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Es besteht Bedarf an einem zuverlässigen In-vitro-System, das die physiologische Umgebung des Herzens für Arzneimitteltests genau reproduzieren kann.Die begrenzte Verfügbarkeit menschlicher Herzgewebekultursysteme hat zu ungenauen Interpretationen der kardialen Arzneimittelwirkungen geführt.Hier haben wir ein Herzgewebekulturmodell (CTCM) entwickelt, das Herzschnitte elektromechanisch stimuliert und während der systolischen und diastolischen Phase des Herzzyklus eine physiologische Dehnung erfährt.Nach 12 Tagen Kultur verbesserte dieser Ansatz teilweise die Lebensfähigkeit von Herzabschnitten, bewahrte jedoch ihre strukturelle Integrität nicht vollständig.Daher stellten wir nach dem Screening kleiner Moleküle fest, dass die Zugabe von 100 nM Triiodthyronin (T3) und 1 μM Dexamethason (Dex) zu unserem Medium die Mikrostruktur der Schnitte 12 Tage lang aufrechterhielt.In Kombination mit der T3/Dex-Behandlung hielt das CTCM-System Transkriptionsprofile, Lebensfähigkeit, Stoffwechselaktivität und strukturelle Integrität 12 Tage lang auf dem gleichen Niveau wie frisches Herzgewebe.Darüber hinaus induziert eine übermäßige Dehnung des Herzgewebes in Kultur eine hypertrophe Herzsignalisierung, was den Beweis für die Fähigkeit von CTCM liefert, durch Herzdehnung induzierte hypertrophe Zustände nachzuahmen.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTCM die Physiologie und Pathophysiologie des Herzens in Kultur über lange Zeiträume modellieren kann und so ein zuverlässiges Arzneimittelscreening ermöglicht.
Vor der klinischen Forschung werden zuverlässige In-vitro-Systeme benötigt, die die physiologische Umgebung des menschlichen Herzens genau reproduzieren können.Solche Systeme sollten veränderte mechanische Dehnung, Herzfrequenz und elektrophysiologische Eigenschaften nachahmen.Tiermodelle werden üblicherweise als Screening-Plattform für die Herzphysiologie verwendet und weisen nur eine begrenzte Zuverlässigkeit bei der Darstellung der Auswirkungen von Arzneimitteln auf das menschliche Herz auf1,2.Letztendlich ist das Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) ein hochempfindliches und spezifisches Modell für verschiedene therapeutische und pharmakologische Interventionen, das die Physiologie und Pathophysiologie des menschlichen Herzens genau nachbildet3.Das Fehlen eines solchen Systems schränkt die Entdeckung neuer Behandlungsmöglichkeiten für Herzinsuffizienz ein4,5 und hat dazu geführt, dass die Kardiotoxizität von Medikamenten ein Hauptgrund für den Ausstieg aus dem Markt ist6.
Im letzten Jahrzehnt wurden acht nicht kardiovaskuläre Medikamente aus der klinischen Anwendung genommen, weil sie eine Verlängerung des QT-Intervalls verursachen, was zu ventrikulären Arrhythmien und plötzlichem Tod führt7.Daher besteht ein zunehmender Bedarf an zuverlässigen präklinischen Screening-Strategien zur Beurteilung der kardiovaskulären Wirksamkeit und Toxizität.Der jüngste Einsatz von vom Menschen induzierten pluripotenten Kardiomyozyten aus Stammzellen (hiPS-CM) beim Arzneimittelscreening und bei Toxizitätstests bietet eine Teillösung für dieses Problem.Allerdings sind die unreife Natur von hiPS-CMs und der Mangel an multizellulärer Komplexität des Herzgewebes wesentliche Einschränkungen dieser Methode.Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese Einschränkung teilweise überwunden werden kann, indem frühe hiPS-CM zur Bildung von Hydrogelen im Herzgewebe kurz nach dem Einsetzen spontaner Kontraktionen eingesetzt und die elektrische Stimulation im Laufe der Zeit allmählich gesteigert wird.Diesen hiPS-CM-Mikrogeweben fehlen jedoch die ausgereiften elektrophysiologischen und kontraktilen Eigenschaften des erwachsenen Myokards.Darüber hinaus weist menschliches Herzgewebe eine komplexere Struktur auf und besteht aus einer heterogenen Mischung verschiedener Zelltypen, darunter Endothelzellen, Neuronen und Stromafibroblasten, die durch spezifische Sätze extrazellulärer Matrixproteine ​​​​verbunden sind.Diese Heterogenität der Nicht-Kardiomyozytenpopulationen11,12,13 im Herzen erwachsener Säugetiere stellt ein großes Hindernis für die Modellierung von Herzgewebe mithilfe einzelner Zelltypen dar.Diese großen Einschränkungen unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung von Methoden zur Kultivierung von intaktem Myokardgewebe unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Kultivierte dünne (300 µm) Schnitte des menschlichen Herzens haben sich als vielversprechendes Modell eines intakten menschlichen Myokards erwiesen.Diese Methode bietet Zugang zu einem vollständigen 3D-Vielzellsystem ähnlich dem menschlichen Herzgewebe.Bis 2019 war die Verwendung kultivierter Herzschnitte jedoch durch die kurze (24 Stunden) Kulturüberlebenszeit begrenzt.Dies ist auf eine Reihe von Faktoren zurückzuführen, darunter das Fehlen einer physikalisch-mechanischen Dehnung, die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Verwendung einfacher Medien, die die Bedürfnisse des Herzgewebes nicht erfüllen.Im Jahr 2019 zeigten mehrere Forschungsgruppen, dass die Einbeziehung mechanischer Faktoren in Herzgewebekultursysteme die Lebensdauer der Kultur verlängern, die Herzexpression verbessern und Herzpathologien nachahmen kann.Zwei elegante Studien 17 und 18 zeigen, dass sich eine einachsige mechanische Belastung während der Kultur positiv auf den Herzphänotyp auswirkt.Allerdings nutzten diese Studien nicht die dynamische dreidimensionale physikalisch-mechanische Belastung des Herzzyklus, da die Herzabschnitte entweder mit isometrischen Zugkräften 17 oder linearer auxotonischer Belastung 18 belastet wurden.Diese Methoden der Gewebedehnung führten zur Unterdrückung vieler Herzgene oder zur Überexpression von Genen, die mit abnormalen Dehnungsreaktionen verbunden sind.Insbesondere Pitoulis et al.19 entwickelte ein dynamisches Herzschnittkulturbad zur Rekonstruktion des Herzzyklus unter Verwendung von Kraftwandler-Feedback und Spannungsantrieben.Obwohl dieses System eine genauere In-vitro-Herzzyklusmodellierung ermöglicht, schränken die Komplexität und der geringe Durchsatz der Methode die Anwendung dieses Systems ein.Unser Labor hat kürzlich ein vereinfachtes Kultursystem entwickelt, das elektrische Stimulation und ein optimiertes Medium verwendet, um die Lebensfähigkeit von Abschnitten von Schweine- und menschlichem Herzgewebe bis zu 6 Tage lang aufrechtzuerhalten20,21.
Im aktuellen Manuskript beschreiben wir ein kardiales Gewebekulturmodell (CTCM), das Abschnitte des Schweineherzens verwendet und humorale Hinweise einbezieht, um die dreidimensionale Herzphysiologie und die pathophysiologische Ausdehnung während des Herzzyklus zu rekapitulieren.Dieses CTCM kann die Genauigkeit der präklinischen Medikamentenvorhersage auf ein noch nie dagewesenes Niveau steigern, indem es ein kostengünstiges Herzsystem mit mittlerem Durchsatz bereitstellt, das die Physiologie/Pathophysiologie des Säugetierherzens für präklinische Medikamententests nachahmt.
Hämodynamische mechanische Signale spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Kardiomyozytenfunktion in vitro 22,23,24.Im aktuellen Manuskript haben wir ein CTCM entwickelt (Abbildung 1a), das die Herzumgebung eines Erwachsenen nachahmen kann, indem es sowohl elektrische als auch mechanische Stimulation bei physiologischen Frequenzen (1,2 Hz, 72 Schläge pro Minute) induziert.Um eine übermäßige Gewebedehnung während der Diastole zu vermeiden, wurde ein 3D-Druckgerät verwendet, um die Gewebegröße um 25 % zu vergrößern (Abb. 1b).Die durch das C-PACE-System induzierte elektrische Stimulation wurde mithilfe eines Datenerfassungssystems so eingestellt, dass sie 100 ms vor der Systole begann, um den Herzzyklus vollständig zu reproduzieren.Das Gewebekultursystem verwendet einen programmierbaren pneumatischen Aktuator (LB Engineering, Deutschland), um eine flexible Silikonmembran zyklisch auszudehnen, um eine Expansion der Herzscheiben in der oberen Kammer zu bewirken.Das System war über einen Druckwandler mit einer externen Luftleitung verbunden, was eine genaue Einstellung des Drucks (± 1 mmHg) und der Zeit (± 1 ms) ermöglichte (Abb. 1c).
a Befestigen Sie den Gewebeschnitt am 7-mm-Stützring (blau dargestellt) in der Kulturkammer des Geräts.Die Kulturkammer ist durch eine dünne, flexible Silikonmembran von der Luftkammer getrennt.Platzieren Sie zwischen jeder Kammer eine Dichtung, um Undichtigkeiten zu verhindern.Der Deckel des Geräts enthält Graphitelektroden, die für eine elektrische Stimulation sorgen.b Schematische Darstellung des großen Gewebegeräts, des Führungsrings und des Stützrings.Die Gewebeschnitte (braun) werden auf das übergroße Gerät gelegt, wobei der Führungsring in der Nut am äußeren Rand des Geräts platziert wird.Platzieren Sie den mit Gewebe-Acrylkleber beschichteten Stützring mithilfe der Führung vorsichtig über dem Abschnitt des Herzgewebes.c Diagramm, das die Zeit der elektrischen Stimulation als Funktion des Luftkammerdrucks zeigt, der von einem programmierbaren pneumatischen Aktuator (PPD) gesteuert wird.Ein Datenerfassungsgerät wurde verwendet, um die elektrische Stimulation mithilfe von Drucksensoren zu synchronisieren.Wenn der Druck in der Kulturkammer den eingestellten Schwellenwert erreicht, wird ein Impulssignal an das C-PACE-EM gesendet, um eine elektrische Stimulation auszulösen.d Bild von vier CTCMs, die auf einem Inkubatorregal platziert sind.Vier Geräte sind über einen pneumatischen Kreislauf mit einem PPD verbunden, und in das hämostatische Ventil sind Drucksensoren eingesetzt, um den Druck im pneumatischen Kreislauf zu überwachen.Jedes Gerät enthält sechs Gewebeschnitte.
