Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Εμφανίζει ένα καρουζέλ τριών διαφανειών ταυτόχρονα.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά Προηγούμενο και Επόμενο για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά ή χρησιμοποιήστε τα κουμπιά ρυθμιστικού στο τέλος για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά.
Ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός και ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός εμποδίζουν τους βιοθεραπευτικούς παράγοντες να φτάσουν τους στόχους τους στο κεντρικό νευρικό σύστημα, εμποδίζοντας έτσι την αποτελεσματική θεραπεία νευρολογικών παθήσεων.Για να ανακαλύψουμε νέους μεταφορείς εγκεφάλου in vivo, εισαγάγαμε μια βιβλιοθήκη πεπτιδίων φάγων Τ7 και συλλέξαμε σειριακά αίμα και εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) χρησιμοποιώντας ένα διασωληνωμένο, συνειδητό μοντέλο μεγάλης δεξαμενής αρουραίων.Ειδικοί κλώνοι φάγων εμπλουτίστηκαν σε μεγάλο βαθμό σε ΕΝΥ μετά από τέσσερις γύρους επιλογής.Η δοκιμή μεμονωμένων υποψηφίων πεπτιδίων αποκάλυψε περισσότερο από 1000 φορές εμπλουτισμό στο ΕΝΥ.Η βιοδραστικότητα της διαμεσολαβούμενης από πεπτίδιο παροχής στον εγκέφαλο επιβεβαιώθηκε από μια μείωση 40% στο επίπεδο του αμυλοειδούς-β στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό χρησιμοποιώντας έναν αναστολέα πεπτιδίου BACE1 συνδεδεμένο με το αναγνωρισμένο νέο πεπτίδιο διέλευσης.Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα πεπτίδια που ταυτοποιούνται με μεθόδους επιλογής φάγων in vivo μπορεί να είναι χρήσιμα οχήματα για τη συστημική παροχή μακρομορίων στον εγκέφαλο με θεραπευτικό αποτέλεσμα.
Η έρευνα για τη στοχευμένη θεραπεία του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) έχει επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό στον εντοπισμό βελτιστοποιημένων φαρμάκων και παραγόντων που παρουσιάζουν ιδιότητες στόχευσης του ΚΝΣ, με λιγότερη προσπάθεια για την ανακάλυψη των μηχανισμών που οδηγούν την παροχή ενεργού φαρμάκου στον εγκέφαλο.Αυτό αρχίζει να αλλάζει τώρα, καθώς η παροχή φαρμάκων, ειδικά τα μεγάλα μόρια, είναι αναπόσπαστο μέρος της σύγχρονης ανάπτυξης φαρμάκων της νευροεπιστήμης.Το περιβάλλον του κεντρικού νευρικού συστήματος προστατεύεται καλά από το εγκεφαλοαγγειακό σύστημα φραγμού, που αποτελείται από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB) ​​και τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BCBB)1, καθιστώντας δύσκολη την παροχή φαρμάκων στον εγκέφαλο1,2.Υπολογίζεται ότι σχεδόν όλα τα φάρμακα μεγάλων μορίων και πάνω από το 98% των μικρομοριακών φαρμάκων αποβάλλονται από τον εγκέφαλο3.Γι' αυτό είναι πολύ σημαντικό να εντοπιστούν νέα συστήματα μεταφοράς εγκεφάλου που παρέχουν αποτελεσματική και ειδική χορήγηση θεραπευτικών φαρμάκων στο ΚΝΣ 4,5.Ωστόσο, το BBB και το BCSFB παρουσιάζουν επίσης μια εξαιρετική ευκαιρία για τη χορήγηση φαρμάκων καθώς διεισδύουν και εισέρχονται σε όλες τις δομές του εγκεφάλου μέσω της εκτεταμένης αγγείωσης του.Έτσι, οι τρέχουσες προσπάθειες για τη χρήση μη επεμβατικών μεθόδων παροχής στον εγκέφαλο βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στον μηχανισμό της μεταφοράς μέσω υποδοχέα (PMT) χρησιμοποιώντας τον ενδογενή υποδοχέα BBB6.Παρά τις πρόσφατες βασικές προόδους με τη χρήση της οδού υποδοχέα τρανσφερρίνης7,8, απαιτείται περαιτέρω ανάπτυξη νέων συστημάτων χορήγησης με βελτιωμένες ιδιότητες.Για το σκοπό αυτό, ο στόχος μας ήταν να εντοπίσουμε πεπτίδια ικανά να μεσολαβήσουν στη μεταφορά του ΕΝΥ, καθώς θα μπορούσαν κατ' αρχήν να χρησιμοποιηθούν για την παροχή μακρομορίων στο ΚΝΣ ή για το άνοιγμα νέων οδών υποδοχέα.Συγκεκριμένα, συγκεκριμένοι υποδοχείς και μεταφορείς του εγκεφαλοαγγειακού συστήματος (BBB και BSCFB) μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί στόχοι για την ενεργό και ειδική χορήγηση βιοθεραπευτικών φαρμάκων.Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) είναι ένα εκκριτικό προϊόν του χοριοειδούς πλέγματος (CS) και βρίσκεται σε άμεση επαφή με το διάμεσο υγρό του εγκεφάλου μέσω του υπαραχνοειδή και του κοιλιακού χώρου4.Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι το υπαραχνοειδή εγκεφαλονωτιαίο υγρό διαχέεται υπερβολικά στο διάμεσο τμήμα του εγκεφάλου9.Ελπίζουμε να έχουμε πρόσβαση στον παρεγχυματικό χώρο χρησιμοποιώντας αυτήν την υπαραχνοειδή οδό εισροής ή απευθείας μέσω του BBB.Για να το επιτύχουμε αυτό, εφαρμόσαμε μια ισχυρή in vivo στρατηγική επιλογής φάγων που προσδιορίζει ιδανικά τα πεπτίδια που μεταφέρονται από οποιαδήποτε από αυτές τις δύο διακριτές οδούς.
Τώρα περιγράφουμε μια διαδοχική in vivo μέθοδο διαλογής εμφάνισης φάγων με δειγματοληψία ΕΝΥ σε συνδυασμό με αλληλουχία υψηλής απόδοσης (HTS) για την παρακολούθηση των αρχικών κύκλων επιλογής με την υψηλότερη ποικιλομορφία βιβλιοθήκης.Πραγματοποιήθηκε διαλογή σε αρουραίους που είχαν τις αισθήσεις τους με μόνιμα εμφυτευμένο σωληνίσκο μεγάλης δεξαμενής (CM) για να αποφευχθεί η μόλυνση του αίματος.Είναι σημαντικό ότι αυτή η προσέγγιση επιλέγει τόσο τη στόχευση του εγκεφάλου όσο και τα πεπτίδια με δραστηριότητα μεταφοράς κατά μήκος του εγκεφαλοαγγειακού φραγμού.Χρησιμοποιήσαμε φάγους Τ7 λόγω του μικρού τους μεγέθους (~60 nm)10 και προτείναμε ότι είναι κατάλληλοι για τη μεταφορά κυστιδίων που επιτρέπουν τη διακυτταρική διέλευση του φραγμού του ενδοθηλίου και/ή του επιθηλίου-μυελού.Μετά από τέσσερις γύρους panning, απομονώθηκαν πληθυσμοί φάγων που έδειξαν ισχυρό in vivo εμπλουτισμό ΕΝΥ και συσχέτιση εγκεφαλικών μικροαγγείων.Είναι σημαντικό ότι μπορέσαμε να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματά μας αποδεικνύοντας ότι τα προτιμώμενα και χημικά συντιθέμενα καλύτερα υποψήφια πεπτίδια είναι σε θέση να μεταφέρουν φορτίο πρωτεΐνης στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό.Πρώτον, οι φαρμακοδυναμικές επιδράσεις του ΚΝΣ διαπιστώθηκαν με συνδυασμό ενός κορυφαίου πεπτιδίου διέλευσης με έναν αναστολέα του πεπτιδίου BACE1.Εκτός από την απόδειξη ότι οι in vivo στρατηγικές λειτουργικού προσυμπτωματικού ελέγχου μπορούν να αναγνωρίσουν νέα πεπτίδια μεταφοράς εγκεφάλου ως αποτελεσματικούς φορείς φορτίου πρωτεΐνης, αναμένουμε ότι παρόμοιες προσεγγίσεις λειτουργικής επιλογής θα γίνουν επίσης σημαντικές για τον εντοπισμό νέων οδών μεταφοράς εγκεφάλου.
Με βάση τις μονάδες σχηματισμού πλάκας (PFU), μετά το στάδιο συσκευασίας φάγου, σχεδιάστηκε και δημιουργήθηκε μια βιβλιοθήκη τυχαίων 12-μερών γραμμικών πεπτιδίων φάγων Τ7 με ποικιλία περίπου 109 (βλ. Υλικά και Μέθοδοι).Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι αναλύσαμε προσεκτικά αυτήν τη βιβλιοθήκη πριν από την in vivo panning.Η ενίσχυση PCR δειγμάτων βιβλιοθήκης φάγων χρησιμοποιώντας τροποποιημένους εκκινητές δημιούργησε αμπλικόνια που ήταν άμεσα εφαρμόσιμα στο HTS (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α).Λόγω α) σφαλμάτων αλληλουχίας HTS11, β) επίδρασης στην ποιότητα των εκκινητών (NNK) 1-12 και γ) παρουσίας φάγου άγριου τύπου (wt) (ενθέματα σκελετού) στη βιβλιοθήκη αναμονής, εφαρμόστηκε μια διαδικασία φιλτραρίσματος αλληλουχίας για την εξαγωγή μόνο επαληθευμένων πληροφοριών αλληλουχίας (Συμπληρωματικό Σχήμα 1b).Αυτά τα βήματα φίλτρου ισχύουν για όλες τις βιβλιοθήκες αλληλουχίας HTS.Για την τυπική βιβλιοθήκη, λήφθηκαν συνολικά 233.868 αναγνώσεις, εκ των οποίων το 39% πέρασε τα κριτήρια φίλτρου και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση βιβλιοθήκης και επιλογή για τους επόμενους γύρους (Συμπληρωματικό Σχήμα 1γ–ε).Οι αναγνώσεις ήταν κατά κύριο λόγο πολλαπλάσια μήκους 3 ζευγών βάσεων με κορυφή στα 36 νουκλεοτίδια (Συμπληρωματικό Σχήμα 1c), επιβεβαιώνοντας τον σχεδιασμό της βιβλιοθήκης (ΝΝΚ) 1-12.Σημειωτέον, περίπου το 11% των μελών της βιβλιοθήκης περιείχε ένα ένθετο PAGISRELVDKL 12-διάστατου άγριου τύπου (wt) και σχεδόν οι μισές αλληλουχίες (49%) περιείχαν εισαγωγές ή διαγραφές.Το HTS της βιβλιοθήκης της βιβλιοθήκης επιβεβαίωσε την υψηλή ποικιλομορφία των πεπτιδίων στη βιβλιοθήκη: περισσότερο από το 81% των αλληλουχιών πεπτιδίων βρέθηκαν μόνο μία φορά και μόνο το 1,5% εμφανίστηκε σε ≥4 αντίγραφα (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α).Οι συχνότητες των αμινοξέων (aa) και στις 12 θέσεις στο ρεπερτόριο συσχετίστηκαν καλά με τις αναμενόμενες συχνότητες για τον αριθμό των κωδικονίων που δημιουργούνται από το εκφυλισμένο ρεπερτόριο NKK (Συμπληρωματικό Σχήμα 2b).Η παρατηρούμενη συχνότητα των υπολειμμάτων aa που κωδικοποιούνται από αυτά τα ένθετα συσχετίστηκε καλά με την υπολογισμένη συχνότητα (r = 0,893) (Συμπληρωματικό Σχήμα 2c).Η προετοιμασία των βιβλιοθηκών φάγων για ένεση περιλαμβάνει τα στάδια ενίσχυσης και απομάκρυνσης της ενδοτοξίνης.Αυτό έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι δυνητικά μειώνει την ποικιλομορφία των βιβλιοθηκών φάγων12,13.Επομένως, προσδιορίσαμε την αλληλουχία μιας βιβλιοθήκης φάγων ενισχυμένης με πλάκα που είχε υποβληθεί σε αφαίρεση ενδοτοξίνης και τη συγκρίναμε με την αρχική βιβλιοθήκη για να εκτιμήσουμε τη συχνότητα της ΑΑ.Παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση (r = 0,995) μεταξύ της αρχικής δεξαμενής και της ενισχυμένης και καθαρισμένης δεξαμενής (Συμπληρωματικό Σχήμα 2δ), υποδεικνύοντας ότι ο ανταγωνισμός μεταξύ κλώνων που ενισχύθηκαν σε πλάκες χρησιμοποιώντας φάγο Τ7 δεν προκάλεσε σημαντική μεροληψία.Αυτή η σύγκριση βασίζεται στη συχνότητα των τριπεπτιδικών μοτίβων σε κάθε βιβλιοθήκη, καθώς η ποικιλομορφία των βιβλιοθηκών (~109) δεν μπορεί να αποτυπωθεί πλήρως ακόμη και με HTS.Η ανάλυση συχνότητας του aa σε κάθε θέση αποκάλυψε μια μικρή προκατάληψη που εξαρτάται από τη θέση στις τρεις τελευταίες θέσεις του εισαγόμενου ρεπερτορίου (Συμπληρωματικό Σχήμα 2e).Συμπερασματικά, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η ποιότητα και η ποικιλομορφία της βιβλιοθήκης ήταν αποδεκτές και παρατηρήθηκαν μόνο μικρές αλλαγές στην ποικιλομορφία λόγω της ενίσχυσης και της προετοιμασίας των βιβλιοθηκών φάγων μεταξύ πολλών γύρων επιλογής.
