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Neue immunologische und massenspektrometrische Methoden zur komplexen Analyse persistenter Oligosaccharide in mit AFEX vorbehandeltem Maisstroh. Lignozellulose-Biomasse ist eine nachhaltige Alternative zu fossilen Brennstoffen und wird häufig zur Entwicklung von Biotechnologien für die Herstellung von Produkten wie Lebensmitteln, Futtermitteln, Kraftstoffen und Chemikalien eingesetzt. Der Schlüssel zu diesen Technologien liegt in der Entwicklung kostengünstiger Verfahren zur Umwandlung komplexer Kohlenhydrate aus pflanzlichen Zellwänden in einfache Zucker wie Glucose, Xylose und Arabinose. Da lignozellulose-Biomasse sehr zäh ist, muss sie thermochemischen Behandlungen (z. B. Ammoniak-Faser-Exfoliation (AFEX), verdünnten Säuren (DA), ionischen Flüssigkeiten (IL)) und biologischen Behandlungen (z. B. enzymatischer Hydrolyse und mikrobieller Fermentation) unterzogen werden, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Beim Einsatz kommerzieller Pilzenzyme im Hydrolyseprozess sind jedoch nur 75–85 % der gebildeten löslichen Zucker Monosaccharide und die restlichen 15–25 % sind lösliche, hartnäckige Oligosaccharide, die für Mikroorganismen nicht immer verfügbar sind. Zuvor haben wir lösliche, hartnäckige Oligosaccharide erfolgreich isoliert und gereinigt, indem wir eine Kombination aus Kohlenstoff- und Kieselgurtrennung sowie Größenausschlusschromatographie verwendeten, und außerdem ihre enzymhemmenden Eigenschaften untersucht. Wir haben festgestellt, dass Oligosaccharide mit methylierten Uronsäuresubstitutionen mit höherem Polymerisationsgrad (DP) mit kommerziellen Enzymmischungen schwieriger zu verarbeiten sind als Oligosaccharide mit niedrigem DP und neutrale Oligosaccharide. Hier berichten wir über die Verwendung mehrerer zusätzlicher Methoden, darunter Glykan-Profiling mit monoklonalen Antikörpern (mAbs), die spezifisch für Glykane aus pflanzlicher Biomasse sind, um Glykanbindungen in pflanzlichen Zellwänden und enzymatischen Hydrolysaten zu charakterisieren, matrixunterstützte Laserdesorptionsionisation und Flugzeit-Massenspektrometrie. MALDI-TOF-MS verwendet strukturinformative diagnostische Peaks, die durch Spektroskopie nach sekundärem Zerfall negativer Ionen erhalten werden, sowie Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS), um Oligosaccharidbindungen mit und ohne Derivatisierung zu charakterisieren. Aufgrund der geringen Größe von Oligosacchariden (DP 4–20) lassen sich diese Moleküle nur schwer für die Bindung und Charakterisierung von mAbs verwenden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine neue Methode zur Immobilisierung von Oligosacchariden auf Basis von Biotinkonjugation angewendet. Diese Methode markierte erfolgreich die Mehrzahl der löslichen Oligosaccharide mit niedrigem DP auf der Mikroplattenoberfläche. Diese wurden anschließend in einem Hochdurchsatz-mAb-System für die spezifische Ligationsanalyse eingesetzt. Diese neue Methode wird zukünftig die Entwicklung fortschrittlicherer Hochdurchsatz-Glykom-Assays erleichtern, mit denen Oligosaccharide in Biomarkern für diagnostische Zwecke isoliert und charakterisiert werden können.
Lignozellulose-Biomasse, die aus landwirtschaftlichen und forstwirtschaftlichen Materialien, Gras und Holz besteht, ist ein potenzieller Rohstoff zur Herstellung von biobasierten Produkten wie Nahrungsmitteln, Futtermitteln, Kraftstoffen und chemischen Vorläufern zur Herstellung höherwertiger Produkte1. In den Zellwänden der Pflanzen vorhandene Kohlenhydrate (wie Zellulose und Hemizellulose) werden durch chemische Verarbeitung und Biotransformation (wie enzymatische Hydrolyse und mikrobielle Fermentation) zu Monosacchariden depolymerisiert. Gängige Vorbehandlungen sind Ammoniak-Faserexpansion (AFEX), verdünnte Säure (DA), ionische Flüssigkeit (IL) und Dampfexplosion (SE), die durch eine Kombination aus Chemikalien und Hitze die Lignozelluloseproduktion durch Öffnen der Zellwände der Pflanzen reduzieren3,4. Hartnäckigkeit der Materie, 5. Die enzymatische Hydrolyse wird bei einer hohen Feststoffbelastung unter Verwendung handelsüblicher aktiver kohlenhydrathaltiger Enzyme (CAZymes) und die mikrobielle Fermentation unter Verwendung gentechnisch veränderter Hefen oder Bakterien durchgeführt, um biobasierte Kraftstoffe und Chemikalien herzustellen6.
