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Die Fruchtbarkeit von Vögeln hängt von ihrer Fähigkeit ab, über einen längeren Zeitraum genügend lebensfähige Spermien in den Spermienspeicherkanälchen (SST) zu speichern. Der genaue Mechanismus, durch den Spermien in die SST gelangen, sich darin verweilen und sie verlassen, ist weiterhin umstritten. Die Spermien von Sharkasi-Hühnern zeigten eine hohe Tendenz zur Agglutination und bildeten bewegliche, filamentöse Bündel mit vielen Zellen. Da es schwierig ist, die Motilität und das Verhalten von Spermien in einem undurchsichtigen Eileiter zu beobachten, verwendeten wir zur Untersuchung der Agglutination und Motilität der Spermien ein mikrofluidisches Gerät mit einem Mikrokanalquerschnitt ähnlich dem von Spermien. Diese Studie erörtert, wie sich Spermienbündel bilden, wie sie sich bewegen und welche mögliche Rolle sie bei der Verlängerung der Verweildauer der Spermien in den SST spielen. Wir untersuchten die Geschwindigkeit und das rheologische Verhalten der Spermien, als innerhalb eines mikrofluidischen Kanals durch hydrostatischen Druck ein Flüssigkeitsfluss erzeugt wurde (Flussrate = 33 µm/s). Die Spermien neigen dazu, gegen den Strom zu schwimmen (positive Rheologie), und die Geschwindigkeit des Spermienbündels ist im Vergleich zu einzelnen Spermien deutlich reduziert. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel spiralförmig bewegen und mit zunehmender Anzahl einzelner Spermien an Länge und Dicke zunehmen. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der Mikrofluidkanäle näherten und an ihnen haften blieben, um zu vermeiden, dass sie von einer Strömungsgeschwindigkeit von > 33 µm/s mitgerissen wurden. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der Mikrofluidkanäle näherten und an ihnen haften blieben, um zu vermeiden, dass sie von einer Strömungsgeschwindigkeit von > 33 µm/s mitgerissen wurden. Aus diesem Grund werden Spermien-Spermafilme mit vielen Kanälen von Mikrowellensendern verwendet und verwendet, sodass sie mit der Zeit verbunden sind потока жидкости> 33 мкм / с. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden der Mikrofluidkanäle nähern und an ihnen haften, um bei Flüssigkeitsströmungsraten von >33 µm/s nicht weggespült zu werden.Die Geschwindigkeit beträgt 33 µm/s.33 µm/s beträgt ca. Aus diesem Grund werden Spermien-Spritzpistolen in eine große Anzahl von Mikrokanälen eingebracht und verwendet, sodass sie eine geringe Belastung für die Gesundheit darstellen mit einer Geschwindigkeit von > 33 Millionen Kubikmetern pro Sekunde. Es wurde beobachtet, dass sich Spermienbündel den Seitenwänden des Mikrofluidkanals nähern und an ihnen haften, um zu vermeiden, dass sie von einer Flüssigkeitsströmung mit >33 µm/s weggespült werden.Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie zeigten, dass die Spermienbündel von reichlich dichtem Material getragen wurden. Die erhaltenen Daten belegen die einzigartige Mobilität der Sharkazi-Hühnerspermien sowie ihre Fähigkeit, zu agglutinieren und bewegliche Bündel zu bilden. Dies trägt zu einem besseren Verständnis der Langzeitlagerung von Spermien in SMT bei.
Damit es bei Menschen und den meisten Tieren zu einer Befruchtung kommt, müssen Spermien und Eizellen zum richtigen Zeitpunkt am Befruchtungsort eintreffen. Die Paarung muss daher vor oder zum Zeitpunkt des Eisprungs erfolgen. Manche Säugetiere wie Hunde sowie andere Arten wie Insekten, Fische, Reptilien und Vögel hingegen speichern Spermien für einen längeren Zeitraum in ihren Fortpflanzungsorganen, bis ihre Eizellen zur Befruchtung bereit sind (asynchrone Befruchtung 1 ). Vögel können die Lebensfähigkeit von Spermien, die zur Befruchtung von Eizellen befähigt sind, 2–10 Wochen lang aufrechterhalten2.
Dies ist ein einzigartiges Merkmal, das Vögel von anderen Tieren unterscheidet, da es eine hohe Befruchtungswahrscheinlichkeit nach einmaliger Befruchtung über mehrere Wochen ohne gleichzeitige Paarung und Eisprung ermöglicht. Das wichtigste Spermienspeicherorgan, der sogenannte Spermienspeichertubulus (SST), befindet sich in den inneren Schleimhautfalten am uterovaginalen Übergang. Bis heute sind die Mechanismen, durch die Spermien in die Samenbank gelangen, sich dort aufhalten und sie verlassen, nicht vollständig verstanden. Basierend auf früheren Studien wurden viele Hypothesen aufgestellt, von denen jedoch keine bestätigt wurde.
Forman4 stellte die Hypothese auf, dass Spermien ihren Aufenthalt in der SST-Höhle durch kontinuierliche oszillierende Bewegung entgegen der Flüssigkeitsströmungsrichtung durch Proteinkanäle auf den SST-Epithelzellen aufrechterhalten (Rheologie). ATP wird aufgrund der ständigen Flagellenaktivität, die erforderlich ist, um die Spermien im SST-Lumen zu halten, erschöpft und die Motilität nimmt schließlich ab, bis die Spermien durch den Flüssigkeitsstrom aus der Spermienbank befördert werden und eine neue Reise durch den aufsteigenden Eileiter antreten, um die Eizelle zu befruchten (Forman4). Dieses Modell der Spermienspeicherung wird durch den immunzytochemischen Nachweis der Aquaporine 2, 3 und 9 in SST-Epithelzellen gestützt. Bislang fehlen Studien zur Rheologie von Hühnersamen und ihrer Rolle bei der SST-Speicherung, der vaginalen Spermienauswahl und der Spermienkonkurrenz. Bei Hühnern gelangen Spermien nach der natürlichen Paarung in die Vagina, aber mehr als 80 % der Spermien werden kurz nach der Paarung aus der Vagina ausgestoßen. Dies deutet darauf hin, dass die Vagina der primäre Ort der Spermienselektion bei Vögeln ist. Darüber hinaus wurde berichtet, dass weniger als 1 % der in der Vagina befruchteten Spermien in SSTs landen.2 Bei der künstlichen Befruchtung von Küken in der Vagina steigt die Zahl der Spermien, die die SSTs erreichen, 24 Stunden nach der Befruchtung tendenziell an. Der Mechanismus der Spermienselektion während dieses Prozesses ist bisher unklar, und die Spermienmotilität könnte eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Spermien in SSTs spielen. Aufgrund der dicken und undurchsichtigen Wände der Eileiter ist es schwierig, die Spermienmotilität in den Eileitern von Vögeln direkt zu überwachen. Daher fehlt uns grundlegendes Wissen darüber, wie Spermien nach der Befruchtung in die SSTs übergehen.
