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Kürzlich wurde eine chemiefreie antimikrobielle Plattform auf Basis der Nanotechnologie unter Verwendung künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) entwickelt. EWNS haben eine hohe Oberflächenladung und sind reich an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die mit einer Reihe von Mikroorganismen, einschließlich lebensmittelbedingter Krankheitserreger, interagieren und diese inaktivieren können. Hier zeigt sich, dass ihre Eigenschaften während der Synthese fein abgestimmt und optimiert werden können, um ihr antibakterielles Potenzial weiter zu steigern. Die EWNS-Laborplattform wurde entwickelt, um die Eigenschaften von EWNS durch Änderung der Syntheseparameter fein abzustimmen. Die Charakterisierung der EWNS-Eigenschaften (Ladung, Größe und ROS-Gehalt) erfolgte mittels moderner Analysemethoden. Zusätzlich wurden Lebensmittelmikroorganismen wie Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum und Saccharomyces cerevisiae auf die Oberfläche von Bio-Kirschtomaten geimpft, um ihr mikrobielles Inaktivierungspotenzial zu bewerten. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Eigenschaften von EWNS während der Synthese fein abgestimmt werden können, was zu einer exponentiellen Steigerung der Inaktivierungseffizienz führt. Insbesondere erhöhte sich die Oberflächenladung um den Faktor vier, und der ROS-Gehalt nahm zu. Die mikrobielle Entfernungsrate war mikrobiell abhängig und lag nach 45-minütiger Exposition gegenüber einer Aerosoldosis von 40.000 #/cm3 EWNS zwischen 1,0 und 3,8 log.
Mikrobielle Kontamination ist die Hauptursache für lebensmittelbedingte Erkrankungen, die durch die Aufnahme von Krankheitserregern oder deren Toxinen verursacht werden. Allein in den USA sind lebensmittelbedingte Erkrankungen jährlich für etwa 76 Millionen Erkrankungen, 325.000 Krankenhausaufenthalte und 5.000 Todesfälle verantwortlich1. Das US-Landwirtschaftsministerium (USDA) schätzt zudem, dass der erhöhte Konsum von Frischwaren für 48 Prozent aller in den USA gemeldeten lebensmittelbedingten Erkrankungen verantwortlich ist2. Die Kosten für Erkrankungen und Todesfälle durch lebensmittelbedingte Krankheitserreger sind in den USA sehr hoch und werden von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) auf über 15,6 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt3.
Derzeit werden chemische4, Strahlungs5 und thermische6 antimikrobielle Interventionen zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit hauptsächlich an begrenzten kritischen Kontrollpunkten (CCPs) in der Produktionskette (normalerweise nach der Ernte und/oder während der Verpackung) eingesetzt und nicht kontinuierlich, sodass frische Produkte einer Kreuzkontamination ausgesetzt sind7. Antimikrobielle Interventionen sind erforderlich, um lebensmittelbedingte Krankheiten und Lebensmittelverderb besser unter Kontrolle zu halten und könnten über den gesamten Produktionsprozess vom Erzeuger bis zum Verbraucher angewendet werden. Dies wäre mit geringeren Auswirkungen und Kosten verbunden.
