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Die Angustifolius-Lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ist eine Hülsenfruchtpflanze, die zur Nahrungsmittelproduktion und zur Bodenverbesserung verwendet wird.Die weltweite Verbreitung von NLL als Kulturpflanze hat viele pathogene Pilze angezogen, darunter auch Lupinen-Anthraknose, die die verheerende Anthraknose-Krankheit verursacht.Zwei Allele, Lanr1 und AnMan, die eine erhöhte Resistenz verleihen, wurden in der NLL-Züchtung verwendet, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch noch unbekannt.In dieser Studie wurden die Marker Lanr1 und AnMan zum Screening europäischer NLL-Proben verwendet.Tests des Impfstoffs in einer kontrollierten Umgebung bestätigten die Wirksamkeit beider resistenter Spender.Das Profiling der differentiellen Genexpression wurde an repräsentativen resistenten und anfälligen Linien durchgeführt.Anthracnose-Resistenz war mit einer Überexpression der genontologischen Begriffe „GO:0006952 Verteidigungsreaktion“, „GO:0055114 Redoxprozess“ und „GO:0015979 Photosynthese“ verbunden.Darüber hinaus zeigte die Lanr1(83A:476)-Linie nach der Inokulation schnell eine signifikante Umprogrammierung des Transkriptoms, während die anderen Linien eine Verzögerung dieser Reaktion um etwa 42 Stunden zeigten.Abwehrreaktionen sind mit den Genen TIR-NBS, CC-NBS-LRR und NBS-LRR, 10 an der Pathogenese beteiligten Proteinen, Lipidtransferproteinen, Endoglucan-1,3-β-Glucosidase, glycinreichen Zellwandproteinen und Genen aus dem reaktiven Weg von Sauerstoff verbunden.Frühe Reaktionen auf 83A:476, einschließlich der sorgfältigen Unterdrückung von mit der Photosynthese verbundenen Genen, fielen mit einem erfolgreichen Schutz während der vegetativen Wachstumsphase der Pilzbiologie zusammen, was darauf hindeutet, dass ein Effektor die Immunität auslöst.Die Mandeloop-Reaktion wird verlangsamt, ebenso wie der gesamte horizontale Widerstand.
Die Schmalblättrige Lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) ist ein proteinreiches Getreide mit Ursprung im westlichen Mittelmeerraum1,2.Derzeit wird es als Nahrungspflanze für Tiere und Menschen angebaut.Aufgrund der Stickstofffixierung durch symbiotische stickstofffixierende Bakterien und der allgemeinen Verbesserung der Bodenstruktur gilt es auch als Gründüngung in Fruchtfolgesystemen.NLL hat im letzten Jahrhundert einen schnellen Domestikationsprozess durchlaufen und steht immer noch unter hohem Zuchtdruck3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Mit der weit verbreiteten Kultivierung von NLL schuf die Abfolge pathogener Pilze neue landwirtschaftliche Nischen und verursachte neue erntezerstörende Krankheiten. Am bemerkenswertesten für Lupinenzüchter und -züchter war das Auftreten von Anthracnose, verursacht durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Am bemerkenswertesten für Lupinenzüchter und -züchter war das Auftreten von Anthracnose, verursacht durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Die wichtigsten Beispiele für die Bekämpfung von Krankheiten und Krankheiten durch Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Am bemerkenswertesten für Lupinenzüchter und -züchter war das Auftreten von Anthracnose, verursacht durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说, 最引人注目的是炭疽病的出现, 它是由病原真菌Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的.Die meisten Arten von Tieren, die sich mit Colletotrichum lupini (Bondar) behaart fühlen. 1 Die häufigste Verwendung für Fermenter und Selektoren von Lupinen ermöglicht die Ansteckung und Auswahl eines krankheitserregenden Pilzes aus Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Am auffälligsten für Lupinenzüchter und -züchter ist das Auftreten von Anthracnose, verursacht durch den pathogenen Pilz Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Die frühesten Berichte über die Krankheit kamen aus Brasilien und den Vereinigten Staaten, wobei typische Symptome 1912 bzw. 1929 auftraten.Nach etwa 30 Jahren wurde der Erreger jedoch als Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz bezeichnet. & Sacc., teleomorphes Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorphes Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Telemorphon Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Teleomorph von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., eine Gattung von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., eine Gattung von Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in einer uralten Morphologie. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .und H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。und H. Schlenk, .Eine vorläufige Krankheitsphänotypisierung, die Mitte des 20. Jahrhunderts durchgeführt wurde, zeigte eine gewisse Resistenz bei NLL und Akzessionen der Gelben Lupine (L. luteus L.), aber alle getesteten Akzessionen der Weißen Lupine (L. albus L.) waren sehr anfällig15,16.Studien haben gezeigt, dass die Entwicklung von Anthracnose mit erhöhtem Niederschlag (Luftfeuchtigkeit) und Temperatur (im Bereich von 12–28 °C) verbunden ist, was bei höheren Temperaturen zu einer Verletzung der Resistenz führt17, 18. Tatsächlich war die Zeit, die die Konidien zum Keimen und zum Ausbruch der Krankheit benötigten, bei 24 °C (4 Stunden) viermal kürzer als bei 12 °C (16 Stunden) unter Bedingungen hoher Luftfeuchtigkeit19.Somit hat die anhaltende globale Erwärmung zur Ausbreitung von Anthracnose geführt.Allerdings wurde die Krankheit in Frankreich (1982) und der Ukraine (1983) als Vorbote einer drohenden Bedrohung beobachtet, von der damaligen Lupinenindustrie jedoch offenbar ignoriert20,21.Einige Jahre später breitete sich diese verheerende Krankheit auf der ganzen Welt aus und betraf auch große Lupinenanbauländer wie Australien, Polen und Deutschland22,23,24.Nach einem Anthracnose-Ausbruch Mitte der 1990er Jahre führte ein umfangreiches Screening zur Identifizierung mehrerer resistenter Spender in NLL19-Proben.Die NLL-Resistenz gegen Anthracnose wird durch zwei separate dominante Allele kontrolliert, die in verschiedenen Keimplasmaquellen vorkommen: Lanr1 in der Sorte Tanjil und Wonga und AnMan in der Sorte.Mandalay 25, 26. Diese Allele ergänzen die molekularen Marker, die die Auswahl resistenten Keimplasmas in Zuchtprogrammen unterstützen25,26,27,28,29,30.Die resistente Zuchtlinie 83A:476, die das Lanr1-Allel trägt, wurde mit der anfälligen Wildlinie P27255 gekreuzt, um eine RIL-Population zu erhalten, die auf Anthracnose-Resistenz segregiert, was es ermöglichte, den Lanr1-Locus dem Chromosom NLL-1131, 32, 33 zuzuordnen. Durch die Ausrichtung von Verknüpfungskartenmarkierungen von flankierenden Resistenz-Loci zu Anthracnose mit einem genomischen Gerüst ergab NLL den Standort aller drei Allele auf demselben Chromosom (NLL-11), aber an unterschiedlichen Positionen29,34,35.Aufgrund der geringen Anzahl von RILs und der großen genetischen Distanz zwischen Markern und entsprechenden Allelen können jedoch keine verlässlichen Rückschlüsse auf die ihnen zugrunde liegenden Gene gezogen werden.Andererseits ist der Einsatz der umgekehrten Genetik bei Lupinen aufgrund ihres sehr geringen Regenerationspotenzials schwierig, was eine genetische Manipulation umständlich macht37.
Die Entwicklung von domestiziertem Keimplasma, das das gewünschte Allel im homozygoten Zustand trägt, wie 83A:476 (Lanr1) und Mandelup (AnMan), hat die Tür zur Untersuchung der Anthracnose-Resistenz angesichts des Vorhandenseins gegensätzlicher Allelkombinationen in Wildpopulationen geöffnet.Möglichkeiten molekularer Mechanismen.Vergleichen Sie Abwehrreaktionen, die von bestimmten Genotypen erzeugt werden.In dieser Studie wurde die frühe Transkriptomreaktion von NLL auf die Impfung gegen C. lupini untersucht.Zunächst wurde ein europäisches NLL-Keimplasma-Panel mit 215 Linien unter Verwendung molekularer Marker gescreent, die die Lanr1- und AnMan-Allele markieren.Anschließend wurde die Anthracnose-Phänotypisierung unter kontrollierten Bedingungen an 50 NLL-Linien durchgeführt, die zuvor auf molekulare Marker selektiert worden waren.Basierend auf diesen Experimenten wurden vier Linien mit unterschiedlicher Anthracnose-Resistenz und Lanr1/AnMan-Allelzusammensetzung für die Profilierung der differenziellen Abwehrgenexpression mithilfe zweier komplementärer Ansätze ausgewählt: Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und Echtzeit-PCR-Quantifizierung.
