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Die Fruchtbarkeit von Vögeln hängt von ihrer Fähigkeit ab, genügend lebensfähige Spermien über einen längeren Zeitraum in den Spermienspeicherkanälchen (SST) zu speichern.Der genaue Mechanismus, durch den Spermien in das SST gelangen, sich dort aufhalten und es verlassen, bleibt umstritten.Die Spermien von Sharkasi-Hühnern zeigten eine hohe Neigung zur Agglutination und bildeten bewegliche, fadenförmige Bündel mit vielen Zellen.Aufgrund der Schwierigkeit, die Motilität und das Verhalten von Spermien in einem undurchsichtigen Eileiter zu beobachten, verwendeten wir ein Mikrofluidikgerät mit einem Mikrokanalquerschnitt ähnlich dem von Spermien, um die Agglutination und Motilität der Spermien zu untersuchen.In dieser Studie wird erörtert, wie sich Spermienbündel bilden, wie sie sich bewegen und welche Rolle sie möglicherweise bei der Verlängerung der Verweildauer der Spermien im SST spielen.Wir untersuchten die Spermiengeschwindigkeit und das rheologische Verhalten, wenn durch hydrostatischen Druck (Flussrate = 33 µm/s) ein Flüssigkeitsfluss in einem Mikrofluidikkanal erzeugt wurde.Die Spermien neigen dazu, gegen den Strom zu schwimmen (positive Rheologie) und die Geschwindigkeit des Spermienbündels ist im Vergleich zu einzelnen Spermien deutlich verringert.Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel spiralförmig bewegen und an Länge und Dicke zunehmen, wenn mehr einzelne Spermien rekrutiert werden. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der Mikrofluidikkanäle näherten und daran festhielten, um zu verhindern, dass sie mit einer Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit von > 33 µm/s mitgerissen werden. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der Mikrofluidikkanäle näherten und daran festhielten, um zu verhindern, dass sie mit einer Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit von > 33 µm/s mitgerissen werden. Aus diesem Grund werden Spermien-Spermafilme mit vielen Kanälen von Mikrowellensendern verwendet und verwendet, sodass sie mit der Zeit verbunden sind Kosten> 33 Mio. Kubikmeter / Sek. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der Mikrofluidikkanäle nähern und daran haften, um bei Flüssigkeitsströmungsraten von >33 µm/s nicht weggeschwemmt zu werden.Die Geschwindigkeit beträgt 33 µm/s.33 µm/s beträgt ca. Aus diesem Grund werden Spermien-Spritzpistolen mit einem Mikrokanal ausgestattet und verwendet, damit sie mit der Zeit nichts zu tun haben ю > 33 mm²/s. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden des Mikrofluidikkanals nähern und daran haften, um zu verhindern, dass sie vom Flüssigkeitsstrom mit >33 µm/s weggeschwemmt werden.Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie ergab, dass die Spermienbündel von reichlich dichtem Material getragen wurden.Die erhaltenen Daten belegen die einzigartige Mobilität der Spermatozoen von Sharkazi-Hühnern sowie die Fähigkeit der Spermatozoen, zu agglutinieren und mobile Bündel zu bilden, was zu einem besseren Verständnis der Langzeitlagerung von Spermatozoen bei SMT beiträgt.
Um bei Menschen und den meisten Tieren eine Befruchtung zu erreichen, müssen Spermien und Eizellen zum richtigen Zeitpunkt am Befruchtungsort eintreffen.Daher muss die Paarung vor oder zum Zeitpunkt des Eisprungs erfolgen.Andererseits speichern einige Säugetiere wie Hunde sowie Nicht-Säugetierarten wie Insekten, Fische, Reptilien und Vögel Spermien über einen längeren Zeitraum in ihren Fortpflanzungsorganen, bis ihre Eier zur Befruchtung bereit sind (asynchrone Befruchtung 1).Vögel sind in der Lage, die Lebensfähigkeit von Spermien, die Eier befruchten können, für 2–10 Wochen aufrechtzuerhalten2.
Dies ist ein einzigartiges Merkmal, das Vögel von anderen Tieren unterscheidet, da es eine hohe Befruchtungswahrscheinlichkeit nach einer einzigen Befruchtung über mehrere Wochen ohne gleichzeitige Paarung und Eisprung bietet.Das Hauptorgan zur Spermienspeicherung, der sogenannte Spermienspeichertubulus (SST), befindet sich in den inneren Schleimhautfalten am uterovaginalen Übergang.Bis heute sind die Mechanismen, durch die Spermien in die Samenbank gelangen, dort verbleiben und diese verlassen, nicht vollständig geklärt.Basierend auf früheren Studien wurden viele Hypothesen aufgestellt, aber keine davon wurde bestätigt.
Forman4 stellte die Hypothese auf, dass Spermien ihren Aufenthalt in der SST-Höhle durch kontinuierliche oszillierende Bewegung entgegen der Richtung des Flüssigkeitsflusses durch Proteinkanäle auf SST-Epithelzellen behalten (Rheologie).Aufgrund der ständigen Flagellenaktivität, die erforderlich ist, um die Spermien im SST-Lumen zu halten, wird ATP erschöpft, und die Beweglichkeit lässt schließlich nach, bis die Spermien durch den Flüssigkeitsfluss aus der Samenbank befördert werden und eine neue Reise durch den aufsteigenden Eileiter beginnen, um die Spermien zu befruchten.Ei (Forman4).Dieses Modell der Spermienlagerung wird durch den immunzytochemischen Nachweis der in SST-Epithelzellen vorhandenen Aquaporine 2, 3 und 9 gestützt.Bisher fehlen Studien zur Rheologie von Hühnersperma und ihrer Rolle bei der SST-Speicherung, der vaginalen Spermienauswahl und der Spermienkonkurrenz.Bei Hühnern gelangen Spermien nach der natürlichen Paarung in die Vagina, aber mehr als 80 % der Spermien werden kurz nach der Paarung aus der Vagina ausgestoßen.Dies deutet darauf hin, dass die Vagina der primäre Ort für die Spermienselektion bei Vögeln ist.Darüber hinaus wurde berichtet, dass weniger als 1 % der in der Vagina befruchteten Spermien in SSTs enden2.Bei der künstlichen Befruchtung von Küken in der Vagina steigt die Anzahl der Spermien, die den SST erreichen, tendenziell 24 Stunden nach der Befruchtung an.Bisher ist der Mechanismus der Spermienselektion während dieses Prozesses unklar und die Spermienmotilität könnte eine wichtige Rolle bei der SST-Spermienaufnahme spielen.Aufgrund der dicken und undurchsichtigen Wände der Eileiter ist es schwierig, die Spermienmotilität in den Eileitern von Vögeln direkt zu überwachen.Daher fehlen uns grundlegende Kenntnisse darüber, wie Spermien nach der Befruchtung in SST übergehen.