Kürzlich wurde eine chemikalienfreie antimikrobielle Plattform auf Nanotechnologiebasis entwickelt, um Bakterien auf Oberflächen und in der Luft mithilfe künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) zu inaktivieren. Für die Synthese der EVNS wurden zwei parallele Prozesse verwendet: Elektrospray und Wasserionisation (Abb. 1a). Es wurde bereits gezeigt, dass EWNS einzigartige physikalische und biologische Eigenschaften besitzen8,9,10. EWNS haben durchschnittlich 10 Elektronen pro Struktur und eine durchschnittliche Nanometergröße von 25 nm (Abb. 1b,c)8,9,10. Zudem zeigte die Elektronenspinresonanz (ESR), dass EWNS große Mengen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) enthalten, hauptsächlich Hydroxyl- (OH•) und Superoxid-Radikale (O2-) (Abb. 1c)8. EWNS verbleiben lange Zeit in der Luft und können mit in der Luft schwebenden und auf Oberflächen vorhandenen Mikroben kollidieren, wobei sie ihre ROS-Fracht freisetzen und eine mikrobielle Inaktivierung verursachen (Abb. 1d). Diese früheren Studien zeigten auch, dass EWNS mit verschiedenen gramnegativen und grampositiven Bakterien, die für die öffentliche Gesundheit relevant sind, einschließlich Mykobakterien, auf Oberflächen und in der Luft interagieren und diese inaktivieren können8,9. Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass die Inaktivierung durch eine Zerstörung der Zellmembran verursacht wurde. Darüber hinaus haben akute Inhalationsstudien gezeigt, dass hohe Dosen von EWNS keine Lungenschäden oder Entzündungen verursachen8.
(a) Elektrospray entsteht, wenn zwischen einer flüssigkeitshaltigen Kapillare und einer Gegenelektrode Hochspannung angelegt wird. (b) Das Anlegen von Hochspannung führt zu zwei verschiedenen Phänomenen: (i) Elektrospray von Wasser und (ii) Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (Ionen), die in den EWNS eingeschlossen werden. (c) Die einzigartige Struktur der EWNS. (d) EWNS sind aufgrund ihrer Nanoskaligkeit hochmobil und können mit luftübertragenen Krankheitserregern interagieren.
Die Fähigkeit der antimikrobiellen EWNS-Plattform, lebensmittelbedingte Mikroorganismen auf der Oberfläche frischer Lebensmittel zu inaktivieren, wurde kürzlich ebenfalls nachgewiesen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die EWNS-Oberflächenladung in Kombination mit einem elektrischen Feld zur gezielten Abgabe genutzt werden kann. Noch wichtiger ist, dass innerhalb von 90 Minuten nach Einwirkung von EWNS in einer Konzentration von etwa 50.000 #/cm311 ein vielversprechendes erstes Ergebnis einer etwa 1,4-log-Reduktion der Aktivität von Bio-Tomaten gegen verschiedene Lebensmittelmikroorganismen wie E. coli und Listeria beobachtet wurde. Darüber hinaus zeigten vorläufige organoleptische Bewertungstests keinen organoleptischen Effekt im Vergleich zur Kontrolltomate. Obwohl diese ersten Inaktivierungsergebnisse selbst bei sehr niedrigen EWNS-Dosen von 50.000 #/cc Lebensmittelsicherheit versprechen, ist es klar, dass ein höheres Inaktivierungspotenzial vorteilhafter wäre, um das Infektions- und Verderbrisiko weiter zu reduzieren.
Hier konzentrieren wir unsere Forschung auf die Entwicklung einer EWNS-Generierungsplattform, um die Syntheseparameter zu optimieren und die physikochemischen Eigenschaften der EWNS zu verbessern und so ihr antibakterielles Potenzial zu steigern. Die Optimierung konzentrierte sich insbesondere auf die Erhöhung der Oberflächenladung (zur Verbesserung der gezielten Abgabe) und des ROS-Gehalts (zur Verbesserung der Inaktivierungseffizienz). Die Charakterisierung der optimierten physikochemischen Eigenschaften (Größe, Ladung und ROS-Gehalt) erfolgte mittels moderner Analysemethoden und unter Verwendung gängiger Lebensmittelmikroorganismen wie E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae und M. parafortuitum.
EVNS wurde durch gleichzeitiges Elektrospraying und Ionisierung von hochreinem Wasser (18 MΩ cm–1) synthetisiert. Der elektrische Zerstäuber 12 wird typischerweise zum Zerstäuben von Flüssigkeiten sowie synthetischen Polymer- und Keramikpartikeln 13 und Fasern 14 kontrollierter Größe verwendet.