CAZymes in kommerziellen Enzymen bestehen aus einer komplexen Mischung von Enzymen, die synergistisch komplexe Kohlenhydrat-Zucker-Bindungen spalten und Monosaccharide bilden2,7. Wie wir bereits früher berichteten, macht das komplexe Netzwerk aromatischer Polymere von Lignin mit Kohlenhydraten diese sehr widerspenstig, was zu einer unvollständigen Zuckerumwandlung führt und zur Ansammlung von 15–25 % sexueller Oligosaccharide, die bei der enzymatischen Hydrolyse der vorbehandelten Biomasse nicht entstehen. Dies ist ein häufiges Problem bei verschiedenen Methoden der Biomassevorbehandlung. Einige Gründe für diesen Engpass sind die Enzymhemmung während der Hydrolyse oder das Fehlen oder die geringen Mengen essentieller Enzyme, die zum Spalten von Zuckerbindungen in pflanzlicher Biomasse erforderlich sind. Das Verständnis der Zusammensetzung und der strukturellen Eigenschaften von Zuckern, beispielsweise der Zuckerbindungen in Oligosacchariden, wird uns helfen, die Zuckerumwandlung während der Hydrolyse zu verbessern und biotechnologische Prozesse kostenmäßig konkurrenzfähig mit Produkten auf Erdölbasis zu machen.
Die Bestimmung der Kohlenhydratstruktur ist eine Herausforderung und erfordert eine Kombination aus Methoden wie Flüssigkeitschromatographie (LC)11,12, Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)13, Kapillarelektrophorese (CE)14,15,16 und Massenspektrometrie (MS)17. ,18. MS-Methoden wie Flugzeit-Massenspektrometrie mit Laserdesorption und Ionisation unter Verwendung einer Matrix (MALDI-TOF-MS) sind vielseitige Methoden zur Bestimmung von Kohlenhydratstrukturen. In letzter Zeit wurde die kollisionsinduzierte Dissoziations-Tandem-MS (CID) von Natriumionenaddukten am häufigsten verwendet, um Fingerabdrücke zu identifizieren, die den Bindungspositionen von Oligosacchariden, anomeren Konfigurationen, Sequenzen und Verzweigungspositionen entsprechen 20, 21.
Die Glykananalyse ist ein hervorragendes Instrument zur detaillierten Identifizierung von Kohlenhydratbindungen22. Bei dieser Methode werden monoklonale Antikörper (mAbs) verwendet, die gegen Glykan in der Zellwand von Pflanzen gerichtet sind und als Sonden zum Verständnis komplexer Kohlenhydratverbindungen dienen. Weltweit sind über 250 mAbs erhältlich, die unter Verwendung verschiedener Saccharide gegen verschiedene lineare und verzweigte Oligosaccharide entwickelt wurden24. Mehrere mAbs werden häufig verwendet, um die Struktur, Zusammensetzung und Modifikationen der pflanzlichen Zellwand zu charakterisieren, da je nach Zelltyp, Organ, Alter, Entwicklungsstadium und Wachstumsumgebung der Pflanze erhebliche Unterschiede bestehen25,26. In jüngerer Zeit wurde diese Methode verwendet, um Vesikelpopulationen in pflanzlichen und tierischen Systemen und ihre jeweiligen Rollen beim Glykantransport, die durch subzelluläre Marker, Entwicklungsstadien oder Umweltreize bestimmt werden, zu verstehen, und um die enzymatische Aktivität zu bestimmen. Zu den verschiedenen Strukturen von Glykanen und Xylanen, die identifiziert wurden, gehören Pektin (P), Xylan (X), Mannan (M), Xyloglucane (XylG), Mixed-Bond-Glucane (MLG), Arabinoxylan (ArbX), Galactomannan (GalG), Glucuronsäure-Arabinoxylan (GArbX) und Arabino-Galactan (ArbG)29.
Trotz all dieser Forschungsanstrengungen haben sich nur wenige Studien mit der Art der Oligosaccharidansammlung während der Hydrolyse mit hoher Feststoffbeladung (HSL) befasst, einschließlich der Oligosaccharidfreisetzung, der Änderung der Oligomerkettenlänge während der Hydrolyse, verschiedener Polymere mit niedrigem DP und ihrer Kurvenverteilungen 30,31,32. Obwohl sich die Glykananalyse als nützliches Instrument für eine umfassende Analyse der Glykanstruktur erwiesen hat, ist es schwierig, wasserlösliche Oligosaccharide mit niedrigem DP mithilfe von Antikörpermethoden zu bewerten. Oligosaccharide mit kleinerem DP und einem Molekulargewicht von weniger als 5–10 kDa binden nicht an ELISA-Platten 33, 34 und werden vor der Antikörperzugabe weggewaschen.
Hier demonstrieren wir erstmals einen ELISA-Test auf Avidin-beschichteten Platten mit monoklonalen Antikörpern, der ein einstufiges Biotinylierungsverfahren für lösliche, refraktäre Oligosaccharide mit einer Glykomanalyse kombiniert. Unser Ansatz zur Glykomanalyse wurde durch MALDI-TOF-MS und GC-MS-basierte Analyse komplementärer Oligosaccharidbindungen mittels Trimethylsilyl (TMS)-Derivatisierung hydrolysierter Zuckerzusammensetzungen validiert. Dieser innovative Ansatz kann zukünftig als Hochdurchsatzmethode weiterentwickelt werden und breitere Anwendung in der biomedizinischen Forschung finden35.
Posttranslationale Modifikationen von Enzymen und Antikörpern, wie beispielsweise die Glykosylierung,36 beeinflussen deren biologische Aktivität. Beispielsweise spielen Veränderungen der Glykosylierung von Serumproteinen eine wichtige Rolle bei entzündlicher Arthritis und werden als diagnostische Marker verwendet37. In der Literatur wird berichtet, dass verschiedene Glykane bei einer Vielzahl von Krankheiten auftreten, darunter chronische Entzündungskrankheiten des Magen-Darm-Trakts und der Leber, Virusinfektionen sowie Eierstock-, Brust- und Prostatakrebs38,39,40. Das Verständnis der Struktur von Glykanen mithilfe antikörperbasierter Glykan-ELISA-Methoden erhöht die Sicherheit bei der Krankheitsdiagnose ohne den Einsatz komplexer MS-Methoden.
