Ορισμένα θέματα αντιμετώπισης προβλημάτων LC δεν είναι ποτέ ξεπερασμένα, καθώς υπάρχουν προβλήματα στην πρακτική του LC, ακόμη και όταν η τεχνολογία των οργάνων βελτιώνεται με την πάροδο του χρόνου. Υπάρχουν πολλοί τρόποι με τους οποίους μπορεί να προκύψουν προβλήματα σε ένα σύστημα LC και να καταλήξουν σε κακή μορφή αιχμής. Όταν προκύπτουν ζητήματα που σχετίζονται με το σχήμα κορυφής, μια σύντομη λίστα πιθανών αιτιών για αυτά τα αποτελέσματα βοηθά στην απλοποίηση της εμπειρίας αντιμετώπισης προβλημάτων.
Ήταν διασκεδαστικό να γράφω αυτήν τη στήλη "Αντιμετώπιση προβλημάτων LC" και να σκέφτομαι θέματα κάθε μήνα, επειδή ορισμένα θέματα δεν ξεφεύγουν ποτέ από τη μόδα. Ενώ στον τομέα της έρευνας χρωματογραφίας ορισμένα θέματα ή ιδέες καθίστανται παρωχημένα καθώς αντικαθίστανται από νεότερες και καλύτερες ιδέες, στον τομέα της αντιμετώπισης προβλημάτων, αφού το πρώτο άρθρο αντιμετώπισης προβλημάτων εμφανίστηκε σε αυτό το περιοδικό (the19) τα τελευταία χρόνια, έχω επικεντρώσει πολλές ενότητες αντιμετώπισης προβλημάτων LC σε σύγχρονες τάσεις που επηρεάζουν την υγρή χρωματογραφία (LC) (για παράδειγμα, η σχετική σύγκριση της κατανόησής μας για την επίδραση της πίεσης στη συγκράτηση [2] New Advances) Η ερμηνεία μας των αποτελεσμάτων LC και ο τρόπος αντιμετώπισης προβλημάτων με σύγχρονα όργανα LC. Σε αυτό το μήνα, η δόση αυτού του μήνα, and death» θέματα αντιμετώπισης προβλημάτων LC — στοιχεία που είναι εξαιρετικά για κάθε εργαλείο αντιμετώπισης προβλημάτων είναι απαραίτητα, ανεξάρτητα από την ηλικία του συστήματος που χρησιμοποιούμε. Το βασικό θέμα αυτής της σειράς είναι πολύ σχετικό με τον περίφημο πίνακα τοίχου «LC Troubleshooting Guide» (4) του LCGC που κρέμεται σε πολλά εργαστήρια. ή σχήμα αιχμής! Δεν μπορούμε να εξετάσουμε όλα αυτά τα ζητήματα λεπτομερώς σε ένα άρθρο, επομένως σε αυτήν την πρώτη δόση για το θέμα, θα εστιάσω σε μερικά από αυτά που βλέπω πιο συχνά. Ελπίζω οι μικροί και μεγάλοι χρήστες LC να βρουν μερικές χρήσιμες συμβουλές και υπενθυμίσεις για αυτό το σημαντικό θέμα.
Βρίσκω τον εαυτό μου να απαντά όλο και περισσότερο σε ερωτήσεις αντιμετώπισης προβλημάτων με το "οτιδήποτε είναι δυνατό". Αυτή η απάντηση μπορεί να φαίνεται εύκολη όταν εξετάζουμε παρατηρήσεις που είναι δύσκολο να ερμηνευτούν, αλλά τη βρίσκω συχνά κατάλληλη. Με πολλές πιθανές αιτίες κακής μορφής κορυφής, είναι σημαντικό να έχουμε ανοιχτό μυαλό όταν εξετάζουμε ποιο μπορεί να είναι το πρόβλημα και να μπορούμε να ιεραρχούμε πιθανές αιτίες για να ξεκινήσουμε τις προσπάθειες αντιμετώπισης προβλημάτων.