Mit einem einzigen pneumatischen Aktuator konnten wir vier CTCM-Geräte steuern, von denen jedes sechs Gewebeschnitte aufnehmen konnte (Abb. 1d).Bei der CTCM wird der Luftdruck in der Luftkammer in einen synchronen Druck in der Flüssigkeitskammer umgewandelt und induziert eine physiologische Expansion der Herzscheibe (Abbildung 2a und Zusatzfilm 1).Bewertung der Gewebedehnung bei 80 mm Hg.Kunst.zeigte eine Dehnung der Gewebeabschnitte um 25 % (Abb. 2b).Es wurde gezeigt, dass diese prozentuale Dehnung einer physiologischen Sarkomerlänge von 2,2–2,3 µm für eine normale Kontraktilität des Herzabschnitts entspricht17,19,25.Die Gewebebewegung wurde mithilfe benutzerdefinierter Kameraeinstellungen bewertet (ergänzende Abbildung 1).Die Amplitude und Geschwindigkeit der Gewebebewegung (Abb. 2c, d) entsprach der Dehnung während des Herzzyklus und der Zeit während Systole und Diastole (Abb. 2b).Dehnung und Geschwindigkeit des Herzgewebes während der Kontraktion und Entspannung blieben in der Kultur 12 Tage lang konstant (Abb. 2f).Um die Auswirkung der elektrischen Stimulation auf die Kontraktilität während der Kultur zu bewerten, haben wir eine Methode zur Bestimmung der aktiven Deformität mithilfe eines Schattierungsalgorithmus entwickelt (ergänzende Abbildung 2a, b) und konnten zwischen Deformitäten mit und ohne elektrische Stimulation unterscheiden.Derselbe Abschnitt des Herzens (Abb. 2f).Im beweglichen Bereich des Schnitts (R6-9) war die Spannung während der elektrischen Stimulation um 20 % höher als ohne elektrische Stimulation, was auf den Beitrag der elektrischen Stimulation zur kontraktilen Funktion hinweist.
Repräsentative Spuren des Luftkammerdrucks, des Flüssigkeitskammerdrucks und der Gewebebewegungsmessungen bestätigen, dass der Kammerdruck den Flüssigkeitskammerdruck verändert und eine entsprechende Bewegung des Gewebeschnitts verursacht.b Repräsentative Spuren der prozentualen Dehnung (blau) von Gewebeabschnitten, die der prozentualen Dehnung (orange) entsprechen.c Die gemessene Bewegung der Herzscheibe stimmt mit der gemessenen Bewegungsgeschwindigkeit überein.(d) Repräsentative Trajektorien zyklischer Bewegung (blaue Linie) und Geschwindigkeit (orange gepunktete Linie) in einem Schnitt des Herzens.e Quantifizierung der Zykluszeit (n = 19 Scheiben pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), der Kontraktionszeit (n = 19 Scheiben pro Gruppe), der Entspannungszeit (n = 19 Scheiben pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), der Gewebebewegung (n = 25).Scheiben)/Gruppe von verschiedenen Schweinen), maximale systolische Geschwindigkeit (n = 24(D0), 25(D12) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen) und maximale Relaxationsrate (n=24(D0), 25(D12) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen).Der zweiseitige Student-T-Test zeigte bei keinem Parameter einen signifikanten Unterschied.f Repräsentative Dehnungsanalysespuren von Gewebeschnitten mit (rot) und ohne (blau) elektrischer Stimulation, zehn regionale Bereiche von Gewebeschnitten aus demselben Abschnitt.Die unteren Felder zeigen die Quantifizierung des prozentualen Spannungsunterschieds in Gewebeschnitten mit und ohne elektrische Stimulation in zehn Bereichen aus verschiedenen Schnitten. (n = 8 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 Zeilen/Gruppe aus mehreren Zeilen, ergibt eine doppelte T-Kriterium-Stufe; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 Abschnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, zweiseitiger Student-t-Test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 Stufen/Gruppe, aus verschiedenen Breiten, zweistufiges Kriterium; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 Abschnitte/Gruppe, von verschiedenen Schweinen, zweiseitiger Student-t-Test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
In unserem vorherigen statischen biomimetischen Herzschnittkultursystem [20, 21] haben wir die Lebensfähigkeit, Funktion und strukturelle Integrität von Herzschnitten sechs Tage lang aufrechterhalten, indem wir elektrische Stimulation angewendet und die Medienzusammensetzung optimiert haben.Nach 10 Tagen gingen diese Zahlen jedoch stark zurück.Wir beziehen uns auf Abschnitte, die in unserem vorherigen statischen biomimetischen Kultursystem 20, 21 unter Kontrollbedingungen (Strg) kultiviert wurden, und wir werden unser zuvor optimiertes Medium als MC-Bedingungen und Kultur unter gleichzeitiger mechanischer und elektrischer Stimulation (CTCM) verwenden.genannt .Zunächst stellten wir fest, dass die mechanische Stimulation ohne elektrische Stimulation nicht ausreichte, um die Lebensfähigkeit des Gewebes für 6 Tage aufrechtzuerhalten (ergänzende Abbildung 3a, b).Interessanterweise blieb mit der Einführung der physiomechanischen und elektrischen Stimulation mittels STCM die Lebensfähigkeit von 12-Tage-Herzschnitten unter MS-Bedingungen dieselbe wie bei frischen Herzschnitten, nicht jedoch unter CONTROL-Bedingungen, wie die MTT-Analyse zeigt (Abb. 1).3a).Dies deutet darauf hin, dass durch mechanische Stimulation und Simulation des Herzzyklus Gewebeabschnitte doppelt so lange lebensfähig bleiben können wie in unserem vorherigen statischen Kultursystem.Die Beurteilung der strukturellen Integrität von Gewebeschnitten durch Immunmarkierung von kardialem Troponin T und Connexin 43 zeigte jedoch, dass die Connexin 43-Expression in MC-Geweben am 12. Tag signifikant höher war als in den Kontrollen am selben Tag.Die einheitliche Expression von Connexin 43 und die Bildung der Z-Scheibe blieben jedoch nicht vollständig erhalten (Abb. 3b).Wir verwenden ein Framework für künstliche Intelligenz (KI), um die strukturelle Integrität des Gewebes zu quantifizieren26, eine bildbasierte Deep-Learning-Pipeline, die auf Troponin-T- und Connexin-Färbung43 basiert, um die strukturelle Integrität und Fluoreszenz von Herzschnitten im Hinblick auf die Stärke der Lokalisierung automatisch zu quantifizieren.Diese Methode nutzt ein Convolutional Neural Network (CNN) und ein Deep-Learning-Framework, um die strukturelle Integrität von Herzgewebe auf automatisierte und unvoreingenommene Weise zuverlässig zu quantifizieren, wie in der Referenz beschrieben.26. MC-Gewebe zeigte im Vergleich zu statischen Kontrollschnitten eine verbesserte strukturelle Ähnlichkeit zum Tag 0.Darüber hinaus zeigte die Trichrom-Färbung nach Masson einen deutlich geringeren Prozentsatz an Fibrose unter MS-Bedingungen im Vergleich zu Kontrollbedingungen am 12. Tag der Kultur (Abb. 3c).Während CTCM die Lebensfähigkeit von Herzgewebeschnitten am Tag 12 auf ein ähnliches Niveau wie frisches Herzgewebe steigerte, verbesserte es die strukturelle Integrität der Herzschnitte nicht wesentlich.
