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Poröse Silica-Partikel wurden durch ein Sol-Gel-Verfahren mit einigen Modifikationen hergestellt, um makroporöse Partikel zu erhalten. Diese Partikel wurden durch reversible Additionsfragmentierungs-Kettentransfer-Polymerisation (RAFT) mit N-Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PMI) und Styrol derivatisiert, um eine N-Phenylmaleimid-Interkalation der stationären Phase von Polystyrol (PMP) herzustellen. Edelstahlsäulen mit schmalem Durchmesser (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurden durch Aufschlämmungspackung gepackt. Bewertete PMP-Säule Trennung einer Peptidmischung bestehend aus fünf Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) und Trypsinverdau von menschlichem Serumalbumin (HAS). Unter optimalen Elutionsbedingungen beträgt die theoretische Bodenzahl der Peptidmischung bis zu 280.000 Böden/m². Vergleicht man die Trennleistung der entwickelten Säule mit Bei Verwendung der kommerziellen Ascentis Express RP-Amid-Säule wurde beobachtet, dass die Trennleistung der PMP-Säule der kommerziellen Säule hinsichtlich Trenneffizienz und Auflösung überlegen war.
In den letzten Jahren hat sich die biopharmazeutische Industrie zu einem expandierenden globalen Markt mit einem erheblichen Anstieg des Marktanteils entwickelt. Angesichts des explosionsartigen Wachstums der biopharmazeutischen Industrie1,2,3 ist die Analyse von Peptiden und Proteinen sehr gefragt. Zusätzlich zum Zielpeptid werden während der Peptidsynthese mehrere Verunreinigungen erzeugt, die eine chromatographische Reinigung erfordern, um Peptide mit der gewünschten Reinheit zu erhalten. Die Analyse und Charakterisierung von Proteinen in Körperflüssigkeiten, Geweben und Zellen ist aufgrund der großen Anzahl potenziell nachweisbarer Spezies in einer einzigen eine äußerst anspruchsvolle Aufgabe Obwohl Massenspektrometrie ein wirksames Werkzeug für die Peptid- und Proteinsequenzierung ist, ist die Trennung nicht ideal, wenn solche Proben in einem Durchgang in das Massenspektrometer injiziert werden. Dieses Problem kann durch die Implementierung von Flüssigchromatographie-Trennungen (LC) vor der MS-Analyse gemildert werden, wodurch die Anzahl der Analyten verringert wird, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in das Massenspektrometer gelangen Die Flüssigkeitschromatographie (LC) hat im letzten Jahrzehnt erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einer beliebten Technik in der Proteomanalyse geworden7,8,9,10.
Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RP-LC) wird häufig zur Reinigung und Trennung von Peptidmischungen unter Verwendung von Octadecyl-modifiziertem Silica (ODS) als stationärer Phase eingesetzt11,12,13. Stationäre RP-Phasen ermöglichen jedoch aufgrund ihrer komplexen Struktur und amphiphilen Natur keine zufriedenstellende Trennung von Peptiden und Proteinen 14,15. Daher sind speziell entwickelte stationäre Phasen erforderlich, um Peptide und Proteine ​​mit polaren und unpolaren Einheiten zu analysieren, um mit diesen zu interagieren und sie festzuhalten Analyten16. Die Mixed-Mode-Chromatographie, die multimodale Wechselwirkungen bietet, kann eine Alternative zur RP-LC für die Trennung von Peptiden, Proteinen und anderen komplexen Mischungen sein. Es wurden mehrere stationäre Mixed-Mode-Phasen hergestellt und mit diesen Phasen gefüllte Säulen für Peptid- und Proteintrennungen verwendet17,18,19,20,21. Stationäre Mixed-Mode-Phasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polare Interkalation/RPLC) eignen sich für die Peptid- und Proteintrennung Dies ist auf das Vorhandensein sowohl polarer als auch unpolarer Gruppen zurückzuführen22,23,24,25,26,27,28. In ähnlicher Weise zeigen polare interkalierende stationäre Phasen mit kovalent gebundenen polaren Gruppen eine gute Trennleistung und einzigartige Selektivität für polare und unpolare Analyten, da die Trennung von der Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase abhängt.Multimodale Interaktionen 29, 30, 31, 32. Kürzlich haben Zhang et al.30 stellten eine stationäre Polyaminphase mit Dodecyl-Endgruppen her und trennten erfolgreich Kohlenwasserstoffe, Antidepressiva, Flavonoide, Nukleoside, Östrogene und mehrere andere Analyten. Der polare Interkalator hat sowohl polare als auch unpolare Gruppen und kann daher zur Trennung von Peptiden und Proteinen verwendet werden, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Einheiten aufweisen. Polar eingebettete Säulen (z. B. in Amid eingebettete C18-Säulen) sind unter dem Handelsnamen Ascentis Express RP kommerziell erhältlich -Amidsäulen, diese Säulen werden jedoch nur für die Analyse von Amin 33 verwendet.
