die 8487+1G>A-Variante kam häufiger bei Probanden aus Messina, Palermo und Caltanissetta vor.28 Rebbeck et al.haben zuvor die c.5851_5854delAGTT-Veränderung in Kolumbien beschrieben.37 Ein weiterer BRCA2-PV, c.631+1G>A, wurde bei BC- und OC-Patienten aus Sizilien (Agrigent, Siracusa und Ragusa) gefunden.28 Insbesondere beobachteten wir die Koexistenz von zwei BRCA2-Varianten (BRCA2 c.631G>A und c.7008-2A>T) bei demselben Patienten, von dem wir annahmen, dass er getrennt ist im cis-Modus erzeugt, wie zuvor bereits berichtet.34,46 Diese BRCA2-Uble-Mutationen werden tatsächlich häufig in der italienischen Region beobachtet und es wurde festgestellt, dass sie vorzeitige Stoppcodons einführen, was das Spleißen der Messenger-RNA beeinträchtigt und zum Versagen des BRCA2-Proteins führt.47,48
Wir haben auch BRCA1- und BRCA2-PVs in mutmaßlichen OCCR- und BCCR-Regionen von Proteindomänen und Genen kartiert. Diese Regionen wurden von Rebbeck et al. beschrieben.als Risikobereiche für die Entwicklung von Eierstock- bzw. Brustkrebs.49 Die Belege für den Zusammenhang zwischen der Lage von Keimbahnvarianten und dem Brust- oder Eierstockkrebsrisiko bleiben jedoch umstritten.28,50-52 In unserer Population befanden sich BRCA1-PVs überwiegend in der BCCR-Region, wohingegen BRCA2-PVs überwiegend in der OCCR-Region lokalisiert waren. Wir konnten jedoch keinen Zusammenhang zwischen mutmaßlichen OCCR- und BCCR-Regionen und BC-Merkmalen finden. Dies kann auf die begrenzte Anzahl von Patienten mit BRCA1 zurückzuführen sein /2-Mutationen. Aus Sicht der Proteindomäne sind BRCA1-PVs über das gesamte Protein verteilt und BRCA2-Veränderungen finden sich bevorzugt in der BRC-Wiederholungsdomäne.
Schließlich korrelierten wir klinisch-pathologische Merkmale von BC mit BRCA1/2 PV. Aufgrund der begrenzten Anzahl eingeschlossener Patienten fanden wir nur eine signifikante Korrelation zwischen Ki-67 und dem Tumorgrad. Obwohl die Bewertung und Interpretation von Ki-67 etwas kontrovers bleibt, ist es sicher, dass hohe Proliferationsraten mit einem erhöhten Risiko eines erneuten Auftretens der Krankheit und einer verringerten Überlebensrate verbunden sind. Bisher liegt der Grenzwert für die Unterscheidung zwischen „hohem“ und „niedrigem“ Ki-67 bei 20 %. Dieser Schwellenwert gilt jedoch nicht für unseren BR Patientenpopulation mit CA1/2-Mutation, die einen mittleren Ki-67-Wert von 25 % aufweist. Dieser Trend bei hohen Ki-67-Raten kann durch die Prävalenz in unseren Luminal-B- und TNBC-Kohorten erklärt werden, in denen nur wenige Luminal-A-Tumoren vorhanden waren. Einige Hinweise scheinen jedoch darauf hinzudeuten, dass ein höherer Ki-67-Cutoff (25–30 %) Patienten besser nach ihrer Prognose stratifizieren kann.53,54 Aus den Ergebnissen unserer Analyse ist eine signifikante Korrelation nicht überraschend .Tritt zwischen hohen Ki-67-Werten und dem Vorhandensein von BRCA1-PV auf. Tatsächlich sind BRCA1-assoziierte Tumoren typisch für TNBC und weisen aggressivere Merkmale auf.16,17
Zusammenfassend liefert diese Studie einen Bericht über den Mutationsstatus von BRCA1/2 in einer BC-Kohorte aus Ostsizilien. Insgesamt stimmen unsere Ergebnisse mit bereits vorhandenen Erkenntnissen überein, sowohl in Bezug auf die Mutationsprävalenz als auch auf klinisch-pathologische Merkmale in BC. Weitere Studien an größeren Populationen von BRCA1/2-mutierten BC-Patienten, wie z angemessenes Management der zunehmenden Zahl von Personen mit erhöhtem Krebsrisiko aufgrund genetischer Mutationen.
Wir haben bestätigt, dass die Patienten eine Einverständniserklärung zur anonymen Freigabe ihrer Tumorproben für Forschungszwecke unterzeichnet haben. Alle Patienten haben eine schriftliche Einverständniserklärung gemäß der Deklaration von Helsinki unterzeichnet. Gemäß den Richtlinien des AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco“ war diese Studie von der ethischen Prüfung ausgenommen, da die BRCA1/2-Analyse gemäß der klinischen Praxis durchgeführt wurde und alle Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung gegeben haben. Die Patienten stimmen auch der Verwendung ihrer Daten für Forschungszwecke zu.
Wir danken Prof. Paolo Vigneri für seine von der Ethikkommission geforderte Unterstützung bei der Betreuung von Brustkrebspatientinnen.
Federica Martorana berichtet über Honorare von Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Die anderen Autoren geben an, dass in dieser Arbeit keine Interessenkonflikte bestehen.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al.Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN schätzt die Inzidenz und Mortalität von 36 Krebsarten in 185 Ländern auf der ganzen Welt.CA Cancer J Clin.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660