Die Rheologie wurde kürzlich als wichtiger Faktor für den Spermientransport in den Genitalien von Säugetieren erkannt. Basierend auf der Fähigkeit beweglicher Spermien, im Gegenstrom zu wandern, nutzten Zaferani et al.8 ein Corra-Mikrofluidiksystem, um bewegliche Spermien passiv aus gefangenen Samenproben zu isolieren. Diese Art der Samensortierung ist für die medizinische Unfruchtbarkeitsbehandlung und die klinische Forschung unerlässlich und wird herkömmlichen Methoden vorgezogen, die zeit- und arbeitsintensiv sind und die Morphologie und strukturelle Integrität der Spermien beeinträchtigen können. Bisher wurden jedoch keine Studien zum Einfluss von Sekreten aus den Geschlechtsorganen von Hühnern auf die Spermienmotilität durchgeführt.
Unabhängig vom Mechanismus, der die Spermien im SST speichert, haben viele Forscher beobachtet, dass sich die Spermien im SST von Hühnern (9, 10), Wachteln (2) und Truthähnen (11) Kopf an Kopf agglutinieren und so agglutinierte Spermienbündel bilden. Die Autoren vermuten einen Zusammenhang zwischen dieser Agglutination und der Langzeitspeicherung der Spermien im SST.
Tingari und Lake12 berichteten von einer starken Assoziation zwischen Spermien in der Spermienempfangsdrüse des Huhns und stellten die Frage, ob Vogelspermien auf die gleiche Weise agglutinieren wie Säugetierspermien. Sie vermuten, dass die tiefen Verbindungen zwischen den Spermien im Samenleiter auf den Stress zurückzuführen sein könnten, der durch die Anwesenheit einer großen Anzahl von Spermien auf kleinem Raum entsteht.
Bei der Untersuchung des Verhaltens von Spermien auf frischen, hängenden Objektträgern lassen sich vorübergehende Anzeichen von Agglutination beobachten, insbesondere an den Rändern der Samentröpfchen. Die Agglutination wurde jedoch häufig durch die mit der kontinuierlichen Bewegung verbundene Rotationsbewegung gestört, was die vorübergehende Natur dieses Phänomens erklärt. Die Forscher stellten außerdem fest, dass nach Zugabe des Verdünnungsmittels zum Sperma längliche, fadenförmige Zellaggregate entstanden.
Frühe Versuche, ein Spermium zu imitieren, wurden unternommen, indem ein dünner Draht von einem hängenden Tropfen entfernt wurde, wodurch ein längliches, spermienähnliches Bläschen entstand, das aus dem Samentropfen herausragte. Die Spermien ordneten sich innerhalb des Bläschens sofort parallel an, doch aufgrund der 3D-Beschränkung verschwand die gesamte Einheit schnell. Um die Spermienagglutination zu studieren, ist es daher notwendig, die Motilität und das Verhalten der Spermien direkt in isolierten Spermienspeicherkanälchen zu beobachten, was schwierig zu erreichen ist. Deshalb ist es notwendig, ein Instrument zu entwickeln, das Spermien imitiert, um Studien zur Spermienmotilität und zum Agglutinationsverhalten zu unterstützen. Brillard et al13 berichteten, dass die durchschnittliche Länge der Spermienspeicherkanälchen bei erwachsenen Hühnern 400 bis 600 µm beträgt, manche SSTs jedoch bis zu 2000 µm lang sein können. Mero und Ogasawara14 unterteilten die Samendrüsen in vergrößerte und nicht vergrößerte Spermienspeicherkanälchen, die beide dieselbe Länge (~500 µm) und Halsbreite (~38 µm) aufwiesen, aber der mittlere Lumendurchmesser der Kanälchen betrug 56,6 bzw. 11,2 µm. In der vorliegenden Studie verwendeten wir ein Mikrofluidikgerät mit einer Kanalgröße von 200 µm × 20 µm (B × H), dessen Querschnitt ziemlich nahe an dem des verstärkten SST liegt. Außerdem untersuchten wir die Spermienmotilität und das Agglutinationsverhalten in fließender Flüssigkeit, was mit Foremans Hypothese übereinstimmt, dass von SST-Epithelzellen produzierte Flüssigkeit die Spermien in Gegenstromrichtung (rheologisch) im Lumen hält.
Ziel dieser Studie war es, die Probleme bei der Beobachtung der Spermienmotilität im Eileiter zu überwinden und die Schwierigkeiten bei der Untersuchung der Rheologie und des Verhaltens von Spermien in einer dynamischen Umgebung zu umgehen. Ein mikrofluidisches Gerät erzeugt hydrostatischen Druck, um die Spermienmotilität in den Genitalien eines Huhns zu simulieren.
Als ein Tropfen einer verdünnten Spermienprobe (1:40) in das Mikrokanalgerät gegeben wurde, konnten zwei Arten der Spermienmotilität identifiziert werden (isolierte Spermien und gebundene Spermien). Darüber hinaus neigten Spermien dazu, gegen den Strom zu schwimmen (positive Rheologie; Video 1, 2). Obwohl Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit als einzelne Spermien aufwiesen (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien mit positiver Rheotaxis (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit als einzelne Spermien aufwiesen (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien mit positiver Rheotaxis (p < 0,001; Tabelle 2). Bei den Spermienproben handelt es sich um mehr als nur eine geringe Anzahl von Spermien, die aus einer Reihe von Spermien hervorgegangen sind (p < 0,001). demonstrieren Polyreotaktik (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl die Spermienbündel eine geringere Geschwindigkeit als einzelne Spermien aufwiesen (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien mit positiver Rheotaxis (p < 0,001; Tabelle 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001）, 但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001）, 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。））））） Die Untersuchung von Spermienproben war nicht sehr gut, da sie nur wenige Spermien (p < 0,001) enthielten und nur wenige Spermien auf der Grundlage der Analyse ergaben реологией (p < 0,001; Tabelle 2). Obwohl die Geschwindigkeit der Spermienbündel geringer war als die einzelner Spermien (p < 0,001), erhöhten sie den Prozentsatz der Spermien mit positiver Rheologie (p < 0,001; Tabelle 2).Die positive Rheologie für einzelne Spermien und Büschel wird auf etwa 53 % bzw. 85 % geschätzt.
