Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η μορφογένεση του ανθρώπινου εντέρου καθιερώνει χαρακτηριστικά κρύπτης-λάχνης τρισδιάστατης επιθηλιακής μικροαρχιτεκτονικής και χωρικής οργάνωσης. Αυτή η μοναδική δομή απαιτείται για τη διατήρηση της ομοιόστασης του εντέρου προστατεύοντας την εσοχή των βλαστοκυττάρων στη βασική κρύπτη από εξωγενή μικροβιακά αντιγόνα και τους μεταβολίτες τους. Επιπλέον, οι εντερικές λάχνες και η εκκρίνουσα βλέννα παρουσιάζουν λειτουργικά διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα με προστατευτικό φράγμα στην επιφάνεια του εντερικού βλεννογόνου. Επομένως, η αναδημιουργία τρισδιάστατων επιθηλιακών δομών είναι κρίσιμη για την κατασκευή in vitro εντερικών μοντέλων. Αξιοσημείωτα, το οργανικό μιμητικό έντερο σε τσιπ μπορεί να προκαλέσει αυθόρμητη τρισδιάστατη μορφογένεση του εντερικού επιθηλίου με βελτιωμένες φυσιολογικές λειτουργίες και βιομηχανική. Εδώ, παρέχουμε ένα αναπαραγώγιμο πρωτόκολλο για την ισχυρή πρόκληση εντερικής μορφογένεσης στο έντερο σε ένα μικρορευστικό τσιπ καθώς και σε ένα ενσωματωμένο υβριδικό τσιπ Transwell. Περιγράφουμε λεπτομερείς μεθόδους για την κατασκευή συσκευών, την καλλιέργεια Caco-2 ή εντερικών οργανοειδών επιθηλιακών κυττάρων σε συμβατικά περιβάλλοντα καθώς και σε μια μικρορευστική πλατφόρμα, την επαγωγή τρισδιάστατης μορφογένεσης και τον χαρακτηρισμό καθιερωμένων τρισδιάστατων επιθηλίων χρησιμοποιώντας πολλαπλές απεικονιστικές μεθόδους. Αυτό το πρωτόκολλο επιτυγχάνει αναγέννηση της λειτουργικής μικροαρχιτεκτονικής του εντέρου ελέγχοντας τη ροή του βασοπλάγιου υγρού για 5 ημέρες. Η μέθοδος μορφογένεσης in vitro χρησιμοποιεί φυσιολογικά σχετική διατμητική τάση και μηχανική κίνηση και δεν απαιτεί πολύπλοκη κυτταρική μηχανική ή χειρισμό, κάτι που μπορεί να ξεπεράσει άλλες υπάρχουσες τεχνικές. Οραματιζόμαστε ότι το προτεινόμενο πρωτόκολλό μας θα μπορούσε να έχει ευρείες επιπτώσεις στην κοινότητα της βιοϊατρικής έρευνας, παρέχοντας μια μέθοδο για την αναγέννηση τρισδιάστατων εντερικών επιθηλιακών στρωμάτων in vitro για βιοϊατρικές, κλινικές και φαρμακευτικές εφαρμογές.
Πειράματα καταδεικνύουν ότι τα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα Caco-2 που καλλιεργούνται σε μικρορευστομηχανικές συσκευές gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ή διπλοστιβάδες6,7 μπορούν να υποβληθούν σε αυθόρμητη τρισδιάστατη μορφογένεση in vitro χωρίς σαφή κατανόηση του υποκείμενου μηχανισμού. Στην πρόσφατη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι η απομάκρυνση των βασεοπλάγια εκκρινόμενων ανταγωνιστών μορφογόνων από τις συσκευές καλλιέργειας είναι απαραίτητη και επαρκής για την πρόκληση τρισδιάστατης επιθηλιακής μορφογένεσης in vitro, κάτι που έχει αποδειχθεί από το Caco-2 και τα εντερικά οργανοειδή που προέρχονται από ασθενείς. Τα επιθηλιακά κύτταρα επικυρώθηκαν. Σε αυτή τη μελέτη, εστιάσαμε συγκεκριμένα στην παραγωγή κυττάρων και την κατανομή συγκέντρωσης ενός ισχυρού ανταγωνιστή Wnt, του Dickkopf-1 (DKK-1), σε συσκευές gut-on-a-chip και τροποποιημένες μικρορευστομηχανικές συσκευές που περιέχουν ένθετα Transwell, που ονομάζονται "Υβριδικό Τσιπ". Δείχνουμε ότι η προσθήκη εξωγενών ανταγωνιστών Wnt (όπως DKK-1, καταστολέας Wnt 1, εκκρινόμενη πρωτεΐνη 1 που σχετίζεται με το frizzled ή Soggy-1) στο έντερο on-chip αναστέλλει τη μορφογένεση ή διαταράσσει το προδομημένο τρισδιάστατο επιθηλιακό στρώμα, υποδηλώνοντας ότι το ανταγωνιστικό στρες κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας είναι υπεύθυνο για την εντερική μορφογένεση in vitro. Επομένως, μια πρακτική προσέγγιση για την επίτευξη ισχυρής μορφογένεσης στην επιθηλιακή διεπαφή είναι η απομάκρυνση ή η ελάχιστη διατήρηση των επιπέδων των ανταγωνιστών Wnt στο βασοπλάγιο διαμέρισμα με ενεργό έκπλυση (π.χ., σε πλατφόρμες gut-on-a-chip ή hybrid-on-a-chip) ή διάχυση. Βασοπλάγιο μέσο (π.χ., από ένθετα Transwell σε μεγάλες βασοπλάγιες δεξαμενές σε πηγάδια).
Σε αυτό το πρωτόκολλο, παρέχουμε μια λεπτομερή μέθοδο για την κατασκευή μικροσυσκευών gut-on-a-chip και υβριδικών τσιπ εισαγωγής Transwell (βήματα 1-5) για την καλλιέργεια εντερικών επιθηλιακών κυττάρων σε πορώδεις μεμβράνες με βάση πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS) (βήματα 6Α, 7Α, 8, 9) ή πολυεστερικές μεμβράνες ενθεμάτων Transwell (βήματα 6Β, 7Β, 8, 9) και την πρόκληση τρισδιάστατης μορφογένεσης in vitro (βήμα 10). Επίσης, εντοπίσαμε κυτταρικά και μοριακά χαρακτηριστικά ενδεικτικά ιστοειδικής ιστογένεσης και κυτταρικής διαφοροποίησης που εξαρτάται από την καταγωγή, εφαρμόζοντας πολλαπλές απεικονιστικές μεθόδους (βήματα 11-24). Προκαλούμε μορφογένεση χρησιμοποιώντας ανθρώπινα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα, όπως Caco-2 ή εντερικά οργανοειδή, σε δύο μορφές καλλιέργειας με τεχνικές λεπτομέρειες που περιλαμβάνουν τροποποίηση επιφάνειας πορωδών μεμβρανών, δημιουργία δισδιάστατων μονοστοιβάδων και εντερική βιοχημική και αναπαραγωγή του βιομηχανικού μικροπεριβάλλοντος in vitro. Για την πρόκληση τρισδιάστατης μορφογένεσης από δισδιάστατες επιθηλιακές μονοστοιβάδες, αφαιρέσαμε ανταγωνιστές μορφογόνων και στις δύο καλλιεργημένες μορφές με ροή του μέσου στο βασεοπλάγιο διαμέρισμα της καλλιέργειας. Τέλος, παρέχουμε μια αναπαράσταση της χρησιμότητας ενός αναγεννήσιμου τρισδιάστατου επιθηλιακού στρώματος που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μοντελοποίηση της εξαρτώμενης από μορφογόνο επιθηλιακής ανάπτυξης, των διαμήκων συνκαλλιεργειών ξενιστή-μικροβίου, της λοίμωξης από παθογόνο, της φλεγμονώδους βλάβης, της δυσλειτουργίας του επιθηλιακού φραγμού και των θεραπειών που βασίζονται σε προβιοτικά. Παραδείγματα επιρροών.
Το πρωτόκολλό μας μπορεί να είναι χρήσιμο σε ένα ευρύ φάσμα επιστημόνων σε βασική (π.χ. βιολογία του εντερικού βλεννογόνου, βιολογία βλαστοκυττάρων και αναπτυξιακή βιολογία) και εφαρμοσμένη έρευνα (π.χ. προκλινικές δοκιμές φαρμάκων, μοντελοποίηση ασθενειών, μηχανική ιστών και γαστρεντερολογία) ευρείας εμβέλειας. Λόγω της αναπαραγωγιμότητας και της ανθεκτικότητας του πρωτοκόλλου μας για την πρόκληση τρισδιάστατης μορφογένεσης του εντερικού επιθηλίου in vitro, οραματιζόμαστε ότι η τεχνική μας στρατηγική μπορεί να διαδοθεί σε κοινό που μελετά τη δυναμική της κυτταρικής σηματοδότησης κατά την εντερική ανάπτυξη, αναγέννηση ή ομοιόσταση. Επιπλέον, το πρωτόκολλό μας είναι χρήσιμο για την διερεύνηση λοιμώξεων από διάφορους μολυσματικούς παράγοντες όπως ο Norovirus 8, ο Κορονοϊός 2 του Σοβαρού Οξέος Αναπνευστικού Συνδρόμου (SARS-CoV-2), το Clostridium difficile, η Salmonella Typhimurium 9 ή το Vibrio cholerae. Οι γνώσεις σχετικά με την παθολογία και την παθογένεση των ασθενειών είναι επίσης χρήσιμες. Η χρήση ενός συστήματος μικροφυσιολογίας του εντέρου σε ενσωματωμένο τσιπ μπορεί να επιτρέψει τη διαχρονική συνκαλλιέργεια 10 και την επακόλουθη αξιολόγηση της άμυνας του ξενιστή, των ανοσολογικών αποκρίσεων και της αποκατάστασης τραυματισμών που σχετίζονται με παθογόνα στο γαστρεντερικό (ΓΕ) σωλήνα 11. Άλλες γαστρεντερικές διαταραχές που σχετίζονται με το σύνδρομο διαρρέοντος εντέρου, την κοιλιοκάκη, τη νόσο του Crohn, την ελκώδη κολίτιδα, την ληκυθίτιδα ή το σύνδρομο ευερέθιστου εντέρου μπορούν να προσομοιωθούν όταν παρασκευάζονται τρισδιάστατα εντερικά επιθηλιακά στρώματα χρησιμοποιώντας τα τρισδιάστατα εντερικά επιθηλιακά στρώματα του ασθενούς. Αυτές οι ασθένειες περιλαμβάνουν ατροφία των λαχνών, βράχυνση των κρυπτών, βλάβη του βλεννογόνου ή διαταραχή του επιθηλιακού φραγμού. Βιοψία ή εντερικά οργανοειδή που προέρχονται από βλαστοκύτταρα 12,13. Για να μοντελοποιήσουν καλύτερα την υψηλότερη πολυπλοκότητα του περιβάλλοντος της νόσου, οι αναγνώστες μπορούν να εξετάσουν το ενδεχόμενο προσθήκης τύπων κυττάρων που σχετίζονται με τη νόσο, όπως μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) του ασθενούς, σε μοντέλα που περιέχουν τρισδιάστατες μικροαρχιτεκτονικές εντερικών λαχνών-κρυπτών. ιστό-ειδικά ανοσοκύτταρα, 5.
Δεδομένου ότι η τρισδιάστατη επιθηλιακή μικροδομή μπορεί να σταθεροποιηθεί και να απεικονιστεί χωρίς τη διαδικασία τομής, οι θεατές που εργάζονται σε χωρική μεταγραφωμική και απεικόνιση υψηλής ή υπερ-ανάλυσης μπορεί να ενδιαφέρονται για τη χαρτογράφηση της χωροχρονικής δυναμικής γονιδίων και πρωτεϊνών σε επιθηλιακές κόγχες. Ενδιαφέρονται για την τεχνολογία. Απόκριση σε μικροβιακά ή ανοσολογικά ερεθίσματα. Επιπλέον, η διαχρονική διασταύρωση ξενιστή-μικροβίου 10, 14 που συντονίζει την ομοιόσταση του εντέρου μπορεί να δημιουργηθεί στο τρισδιάστατο στρώμα του εντερικού βλεννογόνου με την ταυτόχρονη καλλιέργεια διαφόρων μικροβιακών ειδών, μικροβιακών κοινοτήτων ή κοπρανώδους μικροχλωρίδας, ειδικά στο έντερο σε τσιπ. στην πλατφόρμα. Αυτή η προσέγγιση είναι ιδιαίτερα ελκυστική για το κοινό που μελετά την ανοσολογία του βλεννογόνου, τη γαστρεντερολογία, το ανθρώπινο μικροβίωμα, την καλλιεργητική και την κλινική μικροβιολογία και επιδιώκει να καλλιεργήσει προηγουμένως μη καλλιεργημένο μικροβίωμα του εντέρου στο εργαστήριο. Εάν το πρωτόκολλο μορφογένεσης in vitro μπορεί να προσαρμοστεί σε κλιμακούμενες μορφές καλλιέργειας, όπως ένθετα πολλαπλών φρεατίων σε πλάκες 24, 96 ή 384 φρεατίων που αναπληρώνουν συνεχώς τα βασοπλάγια διαμερίσματα, το πρωτόκολλο μπορεί επίσης να διαδοθεί σε όσους αναπτύσσουν φαρμακευτικές, βιοϊατρικές ή πλατφόρμες υψηλής απόδοσης διαλογής ή επικύρωσης για τη βιομηχανία τροφίμων. Ως απόδειξη της αρχής, πρόσφατα καταδείξαμε τη σκοπιμότητα ενός πολυπλεξ συστήματος μορφογένεσης υψηλής απόδοσης κλιμακώσιμου σε μορφή πλάκας 24 φρεατίων. Επιπλέον, έχουν εμπορευματοποιηθεί προϊόντα πολλαπλών οργάνων σε τσιπ16,17,18. Επομένως, η επικύρωση της μεθόδου μορφογένεσης in vitro μπορεί να επιταχυνθεί και ενδεχομένως να υιοθετηθεί από πολλά ερευνητικά εργαστήρια, τη βιομηχανία ή τις κυβερνητικές και ρυθμιστικές υπηρεσίες για την κατανόηση του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού της μορφογένεσης του εντέρου in vitro σε μεταγραφικό επίπεδο για τη δοκιμή φαρμάκων ή βιοθεραπευτικά Η απορρόφηση και η μεταφορά υποψήφιων φαρμάκων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τρισδιάστατα υποκατάστατα του εντέρου ή χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένα ή εμπορικά μοντέλα οργάνων σε τσιπ για την αξιολόγηση της αναπαραγωγιμότητας της διαδικασίας μορφογένεσης του εντέρου.
Ένας περιορισμένος αριθμός πειραματικών μοντέλων σχετικών με τον άνθρωπο έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της εντερικής επιθηλιακής μορφογένεσης, κυρίως λόγω της έλλειψης εφαρμόσιμων πρωτοκόλλων για την πρόκληση τρισδιάστατης μορφογένεσης in vitro. Στην πραγματικότητα, μεγάλο μέρος της τρέχουσας γνώσης σχετικά με τη μορφογένεση του εντέρου βασίζεται σε μελέτες σε ζώα (π.χ., ζεβρόψαρα20, ποντίκια21 ή κοτόπουλα22). Ωστόσο, είναι απαιτητικά σε εργασία και κόστος, μπορεί να είναι ηθικά αμφισβητήσιμα και, το πιο σημαντικό, δεν προσδιορίζουν με ακρίβεια τις ανθρώπινες αναπτυξιακές διαδικασίες. Αυτά τα μοντέλα έχουν επίσης πολύ περιορισμένη ικανότητα να δοκιμαστούν με πολυεπίπεδο τρόπο. Επομένως, το πρωτόκολλό μας για την αναγέννηση τρισδιάστατων δομών ιστών in vitro ξεπερνά τα in vivo ζωικά μοντέλα, καθώς και άλλα παραδοσιακά στατικά μοντέλα 2D κυτταροκαλλιέργειας. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, η χρήση τρισδιάστατων επιθηλιακών δομών μας επέτρεψε να εξετάσουμε τον χωρικό εντοπισμό διαφοροποιημένων κυττάρων στον άξονα κρύπτης-λάχνης σε απόκριση σε διάφορα βλεννογονικά ή ανοσολογικά ερεθίσματα. Τα τρισδιάστατα επιθηλιακά στρώματα μπορούν να παρέχουν χώρο για να μελετήσουμε πώς τα μικροβιακά κύτταρα ανταγωνίζονται για να σχηματίσουν χωρικές κόγχες και την οικολογική εξέλιξη σε απόκριση σε παράγοντες του ξενιστή (π.χ., εσωτερικοί έναντι εξωτερικών στρώματα βλέννας, έκκριση IgA και αντιμικροβιακά πεπτίδια). Επιπλέον, η τρισδιάστατη επιθηλιακή μορφολογία μπορεί να μας επιτρέψει να κατανοήσουμε πώς η μικροχλωρίδα του εντέρου δομεί τις κοινότητές της και παράγει συνεργιστικά μικροβιακούς μεταβολίτες (π.χ. λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας) που διαμορφώνουν την κυτταρική οργάνωση και τις κόγχες των βλαστοκυττάρων στις βασικές κρύπτες. Αυτά τα χαρακτηριστικά μπορούν να καταδειχθούν μόνο όταν δημιουργηθούν τρισδιάστατα επιθηλιακά στρώματα in vitro.
Εκτός από τη μέθοδο μας για τη δημιουργία τρισδιάστατων εντερικών επιθηλιακών δομών, υπάρχουν αρκετές μέθοδοι in vitro. Η καλλιέργεια εντερικών οργανοειδών είναι μια τεχνική μηχανικής ιστών τελευταίας τεχνολογίας που βασίζεται στην καλλιέργεια εντερικών βλαστοκυττάρων υπό συγκεκριμένες συνθήκες μορφογόνου23,24,25. Ωστόσο, η χρήση τρισδιάστατων οργανοειδών μοντέλων για ανάλυση μεταφοράς ή συνκαλλιέργειες ξενιστή-μικροβίου είναι συχνά δύσκολη επειδή ο εντερικός αυλός περικλείεται μέσα στο οργανοειδές και, ως εκ τούτου, η εισαγωγή συστατικών του αυλού, όπως μικροβιακά κύτταρα ή εξωγενή αντιγόνα, είναι περιορισμένη. Η πρόσβαση στους αυλούς των οργανοειδών μπορεί να βελτιωθεί χρησιμοποιώντας έναν μικροεγχυτήρα26,27, αλλά αυτή η μέθοδος είναι επεμβατική και επίπονη και απαιτεί εξειδικευμένες γνώσεις για την εκτέλεσή της. Επιπλέον, οι παραδοσιακές οργανοειδείς καλλιέργειες που διατηρούνται σε ικριώματα υδρογέλης υπό στατικές συνθήκες δεν αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια την ενεργή in vivo βιομηχανική.
Άλλες προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται από διάφορες ερευνητικές ομάδες χρησιμοποιούν προκατασκευασμένα τρισδιάστατα ικριώματα υδρογέλης για να μιμηθούν την επιθηλιακή δομή του εντέρου καλλιεργώντας απομονωμένα ανθρώπινα εντερικά κύτταρα στην επιφάνεια του πηκτώματος. Κατασκευάστε ικριώματα υδρογέλης χρησιμοποιώντας τρισδιάστατα εκτυπωμένα, μικροαλεσμένα ή λιθογραφικά κατασκευασμένα καλούπια. Αυτή η μέθοδος δείχνει την αυτοοργανωμένη διάταξη απομονωμένων επιθηλιακών κυττάρων in vitro με φυσιολογικά σχετικές διαβαθμίσεις μορφογόνων, δημιουργώντας μια επιθηλιακή δομή υψηλής αναλογίας διαστάσεων και διασταύρωση στρώματος-επιθηλίου συμπεριλαμβάνοντας στρωματικά κύτταρα στο ικρίωμα. Ωστόσο, η φύση των προκατασκευασμένων ικριωμάτων μπορεί να εμποδίσει την εμφάνιση της ίδιας της αυθόρμητης μορφογενετικής διαδικασίας. Αυτά τα μοντέλα επίσης δεν παρέχουν δυναμική ροή στον αυλό ή στο διάμεσο χώρο, χωρίς την τάση διάτμησης ρευστού που χρειάζονται τα εντερικά κύτταρα για να υποβληθούν σε μορφογένεση και να αποκτήσουν φυσιολογική λειτουργία. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη χρησιμοποίησε ικριώματα υδρογέλης σε μια μικρορευστική πλατφόρμα και σχεδίασε εντερικές επιθηλιακές δομές χρησιμοποιώντας τεχνικές χάραξης με λέιζερ. Τα εντερικά οργανοειδή ποντικού ακολουθούν χαραγμένα μοτίβα για να σχηματίσουν εντερικές σωληνοειδείς δομές και η ενδοαυλική ροή ρευστού μπορεί να ανακεφαλαιωθεί χρησιμοποιώντας ένα ενότητα μικρορευστομηχανικής. Ωστόσο, αυτό το μοντέλο δεν παρουσιάζει ούτε αυθόρμητες μορφογενετικές διεργασίες ούτε περιλαμβάνει μηχανοβιολογικές κινήσεις του εντέρου. Οι τεχνικές τρισδιάστατης εκτύπωσης από την ίδια ομάδα ήταν σε θέση να δημιουργήσουν μικροσκοπικούς εντερικούς σωλήνες με αυθόρμητες μορφογενετικές διεργασίες. Παρά την πολύπλοκη κατασκευή διαφορετικών εντερικών τμημάτων μέσα στον σωλήνα, αυτό το μοντέλο στερείται επίσης ροής υγρού στον αυλό και μηχανικής παραμόρφωσης. Επιπλέον, η λειτουργικότητα του μοντέλου μπορεί να είναι περιορισμένη, ειδικά μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας βιοεκτύπωσης, διαταράσσοντας τις πειραματικές συνθήκες ή τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-προς-κύτταρο. Αντ' αυτού, το προτεινόμενο πρωτόκολλό μας παρέχει αυθόρμητη εντερική μορφογένεση, φυσιολογικά σχετική διατμητική τάση, βιομηχανική που μιμείται την κινητικότητα του εντέρου, προσβασιμότητα ανεξάρτητων κορυφαίων και βασοπλάγιων διαμερισμάτων και αναδημιουργία σύνθετων βιολογικών μικροπεριβαλλόντων αρθρωτότητας. Επομένως, το πρωτόκολλο τρισδιάστατης μορφογένεσης in vitro μπορεί να παρέχει μια συμπληρωματική προσέγγιση για την αντιμετώπιση των προκλήσεων των υπαρχουσών μεθόδων.
Το πρωτόκολλό μας επικεντρώνεται εξ ολοκλήρου στην τρισδιάστατη επιθηλιακή μορφογένεση, με μόνο επιθηλιακά κύτταρα σε καλλιέργεια και χωρίς άλλους τύπους περιβαλλόντων κυττάρων όπως μεσεγχυματικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και ανοσοκύτταρα. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, ο πυρήνας του πρωτοκόλλου μας είναι η επαγωγή της επιθηλιακής μορφογένεσης με την αφαίρεση των αναστολέων μορφογόνων που εκκρίνονται στη βασοπλάγια πλευρά του εισαγόμενου μέσου. Ενώ η ισχυρή αρθρωτή δομή του gut-on-a-chip και του hybrid-on-a-chip μας επιτρέπει να αναδημιουργήσουμε το κυματιστό τρισδιάστατο επιθηλιακό στρώμα, πρόσθετες βιολογικές πολυπλοκότητες όπως οι επιθηλιακές-μεσεγχυματικές αλληλεπιδράσεις33,34, η εναπόθεση εξωκυτταρικής μήτρας (ECM)35 και, στο μοντέλο μας, τα χαρακτηριστικά κρύπτης-λάχνης που μεταφέρουν κόγχες βλαστοκυττάρων στις βασικές κρύπτες παραμένουν προς περαιτέρω εξέταση. Τα στρωματικά κύτταρα (π.χ., ινοβλάστες) στο μεσέγχυμα παίζουν βασικό ρόλο στην παραγωγή πρωτεϊνών ECM και στη ρύθμιση της εντερικής μορφογένεσης in vivo35,37,38. Η προσθήκη μεσεγχυματικών Η προσθήκη κυττάρων στο μοντέλο μας ενίσχυσε τη μορφογενετική διαδικασία και την αποτελεσματικότητα της προσκόλλησης των κυττάρων. Το ενδοθηλιακό στρώμα (δηλαδή, τα τριχοειδή αγγεία ή τα λεμφικά αγγεία) παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μοριακής μεταφοράς39 και της στρατολόγησης ανοσοκυττάρων40 στο μικροπεριβάλλον του εντέρου. Επιπλέον, τα στοιχεία του αγγειακού συστήματος που μπορούν να συνδεθούν μεταξύ μοντέλων ιστών αποτελούν προϋπόθεση όταν τα μοντέλα ιστών σχεδιάζονται για να επιδεικνύουν αλληλεπιδράσεις πολλαπλών οργάνων. Επομένως, τα ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί να χρειαστεί να συμπεριληφθούν για να μοντελοποιηθούν πιο ακριβή φυσιολογικά χαρακτηριστικά με ανάλυση σε επίπεδο οργάνου. Τα ανοσοκύτταρα που προέρχονται από ασθενείς είναι επίσης απαραίτητα για την εμφάνιση έμφυτων ανοσολογικών αποκρίσεων, παρουσίασης αντιγόνου, έμφυτης προσαρμοστικής ανοσολογικής αλληλεπίδρασης και ιστικής ανοσίας στο πλαίσιο της μίμησης εντερικής νόσου.
Η χρήση υβριδικών τσιπ είναι πιο απλή από την τεχνική gut-on-a-chip, επειδή η εγκατάσταση της συσκευής είναι απλούστερη και η χρήση ενθεμάτων Transwell επιτρέπει την κλιμακούμενη καλλιέργεια του εντερικού επιθηλίου. Ωστόσο, τα εμπορικά διαθέσιμα ένθετα Transwell με πολυεστερικές μεμβράνες δεν είναι ελαστικά και δεν μπορούν να προσομοιώσουν περισταλτικές κινήσεις. Επιπλέον, το κορυφαίο διαμέρισμα του ενθέματος Transwell που τοποθετήθηκε στο υβριδικό τσιπ παρέμεινε σταθερό χωρίς διατμητική τάση στην κορυφαία πλευρά. Σαφώς, οι στατικές ιδιότητες στο κορυφαίο διαμέρισμα σπάνια επιτρέπουν τη μακροχρόνια βακτηριακή συν-καλλιέργεια σε υβριδικά τσιπ. Ενώ μπορούμε να προκαλέσουμε δυναμικά τρισδιάστατη μορφογένεση σε ένθετα Transwell όταν χρησιμοποιούμε υβριδικά τσιπ, η έλλειψη φυσιολογικά σχετικής βιομηχανικής και ροής κορυφαίου υγρού μπορεί να περιορίσει τη σκοπιμότητα των πλατφορμών υβριδικών τσιπ για πιθανές εφαρμογές.
Οι πλήρους κλίμακας ανακατασκευές του άξονα ανθρώπινης κρύπτης-λάχνης σε καλλιέργειες gut-on-a-chip και hybrid-on-a-chip δεν έχουν πλήρως τεκμηριωθεί. Δεδομένου ότι η μορφογένεση ξεκινά από μια επιθηλιακή μονοστιβάδα, οι τρισδιάστατες μικροαρχιτεκτονικές δεν παρέχουν απαραίτητα μορφολογική ομοιότητα με τις κρύπτες in vivo. Αν και χαρακτηρίσαμε τον πολλαπλασιαζόμενο κυτταρικό πληθυσμό κοντά στην βασική περιοχή της κρύπτης στο μικρομηχανικά επεξεργασμένο τρισδιάστατο επιθήλιο, οι περιοχές της κρύπτης και των λαχνών δεν οριοθετήθηκαν σαφώς. Αν και τα υψηλότερα ανώτερα κανάλια στο τσιπ οδηγούν σε αυξημένο ύψος του μικρομηχανικά επεξεργασμένου επιθηλίου, το μέγιστο ύψος εξακολουθεί να περιορίζεται σε ~300-400 µm. Το πραγματικό βάθος των ανθρώπινων εντερικών κρυπτών στο λεπτό και το παχύ έντερο είναι ~135 µm και ~400 µm, αντίστοιχα, και το ύψος των λαχνών του λεπτού εντέρου είναι ~600 µm41.
Από άποψη απεικόνισης, η απεικόνιση in situ υπερ-ανάλυσης τρισδιάστατων μικροαρχιτεκτονικών μπορεί να περιορίζεται στο έντερο ενός τσιπ, καθώς η απαιτούμενη απόσταση εργασίας από τον αντικειμενικό φακό έως το επιθηλιακό στρώμα είναι της τάξης των μερικών χιλιοστών. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, μπορεί να απαιτείται ένας μακρινός αντικειμενικός φακός. Επιπλέον, η δημιουργία λεπτών τομών για την προετοιμασία δειγμάτων απεικόνισης είναι δύσκολη λόγω της υψηλής ελαστικότητας του PDMS. Επιπλέον, δεδομένου ότι η μικροκατασκευή στρώμα προς στρώμα του εντέρου σε ένα τσιπ περιλαμβάνει μόνιμη προσκόλληση μεταξύ κάθε στρώματος, είναι εξαιρετικά δύσκολο να ανοίξετε ή να αφαιρέσετε το ανώτερο στρώμα για να εξετάσετε την επιφανειακή δομή του επιθηλιακού στρώματος. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM).
Η υδροφοβικότητα του PDMS αποτελεί περιοριστικό παράγοντα σε μελέτες που βασίζονται σε μικρορευστομηχανικές και ασχολούνται με υδρόφοβα μικρά μόρια, καθώς το PDMS μπορεί να προσροφήσει μη ειδικά τέτοια υδρόφοβα μόρια. Εναλλακτικές λύσεις αντί του PDMS μπορούν να εξεταστούν με άλλα πολυμερικά υλικά. Εναλλακτικά, μπορεί να εξεταστεί η τροποποίηση της επιφάνειας του PDMS (π.χ., επικάλυψη με λιπόφιλα υλικά 42 ή πολυ(αιθυλενογλυκόλη) 43) για την ελαχιστοποίηση της προσρόφησης υδρόφοβων μορίων.
Τέλος, η μέθοδός μας δεν έχει χαρακτηριστεί επαρκώς όσον αφορά την παροχή μιας πλατφόρμας διαλογής υψηλής απόδοσης ή μιας φιλικής προς το χρήστη πειραματικής πλατφόρμας τύπου «ένα μέγεθος για όλους». Το τρέχον πρωτόκολλο απαιτεί μια αντλία σύριγγας ανά μικροσυσκευή, η οποία καταλαμβάνει χώρο σε έναν επωαστήρα CO2 και αποτρέπει πειράματα μεγάλης κλίμακας. Αυτός ο περιορισμός μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά με την επεκτασιμότητα καινοτόμων μορφών καλλιέργειας (π.χ., πορώδη ένθετα 24 φρεατίων, 96 φρεατίων ή 384 φρεατίων που επιτρέπουν τη συνεχή αναπλήρωση και αφαίρεση βασοπλευρικών μέσων).
Για να προκαλέσουμε τρισδιάστατη μορφογένεση του ανθρώπινου εντερικού επιθηλίου in vitro, χρησιμοποιήσαμε μια εντερική συσκευή μικρορευστικού τσιπ που περιείχε δύο παράλληλα μικροκανάλια και μια ελαστική πορώδη μεμβράνη ενδιάμεσα για να δημιουργήσουμε μια διεπαφή αυλού-τριχοειδικού ιστού. Επίσης, παρουσιάζουμε τη χρήση μιας μικρορευστικής συσκευής ενός καναλιού (ένα υβριδικό τσιπ) που παρέχει συνεχή βασεοπλάγια ροή κάτω από πολωμένα επιθηλιακά στρώματα που αναπτύσσονται σε ένθετα Transwell. Και στις δύο πλατφόρμες, η μορφογένεση διαφόρων ανθρώπινων εντερικών επιθηλιακών κυττάρων μπορεί να αποδειχθεί εφαρμόζοντας κατευθυντικό χειρισμό της ροής για την απομάκρυνση ανταγωνιστών μορφογόνων από το βασεοπλάγιο διαμέρισμα. Ολόκληρη η πειραματική διαδικασία (Σχήμα 1) αποτελείται από πέντε μέρη: (i) μικροκατασκευή του εντερικού τσιπ ή του εισαγόμενου υβριδικού τσιπ Transwell (βήματα 1-5· Πλαίσιο 1), (ii) παρασκευή εντερικών επιθηλιακών κυττάρων (κύτταρα Caco-2) ή ανθρώπινων εντερικών οργανοειδών. πλαίσια 2-5), (iii) καλλιέργεια εντερικών επιθηλιακών κυττάρων σε εντερικά τσιπ ή υβριδικά τσιπ (βήματα 6-9), (iv) επαγωγή τρισδιάστατης μορφογένεσης in vitro (βήμα 10) και (v)) για τον χαρακτηρισμό της τρισδιάστατης επιθηλιακής μικροδομής (βήματα 11-24). Τέλος, σχεδιάστηκε μια κατάλληλη ομάδα ελέγχου (που συζητείται περαιτέρω παρακάτω) για την επικύρωση της αποτελεσματικότητας της μορφογένεσης in vitro συγκρίνοντας την επιθηλιακή μορφογένεση με χωρικούς, χρονικούς, υπό όρους ή διαδικαστικούς ελέγχους.
Χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές πλατφόρμες καλλιέργειας: έντερο σε τσιπ με ευθεία κανάλια ή μη γραμμικά περιελιγμένα κανάλια ή υβριδικά τσιπ που περιέχουν ένθετα Transwell (TW) σε μια μικρορευστομηχανική συσκευή, κατασκευασμένα όπως περιγράφεται στο Πλαίσιο 1, και το βήμα 1-5. «Κατασκευή Συσκευής» δείχνει τα κύρια βήματα για την κατασκευή ενός μόνο τσιπ ή ενός υβριδικού τσιπ. «Καλλιέργεια Ανθρώπινων Εντερικών Επιθηλιακών Κυττάρων» εξηγεί την πηγή κυττάρων (Caco-2 ή ανθρώπινα εντερικά οργανοειδή) και τη διαδικασία καλλιέργειας που χρησιμοποιείται σε αυτό το πρωτόκολλο. «Μορφογένεση in vitro» δείχνει τα συνολικά βήματα στα οποία καλλιεργούνται επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από Caco-2 ή οργανοειδή σε ένα εντερικό τσιπ ή σε ένθετα Transwell ενός υβριδικού τσιπ, ακολουθούμενη από επαγωγή τρισδιάστατης μορφογένεσης και σχηματισμό μιας χαρακτηρισμένης επιθηλιακής δομής. Ο αριθμός βήματος προγράμματος ή ο αριθμός πλαισίου εμφανίζεται κάτω από κάθε βέλος. Η εφαρμογή παρέχει παραδείγματα για το πώς μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα καθιερωμένα εντερικά επιθηλιακά στρώματα, για παράδειγμα, στον χαρακτηρισμό της κυτταρικής διαφοροποίησης, στις μελέτες φυσιολογίας του εντέρου, στη δημιουργία οικοσυστημάτων ξενιστή-μικροβίου και στη μοντελοποίηση ασθενειών. Ανοσοφθορισμός Εικόνες στην ενότητα «Διαφοροποίηση Κυττάρων» που δείχνουν πυρήνες, F-ακτίνη και MUC2 που εκφράζονται στο τρισδιάστατο επιθηλιακό στρώμα Caco-2 που παράγεται στο τσιπ του εντέρου. Η σηματοδότηση MUC2 υπάρχει σε λαγηνοειδή κύτταρα και βλέννα που εκκρίνεται από τις βλεννογονικές επιφάνειες. Οι φθορίζουσες εικόνες στην ενότητα Φυσιολογία του Εντέρου δείχνουν βλέννα που παράγεται με χρώση για υπολείμματα σιαλικού οξέος και Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης χρησιμοποιώντας φθορίζουσα συγκολλητίνη φύτρου σίτου. Οι δύο επικαλυπτόμενες εικόνες στην ενότητα «Συν-καλλιέργειες Μικροβίων-Ξενιστή» δείχνουν αντιπροσωπευτικές συν-καλλιέργειες ξενιστή-μικροβίου στο έντερο σε ένα τσιπ. Το αριστερό πλαίσιο δείχνει τη συν-καλλιέργεια E. coli που εκφράζει πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) με μικρομηχανικά τρισδιάστατα επιθηλιακά κύτταρα Caco-2. Το δεξί πλαίσιο δείχνει τον εντοπισμό της GFP E. coli που συν-καλλιεργείται με τρισδιάστατα επιθηλιακά κύτταρα Caco-2, ακολουθούμενη από χρώση ανοσοφθορισμού με F-ακτίνη (κόκκινο) και πυρήνες (μπλε). Η μοντελοποίηση ασθενειών απεικονίζει υγιές έναντι διαρρέοντος εντέρου σε τσιπ φλεγμονής του εντέρου υπό φυσιολογική πρόκληση με βακτηριακά αντιγόνα (π.χ. λιποπολυσακχαρίτης, LPS) και ανοσοκύτταρα (π.χ., PBMC· πράσινο). Τα κύτταρα Caco-2 καλλιεργήθηκαν για να δημιουργηθεί ένα τρισδιάστατο επιθηλιακό στρώμα. Γραμμή κλίμακας, 50 µm. Εικόνες στην κάτω σειρά: «Διαφοροποίηση κυττάρων» προσαρμοσμένο με άδεια από την παραπομπή.2. Oxford University Press. Αναπαράγεται με άδεια από την Αναφ.5. NAS. «Συν-καλλιέργεια μικροβίων-ξενιστών» προσαρμοσμένο με άδεια από την αναφ.3. NAS. «Μοντελοποίηση ασθενειών» προσαρμοσμένο με άδεια από την παραπομπή.5. NAS.
Τόσο τα τσιπ gut-on-chip όσο και τα υβριδικά τσιπ κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας αντίγραφα PDMS που αποκαλουπώθηκαν από καλούπια πυριτίου με μαλακή λιθογραφία1,44 και διαμορφώθηκαν με SU-8. Ο σχεδιασμός των μικροκαναλιών σε κάθε τσιπ καθορίζεται λαμβάνοντας υπόψη την υδροδυναμική όπως η διατμητική τάση και η υδροδυναμική πίεση1,4,12. Ο αρχικός σχεδιασμός gut-on-a-chip (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1α), ο οποίος αποτελούνταν από δύο παράλληλους ευθύγραμμους μικροκαναλιούς, έχει εξελιχθεί σε ένα σύνθετο gut-on-a-chip (Εκτεταμένα Δεδομένα Σχήμα 1β) που περιλαμβάνει ένα ζεύγος καμπύλων μικροκαναλιών για να προκαλέσει αυξημένο χρόνο παραμονής υγρού, μη γραμμικά μοτίβα ροής και πολυαξονική παραμόρφωση καλλιεργημένων κυττάρων (Εικόνα 2α-στ)12. Όταν χρειάζεται να αναδημιουργηθεί πιο σύνθετη βιομηχανική του εντέρου, μπορούν να επιλεγούν σύνθετα gut-on-a-chips. Έχουμε δείξει ότι το περίπλοκο Gut-Chip προκαλεί επίσης έντονα τρισδιάστατη μορφογένεση σε παρόμοιο χρονικό πλαίσιο με παρόμοιο βαθμό επιθηλιακής ανάπτυξης σε σύγκριση με το αρχικό. Gut-Chip, ανεξάρτητα από τον τύπο καλλιεργημένου κυττάρου. Επομένως, για την πρόκληση τρισδιάστατης μορφογένεσης, τα γραμμικά και σύνθετα σχέδια εντέρου επί του τσιπ είναι εναλλάξιμα. Τα αντίγραφα PDMS που σκληρύνθηκαν σε καλούπια πυριτίου με μοτίβα SU-8 παρείχαν αρνητικά χαρακτηριστικά μετά την αποκαλούπωση (Εικ. 2α). Για την κατασκευή του εντέρου σε ένα τσιπ, το προετοιμασμένο άνω στρώμα PDMS συγκολλήθηκε διαδοχικά σε μια πορώδη μεμβράνη PDMS και στη συνέχεια ευθυγραμμίστηκε με το κάτω στρώμα PDMS με μη αναστρέψιμη σύνδεση χρησιμοποιώντας μια συσκευή επεξεργασίας κορώνας (Εικ. 2b-f). Για την κατασκευή υβριδικών τσιπ, τα σκληρυμένα αντίγραφα PDMS συγκολλήθηκαν σε γυάλινες πλάκες για να δημιουργηθούν μικρορευστομηχανικές συσκευές ενός καναλιού που θα μπορούσαν να φιλοξενήσουν ένθετα Transwell (Εικ. 2h και Εκτεταμένα Δεδομένα Εικ. 2). Η διαδικασία συγκόλλησης εκτελείται με την επεξεργασία των επιφανειών του αντιγράφου PDMS και του γυαλιού με πλάσμα οξυγόνου ή επεξεργασία κορώνας. Μετά την αποστείρωση της μικροκατασκευασμένης συσκευής που είναι προσαρτημένη στον σωλήνα σιλικόνης, η διάταξη της συσκευής ήταν έτοιμη να εκτελέσει τρισδιάστατη μορφογένεση του εντερικού επιθηλίου (Εικ. 2g).
α, Σχηματική απεικόνιση της παρασκευής εξαρτημάτων PDMS από καλούπια πυριτίου με μοτίβο SU-8. Το μη σκληρυμένο διάλυμα PDMS χύθηκε σε καλούπι πυριτίου (αριστερά), σκληρύνθηκε στους 60 °C (μέση) και ξεκαλουπώθηκε (δεξιά). Το ξεκαλουπωμένο PDMS κόπηκε σε κομμάτια και καθαρίστηκε για περαιτέρω χρήση. β, Φωτογραφία του καλουπιού πυριτίου που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του άνω στρώματος PDMS. γ, Φωτογραφία του καλουπιού πυριτίου που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή της πορώδους μεμβράνης PDMS. δ, Μια σειρά φωτογραφιών των άνω και κάτω εξαρτημάτων PDMS και της συναρμολογημένης εντερικής συσκευής σε τσιπ. ε, Σχηματική απεικόνιση της ευθυγράμμισης των άνω, της μεμβράνης και των κάτω εξαρτημάτων PDMS. Κάθε στρώμα συνδέεται μη αναστρέψιμα με επεξεργασία πλάσματος ή κορώνας. στ, Σχηματική απεικόνιση της κατασκευασμένης συσκευής gut-on-a-chip με επικαλυπτόμενα περίπλοκα μικροκανάλια και θαλάμους κενού. ζ, Ρύθμιση gut-on-a-chip για μικρορευστολογική κυτταροκαλλιέργεια. Το κατασκευασμένο έντερο σε τσιπ συναρμολογημένο με σωλήνα σιλικόνης και σύριγγα τοποθετήθηκε σε καλυπτρίδα. Η συσκευή τσιπ τοποθετήθηκε στο καπάκι του ένα τρυβλίο Petri 150 mm για επεξεργασία. Το συνδετικό υλικό χρησιμοποιείται για το κλείσιμο του σωλήνα σιλικόνης.h, Οπτικά στιγμιότυπα κατασκευής υβριδικού τσιπ και τρισδιάστατης μορφογένεσης χρησιμοποιώντας υβριδικά τσιπ. Ένθετα Transwell που παρασκευάστηκαν ανεξάρτητα για την καλλιέργεια μονοστοιβάδων 2D εντερικών επιθηλιακών κυττάρων εισήχθησαν στο υβριδικό τσιπ για την πρόκληση τρισδιάστατης εντερικής μορφογένεσης. Το μέσο εγχέεται μέσω μικροκαναλιών κάτω από το κυτταρικό στρώμα που έχει δημιουργηθεί στο ένθετο Transwell. Γραμμή κλίμακας, 1 cm.h Ανατυπώθηκε με άδεια από την αναφορά.4. Elsevier.
Σε αυτό το πρωτόκολλο, η κυτταρική σειρά Caco-2 και τα εντερικά οργανοειδή χρησιμοποιήθηκαν ως επιθηλιακές πηγές (Εικ. 3α). Και οι δύο τύποι κυττάρων καλλιεργήθηκαν ανεξάρτητα (Πλαίσιο 2 και Πλαίσιο 5) και χρησιμοποιήθηκαν για την σπορά των επικαλυμμένων με ECM μικροκαναλιών ενθέτων εντέρου ή Transwell. Όταν τα κύτταρα είναι συρρέοντα (>95% κάλυψη στις φιάλες), τα καλλιεργημένα κύτταρα Caco-2 (μεταξύ των περασμάτων 10 και 50) σε φιάλες Τ συλλέγονται για την παρασκευή διασπασμένων κυτταρικών εναιωρημάτων με υγρό θρυψινοποίησης (πλαίσιο 2). Ανθρώπινα εντερικά οργανοειδή από εντερικές βιοψίες ή χειρουργικές εκτομές καλλιεργήθηκαν σε θόλους ικριώματος Matrigel σε πλάκες 24 φρεατίων για την υποστήριξη του δομικού μικροπεριβάλλοντος. Το μέσο που περιείχε απαραίτητα μορφογόνα (όπως Wnt, R-σπονδίνη και Noggin) και παράγοντες ανάπτυξης που παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Πλαίσιο 3 συμπληρώθηκε κάθε δεύτερη μέρα μέχρι τα οργανοειδή να αναπτυχθούν σε διάμετρο ~500 µm. Τα πλήρως αναπτυγμένα οργανοειδή συλλέγονται και διασπώνται σε μεμονωμένα κύτταρα για σπορά. ένθετα εντέρου ή Transwell σε τσιπ (Πλαίσιο 5). Όπως έχουμε αναφέρει προηγουμένως, μπορεί να διαφοροποιηθεί ανάλογα με τον τύπο της νόσου12,13 (π.χ. ελκώδης κολίτιδα, νόσος του Crohn, καρκίνος του παχέος εντέρου ή φυσιολογικός δότης), την εντόπιση της βλάβης (π.χ. βλάβη έναντι μη αλλοιωμένης περιοχής) και την γαστρεντερική θέση στην οδό (π.χ. δωδεκαδάκτυλο, νήστιδα, ειλεό, τυφλό έντερο, κόλον ή ορθό). Στο Πλαίσιο 5 παρέχουμε ένα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο για την καλλιέργεια οργανοειδών του παχέος εντέρου (κολλοειδή) που συνήθως απαιτούν υψηλότερες συγκεντρώσεις μορφογόνων από τα οργανοειδή του λεπτού εντέρου.
α, Ροή εργασίας για την επαγωγή της εντερικής μορφογένεσης στο τσιπ του εντέρου. Το ανθρώπινο εντερικό επιθήλιο Caco-2 και τα εντερικά οργανοειδή χρησιμοποιούνται σε αυτό το πρωτόκολλο για την επίδειξη τρισδιάστατης μορφογένεσης. Τα απομονωμένα επιθηλιακά κύτταρα ενοφθαλμίστηκαν στην προετοιμασμένη συσκευή gut-on-a-chip (παρασκευή τσιπ). Μόλις τα κύτταρα ενοφθαλμιστούν (seeded) και προσκολληθούν (connected) στην πορώδη μεμβράνη PDMS την ημέρα 0 (D0), ξεκινά η κορυφαία (AP) ροή και διατηρείται για τις πρώτες 2 ημέρες (ροή, AP, D0-D2). Η βασεοπλάγια (BL) ροή ξεκινά επίσης μαζί με κυκλικές κινήσεις τάνυσης (stretch, flow, AP και BL) όταν σχηματίζεται μια πλήρης μονοστοιβάδα 2D. Η εντερική τρισδιάστατη μορφογένεση έλαβε χώρα αυθόρμητα μετά από 5 ημέρες μικρορευστικής καλλιέργειας (μορφογένεση, D5). Οι εικόνες αντίθεσης φάσης δείχνουν αντιπροσωπευτική μορφολογία των κυττάρων Caco-2 σε κάθε πειραματικό βήμα ή χρονικό σημείο (ραβδόγραμμα, 100 µm). Τέσσερα σχηματικά διαγράμματα που απεικονίζουν τις αντίστοιχες καταρράκτες της εντερικής μορφογένεσης (πάνω δεξιά). Τα διακεκομμένα βέλη στο σχηματικό αναπαριστούν την κατεύθυνση της ροής του ρευστού. β, Εικόνα SEM που δείχνει την επιφανειακή τοπολογία του καθιερωμένου τρισδιάστατου επιθηλίου Caco-2 (αριστερά). Το ένθετο που επισημαίνει τη μεγεθυμένη περιοχή (λευκό διακεκομμένο πλαίσιο) δείχνει τις αναγεννημένες μικρολάχνες στο τρισδιάστατο στρώμα Caco-2 (δεξιά). γ, Οριζόντια μετωπική όψη καθιερωμένων μεμβρανών Caco-2 3D, κλαουδίνης (ZO-1, κόκκινο) και συνεχών μεμβρανών με βούρτσα που φέρουν την ένδειξη F-ακτίνη (πράσινο) και πυρήνες (μπλε). Οπτικοποίηση ομοεστιακής ανοσοφθορισμού επιθηλιακών κυττάρων σε εντερικά τσιπ. Τα βέλη που δείχνουν προς το μεσαίο σχηματικό υποδεικνύουν τη θέση του εστιακού επιπέδου για κάθε ομοεστιακή όψη. δ, Χρονική πορεία μορφολογικών αλλαγών σε οργανοειδή που καλλιεργήθηκαν σε τσιπ που ελήφθη με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης τις ημέρες 3, 7, 9, 11 και 13. Το ένθετο (πάνω δεξιά) δείχνει την υψηλή μεγέθυνση της παρεχόμενης εικόνας. ε, Φωτομικρογραφία DIC του τρισδιάστατου επιθηλίου οργανοειδούς που καθιερώθηκε στο έντερο σε τομή που ελήφθη την ημέρα 7. στ, Επικαλυπτόμενες εικόνες ανοσοφθορισμού που δείχνουν δείκτες για βλαστοκύτταρα (LGR5, ματζέντα), καλυκοειδή κύτταρα (MUC2, πράσινο), F-ακτίνη (γκρι) και πυρήνες (κυανό) που αναπτύχθηκαν σε τσιπ εντέρου για 3 ημέρες, αντίστοιχα (Αριστερά) και οργανοειδή 13 ημερών (μεσαία) στο επιθηλιακό στρώμα. Δείτε επίσης το Εκτεταμένο Σχήμα Δεδομένων 3, το οποίο επισημαίνει την σηματοδότηση LGR5 χωρίς σηματοδότηση MUC2. Εικόνες φθορισμού που δείχνουν την επιθηλιακή μικροδομή (δεξιά) τρισδιάστατου οργανοειδούς επιθηλίου που δημιουργήθηκε στο έντερο σε ένα τσιπ με χρώση της πλασματικής μεμβράνης με χρωστική CellMask (δεξιά) την 13η ημέρα της καλλιέργειας. Η κλίμακα είναι 50 μm, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά.b Ανατυπώθηκε με άδεια από την παραπομπή.2. Oxford University Press. c Προσαρμόστηκε με άδεια από την παραπομπή.2. Oxford University Press. e και f προσαρμοσμένα με άδεια από παραπομπή.12 Υπό την άδεια Creative Commons CC BY 4.0.
Στο έντερο σε ένα τσιπ, είναι απαραίτητο να τροποποιηθεί η υδρόφοβη επιφάνεια της πορώδους μεμβράνης PDMS για επιτυχή επικάλυψη ECM. Σε αυτό το πρωτόκολλο, εφαρμόζουμε δύο διαφορετικές μεθόδους για να τροποποιήσουμε την υδρόφοβη δράση των μεμβρανών PDMS. Για την καλλιέργεια κυττάρων Caco-2, η επιφανειακή ενεργοποίηση μόνο με επεξεργασία με υπεριώδη ακτινοβολία/όζον ήταν επαρκής για να μειώσει την υδροφοβικότητα της επιφάνειας PDMS, να επικαλύψει την ECM και να προσκολλήσει κύτταρα Caco-2 στη μεμβράνη PDMS. Ωστόσο, η μικρορευστοποιητική καλλιέργεια οργανοειδούς επιθηλίου απαιτεί χημική λειτουργικοποίηση της επιφάνειας για να επιτευχθεί αποτελεσματική εναπόθεση πρωτεϊνών ECM με διαδοχική εφαρμογή πολυαιθυλενοϊμίνης (PEI) και γλουταραλδεΰδης σε μικροκανάλια PDMS. Μετά την τροποποίηση της επιφάνειας, οι πρωτεΐνες ECM εναποτέθηκαν για να καλύψουν την λειτουργικοποιημένη επιφάνεια PDMS και στη συνέχεια εισήχθησαν στο απομονωμένο οργανοειδές επιθήλιο. Αφού προσκολληθούν τα κύτταρα, η μικρορευστοποιητική κυτταροκαλλιέργεια ξεκινά με την έγχυση μόνο του μέσου στο άνω μικροκανάλι μέχρι τα κύτταρα να σχηματίσουν μια πλήρη μονοστρωματική στιβάδα, ενώ το κάτω μικροκανάλι διατηρεί στατικές συνθήκες. Αυτή η βελτιστοποιημένη μέθοδος για την επιφανειακή ενεργοποίηση και την επικάλυψη ECM επιτρέπει την προσκόλληση οργανοειδούς επιθηλίου για την πρόκληση τρισδιάστατης μορφογένεση στην επιφάνεια του PDMS.
Οι καλλιέργειες Transwell απαιτούν επίσης επικάλυψη ECM πριν από την κυτταρική σπορά. Ωστόσο, οι καλλιέργειες Transwell δεν απαιτούν πολύπλοκα βήματα προεπεξεργασίας για την ενεργοποίηση της επιφάνειας των πορωδών ενθεμάτων. Για την ανάπτυξη κυττάρων Caco-2 σε ενθέματα Transwell, η επικάλυψη ECM σε πορώδη ενθέματα επιταχύνει την προσκόλληση των διαχωρισμένων κυττάρων Caco-2 (<1 ώρα) και τον σχηματισμό φραγμού στενής σύνδεσης (<1-2 ημέρες). Για την καλλιέργεια οργανοειδών σε ενθέματα Transwell, τα απομονωμένα οργανοειδή ενοφθαλμίζονται σε ενθέματα επικαλυμμένα με ECM, προσκολλώνται στην επιφάνεια της μεμβράνης (<3 ώρες) και διατηρούνται μέχρι τα οργανοειδή να σχηματίσουν μια πλήρη μονοστοιβάδα με ακεραιότητα φραγμού. Οι καλλιέργειες Transwell εκτελούνται σε πλάκες 24 φρεατίων χωρίς τη χρήση υβριδικών τσιπ.
Η in vitro τρισδιάστατη μορφογένεση μπορεί να ξεκινήσει με την εφαρμογή ροής υγρού στην βασεοπλάγια όψη ενός καθιερωμένου επιθηλιακού στρώματος. Στο έντερο σε ένα τσιπ, η επιθηλιακή μορφογένεση ξεκίνησε όταν το μέσο εγχύθηκε στα άνω και κάτω μικροκανάλια (Εικ. 3α). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, είναι κρίσιμο να εισαχθεί ροή υγρού στο κατώτερο (βασεοπλάγιο) διαμέρισμα για τη συνεχή απομάκρυνση των κατευθυνόμενων εκκρινόμενων αναστολέων μορφογόνων. Για την παροχή επαρκών θρεπτικών συστατικών και ορού στα κύτταρα που είναι συνδεδεμένα με πορώδεις μεμβράνες και για τη δημιουργία τάσης διάτμησης του αυλού, συνήθως εφαρμόζουμε διπλή ροή στο έντερο σε ένα τσιπ. Στα υβριδικά τσιπ, εισήχθησαν ένθετα Transwell που περιείχαν επιθηλιακές μονοστοιβάδες στα υβριδικά τσιπ. Στη συνέχεια, το μέσο εφαρμόστηκε κάτω από την βασεοπλάγια πλευρά του πορώδους ενθέματος Transwell μέσω του μικροκαναλιού. Η εντερική μορφογένεση έλαβε χώρα 3-5 ημέρες μετά την έναρξη της βασεοπλάγιας ροής και στις δύο πλατφόρμες καλλιέργειας.
Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των μικρομηχανικά επεξεργασμένων τρισδιάστατων επιθηλιακών στρωμάτων μπορούν να αναλυθούν εφαρμόζοντας διάφορες απεικονιστικές μεθόδους, όπως μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, μικροσκοπία διαφορικής παρεμβολής (DIC), SEM ή ομοεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (Σχήματα 3 και 4). Η απεικόνιση αντίθεσης φάσης ή DIC μπορεί εύκολα να πραγματοποιηθεί οποιαδήποτε στιγμή κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας για την παρακολούθηση του σχήματος και της προεξοχής των τρισδιάστατων επιθηλιακών στρωμάτων. Λόγω της οπτικής διαφάνειας των μεμβρανών PDMS και πολυεστέρα, τόσο η πλατφόρμα gut-on-a-chip όσο και η υβριδική πλατφόρμα chip μπορούν να παρέχουν απεικόνιση in situ σε πραγματικό χρόνο χωρίς την ανάγκη τομής ή αποσυναρμολόγησης της συσκευής. Κατά την εκτέλεση απεικόνισης ανοσοφθορισμού (Σχήματα 1, 3c, f και 4b, c), τα κύτταρα συνήθως στερεώνονται με 4% (wt/vol) παραφορμαλδεΰδη (PFA), ακολουθούμενη από Triton X-100 και 2% (wt/vol)) αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA), κατά σειρά. Ανάλογα με τον τύπο κυττάρου, μπορούν να χρησιμοποιηθούν διαφορετικά στερεωτικά, διαπερατοποιητές και παράγοντες αποκλεισμού. Χρησιμοποιούνται πρωτογενή αντισώματα που στοχεύουν δείκτες κυττάρων ή περιοχών που εξαρτώνται από την γενεαλογία για την επισήμανση κυττάρων που ακινητοποιούνται in situ στο τσιπ, ακολουθούμενα από δευτερογενή αντισώματα μαζί με μια χρωστική αντίχρωση που στοχεύει είτε τον πυρήνα (π.χ., 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλενο) ινδόλη, DAPI) είτε την F-ακτίνη (π.χ., φαλλοϊδίνη με φθορισμό). Η ζωντανή απεικόνιση με βάση τον φθορισμό μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί in situ για την ανίχνευση της παραγωγής βλέννας (Εικ. 1, «Κυτταρική διαφοροποίηση» και «Φυσιολογία του εντέρου»), του τυχαίου αποικισμού μικροβιακών κυττάρων (Εικ. 1, «Συν-καλλιέργεια ξενιστή-μικροβίου»), της στρατολόγησης ανοσοκυττάρων (Εικ. 1, «Μοντελοποίηση Ασθενειών») ή των περιγραμμάτων της τρισδιάστατης επιθηλιακής μορφολογίας (Εικ. 3c, f και 4b, c). Κατά την τροποποίηση του εντέρου στο τσιπ για τον διαχωρισμό του άνω στρώματος από το κάτω στρώμα μικροκαναλιών, όπως περιγράφεται στην αναφ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η τρισδιάστατη επιθηλιακή μορφολογία καθώς και οι μικρολάχνες στην κορυφαία Το οδοντωτό περίγραμμα μπορεί να απεικονιστεί με SEM (Εικ. 3b). Η έκφραση των δεικτών διαφοροποίησης μπορεί να αξιολογηθεί με ποσοτική PCR5 ή αλληλούχιση RNA ενός κυττάρου. Σε αυτήν την περίπτωση, τρισδιάστατα στρώματα επιθηλιακών κυττάρων που αναπτύσσονται σε εντερικά τσιπ ή υβριδικά τσιπ συλλέγονται με θρυψινοποίηση και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για μοριακή ή γενετική ανάλυση.
α, Ροή εργασίας για την επαγωγή εντερικής μορφογένεσης σε ένα υβριδικό τσιπ. Το Caco-2 και τα εντερικά οργανοειδή χρησιμοποιούνται σε αυτό το πρωτόκολλο για την επίδειξη τρισδιάστατης μορφογένεσης σε μια πλατφόρμα υβριδικού τσιπ. Τα διαχωρισμένα επιθηλιακά κύτταρα ενοφθαλμίστηκαν σε προετοιμασμένα ένθετα Transwell (TW prep· βλέπε σχήμα παρακάτω). Μόλις τα κύτταρα ενοφθαλμίστηκαν (seeded) και προσκολλήθηκαν σε πολυεστερικές μεμβράνες σε ένθετα Transwell, όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες (καλλιέργεια TW). Μετά από 7 ημέρες, ένα μόνο ένθετο Transwell που περιείχε μια δισδιάστατη μονοστρωματική στιβάδα επιθηλιακών κυττάρων ενσωματώθηκε σε ένα υβριδικό τσιπ για να εισαγάγει μια βασοπλάγια ροή (Flow, BL), η οποία τελικά οδήγησε στη δημιουργία ενός τρισδιάστατου επιθηλιακού στρώματος (μορφογένεση). Μικρογραφίες αντίθεσης φάσης που δείχνουν μορφολογικά χαρακτηριστικά επιθηλιακών κυττάρων ανθρώπινου οργάνου που προέρχονται από ανιόν κόλον φυσιολογικού δότη (γραμμή C103) σε κάθε πειραματικό βήμα ή χρονικό σημείο. Τα σχηματικά στα ανώτερα στρώματα απεικονίζουν τη πειραματική διαμόρφωση για κάθε βήμα. β, Τα υβριδικά τσιπ (αριστερό σχηματικό) μπορούν να οδηγήσουν σε τρισδιάστατη μορφογένεση οργανοειδών επιθηλιακών κυττάρων με Οι οπτικές όψεις ομοεστιακής μικροσκοπίας από πάνω προς τα κάτω που ελήφθησαν σε διαφορετικές θέσεις Z (άνω, μεσαία και κάτω· βλέπε δεξιά σχηματική απεικόνιση και τις αντίστοιχες διακεκομμένες γραμμές). έδειξαν εμφανή μορφολογικά χαρακτηριστικά. F-ακτίνη (κυανό), πυρήνας (γκρι). c, Μικρογραφίες ομοεστιακής φθορισμού (τρισδιάστατη γωνιακή όψη) επιθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από οργανοειδή καλλιεργημένα σε στατικό Transwell (TW· ένθετο μέσα σε λευκό διακεκομμένο πλαίσιο) έναντι υβριδικού τσιπ (μεγαλύτερη πλήρης λήψη) που συγκρίνουν τη μορφολογία 2D έναντι της μορφολογίας 3D, αντίστοιχα. Ένα ζεύγος κάθετων διασταυρούμενων όψεων 2D (ένθετο στην επάνω δεξιά γωνία· "XZ") δείχνουν επίσης χαρακτηριστικά 2D και 3D. Γραμμή κλίμακας, 100 µm. c Ανατυπώθηκε με άδεια από την παραπομπή. 4. Elsevier.
Τα δείγματα ελέγχου μπορούν να παρασκευαστούν καλλιεργώντας τα ίδια κύτταρα (Caco-2 ή εντερικά οργανοειδή επιθηλιακά κύτταρα) σε δισδιάστατες μονοστοιβάδες υπό συμβατικές στατικές συνθήκες καλλιέργειας. Αξίζει να σημειωθεί ότι μπορεί να προκύψει εξάντληση θρεπτικών συστατικών λόγω της περιορισμένης χωρητικότητας όγκου των μικροκαναλιών (δηλαδή ~4 µL στο άνω κανάλι στον αρχικό σχεδιασμό του εντερικού τσιπ). Επομένως, μπορεί επίσης να συγκριθεί η επιθηλιακή μορφολογία πριν και μετά την εφαρμογή της βασεοπλάγιας ροής.
Η διαδικασία μαλακής λιθογραφίας θα πρέπει να εκτελείται σε καθαρό δωμάτιο. Για κάθε στρώμα στο τσιπ (άνω και κάτω στρώματα και μεμβράνες) και υβριδικά τσιπ, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές φωτομάσκες και κατασκευάστηκαν σε ξεχωριστά πλακίδια πυριτίου, επειδή τα ύψη των μικροκαναλιών ήταν διαφορετικά. Τα ύψη-στόχος των άνω και κάτω μικροκαναλιών του εντέρου στο τσιπ είναι 500 µm και 200 ​​µm, αντίστοιχα. Το ύψος-στόχος καναλιού του υβριδικού τσιπ είναι 200 ​​µm.
Τοποθετήστε μια γκοφρέτα πυριτίου 3 ιντσών σε ένα πιάτο με ακετόνη. Ανακινήστε απαλά την πλάκα για 30 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια στεγνώστε την στον αέρα. Μεταφέρετε την γκοφρέτα σε ένα πιάτο με IPA και στη συνέχεια περιστρέψτε την πλάκα για 30 δευτερόλεπτα για να την καθαρίσετε.
Ένα διάλυμα πιράνχας (μείγμα υπεροξειδίου του υδρογόνου και πυκνού θειικού οξέος, 1:3 (όγκος/όγκος)) μπορεί προαιρετικά να χρησιμοποιηθεί για τη μεγιστοποίηση της απομάκρυνσης οργανικών υπολειμμάτων από την επιφάνεια του πλακιδίου πυριτίου.
Το διάλυμα Piranha είναι εξαιρετικά διαβρωτικό και παράγει θερμότητα. Απαιτούνται πρόσθετες προφυλάξεις ασφαλείας. Για την απόρριψη των αποβλήτων, αφήστε το διάλυμα να κρυώσει και μεταφέρετέ το σε ένα καθαρό, στεγνό δοχείο απορριμμάτων. Χρησιμοποιήστε δευτερεύοντα δοχεία και επισημάνετε σωστά τα δοχεία απορριμμάτων. Ακολουθήστε τις οδηγίες ασφαλείας της εγκατάστασης για πιο λεπτομερείς διαδικασίες.
Αφυδατώστε τις γκοφρέτες τοποθετώντας τες σε μια θερμή πλάκα στους 200 °C για 10 λεπτά. Μετά την αφυδάτωση, η γκοφρέτα ανακινήθηκε πέντε φορές στον αέρα για να κρυώσει.
Ρίξτε ~10 g φωτοευαίσθητου υλικού SU-8 2100 στο κέντρο της καθαρισμένης γκοφρέτας σιλικόνης. Χρησιμοποιήστε τσιμπιδάκι για να απλώσετε το φωτοευαίσθητο υλικό ομοιόμορφα πάνω στην γκοφρέτα. Περιστασιακά τοποθετείτε την γκοφρέτα σε μια θερμαινόμενη πλάκα στους 65°C για να την κάνετε λιγότερο κολλώδη και να απλώνεται πιο εύκολα. Μην τοποθετείτε την γκοφρέτα απευθείας πάνω στην θερμαινόμενη πλάκα.
Το SU-8 κατανεμήθηκε ομοιόμορφα στο πλακίδιο με επίστρωση spin coating. Προγραμματίστε μια εισερχόμενη περιστροφή του SU-8 για 5-10 δευτερόλεπτα ώστε να διαδίδεται στις 500 rpm με επιτάχυνση 100 rpm/s. Ρυθμίστε την κύρια περιστροφή για σχηματισμό πάχους 200 µm στις 1.500 rpm ή επιτύχετε πάχος 250 µm (δημιουργώντας ύψος 500 µm για το ανώτερο στρώμα του εντέρου στο τσιπ· βλ. «Κρίσιμα βήματα» παρακάτω) ρυθμίζοντας σε επιτάχυνση 300 rpm/s για 30 δευτερόλεπτα στις 1.200 rpm.
Η κύρια ταχύτητα περιστροφής μπορεί να ρυθμιστεί ανάλογα με το στοχευόμενο πάχος του μοτίβου SU-8 στη γκοφρέτα πυριτίου.
Για την κατασκευή μοτίβων SU-8 ύψους 500 µm για το ανώτερο στρώμα του εντέρου στο τσιπ, τα βήματα επίστρωσης με περιδίνηση και μαλακού ψησίματος αυτού του κουτιού (βήματα 7 και 8) επαναλήφθηκαν διαδοχικά (βλ. βήμα 9) για να παραχθούν δύο στρώσεις SU-8 πάχους 250 µm, οι οποίες μπορούν να στρωθούν και να ενωθούν με έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία στο βήμα 12 αυτού του κουτιού, δημιουργώντας ένα στρώμα ύψους 500 µm.
Ψήστε σε μαλακό ψήσιμο τις γκοφρέτες με επικάλυψη SU-8 τοποθετώντας τες προσεκτικά σε μια θερμαινόμενη πλάκα στους 65 °C για 5 λεπτά, στη συνέχεια αλλάξτε τη ρύθμιση στους 95 °C και επωάστε τις για άλλα 40 λεπτά.
Για να επιτευχθεί ύψος 500 μm του μοτίβου SU-8 στο άνω μικροκανάλι, επαναλάβετε τα βήματα 7 και 8 για να δημιουργήσετε δύο στρώματα SU-8 πάχους 250 μm.
Χρησιμοποιώντας το UV Mask Aligner, εκτελέστε μια δοκιμή λάμπας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για να υπολογίσετε τον χρόνο έκθεσης της πλακέτας. (χρόνος έκθεσης, ms) = (δόση έκθεσης, mJ/cm2)/(ισχύς λάμπας, mW/cm2).
Αφού προσδιορίσετε τον χρόνο έκθεσης, τοποθετήστε τη φωτομάσκα στη θήκη μάσκας του ευθυγραμμιστή μάσκας UV και τοποθετήστε τη φωτομάσκα στο πλακίδιο με επικάλυψη SU-8.
Τοποθετήστε την εκτυπωμένη επιφάνεια της φωτομάσκας απευθείας στην πλευρά με την επικάλυψη SU-8 του πλακιδίου πυριτίου για να ελαχιστοποιήσετε τη διασπορά της υπεριώδους ακτινοβολίας.
Εκθέστε την επικαλυμμένη με SU-8 πλακέτα και τη φωτομάσκα κάθετα σε 260 mJ/cm2 υπεριώδους φωτός για τον προκαθορισμένο χρόνο έκθεσης (βλ. βήμα 10 αυτού του πλαισίου).
Μετά την έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία, οι γκοφρέτες πυριτίου με επικάλυψη SU-8 ψήθηκαν στους 65°C για 5 λεπτά και στους 95°C για 15 λεπτά σε κάθε θερμαινόμενη πλάκα για την κατασκευή μοτίβων με ύψος 200 μm. Επεκτείνετε τον χρόνο μετά το ψήσιμο στους 95°C σε 30 λεπτά για την κατασκευή μοτίβων με ύψος 500 μm.
Ο εμφιαλωτής χύνεται σε ένα γυάλινο πιάτο και η ψημένη γκοφρέτα τοποθετείται στο πιάτο. Ο όγκος του εμφιαλωτήρα SU-8 μπορεί να διαφέρει ανάλογα με το μέγεθος της γυάλινης πλάκας. Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε αρκετή ποσότητα εμφιαλωτήρα SU-8 για να αφαιρέσετε εντελώς τον μη εκτεθειμένο SU-8. Για παράδειγμα, όταν χρησιμοποιείτε γυάλινο πιάτο διαμέτρου 150 mm με χωρητικότητα 1 L, χρησιμοποιήστε ~300 mL εμφιαλωτήρα SU-8. Αναπτύξτε το καλούπι για 25 λεπτά με περιστασιακή απαλή περιστροφή.
Ξεπλύνετε το εμφανισμένο καλούπι με ~10 mL φρέσκου εμφανιστικού και στη συνέχεια με IPA ψεκάζοντας το διάλυμα χρησιμοποιώντας πιπέτα.
Τοποθετήστε το πλακίδιο σε ένα καθαριστικό πλάσματος και εκθέστε το σε πλάσμα οξυγόνου (ατμοσφαιρικό αέριο, πίεση-στόχος 1 × 10−5 Torr, ισχύς 125 W) για 1,5 λεπτό.
Τοποθετήστε την πλακέτα σε έναν ξηραντήρα κενού με μια γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα στο εσωτερικό της. Οι πλακέτες και οι αντικειμενοφόροι πλάκες μπορούν να τοποθετηθούν η μία δίπλα στην άλλη. Εάν ο ξηραντήρας κενού χωρίζεται σε πολλά στρώματα με μια πλάκα, τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στον κάτω θάλαμο και τις πλακέτες στον άνω θάλαμο. Ρίξτε 100 μL διαλύματος τριχλωρο(1H, 1H, 2H, 2H-υπερφθοροοκτυλο)σιλανίου σε μια γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα και εφαρμόστε κενό για σιλάνωση.
Αποψύξτε ένα φιαλίδιο κατεψυγμένων κυττάρων Caco-2 σε υδατόλουτρο στους 37°C και, στη συνέχεια, μεταφέρετε τα αποψυγμένα κύτταρα σε μια φιάλη T75 που περιέχει 15 mL προθερμασμένου μέσου Caco-2 στους 37°C.
Για να περάσουν τα κύτταρα Caco-2 σε ~90% συρροή, πρώτα θερμάνετε το μέσο Caco-2, το PBS και 0,25% θρυψίνη/1 mM EDTA σε υδατόλουτρο 37°C.
Αναρροφήστε το μέσο με αναρρόφηση κενού. Πλύνετε τα κύτταρα δύο φορές με 5 mL θερμού PBS επαναλαμβάνοντας την αναρρόφηση κενού και προσθέτοντας φρέσκο ​​PBS.