Das Screening eines Satzes von NLL-Keimplasma (N = 215) mit den Markern Lanr1 (Anseq3 und Anseq4) und AnMan (Anseq4) und AnMan (AnManM1) zeigte, dass nur eine Linie (95726, in der Nähe von Salamanca-b) das „Resistenz“-Allel für alle Marker verstärkt, während „Vorhandensein „anfälliger“ Allele“ den Anteil aller Marker in 158 (~73) ergab ,5%) Linien.Dreizehn Linien produzierten zwei „resistente“ Allele des Lanr1-Markers und 8 Linien produzierten „resistente“ Allele von Lanr1.Marker.Das „Resistenz“-Allel des AnMan-Markers (Ergänzungstabelle S1).Zwei Linien waren heterozygot für den Anseq3-Marker und eine Linie heterozygot für den AnManM1-Marker.42 Linien (19,5 %) trugen entgegengesetzte Phasen der Anseq3- und Anseq4-Allele, was auf eine hohe Rekombinationshäufigkeit zwischen diesen beiden Loci hinweist.Anthracnose-Phänotypen unter kontrollierten Bedingungen (Ergänzungstabelle S2) zeigten eine Variabilität in der Resistenz der getesteten Genotypen, die sich im Schweregrad der Anthracnose widerspiegelte.Die Unterschiede in den Durchschnittswerten lagen zwischen 1,8 (mäßig resistent) und 6,9 (anfällig) und die Unterschiede im Pflanzengewicht lagen zwischen 0,62 (anfällig) und 4,45 g (resistent). Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den in zwei Wiederholungen des Experiments beobachteten Werten (0,51 für den Schweregrad der Erkrankung, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (– 0,59 und – 0,77, P < 0,0001). Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den in zwei Wiederholungen des Experiments beobachteten Werten (0,51 für die Schweregradscores der Erkrankung, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (− 0,59 und − 0,77, P < 0,0001). Die Ergebnisse der zweiten Korrelationsperiode wurden in zwei weiteren Tests ermittelt (0,51 für Einzeltests, P = 0,00017 und 0,61). Massenabmessungen, P < 0,0001), zusätzlich zu diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Es wurde eine signifikante Korrelation zwischen den in zwei Wiederholungen des Experiments beobachteten Werten (0,51 für den Schweregrad der Erkrankung, P = 0,00017 und 0,61 für das Pflanzengewicht, P < 0,0001) sowie zwischen diesen beiden Parametern (- 0,59 und -0,77, P < 0,0001) gefunden (0,0001).疾病严重程度评分为0.51，P = 0.00017，植物重(ca. 0,61, P < 0,0001).在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 评 分为 分为 分为 0,5 1, p = 0,00017, 0,61, p <0,0001, 0,59 und 0,59和- 0,77, P < 0,0001)。 Es wurde ein zentraler Korrelationszeitraum von zwei Punkten ermittelt (Zielpunktzahl 0,51, P = 0,00017 und eine Mindestpunktzahl von 0). ,61, P <0,0001), und zwischen diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,0001) 0,77, P <0,0001. Es gab eine signifikante Korrelation zwischen den doppelt beobachteten Werten (Schweregrad der Erkrankung 0,51, P = 0,00017 und Pflanzengewicht 0,61, P < 0,0001) und zwischen diesen beiden Parametern (-0,59 und -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Typische Symptome, die bei anfälligen Pflanzen beobachtet werden, sind das Abknicken und Verdrehen des Stängels, das einer „Hirtenbogen“-Struktur ähnelt, gefolgt von ovalen Läsionen mit orange/rosa Sporozoiten (ergänzende Abbildung 1).Australische Akzessionen, die die Gene Lanr1 (83A:476 und Tanjil) und AnMan (Mandelup) tragen, sind mäßig resistent (0,0331 und 0,0036).Einige Linien, die auch „resistente“ Lanr1- und/oder AnMan-Allele tragen, zeigen Krankheitssymptome.
Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien, denen jedes „resistente“ Marker-Allel fehlte, ein hohes Maß an Anthracnose-Resistenz (vergleichbar oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für Score und 0,001 für Pflanzengewicht) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für Score und Nicht-Signatur). wichtig für das Gewicht). Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien, denen jedes „resistente“ Marker-Allel fehlte, ein hohes Maß an Anthracnose-Resistenz (vergleichbar oder höher als bei den Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für Score und 0,001 für Pflanzengewicht) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für Score und Nicht-Signatur). wichtig für das Gewicht). Interessant ist, dass die NLL-Linie, die mit der „Resistenz“-Markierungspolitik begonnen hat, eine Reihe von Dienstleistungen in der Nähe (zusammen mit anderen oder anderen) benötigt Dies gilt insbesondere für Lanr1-Gene und AnMan-Gene, wie Boregine (Wert P <0,0001 für alle Parameter), Bojar (Wert P < 0,0001 für Konzentrationen und 0,001 für Massenraster) und viele ии B-549/79b (Wert P <0,0001 für Messungen und nicht für Messungen geeignet). Interessanterweise zeigten mehrere NLL-Linien, denen jedes „resistente“ Marker-Allel fehlte, ein hohes Maß an Resistenz gegen Anthracnose (vergleichbar mit oder höher als für die Genotypen Lanr1 oder AnMan), wie Boregine (P-Wert < 0,0001 für beide Parameter), Bojar (P-Wert < 0,0001 für die Bewertung und 0,001 für das Pflanzengewicht) und Population B-549/79b (P-Wert < 0,0001 für die Bewertung und nicht). von Bedeutung für das Gewicht).有趣的是,一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疽病抗性（与Lanr1 或AnMan基因型相当或更高）, 例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）, Bojar（P 值< 得分为0.0001, 植物重量为0.001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Es ist interessant, dass einige NLL-Systeme, die keine „antigenen“ Marker haben, eine hohe horizontale Resistenz aufweisen (entspricht Lanr1- oder AnMan-Genen oder höher), wie Boregine (beide Parameter P < 0,0001), Bojar (P-Wert < 0,0001, Pflanzengewicht 0,001) und Stamm B-549/79b (P-Wert < 0,0001, Gewicht nicht signifikant). Interessanterweise haben NLL-Vertreter, die alle „Resistenzregeln“ markiert haben, verschiedene Quellen für die Analyse ausgewählt (gekürzt oder von Ihnen verwendet). , aufgrund der Gentypen Lanr1 oder AnMan), auch Boregine (Wert P für Parameter <0,0001), Bojar (Wert P <0,0001, Mindestraster 0,001) und Population B-549/79b (Zertifizierung). ка P-Wert <0,0001, nicht ausreichend). Interessanterweise zeigten einige NLL-Linien, denen keine Resistenz-Marker-Allele fehlt, hohe Anthracnose-Resistenz (vergleichbar mit oder höher als LANR1- oder Anman-Genotypen), wie z.Dieses Phänomen legt die Möglichkeit einer neuen genetischen Resistenzquelle nahe und erklärt den beobachteten Mangel an Korrelation zwischen Markergenotypen und Krankheitsphänotypen (P-Werte von ~0,42 bis ~0,98).So zeigte der Kolmogorov-Smirnov-Test, dass die Daten zur Anthracnose-Resistenz für Scores (P-Werte 0,25 und 0,11) und Pflanzenmasse (P-Werte 0,47 und 0,55) annähernd normalverteilt waren, was meine Hypothese nahelegt, dass mehr Allele als Lanr1 und AnMan beteiligt sind.
Basierend auf den Ergebnissen des Anthracnose-Resistenz-Screenings wurden 4 Linien für die Transkriptomanalyse ausgewählt: 83A:476, Boregine, Mandelup und Population 22660. Diese Linien wurden in Inokulationsexperimenten durch RNA-Sequenzierung erneut auf Anthrax-Resistenz getestet, vorausgesetzt, sie waren die gleichen wie im vorherigen Test.Die Score-Werte waren wie folgt: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) und Population 22660 (6,11 ± 1,29).
Das Illumina NovaSeq 6000-Protokoll erreichte durchschnittlich 40,5 Mread-Paare pro Probe (29,7 bis 54,4 Mreads) (Ergänzungstabelle S3).Die Ausrichtungswerte in der Referenzsequenz lagen zwischen 75,5 % und 88,6 %.Die durchschnittliche Korrelation der Read-Count-Daten zwischen experimentellen Varianten und biologischen Replikaten lag zwischen 0,812 und 0,997 (Mittelwert 0,959). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2917 keine Expression, und die anderen 4785 Gene wurden in vernachlässigbarem Ausmaß exprimiert (Basismittelwert < 5). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2917 keine Expression, und die anderen 4785 Gene wurden in vernachlässigbarem Ausmaß exprimiert (Basismittelwert < 5). Von 35.170 genehmigten 2917-Jährigen wurde kein Expressversand durchgeführt, während 4785 GEN-Tests auf nationaler Ebene (basierend auf der Website) durchgeführt wurden å <5). Von den 35.170 analysierten Genen zeigten 2917 keine Expression und die restlichen 4785 Gene wurden in einem vernachlässigbaren Ausmaß exprimiert (Basismittelwert <5).35.170 Seiten, 2917 Seiten, 4.785 Seiten, 4.785 Seiten, 5 Seiten ）。35.170 Von 35.170 geprüften Personen im Jahr 2917 wurde keine Genehmigung erteilt, und 4785 Personen wurden nicht erneut aktualisiert (basierend auf der vorherigen Bewertung < 5). Von den 35.170 analysierten Genen wurden 2917 nicht exprimiert und die restlichen 4785 Gene zeigten eine vernachlässigbare Expression (Basismittelwert <5).Somit betrug die Anzahl der während des Experiments als exprimiert betrachteten Gene (Basismittelwert ≥ 5) 27.468 (78, 1%) (Ergänzungstabelle S4).