Ένα βασικό βήμα σε οποιαδήποτε άσκηση αντιμετώπισης προβλημάτων — αλλά νομίζω ότι υποτιμάται — είναι η αναγνώριση ότι υπάρχει ένα πρόβλημα που πρέπει να λυθεί. Αναγνωρίζοντας ότι υπάρχει πρόβλημα συχνά σημαίνει ότι αναγνωρίζουμε ότι αυτό που συμβαίνει με το εργαλείο είναι διαφορετικό από τις προσδοκίες μας, που διαμορφώνονται από τη θεωρία, την εμπειρική γνώση και την εμπειρία (5). , fluffy, front edge, tailing, κ.λπ.), αλλά και στο πλάτος. Οι προσδοκίες μας για το πραγματικό σχήμα κορυφής είναι απλές. Η θεωρία (6) υποστηρίζει καλά την προσδοκία του σχολικού βιβλίου ότι, στις περισσότερες περιπτώσεις, οι χρωματογραφικές κορυφές θα πρέπει να είναι συμμετρικές και να συμμορφώνονται με το σχήμα μιας κατανομής Gauss, όπως φαίνεται στο μελλοντικό θέμα πλάτος. Τα σχήματα κορυφής στο σχήμα 1 δείχνουν μερικές από τις άλλες δυνατότητες που θα μπορούσαν να παρατηρηθούν—με άλλα λόγια, μερικούς από τους τρόπους με τους οποίους τα πράγματα θα μπορούσαν να πάνε στραβά. Στο υπόλοιπο αυτής της δόσης, θα αφιερώσουμε χρόνο συζητώντας ορισμένα συγκεκριμένα παραδείγματα καταστάσεων που μπορούν να οδηγήσουν σε αυτούς τους τύπους σχημάτων.
Μερικές φορές οι κορυφές δεν παρατηρούνται καθόλου στο χρωματογράφημα όπου αναμένεται να εκλουθούν. Το παραπάνω διάγραμμα τοιχώματος υποδεικνύει ότι η απουσία κορυφής (υποθέτοντας ότι το δείγμα περιέχει πραγματικά τον αναλυτή στόχο σε συγκέντρωση που θα πρέπει να κάνει την απόκριση του ανιχνευτή επαρκή για να τον δούμε πάνω από το θόρυβο) συνήθως σχετίζεται με κάποιο πρόβλημα του οργάνου ή εσφαλμένες συνθήκες κινητής φάσης (αν παρατηρούνται καθόλου).κορυφές, συνήθως πολύ «αδύναμες»). Μια σύντομη λίστα πιθανών προβλημάτων και λύσεων αυτής της κατηγορίας μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα I.
Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το ερώτημα για το πόσο θα πρέπει να γίνει ανεκτή διεύρυνση κορυφής πριν δώσουμε προσοχή και προσπαθήσουμε να το διορθώσουμε είναι ένα περίπλοκο θέμα που θα συζητήσω σε μελλοντικό άρθρο. Η εμπειρία μου είναι ότι η σημαντική διεύρυνση κορυφής συχνά συνοδεύεται από σημαντική αλλαγή στο σχήμα της κορυφής και η ουρά κορυφής είναι πιο συνηθισμένη από την προ-αιχμή ή τη διάσπαση. Ωστόσο, οι ονομαστικά συμμετρικοί λόγοι προκαλούνται από:
Καθένα από αυτά τα ζητήματα έχει συζητηθεί λεπτομερώς σε προηγούμενα τεύχη του Troubleshooting LC και οι αναγνώστες που ενδιαφέρονται για αυτά τα θέματα μπορούν να ανατρέξουν σε αυτά τα προηγούμενα άρθρα για πληροφορίες σχετικά με τις βασικές αιτίες και τις πιθανές λύσεις σε αυτά τα ζητήματα.Περισσότερες λεπτομέρειες.