Ein Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der MTT-Lebensfähigkeit von frischen Herzschnitten (D0) oder Herzschnittkulturen für 12 Tage entweder in statischer Kultur (D12 Ctrl) oder in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und **p < 0 .01 im Vergleich zu D12 Strg). Ein Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der MTT-Lebensfähigkeit von frischen Herzschnitten (D0) oder Herzschnittkulturen für 12 Tage entweder in statischer Kultur (D12 Ctrl) oder in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, ein einfacher ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl).Das Histogramm zeigt die Quantifizierung der Lebensfähigkeit von MTT-Frischherzschnitten (D0) oder Kultur von Herzschnitten für 12 Tage in entweder statischer Kultur (D12-Kontrolle) oder CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12-Kontrolle). ), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein einseitiger ANOVA-Test durchgeführt;####p < 0,0001 durch D0 und **p < 0,01 durch D12 Strg). ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Strg). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl相比**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Strg) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Strg) 中新鲜心脏切片(D0) 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比**p。)Histogramm, das die Quantifizierung der MTT-Lebensfähigkeit in frischen Herzschnitten (D0) oder Herzschnitten zeigt, die 12 Tage lang in statischer Kultur (D12-Kontrolle) oder CTCM (D12 MC) kultiviert wurden (n = 18 (D0), 15 (D12-Kontrolle)), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test;####p < 0,0001 durch D0, **p < 0,01 durch D12 Strg). ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0, **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Strg).b Troponin-T (grün), Connexin 43 (rot) und DAPI (blau) in frisch isolierten Herzschnitten (D0) oder Herzschnitten, die 12 Tage lang unter statischen Bedingungen (Strg) oder CTCM-Bedingungen (MC) kultiviert wurden) von repräsentativen Immunfluoreszenzbildern (Leermaßstab = 100 µm). Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes durch künstliche Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Schnitte/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes durch künstliche Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Schnitte/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). Die Gesamtstruktur des Gehirns ist ein intelligenter Prozess (n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC). ся однофакторный TEST ANOVA; ####p < 0,0001 durch D0 und ****p < 0,0001 durch D12 Strg). Quantifizierung der strukturellen Integrität von Herzgewebe durch künstliche Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Abschnitte/Gruppen von verschiedenen Schweinen, durchgeführter einseitiger ANOVA-Test; ####p < 0,0001 vs. mit D0 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Scheiben/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Strg-Taste）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Scheiben/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Strg-Taste）. Intelligentes Intellektsystem für die Gesamtstruktur des Gehirns mit niedriger Geschwindigkeit (n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Unter-/Grenzwert aus mehreren Zeilen, Standardtest ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Zur Berechnung ****p < 0,0001 gemäß D12 Strg). Künstliche Intelligenz zur Quantifizierung der strukturellen Integrität von Herzgewebe (n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), jeweils 5 (D12 MC) Abschnitte/Gruppe verschiedener Schweine, einfaktorieller ANOVA-Test; ####p<0,0001 vs. .D0 Zum Vergleich ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) für Herzschnitte, die mit Massons Trichrom-Färbung gefärbt wurden (Maßstab blank = 500 µm) (n = jeweils 10 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) für Herzschnitte, die mit Massons Trichrom-Färbung gefärbt wurden (Maßstab blank = 500 µm) (n = jeweils 10 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c Repräsentatives Bild (später) und einheitlicher Standort (Spray) innerhalb von 15 Minuten, gesperrte dreifarbige Karte von Masson (maximal ohne Auflage = 500 Mio.). м) (n = 10 Stufen/Gruppe aus mehreren Zeilen, wird für den ANOVA-Test verwendet; #### p < 0,0001 nach D0 und ***p < 0,001 nach D12 Ctrl). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) von Herzschnitten, die mit Massons Trichrom-Färbung (unbeschichtete Skala = 500 µm) gefärbt wurden (n = 10 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 Masson度 = 500 µm） （n = 10 ，***p < 0,001 与D12 Strg-Befehl）。 c Repräsentative Bildaufnahme (sechs) und umfassende Analyse (Sprech) innerhalb von sechs, dreistelligen Mengen von Masson (Schulumfang = 500 Millionen Monate) (n = 10 Sres/Gruppen, 10 Min. von 2 Svinies, praktiziert durch eine wissenschaftliche Analyse; ### #p < 0,0001 durch D0, ***p < 0,001 durch S внению mit D12 Strg). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) von Herzschnitten, die mit Massons Trichrom-Färbung (leer = 500 µm) gefärbt wurden (n = 10 Schnitte/Gruppe, jeweils von einem anderen Schwein, getestet durch Einweg-Varianzanalyse; ### # p < 0,0001 im Vergleich zu D0, ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg).Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
Wir stellten die Hypothese auf, dass durch die Zugabe kleiner Moleküle zum Kulturmedium die Integrität der Kardiomyozyten verbessert und die Fibroseentwicklung während der CTCM-Kultur verringert werden könnte.Aufgrund der geringen Anzahl von Störfaktoren haben wir daher mit unseren statischen Kontrollkulturen20,21 nach kleinen Molekülen gescreent.Für dieses Screening wurden Dexamethason (Dex), Trijodthyronin (T3) und SB431542 (SB) ausgewählt.Diese kleinen Moleküle wurden zuvor in hiPSC-CM-Kulturen verwendet, um die Reifung von Kardiomyozyten durch Erhöhung der Sarkomerlänge, T-Tubuli und Leitungsgeschwindigkeit zu induzieren.Darüber hinaus ist bekannt, dass sowohl Dex (ein Glukokortikoid) als auch SB Entzündungen unterdrücken29,30.Daher haben wir getestet, ob der Einschluss eines oder einer Kombination dieser kleinen Moleküle die strukturelle Integrität von Herzabschnitten verbessern würde.Für das erste Screening wurde die Dosis jeder Verbindung basierend auf den üblicherweise in Zellkulturmodellen verwendeten Konzentrationen ausgewählt (1 μM Dex27, 100 nM T327 und 2,5 μM SB31).Nach 12 Tagen Kultur führte die Kombination von T3 und Dex zu einer optimalen strukturellen Integrität der Kardiomyozyten und einem minimalen fibrösen Umbau (Ergänzende Abbildungen 4 und 5).Darüber hinaus führte die Verwendung des Doppelten oder Doppelten dieser T3- und Dex-Konzentrationen im Vergleich zu normalen Konzentrationen zu schädlichen Auswirkungen (ergänzende Abbildung 6a, b).
Nach dem ersten Screening führten wir einen direkten Vergleich von vier Kulturbedingungen durch (Abbildung 4a): Strg: Herzabschnitte, kultiviert in unserer zuvor beschriebenen statischen Kultur unter Verwendung unseres optimierten Mediums;20.21 TD: T3 und Strg s Dex am Mittwoch hinzugefügt;MC: Herzschnitte, kultiviert in CTCM unter Verwendung unseres zuvor optimierten Mediums;und MT: CTCM mit T3 und Dex zum Medium hinzugefügt.Nach 12 Tagen Kultivierung blieb die Lebensfähigkeit von MS- und MT-Geweben dieselbe wie bei frischen Geweben, die mittels MTT-Assay beurteilt wurden (Abb. 4b).Interessanterweise führte die Zugabe von T3 und Dex zu Transwell-Kulturen (TD) im Vergleich zu Ctrl-Bedingungen nicht zu einer signifikanten Verbesserung der Lebensfähigkeit, was auf eine wichtige Rolle der mechanischen Stimulation bei der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit von Herzabschnitten hinweist.
ein experimentelles Designdiagramm, das die vier Kulturbedingungen darstellt, die zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer Stimulation und T3/Dex-Supplementierung auf Medium für 12 Tage verwendet wurden. b Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der Lebensfähigkeit 12 Tage nach der Kultur in allen 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001, ###p < 0 .001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Strg). b Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der Lebensfähigkeit 12 Tage nach der Kultur in allen 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001, ###p < 0 .001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Strg). b Гистограмма показывает ценку жизнеспособности через 12 дней nach культивирования всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) ACHTUNG Anzahl der einzelnen Zeilen (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) Ergebnisse/Gruppe aus mehreren Zeilen, ergibt einen einzigartigen ANOVA-Test; #### p < 0,0001, ###p < 0,001 durch D0 und **p < 0,01 durch D12 Strg). b Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der Lebensfähigkeit 12 Tage nach der Kultur in allen 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test; ####p < 0,0001, ###p < 0 .001 vs. D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Strg). b 条形图显示所有4 种培养条件（Strg、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001, ###p < 0.001 与D0 相比, **p < 0.01 与D12 的）。b 4 12 (D12 MC) b Histogramm, unterteilt in alle 4 Kategorien (Kontrolle, TD, MC und MT), basierend auf den einzelnen Zeilen (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Strg, D12 TD und D12 MT). ), aus Abschnitt 12 (D12 MC) Sektionen/Gruppen, einzigartiger ANOVA-Test; ####p <0,0001, ###p <0,001 nach D0, **p <0,01 nach D12). b Histogramm, das alle 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) zeigt (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), von verschiedenen Schweinen 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe, einseitiger ANOVA-Test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. Kontrolle D12). c Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultur in allen 4 Kulturbedingungen (Strg, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg). c Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultur in allen 4 Kulturbedingungen (Strg, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg). c Гистограмма показывает количественный ценку глюкозы через 12 дней после культивирования всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) auf scrav Nicht mit zwei niedrigen Durchschnittswerten (D0) (n = 6 Punkte/Gruppe von mehreren sechs, zweistelligen Prozentpunkten) Выполняется TEST ANOVA; равнению mit D12 Strg). c Das Histogramm zeigt die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultur unter allen 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, durchgeführter einseitiger ANOVA-Test; ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Strg). c 条形图显示所有4 种培养条件 (Strg, TD, MC 和MT) 与新鲜心脏切片(D0) 相比, 培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组, 来自不同猪, 单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001, 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有有有4 种条件 ((ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比, 培养 后后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组, 来自 猪 ，, , , , , 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001, 与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Strg-Taste）. c Histogramm, 10 Tage nach der Kultivierung für jeweils 4 Kultivierungen (Kontrolle, TD, MC und MT). Anzahl der getesteten ANOVA-Tests; ###p < 0,001 bis D0, ***p < 0,001 Gestützt auf D12 (Regler). c Histogramm, das die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultur für alle 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) zeigt (n = 6 Schnitte/Gruppe, von verschiedenen Schweinen, einseitig wurden ANOVA-Tests durchgeführt, ###p < 0,001 im Vergleich zu D0, ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 (Kontrolle).d Belastungsanalysediagramme von frischem (blau), MC-Gewebe vom 12. Tag (grün) und MT-Gewebe vom 12. Tag (rot) an zehn regionalen Gewebeschnittpunkten (n = 4 Scheiben/Gruppe, einseitiger ANOVA-Test; es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen).e Vulkandiagramm, das unterschiedlich exprimierte Gene in frischen Herzschnitten (D0) im Vergleich zu Herzschnitten zeigt, die 10–12 Tage lang unter statischen Bedingungen (Strg) oder unter MT-Bedingungen (MT) kultiviert wurden.f Heatmap der Sarkomer-Gene für Herzabschnitte, die unter den jeweiligen Kulturbedingungen kultiviert wurden.Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
Die metabolische Abhängigkeit vom Wechsel von der Fettsäureoxidation zur Glykolyse ist ein Kennzeichen der Dedifferenzierung von Kardiomyozyten.Unreife Kardiomyozyten verwenden hauptsächlich Glukose für die ATP-Produktion und verfügen über hypoplastische Mitochondrien mit wenigen Cristae5,32.Glukoseverwertungsanalysen zeigten, dass unter MC- und MT-Bedingungen die Glukoseverwertung ähnlich der in Geweben des Tages 0 war (Abbildung 4c).Allerdings zeigten Ctrl-Proben im Vergleich zu frischem Gewebe einen signifikanten Anstieg der Glukoseverwertung.Dies weist darauf hin, dass die Kombination von CTCM und T3/Dex die Lebensfähigkeit des Gewebes verbessert und den metabolischen Phänotyp von 12-Tage-kultivierten Herzschnitten bewahrt.Darüber hinaus zeigte die Belastungsanalyse, dass die Belastungswerte unter MT- und MS-Bedingungen 12 Tage lang die gleichen blieben wie in frischem Herzgewebe (Abb. 4d).