Vom ersten Zeitpunkt an reagierten alle NLL-Linien auf die Inokulation von C. lupini (Stamm Col-08) mit einer Neuprogrammierung des Transkriptoms (Tabelle 1), es wurden jedoch signifikante Unterschiede zwischen den Linien beobachtet.Somit zeigte die Resistenzlinie 83A:476 (die das Lanr1-Gen trägt) zum ersten Zeitpunkt (6 hpi) eine signifikante Transkriptom-Reprogrammierung mit einem 31- bis 69-fachen Anstieg der Anzahl isolierter Up- und Down-Gene im Vergleich zu anderen Zeitpunkten zu diesem Zeitpunkt.Darüber hinaus war dieser Höhepunkt nur von kurzer Dauer, da die Expression nur einiger weniger Gene zum zweiten Zeitpunkt (12 hpi) signifikant verändert blieb.Interessanterweise erfuhr Boregine, das im Transplantattest ebenfalls ein hohes Maß an Resistenz zeigte, während des Experiments keine so massive transkriptionelle Umprogrammierung.Allerdings war die Anzahl der differentiell exprimierten Gene (DEG) für Boregine und 83A:476 bei 12 HPI gleich.Sowohl Mandelup als auch Population 22660 zeigten zum letzten Zeitpunkt DEG-Höchstwerte (48 l/s), was auf eine relative Verzögerung der Abwehrreaktionen hinweist.
Da 83A:476 im Vergleich zu allen anderen Linien als Reaktion auf C. lupini bei 6 HPI einer massiven Transkriptom-Reprogrammierung unterzogen wurde, waren ~91 % der zu diesem Zeitpunkt beobachteten DEGs linienspezifisch (Abb. 1).Es gab jedoch einige Überschneidungen bei den frühen Reaktionen zwischen den Studienlinien, da 68,5 %, 50,9 % bzw. 52,6 % DEG in Boregine, Mandelup und Population 22660 zu bestimmten Zeitpunkten mit denen in 83A:476 überlappten.Diese DEGs machten jedoch nur einen kleinen Teil (0,97–1,70 %) aller DEGs aus, die derzeit mit 83A:476 erkannt wurden.Darüber hinaus waren zu diesem Zeitpunkt 11 DEGs aus allen Linien kohärent (Ergänzungstabellen S4–S6), einschließlich gemeinsamer Komponenten pflanzlicher Abwehrreaktionen: Lipidtransferprotein (TanjilG_32225), Endoglucan-1,3-β-glucosid-Enzym (TanjilG_23384), zwei stressinduzierbare Proteine ​​wie SAM22 (TanjilG_31528 und TanjilG_31531), grundlegendes Latexprotein (TanjilG_32352) und zwei glycinreiche strukturelle Zellwandproteine ​​(TanjilG_19701 und TanjilG_19702).Es gab auch eine relativ hohe Überlappung der Transkriptomantworten zwischen 83A:476 und Boregine bei 24 HPI (insgesamt 16–38 % DEG) und zwischen Mandelup und Population 22660 bei 48 HPI (insgesamt 14–20 % DEG).
Venn-Diagramm, das die Anzahl der differentiell exprimierten Gene (DEG) in Schmalblättrigen Lupinenlinien (NLL) zeigt, die mit Colletotrichum lupini (Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen, 1999) inokuliert wurden.Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, Träger des Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des AnMan-Allels) und Population 22660 (sehr anfällig).Die Abkürzung hpi steht für Stunden nach der Impfung.Zur Vereinfachung der Grafik wurden Nullwerte entfernt.
Der Satz überexprimierter Gene bei 6 hpi wurde auf das Vorhandensein kanonischer R-Gendomänen analysiert (Ergänzungstabelle S7).Diese Studie ergab eine Transkriptominduktion klassischer Krankheitsresistenzgene mit NBS-LRR-Domänen nur bei 83A:476.Dieser Satz bestand aus einem TIR-NBS-LRR-Gen (tanjilg_05042), fünf CC-NBS-LRR-Genen (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 und tanjilg_16162) sowie vier NBS-LR, Tanjilg_16162 und vier NBS-LRRE (tanjilg_16162). ) sowie Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) und Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Alle diese Gene haben kanonische Domänen, die in konservierten Sequenzen angeordnet sind.Zusätzlich zu den NBS-LRR-Domänengenen wurden mehrere RLL-Kinasen bei 6 hpi aktiviert, nämlich eine in Boregine (TanjilG_19877), zwei in Mandelup (TanjilG_07141 und TanjilG_19877) und in Population 22660 (TanjilG_09014 und TanjilG_10361) und zwei in 83A 27:476 .
Gene mit signifikant veränderter Expression als Reaktion auf die Inokulation mit C. lupini (Stamm Col-08) wurden einer Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse unterzogen (Ergänzungstabelle S8). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Linie) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Linie) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2). Das erste Mal, dass der biologische Prozess mit „GO: 0006952 gesperrter Ausgang“ abgeschlossen wurde, wurde in 6 von 16 (Zeitraum ×) geändert Linien) Kombination mit einem bestimmten Wert (Wert P <0,001) (Risk. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 von 16 (Zeit × Abstammungslinie) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应“, 16 个 (时间×线）组合中的的6 个).中,具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 Der repräsentativste biologische Prozessbegriff ist „GO:0006952 Abwehrreaktion“, der in 6 der 16 (时间×线) Kombinationen mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) (图2) vorkommt. Der erste Teil des vorläufigen biologischen Prozesses lautete „GO: 0006952 Defense Response“ und war in der Kombination 6 von 16 (Zeitraum × Linien) verfügbar ) mit einem bestimmten Wert (Wert P <0,001) (Risk. 2). Der am häufigsten überrepräsentierte biologische Prozessbegriff war „GO:0006952 Defense Response“, der in 6 von 16 Kombinationen (Zeit × Linie) mit hoher Signifikanz (P-Wert < 0,001) auftrat (Abb. 2).Dieser Begriff war zu zwei Zeitpunkten in 83A überrepräsentiert: 476 und Boregine (6 und 24 hpi) und zu einem Zeitpunkt in Mandelup und Population 22660 (12 bzw. 6 hpi).Dies ist ein erwartetes Ergebnis, das die antimykotische Reaktion der resistenten Linien unterstreicht.Darüber hinaus reagierte 83A:476 auf C. lupini, indem es schnell Gene induzierte, die mit dem oxidativen Ausbruch in Verbindung stehen, der durch den Begriff „GO:0055114 Redoxprozess“ dargestellt wird, was auf eine spezifische Abwehrreaktion hinweist, während Boregine spezifische Abwehrreaktionen zeigte, die mit dem Begriff „GO“ in Zusammenhang stehen.:0006950 Stressreaktion“.Population 22660 aktivierte die horizontale Resistenzreaktion mit sekundären Metaboliten, was die übermäßige Anzahl der Begriffe „GO:0016104 Prozess der Triterpen-Biosynthese“ und „GO:0006722 Prozess des Triterpen-Metabolismus“ (beide Begriffe gehören zum gleichen Satz von Genen) hervorhob. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der GO-Terminbereicherungsanalyse lag die Stabilität der Mandelup-Reaktion zwischen Boregine und Population 22660. Darüber hinaus war die frühe Reaktion 83A:476 (6 hpi) und verzögerte Reaktion Mandelup und Population 22660 umfassen den Begriff GO:0015979 „Photosynthese“ und andere verwandte biologische Prozesse.
Die Begriffe der Bioprozess-Genontologie, die bei der Annotation unterschiedlich exprimierter Gene während der Transkriptomreaktionen von Schmalblättrigen Lupinen (NLL), die mit Milzbrandlupinen (Stamm Col-08, 1999 aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen, gewonnen) geimpft wurden, ausgewählt wurden, sind stark übertrieben.Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, unbekannter genetischer Hintergrund), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
Da diese Studie darauf abzielte, Gene zu identifizieren, die zur Anthracnose-Resistenz beitragen, wurden die den GO-Begriffen „GO: 0006952 Abwehrreaktionen“ und „GO: 0055114 Redoxprozesse“ zugeordneten Gene mit Grenzwerten analysiert, da die Basislinie ≥ 30 mit mindestens einer Linie bedeutet.× Zeitpunkt der Kombination statistisch signifikanter Werte von log2 (Faltänderung).Die Anzahl der Gene, die diese Kriterien erfüllten, betrug 65 für GO:0006952 und 524 für GO:0055114.