In der aktuellen Studie wurde eine polar eingebettete stationäre Phase (N-Phenylmaleimid-eingebettetes Polystyrol) hergestellt und für die Trennung von Peptiden und Trypsin-Verdaus von HSA bewertet Der Ligand Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat wurde synthetisiert und zur Derivatisierung von Siliciumdioxidpartikeln verwendet, um eine polare eingebettete stationäre Phase herzustellen. Die resultierende stationäre Phase wurde unter Verwendung des optimierten Packungsschemas in eine Edelstahlsäule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) gepackt. Die Säulenpackung wird durch mechanische Vibration unterstützt, um sicherzustellen, dass sich innerhalb der Säule ein homogenes Bett bildet. Bewerten Sie die Trennung von Peptidmischungen bestehend aus fünf Peptiden durch eine gepackte Säule;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) und Trypsin-Verdau von menschlichem Serumalbumin (HAS). Es wurde beobachtet, dass die Peptidmischung und der Trypsin-Verdau von HSA mit guter Auflösung und Effizienz getrennt wurden. Die Trennleistung der PMP-Säule wurde mit der der Ascentis Express RP-Amid-Säule verglichen. Sowohl Peptide als auch Proteine ​​erwiesen sich als gut aufgelöst und effizient auf der PMP-Säule, die effizienter war als die Ascentis Express RP-Amid-Säule.
PEG (Polyethylenglykol), Harnstoff, Essigsäure, Trimethoxyorthosilikat (TMOS), Trimethylchlorsilan (TMCS), Trypsin, menschliches Serumalbumin (HSA), Ammoniumchlorid, Harnstoff, Hexan Methyldisilazan (HMDS), Methacryloylchlorid (MC), Styrol, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxid (BPO), Acetonitril (ACN) in HPLC-Qualität, Methanol, 2-Propanol und Ace Ton Gekauft von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Eine Mischung aus Harnstoff (8 g), Polyethylenglykol (8 g) und 8 ml 0,01 N Essigsäure wurde 10 Minuten lang gerührt und dann 24 ml TMOS unter eiskalten Bedingungen hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 6 Stunden lang auf 40 °C und dann 8 Stunden lang auf 120 °C in einem Autoklaven aus rostfreiem Stahl erhitzt. Das Wasser wurde abgegossen und das restliche Material 12 Stunden lang bei 70 °C getrocknet. Die getrocknete weiche Masse wurde in einem Ofen glatt gemahlen und 12 Stunden lang bei 550 °C kalziniert. Drei Chargen wurden hergestellt und charakterisiert, um die Reproduzierbarkeit der Partikelgröße, Porengröße und Oberfläche zu untersuchen.
Durch Oberflächenmodifikation von Silica-Partikeln mit dem vorsynthetisierten Liganden Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) und anschließender radialer Polymerisation mit Styrol wurde eine polare Gruppen enthaltende Verbindung hergestellt.Stationäre Phase für Aggregate und Polystyrolketten. Der Herstellungsprozess wird im Folgenden beschrieben.