Um den Gesamteinfluss von CTCM und T3/Dex auf die globale Transkriptionslandschaft von Herzschnittgewebe zu analysieren, führten wir RNAseq an Herzschnitten aus allen vier verschiedenen Kulturbedingungen durch (Ergänzungsdaten 1).Interessanterweise zeigten MT-Schnitte eine hohe transkriptionelle Ähnlichkeit mit frischem Herzgewebe, wobei nur 16 von 13.642 Genen unterschiedlich exprimiert wurden.Wie wir jedoch zuvor gezeigt haben, zeigten Ctrl-Schnitte nach 10–12 Tagen in Kultur 1229 unterschiedlich exprimierte Gene (Abb. 4e).Diese Daten wurden durch qRT-PCR von Herz- und Fibroblastengenen bestätigt (ergänzende Abbildung 7a – c).Interessanterweise zeigten die Ctrl-Abschnitte eine Herunterregulierung von Herz- und Zellzyklusgenen und eine Aktivierung von Entzündungsgenprogrammen.Diese Daten legen nahe, dass die Dedifferenzierung, die normalerweise nach Langzeitkultivierung auftritt, unter MT-Bedingungen vollständig abgeschwächt wird (ergänzende Abbildung 8a, b).Eine sorgfältige Untersuchung der Sarkomer-Gene zeigte, dass nur unter MT-Bedingungen die Gene, die für das Sarkomer (Abb. 4f) und den Ionenkanal (ergänzende Abb. 9) kodieren, erhalten bleiben und sie vor Unterdrückung unter Ctrl-, TD- und MC-Bedingungen schützen.Diese Daten zeigen, dass mit einer Kombination aus mechanischer und humoraler Stimulation (T3/Dex) das Herzschnitt-Transkriptom nach 12 Tagen in Kultur ähnlich wie frische Herzschnitte bleiben kann.
Diese Transkriptionsergebnisse werden durch die Tatsache gestützt, dass die strukturelle Integrität von Kardiomyozyten in Herzschnitten unter MT-Bedingungen 12 Tage lang am besten erhalten bleibt, wie intaktes und lokalisiertes Connexin 43 zeigt (Abb. 5a).Darüber hinaus war die Fibrose in Herzschnitten unter MT-Bedingungen im Vergleich zu CT-Bedingungen deutlich reduziert und ähnelte denen frischer Herzschnitte (Abb. 5b).Diese Daten zeigen, dass die Kombination aus mechanischer Stimulation und T3/Dex-Behandlung die Herzstruktur in Herzschnitten in Kultur wirksam bewahrt.
a Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von Troponin-T (grün), Connexin 43 (rot) und DAPI (blau) in frisch isolierten Herzschnitten (D0) oder 12 Tage lang unter allen vier Kulturbedingungen des Herzschnitts kultiviert (Maßstabsbalken = 100 µm).). Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes durch künstliche Intelligenz (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes durch künstliche Intelligenz (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). Zusammengefasste Strukturanalyse-Methoden mit erweiterter Intelligenz (n = 7 (D0 und D12 Strg), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Ergebnisse/Gruppen von 10.000, 10.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 100.000, 10.000 Quantifizierung der strukturellen Integrität von Herzgewebe mithilfe künstlicher Intelligenz (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Abschnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, durchgeführter einfaktorieller ANOVA-Test; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比, 或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比, 或****p < 0.0001 与D12 Strg 相比）。Quantifizierung der strukturellen Integrität von Herzgewebe mithilfe künstlicher Intelligenz bei verschiedenen Schweinen (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Abschnitte/Gruppe) mit einem einfaktoriellen ANOVA-Test;#### p < 0,0001 durch D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 durch D12 Strg). #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung für mit Massons Trichrom-Färbung gefärbte Herzschnitte (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung für mit Massons Trichrom-Färbung gefärbte Herzschnitte (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einseitiger ANOVA-Test wird durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Strg). b Repräsentative Bilder und eine Reihe von Ergebnissen aus der ganzen Welt, dreidimensional gefärbtes Masson (Maßstablänge = 500 Mio. Kubikmeter) (n = 10 (D0, D1 2 Strg, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Zeilen/Gruppen aus mehreren Zeilen, ausgewählter Standardtest ANOVA; ####p < 0,0001 auf der Skala von D0 und ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 durch D12 Strg). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Herzschnitten, die mit Massons Trichrom-Färbung gefärbt wurden (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, durchgeführte einfaktorielle ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 und ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 vs. D12 Strg). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC）, 来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组, 进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0,0001 与D12 Strg-Taste）. b 用 Masson d12 td und d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组,进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比,***p < 0,001, „****p < 0,0001“ oder „D12 Strg“-Befehl. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung von mit Massons Trichrom gefärbten Herzschnitten (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte von verschiedenen Schweinen/Gruppe, eine ANOVA-Methode; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0, ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D 12 Strg).Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
Schließlich wurde die Fähigkeit von CTCM zur Nachahmung einer Herzhypertrophie durch Erhöhung der Dehnung des Herzgewebes bewertet.Bei CTCM stieg der maximale Luftkammerdruck von 80 mmHg auf 80 mmHg.Kunst.(normale Dehnung) bis 140 mmHg Art.-Nr.(Abb. 6a).Dies entspricht einem Anstieg der Dehnung um 32 % (Abb. 6b), der zuvor als entsprechende prozentuale Dehnung dargestellt wurde, die für Herzabschnitte erforderlich ist, um eine Sarkomerlänge ähnlich der bei Hypertrophie beobachteten Länge zu erreichen.Dehnung und Geschwindigkeit des Herzgewebes während der Kontraktion und Entspannung blieben während der sechstägigen Kultur konstant (Abb. 6c).Herzgewebe aus MT-Bedingungen wurde sechs Tage lang normalen Dehnungsbedingungen (MT (Normal)) oder Überdehnungsbedingungen (MT (OS)) ausgesetzt.Bereits nach vier Tagen in Kultur war der hypertrophe Biomarker NT-ProBNP im Medium unter MT-Bedingungen (OS) im Vergleich zu MT-Bedingungen (normal) signifikant erhöht (Abb. 7a).Darüber hinaus nahm die Zellgröße in MT (OS) (Abb. 7b) nach sechs Tagen Kultivierung im Vergleich zu Abschnitten des MT-Herzens (normal) signifikant zu.Darüber hinaus war die nukleare Translokation von NFATC4 in überdehnten Geweben signifikant erhöht (Abb. 7c).Diese Ergebnisse zeigen die fortschreitende Entwicklung des pathologischen Umbaus nach Hyperdistension und stützen das Konzept, dass das CTCM-Gerät als Plattform zur Untersuchung der dehnungsinduzierten Herzhypertrophie-Signalisierung verwendet werden kann.