83A:476 ergab zwei DEG-Peaks, die mit dem Begriff GO:0006952 versehen waren, der erste bei 6 Genen pro Zoll (64 Gene, Auf- und Abregulierung) und der zweite bei 24 Genen pro Zoll (15 Gene, nur Aufwärtsregulierung).Boregine zeigte auch, dass GO:0006952 zum gleichen Zeitpunkt seinen Höhepunkt erreichte, jedoch mit weniger DEG (11 und 8) und bevorzugter Aktivierung.Mandeloop zeigte zwei Peaks von GO:0006952 bei 12 und 48 HPI, beide trugen 12 Gene (das erste mit aktivierenden Genen und das zweite nur mit unterdrückenden Genen), während die 22660-Population bei 6 HPI (13 Gene) eine größere Dominanz des Anstiegspeaks aufwies.Verordnung.Es ist zu beachten, dass 96,4 % der GO:0006952 DEG in diesen Peaks die gleiche Art von Reaktion aufwiesen (nach oben oder unten), was auf eine signifikante Überlappung der Abwehrreaktionen trotz Unterschieden in der Anzahl der beteiligten Gene hinweist.Die größte Gruppe von Sequenzen im Zusammenhang mit dem Begriff GO:0006952 kodiert das Starvation Stress-Associated Message Protein 22 (SAM22-like), das zur Klasse 10 Pathogenesis-associated Protein (PR-10)-Proteinklade und zum Kernproteinlatex gehört.ähnliches (MLP-ähnliches) Protein (Abb. 3).Die beiden Gruppen unterschieden sich in der Art des Ausdrucks und der Richtung der Reaktion.Die Gene, die für SAM22-ähnliche Proteine ​​kodieren, zeigten zu frühen Zeitpunkten (6 oder 12 hpi) eine konsistente und signifikante Induktion und reagierten am Ende des Experiments im Allgemeinen nicht (48 hpi), während MLP-ähnliche Proteine ​​bei 6 hpi eine Koordination zeigten.hpi.83A:476 und Mandelup bei 48 PS/Zoll, fast alle anderen Datenpunkte reagierten nicht.Darüber hinaus folgten Unterschiede in den Expressionsprofilen von SAM22-ähnlichen Proteingenen der beobachteten Variabilität der Anthracnose-Resistenz, da resistentere Linien mehr Zeitpunkte hatten, zu denen diese Gene signifikant induziert wurden, als empfindlichere Gene.Ein weiteres LlR18A/B-ähnliches PR-10-Gen zeigte ein sehr ähnliches Expressionsmuster wie das SAM22-ähnliche Proteingen.
Die Hauptkomponenten des biologischen Prozessbegriffs „GO:0006952 Defense Response“ und die Expressionsmuster der Kandidatengene der Lanr1- und AnMan-Allele wurden identifiziert.Die Log2-Skala stellt Log2-Werte (fache Änderung) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) zum gleichen Zeitpunkt dar.Die folgenden schmalblättrigen Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
Darüber hinaus wurden die Expressionsprofile der RNA-seq-Kandidatengene Lanr1 (TanjilG_05042) und AnMan (TanjilG_12861) ausgewertet (Abb. 3).Das TanjilG_05042-Gen zeigte eine signifikante Reaktion (Aktivierung) bei 83A:476 nur zum ersten Zeitpunkt (6 hpi), während TanjilG_12861 in Mandeloop nur zu zwei Zeitpunkten signifikant war: 6 hpi (Herunterregulierung) und 24 hpi (6 hpi).Mit.).einstellbar) ).
Die am stärksten überexprimierten Gene im Begriff GO:0055114 „Redoxprozess“ waren Gene, die für Cytochrom-P450-Proteine ​​und Peroxidase kodierten (Abb. 4).Bei Proben, die aus 83A:476 bei 6 HPI isoliert wurden, wurden im Allgemeinen maximale oder minimale log2-Werte (Fold Change) (für 86,6 % der Gene) zwischen inokulierten und Kontrollpflanzen beobachtet, was die starke Reaktion dieses Genotyps auf das inokulierte Geschlecht unterstreicht.83A:476 zeigte den signifikantesten GO: 0055114 DEG bei 6 hpi (503 Gene), während die übrigen Linien bei 48 hpi (Boregine, 31 Gene; Mandelup, 85 Gene; und Population 22660, 78 Gene)).In den meisten Genen der GO:0055114-Familie wurden zwei Arten von Reaktionen auf die Impfung (Aktivierung und Hemmung) beobachtet.Interessanterweise wurden bis zu 97,6 % der DEGs für den Begriff GO: 0055114 in Mandelupe bei 48 PS identifiziert. Diese Beobachtungen legen nahe, dass trotz des deutlich geringeren Maßstabs (d. h. der Anzahl der mutierten Redoxgene 85 gegenüber 503) das Muster der verzögerten Transkriptomreaktionen von Mandelup auf Anthracnose der frühen Reaktion von 83A:476 ähnelt.In Boregine und Population 22660 ist diese Konvergenz mit 51,6 % bzw. 75,6 % geringer.
Die Ausdrucksmuster der Hauptkomponenten des Begriffs des biologischen Prozesses „GO:0055114 Redox-Prozess“ wurden aufgedeckt.Die Log2-Skala stellt Log2-Werte (fache Änderung) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) zum gleichen Zeitpunkt dar.Die folgenden schmalblättrigen Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
83A:476 Zu den transkriptomischen Reaktionen auf die Inokulation mit C. lupini (Stamm Col-08) gehörte auch die koordinierte Stummschaltung von Genen, die dem Begriff GO:0015979 „Photosynthese“ zugeschrieben werden, und anderen verwandten biologischen Prozessen (ABB. 5).Dieser GO:0015979 DEG-Satz enthielt 105 Gene, die bei 6 hpi bei 83A:476 signifikant unterdrückt wurden.In dieser Untergruppe wurden auch 37 Gene in Mandelup bei 48 HPI und 35 zum gleichen Zeitpunkt in der 22660-Population herunterreguliert, darunter 19 DEGs, die beiden Genotypen gemeinsam sind.In keiner Kombination (Zeile x Zeit) wurden DEGs im Zusammenhang mit dem Begriff GO: 0015979 signifikant aktiviert.
Die Ausdrucksmuster der Hauptkomponenten des Begriffs des biologischen Prozesses „GO:0015979 Photosynthese“ wurden aufgedeckt.Die Log2-Skala stellt Log2-Werte (fache Änderung) zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern, Wizhenica, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) zum gleichen Zeitpunkt dar.Die folgenden schmalblättrigen Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels) und Population 22660 (anfällig).
Basierend auf den Ergebnissen der differentiellen Expressionsanalyse und vermutlich an Abwehrreaktionen gegen pathogene Pilze beteiligt, wurde dieser Satz von sieben Genen für die Quantifizierung von Expressionsprofilen durch Echtzeit-PCR ausgewählt (Ergänzungstabelle S9).
Das mutmaßliche Proteingen TanjilG_10657 wurde in allen untersuchten Linien und Zeitpunkten im Vergleich zu Kontrollpflanzen (Mimikpflanzen) signifikant induziert (Ergänzungstabellen S10, S11).Darüber hinaus zeigte das Expressionsprofil von TanjilG_10657 im Verlauf des Experiments für alle Linien einen zunehmenden Trend.Population 22660 zeigte die höchste Empfindlichkeit von TanjilG_10657 gegenüber der Inokulation mit 114-facher Aktivierung und dem höchsten relativen Expressionsniveau (4,4 ± 0,4) bei 24 HPI (Abb. 6a).Das PR10-LlR18A-Protein-Gen TanjilG_27015 zeigte ebenfalls eine Aktivierung über alle Linien und Zeitpunkte hinweg, mit statistischer Signifikanz an den meisten Datenpunkten (Abb. 6b).Ähnlich wie bei TanjilG_10657 wurde das höchste relative Expressionsniveau von TanjilG_27015 in der 22660 inokulierten Population bei 24 HPI (19,5 ± 2,4) beobachtet.Das saure Endochitinase-Gen TanjilG_04706 war in allen Linien und zu allen Zeitpunkten mit Ausnahme von Boregine 6 hpi signifikant hochreguliert (Abb. 6c).Sie wurde zum ersten Zeitpunkt (6 HPI) bei 83A:476 stark induziert (um das 10,5-fache) und stieg in anderen Linien moderat an (um das 6,6- bis 7,5-fache).Während des Experiments blieb die Expression von TanjilG_04706 in 83A:476 und Boregine auf ähnlichen Niveaus, während sie in Mandelup und Population 22660 deutlich anstieg und relativ hohe Werte erreichte (5,9 ± 1,5 bzw. 6,2 ± 1,5).Das Endoglucan-1,3-β-Glucosidase-ähnliche Gen TanjilG_23384 zeigte zu den ersten beiden Zeitpunkten (6 und 12 hpi) in allen Linien außer Population 22660 eine hohe Aktivierung (Abb. 6d).Die höchsten relativen Expressionsniveaus von TanjilG_23384 wurden zum zweiten Zeitpunkt (12 hpi) in Mandelup (2,7 ± 0,3) und 83A:476 (1,5 ± 0,1) beobachtet.Bei 24 HPI war die TanjilG_23384-Expression in allen untersuchten Linien relativ niedrig (von 0,04 ± 0,009 bis 0,44 ± 0,12).