Unsere vorherige Studie zeigte, dass hartnäckige Oligosaccharide nach Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse unhydrolysiert blieben (Abbildung 1). In unserer zuvor veröffentlichten Arbeit entwickelten wir ein Festphasenextraktionsverfahren mit Aktivkohle, um Oligosaccharide aus mit AFEX vorbehandeltem Maisstrohhydrolysat (ACSH)8 zu isolieren. Nach der ersten Extraktion und Trennung wurden die Oligosaccharide mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter fraktioniert und nach Molekulargewicht sortiert gesammelt. Die aus verschiedenen Vorbehandlungen freigesetzten Zuckermonomere und -oligomere wurden mittels Zuckerzusammensetzungsanalyse untersucht. Vergleicht man den Gehalt an Zuckeroligomeren, die durch verschiedene Vorbehandlungsmethoden gewonnen wurden, stellt das Vorhandensein hartnäckiger Oligosaccharide ein häufiges Problem bei der Umwandlung von Biomasse in Monosaccharide dar und kann zu einer Verringerung der Zuckerausbeute um mindestens 10–15 %, sogar bis zu 18 %, führen. Diese Methode wird in den USA für die weitere großtechnische Produktion von Oligosaccharidfraktionen eingesetzt. Das resultierende ACH und seine nachfolgenden Fraktionen mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden in dieser Arbeit als Versuchsmaterial zur Charakterisierung von Oligosacchariden verwendet.
Nach Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse blieben persistente Oligosaccharide unhydrolysiert. (A) zeigt eine Methode zur Oligosaccharidtrennung, bei der Oligosaccharide aus AFEX-vorbehandeltem Maisstrohhydrolysat (ACSH) mithilfe eines Füllkörpers aus Aktivkohle und Kieselgur isoliert werden; (B) Methode zur Trennung von Oligosacchariden. Die Oligosaccharide wurden zusätzlich mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) getrennt; (C) Freigesetzte Saccharidmonomere und -oligomere aus verschiedenen Vorbehandlungen (verdünnte Säure: DA, ionische Flüssigkeit: IL und AFEX). Bedingungen der enzymatischen Hydrolyse: Hohe Feststoffbeladung von 25 % (w/w) (ca. 8 % Glucanbeladung), 96 Stunden Hydrolyse, 20 mg/g kommerzielle Enzymbeladung (Verhältnis Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) und (D) Zuckermonomere und -oligomere aus Glucose, Xylose und Arabinose, freigesetzt aus mit AFEX vorbehandeltem Maisstängel (ACS).
Die Glykananalyse hat sich als nützliches Instrument zur umfassenden Strukturanalyse von Glykanen in Extrakten erwiesen, die aus festen Biomasserückständen isoliert wurden. Wasserlösliche Saccharide sind mit dieser herkömmlichen Methode jedoch unterrepräsentiert41, da niedermolekulare Oligosaccharide auf ELISA-Platten nur schwer zu immobilisieren sind und vor der Antikörperzugabe ausgewaschen werden. Daher wurde zur Antikörperbindung und -charakterisierung eine einstufige Biotinylierungsmethode verwendet, um lösliche, nicht konforme Oligosaccharide auf Avidin-beschichtete ELISA-Platten zu beschichten. Diese Methode wurde mit unserem zuvor produzierten ACSH und einer Fraktion basierend auf seinem Molekulargewicht (oder Polymerisationsgrad, DP) getestet. Die einstufige Biotinylierung wurde verwendet, um die Bindungsaffinität der Oligosaccharide durch Zugabe von Biotin-LC-Hydrazid zum reduzierenden Ende des Kohlenhydrats zu erhöhen (Abb. 2). In Lösung reagiert die Hemiacetalgruppe am reduzierenden Ende mit der Hydrazidgruppe des Biotin-LC-Hydrazids und bildet eine Hydrazonbindung. In Gegenwart des Reduktionsmittels NaCNBH3 wird die Hydrazonbindung zu einem stabilen biotinylierten Endprodukt reduziert. Durch die Modifikation des reduzierenden Zuckerendes wurde die Bindung von Oligosacchariden mit niedrigem DP an ELISA-Platten möglich. In unserer Studie wurde dies auf Avidin-beschichteten Platten unter Verwendung von Glykan-gerichteten mAbs erreicht.
Screening monoklonaler Antikörper mittels ELISA auf biotinylierte Oligosaccharide. (A) zeigt die kombinierte Biotinylierung von Oligosacchariden und anschließendes ELISA-Screening mit glycan-gerichteten mAbs auf NeutrAvidin-beschichteten Platten. (B) zeigt ein einstufiges Verfahren zur Biotinylierung von Reaktionsprodukten.
Avidinbeschichtete Platten mit Oligosaccharid-konjugierten Antikörpern wurden anschließend zu Primär- und Sekundärantikörpern hinzugefügt und in einem licht- und zeitempfindlichen Medium gewaschen. Nach Abschluss der Antikörperbindung wurde TMB-Substrat hinzugefügt, um die Platte zu inkubieren. Die Reaktion wurde schließlich mit Schwefelsäure gestoppt. Die inkubierten Platten wurden mit einem ELISA-Lesegerät analysiert, um die Bindungsstärke jedes Antikörpers zu bestimmen und antikörperspezifische Vernetzungen nachzuweisen. Details und Parameter des Experiments finden Sie im entsprechenden Abschnitt „Materialien und Methoden“.