Repräsentative Spuren des Luftkammerdrucks, des Flüssigkeitskammerdrucks und der Gewebebewegungsmessungen bestätigen, dass der Kammerdruck den Flüssigkeitskammerdruck verändert und eine entsprechende Bewegung des Gewebeschnitts verursacht.b Repräsentative Dehnungsprozentsatz- und Dehnungsratenkurven für normal gedehnte (orange) und überdehnte (blau) Gewebeabschnitte.c Balkendiagramm mit Zykluszeit (n = 19 Scheiben pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Kontraktionszeit (n = 18–19 Scheiben pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Entspannungszeit (n = 19 Scheiben pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Amplitude der Gewebebewegung (n = 14 Scheiben/Gruppe, von verschiedenen Schweinen), systolischer Spitzengeschwindigkeit (n = 14 Scheiben/Gruppe, von verschiedenen Schweinen) und Spitzenrelaxationsrate (n = 14 (D0), 15 (D6) ) Abschnitte/Gruppen) von verschiedenen Schweinen), der zweiseitige Student-T-Test zeigte keinen signifikanten Unterschied in irgendeinem Parameter, was darauf hindeutet, dass diese Parameter während der 6-tägigen Kultur mit Überspannung konstant blieben.Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
a Balkendiagramm-Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentration in Kulturmedien aus Herzschnitten, die unter MT-Normaldehnungsbedingungen (Norm) oder Überdehnungsbedingungen (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird eine Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt; **p < 0,01 im Vergleich zur Normaldehnung). a Balkendiagramm-Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentration in Kulturmedien aus Herzschnitten, die unter MT-Normaldehnungsbedingungen (Norm) oder Überdehnungsbedingungen (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird eine Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt; **p < 0,01 im Vergleich zur Normaldehnung).Quantitatives Histogramm der NT-ProBNP-Konzentration im Kulturmedium aus Herzschnitten, die unter Bedingungen normaler MT-Streckung (Norm) oder Überstreckung (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4).MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, eine Zwei-Faktor-Varianzanalyse wird durchgeführt;**p < 0,01 im Vergleich zur normalen Norm. **p < 0,01 im Vergleich zur normalen Dehnung). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 ( D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双双向方差分析；**与正常拉伸比，p < 0,01）。 a Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentration in Herzschnitten, die unter MT-Bedingungen mit normaler Dehnung (Norm) oder Überdehnung (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) aus verschiedenen Proben/Häufchen; **im Vergleich mit normaler Dehnung, p < 0,01).Histogramm Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentrationen in Herzschnitten, die unter Bedingungen normaler MT-Streckung (Norm) oder Überstreckung (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) und D4 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, bidirektionale Varianzanalyse;**p < 0,01 im Vergleich zur normalen Norm. **p < 0,01 im Vergleich zur normalen Dehnung). b Repräsentative Bilder für mit Troponin-T und WGA gefärbte Herzschnitte (links) und Zellgrößenquantifizierung (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Gruppe aus 10 verschiedenen Schnitten verschiedener Schweine, Two-tailed Student t-Test wird durchgeführt; ****p < 0,0001 im Vergleich zur normalen Dehnung). b Repräsentative Bilder für mit Troponin-T und WGA gefärbte Herzschnitte (links) und Zellgrößenquantifizierung (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Gruppe aus 10 verschiedenen Schnitten verschiedener Schweine, Two-tailed Student t-Test wird durchgeführt; ****p < 0,0001 im Vergleich zur normalen Dehnung). b Repräsentative Bildanalyse in der zweiten Hälfte, 30.000 US-Dollar, 3.000 US-Dollar, 3.000 US-Dollar und 3.000 US-Dollar (n = 330 (D6 MTOS), 369 ( D6 MTNorm) Schlüssel/Gruppe aus 10 verschiedenen Abschnitten auf mehreren Ebenen, zwei verschiedene T-Kriterien-Stufen; ****p < 0,0001 nach Norm ем). b Repräsentative Bilder von mit Troponin-T und AZP gefärbten Herzschnitten (links) und Zellgrößenquantifizierung (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Gruppe aus 10 verschiedenen Schnitten verschiedener Schweine, es wurde ein zweischwänziger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001 im Vergleich zum Normalstamm). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS）来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0,0001）。 b Repräsentative Bilder von mit Calcarein-T und WGA gefärbten Herzschnitten (links) und Zellgröße (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 aus 10 verschiedenen Schnitten (D6 MTNorm)). b Repräsentative Bildanalyse mit sechs, dreistelligen Trophäen und einem niedrigen Auflösungsvermögen (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MT). Norm) aus 10 verschiedenen Abschnitten aus verschiedenen Teilen des Landes (Gruppe/Gruppe, Doppelkriterium: ****p < 0,0001 gemäß normaler Norm). b Repräsentative Bilder von mit Troponin-T und AZP gefärbten Herzschnitten (links) und Quantifizierung der Zellgröße (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) aus 10 verschiedenen Schnitten verschiedener Schweine) Zellen/Gruppe, zweiseitiges Kriterium Student's t;****p < 0,0001 im Vergleich zur Normalbelastung). c Repräsentative Bilder für MTOS-Herzschnitte von Tag 0 und Tag 6, immunmarkiert für Troponin-T und NFATC4 und Quantifizierung der Translokation von NFATC4 in die Kerne von CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder für MTOS-Herzschnitte von Tag 0 und Tag 6, immunmarkiert für Troponin-T und NFATC4 und Quantifizierung der Translokation von NFATC4 in die Kerne von CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen. Es wird ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder für MTOS-Sätze 0 und 6 Tage, Immunimmunisierung für Tropon-T und NFATC4 sowie eine umfassende Analyse der NFATC4-Übertragung vor einem Jahr ых клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-kriterium Стьюдента; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder für Herzschnitte bei 0 und 6 Tagen MTOS, immunmarkiert für Troponin-T und NFATC4 und Quantifizierung der NFATC4-Translokation im Kern kavernöser Zellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen), durchgeführter zweiseitiger Student-t-Test;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像, 以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Repräsentative Bilder von Calcanin-T- und NFATC4-Immunmarkierungs-Herzschnitten mit 0,6 MTOS und NFATC4 aus verschiedenen NFATC4-CM-Zellkern-Mengen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS on 0 Neues Jahr (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Teil/Gruppe, zwei-hochwertige T-Kriterien-Stufen; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder von MTOS-Herzschnitten am Tag 0 und 6 für die Troponin-T- und NFATC4-Immunmarkierung und Quantifizierung der NFATC4-Translokation im Kern von CM von verschiedenen Schweinen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe, zweiseitiges t-Kriterium Student; *p < 0,05).Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
Für die translationale Herz-Kreislauf-Forschung sind zelluläre Modelle erforderlich, die die Herzumgebung genau reproduzieren.In dieser Studie wurde ein CTCM-Gerät entwickelt und charakterisiert, das ultradünne Abschnitte des Herzens stimulieren kann.Das CTCM-System umfasst eine physiologisch synchronisierte elektromechanische Stimulation sowie die Anreicherung von T3- und Dex-Flüssigkeiten.Wenn Schweineherzschnitte diesen Faktoren ausgesetzt wurden, blieben ihre Lebensfähigkeit, strukturelle Integrität, Stoffwechselaktivität und Transkriptionsexpression nach 12 Tagen Kultur dieselben wie in frischem Herzgewebe.Darüber hinaus kann eine übermäßige Dehnung des Herzgewebes zu einer durch Hyperextension verursachten Hypertrophie des Herzens führen.Insgesamt untermauern diese Ergebnisse die entscheidende Rolle physiologischer Kulturbedingungen bei der Aufrechterhaltung eines normalen Herzphänotyps und bieten eine Plattform für das Arzneimittelscreening.
Viele Faktoren tragen dazu bei, ein optimales Umfeld für die Funktion und das Überleben von Kardiomyozyten zu schaffen.Die offensichtlichsten dieser Faktoren hängen mit (1) interzellulären Wechselwirkungen, (2) elektromechanischer Stimulation, (3) humoralen Faktoren und (4) Stoffwechselsubstraten zusammen.Physiologische Zell-Zell-Interaktionen erfordern komplexe dreidimensionale Netzwerke mehrerer Zelltypen, die von einer extrazellulären Matrix unterstützt werden.Solch komplexe zelluläre Interaktionen lassen sich in vitro durch Co-Kultivierung einzelner Zelltypen nur schwer rekonstruieren, können aber mithilfe der organotypischen Natur von Herzschnitten leicht erreicht werden.
Mechanische Dehnung und elektrische Stimulation der Kardiomyozyten sind entscheidend für die Aufrechterhaltung des Herzphänotyps33,34,35.Während die mechanische Stimulation weithin für die Konditionierung und Reifung von hiPSC-CM eingesetzt wird, wurde kürzlich in mehreren eleganten Studien versucht, Herzscheiben in Kultur mithilfe einer einachsigen Belastung mechanisch zu stimulieren.Diese Studien zeigen, dass sich eine zweidimensionale einachsige mechanische Belastung während der Kultur positiv auf den Phänotyp des Herzens auswirkt.In diesen Studien wurden Abschnitte des Herzens entweder mit isometrischen Zugkräften17 oder linearer auxotonischer Belastung18 belastet oder der Herzzyklus wurde mithilfe von Kraftwandler-Feedback und Spannungsantrieben nachgebildet.Diese Methoden nutzen jedoch eine einachsige Gewebedehnung ohne Umgebungsoptimierung, was zur Unterdrückung vieler Herzgene oder zur Überexpression von Genen führt, die mit abnormalen Dehnungsreaktionen verbunden sind.Das hier beschriebene CTCM bietet einen elektromechanischen 3D-Stimulus, der den natürlichen Herzzyklus in Bezug auf Zykluszeit und physiologische Dehnung (25 % Dehnung, 40 % Systole, 60 % Diastole und 72 Schläge pro Minute) nachahmt.Obwohl diese dreidimensionale mechanische Stimulation allein nicht ausreicht, um die Gewebeintegrität aufrechtzuerhalten, ist eine Kombination aus humoraler und mechanischer Stimulation mithilfe von T3/Dex erforderlich, um die Lebensfähigkeit, Funktion und Integrität des Gewebes angemessen aufrechtzuerhalten.
Humorale Faktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation des Phänotyps des erwachsenen Herzens.Dies wurde in HiPS-CM-Studien hervorgehoben, in denen T3 und Dex zu Kulturmedien hinzugefügt wurden, um die Zellreifung zu beschleunigen.T3 kann den Transport von Aminosäuren, Zucker und Kalzium durch Zellmembranen beeinflussen36.Darüber hinaus fördert T3 die MHC-α-Expression und die Herunterregulierung von MHC-β und fördert so die Bildung schnell kontrahierender Myofibrillen in reifen Kardiomyozyten im Vergleich zu langsam kontrahierenden Myofibrillen in fetalen CM.Ein T3-Mangel führt bei Patienten mit Hypothyreose zum Verlust myofibrillärer Bänder und zu einer verringerten Tonusentwicklung37.Dex wirkt auf Glukokortikoidrezeptoren und erhöht nachweislich die Kontraktilität des Myokards in isolierten perfundierten Herzen;38 Es wird angenommen, dass diese Verbesserung mit der Auswirkung auf den durch Kalziumablagerungen verursachten Eintrag (SOCE) zusammenhängt 39,40.Darüber hinaus bindet Dex an seine Rezeptoren und löst so eine breite intrazelluläre Reaktion aus, die die Immunfunktion und Entzündungen unterdrückt30.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass physikalisch-mechanische Stimulation (MS) die Gesamtleistung der Kultur im Vergleich zu CT verbesserte, jedoch die Lebensfähigkeit, strukturelle Integrität und kardiale Expression über 12 Tage in der Kultur nicht aufrechterhielt.Im Vergleich zu Ctrl verbesserte die Zugabe von T3 und Dex zu CTCM (MT)-Kulturen die Lebensfähigkeit und behielt ähnliche Transkriptionsprofile, strukturelle Integrität und Stoffwechselaktivität mit frischem Herzgewebe für 12 Tage bei.Darüber hinaus wurde durch die Kontrolle des Ausmaßes der Gewebedehnung mit STCM ein durch Hyperextension induziertes Herzhypertrophiemodell erstellt, das die Vielseitigkeit des STCM-Systems veranschaulicht.Es ist zu beachten, dass Herzumbau und Fibrose zwar in der Regel intakte Organe betreffen, deren zirkulierende Zellen die entsprechenden Zytokine sowie Phagozytose und andere Umbaufaktoren bereitstellen können, Teile des Herzens jedoch dennoch den fibrotischen Prozess als Reaktion auf Stress und Trauma nachahmen können.in Myofibroblasten.Dies wurde zuvor in diesem Herzschnittmodell evaluiert.Es ist zu beachten, dass CTCM-Parameter durch Änderung von Druck/elektrischer Amplitude und Frequenz moduliert werden können, um viele Zustände wie Tachykardie, Bradykardie und mechanische Kreislaufunterstützung (mechanisches entlastetes Herz) zu simulieren.Damit bietet das System einen mittleren Durchsatz für Drogentests.Die Fähigkeit von CTCM, durch Überanstrengung verursachte Herzhypertrophie zu modellieren, ebnet den Weg für die Erprobung dieses Systems für eine personalisierte Therapie.Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass mechanische Dehnung und humorale Stimulation für die Aufrechterhaltung der Kultur von Herzgewebeschnitten von entscheidender Bedeutung sind.