Wie in früheren Veröffentlichungen 8, 9, 10, 11 ausführlich beschrieben, wird in einem typischen Experiment eine Hochspannung zwischen einer Metallkapillare und einer geerdeten Gegenelektrode angelegt. Während dieses Prozesses treten zwei verschiedene Phänomene auf: 1) Elektrospray und 2) Ionisierung des Wassers. Ein starkes elektrisches Feld zwischen den beiden Elektroden führt dazu, dass sich an der Oberfläche des kondensierten Wassers negative Ladungen aufbauen, was zur Bildung von Taylor-Kegeln führt. Dadurch bilden sich hochgeladene Wassertropfen, die gemäß der Rayleigh-Theorie weiter in kleinere Partikel zerfallen16. Gleichzeitig führt ein starkes elektrisches Feld dazu, dass sich einige Wassermoleküle aufspalten und Elektronen abstreifen (Ionisierung), wodurch eine große Menge reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)17 entsteht. Gleichzeitig erzeugte ROS18-Pakete wurden in EWNS eingekapselt (Abb. 1c).
Abb. 2a zeigt das EWNS-Erzeugungssystem, das in dieser Studie entwickelt und für die EWNS-Synthese verwendet wurde. Gereinigtes Wasser aus einer geschlossenen Flasche wurde durch einen Teflonschlauch (2 mm Innendurchmesser) einer 30G-Edelstahlnadel (Metallkapillare) zugeführt. Wie in Abbildung 2b dargestellt, wird der Wasserfluss durch den Luftdruck in der Flasche gesteuert. Die Nadel ist an einer Teflonkonsole befestigt, die manuell auf einen bestimmten Abstand von der Gegenelektrode eingestellt werden kann. Die Gegenelektrode ist eine polierte Aluminiumscheibe mit einem Loch in der Mitte zur Probenentnahme. Unter der Gegenelektrode befindet sich ein Aluminium-Probenahmetrichter, der über einen Probenahmeanschluss mit dem Rest des Versuchsaufbaus verbunden ist (Abb. 2b). Alle Komponenten des Probenehmers sind elektrisch geerdet, um Ladungsaufbau zu vermeiden, der die Partikelprobenahme beeinträchtigen könnte.
(a) Engineered Water Nanostructure Generation System (EWNS). (b) Querschnitt des Probenehmers und der Elektrospray-Einheit mit Darstellung der wichtigsten Parameter. (c) Versuchsaufbau zur Bakterieninaktivierung.
Das oben beschriebene EWNS-Erzeugungssystem ermöglicht die Änderung wichtiger Betriebsparameter zur Feinabstimmung der EWNS-Eigenschaften. Passen Sie die angelegte Spannung (V), den Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode (L) und den Wasserfluss (φ) durch die Kapillare an, um die EWNS-Eigenschaften zu optimieren. Die Symbole [V (kV), L (cm)] kennzeichnen verschiedene Kombinationen. Passen Sie den Wasserfluss an, um einen stabilen Taylor-Kegel mit einem bestimmten Wert von [V, L] zu erhalten. Für diese Studie wurde die Öffnung der Gegenelektrode (D) auf 0,5 Zoll (1,29 cm) eingestellt.
Aufgrund der eingeschränkten Geometrie und Asymmetrie kann die elektrische Feldstärke nicht aus ersten Prinzipien berechnet werden. Stattdessen wurde die Software QuickField™ (Svendborg, Dänemark)19 zur Berechnung des elektrischen Felds verwendet. Da das elektrische Feld nicht einheitlich ist, wurde der Wert des elektrischen Felds an der Spitze der Kapillare als Referenzwert für verschiedene Konfigurationen verwendet.
Während der Studie wurden verschiedene Kombinationen aus Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode hinsichtlich der Taylor-Kegel-Bildung, der Taylor-Kegel-Stabilität, der EWNS-Produktionsstabilität und der Reproduzierbarkeit bewertet. Verschiedene Kombinationen sind in der Ergänzungstabelle S1 dargestellt.