Η σειριακή δειγματοληψία εγκεφαλονωτιαίου υγρού μπορεί να πραγματοποιηθεί με χειρουργική εμφύτευση ενός σωληνίσκου στο CM αρουραίων που έχουν τις αισθήσεις τους για να διευκολυνθεί η αναγνώριση του φάγου Τ7 που εγχύεται ενδοφλεβίως (iv) μέσω του BBB και/ή του BCSFB (Εικ. 1a-b).Χρησιμοποιήσαμε δύο ανεξάρτητους βραχίονες επιλογής (βραχίονες Α και Β) στους τρεις πρώτους γύρους επιλογής in vivo (Εικ. 1γ).Σταδιακά αυξήσαμε την αυστηρότητα της επιλογής μειώνοντας τη συνολική ποσότητα φάγου που εισήχθη στους τρεις πρώτους γύρους επιλογής.Για τον τέταρτο γύρο panning, συνδυάσαμε δείγματα από τους κλάδους Α και Β και πραγματοποιήσαμε τρεις επιπλέον ανεξάρτητες επιλογές.Για να μελετηθούν οι in vivo ιδιότητες των σωματιδίων φάγων Τ7 σε αυτό το μοντέλο, φάγος άγριου τύπου (κύριο ένθετο PAGISRELVDKL) εγχύθηκε σε αρουραίους μέσω της φλέβας της ουράς.Η ανάκτηση φάγων από εγκεφαλονωτιαίο υγρό και αίμα σε διαφορετικά χρονικά σημεία έδειξε ότι οι σχετικά μικροί εικοσαεδρικοί φάγοι Τ7 είχαν μια ταχεία αρχική φάση κάθαρσης από το διαμέρισμα αίματος (Συμπληρωματικό Σχήμα 3).Με βάση τους τίτλους που χορηγήθηκαν και τον όγκο αίματος των αρουραίων, υπολογίσαμε ότι μόνο περίπου 1% wt.φάγος από τη χορηγηθείσα δόση ανιχνεύθηκε στο αίμα 10 λεπτά μετά την ενδοφλέβια ένεση.Μετά από αυτή την αρχική ταχεία πτώση, μετρήθηκε μια πιο αργή πρωτογενής κάθαρση με χρόνο ημιζωής 27,7 λεπτών.Είναι σημαντικό ότι μόνο πολύ λίγοι φάγοι ανακτήθηκαν από το διαμέρισμα του ΕΝΥ, υποδεικνύοντας χαμηλό υπόβαθρο για μετανάστευση φάγων άγριου τύπου στο διαμέρισμα ΕΝΥ (Συμπληρωματικό Σχήμα 3).Κατά μέσο όρο, μόνο περίπου 1 x 10-3% τίτλοι φάγου Τ7 στο αίμα και 4 x 10-8% αρχικώς εγχυθέντων φάγων ανιχνεύθηκαν στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου δειγματοληψίας (0-250 λεπτά).Σημειωτέον, ο χρόνος ημιζωής (25,7 λεπτά) του άγριου τύπου φάγου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ήταν παρόμοιος με αυτόν που παρατηρήθηκε στο αίμα.Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι το φράγμα που διαχωρίζει το διαμέρισμα ΕΝΥ από το αίμα είναι άθικτο σε αρουραίους που έχουν διασωληνωθεί με CM, επιτρέποντας την in νίνο επιλογή βιβλιοθηκών φάγων για την αναγνώριση κλώνων που μεταφέρονται εύκολα από το αίμα στο διαμέρισμα ΕΝΥ.
(α) Δημιουργία μιας μεθόδου για την εκ νέου δειγματοληψία εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ) από μια μεγάλη πισίνα.(β) Διάγραμμα που δείχνει την κυτταρική θέση του φραγμού του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και τη στρατηγική επιλογής που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό πεπτιδίων που διασχίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB) ​​και τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό.(γ) Διάγραμμα ροής διαλογής εμφάνισης φάγων in vivo.Σε κάθε γύρο επιλογής, οι φάγοι (αναγνωριστικά ζώων μέσα στα βέλη) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως.Δύο ανεξάρτητα εναλλακτικά υποκαταστήματα (Α, Β) διατηρούνται χωριστά μέχρι τον 4ο γύρο επιλογής.Για τους γύρους επιλογής 3 και 4, κάθε κλώνος φάγου που εξήχθη από το CSF αναλύθηκε με το χέρι.(δ) Κινητική φάγου που απομονώθηκε από αίμα (κόκκινοι κύκλοι) και εγκεφαλονωτιαίο υγρό (πράσινα τρίγωνα) κατά τον πρώτο γύρο επιλογής σε δύο διασωληνωμένους αρουραίους μετά από ενδοφλέβια ένεση της βιβλιοθήκης πεπτιδίων Τ7 (2 x 1012 φάγοι/ζώο).Τα μπλε τετράγωνα υποδεικνύουν τη μέση αρχική συγκέντρωση φάγου στο αίμα, που υπολογίζεται από την ποσότητα του ενέσιμου φάγου, λαμβάνοντας υπόψη τον συνολικό όγκο αίματος.Τα μαύρα τετράγωνα υποδεικνύουν το σημείο τομής της γραμμής y που προκύπτει από τις συγκεντρώσεις των φάγων του αίματος.(ε, στ) Παρουσιάστε τη σχετική συχνότητα και κατανομή όλων των πιθανών επικαλυπτόμενων τριπεπτιδικών μοτίβων που βρίσκονται στο πεπτίδιο.Εμφανίζεται ο αριθμός των μοτίβων που βρέθηκαν σε 1000 αναγνώσεις.Σημαντικά (p < 0,001) εμπλουτισμένα μοτίβα σημειώνονται με κόκκινες κουκκίδες.(ε) Διάγραμμα διασποράς συσχέτισης που συγκρίνει τη σχετική συχνότητα του τριπεπτιδικού μοτίβου της εγχυόμενης βιβλιοθήκης με φάγους που προέρχονται από αίμα από ζώα #1.1 και #1.2.(στ) Σχέδιο διασποράς συσχέτισης που συγκρίνει τις σχετικές συχνότητες των μοτίβων τριπεπτιδίων ζωικών φάγων #1.1 και #1.2 που απομονώνονται στο αίμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό.(g, h) Αναπαράσταση αλληλουχίας ID φάγου εμπλουτισμένου σε αίμα (g) έναντι εγχυόμενων βιβλιοθηκών και φάγου εμπλουτισμένου σε CSF (h) έναντι αίματος μετά από έναν γύρο in vivo επιλογής και στα δύο ζώα.Το μέγεθος του κωδικού ενός γράμματος υποδεικνύει πόσο συχνά εμφανίζεται αυτό το αμινοξύ σε αυτή τη θέση.Πράσινο = πολικό, μωβ = ουδέτερο, μπλε = βασικό, κόκκινο = όξινο και μαύρο = υδρόφοβα αμινοξέα.Το σχήμα 1a, b σχεδιάστηκε και δημιουργήθηκε από τον Eduard Urich.