N-Phenylmaleimid (200 mg) und Methylvinylisocyanat (100 mg) wurden in trockenem Toluol gelöst und 0,1 ml 2,2′-Azoisobutyronitril (AIBN) wurden in den Reaktionskolben gegeben, um Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Copolymer (PMCP) herzustellen. Die Mischung wurde 3 Stunden lang auf 60 °C erhitzt, filtriert und 3 Stunden lang in einem Ofen bei 40 °C getrocknet.
Getrocknete Siliciumdioxidpartikel (2 g) wurden in trockenem Toluol (100 ml) dispergiert, gerührt und 10 Minuten lang in einem 500-ml-Rundkolben mit Ultraschall behandelt. PMCP (10 mg) wurde in Toluol gelöst und über einen Tropftrichter tropfenweise in den Reaktionskolben gegeben. Die Mischung wurde 8 Stunden lang bei 100 °C unter Rückfluss erhitzt, filtriert und mit Aceton gewaschen und 3 Stunden lang bei 60 °C getrocknet. PMCP-gebundene Silicapartikel (100 g) wurden in Toluol (200 ml) gelöst und 4-Hydroxy-TEMPO (2 ml) in Gegenwart von 100 µL Dibutylzinndilaurat als Katalysator zugegeben. Die Mischung wurde 8 Stunden lang bei 50 °C gerührt, filtriert und 3 Stunden lang bei 50 °C getrocknet.
Styrol (1 ml), Benzoylperoxid BPO (0,5 ml) und TEMPO-PMCP-gebundene Silicapartikel (1,5 g) wurden in Toluol dispergiert und mit Stickstoff gespült. Die Polymerisation von Styrol wurde 12 Stunden lang bei 100 °C durchgeführt. Das resultierende Produkt wurde mit Methanol gewaschen und über Nacht bei 60 °C getrocknet. Das Gesamtreaktionsschema ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 393 K entgast, um einen Restdruck von weniger als 10-3 Torr zu erhalten. Die bei einem relativen Druck von P/P0 = 0,99 adsorbierte N2-Menge wurde zur Bestimmung des Gesamtporenvolumens verwendet. Die Morphologie von nackten und ligandengebundenen Silica-Partikeln wurde mit Rasterelektronenmikroskopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan) untersucht. Getrocknete Proben (blankes Silica und ligandengebundene Silica-Partikel) wurden auf eine Aluminiumplatte gelegt Die Proben wurden mit einem Q150T-Sputterbeschichter mit Gold überzogen und eine 5 nm dicke Au-Schicht auf den Proben abgeschieden Aked-Silica-Partikel und ligandengebundene Silica-Partikel (jeweils 5 mg) wurden in 5 ml Isopropanol dispergiert, 10 Minuten lang beschallt, 5 Minuten lang gevortext und auf die optische Bank des Mastersizers gelegt. Die thermogravimetrische Analyse wurde mit einer Geschwindigkeit von 5 °C pro Minute über einen Temperaturbereich von 30 bis 800 °C durchgeführt.
Mit Glas ausgekleidete Edelstahlsäulen mit schmaler Bohrung und den Abmessungen (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurden mit der Aufschlämmungspackungsmethode gepackt, wobei das gleiche Verfahren wie in Lit. angewendet wurde.31. Eine Edelstahlsäule (mit Glasauskleidung, 100 × 1,8 mm Innendurchmesser) mit einem Auslassanschluss, der eine 1-µm-Fritte enthielt, wurde mit einem Aufschlämmungspacker (Alltech Deerfield, IL, USA) verbunden. Bereiten Sie eine Aufschlämmung der stationären Phase vor, indem Sie 150 mg der stationären Phase in 1,2 ml Methanol suspendieren und zur Lagersäule schicken. Methanol wurde sowohl als Aufschlämmungslösungsmittel als auch als Treiblösungsmittel verwendet. Füllen Sie die Säule nacheinander, indem Sie einen Druck von 100 MP für 10 Minuten, 80 MP für 15 Minuten und 60 MP für 30 Minuten anwenden. Während des Packens wurden mechanische Vibrationen mit zwei GC-Säulenschüttlern (Alltech, Deerfield, IL, USA) angewendet, um eine gleichmäßige Packung der Säule sicherzustellen. Schließen Sie den Aufschlämmungspacker und lassen Sie den Druck langsam ab, um Schäden innerhalb der Säule zu vermeiden. Trennen Sie die Säule von der Aufschlämmungspackungseinheit und schließen Sie ein weiteres Anschlussstück an den Einlass und an zum LC-System, um dessen Leistung zu überprüfen.