Der Ausgang des EWNS-Erzeugungssystems wurde direkt an einen Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, Modell 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) angeschlossen, um die Partikelanzahlkonzentration zu messen, und wurde mit einem Faraday-Aerosolelektrometer (TSI, Modell 3068B, Shoreview, MN) verwendet, um Aerosolströme zu messen, wie in unserer vorherigen Veröffentlichung9 beschrieben. Sowohl das SMPS als auch das Aerosolelektrometer nahmen Proben bei einer Flussrate von 0,5 l/min (Gesamtprobenfluss 1 l/min). Partikelkonzentrationen und Aerosolströme wurden 120 s lang gemessen. Die Messung wurde 30-mal wiederholt. Die Gesamtaerosolladung wird aus aktuellen Messungen berechnet, und die durchschnittliche EWNS-Ladung wird aus der Gesamtzahl der beprobten EWNS-Partikel geschätzt. Die durchschnittlichen Kosten von EWNS können mit Gleichung (1) berechnet werden:
Dabei ist IEl der gemessene Strom, NSMPS die mit dem SMPS gemessene Teilchenkonzentration und φEl die Durchflussrate zum Elektrometer.
Da die relative Luftfeuchtigkeit (RH) die Oberflächenladung beeinflusst, wurden Temperatur und (RH) während des Experiments konstant bei 21 °C bzw. 45 % gehalten.
Zur Messung der Größe und Lebensdauer des EWNS wurden Rasterkraftmikroskopie (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornien) und die AC260T-Sonde (Olympus, Tokio, Japan) verwendet. Die AFM-Scanrate beträgt 1 Hz, der Scanbereich 5 µm × 5 µm mit 256 Scanlinien. Alle Bilder wurden mit der Asylum-Software (Maske mit einem Bereich von 100 nm und einem Schwellenwert von 100 pm) einer Bildausrichtung erster Ordnung unterzogen.
Entfernen Sie den Probenahmetrichter und platzieren Sie die Glimmeroberfläche für eine durchschnittliche Zeit von 120 s in einem Abstand von 2,0 cm von der Gegenelektrode, um ein Zusammenwachsen der Partikel und die Bildung unregelmäßiger Tröpfchen auf der Glimmeroberfläche zu vermeiden. EWNS wurde direkt auf frisch geschnittene Glimmeroberflächen aufgetragen (Ted Pella, Redding, CA). Unmittelbar nach dem Sputtern wurde die Glimmeroberfläche mittels AFM visualisiert. Der Oberflächenkontaktwinkel von frisch geschnittenem, unverändertem Glimmer liegt nahe 0°, sodass sich EWNS in einer gewölbten Form über die Glimmeroberfläche ausbreitet20. Der Durchmesser (a) und die Höhe (h) der diffundierenden Tröpfchen wurden direkt anhand der AFM-Topographie gemessen und verwendet, um das gewölbte Diffusionsvolumen EWNS mithilfe unserer zuvor validierten Methode zu berechnen8. Unter der Annahme, dass das integrierte EVNS das gleiche Volumen hat, kann der äquivalente Durchmesser anhand von Gleichung (2) berechnet werden:
In Übereinstimmung mit unserer zuvor entwickelten Methode wurde eine Elektronenspinresonanz (ESR)-Spinfalle verwendet, um das Vorhandensein kurzlebiger radikalischer Zwischenprodukte in EWNS zu erkennen. Aerosole wurden durch eine Lösung mit 235 mM DEPMPO (5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrrolin-N-oxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) geleitet. Alle EPR-Messungen wurden mit einem Bruker EMX-Spektrometer (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) und Flachzellen-Arrays durchgeführt. Die Acquisit-Software (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) wurde zum Sammeln und Analysieren der Daten verwendet. Die ROS-Charakterisierung wurde nur für einen Satz von Betriebsbedingungen [-6,5 kV, 4,0 cm] durchgeführt. EWNS-Konzentrationen wurden unter Berücksichtigung des EWNS-Verlusts im Impaktor mit SMPS gemessen.
Die Ozonwerte wurden mit einem 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co) überwacht8,9,10.