Es wurde beobachtet, dass die Spermien von Sharkasi-Hühnern unmittelbar nach der Ejakulation lineare Bündel bilden, die aus Dutzenden von Individuen bestehen. Diese Büschel nehmen mit der Zeit an Länge und Dicke zu und können in vitro mehrere Stunden bestehen bleiben, bevor sie sich auflösen (Video 3). Diese filamentösen Bündel haben die Form der Ameisenigel-Spermien, die sich am Ende des Nebenhodens bilden. Es wurde festgestellt, dass das Sperma von Sharkashi-Hühnern eine hohe Tendenz zur Agglutination hat und in weniger als einer Minute nach der Entnahme ein netzartiges Bündel bildet. Diese Strahlen sind dynamisch und in der Lage, an nahegelegenen Wänden oder statischen Objekten zu haften. Obwohl Spermienbündel die Geschwindigkeit der Spermienzellen verringern, ist es klar, dass sie makroskopisch ihre Linearität erhöhen. Die Länge der Bündel variiert in Abhängigkeit von der Anzahl der in den Bündeln gesammelten Spermien. Zwei Teile des Bündels wurden isoliert: der Anfangsteil mit dem freien Kopf des agglutinierten Spermiums und der Endteil mit dem Schwanz und dem gesamten distalen Ende des Spermiums. Mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (950 fps) wurden freie Köpfe agglutinierter Spermien im Anfangsteil des Bündels beobachtet. Diese waren durch ihre oszillierende Bewegung für die Bewegung des Bündels verantwortlich und zogen die übrigen Spermien spiralförmig in das Bündel hinein (Video 4). In langen Bündeln wurde jedoch beobachtet, dass einige freie Spermienköpfe am Körper und am Endteil des Bündels hafteten und als Flügel fungierten, um das Bündel voranzutreiben.
In einer langsamen Flüssigkeitsströmung bewegen sich die Spermienbündel parallel zueinander. Sie beginnen sich jedoch zu überlappen und an allem Unbeweglichen zu haften, um bei zunehmender Strömungsgeschwindigkeit nicht von der Strömung weggespült zu werden. Die Bündel bilden sich, wenn sich eine Handvoll Spermien einander nähern. Sie beginnen sich synchron zu bewegen, wickeln sich umeinander und haften dann an einer klebrigen Substanz. Abbildungen 1 und 2 zeigen, wie sich die Spermien einander nähern und eine Verbindung bilden, während sich die Schwänze umeinander wickeln.
Die Forscher erzeugten mittels hydrostatischem Druck einen Flüssigkeitsfluss in einem Mikrokanal, um die Rheologie von Spermien zu untersuchen. Verwendet wurde ein Mikrokanal mit einer Größe von 200 µm × 20 µm (B × H) und einer Länge von 3,6 µm. Die Mikrokanäle wurden zwischen Behältern mit an den Enden angebrachten Spritzen verwendet. Lebensmittelfarbe wurde verwendet, um die Kanäle besser sichtbar zu machen.
Verbindungskabel und Zubehör an der Wand befestigen. Das Video wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop aufgenommen. Jedes Bild zeigt Phasenkontrastmikroskopie und Mapping-Bilder. (A) Die Verbindung zwischen zwei Strömen widersteht dem Fluss aufgrund der Spiralbewegung (roter Pfeil). (B) Die Verbindung zwischen dem Rohrbündel und der Kanalwand (rote Pfeile), gleichzeitig sind sie mit zwei anderen Bündeln verbunden (gelbe Pfeile). (C) Spermienbündel im Mikrofluidkanal beginnen, sich miteinander zu verbinden (rote Pfeile) und bilden ein Netz aus Spermienbündeln. (D) Bildung eines Netzwerks aus Spermienbündeln.
Als ein Tropfen verdünntes Sperma in das Mikrofluidik-Gerät gegeben und eine Strömung erzeugt wurde, beobachtete man, dass sich der Spermienstrahl entgegen der Strömungsrichtung bewegte. Die Bündel schmiegen sich eng an die Wände der Mikrokanäle, und die freien Köpfe im Anfangsteil der Bündel liegen eng an ihnen an (Video 5). Sie haften außerdem an stationären Partikeln in ihrem Weg, wie z. B. Schmutz, und werden so nicht von der Strömung mitgerissen. Mit der Zeit entwickeln sich diese Bündel zu langen Filamenten, die weitere einzelne Spermien und kürzere Bündel einfangen (Video 6). Lässt die Strömung nach, bilden lange Spermienstränge ein Netzwerk von Spermienlinien (Video 7; Abbildung 2).
Bei hoher Strömungsgeschwindigkeit (V > 33 µm/s) verstärken sich die Spiralbewegungen der Fäden, um möglichst viele einzelne Spermienbündel einzufangen und so der Treibkraft der Strömung besser standzuhalten. Bei hoher Strömungsgeschwindigkeit (V > 33 µm/s) verstärken sich die Spiralbewegungen der Fäden, um möglichst viele einzelne Spermienbündel einzufangen und so der Treibkraft der Strömung besser standzuhalten. Nach einer bestimmten Zeitspanne (V > 33 m²/s) ist die Wiedergabegeschwindigkeit nicht ausreichend, da nur wenige Geräte verwendet werden können Spermatozoiden, Durch die Verwendung von Stiften wird die Geschwindigkeit des Kabels erhöht. Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) verstärken sich die spiralförmigen Bewegungen der Stränge, da sie versuchen, viele einzelne Spermien zu fangen und so Bündel zu bilden, die der Driftkraft der Strömung besser standhalten können.在高流速(V > 33 µm/s)时,螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时, 的 螺旋 运动 增加, 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子, 从而 更 地抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 Bei einer Aufnahmegeschwindigkeit (V > 33 m²/s) wird eine spiralförmige Bewegung durchgeführt, bevor mehrere andere Spermien entfernt werden. образующих пучки, чтобы лучше опротивляться силам дрейфа потока. Bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten (V > 33 µm/s) verstärkt sich die spiralförmige Bewegung der Filamente, um möglichst viele einzelne Spermien einzufangen und Bündel zu bilden, die den Driftkräften der Strömung besser standhalten.Sie versuchten auch, Mikrokanäle an den Seitenwänden anzubringen.
Spermienbündel wurden mittels Lichtmikroskopie (LM) als Ansammlungen von Spermienköpfen und eingerollten Schwänzen identifiziert. Spermienbündel mit verschiedenen Aggregaten wurden ebenfalls als verdrehte Köpfe und Flagellenaggregate, mehrere verschmolzene Spermienschwänze, an einem Schwanz befestigte Spermienköpfe und Spermienköpfe mit gebogenen Kernen als mehrere verschmolzene Kerne identifiziert. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Rasterelektronenmikroskopie (REM) zeigte, dass die Spermienbündel umhüllte Aggregate von Spermienköpfen waren und die Spermienaggregate ein Netzwerk gewickelter Schwänze aufwiesen.