Obwohl die hier präsentierten Daten darauf hindeuten, dass CTCM eine vielversprechende Plattform für die Modellierung intakten Myokards ist, weist diese Kulturmethode einige Einschränkungen auf.Die Haupteinschränkung der CTCM-Kultur besteht darin, dass sie kontinuierliche dynamische mechanische Belastungen auf die Schnitte ausübt, was die Fähigkeit ausschließt, die Herzschnittkontraktionen während jedes Zyklus aktiv zu überwachen.Darüber hinaus ist aufgrund der geringen Größe der Herzschnitte (7 mm) die Möglichkeit, die systolische Funktion außerhalb von Kultursystemen mithilfe herkömmlicher Kraftsensoren zu bewerten, begrenzt.Im aktuellen Manuskript überwinden wir diese Einschränkung teilweise, indem wir die optische Spannung als Indikator für die kontraktile Funktion bewerten.Diese Einschränkung erfordert jedoch weitere Arbeiten und kann in Zukunft durch die Einführung von Methoden zur optischen Überwachung der Funktion von Herzscheiben in Kulturen behoben werden, beispielsweise durch optische Kartierung mit Kalzium und spannungsempfindlichen Farbstoffen.Eine weitere Einschränkung von CTCM besteht darin, dass das Arbeitsmodell den physiologischen Stress (Vorlast und Nachlast) nicht manipuliert.Bei der CTCM wurde Druck in entgegengesetzte Richtungen induziert, um in sehr großen Geweben eine physiologische Dehnung von 25 % in der Diastole (vollständige Dehnung) und Systole (Kontraktionslänge während der elektrischen Stimulation) zu reproduzieren.Diese Einschränkung sollte in zukünftigen CTCM-Designs durch ausreichenden Druck auf das Herzgewebe von beiden Seiten und durch Anwendung der genauen Druck-Volumen-Beziehungen, die in den Herzkammern auftreten, beseitigt werden.
Der in diesem Manuskript beschriebene durch Überdehnung verursachte Umbau beschränkt sich auf die Nachahmung hypertropher Hyperdehnungssignale.Somit kann dieses Modell bei der Untersuchung dehnungsinduzierter hypertropher Signale helfen, ohne dass humorale oder neuronale Faktoren erforderlich sind (die in diesem System nicht existieren).Weitere Studien sind erforderlich, um die Vielfalt von CTCM zu erhöhen. Beispielsweise wird die Kokultivierung mit Immunzellen, zirkulierenden humoralen Plasmafaktoren und Innervation bei Kokultivierung mit neuronalen Zellen die Möglichkeiten der Krankheitsmodellierung mit CTCM verbessern.
In dieser Studie wurden dreizehn Schweine verwendet.Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Louisville genehmigt.Der Aortenbogen wurde abgeklemmt und das Herz mit 1 l steriler Kardioplegie (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml Heparin, pH bis 7,4) perfundiert; Die Herzen wurden in eiskalter kardioplegischer Lösung aufbewahrt, bis sie auf Eis ins Labor transportiert wurden, was normalerweise <10 Minuten dauert. Die Herzen wurden in eiskalter kardioplegischer Lösung aufbewahrt, bis sie auf Eis ins Labor transportiert wurden, was normalerweise <10 Minuten dauert. Die Dauer der Herz-Kreislauf-Erkrankung beträgt weniger als 10 Minuten. Die Herzen wurden in eiskalter kardioplegischer Lösung bis zum Transport auf Eis ins Labor gelagert, was normalerweise <10 Minuten dauert.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中, 直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中, 直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟. Bringen Sie die Blutgefäße in die Herz-Kreislauf-Erkrankung zum Transport in Laboratorien auf die Straße, mindestens 10 Minuten. Halten Sie die Herzen bei Kardioplegie auf Eis, bis sie zum Labor auf Eis transportiert werden, normalerweise <10 Minuten.
Das CTCM-Gerät wurde in der CAD-Software (Computer Aided Design) von SolidWorks entwickelt.Die Kulturkammern, Trennwände und Luftkammern bestehen aus CNC-klarem Acrylkunststoff.Der Stützring mit 7 mm Durchmesser besteht in der Mitte aus hochdichtem Polyethylen (HDPE) und verfügt über eine O-Ring-Nut zur Aufnahme des Silikon-O-Rings, der zum Abdichten der Medien darunter verwendet wird.Eine dünne Silica-Membran trennt die Kulturkammer von der Trennplatte.Die Silikonmembran ist aus einer 0,02 Zoll dicken Silikonfolie lasergeschnitten und hat eine Härte von 35A.Die unteren und oberen Silikondichtungen sind aus einer 1/16″ dicken Silikonfolie lasergeschnitten und haben eine Härte von 50A.Für die Befestigung des Blocks und die Herstellung einer luftdichten Abdichtung werden Schrauben und Flügelmuttern aus Edelstahl 316L verwendet.
Eine spezielle Leiterplatte (PCB) ist für die Integration in das C-PACE-EM-System konzipiert.Die Swiss-Machine-Anschlussbuchsen auf der Leiterplatte sind über versilberte Kupferdrähte und in die Elektroden eingeschraubte 0-60-Bronzeschrauben mit Graphitelektroden verbunden.Die Leiterplatte wird in der Abdeckung des 3D-Druckers platziert.
Das CTCM-Gerät wird von einem programmierbaren pneumatischen Aktuator (PPD) gesteuert, der einen kontrollierten Kreislaufdruck ähnlich einem Herzzyklus erzeugt.Wenn der Druck in der Luftkammer steigt, dehnt sich die flexible Silikonmembran nach oben aus und drückt das Medium unter die Gewebestelle.Der Gewebebereich wird dann durch diesen Flüssigkeitsausstoß gedehnt und ahmt so die physiologische Ausdehnung des Herzens während der Diastole nach.Auf dem Höhepunkt der Entspannung wurde über Graphitelektroden eine elektrische Stimulation angewendet, die den Druck in der Luftkammer verringerte und eine Kontraktion der Gewebeabschnitte verursachte.Im Inneren des Rohrs befindet sich ein hämostatisches Ventil mit einem Drucksensor zur Erfassung des Drucks im Luftsystem.Der vom Drucksensor erfasste Druck wird an einen Datensammler angelegt, der mit dem Laptop verbunden ist.Dies ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung des Drucks im Inneren der Gaskammer.Wenn der maximale Kammerdruck erreicht war (Standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), wurde das Datenerfassungsgerät angewiesen, ein Signal an das C-PACE-EM-System zu senden, um 2 ms lang ein zweiphasiges Spannungssignal zu erzeugen, das auf 4 V eingestellt ist.