Für alle EWNS-Eigenschaften entspricht der Messwert dem Mittelwert der Messungen und der Messfehler der Standardabweichung. Ein T-Test wurde durchgeführt, um den Wert des optimierten EWNS-Attributs mit dem entsprechenden Wert des Basis-EWNS zu vergleichen.
Abbildung 2c zeigt ein zuvor entwickeltes und charakterisiertes elektrostatisches Niederschlags-Durchlaufsystem (EPES), mit dem EWNS11 gezielt auf Oberflächen gerichtet werden kann. EPES nutzt eine EWNS-Ladung in Kombination mit einem starken elektrischen Feld, um die Zieloberfläche gezielt anzusteuern. Details des EPES-Systems werden in einer aktuellen Veröffentlichung von Pyrgiotakis et al.11 vorgestellt. EPES besteht aus einer 3D-gedruckten PVC-Kammer mit konischen Enden, die in der Mitte zwei parallele Edelstahlplatten (Edelstahl 304, hochglanzpoliert) im Abstand von 15,24 cm enthält. Die Platten wurden an eine externe Hochspannungsquelle (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) angeschlossen; die untere Platte war stets positiv, die obere stets geerdet (schwebend). Die Kammerwände sind mit Aluminiumfolie bedeckt, die elektrisch geerdet ist, um Partikelverlust zu verhindern. Die Kammer verfügt über eine versiegelte Fronttür, die es ermöglicht, Testoberflächen auf Kunststoffgestelle zu legen und diese von der unteren Metallplatte abzuheben, um Hochspannungsstörungen zu vermeiden.
Die Ablagerungseffizienz von EWNS in EPES wurde gemäß einem zuvor entwickelten Protokoll berechnet, das in der ergänzenden Abbildung S111 detailliert beschrieben ist.
Als Kontrollkammer ist der zweite Durchfluss durch die zylindrische Kammer in Reihe mit dem EPES-System geschaltet und verwendet einen dazwischenliegenden HEPA-Filter zur Entfernung von EWNS. Wie in Abb. 2c dargestellt, wurde das EWNS-Aerosol durch zwei in Reihe geschaltete Kammern gepumpt. Der Filter zwischen Kontrollraum und EPES entfernt alle verbleibenden EWNS, wodurch Temperatur (T), relative Luftfeuchtigkeit (RH) und Ozonwerte gleich bleiben.
Es wurde festgestellt, dass wichtige durch Lebensmittel übertragene Mikroorganismen frische Produkte verunreinigen, wie beispielsweise Escherichia coli (ATCC Nr. 27325), ein Fäkalindikator, Salmonella enterica (ATCC Nr. 53647), ein durch Lebensmittel übertragener Krankheitserreger, Listeria innocua (ATCC Nr. 33090), eine Alternative zur pathogenen Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC Nr. 4098) als Alternative zur Verderbnishefe und Mycobacterium parafortuitous (ATCC Nr. 19686) als resistenteres lebendes Bakterium, das von der ATCC (Manassas, Virginia) erworben wurde.
Kaufen Sie nach Belieben Bio-Kirschtomaten im Supermarkt und lagern Sie diese bis zum Gebrauch (bis zu 3 Tage) bei 4 °C im Kühlschrank. Wählen Sie zum Experimentieren Tomaten einer Größe von etwa 1,25 cm Durchmesser aus.
Die Protokolle für Inkubation, Inokulation, Exposition und Koloniezählung wurden in unseren früheren Veröffentlichungen detailliert beschrieben und in den Zusatzdaten 11 ausführlich erläutert. Die EWNS-Leistung wurde bewertet, indem inokulierte Tomaten 45 Minuten lang 40.000 #/cm3 ausgesetzt wurden. Kurz gesagt, zum Zeitpunkt t = 0 min wurden drei Tomaten verwendet, um die überlebenden Mikroorganismen zu bewerten. Drei Tomaten wurden in EPES gelegt und 40.000 #/cc EWNS ausgesetzt (EWNS-exponierte Tomaten), drei weitere kamen in die Kontrollkammer (Kontrolltomaten). Keine der Tomatengruppen wurde einer zusätzlichen Verarbeitung unterzogen. EWNS-exponierte Tomaten und Kontrolltomaten wurden nach 45 Minuten entfernt, um die Wirkung von EWNS zu bewerten.
Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte gemäß dem in den ergänzenden Daten beschriebenen Protokoll.
Zur Beurteilung der Inaktivierungsmechanismen wurden EWNS-exponierte (45 Min., EWNS-Aerosolkonzentration 40.000 #/cm3) und nicht exponierte Bakterienproben von E. coli, Enterobacter und L. innocua pelletiert. Der Niederschlag wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur in 0,1 M Natriumcacodylatlösung (pH 7,4) mit einem Fixiermittel aus 2,5 % Glutaraldehyd, 1,25 % Paraformaldehyd und 0,03 % Pikrinsäure fixiert. Nach dem Waschen wurden sie 2 Stunden lang mit 1 % Osmiumtetroxid (OsO4)/1,5 % Kaliumferrocyanid (KFeCN6) fixiert, dreimal mit Wasser gewaschen und 1 Stunde lang in 1 % Uranylacetat inkubiert, dann zweimal mit Wasser gewaschen. Anschließend erfolgte jeweils 10-minütige Dehydratation mit 50 %, 70 %, 90 % und 100 % Alkohol. Die Proben wurden anschließend eine Stunde lang in Propylenoxid gelegt und mit einer 1:1-Mischung aus Propylenoxid und TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA) imprägniert. Die Proben wurden in TAAB Epon eingebettet und 48 Stunden bei 60 °C polymerisiert. Das ausgehärtete Granulat wurde geschnitten und mittels TEM mit einem JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), einem konventionellen Transmissionselektronenmikroskop mit einer AMT 2k CCD-Kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA), visualisiert.
Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Für jeden Zeitpunkt wurden Bakterienproben dreifach ausgestrichen, was insgesamt neun Datenpunkte pro Punkt ergab. Der Durchschnitt dieser Daten wurde als Bakterienkonzentration für den jeweiligen Organismus verwendet. Die Standardabweichung wurde als Messfehler verwendet. Alle Punkte zählen.
Der Logarithmus der Abnahme der Bakterienkonzentration im Vergleich zu t = 0 min wurde mit folgender Formel berechnet:
Dabei ist C0 die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt 0 (d. h. nachdem die Oberfläche getrocknet ist, aber bevor sie in die Kammer gelegt wurde) und Cn die Bakterienkonzentration auf der Oberfläche nach n Minuten Einwirkung.
Um den natürlichen Abbau der Bakterien während der 45-minütigen Expositionsdauer zu berücksichtigen, wurde die Log-Reduktion im Vergleich zur Kontrolle nach 45 Minuten wie folgt berechnet:
Dabei ist Cn die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt n und Cn-Kontrolle die Konzentration der Kontrollbakterien zum Zeitpunkt n. Die Daten werden als Log-Reduktion im Vergleich zur Kontrolle dargestellt (keine EWNS-Exposition).
Während der Studie wurden mehrere Kombinationen aus Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode im Hinblick auf Taylor-Kegel-Bildung, Taylor-Kegel-Stabilität, EWNS-Produktionsstabilität und Reproduzierbarkeit bewertet. Verschiedene Kombinationen sind in der Ergänzungstabelle S1 dargestellt. Für eine vollständige Studie wurden zwei Fälle ausgewählt, die stabile und reproduzierbare Eigenschaften (Taylor-Kegel, EWNS-Produktion und Stabilität über die Zeit) zeigten. Abb. 3 zeigt die Ergebnisse zu Ladung, Größe und ROS-Gehalt für zwei Fälle. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 zusammengefasst. Als Referenz enthalten Abbildung 3 und Tabelle 1 die Eigenschaften der zuvor synthetisierten, nicht optimierten EWNS8, 9, 10, 11 (Basis-EWNS). Berechnungen der statistischen Signifikanz unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests sind in der Ergänzungstabelle S2 erneut veröffentlicht. Zusätzliche Daten umfassen außerdem Studien über die Auswirkung des Durchmessers des Probenahmelochs der Gegenelektrode (D) und des Abstands zwischen der Erdungselektrode und der Nadelspitze (L) (Ergänzende Abbildungen S2 und S3).