Die Morphologie und Ultrastruktur der Spermien sowie die Bildung von Spermienbündeln wurden mittels Lichtmikroskopie (Halbschnitt), Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, Spermienausstriche wurden mit Acridinorange gefärbt und mittels Epifluoreszenzmikroskopie untersucht.
Die Färbung des Spermienausstrichs mit Acridinorange (Abb. 3B) zeigte, dass die Spermienköpfe aneinander klebten und mit Sekret bedeckt waren, was zur Bildung großer Büschel führte (Abb. 3D). Die Spermienbündel bestanden aus Spermienaggregaten mit einem Netzwerk anhaftender Schwänze (Abb. 4A–C). Spermienbündel bestehen aus den Schwänzen vieler aneinander haftender Spermien (Abb. 4D). Die Köpfe der Spermienbündel waren mit Sekreten (Abb. 4E,F) bedeckt.
Bildung des Spermienbündels. Mithilfe von Phasenkontrastmikroskopie und mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichen konnte gezeigt werden, dass die Köpfe der Spermien aneinander haften. (A) Die frühe Spermienbüschelbildung beginnt mit einem Spermium (weißer Kreis) und drei Spermien (gelber Kreis), wobei die Spirale am Schwanz beginnt und am Kopf endet. (B) Mikrofotografie eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs mit anhaftenden Spermienköpfen (Pfeile). Der Ausfluss bedeckt den/die Kopf(e). 1000-fache Vergrößerung. (C) Entwicklung eines großen Strahls, der durch Strömung in einem Mikrofluidkanal transportiert wird (mithilfe einer Hochgeschwindigkeitskamera mit 950 fps). (D) Mikrofotografie eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs mit großen Büscheln (Pfeile). 200-fache Vergrößerung.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Spermienstrahls und eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs. (A, B, D, E) sind digitale Farb-Rasterelektronenmikroskopiebilder von Spermien, und C und F sind Mikroskopiebilder von mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichen, die die Anhaftung mehrerer Spermien zeigen, die das Schwanznetz umwickeln. (AC) Spermienaggregate sind als Netzwerk aus aneinander befestigten Schwänzen (Pfeile) dargestellt. (D) Anhaftung mehrerer Spermien (mit Klebesubstanz, rosa Umriss, Pfeil), die sich um den Schwanz wickeln. (E und F) Spermienkopfaggregate (Zeiger), bedeckt mit Klebematerial (Zeiger). Die Spermien bildeten Bündel mit mehreren wirbelartigen Strukturen (F). (C) 400-fache und (F) 200-fache Vergrößerung.
Mittels Transmissionselektronenmikroskopie stellten wir fest, dass die Spermienbündel Schwänze (Abb. 6A, C), Köpfe mit Schwänzen (Abb. 6B) oder Köpfe mit Schwänzen (Abb. 6D) aufwiesen. Die Köpfe der Spermien im Bündel sind gekrümmt und weisen im Schnitt zwei Kernregionen auf (Abb. 6D). Im Schnittbündel hatten die Spermien einen verdrehten Kopf mit zwei Kernregionen und mehreren Flagellenregionen (Abb. 5A).
Digitale Farbelektronenmikroskopie, die die Verbindungsenden im Spermienbündel und das Agglutinationsmaterial zeigt, das die Spermienköpfe verbindet. (A) Verbundener Schwanz einer großen Anzahl von Spermien. Beachten Sie, wie der Schwanz sowohl im Hochformat (Pfeil) als auch im Querformat (Pfeil) aussieht. (B) Der Kopf (Pfeil) des Spermiums ist mit dem Schwanz (Pfeil) verbunden. (C) Mehrere Spermienschwänze (Pfeile) sind verbunden. (D) Agglutinationsmaterial (AS, blau) verbindet vier Spermienköpfe (lila).
Mittels Rasterelektronenmikroskopie wurden Spermienköpfe in mit Sekreten oder Membranen bedeckten Spermienbündeln nachgewiesen (Abbildung 6B). Dies deutet darauf hin, dass die Spermienbündel durch extrazelluläres Material verankert sind. Das agglutinierte Material konzentrierte sich im Spermienkopf (quallenkopfartige Anordnung; Abbildung 5B) und dehnte sich distal aus. Nach Anfärbung mit Acridinorange (Abbildung 6C) erschien es unter dem Fluoreszenzmikroskop leuchtend gelb. Diese Substanz ist unter dem Rasterelektronenmikroskop deutlich sichtbar und gilt als Bindemittel. Semidünne Schnitte (Abbildung 5C) und mit Acridinorange gefärbte Spermienausstriche zeigten Spermienbündel mit dicht gepackten Köpfen und eingerollten Schwänzen (Abbildung 5D).
Verschiedene Mikrofotografien zeigen die Ansammlung von Spermienköpfen und gefalteten Schwänzen unter Verwendung verschiedener Methoden. (A) Digitale Farbtransmissionselektronenmikroskopie eines Spermienbündels im Querschnitt, die einen gewundenen Spermienkopf mit zweiteiligem Kern (blau) und mehreren Flagellenteilen (grün) zeigt. (B) Digitale Farbrasterelektronenmikroskopie, die eine Ansammlung quallenartiger Spermienköpfe (Pfeile) zeigt, die bedeckt zu sein scheinen. (C) Halbdünner Schnitt zeigt aggregierte Spermienköpfe (Pfeile) und eingerollte Schwänze (Pfeile). (D) Mikrofotografie eines mit Acridinorange gefärbten Spermienausstrichs, die Aggregate von Spermienköpfen (Pfeile) und eingerollten anhaftenden Schwänzen (Pfeile) zeigt. Beachten Sie, dass eine klebrige Substanz (S) den Kopf des Spermiums bedeckt. (D) 1000-fache Vergrößerung.
Mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (Abb. 7A) wurde außerdem festgestellt, dass die Spermienköpfe verdreht waren und die Kerne eine Spiralform aufwiesen, was durch mit Acridinorange gefärbte und mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersuchte Spermienausstriche bestätigt wurde (Abb. 7B).
(A) Digitale Farbtransmissionselektronenmikroskopie und (B) Mit Acridinorange gefärbter Spermienausstrich mit gewundenen Köpfen und der Anhaftung von Spermienköpfen und -schwänzen (Pfeile). (B) 1000-fache Vergrößerung.
Ein interessanter Befund ist, dass Sharkazis Spermien sich zu beweglichen filamentösen Bündeln aggregieren. Die Eigenschaften dieser Bündel ermöglichen es uns, ihre mögliche Rolle bei der Aufnahme und Speicherung von Spermien im SST zu verstehen.