Wir demonstrieren den Nutzen dieser neu entwickelten Methode für spezifische Anwendungen durch die Charakterisierung der löslichen Oligosaccharide in ACSH sowie in rohen und gereinigten Oligosaccharidfraktionen, die aus Lignocellulosehydrolysaten isoliert wurden. Wie in Abbildung 3 dargestellt, handelt es sich bei den am häufigsten in ACSH mithilfe von bioacylierten Glykom-Assays identifizierten epitopsubstituierten Xylanen in der Regel um Uronsäure (U) oder Methyluronsäure (MeU) sowie pektinische Arabinogalactane. Die meisten dieser Verbindungen wurden bereits in unserer vorherigen Studie zur Analyse von Glykanen nicht-hydrolysierter Feststoffe (UHS)43 gefunden.
Nachweis von resistenten Oligosaccharidepitopen mithilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen das Zellwandglykan. Die „neutrale“ Fraktion ist die ACN-Fraktion, die „saure“ Fraktion die FA-Fraktion. Hellere Rottöne auf der Heatmap zeigen einen höheren Epitopgehalt an, hellere Blautöne einen leeren Hintergrund. Die Farbwerte auf der Skala basieren auf Roh-OD-Werten für Formulierungen N=2. Die wichtigsten von den Antikörpern erkannten Epitope sind rechts dargestellt.
Diese nicht-zellulosehaltigen Strukturen konnten von den gängigsten Cellulasen und Hemicellulasen in der getesteten kommerziellen Enzymmischung, die die am häufigsten verwendeten kommerziellen Enzyme enthält, nicht gespalten werden. Daher sind für ihre Hydrolyse neue Hilfsenzyme erforderlich. Ohne die notwendigen nicht-zellulosehaltigen Hilfsenzyme verhindern diese nicht-zellulosehaltigen Bindungen eine vollständige Umwandlung in Monosaccharide, selbst wenn ihre Ausgangszuckerpolymere mithilfe kommerzieller Enzymmischungen umfassend in kürzere Fragmente hydrolysiert und aufgelöst werden.
Weitere Untersuchungen der Signalverteilung und ihrer Bindungsstärke zeigten, dass bindende Epitope in Zuckerfraktionen mit hohem DP (A, B, C, DP bis 20+) niedriger waren als in Fraktionen mit niedrigem DP (D, E, F, DP) in Dimeren) (Abb. 1). Saure Fragmente kommen in Nicht-Zellulose-Epitopen häufiger vor als in neutralen Fragmenten. Diese Phänomene stimmen mit dem in unserer vorherigen Studie beobachteten Muster überein, in der Anteile mit hohem DP und sauren Anteilen resistenter gegenüber enzymatischer Hydrolyse waren. Daher kann das Vorhandensein von Nicht-Zellulose-Glycanepitopen sowie U- und MeU-Substitutionen erheblich zur Stabilität der Oligosaccharide beitragen. Es ist zu beachten, dass die Bindungs- und Nachweiseffizienz bei Oligosacchariden mit niedrigem DP-Gehalt problematisch sein kann, insbesondere wenn es sich bei dem Epitop um ein dimeres oder trimeres Oligosaccharid handelt. Dies kann mit handelsüblichen Oligosacchariden unterschiedlicher Länge getestet werden, die jeweils nur ein Epitop enthalten, das an einen spezifischen mAb bindet.
So deckte der Einsatz strukturspezifischer Antikörper bestimmte Arten von hartnäckigen Bindungen auf. Abhängig vom verwendeten Antikörpertyp, dem entsprechenden Ligationsmuster und der Stärke des von ihm erzeugten Signals (am stärksten bzw. am wenigsten häufig) können neue Enzyme identifiziert und semiquantitativ dem Enzymgemisch hinzugefügt werden, um eine vollständigere Glykokonversion zu erreichen. Am Beispiel der Analyse von ACSH-Oligosacchariden lässt sich für jedes Biomassematerial eine Datenbank mit Glykanbindungen erstellen. Dabei ist zu beachten, dass die unterschiedliche Affinität der Antikörper berücksichtigt werden muss. Ist diese unbekannt, erschwert dies den Vergleich der Signale verschiedener Antikörper. Darüber hinaus ist der Vergleich von Glykanbindungen möglicherweise am besten zwischen Proben desselben Antikörpers möglich. Diese hartnäckigen Bindungen können dann mit der CAZyme-Datenbank verknüpft werden, aus der wir Enzyme identifizieren, Kandidatenenzyme auswählen und auf bindungsbrechende Enzyme testen oder mikrobielle Systeme zur Expression dieser Enzyme für den Einsatz in Bioraffinerien entwickeln können44.
Um zu beurteilen, wie immunologische Methoden alternative Methoden zur Charakterisierung niedermolekularer Oligosaccharide in Lignocellulosehydrolysaten ergänzen, führten wir MALDI (Abb. 4, S1–S8) und eine Analyse der aus TMS gewonnenen Saccharide auf Basis von GC-MS auf demselben Oligosaccharidteil durch (Abb. 5). MALDI wird verwendet, um zu vergleichen, ob die Massenverteilung von Oligosaccharidmolekülen mit der gewünschten Struktur übereinstimmt. Abb. 4 zeigt MS der neutralen Komponenten ACN-A und ACN-B. Die ACN-A-Analyse bestätigte einen Bereich von Pentosenzuckern von DP 4–8 (Abb. 4) bis DP 22 (Abb. S1), deren Gewichte MeU-Xylan-Oligosacchariden entsprechen. Die ACN-B-Analyse bestätigte die Pentose- und Glucoxylan-Reihen mit DP 8–15. In ergänzendem Material wie Abbildung S3 zeigen FA-C-Säure-Massenverteilungskarten eine Reihe von (Me)U-substituierten Pentosenzuckern mit einem DP von 8–15, die mit den im ELISA-basierten mAb-Screening gefundenen substituierten Xylanen übereinstimmen. Die Epitope sind konsistent.