(a–c) AFM-Größenverteilung. (d – f) Oberflächenladungscharakteristik. (g) Charakterisierung von ROS und ESR.
Wichtig ist auch, dass unter allen oben genannten Bedingungen die gemessenen Ionisierungsströme im Bereich von 2–6 µA und die Spannungen im Bereich von -3,8 bis -6,5 kV lagen. Dies führte zu einem Stromverbrauch dieses einpoligen EWNS von weniger als 50 mW. Obwohl das EWNS unter hohem Druck synthetisiert wurde, war der Ozongehalt sehr niedrig und überschritt nie 60 ppb.
Ergänzende Abbildung S4 zeigt die simulierten elektrischen Felder für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm]. Die Felder für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] werden mit 2 × 105 V/m bzw. 4,7 × 105 V/m berechnet. Dies ist zu erwarten, da das Verhältnis von Spannung zu Abstand im zweiten Fall deutlich höher ist.
Abb. 3a,b zeigt den mit dem AFM8 gemessenen EWNS-Durchmesser. Die durchschnittlichen EWNS-Durchmesser für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] wurden mit 27 nm bzw. 19 nm berechnet. Die geometrischen Standardabweichungen der Verteilungen für die Fälle [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] betragen 1,41 bzw. 1,45, was auf eine enge Größenverteilung hindeutet. Sowohl die mittlere Größe als auch die geometrische Standardabweichung liegen sehr nahe an der Basis-EWNS und betragen 25 nm bzw. 1,41. Abb. 3c zeigt die Größenverteilung der Basis-EWNS, gemessen mit derselben Methode unter denselben Bedingungen.
Abb. 3d,e zeigt die Ergebnisse der Ladungscharakterisierung. Die Daten sind Durchschnittswerte von 30 gleichzeitigen Messungen von Konzentration (#/cm³) und Stromstärke (I). Die Analyse zeigt, dass die durchschnittliche Ladung der EWNS 22 ± 6 e- bzw. 44 ± 6 e- für [-6,5 kV, 4,0 cm] bzw. [-3,8 kV, 0,5 cm] beträgt. Im Vergleich zu den Baseline-EWNS (10 ± 2 e-) ist ihre Oberflächenladung deutlich höher, doppelt so hoch wie im Szenario [-6,5 kV, 4,0 cm] und viermal so hoch wie im Szenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. 3f zeigt grundlegende EWNS-Zahlungsdaten.
Aus den EWNS-Konzentrationskarten (Ergänzende Abbildungen S5 und S6) ist ersichtlich, dass die Szene [-6,5 kV, 4,0 cm] eine deutlich höhere Partikelanzahl aufweist als die Szene [-3,8 kV, 0,5 cm]. Es ist außerdem zu beachten, dass die EWNS-Konzentrationen bis zu 4 Stunden lang überwacht wurden (Ergänzende Abbildungen S5 und S6), wobei die EWNS-Generationsstabilität in beiden Fällen die gleichen Partikelanzahlkonzentrationen aufwies.
Abbildung 3g zeigt das EPR-Spektrum nach Abzug der Kontrollgruppe (Hintergrund) für optimierte EWNS bei [-6,5 kV, 4,0 cm]. Das ROS-Spektrum wird auch mit dem EWNS-Basisspektrum in einer zuvor veröffentlichten Arbeit verglichen. Die berechnete Anzahl der mit der Spinfalle reagierenden EWNS beträgt 7,5 × 104 EWNS/s und ist damit vergleichbar mit dem zuvor veröffentlichten Basis-EWNS8. Die EPR-Spektren zeigten deutlich das Vorhandensein von zwei ROS-Typen, wobei O2- überwog, während OH• in geringerer Menge vorhanden war. Darüber hinaus zeigte ein direkter Vergleich der Peakintensitäten, dass die optimierten EWNS einen signifikant höheren ROS-Gehalt als die Basis-EWNS aufwiesen.