Es wurden eine LC-Pumpe (10AD Shimadzu, Japan), ein Injektor (Valco (USA) C14 W.05) mit 50-nL-Injektionsschleife, ein Membranentgaser (Shimadzu DGU-14A), ein UV-VIS-Kapillarfenster, ein spezieller µLC-Gerätedetektor (UV-2075) und glasbeschichtete Mikrosäulen konstruiert. Verwenden Sie sehr schmale und kurze Verbindungsschläuche, um den Effekt einer zusätzlichen Säulenbandverbreiterung zu minimieren. Nach dem Verpacken werden Kapillaren (50 μm) hergestellt ID 365 und Reduzierverbindungskapillaren (50 μm) wurden am 1/16-Zoll-Auslass der Reduzierverbindung installiert. Die Datenerfassung und chromatographische Verarbeitung erfolgte mit der Software Multichro 2000. Überwachung bei 254 nm. Die Analyten wurden auf UV-Absorption getestet. Chromatografische Daten wurden mit OriginPro8 (Northampton, MA) analysiert.
Albumin aus menschlichem Serum, lyophilisiertes Pulver, ≥ 96 % (Agarose-Gelelektrophorese), 3 mg, gemischt mit Trypsin (1,5 mg), 4,0 M Harnstoff (1 ml) und 0,2 M Ammoniumbicarbonat (1 ml). Die Lösung wurde 10 Minuten lang gerührt und 6 Stunden lang in einem Wasserbad bei 37 °C gehalten, dann mit 1 ml 0,1 % TFA gequencht. Filtern Sie die Lösung und lagern Sie sie unter 4 °C.
Die Trennung von Peptidmischungen und HSA-Trypsinverdauungen wurden separat auf PMP-Säulen bewertet. Überprüfen Sie die Trennung der Peptidmischung und der Trypsinverdauung von HSA durch die PMP-Säule und vergleichen Sie die Ergebnisse mit der Ascentis Express RP-Amid-Säule. Die theoretische Bodenzahl wird wie folgt berechnet:
REM-Bilder von bloßen Silica-Partikeln und ligandengebundenen Silica-Partikeln sind in Abb. 1 dargestellt.2 .REM-Bilder von nackten Silica-Partikeln (A, B) zeigen, dass diese Partikel im Gegensatz zu unseren früheren Studien kugelförmig sind, wobei die Partikel länglich sind oder eine unregelmäßige Symmetrie aufweisen. Die Oberfläche der ligandengebundenen Silica-Partikel (C, D) ist glatter als die der blanken Silica-Partikel, was möglicherweise auf die Beschichtung der Oberfläche der Silica-Partikel mit Polystyrolketten zurückzuführen ist.
Rasterelektronenmikroskopbilder von nackten Silica-Partikeln (A, B) und ligandengebundenen Silica-Partikeln (C, D).
Die Partikelgrößenverteilungen von bloßen Silica-Partikeln und ligandengebundenen Silica-Partikeln sind in Abbildung 3(A) dargestellt. Volumenbasierte Partikelgrößenverteilungskurven zeigten, dass die Größe der Silica-Partikel nach chemischer Modifikation zunahm (Abb. 3A). Die Partikelgrößenverteilungsdaten der Silica-Partikel aus der aktuellen Studie und der vorherigen Studie werden in Tabelle 1(A) verglichen. Die volumenbasierte Partikelgröße d(0,5) von PMP beträgt 3,36 μm im Vergleich zu unserer vorherigen Studie mit dem Wert ad(0,5). von 3,05 μm (Polystyrol-gebundene Silica-Partikel)34. Diese Charge wies im Vergleich zu unserer vorherigen Studie aufgrund der unterschiedlichen Verhältnisse von PEG, Harnstoff, TMOS und Essigsäure in der Reaktionsmischung eine engere Partikelgrößenverteilung auf Phase betrug die Schichtdicke 1,38 µm.