Ενέσαμε μια βιβλιοθήκη πεπτιδίων φάγου σε δύο αρουραίους οργάνου CM (clades Α και Β) και απομονώσαμε φάγο από εγκεφαλονωτιαίο υγρό και αίμα (Εικόνα 1δ).Η αρχική ταχεία κάθαρση της βιβλιοθήκης ήταν λιγότερο έντονη σε σύγκριση με τον άγριου τύπου φάγο.Ο μέσος χρόνος ημιζωής της εγχυόμενης βιβλιοθήκης και στα δύο ζώα ήταν 24,8 λεπτά στο αίμα, παρόμοιος με τους φάγους άγριου τύπου και 38,5 λεπτά στο ΕΝΥ.Δείγματα φάγου αίματος και εγκεφαλονωτιαίου υγρού από κάθε ζώο υποβλήθηκαν σε HTS και όλα τα ταυτοποιημένα πεπτίδια αναλύθηκαν για την παρουσία ενός μικρού τριπεπτιδικού μοτίβου.Επιλέχθηκαν μοτίβα τριπεπτιδίου επειδή παρέχουν μια ελάχιστη βάση για το σχηματισμό δομής και τις αλληλεπιδράσεις πεπτιδίου-πρωτεΐνης14,15.Βρήκαμε μια καλή συσχέτιση στην κατανομή των μοτίβων μεταξύ της εγχυόμενης βιβλιοθήκης φάγων και των κλώνων που εξήχθησαν από το αίμα και των δύο ζώων (Εικ. 1e).Τα δεδομένα δείχνουν ότι η σύνθεση της βιβλιοθήκης είναι οριακά μόνο εμπλουτισμένη στο διαμέρισμα αίματος.Οι συχνότητες αμινοξέων και οι συναινετικές αλληλουχίες αναλύθηκαν περαιτέρω σε κάθε θέση χρησιμοποιώντας μια προσαρμογή του λογισμικού Weblogo16.Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε έναν ισχυρό εμπλουτισμό στα υπολείμματα γλυκίνης του αίματος (Εικ. 1g).Όταν το αίμα συγκρίθηκε με κλώνους που επιλέχθηκαν από το ΕΝΥ, παρατηρήθηκε έντονη επιλογή και κάποια αποεπιλογή μοτίβων (Εικ. 1 στ) και ορισμένα αμινοξέα ήταν κατά προτίμηση παρόντα σε προκαθορισμένες θέσεις στο 12-μελές (Σχήμα 1h).Συγκεκριμένα, τα μεμονωμένα ζώα διέφεραν σημαντικά στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ενώ εμπλουτισμός γλυκίνης αίματος παρατηρήθηκε και στα δύο ζώα (Συμπληρωματικό Σχήμα 4a–j).Μετά από αυστηρό φιλτράρισμα των δεδομένων αλληλουχίας στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό των ζώων #1.1 και #1.2, ελήφθησαν συνολικά 964 και 420 μοναδικά πεπτίδια 12-μερών (Συμπληρωματικό Σχήμα 1d–e).Οι απομονωμένοι κλώνοι φάγων ενισχύθηκαν και υποβλήθηκαν σε έναν δεύτερο γύρο επιλογής ίη νίνο.Οι φάγοι που εξήχθησαν από τον δεύτερο γύρο επιλογής υποβλήθηκαν σε HTS σε κάθε ζώο και όλα τα αναγνωρισμένα πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος σε ένα πρόγραμμα αναγνώρισης μοτίβων για να αναλυθεί η εμφάνιση τριπεπτιδικών μοτίβων (Εικ. 2a, b, ef).Σε σύγκριση με τον πρώτο κύκλο του φάγου που ανακτήθηκε από το ΕΝΥ, παρατηρήσαμε περαιτέρω επιλογή και αποεπιλογή πολλών μοτίβων στο ΕΝΥ στους κλάδους Α και Β (Εικ. 2).Εφαρμόστηκε ένας αλγόριθμος αναγνώρισης δικτύου για να προσδιοριστεί εάν αντιπροσώπευαν διαφορετικά μοτίβα συνεπούς ακολουθίας.Παρατηρήθηκε μια σαφής ομοιότητα μεταξύ των 12-διαστάσεων αλληλουχιών που ανακτήθηκαν από το CSF στην εναλλακτική κλάση Α (Εικ. 2c, d) και στην κλάση Β (Εικ. 2g, h).Η συγκεντρωτική ανάλυση σε κάθε κλάδο αποκάλυψε διαφορετικά προφίλ επιλογής για πεπτίδια 12-μερών (Συμπληρωματικό Σχήμα 5c,d) και μια αύξηση στην αναλογία CSF/τίτλου αίματος με την πάροδο του χρόνου για συγκεντρωμένους κλώνους μετά τον δεύτερο γύρο επιλογής σε σύγκριση με τον πρώτο γύρο επιλογής (Συμπληρωματικό Σχήμα 5e).).
Εμπλουτισμός μοτίβων και πεπτιδίων στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό με δύο διαδοχικούς γύρους επιλογής λειτουργικής εμφάνισης φάγου in vivo.
Όλοι οι φάγοι του εγκεφαλονωτιαίου υγρού που ανακτήθηκαν από τον πρώτο γύρο κάθε ζώου (ζώα #1.1 και #1.2) συνενώθηκαν, ενισχύθηκαν, αναλύθηκαν η αλληλουχία με ΗΤ και επανενέθηκαν μαζί (2 χ 1010 φάγοι/ζώο) 2 SM διασωληνωμένοι αρουραίοι (#1.1 → #).2.1 και 2.2, 1.2 → 2.3 και 2.4).(α,β,ε,στ) Διαγράμματα διασποράς συσχέτισης που συγκρίνουν τη σχετική συχνότητα των τριπεπτιδικών μοτίβων όλων των φάγων που προέρχονται από το CSF στον πρώτο και τον δεύτερο γύρο επιλογής.Σχετική συχνότητα και κατανομή μοτίβων που αντιπροσωπεύουν όλα τα πιθανά επικαλυπτόμενα τριπεπτίδια που βρίσκονται σε πεπτίδια και στους δύο προσανατολισμούς.Εμφανίζεται ο αριθμός των μοτίβων που βρέθηκαν σε 1000 αναγνώσεις.Τα μοτίβα που επιλέχθηκαν ή εξαιρέθηκαν σημαντικά (p < 0,001) σε μία από τις συγκριτικές βιβλιοθήκες επισημαίνονται με κόκκινες κουκκίδες.(c, d, g, h) Αναπαράσταση λογότυπου αλληλουχίας όλων των πλούσιων σε CSF μακρών αλληλουχιών 12 αμινοξέων με βάση τους γύρους 2 και 1 της in vivo επιλογής.Το μέγεθος του κωδικού ενός γράμματος υποδεικνύει πόσο συχνά εμφανίζεται αυτό το αμινοξύ σε αυτή τη θέση.Για την αντιπροσώπευση του λογότυπου, συγκρίνεται η συχνότητα των αλληλουχιών ΕΝΥ που εξάγονται από μεμονωμένα ζώα μεταξύ δύο γύρων επιλογής και εμφανίζονται οι εμπλουτισμένες αλληλουχίες στον δεύτερο γύρο: (γ) #1.1–#2.1 (δ) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 και (η) #1.2–#2.4.Τα πιο εμπλουτισμένα αμινοξέα σε μια δεδομένη θέση στα (γ, δ) ζώα αρ.2.1 και αρ.2.2 ή (g, h) στα ζώα αρ.2.3 και αρ.2.4 εμφανίζονται έγχρωμα.Πράσινο = πολικό, μωβ = ουδέτερο, μπλε = βασικό, κόκκινο = όξινο και μαύρο = υδρόφοβα αμινοξέα.
Μετά τον τρίτο γύρο επιλογής, αναγνωρίσαμε 124 μοναδικές αλληλουχίες πεπτιδίου (#3.1 και #3.2) από 332 κλώνους φάγων που έχουν ανασυσταθεί με CSF που απομονώθηκαν από δύο ζώα (Συμπληρωματικό Σχήμα 6a).Η ακολουθία LGSVS (18,7%) είχε την υψηλότερη σχετική αναλογία, ακολουθούμενη από τα άγριου τύπου ένθετα PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) και SARGSWREIVSLS (2,2%).Στον τελευταίο τέταρτο γύρο, συγκεντρώσαμε δύο ανεξάρτητα επιλεγμένα κλαδιά από τρία ξεχωριστά ζώα (Εικ. 1γ).Από τους 925 κλώνους φάγου με αλληλουχία που ανακτήθηκαν από το ΕΝΥ, στον τέταρτο γύρο βρήκαμε 64 μοναδικές αλληλουχίες πεπτιδίου (Συμπληρωματικό Σχήμα 6b), μεταξύ των οποίων η σχετική αναλογία φάγου άγριου τύπου μειώθηκε στο 0,8%.Οι πιο συνηθισμένοι κλώνοι του ΕΝΥ στον τέταρτο γύρο ήταν οι LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) (3.6VSDGSD) και 3.6%) και RLSSVSDGLS (3.6%) και 3.6%).%)).Το εύρος μήκους των επιλεγμένων πεπτιδίων οφείλεται σε εισαγωγές/διαγραφές νουκλεοτιδίων ή σε πρόωρα κωδικόνια τερματισμού στους εκκινητές της βιβλιοθήκης όταν χρησιμοποιούνται εκφυλισμένα κωδικόνια για το σχεδιασμό της βιβλιοθήκης ΝΝΚ.Τα κωδικόνια πρόωρης διακοπής παράγουν βραχύτερα πεπτίδια και επιλέγονται επειδή περιέχουν το ευνοϊκό μοτίβο αα.Μεγαλύτερα πεπτίδια μπορεί να προκύψουν από εισαγωγές/διαγραφές στους εκκινητές των συνθετικών βιβλιοθηκών.Αυτό τοποθετεί το σχεδιασμένο κωδικόνιο τερματισμού έξω από το πλαίσιο και το διαβάζει έως ότου εμφανιστεί ένα νέο κωδικόνιο τερματισμού προς τα κάτω.Γενικά, υπολογίσαμε τους συντελεστές εμπλουτισμού και για τους τέσσερις γύρους επιλογής συγκρίνοντας τα δεδομένα εισόδου με τα δεδομένα εξόδου δείγματος.Για τον πρώτο γύρο διαλογής, χρησιμοποιήσαμε τίτλους φάγου άγριου τύπου ως μη ειδική αναφορά υποβάθρου.Είναι ενδιαφέρον ότι η επιλογή αρνητικών φάγων ήταν πολύ ισχυρή στον πρώτο κύκλο του ΕΝΥ, αλλά όχι στο αίμα (Εικ. 3α), κάτι που μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή πιθανότητα παθητικής διάχυσης των περισσότερων μελών της βιβλιοθήκης πεπτιδίων στο διαμέρισμα του ΕΝΥ ή οι σχετικοί φάγοι τείνουν να διατηρούνται ή να απομακρύνονται πιο αποτελεσματικά από την κυκλοφορία του αίματος από τους βακτηριοφάγους.Ωστόσο, στον δεύτερο γύρο του panning, παρατηρήθηκε ισχυρή επιλογή φάγων στο CSF και στις δύο clades, υποδηλώνοντας ότι ο προηγούμενος γύρος εμπλουτίστηκε σε φάγους που εμφανίζουν πεπτίδια που προάγουν την πρόσληψη CSF (Εικ. 3a).Και πάλι, χωρίς σημαντικό εμπλουτισμό αίματος.Επίσης στον τρίτο και τον τέταρτο γύρο, οι κλώνοι φάγων εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε ΕΝΥ.Συγκρίνοντας τη σχετική συχνότητα κάθε μοναδικής αλληλουχίας πεπτιδίου μεταξύ των δύο τελευταίων γύρων επιλογής, βρήκαμε ότι οι αλληλουχίες εμπλουτίστηκαν ακόμη περισσότερο στον τέταρτο γύρο επιλογής (Εικ. 3b).Ένα σύνολο 931 τριπεπτιδικών μοτίβων εκχυλίστηκαν και από τις 64 μοναδικές πεπτιδικές αλληλουχίες χρησιμοποιώντας και τους δύο προσανατολισμούς πεπτιδίου.Τα πιο εμπλουτισμένα μοτίβα στον τέταρτο γύρο εξετάστηκαν πιο προσεκτικά για τα προφίλ εμπλουτισμού τους σε όλους τους γύρους σε σύγκριση με την εγχυόμενη βιβλιοθήκη (περικοπή: 10% εμπλουτισμός) (Συμπληρωματικό Σχ. 6γ).Τα γενικά πρότυπα επιλογής έδειξαν ότι τα περισσότερα από τα κίνητρα που μελετήθηκαν εμπλουτίστηκαν σε όλους τους προηγούμενους γύρους και των δύο κλάδων επιλογής.Ωστόσο, ορισμένα μοτίβα (π.χ. SGL, VSG, LGS GSV) προέρχονταν κυρίως από την εναλλακτική κλάση Α, ενώ άλλα (π.χ. FGW, RTN, WGF, NTR) εμπλουτίστηκαν στην εναλλακτική κατηγορία Β.
Επικύρωση μεταφοράς CSF εμπλουτισμένων με CSF πεπτιδίων που εμφανίζονται σε φάγους και βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων οδηγών συζευγμένων με ωφέλιμα φορτία στρεπταβιδίνης.