Expressionsprofile ausgewählter Gene (ag), ermittelt durch quantitative PCR.Die Zahlen 6, 12 und 24 stehen für Stunden nach der Impfung.Die Gene LanDExH7 und LanTUB6 wurden zur Normalisierung und LanTUB6 zur Kalibrierung zwischen den Serien verwendet.Fehlerbalken stellen die Standardabweichung basierend auf drei biologischen Replikaten dar, wobei es sich jeweils um den Durchschnitt von drei technischen Replikaten handelt. Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 aus dem Lupinenfeld in Wierzenica, Polen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) ist über den Datenpunkten markiert (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen den inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 aus dem Lupinenfeld in Wierzenica, Polen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) ist über den Datenpunkten markiert (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Statistische Untersuchung der Verbreitung in den letzten Jahren der Impfung (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, geboren im Jahr 1999). Польша) и контрольными (ложно инокулированными) растениями отмечена над точками данных (*Wert P < 0,05, **Wert P ≤ 0,01, ***Wert P ≤ 0,001). Statistisch signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen 1999 aus einem Lupinenfeld in Wierzhenice, Polen) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) sind über den Datenpunkten angegeben (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。Pflanzen (Colletotrichum lupini, Farbe-08), 1999差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Statistische Stichproben in den letzten Jahren der Impfungen (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, verbreitet mit Pollupinen in Verzhen, Polen, (Stand 1999) und Kontrollorgane (nicht identifizierte Personen) haben sich auf die folgenden Ergebnisse eingestellt (* P-Wert < 0,05, ** P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001). Statistisch signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen inokulierten (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern in Verzhenice, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert) sind über den Datenpunkten angegeben (*P-Wert < 0,05, **P-Wert ≤ 0,01, ***P-Wert ≤ 0,001).Die analysierten NLL-Linien waren: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels), Boregine (resistent, unbekannter genetischer Hintergrund) und Population 22660 (anfällig).
Das Kandidatengen TanjilG_05042 am Lanr1-Locus zeigte ein deutlich anderes Expressionsmuster als die aus RNA-seq-Studien erhaltenen Profile (Abb. 6e).Bei Mandelup und der 22660-Population wurde eine signifikante Aktivierung dieses Gens beobachtet (bis zum 39,7-fachen bzw. 11,7-fachen), was zu relativ hohen Expressionsniveaus führte (bis zu 1,4 ± 0,14 bzw. 7,2 ± 1,3).83A:476 zeigte auch eine gewisse Hochregulierung des TanjilG_05042-Gens (bis zum 3,8-fachen), allerdings waren die erreichten relativen Expressionsniveaus (0,044 ± 0,002) mehr als 30-fach niedriger als die bei Mandelup und der 22660-Population beobachteten Werte.Die durch qPCR analysierten Ergebnisse zeigten signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus zwischen Genotypen in scheingeimpften (Kontroll-)Varianten und erreichten einen 58-fachen Unterschied zwischen den Populationen 22660 und 83A:476 sowie zwischen den Populationen 22660 und 22660. Ein zweifacher Unterschied wurde zwischen Boregine und Mandalup erreicht.
Das Kandidatengen am AnMan-Locus, TanjilG_12861, wurde als Reaktion auf die Impfung in 83A:476 und Mandelup aktiviert, war in der 22660-Population neutral und wurde in Boregine herunterreguliert (Abb. 6f).Die relative Expression des TanjilG_12861-Gens war im inokulierten 83A am höchsten: 476 (0,14 ± 0,01).Das 17,4 kDa große Klasse-I-Hitzeschockprotein-Gen TanjilG_05080 HSP17.4 zeigte in allen untersuchten Stämmen und Zeitpunkten niedrigere relative Expressionsniveaus (Abb. 6g).Der höchste Wert wurde bei 24 HPI in der 22660-Population beobachtet (0,14 ± 0,02, ein achtfacher Anstieg der Reaktion auf die Impfung).
Der Vergleich der Genexpressionsprofile (Abb. 7) ergab eine hohe Korrelation zwischen TanjilG_10657 und vier anderen Genen: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) und TanjilG_04706 (r = 0,79).Solche Ergebnisse könnten auf eine Co-Regulation dieser Gene während Abwehrreaktionen hinweisen.Die Gene TanjilG_12861 und TanjilG_23384 zeigten im Vergleich zu anderen Genen unterschiedliche Expressionsprofile mit niedrigeren Werten des Pearson-Korrelationskoeffizienten (von 0,08 bis 0,43 bzw. -0,19 bis 0,28).
Korrelationen zwischen Genexpressionsprofilen wurden mittels quantitativer PCR nachgewiesen.Die folgenden schmalblättrigen Lupinenlinien wurden analysiert: 83A:476 (resistent, Träger des homozygoten Lanr1-Allels), Mandelup (mäßig resistent, Träger des homozygoten AnMan-Allels), Boregine (resistent, genetischer Hintergrund unbekannt) und Population 22660 (anfällig).Es wurden drei Zeitpunkte berechnet (6, 12 und 24 Stunden nach der Inokulation), darunter inokulierte (Colletotrichum lupini, Stamm Col-08, gewonnen aus Lupinenfeldern in Wierzhenice, Polen, 1999) und Kontrollpflanzen (scheininokuliert).Die Skala zeigt den Wert des Pearson-Korrelationskoeffizienten.
Basierend auf Daten, die bei 6 PS pro Zoll erhalten wurden, wurde WGCNA an 9981 Grad durchgeführt, die durch den Vergleich von inokulierten und Kontrollpflanzen identifiziert wurden, um sich auf frühe Abwehrreaktionen zu konzentrieren (Ergänzungstabelle S12).Es wurden 22 Genmodule (Cluster) mit korrelierten (positiven oder negativen) Expressionsprofilen zwischen Genotypen und experimentellen Varianten gefunden. Im Durchschnitt sanken die Genexpressionsniveaus in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (in beiden Varianten war dieser Trend jedoch in den Kontrollpflanzen stärker). Im Durchschnitt sanken die Genexpressionsniveaus in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (in beiden Varianten war dieser Trend jedoch in den Kontrollpflanzen stärker). Im Laufe der letzten Generationen wurde diese Nachricht im Abschnitt 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (in den oben genannten Varianten, ab und zu, diese Tendenz wurde nicht mehr kontrolliert) erstellt растений). Im Durchschnitt sanken die Genexpressionsniveaus in der Reihenfolge 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (in beiden Varianten war dieser Trend jedoch in den Kontrollpflanzen stärker).平均而言,基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Bevölkerung 22660照植物中更强）.平均 而 言, 基因 水平 按 按 83a: 476> Mandelup> Boregine> Population 22660 的 顺序 下降 （, 在 种 中, 这 种 在 在 植物中 更）。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 Im Laufe der letzten Generationen wurde die Bevölkerung im Jahr 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (aufgrund der oben genannten Varianten und dieser Tendenz) in den Kontrollbereich verschoben nicht). Im Durchschnitt sanken die Genexpressionsniveaus in der Serie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Population 22660 (in beiden Varianten war dieser Trend jedoch in den Kontrollpflanzen stärker).Die Impfung führte zu einer Hochregulation der Genexpression, insbesondere in den Modulen 18, 19, 14, 6 und 1 (in absteigender Reihenfolge der Wirkung), zu einer negativen Regulierung (z. B. Module 9 und 20) oder mit neutralen Effekten (z. B. Module 11, 22, 8 und 13).Die GO-Begriffsanreicherungsanalyse (Ergänzungstabelle S13) ergab „GO: 0006952 Schutzreaktionen“ für das inokulierte Modul (18) mit maximaler Aktivierung, einschließlich der durch qPCR analysierten Gene (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 und TanjilG_27015) sowie viele der am stärksten unterdrückten Photosynthesemodule (9).Der Konzentrator von Modul 18 (Abb. 8) wurde als das TanjilG_26536-Gen identifiziert, das das PR-10-ähnliche LlR18B-Protein kodiert, und der Konzentrator von Modul 9 wurde als das TanjilG_28955-Gen identifiziert, das das Photosystem-II-PsbQ-Protein kodiert.Ein Kandidat für das Anthracnose-Resistenzgen Lanr1, TanjilG_05042, wurde in Modul 22 (Abb. 9) gefunden und ist mit den Begriffen „GO:0044260 Zelluläre makromolekulare Stoffwechselprozesse“ und „GO:0006355 Transkriptionsregulation, DNA-Templating“ verbunden, die den Hub TanjilG_01212 tragen.Das Gen kodiert für den Hitzestress-Transkriptionsfaktor A-4a (HSFA4a).