Partikelgrößenverteilung (A) und Porengrößenverteilung (B) von reinen Silica-Partikeln und ligandengebundenen Silica-Partikeln.
Die Porengröße, das Porenvolumen und die Oberfläche der Silica-Partikel der aktuellen Studie sind in Tabelle 1(B) angegeben. Die PSD-Profile von nackten Silica-Partikeln und ligandengebundenen Silica-Partikeln sind in Abbildung 3(B) dargestellt Die Änderung der Kurve ist in Abb. 3(B) dargestellt. Ebenso verringerte sich das Porenvolumen der Silica-Partikel nach der chemischen Modifikation von 0,67 auf 0,58 cm3/g. Die spezifische Oberfläche der derzeit untersuchten Silica-Partikel beträgt 116 m2/g, was mit unserer vorherigen Studie (124 m2/g) vergleichbar ist. Wie in Tabelle 1(B) gezeigt, verringerte sich auch die Oberfläche (m2/g) der Silica-Partikel von 116 m2/g auf 105 m2/g nach chemischer Modifizierung.
Die Ergebnisse der Elementaranalyse der stationären Phase sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Kohlenstoffbeladung der aktuellen stationären Phase beträgt 6,35 %, was niedriger ist als die Kohlenstoffbeladung unserer vorherigen Studie (Polystyrol-gebundene Silica-Partikel, 7,93 %35 bzw. 10,21 %). 42. Die Kohlenstoffbeladung der aktuellen stationären Phase ist gering, da bei der Herstellung des aktuellen SP neben Styrol einige polare Liganden wie Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) verwendet wurden ) und 4-Hydroxy-TEMPO wurden verwendet. Der Stickstoff-Gewichtsprozentsatz der aktuellen stationären Phase beträgt 2,21 %, verglichen mit 0,1735 bzw. 0,85 Gewichtsprozent Stickstoff in früheren Studien. Dies bedeutet, dass der Gewichtsprozentanteil an Stickstoff in der aktuellen stationären Phase aufgrund von Phenylmaleimid höher ist. Ebenso betrugen die Kohlenstoffbeladungen der Produkte (4) und (5) 2,7 % bzw. 2,9 %, während die Kohlenstoffbeladung des Endprodukts (6) betrug 6,35 %, wie in Tabelle 2 gezeigt. Der Gewichtsverlust wurde mit der stationären PMP-Phase überprüft, und die TGA-Kurve ist in Abbildung 4 dargestellt. Die TGA-Kurve zeigt einen Gewichtsverlust von 8,6 %, was gut mit der Kohlenstoffbeladung (6,35 %) übereinstimmt, da die Liganden nicht nur C, sondern auch N, O und H enthalten.
Der Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Ligand wurde für die Oberflächenmodifizierung von Silica-Partikeln ausgewählt, da er polare Phenylmaleimid-Gruppen und Vinylisocyanat-Gruppen aufweist. Vinylisocyanat-Gruppen können durch lebende radikalische Polymerisation weiter mit Styrol reagieren. Der zweite Grund besteht darin, eine Gruppe einzufügen, die eine mäßige Wechselwirkung mit dem Analyten und keine starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Analyten und der stationären Phase aufweist, da die Phenylmaleimid-Einheit bei normalem pH-Wert keine virtuelle Ladung aufweist. Die Polarität der stationären Phase kann durch das Optimum gesteuert werden Menge an Styrol und die Reaktionszeit der radikalischen Polymerisation. Der letzte Schritt der Reaktion (radikalische Polymerisation) ist kritisch und kann die Polarität der stationären Phase verändern. Eine Elementaranalyse wurde durchgeführt, um die Kohlenstoffbeladung dieser stationären Phasen zu überprüfen Produktivität, Auflösung, N-Wert usw.). Basierend auf diesen Experimenten wurde eine optimierte Formulierung zur Vorbereitung der stationären PMP-Phase ausgewählt, um eine kontrollierte Polarität und eine gute Analytretention sicherzustellen.