Abb. 4 zeigt die Abscheidungseffizienz von EWNS in EPES. Die Daten sind ebenfalls in Tabelle I zusammengefasst und mit den ursprünglichen EWNS-Daten verglichen. In beiden EUNS-Fällen lag die Abscheidung selbst bei einer niedrigen Spannung von 3,0 kV nahe 100 %. Typischerweise reichen 3,0 kV aus, um unabhängig von der Änderung der Oberflächenladung eine 100-prozentige Abscheidung zu erreichen. Unter den gleichen Bedingungen betrug die Abscheidungseffizienz der Baseline-EWNS aufgrund der geringeren Ladung (durchschnittlich 10 Elektronen pro EWNS) nur 56 %.
Abbildung 5 und Tabelle 2 fassen den Inaktivierungsgrad von Mikroorganismen zusammen, die auf der Oberfläche von Tomaten inokuliert wurden, nachdem sie unter optimalen Bedingungen (-6,5 kV, 4,0 cm) 45 Minuten lang etwa 40.000 #/cm3 EWNS ausgesetzt waren. Inokulierte E. coli und L. innocua zeigten nach 45 Minuten Exposition eine signifikante Reduktion von 3,8 log. Unter den gleichen Bedingungen zeigte S. enterica eine geringere log-Reduktion von 2,2 log, während S. cerevisiae und M. parafortuitum eine Reduktion von 1,0 log aufwiesen.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen (Abbildung 6) zeigen die physikalischen Veränderungen, die durch EWNS in E. coli-, Salmonella enterica- und L. innocua-Zellen hervorgerufen werden und zur Inaktivierung führen. Kontrollbakterien wiesen intakte Zellmembranen auf, während exponierte Bakterien beschädigte Außenmembranen aufwiesen.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Kontroll- und exponierten Bakterien zeigten Membranschäden.
Die Daten zu den physikochemischen Eigenschaften der optimierten EWNS zeigen insgesamt, dass die EWNS-Eigenschaften (Oberflächenladung und ROS-Gehalt) im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten EWNS-Basisdaten8,9,10,11 deutlich verbessert wurden. Andererseits blieb ihre Größe im Nanometerbereich, was sehr ähnlich zu zuvor veröffentlichten Ergebnissen ist, sodass sie lange in der Luft verbleiben konnten. Die beobachtete Polydispersität lässt sich durch Änderungen der Oberflächenladung erklären, die das Ausmaß des Rayleigh-Effekts, die Zufälligkeit und das potenzielle Verschmelzen von EWNS bestimmen. Wie jedoch von Nielsen et al.22 ausführlich beschrieben, verringert eine hohe Oberflächenladung die Verdunstung, indem sie effektiv die Oberflächenenergie/-spannung des Wassertropfens erhöht. Diese Theorie wurde in unserer vorherigen Veröffentlichung8 für Mikrotröpfchen22 und EWNS experimentell bestätigt. Der Verlust mit der Zeit kann sich ebenfalls auf die Größe auswirken und zur beobachteten Größenverteilung beitragen.
Darüber hinaus beträgt die Ladung pro Struktur je nach Umständen etwa 22–44 e-, was deutlich höher ist als bei den grundlegenden EWNS, die eine durchschnittliche Ladung von 10 ± 2 Elektronen pro Struktur aufweisen. Es ist jedoch zu beachten, dass dies die durchschnittliche Ladung von EWNS ist. Seto et al. haben gezeigt, dass die Ladung nicht gleichmäßig ist und einer logarithmischen Normalverteilung folgt21. Im Vergleich zu unseren früheren Arbeiten verdoppelt die Verdoppelung der Oberflächenladung die Abscheidungseffizienz im EPES-System auf fast 100 %11.