Gewichtete Netzwerkanalyse der Genkoexpression von Modulen mit überrepräsentierten biologischen Prozessbegriffen „GO: 0006952 Abwehrreaktionen“.Die Ligation wurde vereinfacht, um die vier durch qPCR analysierten Gene hervorzuheben (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 und TanjilG_27015).
Gewichtete Netzwerkanalyse der Genkoexpression eines Moduls mit einem überrepräsentierten biologischen Prozessbegriff „GO: 0006355: Transkriptionelle Regulierung, DNA-Templating“ und einem Kandidaten für das Anthracnose-Resistenzgen Lanr1 TanjilG_05042.Die Ligation wurde vereinfacht, um das TanjilG_05042-Gen und das zentrale TanjilG_01212-Gen zu isolieren.
In Australien durchgeführte Tests zur Anthracnose-Resistenz zeigten, dass die meisten der früh freigegebenen Sorten anfällig waren;Kalya, Coromup und Mandelup wurden als mäßig resistent beschrieben, während Wonga, Tanjil und 83A:476 als sehr resistent beschrieben wurden26,27,31.hatte das gleiche Resistenz-Allel mit der Bezeichnung Lanr1, und Coromup und Mandelup hatten ein anderes Allel mit der Bezeichnung AnMan10, 26, 39, während Kalya ein anderes Allel vererbte., Lanr2.Das Screening auf Anthracnose-Resistenz in Deutschland führte zur Identifizierung einer resistenten Linie Bo7212 mit einem anderen Kandidatenallel als Lanr1, genannt LanrBo36.
Unsere Studie ergab eine sehr geringe Häufigkeit (etwa 6 %) des Lanr1-Allels im getesteten Keimplasma.Diese Beobachtung steht im Einklang mit den Ergebnissen des Screenings osteuropäischen Keimplasmas mithilfe der Anseq3- und Anseq4-Marker, die zeigten, dass das Lanr1-Allel nur in zwei belarussischen Linien vorhanden ist.Dies deutet darauf hin, dass das Lanr1-Allel von lokalen Zuchtprogrammen noch nicht weit verbreitet ist, anders als in Australien, wo es eines der Schlüsselallele für die markergestützte Züchtung ist.Dies könnte auf die geringere Resistenz zurückzuführen sein, die das Lanr1-Allel unter europäischen Feldbedingungen im Vergleich zum australischen Bericht bietet.Darüber hinaus haben Studien zu Anthracnose in Gebieten mit hohem Niederschlag in Australien gezeigt, dass durch das Lanr1-Allel vermittelte Resistenzreaktionen bei Wetterbedingungen, die das Wachstum und die schnelle Entwicklung des Krankheitserregers begünstigen, möglicherweise nicht wirksam sind19,42.Tatsächlich wurden in der vorliegenden Studie einige Symptome von Anthracnose auch bei Genotypen beobachtet, die das Lanr1-Allel tragen, was darauf hindeutet, dass die Resistenz unter optimalen Bedingungen für die Entwicklung von C. lupini verschwinden könnte.Darüber hinaus sind falsch positive Interpretationen des Vorhandenseins von Anseq3- und Anseq4-Markern möglich, die etwa 1 cM vom Lanr1-Locus entfernt sind 28,30,43 .
Unsere Studie zeigte, dass 83A:476, das das Lanr1-Allel trug, auf die Inokulation mit C. lupini mit einer groß angelegten Transkriptom-Reprogrammierung zum ersten analysierten Zeitpunkt (6 hpi) reagierte, während in Mandelup, das das AnMan-Allel trug, transkriptomische Reaktionen viel später beobachtet wurden.(von 24 bis 48 PS).Diese zeitlichen Schwankungen der Abwehrreaktionen gehen mit Unterschieden in den Krankheitssymptomen einher und unterstreichen die Bedeutung einer frühzeitigen Erkennung von Krankheitserregern für eine erfolgreiche Reaktion auf Resistenzen.Um Pflanzengewebe zu infizieren, müssen Milzbrandsporen auf der Wirtsoberfläche mehrere Entwicklungsstadien durchlaufen, darunter Keimung, Zellteilung und Bildung eines Appressoriums.Ein Anhängsel ist eine infektiöse Struktur, die sich an der Oberfläche des Wirts anheftet und das Eindringen in das Wirtsgewebe erleichtert.So zeigten Sporen von C. gloeosporioides in Erbsenextrakt die erste Kernteilung nach 75–90 Minuten Inkubation, die Bildung eines Keimschlauchs nach 90–120 Minuten und die Unterdrückung nach 4 Stunden 45 .Mango C. gloeosporioides zeigte nach 3-stündiger Inkubation eine Konidienkeimung von mehr als 40 % und nach 4 Stunden eine etwa 20-prozentige Bildung von Appressoren.Das virulenzassoziierte CAP20-Gen von C. gloeosporioides zeigte nach 3,5-stündiger Inkubation in Avocado-Oberflächenwachs mit hohen Konzentrationen an CAP20-Protein nach 4 Stunden und 46 Minuten Transkriptionsaktivität in epiphytenbildenden Konidien.In ähnlicher Weise wurde die Aktivität von Melanin-Biosynthesegenen in C. trifolii während einer zweistündigen Inkubation induziert, gefolgt von der Bildung eines Appressoriums nach einer Stunde.Studien an Blattgeweben haben gezeigt, dass mit C. acutatum inokulierte Erdbeeren bei 8 hpi eine erste Unterdrückung erfahren, während mit C. coccodes inokulierte Tomaten bei 4 hpi eine erste Unterdrückung erfahren48,49.weitgehend im Einklang mit der Zeitskala von Colletotrichum spp.infektiöser Prozess.Schnelle Abwehrreaktionen auf 83A:476 deuten auf eine Beteiligung von Pflanzenresistenz- und Effektor-ausgelösten Immunitätsgenen (ETI) in dieser Linie hin, während Mandelups verzögerte Reaktionen die Hypothese der mikroassoziierten molekularmusterausgelösten Immunität (MTI) stützen 50. Frühe Reaktionen auf 83A: 476 und Mandelup.Die teilweise Überlappung zwischen hoch- oder herunterregulierten Genen bei der verzögerten Reaktion unterstützt dieses Konzept ebenfalls, da ETI oft als eine beschleunigte und verstärkte MTI-Reaktion angesehen wird, die im programmierten Zelltod an der Infektionsstelle, bekannt als anaphylaktischer Schock, gipfelt 51,52.
Die meisten Gene, die dem überrepräsentierten Begriff Gene Ontology GO:0006952 „Defense Response“ zugeschrieben werden, sind die 11 Homologen des stressinduzierten Fasten-Message-22-Proteins (ähnlich SAM22) und der sieben wichtigsten Latex-Protein-ähnlichen Proteine ​​(MLPs).-ähnliche Proteine ​​31, 34, 43 und 423 zeigten Sequenzähnlichkeit.SAM22-ähnliche Gene zeigten eine signifikante Aktivierung, die länger anhielt und ein erhöhtes Maß an Anthracnose-Resistenz zeigte (83A:476 und Boregine).MLP-ähnliche Gene wurden jedoch nur in Linien herunterreguliert, die das Kandidaten-Resistenz-Allel trugen (83A:476/Lanr1 bei 6 hpi und Mandelup/AnMan bei 24 hpi).Es ist zu beachten, dass alle identifizierten SAM22-ähnlichen Homologen aus einem Gencluster mit einer Größe von etwa 105 kb stammen, während MLP-ähnliche Gene aus separaten Regionen des Genoms stammen.Eine koordinierte Aktivierung solcher SAM22-ähnlicher Gene wurde auch in unserer vorherigen Studie zur NLL-Resistenz gegen die Impfung mit Diaporthetoxica festgestellt, was darauf hindeutet, dass sie an den horizontalen Komponenten der Abwehrreaktion beteiligt sind.Diese Schlussfolgerung wird auch durch Berichte über eine positive Reaktion von SAM22-ähnlichen Genen auf eine Verletzung oder Behandlung mit Salicylsäure, Pilzinduktoren oder Wasserstoffperoxid gestützt.