(α) Οι αναλογίες εμπλουτισμού υπολογίστηκαν και στους τέσσερις γύρους (R1-R4) με βάση τους τίτλους φάγων που έχουν εγχυθεί (εισαγωγή = Ι) και τους τίτλους φάγων του ΕΝΥ (έξοδος = Ο).Οι συντελεστές εμπλουτισμού για τους τρεις τελευταίους γύρους (R2-R4) υπολογίστηκαν σε σύγκριση με τον προηγούμενο γύρο και τον πρώτο γύρο (R1) με δεδομένα βάρους.Οι ανοιχτές ράβδοι είναι εγκεφαλονωτιαίο υγρό, οι σκιασμένες ράβδοι είναι το πλάσμα.(***p<0,001, βάσει του Student's t-test).(β) Κατάλογος με τα πιο άφθονα πεπτίδια φάγου, ταξινομημένα σύμφωνα με τη σχετική αναλογία τους σε όλους τους φάγους που συλλέχθηκαν στο ΕΝΥ μετά τον 4ο γύρο επιλογής.Οι έξι πιο συνηθισμένοι κλώνοι φάγων επισημαίνονται με χρώμα, αριθμημένοι και οι παράγοντες εμπλουτισμού τους μεταξύ των γύρων 3 και 4 της επιλογής (ένθετα).(γ, δ) Οι έξι πιο εμπλουτισμένοι κλώνοι φάγων, οι άδειοι φάγοι και οι γονικές πεπτιδικές βιβλιοθήκες φάγου από τον κύκλο 4 αναλύθηκαν μεμονωμένα σε ένα μοντέλο δειγματοληψίας ΕΝΥ.Συλλέχθηκαν δείγματα ΕΝΥ και αίματος στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία.(γ) Ίσες ποσότητες 6 υποψήφιων κλώνων φάγων (2 x 1010 φάγων/ζώα), κενών φάγων (#1779) (2 x 1010 φάγων/ζώων) και βιβλιοθηκών πεπτιδίων αποθεμάτων φάγων (2 x 1012 φάγους/ζώα) Ενέσεις τουλάχιστον 3 CM στο ζώο για να ελαχιστοποιηθεί η ουρά.Δείχνεται η φαρμακοκινητική του ΕΝΥ κάθε κλώνου φάγου που έχει εγχυθεί και της βιβλιοθήκης πεπτιδίων φάγου με την πάροδο του χρόνου.(δ) δείχνει τη μέση αναλογία ΕΝΥ/αίμα για όλους τους ανακτηθέντες φάγους/mL κατά τη διάρκεια του χρόνου δειγματοληψίας.(ε) Τέσσερα συνθετικά πεπτίδια-οδηγοί και ένας ανακατεμένος έλεγχος συνδέθηκαν με βιοτίνη με στρεπταβιδίνη μέσω του Ν-άκρου τους (επίδειξη τετραμερούς) ακολουθούμενη από ένεση (φλέβα ουράς iv, 10 mg στρεπταβιδίνης/kg).Τουλάχιστον τρεις διασωληνωμένοι αρουραίοι (Ν = 3).).Δείγματα ΕΝΥ συλλέχθηκαν στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και οι συγκεντρώσεις στρεπταβιδίνης μετρήθηκαν με ELISA αντι-στρεπταβιδίνης ΕΝΥ (nd = δεν ανιχνεύθηκε).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, με βάση τη δοκιμή ANOVA).(στ) Σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων του πιο εμπλουτισμένου κλώνου πεπτιδίου φάγου #2002 (μωβ) με άλλους επιλεγμένους κλώνους πεπτιδίου φάγου από τον 4ο γύρο επιλογής.Τα ίδια και παρόμοια θραύσματα αμινοξέων είναι χρωματικά κωδικοποιημένα.
Από όλους τους εμπλουτισμένους φάγους στον τέταρτο γύρο (Εικ. 3b), επιλέχθηκαν έξι υποψήφιοι κλώνοι για περαιτέρω ατομική ανάλυση στο μοντέλο δειγματοληψίας ΕΝΥ.Ίσες ποσότητες έξι βιβλιοθηκών υποψήφιων φάγων, κενών φάγων (χωρίς ένθετο) και πεπτιδίων προφάγου εγχύθηκαν σε τρία ζώα CM με σωληνώσεις και προσδιορίστηκαν φαρμακοκινητικές σε δοκιμές ΕΝΥ (Εικ. 3c) και αίματος (Συμπληρωματικό Σχήμα 7).Όλοι οι κλώνοι φάγων που δοκιμάστηκαν στόχευαν το διαμέρισμα του ΕΝΥ σε επίπεδο 10-1000 φορές υψηλότερο από αυτό του κενού φάγου ελέγχου (#1779).Για παράδειγμα, οι κλώνοι #2020 και #2077 είχαν περίπου 1000 φορές υψηλότερους τίτλους CSF από τον φάγο ελέγχου.Το φαρμακοκινητικό προφίλ κάθε επιλεγμένου πεπτιδίου είναι διαφορετικό, αλλά όλα έχουν υψηλή ικανότητα υποδοχής ΕΝΥ.Παρατηρήσαμε μια σταθερή μείωση με την πάροδο του χρόνου για τους κλώνους #1903 και #2011, ενώ για τους κλώνους #2077, #2002 και #2009 μια αύξηση κατά τα πρώτα 10 λεπτά μπορεί να υποδηλώνει ενεργή μεταφορά, αλλά πρέπει να επαληθευτεί.Οι κλώνοι #2020, #2002 και #2077 σταθεροποιήθηκαν σε υψηλά επίπεδα, ενώ η συγκέντρωση ΕΝΥ του κλώνου #2009 μειώθηκε αργά μετά την αρχική αύξηση.Στη συνέχεια συγκρίναμε τη σχετική συχνότητα κάθε υποψήφιου ΕΝΥ με τη συγκέντρωσή του στο αίμα (Εικ. 3δ).Η συσχέτιση του μέσου τίτλου κάθε υποψήφιου ΕΝΥ με τον τίτλο αίματος του σε όλους τους χρόνους δειγματοληψίας έδειξε ότι τρεις από τους έξι υποψήφιους εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε ΕΝΥ αίματος.Είναι ενδιαφέρον ότι ο κλώνος #2077 έδειξε υψηλότερη σταθερότητα στο αίμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 7).Για να επιβεβαιώσουμε ότι τα ίδια τα πεπτίδια είναι ικανά να μεταφέρουν ενεργά φορτίο εκτός από σωματίδια φάγου στο διαμέρισμα του CSF, συνθέσαμε τέσσερα πεπτίδια-οδηγούς παραγωγοποιημένα με βιοτίνη στο Ν-άκρο όπου τα πεπτίδια συνδέονται με το σωματίδιο φάγου.Βιοτινυλιωμένα πεπτίδια (αρ. 2002, 2009, 2020 και 2077) συζεύχθηκαν με στρεπταβιδίνη (SA) για να ληφθούν πολυμερείς μορφές που μιμούνται κάπως τη γεωμετρία των φάγων.Αυτή η μορφή μας επέτρεψε επίσης να μετρήσουμε την έκθεση SA στο αίμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό ως πεπτίδια πρωτεΐνης που μεταφέρουν φορτίο.Είναι σημαντικό ότι τα δεδομένα φάγου θα μπορούσαν συχνά να αναπαραχθούν όταν χορηγήθηκαν συνθετικά πεπτίδια σε αυτή τη συζευγμένη με SA μορφή (Εικ. 3e).Τα ανακατεμένα πεπτίδια είχαν λιγότερη αρχική έκθεση και ταχύτερη κάθαρση του ΕΝΥ με μη ανιχνεύσιμα επίπεδα εντός 48 ωρών.Για να αποκτήσουμε εικόνα για τις οδούς διανομής αυτών των κλώνων πεπτιδικών φάγων στον χώρο του ΕΝΥ, αναλύσαμε τον εντοπισμό μεμονωμένων επιτυχιών πεπτιδίου φάγου χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC) για την άμεση ανίχνευση σωματιδίων φάγου 1 ώρα μετά την ενδοφλέβια ένεση in vivo.Σημειωτέον, οι κλώνοι #2002, #2077 και #2009 μπορούσαν να ανιχνευθούν με έντονη χρώση στα τριχοειδή αγγεία του εγκεφάλου, ενώ ο φάγος ελέγχου (#1779) και ο κλώνος #2020 δεν ανιχνεύθηκαν (Συμπληρωματικό Σχήμα 8).Αυτό υποδηλώνει ότι αυτά τα πεπτίδια συμβάλλουν στην επίδραση στον εγκέφαλο ακριβώς διασχίζοντας το BBB.Απαιτείται περαιτέρω λεπτομερής ανάλυση για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, καθώς μπορεί επίσης να εμπλέκεται η διαδρομή BSCFB.Κατά τη σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων του πιο εμπλουτισμένου κλώνου (#2002) με άλλα επιλεγμένα πεπτίδια, σημειώθηκε ότι μερικά από αυτά έχουν παρόμοιες προεκτάσεις αμινοξέων, που μπορεί να υποδεικνύουν έναν παρόμοιο μηχανισμό μεταφοράς (Εικ. 3στ).
Λόγω του μοναδικού προφίλ πλάσματος και της σημαντικής αύξησης του ΕΝΥ με την πάροδο του χρόνου, ο κλώνος εμφάνισης φάγου #2077 διερευνήθηκε περαιτέρω για μεγαλύτερη περίοδο 48 ωρών και μπόρεσε να αναπαράγει την ταχεία αύξηση του ΕΝΥ που παρατηρήθηκε σε συνδυασμό με παρατεταμένα επίπεδα SA (Εικ. 4α).Όσον αφορά άλλους αναγνωρισμένους κλώνους φάγου, ο #2077 χρωματίστηκε έντονα για τα τριχοειδή αγγεία του εγκεφάλου και έδειξε σημαντικό εντοπισμό με λεκτίνη τριχοειδούς δείκτη όταν παρατηρήθηκε σε υψηλότερη ανάλυση και πιθανώς κάποια χρώση στον παρεγχυματικό χώρο (Εικόνα 4β).Για να διερευνήσουμε εάν μπορούσαν να επιτευχθούν φαρμακολογικές επιδράσεις με τη μεσολάβηση πεπτιδίου στο ΚΝΣ, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα στο οποίο οι βιοτινυλιωμένες εκδόσεις του i) του πεπτιδίου μεταβίβασης #2077 και ii) του πεπτιδίου αναστολέα BACE1 αναμίχθηκαν με SA σε δύο διαφορετικές αναλογίες.Για τον ένα συνδυασμό χρησιμοποιήσαμε μόνο τον αναστολέα πεπτιδίου BACE1 και για τον άλλο χρησιμοποιήσαμε αναλογία 1:3 του αναστολέα πεπτιδίου BACE1 προς το πεπτίδιο #2077.Και τα δύο δείγματα χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως και τα επίπεδα αίματος και εγκεφαλονωτιαίου υγρού του βήτα-αμυλοειδούς πεπτιδίου 40 (Abeta40) μετρήθηκαν με την πάροδο του χρόνου.Το Abeta40 μετρήθηκε στο ΕΝΥ καθώς αντανακλά την αναστολή BACE1 στο παρέγχυμα του εγκεφάλου.Όπως αναμενόταν, και τα δύο σύμπλοκα μείωσαν σημαντικά τα επίπεδα του Abeta40 στο αίμα (Εικ. 4c, d).Ωστόσο, μόνο δείγματα που περιέχουν μίγμα πεπτιδίου αρ.2077 και ένας αναστολέας του πεπτιδίου BACE1 συζευγμένος με SA προκάλεσε σημαντική μείωση στο Abeta40 στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Εικ. 4γ).Τα δεδομένα δείχνουν ότι το πεπτίδιο αρ.Το 2077 είναι σε θέση να μεταφέρει την πρωτεΐνη SA των 60 kDa στο ΚΝΣ και επίσης προκαλεί φαρμακολογικά αποτελέσματα με συζευγμένους με SA αναστολείς του πεπτιδίου BACE1.