MALDI-MS-Spektrum löslicher, nicht konformer Oligosaccharide in ACS. Hier (A) ACN-A-Fraktionen mit geringem Gewicht, die durch methylierte Uronsäure (DP 4-8) ersetzte Glucuroxylan-Oligosaccharide enthalten, und (B) ACN-B-Xylan und durch Glucuroxylan ersetzte methylierte Uronsäure-Oligosaccharide (DP 8-15).
Analyse der Zusammensetzung des Glykanrests refraktärer Oligosaccharide. Hier (A) TMS-Saccharidzusammensetzung verschiedener Oligosaccharidfraktionen, ermittelt mittels GC-MS-Analyse. (B) Strukturen verschiedener TMS-abgeleiteter Zucker in Oligosacchariden. ACN – Acetonitrilfraktion mit neutralen Oligosacchariden und FA – Ferulasäurefraktion mit sauren Oligosacchariden.
Eine weitere interessante Schlussfolgerung ergab sich aus der LC-MS-Analyse der Oligosaccharidfraktion, wie in Abbildung S9 dargestellt (die Methoden sind im elektronischen Zusatzmaterial zu finden). Während der Ligation der ACN-B-Fraktion wurden wiederholt Fragmente von Hexose- und -OAc-Gruppen beobachtet. Dieser Befund bestätigt nicht nur die in der Glykom- und MALDI-TOF-Analyse beobachtete Fragmentierung, sondern liefert auch neue Informationen über potenzielle Kohlenhydratderivate in vorbehandelter lignozellulosehaltiger Biomasse.
Wir führten außerdem eine Analyse der Glykanzusammensetzung von Oligosaccharidfraktionen mittels TMS-Glykanderivatisierung durch. Mittels GC-MS bestimmten wir die Zusammensetzung neuraler (nicht-derivativer) und saurer Zucker (GluA und GalA) in der Oligosaccharidfraktion (Abb. 5). Glucuronsäure kommt in den sauren Komponenten C und D vor, während Galacturonsäure in den sauren Komponenten A und B enthalten ist, die beide Komponenten saurer Zucker mit hohem DP sind. Diese Ergebnisse bestätigen nicht nur unsere ELISA- und MALDI-Daten, sondern stimmen auch mit unseren früheren Untersuchungen zur Oligosaccharidanreicherung überein. Daher glauben wir, dass moderne immunologische Methoden mittels Biotinylierung von Oligosacchariden und anschließendem ELISA-Screening ausreichen, um lösliche, widerspenstige Oligosaccharide in verschiedenen biologischen Proben nachzuweisen.
Da ELISA-basierte mAb-Screeningmethoden mit mehreren verschiedenen Methoden validiert wurden, wollten wir das Potenzial dieser neuen quantitativen Methode weiter erforschen. Zwei kommerzielle Oligosaccharide, Xylohexasaccharid-Oligosaccharid (XHE) und 23-α-L-Arabinofuranosyl-Xylotriose (A2XX), wurden gekauft und mit einem neuen mAb-Ansatz getestet, der auf das Zellwandglykan abzielt. Abbildung 6 zeigt eine lineare Korrelation zwischen dem biotinylierten Bindungssignal und der Log-Konzentration der Oligosaccharidkonzentration, was auf ein mögliches Langmuir-Adsorptionsmodell hindeutet. Unter den mAbs korrelierten CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 und CCRC-M151 mit XHE und CCRC-M108, CCRC-M109 und LM11 mit A2XX über einen Bereich von 1 nm bis 100 Nanometer. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Antikörpern während des Experiments wurden nur begrenzte Experimente mit jeder Oligosaccharidkonzentration durchgeführt. Dabei ist zu beachten, dass einige Antikörper sehr unterschiedlich auf dasselbe Oligosaccharid als Substrat reagieren, vermutlich weil sie an leicht unterschiedliche Epitope binden und sehr unterschiedliche Bindungsaffinitäten aufweisen können. Die Mechanismen und Implikationen einer genauen Epitopidentifizierung werden deutlich komplexer sein, wenn der neue mAb-Ansatz auf reale Proben angewendet wird.
Zwei kommerzielle Oligosaccharide wurden verwendet, um den Nachweisbereich verschiedener Glykan-gerichteter mAbs zu bestimmen. Lineare Korrelationen mit der logarithmischen Konzentration der Oligosaccharidkonzentration deuten auf Langmuir-Adsorptionsmuster für (A) XHE mit mAb und (B) A2XX mit mAb hin. Die entsprechenden Epitope zeigen die Strukturen der kommerziellen Oligosaccharide, die als Substrate im Test verwendet wurden.