Die Rheologie wurde kürzlich als wichtiger Faktor für die Steuerung des Spermientransports in den Genitalien von Säugetieren erkannt.Basierend auf der Fähigkeit beweglicher Spermien, im Gegenstrom zu wandern, verwendeten Zaferani et al8 ein Corra-Mikrofluidiksystem, um bewegliche Spermien passiv aus eingepferchten Samenproben zu isolieren.Diese Art der Samensortierung ist für die medizinische Behandlung von Unfruchtbarkeit und die klinische Forschung von wesentlicher Bedeutung und wird herkömmlichen Methoden vorgezogen, die zeit- und arbeitsintensiv sind und die Morphologie und strukturelle Integrität der Spermien beeinträchtigen können.Bisher wurden jedoch keine Studien zum Einfluss von Sekreten aus den Genitalorganen von Hühnern auf die Spermienmotilität durchgeführt.
Unabhängig vom Mechanismus, der die Spermienspeicherung im SST aufrechterhält, haben viele Forscher beobachtet, dass residente Spermien im SST von Hühnern 9, 10, Wachteln 2 und Truthähnen 11 Kopf an Kopf agglutinieren und agglutinierte Spermienbündel bilden.Die Autoren vermuten, dass es einen Zusammenhang zwischen dieser Agglutination und der Langzeitlagerung von Spermien im SST gibt.
Tingari und Lake12 berichteten über einen starken Zusammenhang zwischen Spermien in der Spermienaufnahmedrüse des Huhns und stellten die Frage, ob Vogelspermien auf die gleiche Weise agglutinieren wie Säugetierspermien.Sie glauben, dass die tiefen Verbindungen zwischen den Spermien in den Samenleitern möglicherweise auf den Stress zurückzuführen sind, der durch die Anwesenheit einer großen Anzahl von Spermien auf kleinem Raum entsteht.
Bei der Beurteilung des Verhaltens von Spermatozoen auf frisch hängenden Objektträgern können vorübergehende Anzeichen einer Agglutination, insbesondere an den Rändern der Samentröpfchen, beobachtet werden.Allerdings wurde die Agglutination häufig durch die mit der kontinuierlichen Bewegung verbundene Rotationsbewegung gestört, was den vorübergehenden Charakter dieses Phänomens erklärt.Den Forschern fiel außerdem auf, dass bei Zugabe des Verdünnungsmittels zum Samen längliche „fadenartige“ Zellaggregate entstanden.
Frühe Versuche, ein Spermatozoon nachzuahmen, wurden unternommen, indem man einen dünnen Draht von einem hängenden Tropfen entfernte, was dazu führte, dass ein längliches, spermienähnliches Vesikel aus dem Samentropfen herausragte.Die Spermien richteten sich sofort parallel innerhalb des Vesikels auf, die gesamte Einheit verschwand jedoch aufgrund der 3D-Begrenzung schnell.Um die Agglutination von Spermien zu untersuchen, ist es daher notwendig, die Motilität und das Verhalten von Spermien direkt in isolierten Spermienspeicherkanälchen zu beobachten, was schwierig zu erreichen ist.Daher ist es notwendig, ein Instrument zu entwickeln, das Spermien nachahmt, um Studien zur Spermienmotilität und zum Agglutinationsverhalten zu unterstützen.Brillard et al.13 berichteten, dass die durchschnittliche Länge der Spermienspeicherkanälchen bei erwachsenen Küken 400–600 µm beträgt, einige SSTs können jedoch bis zu 2000 µm lang sein.Mero und Ogasawara14 teilten die Samendrüsen in vergrößerte und nicht vergrößerte Spermienspeicherröhrchen ein, die beide die gleiche Länge (~500 µm) und Halsbreite (~38 µm) hatten, aber der mittlere Lumendurchmesser der Röhrchen betrug 56,6 und 56,6 µm.., bzw. 11,2 μm.In der aktuellen Studie verwendeten wir ein mikrofluidisches Gerät mit einer Kanalgröße von 200 µm × 20 µm (B × H), dessen Querschnitt dem des verstärkten SST etwas nahe kommt.Darüber hinaus untersuchten wir die Spermienmotilität und das Agglutinationsverhalten in fließender Flüssigkeit, was mit Foremans Hypothese übereinstimmt, dass von SST-Epithelzellen produzierte Flüssigkeit die Spermien im Gegenstrom (rheologische Richtung) im Lumen hält.
Ziel dieser Studie war es, die Probleme bei der Beobachtung der Spermienmotilität im Eileiter zu überwinden und die Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Rheologie und des Verhaltens von Spermien in einer dynamischen Umgebung zu vermeiden.Es wurde ein mikrofluidisches Gerät verwendet, das hydrostatischen Druck erzeugt, um die Spermienmotilität in den Genitalien eines Huhns zu simulieren.
Wenn ein Tropfen einer verdünnten Spermienprobe (1:40) in das Mikrokanalgerät geladen wurde, konnten zwei Arten der Spermienmotilität identifiziert werden (isolierte Spermien und gebundene Spermien).Darüber hinaus neigten Spermien dazu, gegen den Strom zu schwimmen (positive Rheologie; Video 1, 2). Obwohl Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit aufwiesen als einzelne Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz an Spermien mit positiver Rheotaxis (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit aufwiesen als einzelne Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz an Spermien mit positiver Rheotaxis (p < 0,001; Tabelle 2). Bei den Spermienproben handelt es sich um mehr als nur wenige Tests, bei denen es sich um spezielle Spermienproben (p < 0,001) handelt х положительный реотаксис (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl die Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit aufwiesen als einzelne Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien mit positiver Rheotaxis (p < 0,001; Tabelle 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001）,但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001）, 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Bei der Untersuchung von Spermienproben handelte es sich um eine Reihe von Spermien (p < 0,001). 0,001; Tabelle 2). Obwohl die Geschwindigkeit der Spermienbündel geringer war als die der einzelnen Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien mit positiver Rheologie (p < 0,001; Tabelle 2).Die positive Rheologie für einzelne Spermien und Büschel wird auf etwa 53 % bzw. 85 % geschätzt.