Es wurde gezeigt, dass MLP-ähnliche Gene bei vielen Pflanzenarten auf verschiedene abiotische und biotische Belastungen reagieren, einschließlich bakterieller, viraler und pathogener Pilzinfektionen55.Die Richtungen der Reaktion auf bestimmte Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern reichten von stark ansteigend (d. h. während des Befalls von Baumwolle mit Verticillium dahliae) bis hin zu deutlich abnehmend (d. h. nach Befall von Apfelbäumen mit Alternaria spp.)56,57.Eine signifikante Herunterregulierung des MLP-ähnlichen 423-Gens wurde während der Avocado-Abwehr gegen eine Infektion mit F. niger und während einer Infektion des Apfelbaums Botryosphaeria berengeriana f. beobachtet.cn.Piricola und Alternaria alternata sind Apfelpathotypen58,59.Darüber hinaus zeigten Apfelkalli, die das MLP-ähnliche 423-Gen überexprimierten, eine geringere Expression von Resistenz-assoziierten Genen und waren anfälliger für Pilzinfektionen59.Nach Fusarium oxysporum f wurde das MLP-ähnliche 423-Gen auch im resistenten Keimplasma von Gartenbohnen unterdrückt.cn.Bohneninfektion 60.
Weitere Mitglieder der PR-10-Familie, die in unserer RNA-seq-Studie identifiziert wurden, waren die Gene LlR18A und LlR18B als Reaktion auf die Hochregulierung sowie das hochregulierte (1 Gen) oder herunterregulierte (3 Gene) Gen für das Lipidtransferprotein DIR1..Darüber hinaus hebt WGCNA das LlR18B-Gen als Hub in diesem Modul hervor, das sehr anfällig für Impfungen ist und mehrere schützende Antwortgene trägt.Die LlR18A- und LlR18B-Gene wurden in gelben Lupinenblättern als Reaktion auf pathogene Bakterien sowie in NLL-Stämmen nach der Inokulation mit D. toxica induziert, während das Reishomolog dieser Gene, RSOsPR10, schnell durch eine Pilzinfektion induziert wurde, die vermutlich am Jasmonsäure-Signalweg beteiligt ist53,61, 62. Das DIR1-Gen kodiert für unspezifische Lipidtransportproteine, die für den On benötigt werden Satz systemischer erworbener Resistenzen (SAR).Mit der Entwicklung von Schutzreaktionen wird das DIR1-Protein vom Infektionsherd durch das Phloem transportiert, um SAR in entfernten Organen auszulösen.Interessanterweise wurde das TanjilG_02313 DIR1-Gen zum ersten Zeitpunkt in den Linien 84A:476 und Population 22660 signifikant induziert, eine Anthracnose-Resistenz entwickelte sich jedoch nur in Linie 84A:476 erfolgreich.Dies könnte auf eine gewisse Subfunktionalisierung des DIR1-Gens in NLL hinweisen, da die verbleibenden drei Homologen auf die Inokulation nur in der 83A:476-Linie bei 6 hpi reagierten und diese Reaktion nach unten gerichtet war.
In unserer Studie waren die häufigsten Komponenten, die dem biologischen Prozess namens „GO:0055114 Redox-Prozess“ entsprechen, Cytochrom-P450-Protein, Peroxidase, Linolsäure-9S-/13S-Lipoxygenase und 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure-Oxidase.Darüber hinaus definiert unsere WGCNA das HSFA4a-Homolog als Hub, der Module wie den Lanr1-Resistenzgenkandidaten TanjilG_05042 trägt.HSFA4a ist ein Bestandteil der redoxabhängigen Regulation der Kerntranskription in Pflanzen.
Cytochrom-P450-Proteine ​​sind Oxidoreduktasen, die NADPH- und/oder O2-abhängige Hydroxylierungsreaktionen im Primär- und Sekundärstoffwechsel katalysieren, einschließlich des Metabolismus von Xenobiotika sowie Hormonen, Fettsäuren, Sterolen, Zellwandkomponenten, Biopolymeren und der Biosynthese von Schutzverbindungen 69. In unserer Studie wurde die Variabilität der pflanzlichen Cytochrom-P450-Funktion von -10,6 log2 (fache Änderung) auf 5,7 reduziert aufgrund einer großen Anzahl veränderter Homologe (37) und unterschiedlicher Reaktionsmuster zwischen bestimmten Genen, was eine Aufwärtskorrektur widerspiegelt..Es wäre höchst spekulativ, nur RNA-seq-Daten zur Aufklärung der mutmaßlichen biologischen Funktion der NLL-Gene in einer so großen Protein-Superfamilie zu verwenden.Es ist jedoch anzumerken, dass einige Cytochrom-P450-Gene mit einer erhöhten Resistenz gegen pathogene Pilze oder Bakterien verbunden sind, einschließlich eines Beitrags zu allergischen Reaktionen69,70,71.
Peroxidasen der Klasse III sind multifunktionale Pflanzenenzyme, die an einer Vielzahl von Stoffwechselprozessen während des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung sowie als Reaktion auf Umweltstress wie Salzgehalt, Trockenheit, hohe Lichtintensität und Krankheitserregerbefall beteiligt sind72.Peroxidasen sind an der Interaktion mehrerer Pflanzenarten mit Anthracis beteiligt, darunter Stylosanthes humilis und C. gloeosporioides, Lens culinaris und C. truncatum, Phaseolus vulgaris und C. lindemuthianum, Cucumis sativus und C. lagenarium73,74,75,76.Die Reaktion erfolgt sehr schnell, manchmal sogar bei 4 HPI, bevor der Pilz in das Pflanzengewebe eindringt73.Das Peroxidase-Gen reagierte auch auf die NLL-Inokulation mit D. toxica.Zusätzlich zu ihren typischen Funktionen zur Regulierung des oxidativen Ausbruchs oder zur Beseitigung von oxidativem Stress können Peroxidasen das Wachstum von Krankheitserregern stören, indem sie physikalische Barrieren auf der Grundlage der Zellwandverstärkung während der Lignifizierung, Untereinheit oder Vernetzung spezifischer Verbindungen schaffen.Diese Funktion kann in silico dem TanjilG_03329-Gen zugeschrieben werden, das für eine mutmaßliche Lignin-bildende Anion-Peroxidase kodiert, die in unserer Studie in der 83A:476-resistenten Linie bei 6 HPI signifikant hochreguliert war, nicht jedoch in anderen Stämmen und Zeitpunkten, die nicht reagierten.
Die 9S-/13S-Lipoxygenase der Linolsäure ist der erste Schritt im oxidativen Weg der Lipidbiosynthese78.Die Produkte dieses Weges haben mehrere Funktionen bei der Pflanzenabwehr, einschließlich der Stärkung der Zellwand durch die Bildung von Callose- und Pektinablagerungen und der Regulierung von oxidativem Stress durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies79,80,81,82,83.In der vorliegenden Studie war die Expression der Linolsäure-9S-/13S-Lipoxygenase in allen Stämmen verändert, aber in der anfälligen Population 22660 herrschte zu unterschiedlichen Zeitpunkten eine Hochregulierung vor, während sie in Stämmen, die resistentes Lanr1 und das AnMan-Allel tragen, die Diversifizierung der Oxylipinschicht bei schützenden Milzbrandreaktionen zwischen diesen Genotypen betont.
Das 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat-Oxidase (ACO)-Homolog wurde bei Inokulation mit Lupine deutlich hochreguliert (9 Gene) oder herunterreguliert (2 Gene).Mit zwei Ausnahmen traten alle diese Reaktionen bei 6 PS auf.bei 83A:476.Die durch ACO-Proteine ​​vermittelte enzymatische Reaktion ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Ethylenproduktion und wird daher stark reguliert84.Ethylen ist ein Pflanzenhormon, das verschiedene Rollen bei der Regulierung der Pflanzenentwicklung und der Reaktion auf abiotische und biotische Stressbedingungen spielt.Die Induktion der ACO-Transkription und die Aktivierung des Ethylen-Signalwegs sind an der Erhöhung der Resistenz von Reis gegen den hemibiotrophen Pilz Oryzae oryzae beteiligt, indem sie die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und Phytoalexine regulieren.Ein sehr ähnlicher Blattinfektionsprozess, der zwischen M. oryzae und C. lupini88,89 vor dem Hintergrund einer signifikanten Hochregulierung der ACO-Homologen in der Linie 83A:476, über die in dieser Studie berichtet wurde, festgestellt wurde, verschiebt die Möglichkeit, Resistenz gegen NLL-Anthracnose zu verleihen. Ethylen ist ein zentraler Signalschritt in molekularen Signalwegen.