Nach der Paarung gelangen die Spermien in die Vagina und durchlaufen einen intensiven Selektionsprozess, wodurch nur eine begrenzte Anzahl in die SST gelangt15,16. Die Mechanismen, wie Spermien in die SST gelangen und sie wieder verlassen, sind bislang unklar. Bei Geflügel werden Spermien je nach Art für einen längeren Zeitraum von 2 bis 10 Wochen in der SST gespeichert6. Der Zustand des Spermas während der Lagerung in der SST ist weiterhin umstritten. Befinden sie sich in Bewegung oder ruhen sie? Anders gefragt: Wie halten Spermien ihre Position in der SST so lange?
Forman4 schlug vor, dass die Verweildauer und der Ausstoß im SST durch die Spermienmotilität erklärt werden könnten. Die Autoren vermuten, dass Spermien ihre Position halten, indem sie gegen den vom SST-Epithel erzeugten Flüssigkeitsstrom schwimmen, und dass Spermien aus dem SST ausgestoßen werden, wenn ihre Geschwindigkeit unter den Punkt fällt, an dem sie aufgrund fehlender Energie beginnen, sich rückwärts zu bewegen. Zaniboni5 bestätigte das Vorhandensein der Aquaporine 2, 3 und 9 im apikalen Bereich der SST-Epithelzellen, was Foremans Spermienspeichermodell indirekt stützen könnte. In der vorliegenden Studie stellten wir fest, dass fast die Hälfte der Spermien von Sharkashi in der fließenden Flüssigkeit eine positive Rheologie aufweisen und dass agglutinierte Spermienbündel die Anzahl der Spermien mit positiver Rheologie erhöhen, obwohl die Agglutination sie verlangsamt. Wie Spermien durch den Eileiter des Vogels zum Befruchtungsort gelangen, ist noch nicht vollständig geklärt. Bei Säugetieren übt die Follikelflüssigkeit eine chemische Anziehung auf Spermien aus. Man geht jedoch davon aus, dass Chemoattraktanten die Spermien dazu lenken, weite Entfernungen zurückzulegen7. Für den Spermientransport sind also andere Mechanismen verantwortlich. Die Fähigkeit der Spermien, sich zu orientieren und gegen die nach der Paarung freigesetzte Flüssigkeit der Eileiter zu fließen, ist Berichten zufolge ein wichtiger Faktor für die Spermienansteuerung bei Mäusen. Parker 17 vermutete, dass Spermien bei Vögeln und Reptilien die Eileiter durchqueren, indem sie gegen den Flimmerstrom schwimmen. Obwohl dies bei Vögeln nicht experimentell nachgewiesen wurde, fand Adolphi 18 als Erster heraus, dass Vogelsperma positive Ergebnisse liefert, wenn zwischen Deckglas und Objektträger mithilfe eines Streifens Filterpapier eine dünne Flüssigkeitsschicht erzeugt wird. Rheologie. Hino und Yanagimachi [19] legten einen Eierstock-Eileiter-Gebärmutter-Komplex einer Maus in einen Perfusionsring und injizierten 1 µl Tinte in den Isthmus, um den Flüssigkeitsfluss in den Eileitern sichtbar zu machen. Sie stellten eine sehr aktive Kontraktions- und Entspannungsbewegung im Eileiter fest, bei der sich alle Tintenkügelchen stetig in Richtung der Ampulle des Eileiters bewegten. Die Autoren betonen die Bedeutung des Eileiterflüssigkeitsflusses von den unteren zu den oberen Eileitern für den Spermienauftrieb und die Befruchtung. Brillard20 berichtete, dass Spermien bei Hühnern und Truthähnen durch aktive Bewegung vom Scheideneingang, wo sie gespeichert werden, zum uterovaginalen Übergang wandern, wo sie ebenfalls gespeichert werden. Zwischen dem uterovaginalen Übergang und dem Infundibulum ist diese Bewegung jedoch nicht erforderlich, da der Transport der Spermien durch passive Verdrängung erfolgt. In Kenntnis dieser früheren Empfehlungen und der Ergebnisse der vorliegenden Studie kann davon ausgegangen werden, dass die Fähigkeit der Spermien, sich stromaufwärts zu bewegen (Rheologie), eine der Eigenschaften ist, auf denen der Selektionsprozess beruht. Diese bestimmt den Durchgang der Spermien durch die Vagina und ihren Eintritt in den CCT zur Speicherung. Wie Forman4 vorschlug, könnte dies auch den Prozess erleichtern, bei dem Spermien für eine gewisse Zeit in die SST und ihren Lebensraum eindringen und sie dann wieder verlassen, wenn ihre Geschwindigkeit nachlässt.
Matsuzaki und Sasanami 21 hingegen vermuteten, dass Vogelspermien im männlichen und weiblichen Reproduktionstrakt Motilitätsänderungen von der Ruhephase zur Motilität durchlaufen. Die Hemmung der residenten Spermienmotilität im SST wurde als Erklärung für die lange Speicherzeit der Spermien und deren anschließende Regeneration nach Verlassen des SST vorgeschlagen. Matsuzaki et al. 1 berichteten unter hypoxischen Bedingungen über eine hohe Laktatproduktion und -freisetzung im SST, was zu einer Hemmung der residenten Spermienmotilität führen könnte. In diesem Fall spiegelt sich die Bedeutung der Spermienrheologie in der Selektion und Absorption der Spermien und nicht in ihrer Speicherung wider.
Das Spermienagglutinationsmuster gilt als plausible Erklärung für die lange Speicherdauer von Spermien im SST, da dies ein häufiges Muster der Spermienretention bei Geflügel ist2,22,23. Bakst et al. 2 beobachteten, dass die meisten Spermien aneinander hafteten und faszikuläre Aggregate bildeten und dass einzelne Spermien in Wachtel-CCM selten gefunden wurden. Andererseits beobachteten Wen et al. 24 mehr verstreute Spermien und weniger Spermienbüschel im SST-Lumen von Hühnern. Aufgrund dieser Beobachtungen kann angenommen werden, dass die Neigung zur Spermienagglutination zwischen Vögeln und zwischen Spermien im selben Ejakulat unterschiedlich ist. Außerdem vermuteten Van Krey et al. 9, dass die zufällige Dissoziation agglutinierter Spermien für das allmähliche Eindringen der Spermien in das Lumen des Eileiters verantwortlich ist. Dieser Hypothese zufolge sollten Spermien mit geringerer Agglutinationskapazität zuerst aus dem SST ausgestoßen werden. In diesem Zusammenhang könnte die Fähigkeit der Spermien zur Agglutination ein Faktor sein, der den Ausgang der Spermienkonkurrenz bei schmutzigen Vögeln beeinflusst. Zudem bleibt die Fruchtbarkeit umso länger erhalten, je länger die agglutinierten Spermien dissoziieren.