Es wurde beobachtet, dass die Spermien von Sharkasi-Hühnern unmittelbar nach der Ejakulation lineare Bündel bilden, die aus Dutzenden von Individuen bestehen.Diese Büschel nehmen mit der Zeit an Länge und Dicke zu und können mehrere Stunden in vitro verbleiben, bevor sie sich auflösen (Video 3).Diese fadenförmigen Bündel haben die Form von Echidna-Spermatozoen, die sich am Ende des Nebenhodens bilden.Es wurde festgestellt, dass der Samen von Sharkashi-Hühnern eine hohe Tendenz zur Agglutination und zur Bildung eines Netzbündels in weniger als einer Minute nach der Entnahme aufweist.Diese Balken sind dynamisch und können an nahegelegenen Wänden oder statischen Objekten haften.Obwohl Spermienbündel die Geschwindigkeit der Spermien verringern, ist es klar, dass sie makroskopisch ihre Linearität erhöhen.Die Länge der Bündel variiert je nach Anzahl der in Bündeln gesammelten Spermien.Es wurden zwei Teile des Bündels isoliert: der Anfangsteil, einschließlich des freien Kopfes des agglutinierten Spermas, und der Endteil, einschließlich des Schwanzes und des gesamten distalen Endes des Spermas.Mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (950 fps) wurden im Anfangsteil des Bündels freie Köpfe agglutinierter Spermien beobachtet, die aufgrund ihrer oszillierenden Bewegung für die Bewegung des Bündels verantwortlich sind und die übrigen Spermien mit einer spiralförmigen Bewegung in das Bündel hineinziehen (Video 4).Bei langen Büscheln wurde jedoch beobachtet, dass einige freie Spermienköpfe am Körper hafteten und der Endteil des Büschels als Flügel fungierte, um den Antrieb des Büschels zu unterstützen.
Während sich die Spermienbündel in einem langsamen Flüssigkeitsstrom parallel zueinander bewegen, beginnen sie sich zu überlappen und an allem festzukleben, was sich nicht bewegt, um bei zunehmender Strömungsgeschwindigkeit nicht vom Strom weggespült zu werden.Die Bündel bilden sich, wenn sich eine Handvoll Samenzellen einander nähern, sie beginnen sich synchron zu bewegen, sich umeinander zu wickeln und dann an einer klebrigen Substanz festzukleben.Die Abbildungen 1 und 2 zeigen, wie sich die Spermien einander nähern und eine Verbindung bilden, während sich die Schwänze umeinander wickeln.
Die Forscher wendeten hydrostatischen Druck an, um einen Flüssigkeitsfluss in einem Mikrokanal zu erzeugen und so die Rheologie der Spermien zu untersuchen.Es wurde ein Mikrokanal mit einer Größe von 200 µm × 20 µm (B × H) und einer Länge von 3,6 µm verwendet.Verwenden Sie Mikrokanäle zwischen Behältern mit an den Enden angebrachten Spritzen.Um die Kanäle besser sichtbar zu machen, wurde Lebensmittelfarbe verwendet.
Befestigen Sie Verbindungskabel und Zubehör an der Wand.Das Video wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop aufgenommen.Zu jedem Bild werden Phasenkontrastmikroskopie- und Mapping-Bilder präsentiert.(A) Die Verbindung zwischen zwei Strömen widersetzt sich der Strömung aufgrund der Spiralbewegung (roter Pfeil).(B) Die Verbindung zwischen Rohrbündel und Kanalwand (rote Pfeile), gleichzeitig sind sie mit zwei anderen Rohrbündeln verbunden (gelbe Pfeile).(C) Spermienbündel im Mikrofluidikkanal beginnen sich miteinander zu verbinden (rote Pfeile) und bilden ein Netz aus Spermienbündeln.(D) Bildung eines Netzwerks von Spermienbündeln.
Als ein Tropfen verdünnten Spermas in das Mikrofluidikgerät geladen wurde und ein Fluss erzeugt wurde, konnte beobachtet werden, dass sich der Spermastrahl entgegen der Flussrichtung bewegte.Die Bündel liegen eng an den Wänden der Mikrokanäle an, und die freien Köpfe im Anfangsteil der Bündel liegen eng daran an (Video 5).Sie haften auch an allen stationären Partikeln in ihrem Weg, wie z. B. Trümmern, um zu verhindern, dass sie von der Strömung weggeschwemmt werden.Im Laufe der Zeit werden diese Büschel zu langen Filamenten, in denen andere einzelne Spermien und kürzere Büschel gefangen sind (Video 6).Wenn sich der Fluss zu verlangsamen beginnt, beginnen lange Spermienlinien, ein Netzwerk aus Spermienlinien zu bilden (Video 7; Abbildung 2).
Bei hoher Strömungsgeschwindigkeit (V > 33 µm/s) werden die Spiralbewegungen der Fäden verstärkt, um viele einzelne Spermien zu fangen und Bündel zu bilden, die der Driftkraft der Strömung besser widerstehen können. Bei hoher Strömungsgeschwindigkeit (V > 33 µm/s) werden die Spiralbewegungen der Fäden verstärkt, um viele einzelne Spermien zu fangen und Bündel zu bilden, die der Driftkraft der Strömung besser widerstehen können. Bei einer Aufnahmegeschwindigkeit (V > 33 m²/s) ist die Geschwindigkeit der Übertragung nicht ausreichend Mit den Knöpfen können Sie sich die Zeit vertreiben. Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) nehmen die helikalen Bewegungen der Stränge zu, da sie versuchen, viele einzelne Spermien zu fangen und Bündel zu bilden, die der Driftkraft der Strömung besser widerstehen können.在高流速 (V > 33 µm/s)抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时, 的 螺旋 运动 增加, 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子, 从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 Bei einer Aufnahmegeschwindigkeit (V > 33 m²/s) wird die Spirale nach dem Einschalten mehrerer anderer Spermien, die auf dem Bildschirm angezeigt werden, angezeigt ки, чтобы лучше опротивляться силам дрейфа потока. Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) nimmt die spiralförmige Bewegung der Filamente zu, um viele einzelne Spermien einzufangen, die Bündel bilden, um den Driftkräften der Strömung besser zu widerstehen.Sie versuchten auch, Mikrokanäle an den Seitenwänden anzubringen.
Mittels Lichtmikroskopie (LM) wurden Spermienbündel als Ansammlungen von Spermienköpfen und -schwänzen identifiziert.Spermienbündel mit verschiedenen Aggregaten wurden auch als verdrehte Köpfe und Flagellenaggregate, mehrfach verschmolzene Spermienschwänze, an einem Schwanz befestigte Spermienköpfe und Spermienköpfe mit gebogenen Kernen als mehrfach verschmolzene Kerne identifiziert.Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte, dass es sich bei den Spermienbündeln um umhüllte Aggregate von Spermienköpfen handelte und dass die Spermienaggregate ein daran befestigtes Netzwerk aus umhüllten Schwänzen aufwiesen.
Die Morphologie und Ultrastruktur der Spermien sowie die Bildung von Spermienbündeln wurden mittels Lichtmikroskopie (Halbschnitt), Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, Spermienausstriche wurden mit Acridinorange angefärbt und mittels Epifluoreszenzmikroskopie untersucht.