In der vorliegenden Studie wurde eine großflächige Unterdrückung vieler mit der Photosynthese verbundener Gene bei 6 hpi in 83A:476 und bei 48 hpi in Mandeloop und der 22660-Population beobachtet.Ausmaß und Verlauf dieser Veränderungen sind proportional zum Niveau.In diesem Experiment wurde eine Anthracnose-Resistenz beobachtet.Kürzlich wurde in mehreren Modellen von Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkungen, einschließlich pathogener Bakterien und Pilze, über eine starke und frühe Unterdrückung von Transkripten im Zusammenhang mit der Photosynthese berichtet.Eile (ab 2 HPI bei einigen Interaktionen) und globale Unterdrückung von Genen, die mit der Photosynthese als Reaktion auf eine Infektion verbunden sind, können eine Pflanzenimmunität auslösen, die auf dem Einsatz reaktiver Sauerstoffspezies und ihrer Interaktion mit dem Salicylsäureweg zur Vermittlung allergischer Reaktionen basiert 90,94.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zu den für die resistenteste Abstammungslinie (83A:476) vorgeschlagenen Abwehrreaktionsmechanismen eine schnelle Pathogenerkennung durch das R-Gen (vermutlich TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) und eine durch allergische Reaktionen vermittelte Salicylsäure- und Ethylensignalisierung gehören, gefolgt von der Etablierung einer weitreichenden SAR.Die Wirkung wird durch das Protein DIR-1 unterstützt.Es ist zu beachten, dass die biotrophe Periode bei einer Infektion mit C. lupini sehr kurz ist (ca. 2 Tage), gefolgt von nekrotischem Wachstum95.Der Übergang zwischen diesen Stadien kann mit Nekrose und der Expression von Ethylen-induzierbaren Proteinen verbunden sein, die als Auslöser von Überempfindlichkeitsreaktionen in Wirtspflanzen wirken.Daher ist das Zeitfenster für den erfolgreichen Fang von C. lupini im biotrophen Stadium sehr eng.Die in 83A:476 bei 6 hpi beobachtete Neuprogrammierung von Genen im Zusammenhang mit Redox und Photosynthese steht im Einklang mit dem Fortschreiten der Pilzhyphen und kündigt die Entwicklung einer erfolgreichen Schutzreaktion im biotrophen Stadium an.Die transkriptomischen Reaktionen von Mandelup und der 22660-Population sind möglicherweise zu verzögert, um den Pilz einzufangen, bevor er zu nekrotischem Wachstum wechselt. Allerdings ist Mandelup möglicherweise wirksamer als die 22660-Population, da die relativ schnelle Regulierung des PR-10-Proteins die horizontale Resistenz fördert.
ETI, gesteuert durch das kanonische R-Gen, scheint ein häufiger Mechanismus für die Resistenz von Bohnen gegen Anthracnose zu sein.So wird in der Modellhülsenfrucht Medicago truncatula die Resistenz gegen Anthracnose durch das RCT1-Gen verliehen, ein Mitglied der pflanzlichen R-Genklasse TIR-NBS-LRR97.Dieses Gen verleiht Luzerne auch eine Breitspektrum-Anthracnose-Resistenz, wenn es auf anfällige Pflanzen übertragen wird.In der Gartenbohne (P. vulgaris) wurden bisher mehr als zwei Dutzend Anthracnose-Resistenzgene identifiziert.Einige dieser Gene kommen in Regionen vor, in denen es keine kanonischen R-Gene gibt, viele andere befinden sich jedoch an den Rändern von Chromosomen, die den NBS-LRR-Gencluster tragen, einschließlich TIR-NBS-LRRs99.Die genomweite SSR-Studie bestätigte auch den Zusammenhang des NBS-LRR-Gens mit der Anthracnose-Resistenz in der Gartenbohne.Das kanonische R-Gen wurde auch in der Genomregion gefunden, die den Haupt-Anthracnose-Resistenz-Locus in der Weißen Lupine 101 trägt.
Unsere Arbeit zeigt, dass eine sofortige Resistenzreaktion, die in einem frühen Stadium der Pflanzeninfektion (vorzugsweise nicht später als 12 hpi) aktiviert wird, Schmalblättrige Lupinen wirksam vor Anthracnose schützt, die durch den pathogenen Pilz Collelotrichum lupini verursacht wird.Mittels Hochdurchsatzsequenzierung konnten wir unterschiedliche Expressionsprofile von Anthracnose-Resistenzgenen in NLL-Pflanzen nachweisen, die durch die Lanr1- und AnMan-Resistenzgene vermittelt werden.Zur erfolgreichen Abwehr gehört die sorgfältige Gestaltung der Gene für Proteine, die an Redox, Photosynthese und Pathogenese beteiligt sind, und zwar innerhalb weniger Stunden nach dem ersten Kontakt der Pflanze mit einem Krankheitserreger.Ähnliche Schutzreaktionen, allerdings zeitlich verzögert, sind beim Schutz von Pflanzen vor Krankheiten weitaus weniger wirksam.Die durch das Lanr1-Gen vermittelte Anthrax-Resistenz ähnelt der typischen schnellen Reaktion des R-Gens (durch Effektoren ausgelöste Immunität), während das AnMan-Gen höchstwahrscheinlich eine horizontale Reaktion (durch ein mikrobenassoziiertes molekulares Muster ausgelöste Immunität) liefert, was für ein moderates Maß an Nachhaltigkeit sorgt.
Die 215 NLL-Linien, die zum Screening auf Anthracnose-Marker verwendet wurden, bestanden aus 74 Sorten, 60 durch Kreuzung oder Züchtung erhaltenen Linien, 5 Mutanten und 76 wilden oder ursprünglichen Keimplasmen.Die Linien kamen aus 17 Ländern, hauptsächlich aus Polen (58), Spanien (47), Deutschland (27), Australien (26), Russland (19), Weißrussland (7), Italien (5) und anderen Linien.aus 10 Ländern.Das Set enthält auch referenzresistente Linien: 83A:476, Tanjil, Wonga mit dem Lanr1-Allel und Mandelup mit dem AnMan-Allel.Die Linien wurden aus der European Lupine Genetic Resource Database entnommen, die von Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polen, verwaltet wird (Ergänzungstabelle S1).
Die Pflanzen wurden unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet (Photoperiode 16 Stunden, Temperatur 25 °C tagsüber und 18 °C nachts).Zwei biologische Replikate wurden analysiert.DNA wurde aus drei Wochen alten Blättern mit dem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß dem Protokoll isoliert.Die Qualität und Konzentration der isolierten DNA wurde mit spektrophotometrischen Methoden (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bewertet.Der AnManM1-Marker, der das Anthracnose-Resistenzgen AnMan (abgeleitet von der Sorte Mandelup) markiert, und die Marker Anseq3 und Anseq4, die das Gen Lanr1 (abgeleitet von der Sorte Tanjil) flankieren, wurden analysiert 11,26,28.Homozygote für das resistente Allel wurden mit „1“, anfällige mit „0“ und Heterozygote mit 0,5 bewertet.
Basierend auf den Ergebnissen des Screenings auf die Marker AnManM1, AnSeq3 und AnSeq4 und der Verfügbarkeit von Samen für abschließende Folgeexperimente wurden 50 NLL-Linien für die Phänotypisierung der Anthracnose-Resistenz ausgewählt.Die Analyse wurde in zweifacher Ausfertigung in einem computergesteuerten Gewächshaus mit einer 14-stündigen Photoperiode und einem Temperaturbereich von 22 °C am Tag und 19 °C in der Nacht durchgeführt.Vor der Aussaat werden die Samen angekratzt (die Samenschale auf der gegenüberliegenden Seite des Embryos mit einer scharfen Klinge abgeschnitten), um eine Samenruhe aufgrund einer zu harten Samenschale zu verhindern und eine gleichmäßige Keimung zu gewährleisten.Die Pflanzen wurden in Töpfen (11 × 11 × 21 cm) mit steriler Erde (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Warschau, Polen) gezüchtet.Die Beimpfung erfolgte mit dem Stamm Colletotrichum lupini Col-08, der 1999 aus den Stängeln schmalblättriger Lupinenpflanzen auf einem Feld in Verzhenitsa, Großpolen (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E) gezüchtet wurde.Holen Sie sich einen Bereich.Die Isolate wurden in SNA-Medium bei 20 °C unter Schwarzlicht 21 Tage lang kultiviert, um die Sporulation zu induzieren.Vier Wochen nach der Aussaat, als die Pflanzen das 4-6-Blatt-Stadium erreicht hatten, erfolgte die Inokulation durch Besprühen mit einer Konidiensuspension in einer Konzentration von 0,5 x 106 Konidien pro ml.Nach der Inokulation wurden die Pflanzen 24 Stunden lang im Dunkeln bei einer Luftfeuchtigkeit von etwa 98 % und einer Temperatur von 25 °C gehalten, um die Keimung der Konidien und den Infektionsprozess zu erleichtern.Die Pflanzen wurden dann unter einer 14-stündigen Photoperiode bei 22 °C am Tag/19 °C in der Nacht und 70 % Luftfeuchtigkeit gezüchtet.Der Krankheitswert wurde 22 Tage nach der Inokulation ermittelt und reichte von 0 (immun) bis 9 (sehr anfällig), abhängig vom Vorhandensein oder Fehlen nekrotischer Läsionen an Stängeln und Blättern.Zusätzlich wurde nach der Bewertung das Gewicht der Pflanzen gemessen.Beziehungen zwischen Marker-Genotypen und Krankheitsphänotypen wurden als Punkt-Zwei-Sequenz-Korrelationen berechnet (Fehlen heterozygoter Marker in der Reihe von Linien zur Analyse des Anthracnose-Resistenz-Phänotyps).