(α) Κλωνική ένεση (2 × 10 φάγοι/ζώο) φάγου Τ7 που δείχνει μακροχρόνια φαρμακοκινητικά προφίλ του πεπτιδίου CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) και του φάγου ελέγχου χωρίς ένεση (#1779) σε τουλάχιστον τρεις διασωληνωμένους με CM αρουραίους.(β) Ομοεστιακή μικροσκοπική εικόνα αντιπροσωπευτικών φλοιωδών μικροαγγείων σε αρουραίους στους οποίους έγινε έγχυση φάγου (2 × 10 10 φάγοι/ζώο) που δείχνει αντιχρώση του πεπτιδίου #2077 και των αγγείων (λεκτίνη).Αυτοί οι κλώνοι φάγων χορηγήθηκαν σε 3 αρουραίους και αφέθηκαν να κυκλοφορήσουν για 1 ώρα πριν από την έγχυση.Οι εγκέφαλοι τεμαχίστηκαν και χρωματίστηκαν με πολυκλωνικά επισημασμένα με FITC αντισώματα έναντι του καψιδίου φάγου Τ7.Δέκα λεπτά πριν από την έγχυση και την επακόλουθη στερέωση, χορηγήθηκε ενδοφλεβίως επισημασμένη με DyLight594 λεκτίνη.Φθορίζουσες εικόνες που δείχνουν χρώση με λεκτίνη (κόκκινο) της αυλής πλευράς των μικροαγγείων και των φάγων (πράσινων) στον αυλό των τριχοειδών αγγείων και του περιαγγειακού εγκεφαλικού ιστού.Η γραμμή κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm.(γ, δ) Βιοτινυλιωμένο ανασταλτικό πεπτίδιο BACE1 μόνο του ή σε συνδυασμό με βιοτινυλιωμένο πεπτίδιο μεταβίβασης #2077 συζεύχθηκε με στρεπταβιδίνη και ακολούθησε ενδοφλέβια ένεση τουλάχιστον τριών διασωληνωμένων αρουραίων CM (10 mg στρεπταβιδίνης/kg).Η μείωση του Αβ40 που προκαλείται από αναστολέα πεπτιδίου BACE1 μετρήθηκε με ELISA Aβ1-40 στο αίμα (κόκκινο) και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (πορτοκαλί) στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία.Για καλύτερη σαφήνεια, σχεδιάζεται μια διακεκομμένη γραμμή στο γράφημα σε κλίμακα 100%.(γ) Ποσοστό μείωσης του Αβ40 στο αίμα (κόκκινα τρίγωνα) και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (πορτοκαλί τρίγωνα) σε αρουραίους που έλαβαν αγωγή με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με το πεπτίδιο διέλευσης #2077 και το ανασταλτικό πεπτίδιο BACE1 σε αναλογία 3:1.(δ) Ποσοστό μείωσης του αίματος Αβ40 (κόκκινοι κύκλοι) και εγκεφαλονωτιαίου υγρού (πορτοκαλί κύκλοι) αρουραίων που έλαβαν θεραπεία με στρεπταβιδίνη συνδεδεμένη μόνο με ένα ανασταλτικό πεπτίδιο BACE1.Η συγκέντρωση Αβ στον έλεγχο ήταν 420 pg/ml (τυπική απόκλιση = 101 pg/ml).
Η εμφάνιση φάγων έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε διάφορους τομείς της βιοϊατρικής έρευνας17.Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για in vivo μελέτες αγγειακής ποικιλομορφίας18,19 καθώς και για μελέτες που στοχεύουν τα εγκεφαλικά αγγεία20,21,22,23,24,25,26.Σε αυτή τη μελέτη, επεκτείναμε την εφαρμογή αυτής της μεθόδου επιλογής όχι μόνο στον άμεσο εντοπισμό πεπτιδίων που στοχεύουν τα εγκεφαλικά αγγεία, αλλά και στην ανακάλυψη υποψηφίων με ενεργές ιδιότητες μεταφοράς για να διασχίσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό.Περιγράφουμε τώρα την ανάπτυξη μιας διαδικασίας επιλογής in vivo σε διασωληνωμένους με CM αρουραίους και αποδεικνύουμε τη δυνατότητά της να ταυτοποιεί πεπτίδια με ιδιότητες υποδοχής ΕΝΥ.Χρησιμοποιώντας τον φάγο Τ7 που εμφανίζει μια βιβλιοθήκη τυχαίων πεπτιδίων 12-μερών, μπορέσαμε να δείξουμε ότι ο φάγος Τ7 είναι αρκετά μικρός (διάμετρος περίπου 60 nm)10 ώστε να προσαρμοστεί στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, διασχίζοντας έτσι απευθείας τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό ή το χοριοειδές πλέγμα.Παρατηρήσαμε ότι η συλλογή εγκεφαλονωτιαίου υγρού από αρουραίους CM με σωληνώσεις ήταν μια καλά ελεγχόμενη in vivo λειτουργική μέθοδος διαλογής και ότι ο εξαγόμενος φάγος όχι μόνο συνδέθηκε με το αγγειακό σύστημα αλλά λειτουργούσε και ως μεταφορέας κατά μήκος του αιματοεγκεφαλικού φραγμού.Επιπλέον, συλλέγοντας ταυτόχρονα αίμα και εφαρμόζοντας HTS σε ΕΝΥ και φάγους που προέρχονται από αίμα, επιβεβαιώσαμε ότι η επιλογή μας για το ΕΝΥ δεν επηρεάστηκε από τον εμπλουτισμό του αίματος ή την καταλληλότητα για επέκταση μεταξύ των γύρων επιλογής.Ωστόσο, το διαμέρισμα αίματος αποτελεί μέρος της διαδικασίας επιλογής, καθώς οι φάγοι που μπορούν να φτάσουν στο διαμέρισμα του ΕΝΥ πρέπει να επιβιώσουν και να κυκλοφορούν στην κυκλοφορία του αίματος για αρκετό καιρό ώστε να εμπλουτιστούν στον εγκέφαλο.Προκειμένου να εξαγάγουμε αξιόπιστες πληροφορίες ακολουθίας από ακατέργαστα δεδομένα HTS, εφαρμόσαμε φίλτρα προσαρμοσμένα σε σφάλματα αλληλουχίας για συγκεκριμένη πλατφόρμα στη ροή εργασιών ανάλυσης.Με την ενσωμάτωση κινητικών παραμέτρων στη μέθοδο διαλογής, επιβεβαιώσαμε την ταχεία φαρμακοκινητική των φάγων Τ7 άγριου τύπου (t½ ~ 28 min) στο αίμα24, 27, 28 και προσδιορίσαμε επίσης τον χρόνο ημιζωής τους στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (t½ ~ 26 min) ανά λεπτό).Παρά τα παρόμοια φαρμακοκινητικά προφίλ στο αίμα και στο ΕΝΥ, μόνο το 0,001% της συγκέντρωσης του φάγου στο αίμα μπορεί να ανιχνευθεί στο ΕΝΥ, υποδεικνύοντας χαμηλή κινητικότητα υποβάθρου του άγριου τύπου φάγου Τ7 κατά μήκος του αιματοεγκεφαλικού φραγμού.Αυτή η εργασία υπογραμμίζει τη σημασία του πρώτου γύρου επιλογής όταν χρησιμοποιούνται in vivo στρατηγικές panning, ειδικά για συστήματα φάγων που απομακρύνονται γρήγορα από την κυκλοφορία, καθώς λίγοι κλώνοι μπορούν να φτάσουν στο διαμέρισμα του ΚΝΣ.Έτσι, στον πρώτο γύρο, η μείωση της ποικιλομορφίας της βιβλιοθήκης ήταν πολύ μεγάλη, καθώς μόνο ένας περιορισμένος αριθμός κλώνων συλλέχτηκε τελικά σε αυτό το πολύ αυστηρό μοντέλο CSF.Αυτή η in vivo στρατηγική panning περιλάμβανε διάφορα στάδια επιλογής όπως ενεργή συσσώρευση στο διαμέρισμα ΕΝΥ, επιβίωση κλώνων στο διαμέρισμα αίματος και ταχεία απομάκρυνση των κλώνων φάγων Τ7 από το αίμα μέσα στα πρώτα 10 λεπτά (Εικ. 1d και Συμπληρωματικό Σχήμα 4Μ).).Έτσι, μετά τον πρώτο γύρο, εντοπίστηκαν διαφορετικοί κλώνοι φάγων στο ΕΝΥ, αν και η ίδια αρχική δεξαμενή χρησιμοποιήθηκε για μεμονωμένα ζώα.Αυτό υποδηλώνει ότι πολλαπλά αυστηρά βήματα επιλογής για βιβλιοθήκες πηγής με μεγάλο αριθμό μελών βιβλιοθήκης έχουν ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση της ποικιλομορφίας.Επομένως, τα τυχαία συμβάντα θα γίνουν αναπόσπαστο μέρος της αρχικής διαδικασίας επιλογής, επηρεάζοντας σε μεγάλο βαθμό το αποτέλεσμα.Είναι πιθανό ότι πολλοί από τους κλώνους της αρχικής βιβλιοθήκης είχαν παρόμοια τάση εμπλουτισμού ΕΝΥ.Ωστόσο, ακόμη και κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες, τα αποτελέσματα επιλογής μπορεί να διαφέρουν λόγω του μικρού αριθμού κάθε συγκεκριμένου κλώνου στην αρχική ομάδα.