Die Färbung des Spermienausstrichs mit Acridinorange (Abb. 3B) zeigte, dass die Spermienköpfe zusammengeklebt und mit sekretorischem Material bedeckt waren, was zur Bildung großer Büschel führte (Abb. 3D).Die Spermienbündel bestanden aus Spermienaggregaten mit einem Netzwerk anhängender Schwänze (Abb. 4A-C).Spermienbündel bestehen aus den Schwänzen vieler zusammengeklebter Spermien (Abb. 4D).Geheimnisse (Abb. 4E,F) bedeckten die Köpfe der Spermatozoenbündel.
Bildung des Spermatozoenbündels Mittels Phasenkontrastmikroskopie und mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichen konnte gezeigt werden, dass die Köpfe der Spermatozoen zusammenkleben.(A) Die frühe Spermienbüschelbildung beginnt mit einem Spermium (weißer Kreis) und drei Spermien (gelber Kreis), wobei die Spirale am Schwanz beginnt und am Kopf endet.(B) Mikrofotografie eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs, der anhaftende Spermienköpfe zeigt (Pfeile).Der Ausfluss bedeckt den/die Kopf(e).Vergrößerung × 1000. (C) Entwicklung eines großen Strahls, der durch Strömung in einem Mikrofluidikkanal transportiert wird (unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitskamera mit 950 fps).(D) Mikroskopische Aufnahme eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs mit großen Büscheln (Pfeile).Vergrößerung: ×200.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Spermienstrahls und eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs.(A, B, D, E) sind digitale Farb-Rasterelektronenmikroskopaufnahmen von Spermien, und C und F sind mikroskopische Aufnahmen von mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichen, die die Anhaftung mehrerer Spermien zeigen, die das Schwanznetz umhüllen.(AC) Spermienaggregate werden als Netzwerk anhängender Schwänze dargestellt (Pfeile).(D) Adhäsion mehrerer Spermien (mit Klebesubstanz, rosa Umrandung, Pfeil), die sich um den Schwanz wickeln.(E und F) Mit Klebematerial (Zeiger) bedeckte Spermienkopfaggregate (Zeiger).Die Spermien bildeten Bündel mit mehreren wirbelartigen Strukturen (F).(C) 400-fache und (F) 200-fache Vergrößerung.
Mittels Transmissionselektronenmikroskopie stellten wir fest, dass an den Spermienbündeln Schwänze befestigt waren (Abb. 6A, C), Köpfe an Schwänzen befestigt waren (Abb. 6B) oder Köpfe an Schwänzen befestigt waren (Abb. 6D).Die Köpfe der Spermien im Bündel sind gebogen und weisen im Schnitt zwei Kernregionen auf (Abb. 6D).Im Schnittbündel hatten die Spermien einen verdrehten Kopf mit zwei Kernregionen und mehreren Flagellenregionen (Abb. 5A).
Digitale Farbelektronenmikroskopaufnahme, die die Verbindungsschwänze im Spermienbündel und das agglutinierende Material zeigt, das die Spermienköpfe verbindet.(A) Anhängender Schwanz einer großen Anzahl von Spermatozoen.Beachten Sie, wie der Schwanz sowohl im Hochformat (Pfeil) als auch im Querformat (Pfeil) aussieht.(B) Der Kopf (Pfeil) des Spermiums ist mit dem Schwanz (Pfeil) verbunden.(C) Mehrere Spermienschwänze (Pfeile) sind angebracht.(D) Agglutinationsmaterial (AS, blau) verbindet vier Spermienköpfe (lila).
Rasterelektronenmikroskopie wurde verwendet, um Spermienköpfe in mit Sekreten oder Membranen bedeckten Spermienbündeln zu erkennen (Abbildung 6B), was darauf hindeutet, dass die Spermienbündel durch extrazelluläres Material verankert waren.Das agglutinierte Material konzentrierte sich im Spermienkopf (quallenkopfähnliche Anordnung; Abb. 5B) und dehnte sich nach distal aus, was unter dem Fluoreszenzmikroskop ein leuchtend gelbes Aussehen ergab, wenn es mit Acridinorange angefärbt wurde (Abb. 6C).Dieser Stoff ist unter dem Rastermikroskop deutlich sichtbar und gilt als Bindemittel.Halbdünne Schnitte (Abb. 5C) und mit Acridinorange gefärbte Spermienausstriche zeigten Spermienbündel mit dicht gepackten Köpfen und gekräuselten Schwänzen (Abb. 5D).
Verschiedene Mikrofotografien, die die Aggregation von Spermienköpfen und gefalteten Schwänzen mit verschiedenen Methoden zeigen.(A) Digitale Farbtransmissionselektronenmikroskopaufnahme eines Spermienbündels im Querschnitt, die einen gewundenen Spermienkopf mit einem zweiteiligen Kern (blau) und mehreren Flagellenteilen (grün) zeigt.(B) Digitale Rasterelektronenmikroskopaufnahme in Farbe, die eine Ansammlung quallenartiger Spermienköpfe (Pfeile) zeigt, die bedeckt zu sein scheinen.(C) Halbdünnschnitt mit aggregierten Spermienköpfen (Pfeile) und gekräuselten Schwänzen (Pfeile).(D) Mikroskopische Aufnahme eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs, der Aggregate von Spermienköpfen (Pfeile) und gekräuselten anhaftenden Schwänzen (Pfeile) zeigt.Beachten Sie, dass eine klebrige Substanz (S) den Kopf des Spermatozoons bedeckt.(D) 1000-fache Vergrößerung.
Mittels Transmissionselektronenmikroskopie (Abb. 7A) wurde außerdem festgestellt, dass die Spermienköpfe verdreht waren und die Kerne eine Spiralform aufwiesen, was durch mit Acridinorange gefärbte und fluoreszenzmikroskopisch untersuchte Spermienabstriche bestätigt wurde (Abb. 7B).
(A) Digitale Farbtransmissionselektronenmikroskopaufnahme und (B) mit Acridinorange gefärbter Spermienausstrich, der gewundene Köpfe und die Befestigung von Spermienköpfen und -schwänzen zeigt (Pfeile).(B) 1000-fache Vergrößerung.
Ein interessanter Befund ist, dass sich die Spermien von Sharkazi zu beweglichen Fadenbündeln zusammenlagern.Die Eigenschaften dieser Bündel ermöglichen es uns, ihre mögliche Rolle bei der Absorption und Speicherung von Spermatozoen im SST zu verstehen.
Nach der Paarung gelangen die Spermien in die Vagina und durchlaufen einen intensiven Selektionsprozess, der dazu führt, dass nur eine begrenzte Anzahl von Spermien in den SST gelangt15,16.Bisher sind die Mechanismen, durch die Spermien in den SST gelangen und ihn verlassen, unklar.Bei Geflügel werden die Spermien je nach Tierart über einen längeren Zeitraum von 2 bis 10 Wochen im SST gelagert6.Es bestehen weiterhin Kontroversen über den Zustand des Spermas während der Lagerung im SST.Sind sie in Bewegung oder ruhen sie?Mit anderen Worten: Wie behalten Spermien ihre Position im SST so lange bei?