Obwohl die Aggregation und Bündelung von Spermien in mehreren Studien2,22,24 beobachtet wurde, wurden sie aufgrund der Komplexität ihrer kinematischen Beobachtung innerhalb der SST nicht detailliert beschrieben. Es wurden mehrere Versuche unternommen, die Spermienagglutination in vitro zu untersuchen. Eine ausgedehnte, aber vorübergehende Aggregation wurde beobachtet, als der dünne Draht vom herabhängenden Samentropfen entfernt wurde. Dies führte dazu, dass eine längliche Blase aus dem Tropfen herausragte und die Samendrüse imitierte. Aufgrund von 3D-Einschränkungen und kurzen Trocknungszeiten der Tropfen zerfiel der gesamte Block schnell9. In der vorliegenden Studie konnten wir mithilfe von Sharkashi-Hühnern und Mikrofluidik-Chips beschreiben, wie sich diese Büschel bilden und wie sie sich bewegen. Spermienbündel bildeten sich unmittelbar nach der Samenentnahme und bewegten sich spiralförmig, wobei sie im Fluss eine positive Rheologie zeigten. Darüber hinaus wurde bei makroskopischer Betrachtung eine linearere Motilität der Spermienbündel im Vergleich zu isolierten Spermien beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Spermienagglutination vor dem Eindringen in den SST stattfinden kann und die Spermienproduktion nicht wie zuvor angenommen stressbedingt auf einen kleinen Bereich beschränkt ist (Tingari und Lake12). Während der Büschelbildung schwimmen die Spermien synchron, bis sie eine Verbindung bilden, dann wickeln sich ihre Schwänze umeinander und der Kopf des Spermiums bleibt frei, aber der Schwanz und der distale Teil des Spermiums haften durch eine klebrige Substanz aneinander. Daher ist der freie Kopf des Bandes für die Bewegung verantwortlich und zieht den Rest des Bandes mit sich. Rasterelektronenmikroskopie der Spermienbündel zeigte anhaftende Spermienköpfe, die mit viel klebrigem Material bedeckt waren. Dies legt nahe, dass die Spermienköpfe in Ruhebündeln anhafteten, was nach Erreichen des Speicherorts (SST) geschehen sein könnte.
Wird ein Spermienausstrich mit Acridinorange gefärbt, lässt sich unter einem Fluoreszenzmikroskop extrazelluläres Haftmaterial um die Spermienzellen erkennen. Diese Substanz ermöglicht es den Spermienbündeln, an umgebenden Oberflächen oder Partikeln zu haften und sich daran festzuhalten, sodass sie nicht mit der umgebenden Strömung abdriften. Unsere Beobachtungen zeigen somit die Rolle der Spermienhaftung in Form beweglicher Bündel. Ihre Fähigkeit, gegen die Strömung zu schwimmen und an nahegelegenen Oberflächen zu haften, ermöglicht es den Spermien, länger im SST zu verweilen.
Rothschild25 verwendete eine Hämozytometriekamera, um die schwimmende Verteilung von Rindersamen in einem Suspensionstropfen zu untersuchen. Dazu fertigte er Mikrofotografien mit einer Kamera mit vertikaler und horizontaler optischer Achse an. Die Ergebnisse zeigten, dass die Spermien von der Oberfläche der Kammer angezogen wurden. Die Autoren vermuten hydrodynamische Wechselwirkungen zwischen den Spermien und der Oberfläche. Dies und die Fähigkeit des Sharkashi-Kükensamens, klebrige Büschel zu bilden, könnten die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass der Samen an der SST-Wand haftet und lange gelagert wird.
Bccetti und Afzeliu26 berichteten, dass die Glykokalyx der Spermien für die Erkennung und Agglutination von Gameten erforderlich ist. Forman10 beobachtete, dass die Hydrolyse von α-glykosidischen Bindungen in Glykoprotein-Glykolipid-Beschichtungen durch die Behandlung von Vogelsperma mit Neuraminidase zu verringerter Fruchtbarkeit führte, ohne die Spermienmotilität zu beeinträchtigen. Die Autoren vermuten, dass die Wirkung von Neuraminidase auf die Glykokalyx die Spermiensequestrierung an der uterovaginalen Verbindung beeinträchtigt und somit die Fruchtbarkeit verringert. Ihre Beobachtungen können die Möglichkeit nicht außer Acht lassen, dass eine Neuraminidase-Behandlung die Erkennung von Spermien und Eizellen verringern kann. Forman und Engel10 stellten fest, dass die Fruchtbarkeit abnahm, wenn Hennen intravaginal mit neuraminidasebehandeltem Sperma besamt wurden. IVF mit neuraminidasebehandeltem Sperma hatte jedoch im Vergleich zu Kontrollhühnern keinen Einfluss auf die Fruchtbarkeit. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass Veränderungen in der Glykoprotein-Glykolipid-Beschichtung der Spermienmembran die Befruchtungsfähigkeit der Spermien verringern, indem sie die Spermienbindung an der uterovaginalen Verbindung beeinträchtigen, was wiederum aufgrund der Geschwindigkeit der uterovaginalen Verbindung zu einem erhöhten Spermienverlust führt, die Erkennung von Spermien und Eizellen jedoch nicht beeinträchtigt.
Bakst und Bauchan 11 fanden bei Truthähnen kleine Bläschen und Membranfragmente im Lumen des SST und beobachteten, dass einige dieser Körnchen mit der Spermienmembran verschmolzen waren. Die Autoren vermuten, dass diese Zusammenhänge zur Langzeitspeicherung von Spermien im SST beitragen könnten. Die Forscher gaben jedoch keine Auskunft über die Quelle dieser Partikel, d. h. ob sie von CCT-Epithelzellen abgesondert, vom männlichen Fortpflanzungssystem produziert und abgesondert oder vom Spermium selbst produziert werden. Außerdem sind diese Partikel für die Agglutination verantwortlich. Grützner et al. 27 berichteten, dass Epithelzellen des Nebenhodens ein bestimmtes Protein produzieren und absondern, das für die Bildung einporiger Samenleiter erforderlich ist. Die Autoren berichten außerdem, dass die Dispersion dieser Bündel von der Interaktion der Proteine ​​des Nebenhodens abhängt. Nixon et al. 28 fanden heraus, dass die Adnexe ein Protein absondern, das saure, cysteinreiche Osteonektin. SPARC ist an der Bildung von Spermienbüscheln bei Kurzschnabeligeln und Schnabeltieren beteiligt. Die Streuung dieser Strahlen ist mit dem Verlust dieses Proteins verbunden.