Τα μοτίβα που εμπλουτίζονται στο ΕΝΥ διαφέρουν από αυτά στο αίμα.Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε την πρώτη στροφή προς πεπτίδια πλούσια σε γλυκίνη στο αίμα μεμονωμένων ζώων.(Εικ. 1ζ, Συμπληρωματικά Σχ. 4ε, 4στ).Τα πεπτίδια γλυκίνης που περιέχουν φάγους μπορεί να είναι πιο σταθερά και λιγότερο πιθανό να αφαιρεθούν από την κυκλοφορία.Ωστόσο, αυτά τα πλούσια σε γλυκίνη πεπτίδια δεν ανιχνεύθηκαν στα δείγματα του εγκεφαλονωτιαίου υγρού, υποδηλώνοντας ότι οι επιμελημένες βιβλιοθήκες πέρασαν από δύο διαφορετικά στάδια επιλογής: ένα στο αίμα και ένα άλλο που αφέθηκε να συσσωρευτεί στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό.Οι εμπλουτισμένοι με ΕΝΥ κλώνοι που προκύπτουν από τον τέταρτο γύρο επιλογής έχουν δοκιμαστεί εκτενώς.Σχεδόν όλοι οι κλώνοι που δοκιμάστηκαν μεμονωμένα επιβεβαιώθηκε ότι ήταν εμπλουτισμένοι σε ΕΝΥ σε σύγκριση με τον τυφλό φάγο ελέγχου.Ένα χτύπημα πεπτιδίου (#2077) εξετάστηκε με περισσότερες λεπτομέρειες.Έδειξε μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής στο πλάσμα σε σύγκριση με άλλα χτυπήματα (Εικόνα 3δ και Συμπληρωματικό Σχήμα 7) και είναι ενδιαφέρον ότι αυτό το πεπτίδιο περιείχε ένα υπόλειμμα κυστεΐνης στο C-άκρο.Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι η προσθήκη κυστεΐνης σε πεπτίδια μπορεί να βελτιώσει τις φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες δεσμεύοντας την αλβουμίνη 29 .Αυτό είναι επί του παρόντος άγνωστο για το πεπτίδιο #2077 και απαιτεί περαιτέρω μελέτη.Ορισμένα πεπτίδια έδειξαν μια εξάρτηση σθένους στον εμπλουτισμό του ΕΝΥ (τα δεδομένα δεν φαίνονται), η οποία μπορεί να σχετίζεται με την εμφανιζόμενη γεωμετρία της επιφάνειας του καψιδίου Τ7.Το σύστημα Τ7 που χρησιμοποιήσαμε έδειξε 5-15 αντίγραφα κάθε πεπτιδίου ανά σωματίδιο φάγου.Η IHC πραγματοποιήθηκε σε υποψήφιους κλώνους μολύβδου φάγου που εγχύθηκαν ενδοφλεβίως στον εγκεφαλικό φλοιό αρουραίων (Συμπληρωματικό Σχήμα 8).Τα δεδομένα έδειξαν ότι τουλάχιστον τρεις κλώνοι (Νο. 2002, Νο. 2009 και Νο. 2077) αλληλεπιδρούν με το BBB.Μένει να καθοριστεί εάν αυτή η αλληλεπίδραση BBB έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ΕΝΥ ή τη μετακίνηση αυτών των κλώνων απευθείας στο BCSFB.Είναι σημαντικό ότι δείχνουμε ότι τα επιλεγμένα πεπτίδια διατηρούν την ικανότητα μεταφοράς του ΕΝΥ όταν συντίθενται και συνδέονται με το φορτίο πρωτεΐνης.Η σύνδεση των Ν-τερματικών βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων σε SA ουσιαστικά επαναλαμβάνει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τους αντίστοιχους κλώνους φάγου τους στο αίμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Εικ. 3e).Τέλος, δείχνουμε ότι το πεπτίδιο μολύβδου #2077 είναι σε θέση να προάγει την εγκεφαλική δράση ενός βιοτινυλιωμένου πεπτιδικού αναστολέα του BACE1 συζευγμένου με SA, προκαλώντας έντονες φαρμακοδυναμικές επιδράσεις στο ΚΝΣ μειώνοντας σημαντικά τα επίπεδα Abeta40 στο ΕΝΥ (Εικ. 4).Δεν μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε κανένα ομόλογο στη βάση δεδομένων πραγματοποιώντας μια αναζήτηση ομολογίας πεπτιδικής ακολουθίας όλων των επισκέψεων.Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το μέγεθος της βιβλιοθήκης Τ7 είναι περίπου 109, ενώ το θεωρητικό μέγεθος βιβλιοθήκης για τα 12-mers είναι 4 x 1015. Επομένως, επιλέξαμε μόνο ένα μικρό κλάσμα του χώρου ποικιλομορφίας της βιβλιοθήκης πεπτιδίων 12 μερών, πράγμα που μπορεί να σημαίνει ότι περισσότερα βελτιστοποιημένα πεπτίδια μπορούν να αναγνωριστούν με τον προσδιορισμό του χώρου κατά την ταυτοποίηση αυτών των τιμών.Υποθετικά, ένας από τους λόγους για τους οποίους δεν βρήκαμε φυσικά ομόλογα αυτών των πεπτιδίων μπορεί να είναι η αποεπιλογή κατά την εξέλιξη για να αποτραπεί η ανεξέλεγκτη είσοδος ορισμένων πεπτιδικών μοτίβων στον εγκέφαλο.
Συνολικά, τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια βάση για μελλοντικές εργασίες για τον εντοπισμό και τον χαρακτηρισμό των συστημάτων μεταφοράς του εγκεφαλοαγγειακού φραγμού in vivo με περισσότερες λεπτομέρειες.Η βασική ρύθμιση αυτής της μεθόδου βασίζεται σε μια στρατηγική λειτουργικής επιλογής που όχι μόνο προσδιορίζει κλώνους με ιδιότητες δέσμευσης εγκεφαλικών αγγείων, αλλά περιλαμβάνει επίσης ένα κρίσιμο βήμα στο οποίο οι επιτυχημένοι κλώνοι έχουν εγγενή δραστηριότητα για να διασχίζουν βιολογικούς φραγμούς in vivo στο διαμέρισμα του ΚΝΣ.είναι να διευκρινιστεί ο μηχανισμός μεταφοράς αυτών των πεπτιδίων και η προτίμησή τους για δέσμευση στο μικροαγγειακό σύστημα που είναι ειδικό για την περιοχή του εγκεφάλου.Αυτό μπορεί να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων οδών για τη μεταφορά του BBB και των υποδοχέων.Αναμένουμε ότι τα αναγνωρισμένα πεπτίδια μπορούν να συνδεθούν απευθείας με εγκεφαλικούς αγγειακούς υποδοχείς ή σε κυκλοφορούντες συνδέτες που μεταφέρονται μέσω του BBB ή του BCSFB.Οι πεπτιδικοί φορείς με δραστηριότητα μεταφοράς CSF που ανακαλύφθηκαν σε αυτή την εργασία θα διερευνηθούν περαιτέρω.Αυτήν τη στιγμή διερευνούμε την εξειδίκευση του εγκεφάλου αυτών των πεπτιδίων για την ικανότητά τους να διασχίζουν το BBB και/ή το BCSFB.Αυτά τα νέα πεπτίδια θα είναι εξαιρετικά πολύτιμα εργαλεία για την πιθανή ανακάλυψη νέων υποδοχέων ή μονοπατιών και για την ανάπτυξη νέων εξαιρετικά αποτελεσματικών πλατφορμών για την παράδοση μακρομορίων, όπως τα βιολογικά, στον εγκέφαλο.
Σωληνώστε τη μεγάλη δεξαμενή (CM) χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της μεθόδου που περιγράφηκε προηγουμένως.Αναισθητοποιημένοι αρουραίοι Wistar (200-350 g) τοποθετήθηκαν σε στερεοταξική συσκευή και έγινε μια μέση τομή πάνω από το ξυρισμένο και άσηπτα προετοιμασμένο τριχωτό της κεφαλής για να εκτεθεί το κρανίο.Ανοίξτε δύο τρύπες στην περιοχή του πάνω φύλλου και στερεώστε τις βίδες στερέωσης στις τρύπες.Μια πρόσθετη οπή διανοίχτηκε στην πλευρική ινιακή κορυφή για στερεοτακτική καθοδήγηση ενός σωληνίσκου από ανοξείδωτο χάλυβα στο CM.Εφαρμόστε οδοντικό τσιμέντο γύρω από την κάνουλα και ασφαλίστε με βίδες.Μετά από φωτοσκλήρυνση και σκλήρυνση με τσιμέντο, το τραύμα του δέρματος κλείστηκε με ράμμα 4/0 supramid.Η σωστή τοποθέτηση του σωληνίσκου επιβεβαιώνεται με αυθόρμητη διαρροή εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ).Αφαιρέστε τον αρουραίο από τη στερεοταξική συσκευή, λάβετε την κατάλληλη μετεγχειρητική φροντίδα και διαχείριση του πόνου και αφήστε τον να αναρρώσει για τουλάχιστον μία εβδομάδα έως ότου παρατηρηθούν σημάδια αίματος στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό.Οι αρουραίοι Wistar (Crl:WI/Han) ελήφθησαν από τον Charles River (Γαλλία).Όλοι οι αρουραίοι διατηρήθηκαν υπό συγκεκριμένες συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα.Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Κτηνιατρικό Γραφείο της πόλης της Βασιλείας, Ελβετία, και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την Άδεια Ζώου Νο. 2474 (Αξιολόγηση της Ενεργής Μεταφοράς Εγκεφάλου με Μέτρηση Επιπέδων Θεραπευτικών Υποψηφίων στο Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό και τον Εγκέφαλο Αρουραίων).
Κρατήστε απαλά τις αισθήσεις του επίμυ με τον σωληνίσκο CM στο χέρι.Αφαιρέστε το Datura από τον σωληνίσκο και συλλέξτε 10 µl εγκεφαλονωτιαίου υγρού που ρέει αυθόρμητα.Δεδομένου ότι η βατότητα του σωληνίσκου ήταν τελικά σε κίνδυνο, μόνο διαυγή δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού χωρίς ένδειξη μόλυνσης του αίματος ή αποχρωματισμού συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη.Παράλληλα, ελήφθησαν περίπου 10-20 μl αίματος από μια μικρή τομή στην άκρη της ουράς σε σωλήνες με ηπαρίνη (Sigma-Aldrich).Το ΕΝΥ και το αίμα συλλέχθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την ενδοφλέβια ένεση του φάγου Τ7.Περίπου 5–10 μl υγρού απορρίφθηκαν πριν από τη συλλογή κάθε δείγματος ΕΝΥ, που αντιστοιχεί στον νεκρό όγκο του καθετήρα.
Οι βιβλιοθήκες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το φορέα T7Select 10-3b όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο συστήματος T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Εν συντομία, ένα τυχαίο ένθετο DNA 12-μερών συντέθηκε στην ακόλουθη μορφή:
Το κωδικόνιο NNK χρησιμοποιήθηκε για την αποφυγή διπλών κωδικονίων τερματισμού και υπερέκφρασης αμινοξέων στο ένθετο.Το Ν είναι μια χειροκίνητα μικτή ισομοριακή αναλογία κάθε νουκλεοτιδίου και το Κ είναι μια χειροκίνητα μικτή ισομοριακή αναλογία νουκλεοτιδίων αδενίνης και κυτοσίνης.Οι μονόκλωνες περιοχές μετατράπηκαν σε δίκλωνο DNA με περαιτέρω επώαση με dNTP (Novagen) και ένζυμο Klenow (New England Biolabs) σε ρυθμιστικό διάλυμα Klenow (New England Biolabs) για 3 ώρες στους 37°C.Μετά την αντίδραση, δίκλωνο DNA ανακτήθηκε με καθίζηση EtOH.Το προκύπτον DNA υπέστη πέψη με ένζυμα περιορισμού EcoRI και HindIII (και τα δύο από τη Roche).Το διασπασμένο και καθαρισμένο ένθετο (QIAquick, Qiagen) (λιγάση Τ4, New England Biolabs) συνδέθηκε στη συνέχεια εντός πλαισίου σε έναν προ-διασπασμένο φορέα Τ7 μετά το αμινοξύ 348 του γονιδίου καψιδίου 10Β.Οι αντιδράσεις απολίνωσης επωάστηκαν στους 16°C για 18 ώρες πριν από την in vitro συσκευασία.Η συσκευασία φάγων in vitro πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται με το κιτ κλωνοποίησης T7Select 10-3b (Novagen) και το διάλυμα συσκευασίας ενισχύθηκε μία φορά για λύση χρησιμοποιώντας Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν, τιτλοδοτήθηκαν και καταψύχθηκαν στους -80°C ως μητρικό διάλυμα γλυκερίνης.