Herzschnitte wurden entnommen und die Kulturbedingungen in 6 Vertiefungen wurden wie folgt durchgeführt: Übertragen der geernteten Herzen aus dem Transfergefäß in eine Schale mit kaltem (4 °C) Kardioplegietabletten.Der linke Ventrikel wurde mit einer sterilen Klinge isoliert und in Stücke von 1–2 cm3 geschnitten.Diese Gewebeblöcke wurden mit Gewebekleber an Gewebeträgern befestigt und in ein vibrierendes Mikrotom-Gewebebad gelegt, das Tyrodes Lösung enthielt und kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert war (3 g/L 2,3-Butandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-Glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM M MgCl2 (1 ml 1 M Lösung), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M Lösung), bis zu 1 L ddH2O).Das Vibrationsmikrotom war darauf eingestellt, 300 µm dicke Scheiben mit einer Frequenz von 80 Hz, einer horizontalen Vibrationsamplitude von 2 mm und einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,03 mm/s zu schneiden.Das Gewebebad war von Eis umgeben, um die Lösung kühl zu halten, und die Temperatur wurde bei 4 °C gehalten.Übertragen Sie Gewebeschnitte aus dem Mikrotombad in ein Inkubationsbad mit kontinuierlich sauerstoffhaltiger Tyrode-Lösung auf Eis, bis genügend Schnitte für eine Kulturplatte erhalten sind.Für Transwell-Kulturen wurden Gewebeschnitte an sterilen 6 mm breiten Polyurethanträgern befestigt und in 6 ml optimiertes Medium (199-Medium, 1x ITS-Ergänzung, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisch und 2x Antibiotikum-Antimykotikum) gegeben.Durch den C-Pace wurde eine elektrische Stimulation (10 V, Frequenz 1,2 Hz) auf die Gewebeabschnitte angewendet.Für TD-Bedingungen wurden bei jedem Mediumwechsel frisches T3 und Dex in einer Menge von 100 nM und 1 μM hinzugefügt.Das Medium wird vor dem Austausch dreimal täglich mit Sauerstoff gesättigt.Gewebeschnitte wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
Für CTCM-Kulturen wurden Gewebeschnitte auf einem speziell angefertigten 3D-Drucker in einer Petrischale mit modifizierter Tyrode-Lösung platziert.Das Gerät ist so konzipiert, dass es die Herzscheibe um 25 % der Fläche des Stützrings vergrößert.Dies geschieht, damit sich die Herzabschnitte nach dem Übergang von der Tyrode-Lösung in das Medium und während der Diastole nicht dehnen.Mit Histoacrylkleber wurden 300 µm dicke Schnitte auf einem Stützring mit 7 mm Durchmesser fixiert.Nachdem Sie die Gewebeabschnitte am Stützring befestigt haben, schneiden Sie die überschüssigen Gewebeabschnitte ab und legen Sie die befestigten Gewebeabschnitte zurück in das Bad der Tyrode-Lösung auf Eis (4 °C), bis genügend Abschnitte für ein Gerät vorbereitet wurden.Die Gesamtbearbeitungszeit für alle Geräte sollte 2 Stunden nicht überschreiten.Nachdem 6 Gewebeschnitte an ihren Stützringen befestigt waren, wurde das CTCM-Gerät zusammengebaut.Die CTCM-Kulturkammer ist mit 21 ml voroxygeniertem Medium vorgefüllt.Übertragen Sie die Gewebeschnitte in die Kulturkammer und entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen mit einer Pipette.Anschließend wird der Gewebeabschnitt in das Loch geführt und sanft angedrückt.Setzen Sie abschließend die Elektrodenkappe auf das Gerät und übertragen Sie das Gerät in den Inkubator.Verbinden Sie dann das CTCM mit dem Luftschlauch und dem C-PACE-EM-System.Der pneumatische Aktuator öffnet und das Luftventil öffnet das CTCM.Das C-PACE-EM-System wurde so konfiguriert, dass es während der biphasischen Stimulation 2 ms lang 4 V bei 1,2 Hz liefert.Das Medium wurde zweimal täglich und die Elektroden einmal täglich gewechselt, um eine Ansammlung von Graphit auf den Elektroden zu vermeiden.Bei Bedarf können Gewebeschnitte aus ihren Kulturvertiefungen entnommen werden, um eventuell darunter gefallene Luftblasen zu entfernen.Für MT-Behandlungsbedingungen wurde T3/Dex bei jedem Mediumwechsel frisch mit 100 nM T3 und 1 μM Dex hinzugefügt.Die CTCM-Geräte wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
Um gestreckte Trajektorien von Herzschnitten zu erhalten, wurde ein spezielles Kamerasystem entwickelt.Eine Spiegelreflexkamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) wurde mit einem Navitar Zoom 7000 18-108 mm Makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA) verwendet.Die Visualisierung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, nachdem das Medium durch frisches Medium ersetzt wurde.Die Kamera ist in einem Winkel von 51° positioniert und Videos werden mit 30 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet.Zunächst wurde Open-Source-Software (MUSCLEMOTION43) mit Image-J verwendet, um die Bewegung von Herzscheiben zu quantifizieren.Die Maske wurde mit MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) erstellt, um interessierende Regionen für schlagende Herzschnitte zu definieren und so Rauschen zu vermeiden.Manuell segmentierte Masken werden auf alle Bilder in einer Bildsequenz angewendet und dann an das MUSCLEMOTION-Plug-in übergeben.Muscle Motion verwendet die durchschnittliche Intensität der Pixel in jedem Frame, um seine Bewegung relativ zum Referenzframe zu quantifizieren.Die Daten wurden aufgezeichnet, gefiltert und zur Quantifizierung der Zykluszeit und zur Beurteilung der Gewebedehnung während des Herzzyklus verwendet.Das aufgezeichnete Video wurde mit einem Nullphasen-Digitalfilter erster Ordnung nachbearbeitet.Um die Gewebedehnung (Peak-to-Peak) zu quantifizieren, wurde eine Peak-to-Peak-Analyse durchgeführt, um zwischen Peaks und Tälern im aufgezeichneten Signal zu unterscheiden.Darüber hinaus wird eine Trendbereinigung mithilfe eines Polynoms 6. Ordnung durchgeführt, um Signaldrift zu eliminieren.In MATLAB wurde ein Programmcode entwickelt, um die globale Gewebebewegung, Zykluszeit, Entspannungszeit und Kontraktionszeit zu bestimmen (Ergänzungsprogrammcode 44).
Für die Dehnungsanalyse haben wir mithilfe der gleichen Videos, die auch für die mechanische Dehnungsbeurteilung erstellt wurden, zunächst zwei Bilder aufgezeichnet, die Bewegungsspitzen (den höchsten (oberen) und niedrigsten (unteren) Bewegungspunkt) gemäß der MUSCLEMOTION-Software darstellen.Anschließend segmentierten wir die Gewebebereiche und wendeten eine Art Schattierungsalgorithmus auf das segmentierte Gewebe an (ergänzende Abbildung 2a).Das segmentierte Gewebe wurde dann in zehn Unterflächen unterteilt und die Spannung auf jeder Oberfläche wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: Dehnung = (Sup-Sdown)/Sdown, wobei Sup und Sdown die Abstände der Form vom oberen bzw. unteren Schatten des Gewebes sind (ergänzende Abbildung .2b).
Herzschnitte wurden 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert.Fixierte Gewebe wurden 1 Stunde lang in 10 % und 20 % Saccharose und dann über Nacht in 30 % Saccharose dehydriert.Die Schnitte wurden dann in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT-Verbindung) eingebettet und nach und nach in einem Isopentan/Trockeneisbad eingefroren.Lagern Sie OCT-Einbettungsblöcke bis zur Trennung bei -80 °C.Die Objektträger wurden als Schnitte mit einer Dicke von 8 μm hergestellt.
Um OCT aus Herzabschnitten zu entfernen, erhitzen Sie die Objektträger 5 Minuten lang auf einem Heizblock auf 95 °C.1 ml PBS zu jedem Objektträger hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Schnitte durch Zugabe von 0,1 % Triton-X in PBS 15 Minuten bei Raumtemperatur durchdringen.Um zu verhindern, dass unspezifische Antikörper an die Probe binden, geben Sie 1 ml 3 %ige BSA-Lösung auf die Objektträger und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.Anschließend wurde das BSA entfernt und die Objektträger mit PBS gewaschen.Markieren Sie jede Probe mit einem Bleistift.Primärantikörper (1:200 verdünnt in 1 % BSA) (Connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) und Troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) wurden über 90 Minuten zugegeben, dann sekundäre Antikörper (1:200 verdünnt in 1 % BSA) gegen Maus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16). 079), gegen Kaninchen Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) für weitere 90 Minuten. Dreimal mit PBS gewaschen. Um die Zielfärbung vom Hintergrund zu unterscheiden, verwendeten wir nur den sekundären Antikörper als Kontrolle. Schließlich wurde DAPI-Kernfärbung hinzugefügt und die Objektträger wurden in ein Vectashield (Vector Laboratories) gelegt und mit Nagellack versiegelt. (-fache Vergrößerung) und Keyence-Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) mit 5 μg/ml in PBS wurde für die WGA-Färbung verwendet und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf fixierte Schnitte aufgetragen.Anschließend wurden die Objektträger mit PBS gewaschen und jedem Objektträger wurde Sudanschwarz zugesetzt und 30 Minuten lang inkubiert.Anschließend wurden die Objektträger mit PBS gewaschen und mit Vectashield-Einbettungsmedium versetzt.Die Objektträger wurden auf einem Keyence-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung sichtbar gemacht.
OCT wurde wie oben beschrieben aus den Proben entfernt.Tauchen Sie die Objektträger nach dem Entfernen des OCT über Nacht in Bouins Lösung.Die Objektträger wurden dann 1 Stunde lang mit destilliertem Wasser gespült und dann 10 Minuten lang in eine Bibrich-Aloe-Säure-Fuchsin-Lösung gelegt.Anschließend wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gewaschen und 10 Minuten lang in eine Lösung aus 5 % Phosphomolybdän/5 % Phosphorwolframsäure gelegt.Übertragen Sie die Objektträger ohne Spülen 15 Minuten lang direkt in die Anilinblau-Lösung.Anschließend wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gewaschen und für 2 Minuten in eine 1 %ige Essigsäurelösung gelegt.Die Objektträger wurden in 200 N Ethanol getrocknet und in Xylol überführt.Gefärbte Objektträger wurden mit einem Keyence-Mikroskop mit einem 10-fach-Objektiv sichtbar gemacht.Der Prozentsatz der Fibrosefläche wurde mit der Keyence-Analyzer-Software quantifiziert.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), Katalognummer V13154, gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einigen Modifikationen.Insbesondere wurde eine chirurgische Stanze mit einem Durchmesser von 6 mm verwendet, um eine gleichmäßige Gewebegröße während der MTT-Analyse sicherzustellen.Die Gewebe wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers einzeln in die Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen, die MTT-Substrat enthielt, ausplattiert.Die Schnitte werden 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert und das lebende Gewebe metabolisiert das MTT-Substrat unter Bildung einer violetten Formazan-Verbindung.Ersetzen Sie die MTT-Lösung durch 1 ml DMSO und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 °C, um violettes Formazan aus Herzabschnitten zu extrahieren.Die Proben wurden 1:10 in DMSO in 96-Well-Platten mit klarem Boden verdünnt und die violette Farbintensität bei 570 nm mit einem Cytation Plate Reader (BioTek) gemessen.Die Messwerte wurden auf das Gewicht jeder Herzscheibe normalisiert.