In der vorliegenden Studie zeigte die ultrastrukturelle Analyse mittels Elektronenmikroskopie, dass die Spermien an einer großen Menge dichtem Material hafteten. Diese Substanzen gelten als verantwortlich für die Agglutination, die sich zwischen und um die anhaftenden Köpfe herum kondensiert, in der Schwanzregion jedoch in geringeren Konzentrationen. Wir gehen davon aus, dass diese agglutinierende Substanz zusammen mit dem Sperma aus dem männlichen Fortpflanzungssystem (Nebenhoden oder Samenleiter) ausgeschieden wird, da wir während der Ejakulation häufig beobachten, dass sich Sperma von Lymphe und Samenplasma trennt. Es wurde berichtet, dass Vogelspermien beim Passieren der Nebenhoden und Samenleiter reifungsbedingte Veränderungen durchlaufen, die ihre Fähigkeit zur Proteinbindung und zur Aufnahme von Plasmalemma-assoziierten Glykoproteinen unterstützen. Das Fortbestehen dieser Proteine ​​auf residenten Spermienmembranen im SST weist darauf hin, dass diese Proteine ​​den Erwerb der Spermienmembranstabilität 30 beeinflussen und ihre Fertilität bestimmen könnten 31 . Ahammad et al32 berichteten, dass Spermien aus verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystems (von den Hoden bis zum distalen Samenleiter) unter flüssigen Lagerungsbedingungen eine fortschreitende Zunahme der Lebensfähigkeit zeigten, unabhängig von der Lagertemperatur, und dass bei Hühnern nach künstlicher Befruchtung auch die Lebensfähigkeit in den Eileitern zunimmt.
Die Spermienbüschel von Sharkashi-Hühnern haben andere Eigenschaften und Funktionen als die anderer Arten wie Ameisenigel, Schnabeltiere, Waldmäuse, Hirschratten und Meerschweinchen. Bei Sharkasi-Hühnern reduzierte die Bildung von Spermienbündeln ihre Schwimmgeschwindigkeit im Vergleich zu einzelnen Spermien. Diese Bündel erhöhten jedoch den Prozentsatz rheologisch positiver Spermien und verbesserten deren Fähigkeit, sich in einer dynamischen Umgebung zu stabilisieren. Somit bestätigen unsere Ergebnisse die vorherige Annahme, dass Spermienagglutination bei SST mit langfristiger Spermienspeicherung verbunden ist. Wir vermuten außerdem, dass die Neigung der Spermien zur Büschelbildung die Rate des Spermienverlusts bei SST steuern könnte, was den Ausgang der Spermienkonkurrenz verändern könnte. Dieser Annahme zufolge setzen Spermien mit geringer Agglutinationskapazität zuerst SST frei, während Spermien mit hoher Agglutinationskapazität den Großteil der Nachkommen zeugen. Die Bildung einporiger Spermienbündel ist vorteilhaft und beeinflusst das Eltern-Kind-Verhältnis, nutzt aber einen anderen Mechanismus. Bei Ameisenigel und Schnabeltieren sind die Spermien parallel zueinander angeordnet, um die Vorwärtsgeschwindigkeit des Strahls zu erhöhen. Bündel von Ameisenigel bewegen sich etwa dreimal schneller als einzelne Spermien. Man geht davon aus, dass die Bildung solcher Spermienbüschel bei Ameisenigel eine evolutionäre Anpassung zur Aufrechterhaltung der Dominanz ist, da Weibchen promiskuitiv sind und sich meist mit mehreren Männchen paaren. Daher konkurrieren Spermien aus verschiedenen Ejakulaten heftig um die Befruchtung der Eizelle.
Agglutinierte Spermien von Sharkasi-Hühnern lassen sich mithilfe der Phasenkontrastmikroskopie leicht visualisieren, was als vorteilhaft gilt, da es eine einfache Untersuchung des Verhaltens von Spermien in vitro ermöglicht. Der Mechanismus, durch den die Spermienbüschelbildung die Reproduktion bei Sharkasi-Hühnern fördert, unterscheidet sich auch von dem bei einigen Plazentatieren, die ein kooperatives Spermienverhalten aufweisen, wie z. B. Waldmäusen, bei denen einige Spermien die Eier erreichen und anderen verwandten Individuen helfen, ihre Eier zu erreichen und zu beschädigen. um sich zu beweisen. altruistisches Verhalten. Selbstbefruchtung 34. Ein weiteres Beispiel für kooperatives Verhalten von Spermien wurde bei Hirschmäusen gefunden, bei denen Spermien in der Lage waren, die genetisch verwandtsten Spermien zu identifizieren und sich mit ihnen zu verbinden und kooperative Gruppen zu bilden, um ihre Geschwindigkeit im Vergleich zu nicht verwandten Spermien zu erhöhen 35.
Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse widersprechen nicht Fomans Theorie der Langzeitspeicherung von Spermien im SWS. Die Forscher berichten, dass sich Spermienzellen für einen längeren Zeitraum im Strom der Epithelzellen bewegen, die den SST auskleiden, und nach einer bestimmten Zeit sind die Energiespeicher der Spermienzellen erschöpft, was zu einer Verringerung der Geschwindigkeit führt, die die Ausstoßung von Substanzen mit geringem Molekulargewicht ermöglicht. Energie der Spermien mit dem Flüssigkeitsstrom aus dem Lumen des SST Die Höhle des Eileiters. In der vorliegenden Studie beobachteten wir, dass die Hälfte der einzelnen Spermien die Fähigkeit zeigte, gegen fließende Flüssigkeiten zu schwimmen, und ihre Haftung im Bündel erhöhte ihre Fähigkeit, eine positive Rheologie zu zeigen. Darüber hinaus stimmen unsere Daten mit denen von Matsuzaki et al. überein, die berichteten, dass eine erhöhte Laktatsekretion im SST die Motilität der residenten Spermien hemmen kann. Unsere Ergebnisse beschreiben jedoch die Bildung beweglicher Spermienbänder und ihr rheologisches Verhalten in einer dynamischen Umgebung innerhalb eines Mikrokanals und versuchen so, ihr Verhalten in der SST aufzuklären. Zukünftige Forschung könnte sich auf die Bestimmung der chemischen Zusammensetzung und Herkunft des Agglutinierungsstoffs konzentrieren, was Forschern zweifellos dabei helfen wird, neue Möglichkeiten zur Speicherung von flüssigem Sperma zu entwickeln und die Fruchtbarkeitsdauer zu verlängern.