Forman4 schlug vor, dass der Aufenthalt und Auswurf von SST durch die Beweglichkeit der Spermien erklärt werden könnte.Die Autoren gehen davon aus, dass Spermien ihre Position beibehalten, indem sie gegen den vom SST-Epithel erzeugten Flüssigkeitsstrom schwimmen, und dass Spermien aus dem SST ausgestoßen werden, wenn ihre Geschwindigkeit unter den Punkt fällt, an dem sie aufgrund von Energiemangel beginnen, sich rückwärts zu bewegen.Zaniboni5 bestätigte das Vorhandensein der Aquaporine 2, 3 und 9 im apikalen Teil der SST-Epithelzellen, was indirekt das Spermienspeichermodell von Foreman unterstützen könnte.In der aktuellen Studie haben wir herausgefunden, dass fast die Hälfte der Spermien von Sharkashi in der fließenden Flüssigkeit eine positive Rheologie aufweisen und dass agglutinierte Spermienbündel die Anzahl der Spermien mit positiver Rheologie erhöhen, obwohl die Agglutination sie verlangsamt.Wie Spermien durch den Eileiter des Vogels zur Befruchtungsstelle gelangen, ist nicht vollständig geklärt.Bei Säugetieren lockt die Follikelflüssigkeit Spermatozoen an.Man geht jedoch davon aus, dass Chemoattraktoren Spermien dazu veranlassen, sich über weite Distanzen zu nähern7.Daher sind für den Spermientransport andere Mechanismen verantwortlich.Es wurde berichtet, dass die Fähigkeit der Spermien, sich zu orientieren und gegen die nach der Paarung freigesetzte Eileiterflüssigkeit zu fließen, ein wichtiger Faktor bei der gezielten Spermienbekämpfung bei Mäusen ist.Parker 17 schlug vor, dass Spermien die Eileiter durch Schwimmen gegen den Ziliarstrom bei Vögeln und Reptilien passieren.Obwohl dies bei Vögeln nicht experimentell nachgewiesen wurde, war Adolphi18 der Erste, der herausfand, dass Vogelsperma positive Ergebnisse liefert, wenn mit einem Streifen Filterpapier eine dünne Flüssigkeitsschicht zwischen Deckglas und Objektträger erzeugt wird.Rheologie.Hino und Yanagimachi [19] platzierten einen Maus-Eierstock-Tuben-Uterus-Komplex in einem Perfusionsring und injizierten 1 µl Tinte in den Isthmus, um den Flüssigkeitsfluss in den Eileitern sichtbar zu machen.Sie bemerkten eine sehr aktive Kontraktions- und Entspannungsbewegung im Eileiter, bei der sich alle Tintenkügelchen stetig in Richtung der Ampulle des Eileiters bewegten.Die Autoren betonen die Bedeutung des Eileiterflüssigkeitsflusses vom unteren zum oberen Eileiter für die Hebung und Befruchtung der Spermien.Brillard20 berichtete, dass Spermien bei Hühnern und Puten durch aktive Bewegung vom Vaginaleingang, wo sie gespeichert werden, zum uterovaginalen Übergang wandern, wo sie gespeichert werden.Diese Bewegung zwischen Uterovaginalübergang und Infundibulum ist jedoch nicht erforderlich, da der Transport der Spermien durch passive Verdrängung erfolgt.In Kenntnis dieser bisherigen Empfehlungen und der in der aktuellen Studie erzielten Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass die Fähigkeit der Spermien, sich stromaufwärts zu bewegen (Rheologie), eine der Eigenschaften ist, die dem Auswahlprozess zugrunde liegen.Dies bestimmt den Durchgang der Spermien durch die Vagina und ihren Eintritt in den CCT zur Lagerung.Wie Forman4 vermutete, könnte dies auch den Prozess erleichtern, dass Spermien für eine gewisse Zeit in das SST und seinen Lebensraum eindringen und es dann wieder verlassen, wenn ihre Geschwindigkeit nachlässt.
Andererseits schlugen Matsuzaki und Sasanami 21 vor, dass Vogelspermien im männlichen und weiblichen Fortpflanzungstrakt Motilitätsänderungen von der Ruhephase zur Motilität erfahren.Als Erklärung für die lange Lagerungszeit der Spermien und die anschließende Verjüngung nach dem Verlassen des SST wurde eine Hemmung der Motilität der im SST vorhandenen Spermien vorgeschlagen.Unter hypoxischen Bedingungen haben Matsuzaki et al.1 berichtete über eine hohe Produktion und Freisetzung von Laktat im SST, was zu einer Hemmung der Motilität der ansässigen Spermien führen kann.In diesem Fall spiegelt sich die Bedeutung der Spermienrheologie in der Auswahl und Absorption der Spermien wider und nicht in ihrer Lagerung.
Das Agglutinationsmuster der Spermien gilt als plausible Erklärung für die lange Lagerungsdauer der Spermien im SST, da es sich hierbei um ein häufiges Muster der Spermienretention bei Geflügel handelt2,22,23.Bakst et al.2 beobachteten, dass die meisten Spermien aneinander hafteten und faszikuläre Aggregate bildeten, und einzelne Spermien wurden bei Wachtel-CCM selten gefunden.Andererseits haben Wen et al.24 beobachteten mehr verstreute Spermien und weniger Spermienbüschel im SST-Lumen bei Hühnern.Aufgrund dieser Beobachtungen kann davon ausgegangen werden, dass die Neigung zur Spermienagglutination zwischen Vögeln und zwischen Spermien im selben Ejakulat unterschiedlich ist.Darüber hinaus haben Van Krey et al.9 schlugen vor, dass die zufällige Dissoziation agglutinierter Spermien für das allmähliche Eindringen von Spermien in das Lumen des Eileiters verantwortlich ist.Nach dieser Hypothese sollten Spermien mit geringerer Agglutinationskapazität zuerst aus dem SST ausgestoßen werden.In diesem Zusammenhang kann die Fähigkeit der Spermien zur Agglutination ein Faktor sein, der das Ergebnis der Spermienkonkurrenz bei schmutzigen Vögeln beeinflusst.Darüber hinaus bleibt die Fruchtbarkeit umso länger erhalten, je länger die agglutinierten Spermien dissoziieren.