Η ουρά, η πρόσοψη και η διάσπαση μπορούν όλα να προκληθούν από χημικά ή φυσικά φαινόμενα και ο κατάλογος των πιθανών λύσεων σε αυτά τα προβλήματα ποικίλλει ευρέως, ανάλογα με το αν έχουμε να κάνουμε με ένα χημικό ή φυσικό πρόβλημα. Συχνά, συγκρίνοντας τις διαφορετικές κορυφές σε ένα χρωματογράφημα, μπορείτε να βρείτε σημαντικές ενδείξεις για το ποιο είναι το πιο πιθανό φυσικό σχήμα. .Εάν επηρεάζονται μόνο μία ή μερικές κορυφές, αλλά οι υπόλοιπες φαίνονται εντάξει, η αιτία είναι πιθανότατα χημική.
Τα χημικά αίτια της ουράς κορυφής είναι πολύ περίπλοκα για να συζητηθούν εν συντομία εδώ. Ο ενδιαφερόμενος αναγνώστης παραπέμπεται στο πρόσφατο τεύχος του «LC Troubleshooting» για μια πιο εμπεριστατωμένη συζήτηση (10). Ωστόσο, ένα εύκολο πράγμα που πρέπει να δοκιμάσετε είναι να μειώσετε τη μάζα της εγχυόμενης αναλυόμενης ουσίας και να δείτε εάν το σχήμα της κορυφής βελτιώνεται. οι μάζες ή οι χρωματογραφικές συνθήκες πρέπει να αλλάξουν έτσι ώστε να μπορούν να ληφθούν καλά σχήματα κορυφών ακόμη και με εγχυόμενες μεγαλύτερες μάζες.
Υπάρχουν επίσης πολλοί πιθανοί φυσικοί λόγοι για την ουρά αιχμής. Οι αναγνώστες που ενδιαφέρονται για μια λεπτομερή συζήτηση των δυνατοτήτων παραπέμπονται σε ένα άλλο πρόσφατο τεύχος του “LC Troubleshooting” (11). Μία από τις πιο κοινές φυσικές αιτίες της ουράς κορυφής είναι η κακή σύνδεση σε ένα σημείο μεταξύ του εγχυτήρα και του ανιχνευτή (12). βαλβίδα που δεν είχαμε χρησιμοποιήσει πριν και εγκαταστήσαμε έναν βρόχο έγχυσης μικρού όγκου με ένα δακτύλιο που είχε διαμορφωθεί σε ένα τριχοειδές από ανοξείδωτο χάλυβα. Μετά από μερικά αρχικά πειράματα αντιμετώπισης προβλημάτων, συνειδητοποιήσαμε ότι το βάθος της θύρας στον στάτορα της βαλβίδας έγχυσης ήταν πολύ πιο βαθύ από ό,τι είχαμε συνηθίσει, με αποτέλεσμα έναν μεγάλο νεκρό όγκο στο κάτω μέρος της θύρας. φέρνετε στη σωστή θέση για να εξαλείψετε τον νεκρό όγκο στο κάτω μέρος της θύρας.
Τα μέτωπα αιχμής όπως αυτά που φαίνονται στο Σχήμα 1ε μπορούν επίσης να προκληθούν από φυσικά ή χημικά προβλήματα. Μια κοινή φυσική αιτία της μπροστινής ακμής είναι ότι η κλίνη σωματιδίων της στήλης δεν είναι καλά συσκευασμένη ή ότι τα σωματίδια έχουν αναδιοργανωθεί με την πάροδο του χρόνου. Όπως και με την ουρά αιχμής που προκαλείται από αυτό το φυσικό φαινόμενο, ο καλύτερος τρόπος για να το διορθώσετε είναι να αντικαταστήσετε τη στήλη και να συνεχίσετε. Συνθήκες κατακράτησης. Κάτω από ιδανικές (γραμμικές) συνθήκες, η ποσότητα της αναλυόμενης ουσίας που συγκρατείται από τη στατική φάση (επομένως, ο παράγοντας κατακράτησης) σχετίζεται γραμμικά με τη συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στη στήλη. Χρωματογραφικά, αυτό σημαίνει ότι καθώς αυξάνεται η μάζα της αναλυόμενης ουσίας που εγχέεται στη στήλη, η κορυφή γίνεται ψηλότερη, αλλά όχι και ευρύτερη. καθώς εγχέεται περισσότερη μάζα.Επιπλέον, τα μη γραμμικά σχήματα καθορίζουν το σχήμα των χρωματογραφικών κορυφών, με αποτέλεσμα τα μπροστινά ή τα υστερούντα άκρα. Οι γραφικές συνθήκες πρέπει να αλλάξουν για να ελαχιστοποιηθεί αυτή η συμπεριφορά.