Die Verwendung von auf Glykane gerichteten monoklonalen Antikörpern (Glykokomische Analyse oder ELISA-basiertes mAb-Screening) ist ein leistungsstarkes Werkzeug für die detaillierte Charakterisierung der meisten wichtigen Zellwandglykane, aus denen die pflanzliche Biomasse besteht. Die klassische Glykananalyse charakterisiert jedoch nur größere Zellwandglykane, da die meisten Oligosaccharide auf ELISA-Platten nicht effizient immobilisiert werden. In dieser Studie wurde mit AFEX vorbehandeltes Maisstängel bei hohem Feststoffgehalt enzymatisch hydrolysiert. Mittels Zuckeranalyse wurde die Zusammensetzung der widerspenstigen Zellwandkohlenhydrate im Hydrolysat bestimmt. Die mAb-Analyse kleinerer Oligosaccharide in Hydrolysaten wird jedoch unterschätzt, und es bedarf zusätzlicher Werkzeuge, um Oligosaccharide effektiv auf ELISA-Platten zu immobilisieren.
Wir berichten hier über eine neuartige und effiziente Methode zur Oligosaccharid-Immobilisierung für das mAb-Screening. Diese Methode kombiniert Oligosaccharid-Biotinylierung mit anschließendem ELISA-Screening auf NeutrAvidin™-beschichteten Platten. Die immobilisierten biotinylierten Oligosaccharide zeigten eine ausreichende Affinität zum Antikörper, um eine schnelle und effiziente Detektion hartnäckiger Oligosaccharide zu ermöglichen. Die Analyse der Zusammensetzung dieser hartnäckigen Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie bestätigte die Ergebnisse dieses neuen Ansatzes im Immunoscreening. Diese Studien zeigen somit, dass die Kombination aus Oligosaccharid-Biotinylierung und ELISA-Screening mit Glykan-gerichteten monoklonalen Antikörpern zum Nachweis von Vernetzungen in Oligosacchariden eingesetzt werden kann und in anderen biochemischen Studien zur Charakterisierung der Struktur von Oligosacchariden breite Anwendung findet.
Diese biotinbasierte Glykan-Profiling-Methode ist der erste Bericht, der die widerspenstigen Kohlenhydratbindungen löslicher Oligosaccharide in pflanzlicher Biomasse untersuchen kann. Dies hilft zu verstehen, warum sich manche Teile der Biomasse bei der Biokraftstoffproduktion so hartnäckig verhalten. Diese Methode schließt eine wichtige Lücke in der Glykananalyse und erweitert ihre Anwendung auf ein breiteres Spektrum von Substraten über pflanzliche Oligosaccharide hinaus. Zukünftig könnten wir Roboter zur Biotinylierung einsetzen und die von uns entwickelte Methode für die Hochdurchsatzanalyse von Proben mittels ELISA nutzen.
Maisstroh (CS) aus Pioneer 33A14-Hybridsamen wurde 2010 auf der Kramer Farm in Ray, Colorado, geerntet. Mit Genehmigung des Landbesitzers kann diese Biomasse für Forschungszwecke verwendet werden. Die Proben wurden trocken (mit einer Feuchtigkeit von < 6 %) in Druckverschlussbeuteln bei Raumtemperatur gelagert. Die Proben wurden trocken (mit einer Feuchtigkeit von < 6 %) in Druckverschlussbeuteln bei Raumtemperatur gelagert. Die Lieferung erfolgt mit weniger als 6 % Versandgewicht in der Packung bei normaler Temperatur. Die Proben wurden trocken bei einer Luftfeuchtigkeit von <6 % in Beuteln mit Reißverschluss bei Raumtemperatur gelagert.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6 % Die Lieferung erfolgt in Paketen mit einer Temperatur von < 6 %. Die Proben werden in Reißverschlussbeuteln bei Raumtemperatur und einer Luftfeuchtigkeit von < 6 % gelagert.Die Studie entsprach den lokalen und nationalen Richtlinien. Die Zusammensetzungsanalyse erfolgte nach dem NREL-Protokoll. Die Zusammensetzung enthielt 31,4 % Glucan, 18,7 % Xylan, 3,3 % Arabinan, 1,2 % Galactan, 2,2 % Acetyl, 14,3 % Lignin, 1,7 % Protein und 13,4 % Asche.
Cellic® CTec2 (138 mg Protein/ml, Charge VCNI 0001) ist eine komplexe Mischung aus Cellulase, β-Glucosidase und Cellic® HTec2 (157 mg Protein/ml, Charge VHN00001) von Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg Protein/ml), eine komplexe Mischung pektinabbauender Enzyme, wurde von DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) gespendet. Die Enzym-Protein-Konzentrationen wurden durch Schätzung des Proteingehalts (und Subtraktion des Beitrags von Nicht-Protein-Stickstoff) mittels Kjeldahl-Stickstoffanalyse (AOAC-Methode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) bestimmt. Kieselgur 545 wurde von EMD Millipore (Billerica, MA) bezogen. Aktivkohle (DARCO, 100-Maschen-Granulat), Avicel (PH-101), Buchenxylan und alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen.
Die AFEX-Vorbehandlung wurde am GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) durchgeführt. Die Vorbehandlung erfolgte bei 140 °C für 15 Minuten. Die Verweilzeit betrug 46 Sekunden bei einem Verhältnis von 1:1 wasserfreiem Ammoniak zu Biomasse bei einer Beladung von 60 % (w/w) in einem Edelstahl-Tisch-Batch-Reaktor (Parr Instruments Company). Die Behandlung dauerte 30 Minuten. Der Reaktor wurde auf 140 °C erhitzt, und das Ammoniak wurde schnell freigesetzt, wodurch die Biomasse schnell wieder auf Raumtemperatur abkühlte. Die Zusammensetzung des mit AFEX vorbehandelten Maisstängels (ACS) war ähnlich der des unbehandelten Maisstängels (UT-CS).