Απευθείας ενίσχυση PCR μεταβλητών περιοχών φάγου που ενισχύθηκαν σε ζωμό ή πλάκα χρησιμοποιώντας ιδιόκτητους εκκινητές σύντηξης 454/Roche-amplicon.Ο εμπρόσθιος εκκινητής σύντηξης περιέχει αλληλουχίες που πλευρίζουν τη μεταβλητή περιοχή (NNK) 12 (ειδικό για το πρότυπο), τον προσαρμογέα τιτανίου GS FLX A και μια ακολουθία κλειδιών βιβλιοθήκης τεσσάρων βάσεων (TCAG) (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α):
Ο εκκινητής ανάστροφης σύντηξης περιέχει επίσης βιοτίνη συνδεδεμένη σε σφαιρίδια σύλληψης και τον προσαρμογέα B τιτανίου GS FLX που απαιτείται για κλωνική ενίσχυση κατά τη διάρκεια της PCR γαλακτώματος:
Τα αμπλικόνια στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε πυροαλληλουχία 454/Roche σύμφωνα με το πρωτόκολλο 454 GS-FLX Titanium.Για χειροκίνητο προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), το DNA φάγου Τ7 ενισχύθηκε με PCR και αλληλουχήθηκε με τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών:
Τα ένθετα από μεμονωμένες πλάκες υποβλήθηκαν σε ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας το κιτ Roche Fast Start DNA Polymerase (σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή).Εκτελέστε θερμή εκκίνηση (10 λεπτά στους 95 °C) και 35 κύκλους ενίσχυσης (50 δευτερόλεπτα στους 95 °C, 1 λεπτό στους 50 °C και 1 λεπτό στους 72 °C).
Φάγος από βιβλιοθήκες, φάγος άγριου τύπου, φάγος που διασώθηκε από ΕΝΥ και αίμα, ή μεμονωμένοι κλώνοι ενισχύθηκαν σε Escherichia coli BL5615 σε ζωμό ΤΒ (Sigma Aldrich) ή σε δίσκους 500 cm2 (Thermo Scientific) για 4 ώρες στους 37°C.Οι φάγοι εκχυλίστηκαν από τις πλάκες με έκπλυση των πλακών με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (Fluka Analytical) ή με συλλογή των πλακών με αποστειρωμένα άκρα πιπέτας.Οι φάγοι απομονώθηκαν από το υπερκείμενο της καλλιέργειας ή το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης με ένα γύρο κατακρήμνισης πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG 8000) (Promega) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA.
Ο ενισχυμένος φάγος υποβλήθηκε σε 2-3 γύρους αφαίρεσης ενδοτοξίνης χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αφαίρεσης ενδοτοξίνης (Miltenyi Biotec) πριν από την ενδοφλέβια (IV) ένεση (500 μl/ζώο).Στον πρώτο γύρο, εισήχθησαν 2×1012 φάγοι.στο δεύτερο, 2×1010 φάγοι.στον τρίτο και τον τέταρτο γύρο επιλογής, 2×109 φάγοι ανά ζώο.Το περιεχόμενο φάγων στο ΕΝΥ και τα δείγματα αίματος που συλλέχθηκαν στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία προσδιορίστηκε με μέτρηση πλακών σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (εγχειρίδιο συστήματος T7Select).Η επιλογή φάγου διεξήχθη με ενδοφλέβια ένεση καθαρισμένων βιβλιοθηκών στην ουραία φλέβα ή με επανέγχυση φάγου που εξήχθη από το ΕΝΥ από τον προηγούμενο γύρο επιλογής και οι επόμενες συγκομιδές πραγματοποιήθηκαν στα 10 λεπτά, 30 λεπτά, 60 λεπτά, 90 λεπτά, 120 λεπτά, 180 λεπτά, και δείγματα αίματος 240 λεπτά αντίστοιχα.Διεξήχθησαν συνολικά τέσσερις γύροι in vivo panning στους οποίους οι δύο επιλεγμένοι κλάδοι αποθηκεύτηκαν χωριστά και αναλύθηκαν κατά τους τρεις πρώτους γύρους επιλογής.Όλα τα ένθετα φάγων που εξήχθησαν από το ΕΝΥ από τους δύο πρώτους γύρους επιλογής υποβλήθηκαν σε πυροαλληλουχία 454/Roche, ενώ όλοι οι κλώνοι που εξήχθησαν από το ΕΝΥ από τους δύο τελευταίους γύρους επιλογής αναλύθηκαν με το χέρι.Όλοι οι φάγοι αίματος από τον πρώτο γύρο επιλογής υποβλήθηκαν επίσης σε πυροαλληλουχία 454/Roche.Για ένεση κλώνων φάγων, επιλεγμένοι φάγοι ενισχύθηκαν σε Ε. coli (BL5615) σε πλάκες 500 cm2 στους 37°C για 4 ώρες.Κλώνοι που επιλέχθηκαν μεμονωμένα και αλληλουχήθηκαν με το χέρι πολλαπλασιάστηκαν σε μέσο ΤΒ.Μετά την εκχύλιση φάγου, τον καθαρισμό και την απομάκρυνση της ενδοτοξίνης (όπως περιγράφεται παραπάνω), 2×1010 φάγοι/ζώο σε 300 μl εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε μία ουραία φλέβα.
Προεπεξεργασία και ποιοτικό φιλτράρισμα δεδομένων ακολουθίας.Τα δεδομένα Raw 454/Roche μετατράπηκαν από μια δυαδική τυπική μορφή χάρτη ροής (sff) σε μια αναγνώσιμη μορφή Pearson (fasta) χρησιμοποιώντας λογισμικό προμηθευτή.Περαιτέρω επεξεργασία της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ιδιόκτητα προγράμματα και σενάρια C (μη απελευθερωμένο πακέτο λογισμικού) όπως περιγράφεται παρακάτω.Η ανάλυση των πρωτογενών δεδομένων περιλαμβάνει αυστηρές διαδικασίες φιλτραρίσματος πολλαπλών σταδίων.Για να φιλτράρετε τις αναγνώσεις που δεν περιείχαν έγκυρη αλληλουχία DNA ένθετου 12μερών, οι αναγνώσεις ευθυγραμμίστηκαν διαδοχικά με την ετικέτα έναρξης (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), την ετικέτα διακοπής (TAAGCTTGCGGGCCGCACTCGAGTA) και το ένθετο φόντου (CCCTGCAGGGATATCCCGTCGGAATTCT) χρησιμοποιώντας το global test.ευθυγράμμιση που επιτρέπει έως και 2 ασυνέπειες ανά ευθυγράμμιση31.Επομένως, οι αναγνώσεις χωρίς ετικέτες έναρξης και διακοπής και οι αναγνώσεις που περιέχουν ένθετα φόντου, δηλαδή στοίχιση που υπερβαίνει τον επιτρεπόμενο αριθμό αναντιστοιχιών, αφαιρέθηκαν από τη βιβλιοθήκη.Όσον αφορά τις υπόλοιπες αναγνώσεις, η αλληλουχία DNA N-mer που εκτείνεται από το σημείο έναρξης και τελειώνει πριν από το σημείο λήξης αποκόπηκε από την αρχική αλληλουχία ανάγνωσης και υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία (εφεξής «ένθετο»).Μετά τη μετάφραση του ενθέτου, το τμήμα μετά το πρώτο κωδικόνιο τερματισμού στο άκρο 5' του εκκινητή αφαιρείται από το ένθετο.Επιπλέον, αφαιρέθηκαν επίσης νουκλεοτίδια που οδηγούσαν σε ατελή κωδικόνια στο 3' άκρο του εκκινητή.Για να εξαιρεθούν τα ένθετα που περιέχουν μόνο αλληλουχίες υποβάθρου, αφαιρέθηκαν επίσης μεταφρασμένα ένθετα που ξεκινούσαν με το πρότυπο αμινοξέων "PAG".Πεπτίδια με μετα-μεταφραστικό μήκος μικρότερο από 3 αμινοξέα αφαιρέθηκαν από τη βιβλιοθήκη.Τέλος, αφαιρέστε τον πλεονασμό στο ένθετο και προσδιορίστε τη συχνότητα κάθε μοναδικού ένθετου.Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης περιελάμβαναν έναν κατάλογο νουκλεοτιδικών αλληλουχιών (ένθετα) και τις (αναγνωσμένες) συχνότητές τους (Συμπληρωματικά Σχήματα 1c και 2).
Εισαγωγές DNA ομάδας N-mer κατά ομοιότητα αλληλουχίας: Για την εξάλειψη σφαλμάτων αλληλουχίας ειδικά για το 454/Roche (όπως προβλήματα με την αλληλούχιση επεκτάσεων ομοπολυμερών) και την αφαίρεση λιγότερο σημαντικών πλεονασμάτων, τα προηγουμένως φιλτραρισμένα ένθετα αλληλουχίας N-mer DNA ταξινομούνται κατά ομοιότητα.εισαγωγές (επιτρέπονται έως και 2 μη αντιστοιχισμένες βάσεις) χρησιμοποιώντας έναν επαναληπτικό αλγόριθμο που ορίζεται ως εξής: οι εισαγωγές ταξινομούνται πρώτα με βάση τη συχνότητά τους (από την υψηλότερη προς τη χαμηλότερη) και εάν είναι ίδιες, με τη δευτερεύουσα ταξινόμηση κατά μήκος (μακρύτερο προς μικρότερο) ).Έτσι, οι πιο συχνές και μεγαλύτερες εισαγωγές ορίζουν την πρώτη «ομάδα».Η συχνότητα της ομάδας έχει ρυθμιστεί στην βασική συχνότητα.Στη συνέχεια, κάθε εισαγωγή που απομένει στην ταξινομημένη λίστα δοκιμάστηκε να προστεθεί στην ομάδα με ζεύγη στοίχισης Needleman-Wunsch.Εάν ο αριθμός των αναντιστοιχιών, των εισαγωγών ή των διαγραφών σε μια στοίχιση δεν υπερβαίνει το όριο των 2, προστίθεται μια εισαγωγή στην ομάδα και η συνολική συχνότητα της ομάδας αυξάνεται κατά πόσο συχνά προστέθηκε η εισαγωγή.Τα ένθετα που προστίθενται σε μια ομάδα επισημαίνονται ως χρησιμοποιημένα και εξαιρούνται από περαιτέρω επεξεργασία.Εάν η ακολουθία εισαγωγής δεν μπορεί να προστεθεί σε μια ήδη υπάρχουσα ομάδα, η ακολουθία εισαγωγής χρησιμοποιείται για τη δημιουργία μιας νέας ομάδας με την κατάλληλη συχνότητα εισαγωγής και επισημαίνεται ως χρησιμοποιείται.Η επανάληψη τελειώνει όταν κάθε ακολουθία εισαγωγής είτε έχει χρησιμοποιηθεί για να σχηματίσει μια νέα ομάδα είτε μπορεί να συμπεριληφθεί σε μια ήδη υπάρχουσα ομάδα.Άλλωστε, ομαδοποιημένα ένθετα που αποτελούνται από νουκλεοτίδια μεταφράζονται τελικά σε πεπτιδικές αλληλουχίες (βιβλιοθήκες πεπτιδίων).Το αποτέλεσμα αυτής της ανάλυσης είναι ένα σύνολο εισαγωγών και οι αντίστοιχες συχνότητές τους που συνθέτουν τον αριθμό των διαδοχικών αναγνώσεων (Συμπληρωματικό Σχ. 2).