Fünf Peptidmischungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) wurden ebenfalls unter Verwendung einer PMP-Säule unter Verwendung einer mobilen Phase bewertet;60/40 (v/v) Acetonitril/Wasser (0,1 % TFA) bei einer Flussrate von 80 μL/min. Unter optimalen Elutionsbedingungen beträgt die theoretische Bodenzahl (N) pro Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) 20.000 ± 100 (200.000 Böden/m²). Tabelle 3 gibt die N-Werte für die drei PMP-Säulen an und die Chromatogramme sind in Abbildung 5 dargestellt A. Schnelle Analyse auf einer PMP-Säule bei hoher Flussrate (700 μl/min), fünf Peptide wurden innerhalb einer Minute eluiert, die N-Werte waren sehr gut, 13.500 ± 330 pro Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser), entspricht 135.000 Platten/m (Abbildung 5B). Drei gleich große Säulen (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurden mit drei verschiedenen Chargen stationärer PMP-Phase gepackt um die Reproduzierbarkeit zu überprüfen. Die Analytkonzentration für jede Säule wurde unter Verwendung der optimalen Elutionsbedingungen sowie der Anzahl der theoretischen Böden N und der Retentionszeit aufgezeichnet, um die gleiche Testmischung auf jeder Säule zu trennen. Die Reproduzierbarkeitsdaten für die PMP-Säulen sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Reproduzierbarkeit der PMP-Säule korreliert gut mit sehr niedrigen %RSD-Werten, wie in Tabelle 3 gezeigt.
Trennung der Peptidmischung auf der PMP-Säule (B) und der Ascentis Express RP-Amid-Säule (A);mobile Phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-Säulenabmessungen (100 × 1,8 mm ID);analytisch Die Elutionsreihenfolge der Verbindungen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) und 5 (Leucinsäure-Enkephalin)).
Eine PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) wurde für die Trennung von tryptischen Aufschlüssen von menschlichem Serumalbumin in der Hochleistungsflüssigchromatographie evaluiert. Das Chromatogramm in Abbildung 6 zeigt, dass die Probe gut getrennt ist und die Auflösung sehr gut ist Der Verdau wurde in 17 Peaks aufgeteilt, die 17 Peptiden entsprechen. Die Trenneffizienz jedes Peaks im HSA-Verdau wurde berechnet und die Werte sind in Tabelle 5 angegeben.
Ein tryptischer Verdau von HSA (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurde auf einer PMP-Säule aufgetrennt;Flussrate (100 µL/min), mobile Phase 60/40 Acetonitril/Wasser mit 0,1 % TFA.
Dabei ist L die Säulenlänge, η die Viskosität der mobilen Phase, ΔP der Säulengegendruck und u die lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase. Die Permeabilität der PMP-Säule betrug 2,5 × 10-14 m2, die Flussrate betrug 25 μL/min und es wurden 60/40 v/v ACN/Wasser verwendet. Die Permeabilität der PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) war ähnlich der unserer vorherigen Studie Ref .34. Die Permeabilität der mit oberflächlich porösen Partikeln gefüllten Säule beträgt: 1,7 × 10-15 für 1,3 μm-Partikel, 3,1 × 10-15 für 1,7 μm-Partikel, 5,2 × 10-15 und 2,5 × 10-14 m2 für 2,6 μm-Partikel. Für 5 μm-Partikel 43. Daher ist die Permeabilität der PMP-Phase ähnlich der von 5 μm Kern-Schale-Partikel.