Obwohl in mehreren Studien2,22,24 die Aggregation und Aggregation von Spermien zu Bündeln beobachtet wurde, wurden sie aufgrund der Komplexität ihrer kinematischen Beobachtung innerhalb des SST nicht im Detail beschrieben.Es wurden mehrere Versuche unternommen, die Spermienagglutination in vitro zu untersuchen.Eine ausgedehnte, aber vorübergehende Aggregation wurde beobachtet, als der dünne Draht vom herabhängenden Samentropfen entfernt wurde.Dies führt dazu, dass aus dem Tropfen eine längliche Blase herausragt, die die Samendrüse imitiert.Aufgrund von 3D-Einschränkungen und kurzen Abtropfzeiten verfiel der gesamte Block schnell9.In der aktuellen Studie konnten wir mithilfe von Sharkashi-Hühnern und mikrofluidischen Chips beschreiben, wie diese Büschel entstehen und wie sie sich bewegen.Unmittelbar nach der Samengewinnung bildeten sich Spermienbündel, die sich spiralförmig bewegten und eine positive Rheologie zeigten, wenn sie im Fluss vorhanden waren.Darüber hinaus wurde bei makroskopischer Betrachtung beobachtet, dass Spermienbündel im Vergleich zu isolierten Spermien die Linearität der Motilität erhöhen.Dies deutet darauf hin, dass es vor der SST-Penetration zu einer Spermienagglutination kommen kann und dass die Spermienproduktion aufgrund von Stress nicht auf einen kleinen Bereich beschränkt ist, wie zuvor vermutet (Tingari und Lake12).Während der Büschelbildung schwimmen die Spermien synchron, bis sie eine Verbindung bilden, dann wickeln sich ihre Schwänze umeinander und der Kopf des Spermiums bleibt frei, aber der Schwanz und der distale Teil des Spermiums kleben mit einer klebrigen Substanz zusammen.Daher ist der freie Kopf des Bandes für die Bewegung verantwortlich und zieht den Rest des Bandes mit.Die Rasterelektronenmikroskopie der Spermienbündel zeigte, dass die Spermienköpfe mit viel klebrigem Material bedeckt waren, was darauf hindeutet, dass die Spermienköpfe in ruhenden Bündeln befestigt waren, was möglicherweise nach Erreichen der Lagerstelle (SST) geschehen war.
Wenn ein Spermienausstrich mit Acridinorange gefärbt wird, ist unter dem Fluoreszenzmikroskop extrazelluläres Klebematerial um die Spermien herum zu erkennen.Diese Substanz ermöglicht es den Spermienbündeln, an allen umgebenden Oberflächen oder Partikeln zu haften und sich daran festzuhalten, so dass sie nicht mit der umgebenden Strömung treiben.Somit zeigen unsere Beobachtungen die Rolle der Spermienadhäsion in Form mobiler Bündel.Ihre Fähigkeit, gegen den Strom zu schwimmen und an nahe gelegenen Oberflächen zu haften, ermöglicht es den Spermien, länger im SST zu bleiben.
Rothschild25 verwendete eine Hämozytometriekamera, um die schwebende Verteilung von Rindersperma in einem Suspensionstropfen zu untersuchen, indem er Mikrofotografien durch eine Kamera mit sowohl vertikaler als auch horizontaler optischer Achse des Mikroskops machte.Die Ergebnisse zeigten, dass die Spermien von der Oberfläche der Kammer angezogen wurden.Die Autoren vermuten, dass es hydrodynamische Wechselwirkungen zwischen den Spermien und der Oberfläche geben könnte.Berücksichtigt man dies und die Fähigkeit des Samens von Sharkashi-Küken, klebrige Büschel zu bilden, erhöht sich möglicherweise die Wahrscheinlichkeit, dass der Samen an der SST-Wand haften bleibt und über einen längeren Zeitraum gelagert wird.
Bccetti und Afzeliu26 berichteten, dass die Glykokalyx der Spermien für die Gametenerkennung und -agglutination erforderlich ist.Forman10 beobachtete, dass die Hydrolyse von α-glykosidischen Bindungen in Glykoprotein-Glykolipid-Beschichtungen durch die Behandlung von Vogelsamen mit Neuraminidase zu einer verminderten Fruchtbarkeit führte, ohne die Beweglichkeit der Spermien zu beeinträchtigen.Die Autoren vermuten, dass die Wirkung von Neuraminidase auf die Glykokalyx die Spermiensequestrierung am uterovaginalen Übergang beeinträchtigt und dadurch die Fruchtbarkeit verringert.Ihre Beobachtungen können die Möglichkeit nicht ignorieren, dass die Behandlung mit Neuraminidase die Erkennung von Spermien und Eizellen verringern kann.Forman und Engel10 fanden heraus, dass die Fruchtbarkeit verringert war, wenn Hennen intravaginal mit mit Neuraminidase behandeltem Sperma besamt wurden.Allerdings hatte die IVF mit Neuraminidase-behandeltem Sperma im Vergleich zu Kontrollhühnern keinen Einfluss auf die Fruchtbarkeit.Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass Veränderungen in der Glykoprotein-Glykolipid-Beschichtung um die Spermienmembran die Fähigkeit der Spermien zur Befruchtung verringerten, indem sie die Sequestrierung von Spermien an der uterovaginalen Verbindung beeinträchtigten, was wiederum den Spermienverlust aufgrund der Geschwindigkeit der uterovaginalen Verbindung erhöhte, die Erkennung von Spermien und Eizellen jedoch nicht beeinträchtigte.
Bei Truthähnen fanden Bakst und Bauchan 11 kleine Bläschen und Membranfragmente im Lumen des SST und beobachteten, dass einige dieser Körnchen mit der Spermienmembran verschmolzen waren.Die Autoren vermuten, dass diese Beziehungen zur Langzeitspeicherung von Spermien im SST beitragen könnten.Die Forscher machten jedoch keine Angaben zur Quelle dieser Partikel, ob sie von CCT-Epithelzellen abgesondert werden, vom männlichen Fortpflanzungssystem produziert und abgesondert werden oder vom Sperma selbst produziert werden.Außerdem sind diese Partikel für die Agglutination verantwortlich.Grützner et al27 berichteten, dass Nebenhodenepithelzellen ein spezifisches Protein produzieren und absondern, das für die Bildung einporiger Samenbahnen erforderlich ist.Die Autoren berichten auch, dass die Streuung dieser Bündel von der Interaktion epididymaler Proteine ​​abhängt.Nixon et al28 fanden heraus, dass die Adnexe ein Protein absondern, das saure, cysteinreiche Osteonectin;SPARC ist an der Bildung von Spermienbüscheln bei Kurzschnabeligeln und Schnabeltieren beteiligt.Die Streuung dieser Strahlen ist mit dem Verlust dieses Proteins verbunden.