ACSH mit hohem Feststoffgehalt 25 % (w/w) (ungefähr 8 % Dextran-Beladung) wurde als Ausgangsmaterial für die Produktion von Oligosacchariden im großen Maßstab hergestellt. Die enzymatische Hydrolyse von ACS wurde mit einer kommerziellen Enzymmischung durchgeführt, die Cellic® Ctec2 10 mg Protein/g Glucan (in vorbehandelter Biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg Protein/g Glucan und Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) umfasste. ), 5 mg Protein/g Dextran. Die enzymatische Hydrolyse wurde in einem 5-Liter-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 3 Litern, pH 4,8, 50 °C und 250 U/min durchgeführt. Nach 96 Stunden Hydrolyse wurde das Hydrolysat durch Zentrifugation bei 6000 U/min für 30 Minuten und dann bei 14000 U/min für 30 Minuten gesammelt, um nicht hydrolysierte Feststoffe zu entfernen. Das Hydrolysat wurde anschließend einer Sterilfiltration durch einen 0,22 mm Filterbecher unterzogen. Das gefilterte Hydrolysat wurde in sterilen Flaschen bei 4 °C gelagert und anschließend über Aktivkohle fraktioniert.
Analyse der Zusammensetzung von extraktbasierten Biomasseproben gemäß den Laboranalyseverfahren des NREL: Vorbereitung der Proben für die Zusammensetzungsanalyse (NREL/TP-510-42620) und Bestimmung von Strukturkohlenhydraten und Lignin in Biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
Die Oligosaccharidanalyse des Hydrolysatstroms erfolgte im 2-ml-Maßstab mittels autoklavbasierter Säurehydrolyse. Die Hydrolysatprobe wurde mit 69,7 µl 72%iger Schwefelsäure in einem 10-ml-Kulturröhrchen mit Schraubverschluss gemischt und 1 Stunde auf einer Laborbank bei 121 °C inkubiert, auf Eis abgekühlt und in ein HPLC-Fläschchen gefiltert. Die Oligosaccharidkonzentration wurde durch Subtraktion der Monosaccharidkonzentration der nicht hydrolysierten Probe von der Gesamtzuckerkonzentration der säurehydrolysierten Probe bestimmt.
Die Glucose-, Xylose- und Arabinosekonzentrationen in der säurehydrolysierten Biomasse wurden mit einem Shimadzu HPLC-System analysiert, das mit einem Autosampler, Säulenheizung, isokratischer Pumpe und Brechungsindexdetektor auf einer Bio-Rad Aminex HPX-87H-Säule ausgestattet war. Die Säule wurde bei 50 °C gehalten und mit 0,6 ml/min 5 mM H₂SO₄ in Wasser eluiert.
Der Hydrolysatüberstand wurde verdünnt und auf Monomer- und Oligosaccharidgehalt analysiert. Die nach der enzymatischen Hydrolyse erhaltenen monomeren Zucker wurden mittels HPLC analysiert, die mit einer Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-Säule und einer Ascheschutzsäule ausgestattet war. Die Säulentemperatur wurde bei 80 °C gehalten, Wasser diente als mobile Phase mit einer Flussrate von 0,6 ml/min. Oligosaccharide wurden durch Hydrolyse in verdünnter Säure bei 121 °C gemäß den in den Referenzen 41, 48 und 49 beschriebenen Methoden bestimmt.
Die Saccharidanalyse wurde an rohen, mit AFEX vorbehandelten und allen nicht hydrolysierten Biomasserückständen (einschließlich der Herstellung von seriellen Zellwandextrakten und deren mAb-Screening) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren 27, 43, 50, 51 durchgeführt. Für die Glykomanalyse werden alkoholunlösliche Rückstände von Pflanzenzellwandmaterial aus Biomasserückständen hergestellt und einer seriellen Extraktion mit zunehmend aggressiveren Reagenzien wie Ammoniumoxalat (50 mM), Natriumcarbonat (50 mM und 0,5 % (w/v), CON. (1 M und 4 M, beide mit 1 % (w/v) Natriumborhydrid) und saurem Chlorit unterzogen, wie zuvor beschrieben 52,53. Die Extrakte wurden dann einem ELISA gegen ein komplexes Panel von mAb50 unterzogen, die gegen das Zellwandglykan gerichtet sind, und die mAb-Bindungsreaktionen wurden als Heatmap dargestellt. Auf das Pflanzenzellwandglykan gerichtete mAbs wurden aus Laborbeständen (CCRC-, JIM- und MAC-Serie) erworben.
Einstufige Biotinylierung von Oligosacchariden. Die Konjugation von Kohlenhydraten mit Biotin-LC-Hydrazid erfolgte nach folgendem Verfahren. Biotin-LC-Hydrazid (4,6 mg/12 µmol) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO, 70 µl) unter kräftigem Rühren und Erhitzen auf 65 °C für 1 Minute gelöst. Eisessig (30 µl) wurde hinzugefügt und die Mischung auf Natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) gegossen. Nach ca. 1-minütigem Erhitzen auf 65 °C löste sich die Mischung vollständig auf. Anschließend wurden 5 bis 8 µl der Reaktionsmischung zum getrockneten Oligosaccharid (1–100 nmol) gegeben, um einen mindestens zehnfachen molaren Überschuss der Markierung gegenüber dem reduzierenden Ende zu erhalten. Die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei 65 °C durchgeführt, danach wurden die Proben sofort gereinigt. In den Markierungsexperimenten ohne Reduktion wurde kein Natriumcyanoborhydrid verwendet, und die Proben wurden 2,5 Stunden lang bei 65 °C umgesetzt.