Dabei ist Wx das Gewicht der mit Chloroform gepackten Säule, Wy das Gewicht der mit Methanol gepackten Säule und ρ die Dichte des Lösungsmittels. Dichten von Methanol (ρ = 0,7866) und Chloroform (ρ = 1,484). Die Gesamtporosität der SILICA PARTICLES-C18-Säulen (100 × 1,8 mm ID) 34 und C18-Harnstoff-Säulen 31, die wir zuvor untersucht haben, betrug 0 .63 bzw. 0,55. Dies bedeutet, dass das Vorhandensein von Harnstoffliganden die Permeabilität der stationären Phase verringert. Andererseits beträgt die Gesamtporosität der PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) 0,60. Die Permeabilität von PMP-Säulen ist geringer als die von Säulen, die mit C18-gebundenen Silica-Partikeln gefüllt sind, da in stationären Phasen vom C18-Typ die C18-Liganden als lineare Ketten an die Silica-Partikel gebunden sind. Während in stationären Phasen vom Polystyroltyp eine relativ dicke Polymerschicht um sie herum gebildet wird. In einem typischen Experiment wird die Säulenporosität wie folgt berechnet:
Abbildung 7A und B zeigen die PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) und die Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 × 1,8 mm ID) unter Verwendung der gleichen Elutionsbedingungen (d. h. 60/40 ACN/H2O und 0,1 % TFA).) des van-Deemter-Plots.Ausgewählte Peptidmischungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) wurden in 20 µL/min hergestellt. Die minimale Flussrate für beide Säulen beträgt 800 µL/min. Die minimalen HETP-Werte bei der optimalen Flussrate (80 µL/min) für die PMP-Säule und die Ascentis Express RP-Amid-Säule betrugen 2,6 µm bzw. 3,9 µm. Die HETP-Werte zeigen, dass die Trenneffizienz der PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) viel besser ist als die der kommerziell erhältlichen Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 × 1,8 mm ID). Das Van-Deemter-Diagramm in Abb. 7(A) zeigt, dass die Abnahme des N-Werts mit zunehmendem Fluss im Vergleich zu unserer vorherigen Studie nicht signifikant ist. Die höhere Trenneffizienz der PMP-Säule (100 × 1,8 mm). id) im Vergleich zur Ascentis Express RP-Amid-Säule basiert auf Verbesserungen der Partikelform, -größe und der komplexen Säulenpackungsverfahren, die in der aktuellen Arbeit verwendet werden34.
(A) Van-Deemter-Diagramm (HETP gegenüber linearer Geschwindigkeit der mobilen Phase), erhalten mit einer PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA. (B) Van-Deemter-Diagramm (HETP gegenüber linearer Geschwindigkeit der mobilen Phase), erstellt mit einer Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA .
Eine stationäre Phase aus polar eingebettetem Polystyrol wurde für die Trennung von synthetischen Peptidmischungen und Trypsinverdaus von menschlichem Serumalbumin (HAS) in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie hergestellt und bewertet. Die chromatographische Leistung von PMP-Säulen für Peptidmischungen ist hinsichtlich Trenneffizienz und Auflösung ausgezeichnet. Die verbesserte Trennleistung von PMP-Säulen ist auf eine Vielzahl von Gründen zurückzuführen, wie z. B. die Partikelgröße und Porengröße der Silica-Partikel, die kontrollierte Synthese der stationären Phase und die komplexe Säulenpackung. Zusätzlich zur hohen Trenneffizienz, niedrigem Säulengegendruck bei hohem Durchfluss Raten sind ein weiterer Vorteil dieser stationären Phase. PMP-Säulen weisen eine gute Reproduzierbarkeit auf und können für die Analyse von Peptidmischungen und den Trypsinverdau verschiedener Proteine ​​verwendet werden. Wir beabsichtigen, diese Säule für die Trennung von Naturstoffen, bioaktiven Verbindungen aus Heilpflanzen und Pilzextrakten in der Flüssigkeitschromatographie einzusetzen. Zukünftig werden PMP-Säulen auch für die Trennung von Proteinen und monoklonalen Antikörpern evaluiert.
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