In der aktuellen Studie zeigte die Ultrastrukturanalyse mittels Elektronenmikroskopie, dass die Spermien an einer großen Menge dichtem Material hafteten.Es wird angenommen, dass diese Substanzen für die Agglutination verantwortlich sind, die zwischen und um die anhaftenden Köpfe herum kondensiert, jedoch in geringeren Konzentrationen im Schwanzbereich.Wir gehen davon aus, dass diese agglutinierende Substanz zusammen mit der Samenflüssigkeit aus dem männlichen Fortpflanzungssystem (Nebenhoden oder Samenleiter) ausgeschieden wird, da wir bei der Ejakulation oft beobachten, wie sich die Samenflüssigkeit von der Lymphe und dem Samenplasma löst.Es wurde berichtet, dass Vogelspermien, wenn sie den Nebenhoden und den Samenleiter passieren, reifungsbedingte Veränderungen durchlaufen, die ihre Fähigkeit unterstützen, Proteine ​​zu binden und Plasma-Lemma-assoziierte Glykoproteine ​​zu erwerben.Die Persistenz dieser Proteine ​​auf residenten Spermienmembranen im SST legt nahe, dass diese Proteine ​​den Erwerb der Stabilität der Spermienmembran beeinflussen können 30 und ihre Fruchtbarkeit bestimmen 31 .Ahammad et al.32 berichteten, dass Spermien, die aus verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystems (von den Hoden bis zum distalen Samenleiter) gewonnen wurden, unter flüssigen Lagerungsbedingungen unabhängig von der Lagertemperatur eine progressive Steigerung der Lebensfähigkeit zeigten, und dass die Lebensfähigkeit bei Hühnern nach künstlicher Befruchtung auch in den Eileitern zunimmt.
Spermabüschel von Sharkashi-Hühnern haben andere Eigenschaften und Funktionen als andere Arten wie Ameisenigel, Schnabeltiere, Waldmäuse, Hirschratten und Meerschweinchen.Bei Sharkasi-Hühnern reduzierte die Bildung von Spermatozoenbündeln ihre Schwimmgeschwindigkeit im Vergleich zu einzelnen Spermatozoen.Allerdings erhöhten diese Bündel den Anteil rheologisch positiver Spermien und steigerten die Fähigkeit der Spermien, sich in einer dynamischen Umgebung zu stabilisieren.Somit bestätigen unsere Ergebnisse die vorherige Vermutung, dass die Spermienagglutination bei SST mit einer langfristigen Spermienspeicherung verbunden ist.Wir gehen auch davon aus, dass die Neigung der Spermien, Büschel zu bilden, die Rate des Spermienverlusts bei SST steuern kann, was das Ergebnis der Spermienkonkurrenz verändern kann.Nach dieser Annahme setzen Spermien mit geringer Agglutinationskapazität zuerst SST frei, während Spermien mit hoher Agglutinationskapazität den Großteil der Nachkommen hervorbringen.Die Bildung einporiger Spermienbündel ist vorteilhaft und beeinflusst das Eltern-Kind-Verhältnis, nutzt jedoch einen anderen Mechanismus.Bei Ameisenigeln und Schnabeltieren sind die Spermien parallel zueinander angeordnet, um die Vorwärtsgeschwindigkeit des Strahls zu erhöhen.Ameisenigelbündel bewegen sich etwa dreimal schneller als einzelne Spermien.Es wird angenommen, dass die Bildung solcher Spermienbüschel bei Ameisenigeln eine evolutionäre Anpassung zur Aufrechterhaltung der Dominanz darstellt, da Weibchen promiskuitiv sind und sich normalerweise mit mehreren Männchen paaren.Daher konkurrieren Spermien aus verschiedenen Ejakulaten stark um die Befruchtung der Eizelle.
Agglutinierte Spermien von Sharkasi-Hühnern lassen sich mithilfe der Phasenkontrastmikroskopie leicht sichtbar machen, was als vorteilhaft angesehen wird, da es eine einfache Untersuchung des Verhaltens von Spermien in vitro ermöglicht.Der Mechanismus, durch den die Bildung von Spermienbüscheln die Fortpflanzung bei Sharkasi-Hühnern fördert, unterscheidet sich auch von dem Mechanismus, der bei einigen Plazenta-Säugetieren beobachtet wird, die ein kooperatives Spermienverhalten zeigen, beispielsweise bei Waldmäusen, bei denen einige Spermien die Eier erreichen und anderen verwandten Individuen helfen, ihre Eier zu erreichen und zu beschädigen.um dich zu beweisen.altruistisches Verhalten.Selbstbefruchtung 34. Ein weiteres Beispiel für kooperatives Verhalten bei Spermien wurde bei Hirschmäusen gefunden, bei denen Spermien in der Lage waren, die genetisch am stärksten verwandten Spermien zu identifizieren und sich mit ihnen zu verbinden und kooperative Gruppen zu bilden, um ihre Geschwindigkeit im Vergleich zu nicht verwandten Spermien zu erhöhen35.
Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse widersprechen nicht Fomans Theorie der Langzeitlagerung von Spermien bei SWS.Die Forscher berichten, dass sich Spermien über einen längeren Zeitraum hinweg im Fluss der Epithelzellen, die das SST auskleiden, weiterbewegen und nach einer gewissen Zeit die Energiespeicher der Spermien aufgebraucht sind, was zu einer Verringerung der Geschwindigkeit führt, was das Ausstoßen von Substanzen mit geringem Molekulargewicht ermöglicht.Energie der Spermien mit dem Flüssigkeitsfluss aus dem Lumen des SST, der Höhle des Eileiters.In der aktuellen Studie haben wir beobachtet, dass die Hälfte der einzelnen Spermien die Fähigkeit zeigten, gegen fließende Flüssigkeiten zu schwimmen, und dass ihre Adhäsion im Bündel ihre Fähigkeit erhöhte, eine positive Rheologie zu zeigen.Darüber hinaus stimmen unsere Daten mit denen von Matsuzaki et al. überein.1, der berichtete, dass eine erhöhte Laktatsekretion bei SST die Motilität residenter Spermien hemmen kann.Unsere Ergebnisse beschreiben jedoch die Bildung beweglicher Spermienbänder und ihr rheologisches Verhalten in Gegenwart einer dynamischen Umgebung innerhalb eines Mikrokanals, um deren Verhalten bei SST aufzuklären.Zukünftige Forschungen könnten sich auf die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung und des Ursprungs des Agglutinationsmittels konzentrieren, was den Forschern zweifellos dabei helfen wird, neue Möglichkeiten zur Lagerung von flüssigem Sperma zu entwickeln und die Dauer der Fruchtbarkeit zu verlängern.