Δημιουργία μοτίβου: Με βάση μια λίστα μοναδικών πεπτιδίων, δημιουργήθηκε μια βιβλιοθήκη που περιέχει όλα τα πιθανά μοτίβα αμινοξέων (aa) όπως φαίνεται παρακάτω.Κάθε πιθανό σχέδιο μήκους 3 εκχυλίστηκε από το πεπτίδιο και το αντίστροφο σχέδιο του προστέθηκε μαζί με μια κοινή βιβλιοθήκη μοτίβων που περιέχει όλα τα σχέδια (τριπεπτίδια).Οι βιβλιοθήκες με πολύ επαναλαμβανόμενα μοτίβα ταξινομήθηκαν και αφαιρέθηκε ο πλεονασμός.Στη συνέχεια, για κάθε τριπεπτίδιο στη βιβλιοθήκη μοτίβων, ελέγξαμε για την παρουσία του στη βιβλιοθήκη χρησιμοποιώντας υπολογιστικά εργαλεία.Σε αυτή την περίπτωση, προστίθεται η συχνότητα του πεπτιδίου που περιέχει το τριπεπτίδιο που βρέθηκε και αποδίδεται στο μοτίβο στη βιβλιοθήκη μοτίβων ("αριθμός μοτίβων").Το αποτέλεσμα της δημιουργίας μοτίβων είναι ένας δισδιάστατος πίνακας που περιέχει όλες τις εμφανίσεις τριπεπτιδίων (μοτίβα) και τις αντίστοιχες τιμές τους, που είναι ο αριθμός των αναγνώσεων αλληλουχίας που καταλήγουν στο αντίστοιχο μοτίβο όταν οι αναγνώσεις φιλτράρονται, ομαδοποιούνται και μεταφράζονται.Μετρήσεις όπως περιγράφονται αναλυτικά παραπάνω.
Κανονικοποίηση του αριθμού των μοτίβων και των αντίστοιχων γραφικών διασποράς: Ο αριθμός των μοτίβων για κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας
όπου ni είναι ο αριθμός των αναγνώσεων που περιέχουν το θέμα i.Έτσι, το vi αντιπροσωπεύει την ποσοστιαία συχνότητα αναγνώσεων (ή πεπτιδίων) που περιέχουν το μοτίβο i στο δείγμα.Οι τιμές P για τον μη κανονικοποιημένο αριθμό μοτίβων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ακριβή δοκιμή του Fisher.Όσον αφορά τα συσχετιστικά γραφήματα του αριθμού των κινήτρων, οι συσχετίσεις του Spearman υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον κανονικοποιημένο αριθμό κινήτρων με το R.
Για να οπτικοποιηθεί το περιεχόμενο των αμινοξέων σε κάθε θέση στη βιβλιοθήκη πεπτιδίων, δημιουργήθηκαν τα λογογράμματα Ιστού 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Πρώτον, η περιεκτικότητα σε αμινοξέα σε κάθε θέση του 12-μερούς πεπτιδίου αποθηκεύεται σε μια μήτρα 20×12.Στη συνέχεια, ένα σύνολο 1000 πεπτιδίων που περιέχουν την ίδια σχετική περιεκτικότητα σε αμινοξέα σε κάθε θέση δημιουργείται σε μορφή fasta-sequence και παρέχεται ως είσοδος στο web-logo 3, το οποίο δημιουργεί μια γραφική αναπαράσταση της σχετικής περιεκτικότητας αμινοξέων σε κάθε θέση.για μια δεδομένη βιβλιοθήκη πεπτιδίων.Για την οπτικοποίηση πολυδιάστατων συνόλων δεδομένων, δημιουργήθηκαν χάρτες θερμότητας χρησιμοποιώντας ένα εργαλείο που αναπτύχθηκε εσωτερικά στο R (biosHeatmap, ένα πακέτο R που δεν έχει ακόμη κυκλοφορήσει).Τα δενδρογράμματα που παρουσιάζονται στους χάρτες θερμότητας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ιεραρχική μέθοδο ομαδοποίησης του Ward με τη μέτρηση της Ευκλείδειας απόστασης.Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων βαθμολόγησης μοτίβων, οι τιμές P για μη κανονικοποιημένη βαθμολογία υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την ακριβή δοκιμή Fisher.Οι τιμές P για άλλα σύνολα δεδομένων υπολογίστηκαν σε R χρησιμοποιώντας το Student's t-test ή ANOVA.
Επιλεγμένοι κλώνοι φάγων και φάγοι χωρίς ένθετα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως μέσω της ουραία φλέβας (2×1010 φάγοι/ζώο σε 300 μl PBS).Δέκα λεπτά πριν από την έγχυση και την επακόλουθη στερέωση, στα ίδια ζώα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως 100 μl επισημασμένης με DyLight594 λεκτίνης (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 λεπτά μετά την ένεση με φάγο, οι αρουραίοι εγχύθηκαν μέσω της καρδιάς με 50 ml PBS ακολουθούμενα από 50 ml 4% PFA/PBS.Τα δείγματα εγκεφάλου σταθεροποιήθηκαν επιπροσθέτως όλη τη νύχτα σε 4% PFA/PBS και εμποτίστηκαν σε 30% σακχαρόζη όλη τη νύχτα στους 4°C.Τα δείγματα καταψύχονται αμέσως στο μείγμα OCT.Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση των κατεψυγμένων δειγμάτων διεξήχθη σε θερμοκρασία δωματίου σε κρυοτομές 30 μm αποκλεισμένων με 1% BSA και επωάστηκαν με πολυκλωνικά επισημασμένα με FITC αντισώματα έναντι του φάγου Τ7 (Novus NB 600-376A) στους 4 °C.Επωάστε όλη τη νύχτα.Τέλος, οι τομές πλύθηκαν 3 φορές με PBS και εξετάστηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Leica TCS SP5).
Όλα τα πεπτίδια με ελάχιστη καθαρότητα 98% συντέθηκαν από την GenScript USA, βιοτινυλιώθηκαν και λυοφιλοποιήθηκαν.Η βιοτίνη δεσμεύεται μέσω ενός επιπλέον διαχωριστή τριπλής γλυκίνης στο Ν-άκρο.Ελέγξτε όλα τα πεπτίδια χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας.
Η στρεπταβιδίνη (Sigma S0677) αναμείχθηκε με 5-πλάσια ισομοριακή περίσσεια βιοτινυλιωμένου πεπτιδίου, βιοτινυλιωμένου ανασταλτικού πεπτιδίου BACE1 ή συνδυασμού (αναλογία 3:1) βιοτινυλιωμένου ανασταλτικού πεπτιδίου BACE1 και ανασταλτικού πεπτιδίου BACE1 σε DMSO/10% ανασταλτικό PACE1.1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την ένεση.Πεπτίδια συζευγμένα με στρεπταβιδίνη εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε δόση 10 mg/kg σε μία από τις φλέβες της ουράς των αρουραίων με εγκεφαλική κοιλότητα.
Η συγκέντρωση των συμπλοκών στρεπταβιδίνης-πεπτιδίου αξιολογήθηκε με ELISA.Οι πλάκες μικροτιτλοδότησης Nunc Maxisorp (Sigma) επικαλύφθηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C με 1,5 μg/ml αντίσωμα αντιστρεπταβιδίνης ποντικού (Thermo, MA1-20011).Μετά τον αποκλεισμό (ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% ζελατίνη, 1% BSA) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, πλύνετε την πλάκα με 0,05% Tween-20/PBS (πλύση ρυθμιστικό διάλυμα πλάσματος) για 3 δευτερόλεπτα (ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης πλύσης) για 3 δευτερόλεπτα. 0.000, CSF 1:115).Η πλάκα στη συνέχεια επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 4°C με αντίσωμα ανίχνευσης (1 μg/ml, αντι-στρεπταβιδίνη-HRP, Novus NB120-7239).Μετά από τρία στάδια πλύσης, η στρεπταβιδίνη ανιχνεύθηκε με επώαση σε διάλυμα υποστρώματος TMB (Roche) για έως και 20 λεπτά.Αφού σταματήσετε την ανάπτυξη χρώματος με 1M H2SO4, μετρήστε την απορρόφηση στα 450 nm.
Η λειτουργία του συμπλόκου στρεπταβιδίνης-πεπτιδίου-αναστολέα BACE1 αξιολογήθηκε με Aβ(1-40) ELISA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Wako, 294-64701).Εν συντομία, δείγματα CSF αραιώθηκαν σε τυπικό αραιωτικό (1:23) και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C σε πλάκες 96 φρεατίων επικαλυμμένες με αντίσωμα σύλληψης BNT77.Μετά από πέντε στάδια έκπλυσης, προστέθηκε αντίσωμα BA27 συζευγμένο με HRP και επωάστηκε για 2 ώρες στους 4°C, ακολουθούμενο από πέντε στάδια έκπλυσης.Το Αβ(1-40) ανιχνεύθηκε με επώαση σε διάλυμα TMB για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Αφού σταματήσει η ανάπτυξη χρώματος με το διάλυμα διακοπής, μετρήστε την απορρόφηση στα 450 nm.Τα δείγματα πλάσματος υποβλήθηκαν σε εκχύλιση στερεάς φάσης πριν από την ELISA Aβ(1-40).Το πλάσμα προστέθηκε σε 0,2% DEA (Sigma) σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.Μετά από διαδοχική πλύση των πλακών SPE (Oasis, 186000679) με νερό και 100% μεθανόλη, δείγματα πλάσματος προστέθηκαν στις πλάκες SPE και όλο το υγρό απομακρύνθηκε.Τα δείγματα πλύθηκαν (πρώτα με 5% μεθανόλη μετά 30% μεθανόλη) και εκλούστηκαν με 2% NH4OH/90% μεθανόλη.Μετά την ξήρανση του εκλούσματος στους 55°C για 99 λεπτά σε σταθερό ρεύμα Ν2, τα δείγματα μειώθηκαν σε τυπικά αραιωτικά και το Αβ(1-40) μετρήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.
Πώς να αναφέρετε αυτό το άρθρο: Urich, E. et al.Παράδοση φορτίου στον εγκέφαλο χρησιμοποιώντας πεπτίδια διέλευσης που ταυτοποιήθηκαν in vivo.η επιστήμη.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB and Moos T. Παράδοση μακρομοριακών φαρμάκων στον εγκέφαλο χρησιμοποιώντας στοχευμένη θεραπεία.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. Παράδοση πεπτιδικών και πρωτεϊνικών φαρμάκων κατά μήκος του αιματοεγκεφαλικού φραγμού.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός: ένα εμπόδιο στην ανάπτυξη φαρμάκων στον εγκέφαλο.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG και Byrd, A. Προοπτικές για βελτιωμένη χορήγηση φαρμάκου και στόχευση στον εγκέφαλο μέσω της οδού χοριοειδούς πλέγματος-ΕΝΥ.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Εκσυγχρονισμός βιοφαρμακευτικών προϊόντων με μοριακούς δούρειους ίππους για παροχή εγκεφάλου.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, μεταφορά πεπτιδίου με τη μεσολάβηση του υποδοχέα WM μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Αυξήστε τη διείσδυση στον εγκέφαλο και την αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών αντισωμάτων χρησιμοποιώντας μονοσθενή μοριακά σαΐτα.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, Ν. et αϊ.Η μεταφορά του υποδοχέα τρανσφερρίνης (TfR) καθορίζει την πρόσληψη από τον εγκέφαλο παραλλαγών συγγένειας των αντισωμάτων TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).