ELISA-Beschichtung und Waschen von Proben biotinylierter Oligosaccharide. 25 μl der biotinylierten Proben (100 μl jeder konzentrierten Probe, verdünnt in 5 ml 0,1 M Tris-Pufferlösung (TBS)) wurden in jede Vertiefung der Avidin-beschichteten Platte gegeben. Kontrollvertiefungen wurden mit 50 μl Biotin in einer Konzentration von 10 μg/ml in 0,1 M TBS beschichtet. Deionisiertes Wasser diente als Beschichtung für Blindmessungen. Die Tablette wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit 0,1 % Magermilch in 0,1 M TBS gewaschen (Programm Nr. 11 für Grenier Flat 3A).
Zugabe und Waschen der Primärantikörper. 40 µl Primärantikörper in jede Vertiefung geben. Die Mikrotiterplatte 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Anschließend werden die Platten dreimal mit 0,1 % Milch in 0,1 M TBS gewaschen (Waschprogramm Nr. 11 für Grenier Flat 3A).
Sekundärantikörper hinzufügen und waschen. 50 µl Maus-/Ratten-Sekundärantikörper (1:5000 verdünnt in 0,1 % Milch in 0,1 M TBS) in jede Vertiefung geben. Die Mikrotiterplatte 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Anschließend fünfmal mit 0,1 % Milch in 0,1 M TBS (Grenier Flat 5A Plattenwaschprogramm Nr. 12) waschen.
Substrat hinzufügen. 50 µl 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) zum Basissubstrat hinzufügen (indem 2 Tropfen Puffer, 3 Tropfen TMB und 2 Tropfen Wasserstoffperoxid zu 15 ml deionisiertem Wasser hinzugefügt werden). Das TMB-Substrat vorbereiten und vor Gebrauch vortexen. Die Mikrotiterplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
Führen Sie den Schritt durch und lesen Sie die Tablette ab. Geben Sie 50 µl 1 N Schwefelsäure in jede Vertiefung und messen Sie die Absorption im Bereich von 450 bis 655 nm mit einem ELISA-Lesegerät.
Bereiten Sie 1 mg/ml-Lösungen der folgenden Analyten in deionisiertem Wasser vor: Arabinose, Rhamnose, Fucose, Xylose, Galacturonsäure (GalA), Glucuronsäure (GlcA), Mannose, Glucose, Galactose, Lactose, N-Acetylmannosamin (manNAc), N-Acetylglucosamin (glcNAc), N-Acetylgalactosamin (galNAc), Inositol (interner Standard). Zwei Standards wurden durch Zugabe der in Tabelle 1 aufgeführten 1 mg/ml-Zuckerlösungen hergestellt. Die Proben werden eingefroren und bei -80 °C lyophilisiert, bis das gesamte Wasser entfernt ist (normalerweise etwa 12–18 Stunden).
Geben Sie 100–500 µg Probe in Schraubverschlussröhrchen auf einer Analysenwaage. Notieren Sie die zugegebene Menge. Am besten lösen Sie die Probe in einem Lösungsmittel einer bestimmten Konzentration und geben sie als flüssiges Aliquot in das Röhrchen. Verwenden Sie 20 µl 1 mg/ml Inositol als internen Standard pro Probenröhrchen. Die Menge des internen Standards, die der Probe zugegeben wird, muss der Menge des internen Standards entsprechen, die dem Standardröhrchen zugegeben wird.
8 ml wasserfreies Methanol in ein Fläschchen mit Schraubverschluss geben. Anschließend 4 ml 3 N methanolische HCl-Lösung hinzufügen, verschließen und schütteln. Bei diesem Verfahren wird kein Wasser verwendet.
500 µl 1 M HCl-Methanollösung zu den Oligosaccharidproben und Standard-TMS-Röhrchen geben. Die Proben werden über Nacht (168 Stunden) bei 80 °C in einem Thermoblock inkubiert. Das Methanolyseprodukt wird bei Raumtemperatur mit einem Trocknungsverteiler getrocknet. 200 µl MeOH werden hinzugefügt und erneut getrocknet. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt. 200 µl Methanol, 100 µl Pyridin und 100 µl Essigsäureanhydrid werden zur Probe hinzugefügt und gut vermischt. Die Proben werden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und getrocknet. 200 µl Methanol werden hinzugefügt und erneut getrocknet.
200 µl Tri-Sil zugeben und das verschlossene Röhrchen 20 Minuten lang auf 80 °C erhitzen, anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mit einem Trocknungsverteiler die Probe bis auf ein Volumen von ca. 50 µl weitertrocknen. Wichtig zu beachten: Die Proben wurden nicht vollständig getrocknet.
2 ml Hexan zugeben und durch Vortexen gut vermischen. Die Spitzen von Pasteurpipetten (5–8 mm) mit einem Stück Glaswolle füllen, indem die Glaswolle auf eine 5-3/4 Zoll große Pipette gesteckt wird. Die Proben werden 2 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Unlösliche Rückstände werden abgeschieden. Die Probe wird auf 100–150 µl getrocknet. Ein Volumen von ca. 1 µl wird bei einer Anfangstemperatur von 80 °C und einer Anfangszeit von 2,0 Minuten in das GC-MS injiziert (Tabelle 2).