Das Herzschnittmedium wurde durch Medium mit 1 μCi/ml [5-3H]-Glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) für den Glukoseverwertungstest wie zuvor beschrieben ersetzt.Nach 4 Stunden Inkubation 100 µl Medium in ein offenes Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 µl 0,2 N HCl geben.Dann wurde das Röhrchen in ein Szintillationsröhrchen mit 500 μl dH2O gegeben, um [3H]2O 72 Stunden lang bei 37 °C zu verdampfen.Nehmen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Szintillationsröhrchen und geben Sie 10 ml Szintillationsflüssigkeit hinzu.Szintillationszählungen wurden mit einem Tri-Carb 2900TR-Flüssigkeitsszintillationsanalysator (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) durchgeführt.Die Glukoseverwertung wurde dann unter Berücksichtigung der [5-3H]-Glukose-spezifischen Aktivität, des unvollständigen Gleichgewichts und Hintergrunds, der Verdünnung von [5-3H]-zu unmarkierter Glukose und der Effizienz des Szintillationszählers berechnet.Die Daten werden auf die Masse der Herzabschnitte normiert.
Nach der Gewebehomogenisierung in Trizol wurde RNA aus Herzschnitten mit dem Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert.Die Vorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse der RNAsec-Bibliothek wurde wie folgt durchgeführt:
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der RNA-Bibliothek wurde 1 µg RNA pro Probe verwendet.Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext UltraTM RNA Library Prepared Kit für Illumina (NEB, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers erstellt und den Attributsequenzen für jede Probe Indexcodes hinzugefügt.Kurz gesagt, mRNA wurde mithilfe von Magnetkügelchen, die mit Poly-T-Oligonukleotiden befestigt waren, von der Gesamt-RNA gereinigt.Die Fragmentierung wird mit zweiwertigen Kationen bei hoher Temperatur im NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) durchgeführt.Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung von zufälligen Hexamer-Primern und M-MuLV-Reverse-Transkriptase (RNase H-) synthetisiert.Der zweite cDNA-Strang wird dann unter Verwendung von DNA-Polymerase I und RNase H synthetisiert. Die verbleibenden Überhänge werden durch Exonuklease-/Polymerase-Aktivität in stumpfe Enden umgewandelt.Nach der Adenylierung des 3′-Endes des DNA-Fragments wird ein NEBNext-Adapter mit Haarnadelschleifenstruktur daran befestigt, um es für die Hybridisierung vorzubereiten.Zur Auswahl von cDNA-Fragmenten mit einer bevorzugten Länge von 150–200 bp.Bibliotheksfragmente wurden mit dem AMPure XP-System (Beckman Coulter, Beverly, USA) gereinigt.Dann wurden 3 μl USER-Enzym (NEB, USA) mit größenselektierter cDNA, ligiert mit einem Adapter, 15 Minuten lang bei 37 °C und dann 5 Minuten lang bei 95 °C vor der PCR verwendet.Anschließend wurde die PCR unter Verwendung der Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase, universellen PCR-Primern und Index (X)-Primern durchgeführt.Abschließend wurden die PCR-Produkte gereinigt (AMPure XP-System) und die Bibliotheksqualität auf einem Agilent Bioanalyzer 2100-System bewertet.Die cDNA-Bibliothek wurde dann mit einem Novaseq-Sequenzer sequenziert.Rohbilddateien von Illumina wurden mithilfe von CASAVA Base Calling in Rohdaten umgewandelt.Rohdaten werden in Dateien im FASTQ(fq)-Format gespeichert, die Lesesequenzen und entsprechende Basisqualitäten enthalten.Wählen Sie HISAT2 aus, um gefilterte Sequenzierungslesungen mit dem Sscrofa11.1-Referenzgenom abzugleichen.Im Allgemeinen unterstützt HISAT2 Genome jeder Größe, einschließlich Genome mit mehr als 4 Milliarden Basen, und für die meisten Parameter sind Standardwerte festgelegt.Splicing-Reads aus RNA-Seq-Daten können mit HISAT2, dem schnellsten derzeit verfügbaren System, effizient abgeglichen werden, mit der gleichen oder einer besseren Genauigkeit als jede andere Methode.
Die Häufigkeit der Transkripte spiegelt direkt den Grad der Genexpression wider.Die Genexpressionsniveaus werden anhand der Häufigkeit von Transkripten (Sequenzierungszählung) beurteilt, die mit dem Genom oder den Exons verbunden sind.Die Anzahl der Lesevorgänge ist proportional zum Genexpressionsniveau, der Genlänge und der Sequenzierungstiefe.FPKM (Fragmente pro tausend Basenpaare sequenziertes Transkript pro Million Basenpaare) wurden berechnet und P-Werte der differentiellen Expression wurden mithilfe des DESeq2-Pakets bestimmt.Anschließend haben wir die Falscherkennungsrate (FDR) für jeden P-Wert mithilfe der Benjamini-Hochberg-Methode9 basierend auf der integrierten R-Funktion „p.adjust“ berechnet.
Aus Herzschnitten isolierte RNA wurde mit dem SuperScript IV Vilo Master Mix von Thermo (Thermo, Kat.-Nr. 11756050) in einer Konzentration von 200 ng/μl in cDNA umgewandelt.Quantitative RT-PCR wurde unter Verwendung einer transparenten 384-Well-Reaktionsplatte Endura Plate Microamp von Applied Biosystems (Thermo, Kat.-Nr. 4483319) und optischem Microamp-Kleber (Thermo, Kat.-Nr. 4311971) durchgeführt.Die Reaktionsmischung bestand aus 5 µl Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, Kat.-Nr. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer und 3,5 µl H2O pro Vertiefung.Es wurden Standard-qPCR-Zyklen durchgeführt und CT-Werte mit einem Echtzeit-PCR-Gerät Quantstudio 5 von Applied Biosystems (384-Well-Modul; Produkt-Nr. A28135) gemessen.Taqman-Primer wurden von Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA gekauft Die CT-Werte aller Proben wurden auf das Housekeeping-Gen GAPDH normalisiert.
Die Medienfreigabe von NT-ProBNP wurde mit dem NT-ProBNP-Kit (Schwein) (Kat.-Nr. MBS2086979, MyBioSource) gemäß dem Protokoll des Herstellers bewertet.Kurz gesagt, 250 µl jeder Probe und jedes Standards wurden doppelt in jede Vertiefung gegeben.Unmittelbar nach Zugabe der Probe 50 µl Testreagenz A in jede Vertiefung geben.Schütteln Sie die Platte vorsichtig und versiegeln Sie sie mit Dichtmittel.Anschließend wurden die Tabletten 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert.Dann die Lösung absaugen und die Vertiefungen viermal mit 350 µl 1X-Waschlösung waschen, wobei die Waschlösung jedes Mal 1-2 Minuten lang inkubiert wird.Anschließend 100 µl Testreagenz B pro Vertiefung hinzufügen und mit Plattenversiegelungsmittel verschließen.Die Tablette wurde vorsichtig geschüttelt und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.Die Lösung absaugen und die Vertiefungen fünfmal mit 350 µl 1X-Waschlösung waschen.90 µl Substratlösung in jede Vertiefung geben und die Platte verschließen.Inkubieren Sie die Platte 10–20 Minuten lang bei 37 °C.50 µl Stopplösung in jede Vertiefung geben.Die Platte wurde sofort mit einem auf 450 nm eingestellten Cytation (BioTek)-Plattenlesegerät gemessen.
Es wurden Leistungsanalysen durchgeführt, um die Gruppengrößen auszuwählen, die eine Leistung von >80 % zur Erkennung einer absoluten Änderung des Parameters von 10 % mit einer Fehlerrate vom Typ I von 5 % liefern. Es wurden Leistungsanalysen durchgeführt, um die Gruppengrößen auszuwählen, die eine Leistung von >80 % zur Erkennung einer absoluten Änderung des Parameters von 10 % mit einer Fehlerrate vom Typ I von 5 % liefern. Die Analyse der meisten Parameter wurde für die Auswahl einer Gruppengruppe ausgewählt und liegt bei einer Mindestanzahl von mehr als 80 % für die Überwachung. 10 % des absoluten Analyseparameters betragen 5 % ошибок typ I. Eine Leistungsanalyse wurde durchgeführt, um Gruppengrößen auszuwählen, die eine Leistung von >80 % zur Erkennung einer absoluten Parameteränderung von 10 % mit einer Typ-I-Fehlerrate von 5 % bieten würden.80 % des Gesamtgewichts und 10 % des Wassers und 5 % des Wassers.80 % des Gesamtgewichts und 10 % des Wassers und 5 % des Wassers. Es wurde eine Analyse der meisten Parameter zur Auswahl von Gruppen durchgeführt, bei denen es sich um > 80 % der verfügbaren Parameter, 10 % absolute Parameter und 5 % handelt астоты ошибок typ I. Es wurde eine Leistungsanalyse durchgeführt, um eine Gruppengröße auszuwählen, die eine Leistung von >80 % zur Erkennung von 10 % absoluten Parameteränderungen und 5 % Typ-I-Fehlerrate bietet.Gewebeschnitte wurden vor dem Experiment zufällig ausgewählt.Alle Analysen erfolgten zustandsblind und die Proben wurden erst dekodiert, nachdem alle Daten analysiert worden waren.Zur Durchführung aller statistischen Analysen wurde die GraphPad Prism-Software (San Diego, CA) verwendet. Für alle Statistiken wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant angesehen. Für alle Statistiken wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant angesehen. Alle p-Zählerstatistiken wurden mit Zzätzwerten <0,05 erstellt. Für alle Statistiken wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant angesehen.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Alle p-Zählerstatistiken wurden mit Zzätzwerten <0,05 erstellt. Für alle Statistiken wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant angesehen.Für die Daten wurde ein zweiseitiger Student-T-Test mit nur zwei Vergleichen durchgeführt.Zur Bestimmung der Signifikanz zwischen mehreren Gruppen wurde eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA verwendet.Bei der Durchführung von Post-hoc-Tests wurde die Tukey-Korrektur angewendet, um mehrere Vergleiche zu berücksichtigen.Für RNAsec-Daten gelten besondere statistische Überlegungen bei der Berechnung von FDR und p.adjust, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie in der Zusammenfassung des Nature Research Report, die mit diesem Artikel verlinkt ist.