Μερικές φορές παρατηρούμε αυτό που φαίνεται να είναι μια «διαίρεση» κορυφή, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1στ. Το πρώτο βήμα για την επίλυση αυτού του προβλήματος είναι να προσδιορίσουμε εάν το σχήμα κορυφής οφείλεται σε μερική συν-έκλουση (δηλαδή, στην παρουσία δύο διακριτών αλλά στενά εκλουόμενων ενώσεων). Οι αιχμές split" σχετίζονται με τη φυσική. Η απόδοση δεν έχει καμία σχέση με την ίδια τη στήλη. Συχνά, η πιο σημαντική ένδειξη για αυτήν την απόφαση είναι εάν όλες οι κορυφές στο χρωματογράφημα παρουσιάζουν διαχωρισμένα σχήματα ή μόνο μία ή δύο. Εάν είναι μόνο μία ή δύο, πιθανότατα πρόκειται για ζήτημα συν-έκλουσης.εάν όλες οι κορυφές είναι χωρισμένες, είναι πιθανώς ένα φυσικό ζήτημα, πιθανότατα να σχετίζεται με την ίδια τη στήλη.
Οι διαχωρισμένες αιχμές που σχετίζονται με τις φυσικές ιδιότητες της ίδιας της στήλης οφείλονται συνήθως σε μερικώς φραγμένα τριτάκια εισόδου ή εξόδου ή σε αναδιοργάνωση σωματιδίων στη στήλη, επιτρέποντας στην κινητή φάση να ρέει ταχύτερα από την κινητή φάση σε ορισμένες περιοχές του σχηματισμού καναλιού στήλης .σε άλλες περιοχές (11).Ωστόσο, από την εμπειρία μου, αυτή είναι συνήθως μια βραχυπρόθεσμη και όχι μια μακροπρόθεσμη λύση. Αυτό είναι συχνά μοιραίο με τις σύγχρονες στήλες, εάν τα σωματίδια ανασυνδυαστούν μέσα στη στήλη. Σε αυτό το σημείο, είναι καλύτερο να αντικαταστήσετε τη στήλη και να συνεχίσετε.
Η κορυφή στο Σχήμα 1g, επίσης από μια πρόσφατη περίπτωση στο δικό μου εργαστήριο, συνήθως δείχνει ότι το σήμα είναι τόσο υψηλό που έχει φτάσει στο υψηλό άκρο του εύρους απόκρισης. Για τους οπτικούς ανιχνευτές απορρόφησης (UV-vis σε αυτήν την περίπτωση), όταν η συγκέντρωση του αναλύτη είναι πολύ υψηλή, η αναλυόμενη ουσία απορροφά το μεγαλύτερο μέρος του φωτός που διέρχεται από τον ανιχνευτή, αφήνοντας το ηλεκτρικό σήμα. επηρεάζεται από διάφορες πηγές θορύβου, όπως το αδέσποτο φως και το «σκοτεινό ρεύμα», καθιστώντας το σήμα πολύ «ασαφές» στην εμφάνιση και ανεξάρτητο από τη συγκέντρωση αναλυόμενης ουσίας.Όταν συμβεί αυτό, το πρόβλημα μπορεί συχνά να επιλυθεί εύκολα με τη μείωση του όγκου έγχυσης της αναλυόμενης ουσίας—μείωση του όγκου έγχυσης, αραίωση του δείγματος ή και τα δύο.