Fünfzehn 30 Wochen alte männliche Sharkasi mit nacktem Hals (homozygot dominant; Na Na) wurden in der Studie als Samenspender ausgewählt.Die Vögel wurden auf der Forschungsgeflügelfarm der Fakultät für Landwirtschaft der Ashit-Universität im Gouvernement Ashit, Ägypten, aufgezogen.Die Vögel wurden in Einzelkäfigen (30 x 40 x 40 cm) gehalten, einem Lichtprogramm (16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit) ausgesetzt und mit einer Diät gefüttert, die jeweils 160 g Rohprotein, 2800 kcal metabolische Energie und 35 g Kalzium enthielt.5 Gramm verfügbarer Phosphor pro Kilogramm Nahrung.
Den Daten 36, 37 zufolge wurde Sperma von Männern durch Bauchmassage gewonnen.Insgesamt wurden über einen Zeitraum von drei Tagen 45 Samenproben von 15 Männern entnommen.Das Sperma (n = 15/Tag) wurde sofort 1:1 (v:v) mit Belsville Poultry Semen Diluent verdünnt, das Kaliumdiphosphat (1,27 g), Mononatriumglutamat-Monohydrat (0,867 g), Fructose (0,5 d) und wasserfreies Natrium enthält.Acetat (0,43 g), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (0,195 g), Kaliumcitrat-Monohydrat (0,064 g), Kaliummonophosphat (0,065 g), Magnesiumchlorid (0,034 g) und H2O (100 ml), pH = 7, 5, Osmolarität 333 mOsm/kg38.Verdünnte Samenproben wurden zunächst unter einem Lichtmikroskop untersucht, um eine gute Samenqualität (Feuchtigkeit) sicherzustellen, und dann bis zur Verwendung innerhalb einer halben Stunde nach der Entnahme in einem Wasserbad bei 37 °C gelagert.
Die Kinematik und Rheologie von Spermien werden mithilfe eines Systems mikrofluidischer Geräte beschrieben.Samenproben wurden in Beltsville Avian Semen Diluent weiter auf 1:40 verdünnt, in ein Mikrofluidikgerät geladen (siehe unten) und kinetische Parameter wurden mithilfe eines Computerized Semen Analysis (CASA)-Systems bestimmt, das zuvor für die Charakterisierung von Mikrofluidik entwickelt wurde.zur Mobilität von Spermatozoen in flüssigen Medien (Fakultät für Maschinenbau, Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Universität Assiut, Ägypten).Das Plugin kann unter http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39 heruntergeladen werden.Gemessen wurden die Kurvengeschwindigkeit (VCL, μm/s), die lineare Geschwindigkeit (VSL, μm/s) und die durchschnittliche Flugbahngeschwindigkeit (VAP, μm/s).Videos von Spermien wurden mit einem invertierten Optika XDS-3-Phasenkontrastmikroskop (mit 40-fachem Objektiv), das an eine Tucson ISH1000-Kamera angeschlossen war, 3 s lang mit 30 fps aufgenommen.Verwenden Sie die CASA-Software, um mindestens drei Bereiche und 500 Spermienbahnen pro Probe zu untersuchen.Das aufgenommene Video wurde mit einem selbstgebauten CASA verarbeitet.Die Definition der Motilität im CASA-Plug-in basiert auf der Schwimmgeschwindigkeit der Spermien im Vergleich zur Flussrate und berücksichtigt keine anderen Parameter wie die Seitwärtsbewegung, da sich diese beim Flüssigkeitsfluss als zuverlässiger erwiesen hat.Unter rheologischer Bewegung versteht man die Bewegung von Spermien entgegen der Richtung des Flüssigkeitsflusses.Spermatozoen mit rheologischen Eigenschaften wurden durch die Anzahl beweglicher Spermatozoen dividiert;Ruhende und sich konvektiv bewegende Spermien wurden von der Zählung ausgeschlossen.
Sofern nicht anders angegeben, wurden alle verwendeten Chemikalien von Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Ägypten) bezogen.Das Gerät wurde wie von El-sherry et al. beschrieben hergestellt.40 mit einigen Modifikationen.Zu den zur Herstellung der Mikrokanäle verwendeten Materialien gehörten Glasplatten (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25-Negativresist (MicroChem, Newton, CA), Diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) und Polyaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanäle werden mittels Softlithographie hergestellt.Zunächst wurde eine durchsichtige Schutzmaske mit dem gewünschten Mikrokanaldesign auf einem hochauflösenden Drucker (Prismatic, Kairo, Ägypten und Pacific Arts and Design, Markham, ON) gedruckt.Die Master wurden unter Verwendung von Glasplatten als Trägermaterial hergestellt.Die Platten wurden in Aceton, Isopropanol und entionisiertem Wasser gereinigt und anschließend durch Schleuderbeschichtung (3000 U/min, 1 Minute) mit einer 20 µm dicken Schicht SU8-25 beschichtet.Anschließend wurden die SU-8-Schichten schonend getrocknet (65 °C, 2 Min. und 95 °C, 10 Min.) und 50 Sek. lang UV-Strahlung ausgesetzt.Nach der Belichtung 1 Minute und 4 Minuten bei 65 °C und 95 °C backen, um die belichteten SU-8-Schichten zu vernetzen, gefolgt von einer 6,5-minütigen Entwicklung in Diacetonalkohol.Backen Sie die Waffeln hart (200 °C für 15 Minuten), um die SU-8-Schicht weiter zu verfestigen.
PDMS wurde durch Mischen von Monomer und Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 hergestellt, dann in einem Vakuumexsikkator entgast und auf den SU-8-Hauptrahmen gegossen.Das PDMS wurde in einem Ofen (120 °C, 30 Min.) ausgehärtet, dann wurden die Kanäle ausgeschnitten, vom Master getrennt und perforiert, um die Anbringung von Röhrchen am Ein- und Auslass des Mikrokanals zu ermöglichen.Schließlich wurden PDMS-Mikrokanäle mithilfe eines tragbaren Corona-Prozessors (Electro-Technic Products, Chicago, IL), wie an anderer Stelle beschrieben, dauerhaft an Objektträgern befestigt.Der in dieser Studie verwendete Mikrokanal misst 200 µm × 20 µm (B × H) und ist 3,6 cm lang.
Der durch den hydrostatischen Druck im Mikrokanal induzierte Flüssigkeitsfluss wird dadurch erreicht, dass der Flüssigkeitsspiegel im Einlassreservoir über dem Höhenunterschied Δh39 im Auslassreservoir gehalten wird (Abb. 1).
Dabei ist f der Reibungskoeffizient, definiert als f = C/Re für laminare Strömung in einem rechteckigen Kanal, wobei C eine vom Seitenverhältnis des Kanals abhängige Konstante ist, L die Länge des Mikrokanals ist, Vav die durchschnittliche Geschwindigkeit innerhalb des Mikrokanals ist, Dh der hydraulische Durchmesser des Kanals ist, g – Erdbeschleunigung.Mithilfe dieser Gleichung kann die durchschnittliche Kanalgeschwindigkeit anhand der folgenden Gleichung berechnet werden: