Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η εξέλιξη των μικροβιακών παρασίτων περιλαμβάνει μια εξουδετέρωση μεταξύ της φυσικής επιλογής, η οποία προκαλεί τη βελτίωση των παρασίτων, και της γενετικής μετατόπισης, η οποία προκαλεί τα παράσιτα να χάνουν γονίδια και να συσσωρεύουν επιβλαβείς μεταλλάξεις.Εδώ, για να κατανοήσουμε πώς συμβαίνει αυτή η αντίδραση στην κλίμακα ενός μεμονωμένου μακρομορίου, περιγράφουμε τη δομή κρυο-ΕΜ του ριβοσώματος του Encephalitozoon cuniculi, ενός ευκαρυωτικού οργανισμού με ένα από τα μικρότερα γονιδιώματα στη φύση.Η ακραία μείωση του rRNA στα ριβοσώματα του E. cuniculi συνοδεύεται από άνευ προηγουμένου δομικές αλλαγές, όπως η εξέλιξη προηγουμένως άγνωστων συγχωνευμένων συνδετών rRNA και rRNA χωρίς εξογκώματα.Επιπλέον, το ριβόσωμα E. cuniculi επέζησε της απώλειας θραυσμάτων rRNA και πρωτεϊνών αναπτύσσοντας την ικανότητα να χρησιμοποιεί μικρά μόρια ως δομικά μιμητικά αποικοδομημένων θραυσμάτων rRNA και πρωτεϊνών.Συνολικά, δείχνουμε ότι οι μοριακές δομές που πιστεύεται από καιρό ότι είναι μειωμένες, εκφυλισμένες και υπόκεινται σε εξουθενωτικές μεταλλάξεις έχουν έναν αριθμό αντισταθμιστικών μηχανισμών που τις κρατούν ενεργές παρά τις ακραίες μοριακές συσπάσεις.
Επειδή οι περισσότερες ομάδες μικροβιακών παρασίτων διαθέτουν μοναδικά μοριακά εργαλεία για να εκμεταλλευτούν τους ξενιστές τους, συχνά πρέπει να αναπτύξουμε διαφορετικά θεραπευτικά μέσα για διαφορετικές ομάδες παρασίτων1,2.Ωστόσο, νέα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ορισμένες πτυχές της εξέλιξης των παρασίτων είναι συγκλίνουσες και σε μεγάλο βαθμό προβλέψιμες, υποδεικνύοντας μια πιθανή βάση για ευρείες θεραπευτικές παρεμβάσεις σε μικροβιακά παράσιτα3,4,5,6,7,8,9.
Προηγούμενη εργασία έχει εντοπίσει μια κοινή εξελικτική τάση στα μικροβιακά παράσιτα που ονομάζεται μείωση γονιδιώματος ή αποσύνθεση γονιδιώματος10,11,12,13.Η τρέχουσα έρευνα δείχνει ότι όταν οι μικροοργανισμοί εγκαταλείπουν τον ελεύθερο τρόπο ζωής τους και γίνονται ενδοκυτταρικά παράσιτα (ή ενδοσυμβίωσης), το γονιδίωμά τους υφίσταται αργές αλλά εκπληκτικές μεταμορφώσεις για εκατομμύρια χρόνια9,11.Σε μια διαδικασία γνωστή ως αποσύνθεση του γονιδιώματος, τα μικροβιακά παράσιτα συσσωρεύουν επιβλαβείς μεταλλάξεις που μετατρέπουν πολλά προηγουμένως σημαντικά γονίδια σε ψευδογονίδια, οδηγώντας σε σταδιακή απώλεια γονιδίου και κατάρρευση μεταλλάξεων14,15.Αυτή η κατάρρευση μπορεί να καταστρέψει έως και το 95% των γονιδίων στους παλαιότερους ενδοκυτταρικούς οργανισμούς σε σύγκριση με τα στενά συγγενικά ελεύθερα ζωντανά είδη.Έτσι, η εξέλιξη των ενδοκυτταρικών παρασίτων είναι μια διελκυστίνδα μεταξύ δύο αντίθετων δυνάμεων: η Δαρβινική φυσική επιλογή, που οδηγεί στη βελτίωση των παρασίτων και η κατάρρευση του γονιδιώματος, ρίχνοντας τα παράσιτα στη λήθη.Το πώς το παράσιτο κατάφερε να αναδυθεί από αυτή τη διελκυστίνδα και να διατηρήσει τη δραστηριότητα της μοριακής του δομής παραμένει ασαφές.
Αν και ο μηχανισμός της αποσύνθεσης του γονιδιώματος δεν είναι πλήρως κατανοητός, φαίνεται να συμβαίνει κυρίως λόγω της συχνής γενετικής μετατόπισης.Επειδή τα παράσιτα ζουν σε μικρούς, ασεξουαλικούς και γενετικά περιορισμένους πληθυσμούς, δεν μπορούν να εξαλείψουν αποτελεσματικά τις επιβλαβείς μεταλλάξεις που συμβαίνουν μερικές φορές κατά την αντιγραφή του DNA.Αυτό οδηγεί σε μη αναστρέψιμη συσσώρευση επιβλαβών μεταλλάξεων και μείωση του γονιδιώματος του παρασίτου.Ως αποτέλεσμα, το παράσιτο όχι μόνο χάνει γονίδια που δεν είναι πλέον απαραίτητα για την επιβίωσή του στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον.Είναι η αδυναμία των πληθυσμών παρασίτων να εξαλείψουν αποτελεσματικά τις σποραδικές επιβλαβείς μεταλλάξεις που προκαλεί τη συσσώρευση αυτών των μεταλλάξεων σε όλο το γονιδίωμα, συμπεριλαμβανομένων των πιο σημαντικών γονιδίων τους.
Μεγάλο μέρος της τρέχουσας κατανόησής μας για τη μείωση του γονιδιώματος βασίζεται αποκλειστικά σε συγκρίσεις αλληλουχιών γονιδιώματος, με λιγότερη προσοχή στις αλλαγές στα πραγματικά μόρια που εκτελούν λειτουργίες καθαριότητας και χρησιμεύουν ως πιθανοί στόχοι φαρμάκων.Συγκριτικές μελέτες έχουν δείξει ότι το βάρος των επιβλαβών ενδοκυτταρικών μικροβιακών μεταλλάξεων φαίνεται να προδιαθέτει τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα να αναδιπλώνονται και να συσσωρεύονται λανθασμένα, καθιστώντας τα πιο εξαρτώμενα από τον συνοδό και υπερευαίσθητα στη θερμότητα19,20,21,22,23.Επιπλέον, διάφορα παράσιτα -η ανεξάρτητη εξέλιξη που μερικές φορές χωρίζεται μέχρι και 2,5 δισεκατομμύρια χρόνια- βίωσαν παρόμοια απώλεια κέντρων ποιοτικού ελέγχου στη σύνθεση πρωτεϊνών5,6 και στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA24.Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την επίδραση του ενδοκυτταρικού τρόπου ζωής σε όλες τις άλλες ιδιότητες των κυτταρικών μακρομορίων, συμπεριλαμβανομένης της μοριακής προσαρμογής σε ένα αυξανόμενο βάρος επιβλαβών μεταλλάξεων.
Σε αυτή την εργασία, προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα την εξέλιξη των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων των ενδοκυτταρικών μικροοργανισμών, προσδιορίσαμε τη δομή των ριβοσωμάτων του ενδοκυτταρικού παρασίτου Encephalitozoon cuniculi.Το E. cuniculi είναι ένας μύκητας οργανισμός που ανήκει σε μια ομάδα παρασιτικών μικροσποριδίων που έχουν ασυνήθιστα μικρά ευκαρυωτικά γονιδιώματα και επομένως χρησιμοποιούνται ως πρότυποι οργανισμοί για τη μελέτη της αποσύνθεσης του γονιδιώματος25,26,27,28,29,30.Πρόσφατα, η δομή του κρυο-ΕΜ ριβοσώματος προσδιορίστηκε για μέτρια μειωμένα γονιδιώματα των Microsporidia, Paranosema locustae και Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb γονιδίωμα).Αυτές οι δομές υποδηλώνουν ότι κάποια απώλεια ενίσχυσης rRNA αντισταθμίζεται από την ανάπτυξη νέων επαφών μεταξύ γειτονικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών ή την απόκτηση νέων msL131,32 ριβοσωμικών πρωτεϊνών.Τα είδη Encephalitozoon (γονιδίωμα ~2,5 εκατομμύρια bp), μαζί με τον πλησιέστερο συγγενή τους Ordospora, επιδεικνύουν τον απόλυτο βαθμό μείωσης του γονιδιώματος στους ευκαρυώτες – έχουν λιγότερα από 2000 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και αναμένεται ότι τα ριβοσώματά τους δεν στερούνται μόνο θραύσματα επέκτασης rRNA από τα θραύσματα πρωτεΐνης ribosomes ribosomal. s λόγω της έλλειψης ομολόγων τους στο γονιδίωμα του E. cuniculi26,27,28.Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το ριβόσωμα E. cuniculi μπορεί να αποκαλύψει άγνωστες προηγουμένως στρατηγικές για μοριακή προσαρμογή στη διάσπαση του γονιδιώματος.
Η κρυο-ΕΜ δομή μας αντιπροσωπεύει το μικρότερο ευκαρυωτικό κυτταροπλασματικό ριβόσωμα που πρέπει να χαρακτηριστεί και παρέχει μια εικόνα για το πώς ο τελικός βαθμός μείωσης του γονιδιώματος επηρεάζει τη δομή, τη συναρμολόγηση και την εξέλιξη του μοριακού μηχανισμού που είναι ενσωματωμένο στο κύτταρο.Βρήκαμε ότι το ριβόσωμα E. cuniculi παραβιάζει πολλές από τις ευρέως διατηρημένες αρχές της αναδίπλωσης του RNA και της συναρμολόγησης ριβοσώματος και ανακαλύψαμε μια νέα, προηγουμένως άγνωστη ριβοσωμική πρωτεΐνη.Εντελώς απροσδόκητα, δείχνουμε ότι τα ριβοσώματα των μικροσποριδίων έχουν εξελίξει την ικανότητα να δεσμεύουν μικρά μόρια και υποθέτουμε ότι οι περικοπές σε rRNA και πρωτεΐνες προκαλούν εξελικτικές καινοτομίες που μπορεί τελικά να προσδώσουν χρήσιμες ιδιότητες στο ριβόσωμα.
Για να βελτιώσουμε την κατανόησή μας για την εξέλιξη των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων σε ενδοκυτταρικούς οργανισμούς, αποφασίσαμε να απομονώσουμε σπόρια E. cuniculi από καλλιέργειες μολυσμένων κυττάρων θηλαστικών προκειμένου να καθαρίσουμε τα ριβοσώματα τους και να καθορίσουμε τη δομή αυτών των ριβοσωμάτων.Είναι δύσκολο να ληφθεί ένας μεγάλος αριθμός παρασιτικών μικροσποριδίων επειδή τα μικροσπορίδια δεν μπορούν να καλλιεργηθούν σε θρεπτικό μέσο.Αντίθετα, αναπτύσσονται και αναπαράγονται μόνο μέσα στο κύτταρο ξενιστή.Επομένως, για να λάβουμε βιομάζα E. cuniculi για καθαρισμό ριβοσώματος, μολύναμε την κυτταρική σειρά νεφρού θηλαστικού RK13 με σπόρια E. cuniculi και καλλιεργήσαμε αυτά τα μολυσμένα κύτταρα για αρκετές εβδομάδες για να επιτρέψουμε στο E. cuniculi να αναπτυχθεί και να πολλαπλασιαστεί.Χρησιμοποιώντας μια μολυσμένη κυτταρική μονοστιβάδα περίπου μισού τετραγωνικού μέτρου, μπορέσαμε να καθαρίσουμε περίπου 300 mg σπορίων Microsporidia και να τα χρησιμοποιήσουμε για την απομόνωση ριβοσωμάτων.Στη συνέχεια διακόψαμε τα καθαρισμένα σπόρια με γυάλινες χάντρες και απομονώσαμε τα ακατέργαστα ριβοσώματα χρησιμοποιώντας σταδιακή κλασμάτωση πολυαιθυλενογλυκόλης των προϊόντων λύσης.Αυτό μας επέτρεψε να λάβουμε περίπου 300 μg ακατέργαστων ριβοσωμάτων E. cuniculi για δομική ανάλυση.
Στη συνέχεια, συλλέξαμε εικόνες κρυο-ΕΜ χρησιμοποιώντας τα δείγματα ριβοσώματος που προέκυψαν και επεξεργαστήκαμε αυτές τις εικόνες χρησιμοποιώντας μάσκες που αντιστοιχούν στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα, την κεφαλή μικρής υπομονάδας και τη μικρή υπομονάδα.Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, συλλέξαμε εικόνες περίπου 108.000 ριβοσωμικών σωματιδίων και υπολογίσαμε εικόνες κρυο-EM με ανάλυση 2,7 Å (Συμπληρωματικά Σχήματα 1-3).Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε εικόνες cryoEM για να μοντελοποιήσουμε rRNA, ριβοσωμική πρωτεΐνη και παράγοντα αδρανοποίησης Mdf1 που σχετίζεται με ριβοσώματα E. cuniculi (Εικ. 1a, b).
μια Δομή του ριβοσώματος E. cuniculi σε σύμπλοκο με τον παράγοντα αδρανοποίησης Mdf1 (pdb id 7QEP).β Χάρτης του παράγοντα αδρανοποίησης Mdf1 που σχετίζεται με το ριβόσωμα E. cuniculi.c Χάρτης δευτερογενούς δομής που συγκρίνει το ανακτημένο rRNA σε είδη μικροσποριδών με γνωστές ριβοσωμικές δομές.Τα πάνελ δείχνουν τη θέση των ενισχυμένων θραυσμάτων rRNA (ES) και των ενεργών θέσεων του ριβοσώματος, συμπεριλαμβανομένης της θέσης αποκωδικοποίησης (DC), του βρόχου σαρκινισίνης (SRL) και του κέντρου πεπτιδυλ τρανσφεράσης (PTC).δ Η πυκνότητα ηλεκτρονίων που αντιστοιχεί στο κέντρο της πεπτιδυλ τρανσφεράσης του ριβοσώματος E. cuniculi υποδηλώνει ότι αυτή η καταλυτική θέση έχει την ίδια δομή στο παράσιτο E. cuniculi και στους ξενιστές του, συμπεριλαμβανομένου του H. sapiens.e, f Η αντίστοιχη πυκνότητα ηλεκτρονίων του κέντρου αποκωδικοποίησης (e) και η σχηματική δομή του κέντρου αποκωδικοποίησης (f) υποδεικνύουν ότι το E. cuniculi έχει υπολείμματα U1491 αντί για A1491 (αρίθμηση E. coli) σε πολλούς άλλους ευκαρυώτες.Αυτή η αλλαγή υποδηλώνει ότι το E. cuniculi μπορεί να είναι ευαίσθητο στα αντιβιοτικά που στοχεύουν αυτή τη δραστική περιοχή.
Σε αντίθεση με τις προηγουμένως καθιερωμένες δομές των ριβοσωμάτων V. necatrix και P. locustae (και οι δύο δομές αντιπροσωπεύουν την ίδια οικογένεια microsporidia Nosematidae και είναι πολύ παρόμοια μεταξύ τους), τα ριβοσώματα 31,32 E. cuniculi υφίστανται πολυάριθμες διαδικασίες κατακερματισμού rRNA και πρωτεΐνης.Περαιτέρω μετουσίωση (Συμπληρωματικά Σχήματα 4-6).Στο rRNA, οι πιο εντυπωσιακές αλλαγές περιελάμβαναν πλήρη απώλεια του ενισχυμένου θραύσματος 25S rRNA ES12L και μερικό εκφυλισμό των ελίκων h39, h41 και H18 (Εικ. 1c, Συμπληρωματικό Σχ. 4).Μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, οι πιο εντυπωσιακές αλλαγές περιελάμβαναν πλήρη απώλεια της πρωτεΐνης eS30 και βράχυνση των πρωτεϊνών eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 και eS7 (Συμπληρωματικές Εικόνες 4, 5).
Έτσι, η ακραία μείωση των γονιδιωμάτων των ειδών Encephalotozoon/Ordospora αντικατοπτρίζεται στη δομή των ριβοσωμάτων τους: Τα ριβοσώματα E. cuniculi υφίστανται την πιο δραματική απώλεια περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη σε ευκαρυωτικά κυτταροπλασματικά ριβοσώματα που υπόκεινται σε δομικό χαρακτηρισμό, και δεν έχουν καν αυτά τα τμήματα rRNA και πρωτεϊνικών τμημάτων όχι μόνο σε τμήματα της ζωής.Η δομή του ριβοσώματος E. cuniculi παρέχει το πρώτο μοριακό μοντέλο για αυτές τις αλλαγές και αποκαλύπτει εξελικτικά γεγονότα που έχουν παραβλεφθεί τόσο από τη συγκριτική γονιδιωματική όσο και από τις μελέτες της ενδοκυτταρικής βιομοριακής δομής (Συμπληρωματικό Σχήμα 7).Παρακάτω, περιγράφουμε καθένα από αυτά τα γεγονότα μαζί με την πιθανή εξελικτική προέλευσή τους και τον πιθανό αντίκτυπό τους στη λειτουργία του ριβοσώματος.
Στη συνέχεια βρήκαμε ότι, εκτός από μεγάλες περικοπές rRNA, τα ριβοσώματα E. cuniculi έχουν παραλλαγές rRNA σε μία από τις ενεργές τους θέσεις.Αν και το κέντρο της πεπτιδυλ τρανσφεράσης του ριβοσώματος Ε. cuniculi έχει την ίδια δομή με άλλα ευκαρυωτικά ριβοσώματα (Εικ. 1d), το κέντρο αποκωδικοποίησης διαφέρει λόγω της διακύμανσης της αλληλουχίας στο νουκλεοτίδιο 1491 (αρίθμηση Ε. coli, Σχ. 1e, f).Αυτή η παρατήρηση είναι σημαντική επειδή η θέση αποκωδικοποίησης των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων τυπικά περιέχει υπολείμματα G1408 και A1491 σε σύγκριση με τα υπολείμματα βακτηριακού τύπου A1408 και G1491.Αυτή η παραλλαγή βασίζεται στη διαφορετική ευαισθησία των βακτηριακών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων στην οικογένεια των αμινογλυκοσιδών των ριβοσωμικών αντιβιοτικών και σε άλλα μικρά μόρια που στοχεύουν τη θέση αποκωδικοποίησης.Στη θέση αποκωδικοποίησης του ριβοσώματος E. cuniculi, το υπόλειμμα A1491 αντικαταστάθηκε με U1491, δημιουργώντας ενδεχομένως μια μοναδική διεπαφή δέσμευσης για μικρά μόρια που στοχεύουν αυτήν την ενεργή θέση.Η ίδια παραλλαγή A14901 υπάρχει επίσης σε άλλα μικροσπορίδια όπως τα P. locustae και V. necatrix, υποδηλώνοντας ότι είναι ευρέως διαδεδομένη μεταξύ των ειδών μικροσποριδίων (Εικ. 1στ).
Επειδή τα δείγματά μας ριβοσώματος E. cuniculi απομονώθηκαν από μεταβολικά ανενεργά σπόρια, δοκιμάσαμε τον κρυο-ΕΜ χάρτη του E. cuniculi για σύνδεση ριβοσώματος που περιγράφηκε προηγουμένως υπό συνθήκες στρες ή ασιτίας.Παράγοντες αδρανοποίησης 31,32,36,37, 38. Αντιστοιχίσαμε την προηγουμένως καθιερωμένη δομή του ριβοσώματος σε χειμερία νάρκη με τον χάρτη κρυο-ΕΜ του ριβοσώματος E. cuniculi.Για τη σύνδεση, χρησιμοποιήθηκαν ριβοσώματα S. cerevisiae σε σύμπλοκο με παράγοντα αδρανοποίησης Stm138, ριβοσώματα ακρίδας σε σύμπλοκο με παράγοντα Lso232 και ριβοσώματα V. necatrix σε σύμπλοκο με παράγοντες Mdf1 και Mdf231.Ταυτόχρονα, βρήκαμε την πυκνότητα κρυο-ΕΜ που αντιστοιχεί στον παράγοντα ηρεμίας Mdf1.Παρόμοια με τη σύνδεση του Mdf1 στο ριβόσωμα V. necatrix, το Mdf1 συνδέεται επίσης με το ριβόσωμα E. cuniculi, όπου μπλοκάρει τη θέση Ε του ριβοσώματος, βοηθώντας πιθανώς στη διάθεση ριβοσωμάτων όταν τα σπόρια του παρασίτου γίνονται μεταβολικά ανενεργά κατά την αδρανοποίηση του σώματος (Εικόνα 2).).
Το Mdf1 μπλοκάρει τη θέση Ε του ριβοσώματος, η οποία φαίνεται να βοηθά στην αδρανοποίηση του ριβοσώματος όταν τα σπόρια των παρασίτων γίνονται μεταβολικά ανενεργά.Στη δομή του ριβοσώματος E. cuniculi, βρήκαμε ότι το Mdf1 σχηματίζει μια προηγουμένως άγνωστη επαφή με το στέλεχος του ριβοσώματος L1, το τμήμα του ριβοσώματος που διευκολύνει την απελευθέρωση αποακυλιωμένου tRNA από το ριβόσωμα κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνικής σύνθεσης.Αυτές οι επαφές υποδηλώνουν ότι το Mdf1 διαχωρίζεται από το ριβόσωμα χρησιμοποιώντας τον ίδιο μηχανισμό με το αποακετυλιωμένο tRNA, παρέχοντας μια πιθανή εξήγηση για το πώς το ριβόσωμα αφαιρεί το Mdf1 για να ενεργοποιήσει ξανά την πρωτεϊνική σύνθεση.
Ωστόσο, η δομή μας αποκάλυψε μια άγνωστη επαφή μεταξύ του Mdf1 και του σκέλους του ριβοσώματος L1 (το τμήμα του ριβοσώματος που βοηθά στην απελευθέρωση αποακυλιωμένου tRNA από το ριβόσωμα κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνικής σύνθεσης).Συγκεκριμένα, το Mdf1 χρησιμοποιεί τις ίδιες επαφές με το τμήμα του αγκώνα του αποακυλιωμένου μορίου tRNA (Εικ. 2).Αυτή η προηγουμένως άγνωστη μοριακή μοντελοποίηση έδειξε ότι το Mdf1 διαχωρίζεται από το ριβόσωμα χρησιμοποιώντας τον ίδιο μηχανισμό με το αποακετυλιωμένο tRNA, το οποίο εξηγεί πώς το ριβόσωμα αφαιρεί αυτόν τον παράγοντα αδρανοποίησης για να ενεργοποιήσει ξανά την πρωτεϊνική σύνθεση.
Κατά την κατασκευή του μοντέλου rRNA, διαπιστώσαμε ότι το ριβόσωμα E. cuniculi έχει ασυνήθιστα διπλωμένα θραύσματα rRNA, τα οποία ονομάσαμε συγχωνευμένο rRNA (Εικ. 3).Στα ριβοσώματα που εκτείνονται στους τρεις τομείς της ζωής, το rRNA διπλώνεται σε δομές στις οποίες οι περισσότερες βάσεις rRNA είτε ζευγαρώνουν και διπλώνουν μεταξύ τους είτε αλληλεπιδρούν με ριβοσωμικές πρωτεΐνες38,39,40.Ωστόσο, στα ριβοσώματα E. cuniculi, τα rRNA φαίνεται να παραβιάζουν αυτήν την αρχή αναδίπλωσης μετατρέποντας ορισμένες από τις έλικες τους σε μη αναδιπλωμένες περιοχές rRNA.
Δομή της έλικας H18 25S rRNA σε S. cerevisiae, V. necatrix και E. cuniculi.Τυπικά, σε ριβοσώματα που εκτείνονται στους τρεις τομείς ζωής, αυτός ο συνδέτης περιελίσσεται σε μια έλικα RNA που περιέχει 24 έως 34 υπολείμματα.Σε Microsporidia, αντίθετα, αυτός ο συνδέτης rRNA μειώνεται σταδιακά σε δύο μονόκλωνους συνδέτες πλούσιους σε ουριδίνη που περιέχουν μόνο 12 υπολείμματα.Τα περισσότερα από αυτά τα υπολείμματα εκτίθενται σε διαλύτες.Το σχήμα δείχνει ότι τα παρασιτικά μικροσπορίδια φαίνεται να παραβιάζουν τις γενικές αρχές της αναδίπλωσης rRNA, όπου οι βάσεις rRNA συνήθως συνδέονται με άλλες βάσεις ή εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις rRNA-πρωτεΐνης.Στα μικροσπορίδια, ορισμένα θραύσματα rRNA παίρνουν μια δυσμενή πτυχή, στην οποία η προηγούμενη έλικα rRNA γίνεται ένα μονόκλωνο θραύσμα επιμηκυμένο σχεδόν σε ευθεία γραμμή.Η παρουσία αυτών των ασυνήθιστων περιοχών επιτρέπει στα microsporidia rRNA να δεσμεύουν μακρινά θραύσματα rRNA χρησιμοποιώντας έναν ελάχιστο αριθμό βάσεων RNA.
Το πιο εντυπωσιακό παράδειγμα αυτής της εξελικτικής μετάβασης μπορεί να παρατηρηθεί στην έλικα H18 25S rRNA (Εικ. 3).Σε είδη από E. coli έως τον άνθρωπο, οι βάσεις αυτής της έλικας rRNA περιέχουν 24-32 νουκλεοτίδια, σχηματίζοντας μια ελαφρώς ακανόνιστη έλικα.Σε προηγουμένως αναγνωρισμένες ριβοσωμικές δομές από V. necatrix και P. locustae,31,32 οι βάσεις της έλικας Η18 είναι μερικώς αποτυλιγμένες, αλλά το ζεύγος βάσεων νουκλεοτιδίων διατηρείται.Ωστόσο, στο E. cuniculi αυτό το θραύσμα rRNA γίνεται οι βραχύτεροι συνδετήρες 228UUUGU232 και 301UUUUUUUUUU307.Σε αντίθεση με τα τυπικά θραύσματα rRNA, αυτοί οι πλούσιοι σε ουριδίνη συνδέτες δεν περιελίσσονται ούτε κάνουν εκτεταμένη επαφή με ριβοσωμικές πρωτεΐνες.Αντίθετα, υιοθετούν δομές ανοικτές σε διαλύτη και πλήρως ξεδιπλωμένες δομές στις οποίες οι κλώνοι rRNA εκτείνονται σχεδόν ευθεία.Αυτή η τεντωμένη διαμόρφωση εξηγεί πώς το E. cuniculi χρησιμοποιεί μόνο 12 βάσεις RNA για να καλύψει το κενό 33 Α μεταξύ των ελίκων H16 και H18 rRNA, ενώ άλλα είδη απαιτούν τουλάχιστον διπλάσιες βάσεις rRNA για να γεμίσουν το κενό.
Έτσι, μπορούμε να αποδείξουμε ότι, μέσω της ενεργειακά δυσμενούς αναδίπλωσης, τα παρασιτικά μικροσπορίδια έχουν αναπτύξει μια στρατηγική για να συστέλλουν ακόμη και εκείνα τα τμήματα rRNA που παραμένουν ευρέως διατηρημένα σε όλα τα είδη στους τρεις τομείς της ζωής.Προφανώς, με τη συσσώρευση μεταλλάξεων που μετασχηματίζουν τις έλικες rRNA σε βραχείς συνδέτες πολυ-U, το E. cuniculi μπορεί να σχηματίσει ασυνήθιστα θραύσματα rRNA που περιέχουν όσο το δυνατόν λιγότερα νουκλεοτίδια για την απολίνωση των απομακρυσμένων θραυσμάτων rRNA.Αυτό βοηθά να εξηγηθεί πώς τα μικροσπορίδια πέτυχαν μια δραματική μείωση στη βασική μοριακή τους δομή χωρίς να χάσουν τη δομική και λειτουργική τους ακεραιότητα.
Ένα άλλο ασυνήθιστο χαρακτηριστικό του E. cuniculi rRNA είναι η εμφάνιση του rRNA χωρίς πάχυνση (Εικ. 4).Τα εξογκώματα είναι νουκλεοτίδια χωρίς ζεύγη βάσεων που συστρέφονται έξω από την έλικα του RNA αντί να κρύβονται σε αυτήν.Οι περισσότερες προεξοχές rRNA δρουν ως μοριακά συγκολλητικά, βοηθώντας στη σύνδεση γειτονικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών ή άλλων θραυσμάτων rRNA.Ορισμένα από τα εξογκώματα λειτουργούν ως μεντεσέδες, επιτρέποντας στην έλικα rRNA να κάμπτεται και να διπλώνει βέλτιστα για παραγωγική πρωτεϊνοσύνθεση 41 .
a Μια προεξοχή rRNA (αρίθμηση S. cerevisiae) απουσιάζει από τη δομή του ριβοσώματος E. cuniculi, αλλά υπάρχει στους περισσότερους άλλους ευκαρυώτες b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens και E. cuniculi εσωτερικά ριβοσώματα.Τα παράσιτα στερούνται πολλά από τα αρχαία, εξαιρετικά διατηρημένα εξογκώματα rRNA.Αυτές οι πυκνώσεις σταθεροποιούν τη δομή του ριβοσώματος.Επομένως, η απουσία τους στα μικροσπορίδια υποδηλώνει μειωμένη σταθερότητα της αναδίπλωσης του rRNA στα παράσιτα μικροσποριδίων.Η σύγκριση με τα στελέχη P (βλάστες L7/L12 στα βακτήρια) δείχνει ότι η απώλεια εξογκωμάτων rRNA μερικές φορές συμπίπτει με την εμφάνιση νέων εξογκωμάτων δίπλα στα χαμένα εξογκώματα.Η έλικα H42 στο 23S/28S rRNA έχει μια αρχαία διόγκωση (U1206 στο Saccharomyces cerevisiae) που εκτιμάται ότι είναι τουλάχιστον 3,5 δισεκατομμυρίων ετών λόγω της προστασίας της σε τρεις τομείς της ζωής.Στα μικροσπορίδια, αυτό το εξόγκωμα εξαλείφεται.Ωστόσο, ένα νέο εξόγκωμα εμφανίστηκε δίπλα στο χαμένο εξόγκωμα (A1306 στο E. cuniculi).
Εντυπωσιακά, διαπιστώσαμε ότι τα ριβοσώματα E. cuniculi στερούνται των περισσότερων διογκώσεων rRNA που βρίσκονται σε άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένων περισσότερων από 30 διογκώσεων που διατηρούνται σε άλλους ευκαρυώτες (Εικ. 4α).Αυτή η απώλεια εξαλείφει πολλές επαφές μεταξύ ριβοσωμικών υπομονάδων και γειτονικών έλικων rRNA, μερικές φορές δημιουργώντας μεγάλα κοίλα κενά μέσα στο ριβόσωμα, καθιστώντας το ριβόσωμα E. cuniculi πιο πορώδες σε σύγκριση με πιο παραδοσιακά ριβοσώματα (Εικ. 4β).Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι τα περισσότερα από αυτά τα εξογκώματα χάθηκαν επίσης στις προηγουμένως αναγνωρισμένες δομές ριβοσώματος V. necatrix και P. locustae, οι οποίες παραβλέφθηκαν από προηγούμενες δομικές αναλύσεις31,32.
Μερικές φορές η απώλεια διογκώσεων rRNA συνοδεύεται από την ανάπτυξη νέων διογκώσεων δίπλα στο χαμένο εξόγκωμα.Για παράδειγμα, το ριβοσωμικό στέλεχος P περιέχει ένα εξόγκωμα U1208 (στο Saccharomyces cerevisiae) που επέζησε από το E. coli στους ανθρώπους και επομένως υπολογίζεται ότι είναι 3,5 δισεκατομμυρίων ετών.Κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης, αυτή η διόγκωση βοηθά το στέλεχος P να μετακινηθεί μεταξύ ανοικτών και κλειστών διαμορφώσεων, έτσι ώστε το ριβόσωμα να μπορεί να στρατολογήσει παράγοντες μετάφρασης και να τους παραδώσει στην ενεργή θέση.Στα ριβοσώματα E. cuniculi, αυτή η πάχυνση απουσιάζει.Ωστόσο, μια νέα πάχυνση (G883) που βρίσκεται μόνο σε τρία ζεύγη βάσεων μπορεί να συμβάλει στην αποκατάσταση της βέλτιστης ευκαμψίας του στελέχους P (Εικ. 4γ).
Τα δεδομένα μας για το rRNA χωρίς εξογκώματα υποδηλώνουν ότι η ελαχιστοποίηση του rRNA δεν περιορίζεται στην απώλεια στοιχείων rRNA στην επιφάνεια του ριβοσώματος, αλλά μπορεί επίσης να εμπλέκει τον πυρήνα του ριβοσώματος, δημιουργώντας ένα ειδικό για παράσιτο μοριακό ελάττωμα που δεν έχει περιγραφεί σε κύτταρα που ζουν ελεύθερα.παρατηρούνται ζωντανά είδη.
Μετά τη μοντελοποίηση κανονικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών και rRNA, διαπιστώσαμε ότι τα συμβατικά ριβοσωματικά συστατικά δεν μπορούν να εξηγήσουν τα τρία μέρη της κρυο-ΕΜ εικόνας.Δύο από αυτά τα θραύσματα είναι μικρά μόρια σε μέγεθος (Εικ. 5, Συμπληρωματικό Σχ. 8).Το πρώτο τμήμα τοποθετείται μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών uL15 και eL18 σε μια θέση που συνήθως καταλαμβάνεται από το C-άκρο του eL18, το οποίο συντομεύεται στο E. cuniculi.Αν και δεν μπορούμε να προσδιορίσουμε την ταυτότητα αυτού του μορίου, το μέγεθος και το σχήμα αυτού του νησιού πυκνότητας εξηγείται καλά από την παρουσία μορίων σπερμιδίνης.Η σύνδεσή του με το ριβόσωμα σταθεροποιείται από μεταλλάξεις ειδικών για μικροσπορίδια στις πρωτεΐνες uL15 (Asp51 και Arg56), οι οποίες φαίνεται να αυξάνουν τη συγγένεια του ριβοσώματος για αυτό το μικρό μόριο, καθώς επιτρέπουν στο uL15 να τυλίξει το μικρό μόριο σε μια ριβοσωμική δομή.Συμπληρωματικό Σχήμα 2).8, πρόσθετα δεδομένα 1, 2).
Απεικόνιση Cryo-EM που δείχνει την παρουσία νουκλεοτιδίων έξω από τη ριβόζη συνδεδεμένη με το ριβόσωμα E. cuniculi.Στο ριβόσωμα E. cuniculi, αυτό το νουκλεοτίδιο καταλαμβάνει την ίδια θέση με το νουκλεοτίδιο 25S rRNA A3186 (αρίθμηση Saccharomyces cerevisiae) στα περισσότερα άλλα ευκαρυωτικά ριβοσώματα.β Στη ριβοσωμική δομή του E. cuniculi, αυτό το νουκλεοτίδιο βρίσκεται μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών uL9 και eL20, σταθεροποιώντας έτσι την επαφή μεταξύ των δύο πρωτεϊνών.Ανάλυση διατήρησης αλληλουχίας cd eL20 μεταξύ ειδών μικροσποριδίων.Το φυλογενετικό δέντρο του είδους Microsporidia (c) και η ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών της πρωτεΐνης eL20 (d) δείχνουν ότι τα υπολείμματα δέσμευσης νουκλεοτιδίων F170 και K172 διατηρούνται στα περισσότερα τυπικά Microsporidia, με εξαίρεση το S. lophii, με εξαίρεση τα πρώιμα διακλαδισμένα Microsporidia.e Αυτό το σχήμα δείχνει ότι τα υπολείμματα δέσμευσης νουκλεοτιδίων F170 και K172 υπάρχουν μόνο στο eL20 του υψηλά μειωμένου γονιδιώματος των μικροσποριδίων, αλλά όχι σε άλλους ευκαρυώτες.Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα ριβοσώματα Microsporidian έχουν αναπτύξει μια θέση δέσμευσης νουκλεοτιδίων που φαίνεται να δεσμεύει μόρια AMP και τα χρησιμοποιεί για να σταθεροποιήσει τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης στη ριβοσωμική δομή.Η υψηλή διατήρηση αυτής της θέσης δέσμευσης στα Microsporidia και η απουσία της σε άλλους ευκαρυώτες υποδηλώνει ότι αυτή η θέση μπορεί να παρέχει ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα επιβίωσης για Microsporidia.Έτσι, ο θύλακος δέσμευσης νουκλεοτιδίων στο ριβόσωμα των μικροσποριδίων δεν φαίνεται να είναι ένα εκφυλισμένο χαρακτηριστικό ή τελική μορφή αποικοδόμησης rRNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως, αλλά μάλλον μια χρήσιμη εξελικτική καινοτομία που επιτρέπει στο ριβόσωμα των μικροσποριδίων να δεσμεύει απευθείας μικρά μόρια, χρησιμοποιώντας τα ως μοριακά δομικά στοιχεία.δομικά στοιχεία για ριβοσώματα.Αυτή η ανακάλυψη κάνει το ριβόσωμα των μικροσποριδίων το μόνο ριβόσωμα που είναι γνωστό ότι χρησιμοποιεί ένα μόνο νουκλεοτίδιο ως δομικό δομικό στοιχείο του.f Υποθετική εξελικτική οδός που προέρχεται από τη δέσμευση νουκλεοτιδίων.
Η δεύτερη πυκνότητα χαμηλού μοριακού βάρους βρίσκεται στη διεπιφάνεια μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών uL9 και eL30 (Εικ. 5a).Αυτή η διεπαφή περιγράφηκε προηγουμένως στη δομή του ριβοσώματος Saccharomyces cerevisiae ως θέση δέσμευσης για το νουκλεοτίδιο 25S του rRNA A3186 (μέρος της επέκτασης rRNA ES39L)38.Φάνηκε ότι σε εκφυλισμένα ριβοσώματα P. locustae ES39L, αυτή η διεπιφάνεια δεσμεύει ένα άγνωστο μεμονωμένο νουκλεοτίδιο 31 και θεωρείται ότι αυτό το νουκλεοτίδιο είναι μια μειωμένη τελική μορφή rRNA, στην οποία το μήκος του rRNA είναι ~130-230 βάσεις.Το ES39L ανάγεται σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο 32.43.Οι κρυο-ΕΜ εικόνες μας υποστηρίζουν την ιδέα ότι η πυκνότητα μπορεί να εξηγηθεί από τα νουκλεοτίδια.Ωστόσο, η υψηλότερη ανάλυση της δομής μας έδειξε ότι αυτό το νουκλεοτίδιο είναι ένα εξωριβοσωματικό μόριο, πιθανώς AMP (Εικ. 5a, b).
Στη συνέχεια ρωτήσαμε εάν η θέση δέσμευσης νουκλεοτιδίων εμφανίστηκε στο ριβόσωμα του E. cuniculi ή αν υπήρχε προηγουμένως.Δεδομένου ότι η δέσμευση νουκλεοτιδίων μεσολαβείται κυρίως από τα υπολείμματα Phe170 και Lys172 στη ριβοσωμική πρωτεΐνη eL30, αξιολογήσαμε τη διατήρηση αυτών των υπολειμμάτων σε 4396 αντιπροσωπευτικούς ευκαρυώτες.Όπως και στην περίπτωση του uL15 παραπάνω, βρήκαμε ότι τα υπολείμματα Phe170 και Lys172 διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό μόνο σε τυπικά Μικροσπορίδια, αλλά απουσιάζουν σε άλλους ευκαρυώτες, συμπεριλαμβανομένων των άτυπων Microsporidia Mitosporidium και Amphiamblys, στα οποία το θραύσμα ES39L rRNA δεν είναι ανηγμένο (Σχ. 454,6).-μι).
Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι το E. cuniculi και πιθανώς άλλα κανονικά μικροσπορίδια έχουν αναπτύξει την ικανότητα να συλλαμβάνουν αποτελεσματικά μεγάλους αριθμούς μικρών μεταβολιτών στη δομή του ριβοσώματος για να αντισταθμίσουν τη μείωση στα επίπεδα rRNA και πρωτεΐνης.Με αυτόν τον τρόπο, έχουν αναπτύξει μια μοναδική ικανότητα να δεσμεύουν νουκλεοτίδια έξω από το ριβόσωμα, δείχνοντας ότι οι παρασιτικές μοριακές δομές αντισταθμίζουν συλλαμβάνοντας άφθονους μικρούς μεταβολίτες και χρησιμοποιώντας τους ως δομικά μιμητικά αποικοδομημένων τμημάτων RNA και πρωτεΐνης..
Το τρίτο μη προσομοιωμένο τμήμα του κρυο-ΕΜ χάρτη μας, που βρέθηκε στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα.Η σχετικά υψηλή ανάλυση (2,6 Α) του χάρτη μας υποδηλώνει ότι αυτή η πυκνότητα ανήκει σε πρωτεΐνες με μοναδικούς συνδυασμούς υπολειμμάτων μεγάλης πλευρικής αλυσίδας, γεγονός που μας επέτρεψε να αναγνωρίσουμε αυτή την πυκνότητα ως μια προηγουμένως άγνωστη ριβοσωμική πρωτεΐνη που ονομαζόταν msL2 (Μικροσπορίδια-ειδική πρωτεΐνη L2) (μέθοδοι, σχήμα 6).Η αναζήτησή μας στην ομολογία έδειξε ότι το msL2 διατηρείται στην κατηγορία Microsporidia του γένους Encephaliter και Orosporidium, αλλά απουσιάζει σε άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένων άλλων Microsporidia.Στη ριβοσωματική δομή, το msL2 καταλαμβάνει ένα κενό που σχηματίζεται από την απώλεια του εκτεταμένου ES31L rRNA.Σε αυτό το κενό, το msL2 βοηθά στη σταθεροποίηση της αναδίπλωσης του rRNA και μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια του ES31L (Εικόνα 6).
Πυκνότητα ηλεκτρονίων και μοντέλο της ειδικής για Microsporidia ριβοσωμική πρωτεΐνη msL2 που βρίσκεται στα ριβοσώματα E. cuniculi.β Τα περισσότερα ευκαρυωτικά ριβοσώματα, συμπεριλαμβανομένου του ριβοσώματος 80S του Saccharomyces cerevisiae, έχουν χαμένη ενίσχυση ES19L rRNA στα περισσότερα είδη Microsporidian.Η προηγουμένως καθιερωμένη δομή του ριβοσώματος V. necatrix microsporidia υποδηλώνει ότι η απώλεια ES19L σε αυτά τα παράσιτα αντισταθμίζεται από την εξέλιξη της νέας ριβοσωμικής πρωτεΐνης msL1.Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι το ριβόσωμα του E. cuniculi ανέπτυξε επίσης μια πρόσθετη πρωτεΐνη μιμούμενη ριβοσωμικό RNA ως προφανή αντιστάθμιση για την απώλεια του ES19L.Ωστόσο, η msL2 (προς το παρόν σχολιάζεται ως η υποθετική πρωτεΐνη ECU06_1135) και η msL1 έχουν διαφορετική δομική και εξελικτική προέλευση.c Αυτή η ανακάλυψη της δημιουργίας εξελικτικά άσχετων ριβοσωμικών πρωτεϊνών msL1 και msL2 υποδηλώνει ότι εάν τα ριβοσώματα συσσωρεύουν επιζήμιες μεταλλάξεις στο rRNA τους, μπορούν να επιτύχουν πρωτοφανή επίπεδα ποικιλομορφίας σύνθεσης ακόμη και σε ένα μικρό υποσύνολο στενά συγγενών ειδών.Αυτή η ανακάλυψη θα μπορούσε να βοηθήσει στην αποσαφήνιση της προέλευσης και της εξέλιξης του μιτοχονδριακού ριβοσώματος, το οποίο είναι γνωστό για το εξαιρετικά μειωμένο rRNA του και την ανώμαλη μεταβλητότητα στη σύνθεση πρωτεΐνης μεταξύ των ειδών.
Στη συνέχεια συγκρίναμε την πρωτεΐνη msL2 με την πρωτεΐνη msL1 που περιγράφηκε προηγουμένως, τη μόνη γνωστή ριβοσωμική πρωτεΐνη ειδική για μικροσπορίδια που βρέθηκε στο ριβόσωμα V. necatrix.Θέλαμε να ελέγξουμε εάν το msL1 και το msL2 σχετίζονται εξελικτικά.Η ανάλυσή μας έδειξε ότι τα msL1 και msL2 καταλαμβάνουν την ίδια κοιλότητα στη ριβοσωμική δομή, αλλά έχουν διαφορετικές πρωτογενείς και τριτοταγείς δομές, γεγονός που υποδεικνύει την ανεξάρτητη εξελικτική τους προέλευση (Εικ. 6).Έτσι, η ανακάλυψη του msL2 μας παρέχει στοιχεία ότι ομάδες συμπαγών ευκαρυωτικών ειδών μπορούν ανεξάρτητα να εξελίξουν δομικά διακριτές ριβοσωμικές πρωτεΐνες για να αντισταθμίσουν την απώλεια θραυσμάτων rRNA.Αυτό το εύρημα είναι αξιοσημείωτο στο ότι τα περισσότερα κυτταροπλασματικά ευκαρυωτικά ριβοσώματα περιέχουν μια αμετάβλητη πρωτεΐνη, συμπεριλαμβανομένης της ίδιας οικογένειας 81 ριβοσωμικών πρωτεϊνών.Η εμφάνιση των msL1 και msL2 σε διάφορες κλάδες μικροσποριδίων ως απόκριση στην απώλεια εκτεταμένων τμημάτων rRNA υποδηλώνει ότι η υποβάθμιση της μοριακής αρχιτεκτονικής του παρασίτου προκαλεί τα παράσιτα να αναζητούν αντισταθμιστικές μεταλλάξεις, οι οποίες μπορεί τελικά να οδηγήσουν στην απόκτησή τους σε διαφορετικούς πληθυσμούς παρασίτων.δομές.
Τέλος, όταν ολοκληρώθηκε το μοντέλο μας, συγκρίναμε τη σύνθεση του ριβοσώματος E. cuniculi με αυτή που προβλέφθηκε από την αλληλουχία του γονιδιώματος.Αρκετές ριβοσωμικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των eL14, eL38, eL41 και eS30, θεωρούνταν προηγουμένως ότι λείπουν από το γονιδίωμα του E. cuniculi λόγω της προφανούς απουσίας των ομολόγων τους από το γονιδίωμα του E. cuniculi.Απώλεια πολλών ριβοσωμικών πρωτεϊνών προβλέπεται επίσης στα περισσότερα άλλα εξαιρετικά μειωμένα ενδοκυτταρικά παράσιτα και ενδοσυμβίωση.Για παράδειγμα, αν και τα περισσότερα βακτήρια που ζουν ελεύθερα περιέχουν την ίδια οικογένεια 54 ριβοσωμικών πρωτεϊνών, μόνο 11 από αυτές τις οικογένειες πρωτεϊνών έχουν ανιχνεύσιμα ομόλογα σε κάθε αναλυόμενο γονιδίωμα βακτηρίων περιορισμένων στον ξενιστή.Προς υποστήριξη αυτής της ιδέας, μια απώλεια ριβοσωμικών πρωτεϊνών έχει παρατηρηθεί πειραματικά στα V. necatrix και P. locustae microsporidia, τα οποία δεν έχουν τις πρωτεΐνες eL38 και eL4131,32.
Ωστόσο, οι δομές μας δείχνουν ότι μόνο τα eL38, eL41 και eS30 χάνονται στην πραγματικότητα στο ριβόσωμα E. cuniculi.Η πρωτεΐνη eL14 διατηρήθηκε και η δομή μας έδειξε γιατί αυτή η πρωτεΐνη δεν μπορούσε να βρεθεί στην αναζήτηση ομολογίας (Εικ. 7).Στα ριβοσώματα E. cuniculi, το μεγαλύτερο μέρος της θέσης δέσμευσης eL14 χάνεται λόγω αποικοδόμησης του ενισχυμένου με rRNA ES39L.Απουσία του ES39L, το eL14 έχασε το μεγαλύτερο μέρος της δευτεροταγούς δομής του και μόνο το 18% της αλληλουχίας eL14 ήταν πανομοιότυπο στο E. cuniculi και στο S. cerevisiae.Αυτή η κακή διατήρηση της αλληλουχίας είναι αξιοσημείωτη επειδή ακόμη και ο Saccharomyces cerevisiae και ο Homo sapiens -οργανισμοί που εξελίχθηκαν με διαφορά 1,5 δισεκατομμυρίων ετών- μοιράζονται περισσότερο από το 51% των ίδιων υπολειμμάτων στο eL14.Αυτή η ανώμαλη απώλεια διατήρησης εξηγεί γιατί το E. cuniculi eL14 αναφέρεται επί του παρόντος ως η υποτιθέμενη πρωτεΐνη M970_061160 και όχι ως η ριβοσωμική πρωτεΐνη eL1427.
και το ριβόσωμα Microsporidia έχασε την επέκταση ES39L rRNA, η οποία εξάλειψε εν μέρει τη θέση δέσμευσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης eL14.Απουσία ES39L, η πρωτεΐνη μικροσπορίων eL14 υφίσταται απώλεια δευτεροταγούς δομής, στην οποία η πρώην α-έλικα που δεσμεύει rRNA εκφυλίζεται σε βρόχο ελάχιστου μήκους.β Η ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών δείχνει ότι η πρωτεΐνη eL14 είναι εξαιρετικά συντηρημένη σε ευκαρυωτικά είδη (57% ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ ζυμομυκήτων και ανθρώπινων ομολόγων), αλλά κακώς συντηρημένη και αποκλίνουσα στα μικροσπορίδια (στα οποία όχι περισσότερο από 24% των υπολειμμάτων είναι πανομοιότυπα με το ομόλογο eL14).από S. cerevisiae ή H. sapiens).Αυτή η κακή διατήρηση της αλληλουχίας και η μεταβλητότητα της δευτερογενούς δομής εξηγούν γιατί το ομόλογο eL14 δεν βρέθηκε ποτέ στο E. cuniculi και γιατί αυτή η πρωτεΐνη πιστεύεται ότι έχει χαθεί στο E. cuniculi.Αντίθετα, το E. cuniculi eL14 είχε προηγουμένως σχολιαστεί ως υποτιθέμενη πρωτεΐνη M970_061160.Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι η ποικιλομορφία του γονιδιώματος των μικροσποριδίων υπερεκτιμάται επί του παρόντος: ορισμένα γονίδια που πιστεύεται ότι χάνονται στα μικροσπορίδια στην πραγματικότητα διατηρούνται, αν και σε εξαιρετικά διαφοροποιημένες μορφές.Αντίθετα, μερικά πιστεύεται ότι κωδικοποιούν γονίδια μικροσποριδίων για πρωτεΐνες ειδικές για σκουλήκια (π.χ. η υποθετική πρωτεΐνη M970_061160) στην πραγματικότητα κωδικοποιεί τις πολύ διαφορετικές πρωτεΐνες που βρίσκονται σε άλλους ευκαρυώτες.
Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι η μετουσίωση του rRNA μπορεί να οδηγήσει σε δραματική απώλεια διατήρησης της αλληλουχίας σε γειτονικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες, καθιστώντας αυτές τις πρωτεΐνες μη ανιχνεύσιμες για αναζητήσεις ομολογίας.Έτσι, μπορούμε να υπερεκτιμήσουμε τον πραγματικό βαθμό μοριακής αποικοδόμησης σε μικροοργανισμούς γονιδιώματος, καθώς ορισμένες πρωτεΐνες που πιστεύεται ότι έχουν χαθεί επιμένουν στην πραγματικότητα, αν και σε εξαιρετικά αλλοιωμένες μορφές.
Πώς μπορούν τα παράσιτα να διατηρήσουν τη λειτουργία των μοριακών τους μηχανών υπό συνθήκες ακραίας μείωσης του γονιδιώματος;Η μελέτη μας απαντά σε αυτό το ερώτημα περιγράφοντας τη σύνθετη μοριακή δομή (ριβόσωμα) του E. cuniculi, ενός οργανισμού με ένα από τα μικρότερα ευκαρυωτικά γονιδιώματα.
Είναι γνωστό εδώ και σχεδόν δύο δεκαετίες ότι τα μόρια πρωτεΐνης και RNA στα μικροβιακά παράσιτα συχνά διαφέρουν από τα ομόλογά τους μόρια σε ελεύθερα ζωντανά είδη, επειδή δεν διαθέτουν κέντρα ποιοτικού ελέγχου, μειώνονται στο 50% του μεγέθους τους στα ελεύθερα μικρόβια κ.λπ.πολλές εξουθενωτικές μεταλλάξεις που βλάπτουν την αναδίπλωση και τη λειτουργία.Για παράδειγμα, τα ριβοσώματα μικρών οργανισμών γονιδιώματος, συμπεριλαμβανομένων πολλών ενδοκυτταρικών παρασίτων και ενδοσυμβίων, αναμένεται να στερούνται αρκετών ριβοσωμικών πρωτεϊνών και έως το ένα τρίτο των νουκλεοτιδίων rRNA σε σύγκριση με τα ελεύθερα ζωντανά είδη 27, 29, 30, 49. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο αυτά τα μόρια που μελετήθηκαν σε μια γονιδιακή γονιδιακή λειτουργία παραμένει κυρίως σε μεγάλο βαθμό.
Η μελέτη μας δείχνει ότι η δομή των μακρομορίων μπορεί να αποκαλύψει πολλές πτυχές της εξέλιξης που είναι δύσκολο να εξαχθούν από τις παραδοσιακές συγκριτικές γονιδιωματικές μελέτες ενδοκυτταρικών παρασίτων και άλλων οργανισμών περιορισμένων στον ξενιστή (Συμπληρωματικό Σχ. 7).Για παράδειγμα, το παράδειγμα της πρωτεΐνης eL14 δείχνει ότι μπορούμε να υπερεκτιμήσουμε τον πραγματικό βαθμό αποικοδόμησης της μοριακής συσκευής σε παρασιτικά είδη.Τα εγκεφαλιτικά παράσιτα πιστεύεται τώρα ότι έχουν εκατοντάδες γονίδια ειδικά για μικροσπορίδια.Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ορισμένα από αυτά τα φαινομενικά συγκεκριμένα γονίδια είναι στην πραγματικότητα πολύ διαφορετικές παραλλαγές γονιδίων που είναι κοινές σε άλλους ευκαρυώτες.Επιπλέον, το παράδειγμα της πρωτεΐνης msL2 δείχνει πώς παραβλέπουμε τις νέες ριβοσωμικές πρωτεΐνες και υποτιμούμε το περιεχόμενο των παρασιτικών μοριακών μηχανών.Το παράδειγμα των μικρών μορίων δείχνει πώς μπορούμε να παραβλέψουμε τις πιο έξυπνες καινοτομίες στις παρασιτικές μοριακές δομές που μπορούν να τους δώσουν νέα βιολογική δραστηριότητα.
Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα βελτιώνουν την κατανόησή μας για τις διαφορές μεταξύ των μοριακών δομών των οργανισμών περιορισμένων στον ξενιστή και των αντίστοιχων οργανισμών που ζουν ελεύθερα.Δείχνουμε ότι οι μοριακές μηχανές, που από καιρό πιστεύεται ότι είναι μειωμένες, εκφυλισμένες και υποκείμενες σε διάφορες εξουθενωτικές μεταλλάξεις, έχουν αντίθετα ένα σύνολο ασυνήθιστων δομικών χαρακτηριστικών που παραβλέπονται συστηματικά.
Από την άλλη πλευρά, τα μη ογκώδη θραύσματα rRNA και τα συντηγμένα θραύσματα που βρήκαμε στα ριβοσώματα του E. cuniculi υποδηλώνουν ότι η μείωση του γονιδιώματος μπορεί να αλλάξει ακόμη και εκείνα τα μέρη του βασικού μοριακού μηχανισμού που διατηρούνται στους τρεις τομείς της ζωής - μετά από σχεδόν 3,5 δισεκατομμύρια χρόνια.ανεξάρτητη εξέλιξη των ειδών.
Τα απαλλαγμένα από διόγκωση και συντηγμένα θραύσματα rRNA στα ριβοσώματα E. cuniculi παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον υπό το φως προηγούμενων μελετών μορίων RNA σε ενδοσυμβιωτικά βακτήρια.Για παράδειγμα, στο ενδοσυμβίον των αφίδων Buchnera aphidicola, τα μόρια rRNA και tRNA έχουν αποδειχθεί ότι έχουν δομές ευαίσθητες στη θερμοκρασία λόγω της μεροληψίας της σύνθεσης Α+Τ και μεγάλης αναλογίας μη κανονικών ζευγών βάσεων20,50.Αυτές οι αλλαγές στο RNA, καθώς και οι αλλαγές στα μόρια πρωτεΐνης, πιστεύεται τώρα ότι είναι υπεύθυνες για την υπερβολική εξάρτηση των ενδοσυμβίων από τους συντρόφους και την αδυναμία των ενδοσυμβίων να μεταφέρουν θερμότητα 21, 23.Αν και τα παρασιτικά microsporidia rRNA έχουν δομικά διακριτές αλλαγές, η φύση αυτών των αλλαγών υποδηλώνει ότι η μειωμένη θερμική σταθερότητα και η υψηλότερη εξάρτηση από πρωτεΐνες συνοδηγού μπορεί να είναι κοινά χαρακτηριστικά των μορίων RNA σε οργανισμούς με μειωμένο γονιδίωμα.
Από την άλλη πλευρά, οι δομές μας δείχνουν ότι τα παρασιτικά μικροσπορίδια έχουν αναπτύξει μια μοναδική ικανότητα να αντιστέκονται σε ευρέως διατηρημένα θραύσματα rRNA και πρωτεΐνης, αναπτύσσοντας την ικανότητα να χρησιμοποιούν άφθονους και άμεσα διαθέσιμους μικρούς μεταβολίτες ως δομικούς μιμητές εκφυλισμένων θραυσμάτων rRNA και πρωτεΐνης.Αποικοδόμηση μοριακής δομής..Αυτή η άποψη υποστηρίζεται από το γεγονός ότι μικρά μόρια που αντισταθμίζουν την απώλεια πρωτεϊνικών θραυσμάτων στο rRNA και τα ριβοσώματα του E. cuniculi συνδέονται με ειδικά για μικροσπορίδια υπολείμματα στις πρωτεΐνες uL15 και eL30.Αυτό υποδηλώνει ότι η δέσμευση μικρών μορίων με ριβοσώματα μπορεί να είναι προϊόν θετικής επιλογής, στην οποία έχουν επιλεγεί μεταλλάξεις ειδικών για μικροσπορίδια σε ριβοσωμικές πρωτεΐνες για την ικανότητά τους να αυξάνουν τη συγγένεια των ριβοσωμάτων για μικρά μόρια, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε πιο αποτελεσματικούς ριβοσωμικούς οργανισμούς.Η ανακάλυψη αποκαλύπτει μια έξυπνη καινοτομία στη μοριακή δομή των μικροβιακών παρασίτων και μας δίνει μια καλύτερη κατανόηση του πώς οι μοριακές δομές των παρασίτων διατηρούν τη λειτουργία τους παρά την αναγωγική εξέλιξη.
Προς το παρόν, η ταυτοποίηση αυτών των μικρών μορίων παραμένει ασαφής.Δεν είναι σαφές γιατί η εμφάνιση αυτών των μικρών μορίων στη ριβοσωματική δομή διαφέρει μεταξύ των ειδών μικροσποριδίων.Ειδικότερα, δεν είναι σαφές γιατί παρατηρείται δέσμευση νουκλεοτιδίων στα ριβοσώματα των E. cuniculi και P. locustae και όχι στα ριβοσώματα του V. necatrix, παρά την παρουσία του υπολείμματος F170 στις πρωτεΐνες eL20 και K172 του V. necatrix.Αυτή η διαγραφή μπορεί να προκληθεί από το υπόλειμμα 43 uL6 (που βρίσκεται δίπλα στον θύλακα δέσμευσης νουκλεοτιδίων), το οποίο είναι η τυροσίνη στο V. necatrix και όχι η θρεονίνη στο E. cuniculi και το P. locustae.Η ογκώδης αρωματική πλευρική αλυσίδα του Tyr43 μπορεί να επηρεάσει τη δέσμευση νουκλεοτιδίων λόγω της στερικής επικάλυψης.Εναλλακτικά, η φαινομενική διαγραφή νουκλεοτιδίου μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή ανάλυση της κρυο-ΕΜ απεικόνισης, η οποία εμποδίζει τη μοντελοποίηση ριβοσωμικών θραυσμάτων V. necatrix.
Από την άλλη πλευρά, η εργασία μας υποδηλώνει ότι η διαδικασία της αποσύνθεσης του γονιδιώματος μπορεί να είναι μια εφευρετική δύναμη.Συγκεκριμένα, η δομή του ριβοσώματος E. cuniculi υποδηλώνει ότι η απώλεια rRNA και πρωτεϊνικών θραυσμάτων στο ριβόσωμα των μικροσποριδίων δημιουργεί εξελικτική πίεση που προάγει αλλαγές στη δομή του ριβοσώματος.Αυτές οι παραλλαγές εμφανίζονται μακριά από την ενεργό θέση του ριβοσώματος και φαίνεται να βοηθούν στη διατήρηση (ή στην αποκατάσταση) της βέλτιστης συγκρότησης ριβοσώματος που διαφορετικά θα διαταράσσονταν από μειωμένο rRNA.Αυτό υποδηλώνει ότι μια σημαντική καινοτομία του ριβοσώματος των μικροσποριδίων φαίνεται να έχει εξελιχθεί σε ανάγκη να ρυθμιστεί η μετατόπιση γονιδίων.
Ίσως αυτό φαίνεται καλύτερα από τη δέσμευση νουκλεοτιδίων, η οποία δεν έχει παρατηρηθεί ποτέ σε άλλους οργανισμούς μέχρι τώρα.Το γεγονός ότι υπολείμματα δέσμευσης νουκλεοτιδίων υπάρχουν σε τυπικά μικροσπορίδια, αλλά όχι σε άλλα ευκαρυωτικά, υποδηλώνει ότι οι θέσεις δέσμευσης νουκλεοτιδίων δεν είναι απλώς λείψανα που περιμένουν να εξαφανιστούν ή η τελική θέση για το rRNA που θα αποκατασταθεί στη μορφή μεμονωμένων νουκλεοτιδίων.Αντίθετα, αυτός ο ιστότοπος φαίνεται σαν ένα χρήσιμο χαρακτηριστικό που θα μπορούσε να έχει εξελιχθεί σε αρκετούς γύρους θετικής επιλογής.Οι θέσεις δέσμευσης νουκλεοτιδίων μπορεί να είναι υποπροϊόν της φυσικής επιλογής: μόλις αποικοδομηθεί το ES39L, τα μικροσπορίδια αναγκάζονται να αναζητήσουν αποζημίωση για να αποκαταστήσουν τη βέλτιστη βιογένεση του ριβοσώματος απουσία του ES39L.Δεδομένου ότι αυτό το νουκλεοτίδιο μπορεί να μιμηθεί τις μοριακές επαφές του νουκλεοτιδίου A3186 στο ES39L, το μόριο νουκλεοτιδίου γίνεται δομικό στοιχείο του ριβοσώματος, η δέσμευση του οποίου βελτιώνεται περαιτέρω με μετάλλαξη της αλληλουχίας eL30.
Όσον αφορά τη μοριακή εξέλιξη των ενδοκυτταρικών παρασίτων, η μελέτη μας δείχνει ότι οι δυνάμεις της Δαρβινικής φυσικής επιλογής και η γενετική μετατόπιση της αποσύνθεσης του γονιδιώματος δεν λειτουργούν παράλληλα, αλλά ταλαντώνονται.Πρώτον, η γενετική μετατόπιση εξαλείφει σημαντικά χαρακτηριστικά των βιομορίων, καθιστώντας την αποζημίωση εξαιρετικά απαραίτητη.Μόνο όταν τα παράσιτα ικανοποιήσουν αυτή την ανάγκη μέσω της Δαρβινικής φυσικής επιλογής, τα μακρομόριά τους θα έχουν την ευκαιρία να αναπτύξουν τα πιο εντυπωσιακά και καινοτόμα χαρακτηριστικά τους.Είναι σημαντικό ότι η εξέλιξη των θέσεων δέσμευσης νουκλεοτιδίων στο ριβόσωμα E. cuniculi υποδηλώνει ότι αυτό το μοτίβο απώλειας προς κέρδος της μοριακής εξέλιξης όχι μόνο αποσβένει επιβλαβείς μεταλλάξεις, αλλά μερικές φορές προσδίδει εντελώς νέες λειτουργίες σε παρασιτικά μακρομόρια.
Αυτή η ιδέα είναι συνεπής με τη θεωρία κινούμενης ισορροπίας του Sewell Wright, η οποία δηλώνει ότι ένα αυστηρό σύστημα φυσικής επιλογής περιορίζει την ικανότητα των οργανισμών να καινοτομούν51,52,53.Ωστόσο, εάν η γενετική μετατόπιση διαταράσσει τη φυσική επιλογή, αυτές οι μετατοπίσεις μπορούν να προκαλέσουν αλλαγές που δεν είναι από μόνες τους προσαρμοστικές (ή ακόμη και επιζήμιες), αλλά οδηγούν σε περαιτέρω αλλαγές που παρέχουν υψηλότερη φυσική κατάσταση ή νέα βιολογική δραστηριότητα.Το πλαίσιό μας υποστηρίζει αυτή την ιδέα δείχνοντας ότι ο ίδιος τύπος μετάλλαξης που μειώνει την πτυχή και τη λειτουργία ενός βιομορίου φαίνεται να είναι το κύριο έναυσμα για τη βελτίωσή του.Σύμφωνα με το win-win εξελικτικό μοντέλο, η μελέτη μας δείχνει ότι η αποσύνθεση του γονιδιώματος, που παραδοσιακά θεωρείται ως εκφυλιστική διαδικασία, είναι επίσης ένας σημαντικός μοχλός καινοτομίας, μερικές φορές και ίσως ακόμη και συχνά επιτρέποντας στα μακρομόρια να αποκτήσουν νέες παρασιτικές δραστηριότητες.μπορούν να τα χρησιμοποιήσουν.