Στη σχολή χρωματογραφίας, χρησιμοποιούμε το σήμα του ανιχνευτή (δηλαδή τον άξονα y στο χρωματογράφημα) ως δείκτη της συγκέντρωσης αναλυόμενης ουσίας στο δείγμα. Επομένως, φαίνεται περίεργο να δούμε ένα χρωματογράφημα με σήμα κάτω από το μηδέν, καθώς η απλή ερμηνεία είναι ότι αυτό υποδεικνύει αρνητική συγκέντρωση αναλυόμενης ουσίας – η οποία φυσικά δεν είναι φυσικώς δυνατή. vis).
Σε αυτήν την περίπτωση, μια αρνητική κορυφή σημαίνει απλώς ότι τα μόρια που εκλούονται από τη στήλη απορροφούν λιγότερο φως από την ίδια την κινητή φάση αμέσως πριν και μετά την κορυφή. Αυτό μπορεί να συμβεί, για παράδειγμα, όταν χρησιμοποιούνται σχετικά χαμηλά μήκη κύματος ανίχνευσης (<230 nm) και πρόσθετα κινητής φάσης που απορροφούν το μεγαλύτερο μέρος του φωτός σε αυτά τα μήκη κύματος. μπορεί πραγματικά να χρησιμοποιήσει αρνητικές κορυφές για να προετοιμάσει μια καμπύλη βαθμονόμησης και να λάβει ακριβείς ποσοτικές πληροφορίες, επομένως δεν υπάρχει θεμελιώδης λόγος για να τις αποφύγουμε αυτές καθαυτές (αυτή η μέθοδος αναφέρεται μερικές φορές ως «έμμεση ανίχνευση UV») (13). Απορροφούν λιγότερο φως από τους αναλύτες.
Αρνητικές κορυφές μπορούν επίσης να εμφανιστούν όταν χρησιμοποιείται ανίχνευση δείκτη διάθλασης (RI), όταν ο δείκτης διάθλασης των συστατικών εκτός της αναλυόμενης ουσίας στο δείγμα, όπως η μήτρα διαλύτη, είναι διαφορετικός από τον δείκτη διάθλασης της κινητής φάσης. trix σε αυτό της κινητής φάσης.
Στο τρίτο μέρος σχετικά με το βασικό θέμα της αντιμετώπισης προβλημάτων LC, συζήτησα καταστάσεις στις οποίες το παρατηρούμενο σχήμα κορυφής διαφέρει από το αναμενόμενο ή κανονικό σχήμα κορυφής. Η αποτελεσματική αντιμετώπιση προβλημάτων τέτοιων προβλημάτων ξεκινά με τη γνώση των αναμενόμενων σχημάτων κορυφής (με βάση τη θεωρία ή την προηγούμενη εμπειρία με υπάρχουσες μεθόδους), επομένως οι αποκλίσεις από αυτές τις προσδοκίες είναι προφανείς. Τα προβλήματα σχήματος κορυφής έχουν πολλές διαφορετικές πιθανές αιτίες λόγους που βλέπω πιο συχνά. Γνωρίζοντας αυτές τις λεπτομέρειες είναι ένα καλό μέρος για να ξεκινήσετε την αντιμετώπιση προβλημάτων, αλλά δεν καταγράφουν όλες τις πιθανότητες. Οι αναγνώστες που ενδιαφέρονται για μια πιο εμπεριστατωμένη λίστα αιτιών και λύσεων μπορούν να ανατρέξουν στον πίνακα τοίχου LCGC «Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων LC».
(4) Γράφημα τοίχου LCGC "LC Troubleshooting Guide".https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), σελ. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF and Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.