Fünfzehn 30 Wochen alte männliche Sharkasi (homozygot dominant; Na Na) mit nacktem Hals wurden als Samenspender für die Studie ausgewählt. Die Vögel wurden auf der Forschungsgeflügelfarm der Landwirtschaftlichen Fakultät der Ashit-Universität im Gouvernement Ashit, Ägypten, aufgezogen. Sie wurden in Einzelkäfigen (30 x 40 x 40 cm) gehalten, einem Lichtprogramm (16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit) ausgesetzt und mit einer Diät gefüttert, die 160 g Rohprotein, 2800 kcal metabolisierbare Energie und 35 g Kalzium enthielt. Pro Kilogramm Diät wurden 5 g verfügbarer Phosphor zugeführt.
Gemäß den Daten 36, 37 wurde Sperma von männlichen Tieren durch Bauchmassage gewonnen. Insgesamt wurden 45 Spermaproben von 15 Männern über 3 Tage hinweg gesammelt. Das Sperma (n = 15/Tag) wurde sofort 1:1 (v:v) mit Belsville Poultry Semen Diluent verdünnt, das Kaliumdiphosphat (1,27 g), Mononatriumglutamat-Monohydrat (0,867 g), Fructose (0,5 d), wasserfreies Natriumacetat (0,43 g), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (0,195 g), Kaliumcitrat-Monohydrat (0,064 g), Kaliummonophosphat (0,065 g), Magnesiumchlorid (0,034 g) und H2O (100 ml) enthält, pH = 7, 5, Osmolarität 333 mOsm/kg38. Verdünnte Samenproben wurden zunächst unter einem Lichtmikroskop untersucht, um eine gute Samenqualität (Feuchtigkeit) sicherzustellen, und dann in einem Wasserbad bei 37 °C gelagert, bis sie innerhalb einer halben Stunde nach der Entnahme verwendet wurden.
Die Kinematik und Rheologie von Spermien wird anhand eines mikrofluidischen Systems beschrieben. Spermienproben wurden in Beltsville Avian Semen Diluent auf 1:40 verdünnt, in ein mikrofluidisches System (siehe unten) geladen und die kinetischen Parameter mithilfe eines zuvor für die mikrofluidische Charakterisierung entwickelten Computerized Semen Analysis (CASA)-Systems bestimmt. Die Studie untersuchte die Mobilität von Spermien in flüssigen Medien (Abteilung für Maschinenbau, Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Universität Assiut, Ägypten). Das Plugin kann unter folgender Adresse heruntergeladen werden: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Gemessen wurden Kurvengeschwindigkeit (VCL, μm/s), Lineargeschwindigkeit (VSL, μm/s) und durchschnittliche Trajektoriengeschwindigkeit (VAP, μm/s). Videos von Spermien wurden mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop Optika XDS-3 (mit 40x Objektiv) aufgenommen, das an eine Tucson ISH1000-Kamera angeschlossen war, mit 30 fps für 3 s. Verwenden Sie die CASA-Software, um mindestens drei Bereiche und 500 Spermienbahnen pro Probe zu untersuchen. Das aufgenommene Video wurde mit einem selbstgebauten CASA verarbeitet. Die Definition der Motilität im CASA-Plug-in basiert auf der Schwimmgeschwindigkeit der Spermien im Vergleich zur Fließgeschwindigkeit und schließt andere Parameter wie Seitwärtsbewegungen nicht ein, da sich diese bei Flüssigkeitsströmungen als zuverlässiger erwiesen haben. Rheologische Bewegung wird als Bewegung von Spermien entgegen der Fließrichtung beschrieben. Spermien mit rheologischen Eigenschaften wurden durch die Anzahl der beweglichen Spermien geteilt; Spermien im Ruhezustand und konvektiv bewegte Spermien wurden von der Zählung ausgeschlossen.
Alle verwendeten Chemikalien wurden von Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Ägypten) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Das Gerät wurde wie von El-sherry et al. 40 beschrieben, mit einigen Modifikationen hergestellt. Die zur Herstellung der Mikrokanäle verwendeten Materialien umfassten Glasplatten (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25-Negativlack (MicroChem, Newton, CA), Diacetonalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) und Polyaceton. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanäle werden mithilfe von Weichlithografie hergestellt. Zunächst wurde eine durchsichtige Schutzmaske mit dem gewünschten Mikrokanaldesign auf einem hochauflösenden Drucker (Prismatic, Kairo, Ägypten und Pacific Arts and Design, Markham, ON) gedruckt. Die Master wurden unter Verwendung von Glasplatten als Substraten hergestellt. Die Platten wurden in Aceton, Isopropanol und deionisiertem Wasser gereinigt und dann durch Spincoating (3000 U/min, 1 Min) mit einer 20 µm dicken Schicht SU8-25 beschichtet. Die SU-8-Schichten wurden anschließend schonend getrocknet (65 °C, 2 min und 95 °C, 10 min) und 50 s lang UV-belichtet. Nach der Belichtung wurden die freiliegenden SU-8-Schichten 1 min und 4 min lang bei 65 °C und 95 °C gebrannt, um sie zu vernetzen. Anschließend wurden sie 6,5 min lang in Diacetonalkohol entwickelt. Die Waffeln wurden anschließend 15 min lang bei 200 °C hart gebrannt, um die SU-8-Schicht weiter zu verfestigen.
PDMS wurde durch Mischen von Monomer und Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 hergestellt, anschließend in einem Vakuumexsikkator entgast und auf den SU-8-Hauptrahmen gegossen. Das PDMS wurde in einem Ofen ausgehärtet (120 °C, 30 min), anschließend wurden die Kanäle ausgeschnitten, vom Master getrennt und perforiert, um Schläuche am Ein- und Ausgang des Mikrokanals anzubringen. Abschließend wurden die PDMS-Mikrokanäle mithilfe eines tragbaren Corona-Prozessors (Electro-Technic Products, Chicago, IL) wie an anderer Stelle beschrieben dauerhaft auf Objektträgern befestigt. Der in dieser Studie verwendete Mikrokanal misst 200 µm × 20 µm (B × H) und ist 3,6 cm lang.
Der durch hydrostatischen Druck im Mikrokanal induzierte Flüssigkeitsfluss wird dadurch erreicht, dass der Flüssigkeitsstand im Einlassreservoir über dem Höhenunterschied Δh39 im Auslassreservoir gehalten wird (Abb. 1).
Dabei ist f der Reibungskoeffizient, definiert als f = C/Re für die laminare Strömung in einem rechteckigen Kanal, wobei C eine Konstante ist, die vom Seitenverhältnis des Kanals abhängt, L die Länge des Mikrokanals ist, Vav die Durchschnittsgeschwindigkeit im Mikrokanal ist, Dh der hydraulische Durchmesser des Kanals ist und g die Erdbeschleunigung ist. Mit dieser Gleichung lässt sich die Durchschnittsgeschwindigkeit im Kanal wie folgt berechnen: