Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η υγρή βιοψία (LB) είναι μια έννοια που κερδίζει γρήγορα δημοτικότητα στον βιοϊατρικό τομέα.Η ιδέα βασίζεται κυρίως στην ανίχνευση θραυσμάτων του κυκλοφορούντος εξωκυτταρικού DNA (ccfDNA), τα οποία απελευθερώνονται κυρίως ως μικρά θραύσματα μετά τον κυτταρικό θάνατο σε διάφορους ιστούς.Ένα μικρό ποσοστό αυτών των θραυσμάτων προέρχεται από ξένους (ξένους) ιστούς ή οργανισμούς.Στην τρέχουσα εργασία, έχουμε εφαρμόσει αυτήν την έννοια στα μύδια, ένα είδος φρουρού γνωστό για την υψηλή ικανότητα φιλτραρίσματος του θαλασσινού νερού.Χρησιμοποιούμε την ικανότητα των μυδιών να λειτουργούν ως φυσικά φίλτρα για τη σύλληψη περιβαλλοντικών θραυσμάτων DNA από διάφορες πηγές για να παρέχουμε πληροφορίες σχετικά με τη βιοποικιλότητα των θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστημάτων.Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αιμολέμφος μυδιών περιέχει θραύσματα DNA που ποικίλλουν πολύ σε μέγεθος, από 1 έως 5 kb.Η αλληλουχία κυνηγετικών όπλων έδειξε ότι ένας μεγάλος αριθμός θραυσμάτων DNA είναι ξένης μικροβιακής προέλευσης.Μεταξύ αυτών, βρήκαμε θραύσματα DNA από βακτήρια, αρχαία και ιούς, συμπεριλαμβανομένων ιών που είναι γνωστό ότι μολύνουν μια ποικιλία ξενιστών που βρίσκονται συνήθως στα παράκτια θαλάσσια οικοσυστήματα.Συμπερασματικά, η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η έννοια του LB που εφαρμόζεται στα μύδια αντιπροσωπεύει μια πλούσια αλλά ανεξερεύνητη ακόμη πηγή γνώσης σχετικά με τη μικροβιακή ποικιλότητα στα θαλάσσια παράκτια οικοσυστήματα.
Ο αντίκτυπος της κλιματικής αλλαγής (CC) στη βιοποικιλότητα των θαλάσσιων οικοσυστημάτων είναι ένας ταχέως αναπτυσσόμενος τομέας έρευνας.Η υπερθέρμανση του πλανήτη όχι μόνο προκαλεί σημαντικές φυσιολογικές πιέσεις, αλλά και ωθεί τα εξελικτικά όρια της θερμικής σταθερότητας των θαλάσσιων οργανισμών, επηρεάζοντας τον βιότοπο ορισμένων ειδών, ωθώντας τα να αναζητήσουν ευνοϊκότερες συνθήκες [1, 2].Εκτός από το ότι επηρεάζει τη βιοποικιλότητα των μεταζωαρίων, το CC διαταράσσει τη λεπτή ισορροπία των αλληλεπιδράσεων ξενιστή-μικροβίου.Αυτή η μικροβιακή δυσβακτηρίωση αποτελεί σοβαρή απειλή για τα θαλάσσια οικοσυστήματα, καθώς καθιστά τους θαλάσσιους οργανισμούς πιο ευαίσθητους σε μολυσματικά παθογόνα [3, 4].Πιστεύεται ότι τα SS παίζουν σημαντικό ρόλο στους μαζικούς θανάτους, γεγονός που αποτελεί σοβαρό πρόβλημα για τη διαχείριση των παγκόσμιων θαλάσσιων οικοσυστημάτων [5, 6].Αυτό είναι ένα σημαντικό ζήτημα δεδομένων των οικονομικών, οικολογικών και διατροφικών επιπτώσεων πολλών θαλάσσιων ειδών.Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τα δίθυρα που ζουν στις πολικές περιοχές, όπου οι επιπτώσεις της CK είναι πιο άμεσες και σοβαρές [6, 7].Μάλιστα, δίθυρα όπως το Mytilus spp.χρησιμοποιούνται ευρέως για την παρακολούθηση των επιπτώσεων του CC στα θαλάσσια οικοσυστήματα.Δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι ένας σχετικά μεγάλος αριθμός βιοδεικτών έχει αναπτυχθεί για την παρακολούθηση της υγείας τους, χρησιμοποιώντας συχνά μια προσέγγιση δύο επιπέδων που περιλαμβάνει λειτουργικούς βιοδείκτες που βασίζονται στην ενζυματική δραστηριότητα ή κυτταρικές λειτουργίες όπως η βιωσιμότητα των κυττάρων και η φαγοκυτταρική δραστηριότητα [8].Αυτές οι μέθοδοι περιλαμβάνουν επίσης τη μέτρηση της συγκέντρωσης συγκεκριμένων δεικτών πίεσης που συσσωρεύονται στους μαλακούς ιστούς μετά την απορρόφηση μεγάλων ποσοτήτων θαλασσινού νερού.Ωστόσο, η υψηλή ικανότητα διήθησης και το ημι-ανοικτό κυκλοφορικό σύστημα των δίθυρων παρέχουν την ευκαιρία να αναπτυχθούν νέοι βιοδείκτες αιμολέμφου χρησιμοποιώντας την έννοια της υγρής βιοψίας (LB), μια απλή και ελάχιστα επεμβατική προσέγγιση στη διαχείριση ασθενών.δείγματα αίματος [9, 10].Αν και αρκετοί τύποι κυκλοφορούντων μορίων μπορούν να βρεθούν στην ανθρώπινη LB, αυτή η ιδέα βασίζεται κυρίως στην ανάλυση αλληλουχίας DNA των κυκλοφορούντων εξωκυτταρικών τμημάτων του DNA (ccfDNA) στο πλάσμα.Στην πραγματικότητα, η παρουσία του κυκλοφορούντος DNA στο ανθρώπινο πλάσμα είναι γνωστή από τα μέσα του 20ου αιώνα [11], αλλά μόνο τα τελευταία χρόνια η εμφάνιση μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης οδήγησε σε κλινική διάγνωση με βάση το ccfDNA.Η παρουσία αυτών των θραυσμάτων DNA που κυκλοφορούν οφείλεται εν μέρει στην παθητική απελευθέρωση γονιδιωματικού DNA (πυρηνικού και μιτοχονδριακού) μετά τον κυτταρικό θάνατο. Σε υγιή άτομα, η συγκέντρωση του ccfDNA είναι κανονικά χαμηλή (<10 ng/mL), αλλά μπορεί να αυξηθεί κατά 5-10 φορές σε ασθενείς που πάσχουν από διάφορες παθολογίες ή υπόκεινται σε στρες, με αποτέλεσμα την καταστροφή των ιστών. Σε υγιή άτομα, η συγκέντρωση του ccfDNA είναι κανονικά χαμηλή (<10 ng/mL), αλλά μπορεί να αυξηθεί κατά 5-10 φορές σε ασθενείς που πάσχουν από διάφορες παθολογίες ή υπόκεινται σε στρες, με αποτέλεσμα την καταστροφή των ιστών. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), αλλά μπορεί να повышаться σε 5–10 ανά больных со различной патологией или подвергающихся стрессу, приводяврщежему. Σε υγιείς ανθρώπους, η συγκέντρωση του cccDNA είναι συνήθως χαμηλή (<10 ng/mL), αλλά μπορεί να αυξηθεί κατά 5-10 φορές σε ασθενείς με διάφορες παθολογίες ή υπό πίεση που οδηγεί σε βλάβη των ιστών.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承在患有各种病理或承在加5-10 倍，从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Οι συγκεντρώσεις ccfDNA είναι πολύ χαμηλές (<10 ng/ml) σε ανώμαλες λάτρες, αλλά μπορούν να αυξηθούν σε 5-10 φορές σε ασθενείς με διαταραχές παθολογίας ή στρεσσομ, что приводит к повреждению тканей. Οι συγκεντρώσεις ccfDNA είναι συνήθως χαμηλές (<10 ng/ml) σε υγιή άτομα, αλλά μπορεί να αυξηθούν 5-10 φορές σε ασθενείς με διάφορες παθολογίες ή στρες, με αποτέλεσμα την καταστροφή των ιστών.Το μέγεθος των θραυσμάτων ccfDNA ποικίλλει ευρέως, αλλά συνήθως κυμαίνεται από 150 έως 200 bp.[12].Η ανάλυση του αυτοπροερχόμενου ccfDNA, δηλαδή του ccfDNA από φυσιολογικά ή μετασχηματισμένα κύτταρα ξενιστές, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση γενετικών και επιγενετικών αλλαγών που υπάρχουν στο πυρηνικό ή/και μιτοχονδριακό γονιδίωμα, βοηθώντας έτσι τους κλινικούς ιατρούς να επιλέξουν συγκεκριμένες θεραπείες μοριακής στόχευσης [13] .Ωστόσο, το ccfDNA μπορεί να ληφθεί από ξένες πηγές όπως το ccfDNA από εμβρυϊκά κύτταρα κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης ή από μεταμοσχευμένα όργανα [14,15,16,17].Το ccfDNA είναι επίσης μια σημαντική πηγή πληροφοριών για την ανίχνευση της παρουσίας νουκλεϊκών οξέων ενός μολυσματικού παράγοντα (ξένο), που επιτρέπει τη μη επεμβατική ανίχνευση εκτεταμένων λοιμώξεων που δεν αναγνωρίζονται από καλλιέργειες αίματος, αποφεύγοντας την επεμβατική βιοψία μολυσμένου ιστού [18].Πρόσφατες μελέτες έχουν πράγματι δείξει ότι το ανθρώπινο αίμα περιέχει μια πλούσια πηγή πληροφοριών που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό ιικών και βακτηριακών παθογόνων και ότι περίπου το 1% του ccfDNA που βρίσκεται στο ανθρώπινο πλάσμα είναι ξένης προέλευσης [19].Αυτές οι μελέτες καταδεικνύουν ότι η βιοποικιλότητα του κυκλοφορούντος μικροβιώματος ενός οργανισμού μπορεί να αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας ανάλυση ccfDNA.Ωστόσο, μέχρι πρόσφατα, αυτή η έννοια χρησιμοποιήθηκε αποκλειστικά στους ανθρώπους και, σε μικρότερο βαθμό, σε άλλα σπονδυλωτά [20, 21].
Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιούμε το δυναμικό LB για να αναλύσουμε το ccfDNA του Aulacomya atra, ενός νότιου είδους που απαντάται συνήθως στα υποανταρκτικά νησιά Kerguelen, μια ομάδα νησιών στην κορυφή ενός μεγάλου οροπεδίου που σχηματίστηκε πριν από 35 εκατομμύρια χρόνια.ηφαιστειακή έκρηξη.Χρησιμοποιώντας ένα πειραματικό σύστημα in vitro, ανακαλύψαμε ότι θραύσματα DNA στο θαλασσινό νερό προσλαμβάνονται γρήγορα από τα μύδια και εισέρχονται στο διαμέρισμα της αιμολέμφης.Η αλληλουχία κυνηγετικών όπλων έδειξε ότι το ccfDNA της αιμολέμφας μυδιών περιέχει θραύσματα DNA δικής του και μη προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων συμβιωτικών βακτηρίων και θραυσμάτων DNA από βιοώματα τυπικά ψυχρών ηφαιστειακών θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστημάτων.Το Hemolymph ccfDNA περιέχει επίσης ιικές αλληλουχίες που προέρχονται από ιούς με διαφορετικές περιοχές ξενιστών.Βρήκαμε επίσης θραύσματα DNA από πολυκύτταρα ζώα όπως οστεώδη ψάρια, θαλάσσιες ανεμώνες, φύκια και έντομα.Συμπερασματικά, η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η έννοια του LB μπορεί να εφαρμοστεί με επιτυχία σε θαλάσσια ασπόνδυλα για τη δημιουργία ενός πλούσιου γονιδιωματικού ρεπερτορίου στα θαλάσσια οικοσυστήματα.
Ενήλικες (μήκους 55-70 mm) Mytilus platensis (Μ. platensis) και Aulacomya atra (Α. atra) συλλέχθηκαν από τις παλιρροιακές βραχώδεις ακτές του Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Νήσοι Kerguelen τον Δεκέμβριο του 2018. Άλλα ενήλικα μπλε μύδια (Mytilus spp.) ελήφθησαν από έναν εμπορικό προμηθευτή (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Καναδάς) και τοποθετήθηκαν σε αεριζόμενη δεξαμενή ελεγχόμενης θερμοκρασίας (4°C) που περιέχει 10–20 L τεχνητής άλμης 32‰.(τεχνητό θαλασσινό αλάτι Reef Crystal, Instant Ocean, Βιρτζίνια, ΗΠΑ).Για κάθε πείραμα, μετρήθηκε το μήκος και το βάρος μεμονωμένων κελυφών.
Ένα δωρεάν πρωτόκολλο ανοιχτής πρόσβασης για αυτό το πρόγραμμα είναι διαθέσιμο στο διαδίκτυο (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Εν συντομία, η LB αιμολέμφος συλλέχθηκε από τους απαγωγείς μύες όπως περιγράφεται [22].Η αιμολέμφος διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στα 1200xg για 3 λεπτά, το υπερκείμενο καταψύχθηκε (-20°C) μέχρι τη χρήση.Για την απομόνωση και τον καθαρισμό του cfDNA, τα δείγματα (1,5-2,0 ml) αποψύχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, ΡΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.Το ccfDNA αποθηκεύτηκε στους -80°C μέχρι περαιτέρω ανάλυση.Σε ορισμένα πειράματα, το ccfDNA απομονώθηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Τορόντο, Οντάριο, Καναδάς).Το καθαρισμένο DNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια τυπική δοκιμασία PicoGreen.Η κατανομή θραυσμάτων του απομονωμένου ccfDNA αναλύθηκε με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας βιοαναλυτή Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) χρησιμοποιώντας κιτ DNA υψηλής ευαισθησίας.Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 1 μl του δείγματος ccfDNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των θραυσμάτων ccfDNA της αιμολέμφου, η Génome Québec (Μόντρεαλ, Κεμπέκ, Καναδάς) ετοίμασε βιβλιοθήκες κυνηγετικών όπλων χρησιμοποιώντας το κιτ Illumina DNA Mix του κιτ Illumina MiSeq PE75.Χρησιμοποιήθηκε ένας τυπικός προσαρμογέας (BioO).Τα αρχεία ακατέργαστων δεδομένων είναι διαθέσιμα από το NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 και SRR8924809).Η βασική ποιότητα ανάγνωσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το FastQC [23].Το Trimmomatic [24] έχει χρησιμοποιηθεί για κοπή προσαρμογέων και αναγνώσεις κακής ποιότητας.Οι αναγνώσεις κυνηγετικών όπλων με ζευγαρωμένα άκρα συγχωνεύτηκαν με το FLASH σε μεγαλύτερες μεμονωμένες αναγνώσεις με ελάχιστη επικάλυψη 20 bp για την αποφυγή αναντιστοιχιών [25]. Οι συγχωνευμένες αναγνώσεις σχολιάστηκαν με το BLASTN χρησιμοποιώντας μια δίθυρη βάση δεδομένων Ταξινόμησης NCBI (τιμή e < 1e−3 και ομολογία 90%) και η κάλυψη των ακολουθιών χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26]. Οι συγχωνευμένες αναγνώσεις σχολιάστηκαν με το BLASTN χρησιμοποιώντας μια δίθυρη βάση δεδομένων Ταξινόμησης NCBI (τιμή e < 1e−3 και ομολογία 90%) και η κάλυψη των ακολουθιών χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы со помош BLASTN με χρήση βασικών ναννых τάξωνομιι двустворчатых моллюсков NCBI (σημασία e < 1e-3 και 90% μετριότατη μετάδοση), со использованием ΣΚΟΝΗ [26]. Οι συγκεντρωτικές αναγνώσεις σχολιάστηκαν με BLASTN χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων ταξινόμησης δίθυρων NCBI (τιμή e < 1e-3 και 90% ομολογία) και η κάλυψη ακολουθίας χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 使用 用 用 俨释 合并 读数复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были антированы со помош BLASTN με χρήση ταξονόμοιου βάσεως NCBI (σημασία και <1e-3 και 90% μετά από μικρή ηλικία), полнено со использованием DUST [26]. Οι συγκεντρωτικές αναγνώσεις σχολιάστηκαν με BLASTN χρησιμοποιώντας τη δίθυρη ταξινομική βάση δεδομένων NCBI (τιμή e <1e-3 και ομολογία 90%) και η κάλυψη ακολουθίας χαμηλής πολυπλοκότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DUST [26].Οι αναγνώσεις χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: που σχετίζονταν με δίθυρες ακολουθίες (εδώ ονομάζονται αυτοαναγνώσεις) και άσχετες (μη αυτοαναγνώσεις).Δύο ομάδες συναρμολογήθηκαν χωριστά χρησιμοποιώντας MEGAHIT για να δημιουργήσουν contigs [27].Εν τω μεταξύ, η ταξινομική κατανομή των αναγνώσεων του εξωγήινου μικροβιώματος ταξινομήθηκε χρησιμοποιώντας το Kraken2 [28] και αντιπροσωπεύτηκε γραφικά από ένα διάγραμμα πίτας Krona στο Galaxy [29, 30].Τα βέλτιστα kmers καθορίστηκαν να είναι kmers-59 από τα προκαταρκτικά πειράματά μας. Έπειτα, τα Self contigs αναγνωρίστηκαν με ευθυγράμμιση με το BLASTN (δίθυρη βάση δεδομένων NCBI, τιμή e < 1e−10 και 60% ομολογία) για έναν τελικό σχολιασμό. Έπειτα, τα Self contigs αναγνωρίστηκαν με ευθυγράμμιση με το BLASTN (δίθυρη βάση δεδομένων NCBI, τιμή e < 1e−10 και 60% ομολογία) για έναν τελικό σχολιασμό. Το σημείωμα του NCBI είναι <1e-10 και γεγονότης 60%) για το BLASTN. Στη συνέχεια αναγνωρίστηκαν οι αυτοσυγκολλήσεις με αντιστοίχιση με το BLASTN (βάση δεδομένων δίθυρων NCBI, τιμή e <1e-10 και 60% ομολογία) για τον τελικό σχολιασμό.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识襾别最终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Υπόλοιπες πληροφορίες για ενημερωμένες ενδείξεις σημείωσης με το BLASTN (βάση δεδομένων του NCBI για δημιουργούς του μολλιούσκου, σημασία και <1e-10 και %). Στη συνέχεια αναγνωρίστηκαν οι αυτοσυγκολλήσεις για τελικό σχολιασμό με αντιστοίχιση με το BLASTN (βάση δεδομένων δίθυρων NCBI, τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%). Παράλληλα, τα contigs μη εαυτών ομάδων σχολιάστηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, τιμή e < 1e−10 και ομολογία 60%). Παράλληλα, τα contigs μη εαυτών ομάδων σχολιάστηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, τιμή e < 1e−10 και ομολογία 60%). Παράλληλο chugerodnыe grouppovыe contigi bыly annotirovanы with pomoщьyu BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, σημασία e <1e-10 και τομολογία 60%). Παράλληλα, τα contigs ξένων ομάδων σημειώθηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων NT NCBI, τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠 Παράλληλη σύγκρουση, δεν είναι относящиеся к κοινόχρηστη ομάδα, αλλά ανενόχλητη με βοηθητική BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, σημασία e <1e-10 και τομολογία 60%). Παράλληλα, σχολιάστηκαν με BLASTN (βάση δεδομένων nt NCBI, τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%) που δεν ανήκουν σε ομάδες εαυτών. Το BLASTX διεξήχθη επίσης σε nonself contigs χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων nr και RefSeq πρωτεΐνης NCBI (τιμή e < 1e−10 και ομολογία 60%). Το BLASTX διεξήχθη επίσης σε nonself contigs χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων nr και RefSeq πρωτεΐνης NCBI (τιμή e < 1e−10 και ομολογία 60%). Το BLASTX также был проведен на несамостоятельных κοντίγαχ με χρήση των βασικών αριθμών αριθμών και RefSeq NCBI (σημασία e <1e-10 και γομολογία 60%). Το BLASTX διεξήχθη επίσης σε μη εαυτού contigs χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων πρωτεϊνών nr και RefSeq NCBI (τιμή e < 1e-10 και ομολογία 60%).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60% BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах со использованием баз данных белка nr και RefSeq NCBI (σημασία e <1e-10 και τομολογία 60%). Το BLASTX πραγματοποιήθηκε επίσης σε μη εαυτού contigs χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων πρωτεϊνών nr και RefSeq NCBI (τιμή e <1e-10 και ομολογία 60%).Οι δεξαμενές BLASTN και BLASTX των μη αυτο-συνεισφορών αντιπροσωπεύουν τα τελικά contigs (βλ. Συμπληρωματικό αρχείο).
Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για την PCR παρατίθενται στον Πίνακα S1.Η πολυμεράση Taq DNA (Bio Basic Canada, Markham, ON) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση των γονιδίων-στόχων ccfDNA.Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες αντίδρασης: μετουσίωση στους 95°C για 3 λεπτά, 95°C για 1 λεπτό, ρύθμιση θερμοκρασίας ανόπτησης για 1 λεπτό, επιμήκυνση στους 72°C για 1 λεπτό, 35 κύκλοι και τελικά 72°C εντός 10 λεπτών..Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αγαρόζης (1,5%) που περιείχαν SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Καναδάς) στα 95 V.
Τα μύδια (Mytilus spp.) εγκλιματίστηκαν σε 500 ml οξυγονωμένου θαλασσινού νερού (32 PSU) για 24 ώρες στους 4°C.Πλασμιδικό DNA που περιέχει ένα ένθετο που κωδικοποιεί την αλληλουχία cDNA ανθρώπινης γαλακτίνης-7 (αριθμός εισαγωγής NCBI L07769) προστέθηκε στο φιαλίδιο σε τελική συγκέντρωση 190 μg/μl.Μύδια που επωάστηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες χωρίς προσθήκη DNA ήταν ο έλεγχος.Η τρίτη δεξαμενή ελέγχου περιείχε DNA χωρίς μύδια.Για την παρακολούθηση της ποιότητας του DNA στο θαλασσινό νερό, λήφθηκαν δείγματα θαλασσινού νερού (20 μl, τρεις επαναλήψεις) από κάθε δεξαμενή την υποδεικνυόμενη ώρα.Για την ιχνηλασιμότητα του πλασμιδικού DNA, μύδια LB συλλέχθηκαν στους υποδεικνυόμενους χρόνους και αναλύθηκαν με qPCR και ddPCR.Λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι του θαλασσινού νερού, κλάσματα αραιώθηκαν σε νερό ποιότητας PCR (1:10) πριν από όλες τις αναλύσεις PCR.
Η ψηφιακή σταγονοειδής PCR (ddPCR) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο BioRad QX200 (Mississauga, Οντάριο, Καναδάς).Χρησιμοποιήστε το προφίλ θερμοκρασίας για να προσδιορίσετε τη βέλτιστη θερμοκρασία (Πίνακας S1).Οι σταγόνες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια γεννήτρια σταγόνων QX200 (BioRad).Η ddPCR διεξήχθη ως εξής: 95°C για 5 λεπτά, 50 κύκλοι στους 95°C για 30 δευτερόλεπτα και μια δεδομένη θερμοκρασία ανόπτησης για 1 λεπτό και 72°C για 30 δευτερόλεπτα, 4°C για 5 λεπτά και 90°C εντός 5 λεπτών.Ο αριθμός των σταγόνων και οι θετικές αντιδράσεις (αριθμός αντιγράφων/μl) μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης σταγόνων QX200 (BioRad).Δείγματα με λιγότερα από 10.000 σταγονίδια απορρίφθηκαν.Ο έλεγχος μοτίβου δεν εκτελούνταν κάθε φορά που εκτελούνταν η ddPCR.
Η qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Αυστραλία) και ειδικούς εκκινητές LGALS7.Όλες οι ποσοτικές PCR πραγματοποιήθηκαν σε 20 μl χρησιμοποιώντας το κιτ QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).Η qPCR ξεκίνησε με επώαση 15 λεπτών στους 95°C που ακολουθήθηκαν από 40 κύκλους στους 95°C για 10 δευτερόλεπτα και στους 60°C για 60 δευτερόλεπτα με μία συλλογή δεδομένων.Οι καμπύλες τήξης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας διαδοχικές μετρήσεις στους 95°C για 5 δευτερόλεπτα, στους 65°C για 60 δευτερόλεπτα και στους 97°C στο τέλος της qPCR.Κάθε qPCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν, εκτός από τα δείγματα ελέγχου.
Δεδομένου ότι τα μύδια είναι γνωστά για τον υψηλό ρυθμό διήθησής τους, πρώτα ερευνήσαμε εάν μπορούσαν να φιλτράρουν και να διατηρήσουν θραύσματα DNA που υπάρχουν στο θαλασσινό νερό.Μας ενδιέφερε επίσης αν αυτά τα θραύσματα συσσωρεύονται στο ημι-ανοικτό λεμφικό τους σύστημα.Επιλύσαμε αυτό το ζήτημα πειραματικά ανιχνεύοντας τη μοίρα των διαλυτών θραυσμάτων DNA που προστέθηκαν σε δεξαμενές μπλε μυδιών.Για να διευκολυνθεί η παρακολούθηση των θραυσμάτων DNA, χρησιμοποιήσαμε ξένο (όχι αυτο) πλασμιδιακό DNA που περιέχει το γονίδιο ανθρώπινης γαλακτίνης-7.Το ddPCR ανιχνεύει θραύσματα DNA πλασμιδίου στο θαλασσινό νερό και στα μύδια.Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι εάν η ποσότητα των θραυσμάτων DNA στο θαλασσινό νερό παρέμεινε σχετικά σταθερή με την πάροδο του χρόνου (έως 7 ημέρες) απουσία μυδιών, τότε παρουσία μυδιών αυτό το επίπεδο εξαφανίστηκε σχεδόν εντελώς μέσα σε 8 ώρες (Εικ. 1a,b).Θραύσματα εξωγενούς DNA ανιχνεύθηκαν εύκολα μέσα σε 15 λεπτά σε ενδοβαλβιδικό υγρό και αιμολέμφο (Εικ. 1c).Αυτά τα θραύσματα θα μπορούσαν ακόμη να ανιχνευθούν έως και 4 ώρες μετά την έκθεση.Αυτή η δραστηριότητα φιλτραρίσματος σε σχέση με θραύσματα DNA είναι συγκρίσιμη με τη δραστηριότητα φιλτραρίσματος βακτηρίων και φυκών [31].Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα μύδια μπορούν να φιλτράρουν και να συσσωρεύουν ξένο DNA στα υγρά τους διαμερίσματα.
Σχετικές συγκεντρώσεις πλασμιδικού DNA σε θαλασσινό νερό παρουσία (Α) ή απουσία (Β) μυδιών, μετρημένες με ddPCR.Στο Α, τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστά, με τα όρια των πλαισίων να αντιπροσωπεύουν το 75ο και το 25ο εκατοστημόριο.Η προσαρμοσμένη λογαριθμική καμπύλη εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα και η περιοχή που σκιάζεται με γκρι αντιπροσωπεύει το διάστημα εμπιστοσύνης 95%.Στο Β, η κόκκινη γραμμή αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή και η μπλε γραμμή αντιπροσωπεύει το διάστημα εμπιστοσύνης 95% για τη συγκέντρωση.C Συσσώρευση πλασμιδικού DNA στην αιμολέμφο και το βαλβιδικό υγρό των μυδιών σε διαφορετικούς χρόνους μετά την προσθήκη πλασμιδικού DNA.Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως απόλυτα αντίγραφα που ανιχνεύθηκαν/mL (±SE).
Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την προέλευση του ccfDNA σε μύδια που συλλέχθηκαν από παρτέρια μυδιών στα νησιά Kerguelen, μια απομακρυσμένη ομάδα νησιών με περιορισμένη ανθρωπογενή επιρροή.Για το σκοπό αυτό, το cccDNA από αιμολέμφες μυδιών απομονώθηκε και καθαρίστηκε με μεθόδους που χρησιμοποιούνται συνήθως για τον καθαρισμό ανθρώπινου cccDNA [32, 33].Βρήκαμε ότι οι μέσες συγκεντρώσεις ccfDNA της αιμολέμφου στα μύδια είναι στο εύρος των χαμηλών μικρογραμμαρίων ανά ml αιμολέμφου (βλ. Πίνακα S2, Συμπληρωματικές πληροφορίες).Αυτό το εύρος συγκεντρώσεων είναι πολύ μεγαλύτερο από ό,τι σε υγιείς ανθρώπους (χαμηλά νανογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο), αλλά σε σπάνιες περιπτώσεις, σε ασθενείς με καρκίνο, το επίπεδο του ccfDNA μπορεί να φτάσει αρκετά μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο [34, 35].Μια ανάλυση της κατανομής μεγέθους του ccfDNA της αιμολέμφου έδειξε ότι αυτά τα θραύσματα ποικίλλουν πολύ σε μέγεθος, που κυμαίνονται από 1000 bp έως 1000 bp.έως 5000 bp (Εικ. 2).Παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp Investigator Kit με βάση το πυρίτιο, μια μέθοδο που χρησιμοποιείται συνήθως στην εγκληματολογική επιστήμη για την ταχεία απομόνωση και καθαρισμό του γονιδιωματικού DNA από δείγματα DNA χαμηλής συγκέντρωσης, συμπεριλαμβανομένου του ccfDNA [36].
Αντιπροσωπευτικό ηλεκτροφόρημα ccfDNA αιμολέμφου μυδιού.Εκχυλίστηκε με NucleoSnap Plasma Kit (πάνω μέρος) και QIAamp DNA Investigator Kit.B Διάγραμμα βιολιού που δείχνει την κατανομή των συγκεντρώσεων ccfDNA της αιμολέμφου (±SE) στα μύδια.Οι μαύρες και κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν το διάμεσο και το πρώτο και το τρίτο τεταρτημόριο, αντίστοιχα.
Περίπου το 1% του ccfDNA σε ανθρώπους και πρωτεύοντα θηλαστικά έχει ξένη πηγή [21, 37].Δεδομένου του ημι-ανοικτού κυκλοφορικού συστήματος των δίθυρων, του πλούσιου σε μικρόβια θαλασσινού νερού και της κατανομής μεγέθους του ccfDNA μυδιών, υποθέσαμε ότι το ccfDNA αιμολέμφου μυδιού μπορεί να περιέχει μια πλούσια και ποικιλόμορφη δεξαμενή μικροβιακού DNA.Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, προσδιορίσαμε την αλληλουχία του ccfDNA της αιμολέμφου από δείγματα Aulacomya atra που συλλέχθηκαν από τα νησιά Kerguelen, αποδίδοντας πάνω από 10 εκατομμύρια αναγνώσεις, το 97,6% των οποίων πέρασε από ποιοτικό έλεγχο.Οι μετρήσεις στη συνέχεια ταξινομήθηκαν σύμφωνα με ίδιες και μη πηγές χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων δίθυρων BLASTN και NCBI (Εικ. S1, Συμπληρωματικές Πληροφορίες).
Στους ανθρώπους, τόσο το πυρηνικό όσο και το μιτοχονδριακό DNA μπορούν να απελευθερωθούν στην κυκλοφορία του αίματος [38].Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, δεν ήταν δυνατό να περιγραφεί λεπτομερώς το πυρηνικό γονιδιωματικό DNA των μυδιών, δεδομένου ότι το γονιδίωμα του A. atra δεν έχει προσδιοριστεί ή περιγραφεί.Ωστόσο, μπορέσαμε να αναγνωρίσουμε έναν αριθμό θραυσμάτων ccfDNA της δικής μας προέλευσης χρησιμοποιώντας τη βιβλιοθήκη δίθυρων (Εικ. S2, Συμπληρωματικές Πληροφορίες).Επιβεβαιώσαμε επίσης την παρουσία θραυσμάτων DNA δικής μας προέλευσης με κατευθυνόμενη ενίσχυση PCR αυτών των γονιδίων A. atra που αναλύθηκαν σε αλληλουχία (Εικ. 3).Ομοίως, δεδομένου ότι το μιτοχονδριακό γονιδίωμα του A. atra είναι διαθέσιμο σε δημόσιες βάσεις δεδομένων, μπορεί κανείς να βρει στοιχεία για την παρουσία μιτοχονδριακών θραυσμάτων ccfDNA στην αιμολέμφο του A. atra.Η παρουσία θραυσμάτων μιτοχονδριακού DNA επιβεβαιώθηκε με ενίσχυση PCR (Εικ. 3).
Διάφορα μιτοχονδριακά γονίδια υπήρχαν στην αιμολέμφο του A. atra (κόκκινες κουκκίδες – αριθμός αποθέματος: SRX5705969) και του M. platensis (μπλε κουκκίδες – αριθμός αποθέματος: SRX5705968) που ενισχύθηκε με PCR.Σχήμα προσαρμοσμένο από Breton et al., 2011 B Amplification of hemolymph supernatant from A. atra Stored on FTA paper.Χρησιμοποιήστε μια διάτρηση 3 mm για να την προσθέσετε απευθείας στο σωληνάριο PCR που περιέχει το μείγμα PCR.
Δεδομένης της άφθονης μικροβιακής περιεκτικότητας στο θαλασσινό νερό, αρχικά επικεντρωθήκαμε στον χαρακτηρισμό των αλληλουχιών μικροβιακού DNA στην αιμολέμφο.Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιούμε δύο διαφορετικές στρατηγικές.Η πρώτη στρατηγική χρησιμοποίησε το Kraken2, ένα πρόγραμμα ταξινόμησης ακολουθιών βασισμένο σε αλγόριθμο που μπορεί να αναγνωρίσει μικροβιακές αλληλουχίες με ακρίβεια συγκρίσιμη με το BLAST και άλλα εργαλεία [28].Περισσότερες από 6719 αναγνώσεις προσδιορίστηκαν ως βακτηριακής προέλευσης, ενώ 124 και 64 ήταν από αρχαία και ιούς, αντίστοιχα (Εικ. 4).Τα πιο άφθονα θραύσματα βακτηριακού DNA ήταν τα Firmicutes (46%), τα Proteobacteria (27%) και τα Bacteroidetes (17%) (Εικ. 4a).Αυτή η κατανομή είναι σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες για το μικροβίωμα του θαλάσσιου μπλε μυδιού [39, 40].Τα γαμπρωτεοβακτήρια ήταν η κύρια κατηγορία Πρωτεοβακτηρίων (44%), συμπεριλαμβανομένων πολλών Vibrionales (Εικ. 4β).Η μέθοδος ddPCR επιβεβαίωσε την παρουσία θραυσμάτων DNA Vibrio στο ccfDNA του A. atra hemolymph (Εικ. 4c) [41].Για να ληφθούν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη βακτηριακή προέλευση του ccfDNA, ελήφθη μια πρόσθετη προσέγγιση (Εικ. S2, Συμπληρωματικές Πληροφορίες). Σε αυτήν την περίπτωση, οι αναγνώσεις που επικαλύπτονται συναρμολογήθηκαν ως αναγνώσεις ζευγαριού άκρου και ταξινομήθηκαν ως αυτοπροέλευσης (δίθυρα) ή μη με χρήση BLASTN και τιμής e 1e−3 και αποκοπής με ομολογία >90%. Σε αυτήν την περίπτωση, οι αναγνώσεις που επικαλύπτονται συναρμολογήθηκαν ως αναγνώσεις ζευγαριού άκρου και ταξινομήθηκαν ως αυτοπροέλευσης (δίθυρα) ή μη με χρήση BLASTN και τιμής e 1e−3 και αποκοπής με ομολογία >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со парными concami και были классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) ή чужие по происхольждени отсечения со гомологией> 90%. Σε αυτήν την περίπτωση, οι επικαλυπτόμενες αναγνώσεις συλλέχθηκαν ως αναγνώσεις ζευγαρώματος και ταξινομήθηκαν ως εγγενείς (δίθυρες) ή μη αρχικές χρησιμοποιώντας BLASTN και τιμή e 1e-3 και αποκοπή με ομολογία >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 皐e 倢%值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 使 1-3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения со партными concami και classificirovanы ως μεμπστβεννыε (двусчатые моллюски) ή несобственные былые по происхольждени roga gromologi> 90%. Σε αυτήν την περίπτωση, οι επικαλυπτόμενες αναγνώσεις συλλέχθηκαν ως αναγνώσεις με ζεύγη άκρων και ταξινομήθηκαν ως δικές (δίθυρες) ή μη πρωτότυπες χρησιμοποιώντας τιμές e BLASTN και 1e-3 και ένα όριο ομολογίας >90%.Δεδομένου ότι το γονιδίωμα του A. atra δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί η αλληλουχία, χρησιμοποιήσαμε τη στρατηγική συναρμολόγησης de novo του συναρμολογητή MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Συνολικά 147.188 contigs έχουν αναγνωριστεί ως εξαρτώμενα (δίθυρα) προέλευσης.Αυτά τα contigs στη συνέχεια εξερράγησαν με e-τιμές 1e-10 χρησιμοποιώντας BLASTN και BLASTX.Αυτή η στρατηγική μας επέτρεψε να αναγνωρίσουμε 482 μη δίθυρα θραύσματα που υπάρχουν στο A. atra ccfDNA.Περισσότερα από τα μισά (57%) από αυτά τα θραύσματα DNA ελήφθησαν από βακτήρια, κυρίως από βραγχίους συμβίωσης, συμπεριλαμβανομένων των σουλφοτροφικών συμβιόντων, και από βραγχικούς συμβιόντες Solemya velum (Εικ. 5).
Σχετική αφθονία σε επίπεδο τύπου.B Μικροβιακή ποικιλότητα δύο κύριων φυλών (Firmicutes και Proteobacteria).Αντιπροσωπευτική ενίσχυση του ddPCR C Vibrio spp.Α. Θραύσματα του γονιδίου 16S rRNA (μπλε) σε τρεις αιμολέμφους κόλπου.
Συνολικά αναλύθηκαν 482 συλλεχθέντα contigs.Γενικό προφίλ της ταξινομικής κατανομής μεταγονιδιωματικών σχολιασμών (προκαρυώτες και ευκαρυώτες).B Λεπτομερής κατανομή θραυσμάτων βακτηριακού DNA που ταυτοποιήθηκαν από BLASTN και BLASTX.
Η ανάλυση Kraken2 έδειξε επίσης ότι το ccfDNA μυδιών περιείχε θραύσματα αρχαϊκού DNA, συμπεριλαμβανομένων θραυσμάτων DNA των Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) και Thaurmarcheota (11%) (Εικ. 6a).Η παρουσία θραυσμάτων DNA που προέρχονται από το Euryarchaeota και το Crenarchaeota, που είχαν βρεθεί προηγουμένως στη μικροβιακή κοινότητα των μυδιών της Καλιφόρνια, δεν πρέπει να αποτελεί έκπληξη [42].Αν και το Euryarchaeota συνδέεται συχνά με ακραίες συνθήκες, αναγνωρίζεται πλέον ότι τόσο το Euryarchaeota όσο και το Crenarcheota είναι από τα πιο κοινά προκαρυωτικά στο θαλάσσιο κρυογονικό περιβάλλον [43, 44].Η παρουσία μεθανογόνων μικροοργανισμών στα μύδια δεν προκαλεί έκπληξη, δεδομένων των πρόσφατων αναφορών για εκτεταμένες διαρροές μεθανίου από διαρροές πυθμένα στο οροπέδιο Kerguelen [45] και πιθανή μικροβιακή παραγωγή μεθανίου που παρατηρήθηκε στα ανοικτά των ακτών των νησιών Kerguelen [46].
Η προσοχή μας στη συνέχεια στράφηκε στις αναγνώσεις από ιούς DNA.Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη εκτός στόχου για την περιεκτικότητα σε ιούς των μυδιών.Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε θραύσματα DNA βακτηριοφάγων (Caudovirales) (Εικ. 6β).Ωστόσο, το πιο κοινό ιικό DNA προέρχεται από μια ομάδα νουκλεοκυτταροϊών, επίσης γνωστή ως πυρηνικός κυτταροπλασματικός ιός μεγάλου DNA (NCLDV), ο οποίος έχει το μεγαλύτερο γονιδίωμα από οποιονδήποτε ιό.Σε αυτό το γένος, οι περισσότερες αλληλουχίες DNA ανήκουν στις οικογένειες Mimimidoviridae (58%) και Poxviridae (21%), των οποίων οι φυσικοί ξενιστές περιλαμβάνουν σπονδυλωτά και αρθρόποδα, ενώ ένα μικρό ποσοστό αυτών των αλληλουχιών DNA ανήκει σε γνωστά ιολογικά φύκια.Προσβάλλει τα θαλάσσια ευκαρυωτικά φύκια.Οι αλληλουχίες ελήφθησαν επίσης από τον ιό Pandora, τον γιγάντιο ιό με το μεγαλύτερο μέγεθος γονιδιώματος από οποιοδήποτε γνωστό ιικό γένη.Είναι ενδιαφέρον ότι το εύρος των ξενιστών που είναι γνωστό ότι έχουν μολυνθεί με τον ιό, όπως προσδιορίζεται από την αλληλουχία ccfDNA της αιμολέμφου, ήταν σχετικά μεγάλο (Εικόνα S3, Συμπληρωματικές Πληροφορίες).Περιλαμβάνει ιούς που μολύνουν έντομα όπως Baculoviridae και Iridoviridae, καθώς και ιούς που προσβάλλουν αμοιβάδα, άλγη και σπονδυλωτά.Βρήκαμε επίσης αλληλουχίες που ταιριάζουν με το γονιδίωμα του Pithovirus sibericum.Οι πιτοϊοί (επίσης γνωστοί ως «ιοί ζόμπι») απομονώθηκαν για πρώτη φορά από μόνιμο παγετό 30.000 ετών στη Σιβηρία [47].Έτσι, τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με προηγούμενες αναφορές που δείχνουν ότι δεν έχουν εξαφανιστεί όλα τα σύγχρονα είδη αυτών των ιών [48] και ότι αυτοί οι ιοί μπορεί να υπάρχουν σε απομακρυσμένα υποαρκτικά θαλάσσια οικοσυστήματα.
Τέλος, κάναμε εξετάσεις για να δούμε αν μπορούσαμε να βρούμε θραύσματα DNA από άλλα πολυκύτταρα ζώα.Συνολικά 482 ξένα contigs ταυτοποιήθηκαν από τα BLASTN και BLASTX με βιβλιοθήκες nt, nr και RefSeq (γονιδιωματικό και πρωτεϊνικό).Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μεταξύ των ξένων θραυσμάτων του ccfDNA πολυκύτταρων ζώων κυριαρχεί το DNA των οστών (Εικ. 5).Έχουν επίσης βρεθεί θραύσματα DNA από έντομα και άλλα είδη.Ένα σχετικά μεγάλο μέρος των θραυσμάτων DNA δεν έχει εντοπιστεί, πιθανώς λόγω της υποεκπροσώπησης ενός μεγάλου αριθμού θαλάσσιων ειδών στις γονιδιωματικές βάσεις δεδομένων σε σύγκριση με τα χερσαία είδη [49].
Στην παρούσα εργασία, εφαρμόζουμε την έννοια LB στα μύδια, υποστηρίζοντας ότι η αλληλουχία πυροβολισμών ccfDNA της αιμολέμφου μπορεί να παρέχει πληροφορίες για τη σύνθεση των θαλάσσιων παράκτιων οικοσυστημάτων.Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι 1) η αιμολέμφος μυδιών περιέχει σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις (επίπεδα μικρογραμμαρίων) σχετικά μεγάλων (~1-5 kb) κυκλοφορούντων θραυσμάτων DNA.2) αυτά τα θραύσματα DNA είναι τόσο ανεξάρτητα όσο και μη ανεξάρτητα 3) Μεταξύ των ξένων πηγών αυτών των θραυσμάτων DNA, βρήκαμε βακτηριακό, αρχαϊκό και ιικό DNA, καθώς και DNA άλλων πολυκύτταρων ζώων.4) Η συσσώρευση αυτών των ξένων θραυσμάτων ccfDNA στην αιμολέμφο συμβαίνει γρήγορα και συμβάλλει στην εσωτερική δραστηριότητα φιλτραρίσματος των μυδιών.Συμπερασματικά, η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η έννοια της LB, η οποία μέχρι στιγμής έχει εφαρμοστεί κυρίως στον τομέα της βιοϊατρικής, κωδικοποιεί μια πλούσια αλλά ανεξερεύνητη πηγή γνώσης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την καλύτερη κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ των ειδών φρουρών και του περιβάλλοντος τους.
Εκτός από τα πρωτεύοντα θηλαστικά, έχει αναφερθεί απομόνωση ccfDNA σε θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων ποντικών, σκύλων, γατών και αλόγων [50, 51, 52].Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε, η μελέτη μας είναι η πρώτη που αναφέρει την ανίχνευση και την αλληλουχία του ccfDNA σε θαλάσσια είδη με σύστημα ανοιχτής κυκλοφορίας.Αυτό το ανατομικό χαρακτηριστικό και η ικανότητα φιλτραρίσματος των μυδιών μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να εξηγούν τα διαφορετικά χαρακτηριστικά μεγέθους των κυκλοφορούντων θραυσμάτων DNA σε σύγκριση με άλλα είδη.Στον άνθρωπο, τα περισσότερα θραύσματα DNA που κυκλοφορούν στο αίμα είναι μικρά θραύσματα που κυμαίνονται σε μέγεθος από 150 έως 200 bp.με μέγιστη κορυφή 167 bp [34, 53].Ένα μικρό αλλά σημαντικό τμήμα των θραυσμάτων DNA έχει μέγεθος μεταξύ 300 και 500 bp και περίπου το 5% είναι μεγαλύτερο από 900 bp.[54].Ο λόγος για αυτήν την κατανομή μεγέθους είναι ότι η κύρια πηγή ccfDNA στο πλάσμα εμφανίζεται ως αποτέλεσμα κυτταρικού θανάτου, είτε λόγω κυτταρικού θανάτου είτε λόγω νέκρωσης κυκλοφορούντων αιμοποιητικών κυττάρων σε υγιή άτομα ή λόγω απόπτωσης κυττάρων όγκου σε καρκινοπαθείς (γνωστό ως κυκλοφορούν DNA όγκου).ctDNA).Η κατανομή μεγέθους του ccfDNA της αιμολέμφου που βρήκαμε στα μύδια κυμαινόταν από 1000 έως 5000 bp, υποδηλώνοντας ότι το ccfDNA του μυδιού έχει διαφορετική προέλευση.Αυτή είναι μια λογική υπόθεση, καθώς τα μύδια έχουν ένα ημι-ανοικτό αγγειακό σύστημα και ζουν σε θαλάσσια υδάτινα περιβάλλοντα που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις μικροβιακού γονιδιωματικού DNA.Στην πραγματικότητα, τα εργαστηριακά μας πειράματα χρησιμοποιώντας εξωγενές DNA έδειξαν ότι τα μύδια συσσωρεύουν θραύσματα DNA στο θαλασσινό νερό, τουλάχιστον μετά από μερικές ώρες αποικοδομούνται μετά την κυτταρική πρόσληψη ή/και απελευθερώνονται ή/και αποθηκεύονται σε διάφορους οργανισμούς.Δεδομένης της σπανιότητας των κυττάρων (τόσο προκαρυωτικών όσο και ευκαρυωτικών), η χρήση ενδοβαλβιδοειδών διαμερισμάτων θα μειώσει την ποσότητα του ccfDNA από ίδιες πηγές καθώς και από ξένες πηγές.Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της έμφυτης ανοσίας των δίθυρων και του μεγάλου αριθμού κυκλοφορούντων φαγοκυττάρων, υποθέσαμε περαιτέρω ότι ακόμη και το ξένο ccfDNA εμπλουτίζεται σε κυκλοφορούντα φαγοκύτταρα που συσσωρεύουν ξένο DNA κατά την κατάποση μικροοργανισμών ή/και κυτταρικών υπολειμμάτων.Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ccfDNA της δίθυρης αιμολέμφας είναι μια μοναδική αποθήκη μοριακών πληροφοριών και ενισχύει την κατάστασή τους ως είδος φρουρού.
Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι η αλληλουχία και η ανάλυση θραυσμάτων ccfDNA αιμολέμφας που προέρχονται από βακτήρια μπορεί να παρέχει βασικές πληροφορίες σχετικά με τη βακτηριακή χλωρίδα του ξενιστή και τα βακτήρια που υπάρχουν στο περιβάλλον θαλάσσιο οικοσύστημα.Οι τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας πυροβολισμών έχουν αποκαλύψει αλληλουχίες του κοινού βακτηρίου A. atra gill που θα είχαν χαθεί εάν είχαν χρησιμοποιηθεί συμβατικές μέθοδοι αναγνώρισης 16S rRNA, εν μέρει λόγω μιας προκατάληψης βιβλιοθήκης αναφοράς.Στην πραγματικότητα, η χρήση των δεδομένων LB που συλλέχθηκαν από το M. platensis στο ίδιο στρώμα μυδιού στο Kerguelen έδειξε ότι η σύνθεση των βακτηριακών συμβιόντων που σχετίζονται με τα βράγχια ήταν η ίδια και για τα δύο είδη μυδιών (Εικ. S4, Συμπληρωματικές Πληροφορίες).Αυτή η ομοιότητα δύο γενετικά διαφορετικών μυδιών μπορεί να αντανακλά τη σύνθεση των βακτηριακών κοινοτήτων στις ψυχρές, θειούχες και ηφαιστειακές αποθέσεις του Kerguelen [55, 56, 57, 58].Υψηλότερα επίπεδα μικροοργανισμών που μειώνουν το θείο έχουν περιγραφεί καλά κατά τη συγκομιδή μυδιών από βιοστροβιλισμένες παράκτιες περιοχές [59], όπως η ακτή του Πορτ-ο-Φρανς.Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι η χλωρίδα των μυδιών μπορεί να επηρεαστεί από οριζόντια μετάδοση [60, 61].Απαιτείται περισσότερη έρευνα για τον προσδιορισμό της συσχέτισης μεταξύ του θαλάσσιου περιβάλλοντος, της επιφάνειας του πυθμένα της θάλασσας και της σύνθεσης των συμβιωτικών βακτηρίων στα μύδια.Αυτές οι μελέτες βρίσκονται επί του παρόντος σε εξέλιξη.
Το μήκος και η συγκέντρωση του ccfDNA της αιμολέμφου, η ευκολία καθαρισμού και η υψηλή ποιότητά του που επιτρέπει τον γρήγορο προσδιορισμό της αλληλουχίας του κυνηγετικού όπλου είναι μερικά από τα πολλά πλεονεκτήματα της χρήσης του ccfDNA μυδιών για την αξιολόγηση της βιοποικιλότητας στα θαλάσσια παράκτια οικοσυστήματα.Αυτή η προσέγγιση είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για τον χαρακτηρισμό ιικών κοινοτήτων (viromes) σε ένα δεδομένο οικοσύστημα [62, 63].Σε αντίθεση με τα βακτήρια, τα αρχαία και τους ευκαρυώτες, τα ιικά γονιδιώματα δεν περιέχουν φυλογενετικά διατηρημένα γονίδια όπως οι αλληλουχίες 16S.Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι υγρές βιοψίες από είδη-δείκτες όπως τα μύδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό σχετικά μεγάλου αριθμού θραυσμάτων ιού ccfDNA που είναι γνωστό ότι μολύνουν ξενιστές που συνήθως κατοικούν σε παράκτια θαλάσσια οικοσυστήματα.Αυτό περιλαμβάνει ιούς που είναι γνωστό ότι μολύνουν πρωτόζωα, αρθρόποδα, έντομα, φυτά και βακτηριακούς ιούς (π.χ. βακτηριοφάγους).Μια παρόμοια κατανομή βρέθηκε όταν εξετάσαμε το ιόμα ccfDNA της αιμολέμφου των μπλε μυδιών (M. platensis) που συλλέγεται στο ίδιο στρώμα μυδιού στο Kerguelen (Πίνακας S2, Συμπληρωματικές Πληροφορίες).Η αλληλουχία κυνηγετικών όπλων του ccfDNA είναι πράγματι μια νέα προσέγγιση που κερδίζει δυναμική στη μελέτη του ιού του ανθρώπου ή άλλων ειδών [21, 37, 64].Αυτή η προσέγγιση είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για τη μελέτη δίκλωνων ιών DNA, καθώς κανένα γονίδιο δεν διατηρείται μεταξύ όλων των δίκλωνων ιών DNA, αντιπροσωπεύοντας την πιο ποικιλόμορφη και ευρεία κατηγορία ιών στη Βαλτιμόρη [65].Αν και οι περισσότεροι από αυτούς τους ιούς παραμένουν αταξινόμητοι και μπορεί να περιλαμβάνουν ιούς από ένα εντελώς άγνωστο μέρος του ιικού κόσμου [66], ανακαλύψαμε ότι τα ιώματα και οι περιοχές ξενιστών των μυδιών A. atra και M. platensis εμπίπτουν μεταξύ των δύο ειδών.ομοίως (βλ. σχήμα S3, πρόσθετες πληροφορίες).Αυτή η ομοιότητα δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς μπορεί να αντανακλά την έλλειψη επιλεκτικότητας στην πρόσληψη του DNA που υπάρχει στο περιβάλλον.Προς το παρόν απαιτούνται μελλοντικές μελέτες που χρησιμοποιούν καθαρισμένο RNA για τον χαρακτηρισμό του ιού του RNA.
Στη μελέτη μας, χρησιμοποιήσαμε μια πολύ αυστηρή διοχέτευση προσαρμοσμένη από την εργασία του Kowarski και των συναδέλφων [37], οι οποίοι χρησιμοποίησαν μια διαγραφή σε δύο στάδια ομαδοποιημένων αναγνώσεων και contigs πριν και μετά τη συναρμολόγηση του εγγενούς ccfDNA, με αποτέλεσμα ένα υψηλό ποσοστό μη χαρτογραφημένων αναγνώσεων.Επομένως, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι ορισμένες από αυτές τις μη χαρτογραφημένες αναγνώσεις μπορεί να έχουν ακόμα τη δική τους προέλευση, κυρίως επειδή δεν έχουμε γονιδίωμα αναφοράς για αυτό το είδος μυδιών.Χρησιμοποιήσαμε επίσης αυτόν τον αγωγό επειδή ανησυχούσαμε για τις χίμαιρες μεταξύ των προσωπικών και μη αυτοαναγνώσεων και τα μήκη ανάγνωσης που δημιουργούνται από το Illumina MiSeq PE75.Ένας άλλος λόγος για την πλειονότητα των αχαρτογράφητων αναγνώσεων είναι ότι πολλά από τα θαλάσσια μικρόβια, ειδικά σε απομακρυσμένες περιοχές όπως το Kerguelen, δεν έχουν σχολιαστεί.Χρησιμοποιήσαμε το Illumina MiSeq PE75, υποθέτοντας μήκη θραυσμάτων ccfDNA παρόμοια με το ανθρώπινο ccfDNA.Για μελλοντικές μελέτες, δεδομένων των αποτελεσμάτων μας που δείχνουν ότι το ccfDNA της αιμολέμφου έχει μεγαλύτερες αναγνώσεις από τους ανθρώπους και/ή τα θηλαστικά, συνιστούμε τη χρήση μιας πλατφόρμας αλληλούχισης πιο κατάλληλης για μακρύτερα θραύσματα ccfDNA.Αυτή η πρακτική θα διευκολύνει πολύ τον εντοπισμό περισσότερων ενδείξεων για βαθύτερη ανάλυση.Η απόκτηση της επί του παρόντος μη διαθέσιμης πλήρους αλληλουχίας πυρηνικού γονιδιώματος A. atra θα διευκόλυνε επίσης πολύ τη διάκριση του ccfDNA από ίδιες και μη πηγές.Δεδομένου ότι η έρευνά μας έχει επικεντρωθεί στη δυνατότητα εφαρμογής της έννοιας της υγρής βιοψίας στα μύδια, ελπίζουμε ότι καθώς αυτή η έννοια θα χρησιμοποιηθεί σε μελλοντική έρευνα, θα αναπτυχθούν νέα εργαλεία και αγωγοί για να αυξηθεί η δυνατότητα αυτής της μεθόδου για τη μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας των μυδιών.θαλάσσιο οικοσύστημα.
Ως μη επεμβατικός κλινικός βιοδείκτης, τα αυξημένα επίπεδα του ccfDNA στο ανθρώπινο πλάσμα σχετίζονται με διάφορες ασθένειες, βλάβες ιστών και καταστάσεις στρες [67,68,69].Αυτή η αύξηση σχετίζεται με την απελευθέρωση θραυσμάτων DNA δικής του προέλευσης μετά από βλάβη των ιστών.Αντιμετωπίσαμε αυτό το ζήτημα χρησιμοποιώντας οξύ θερμικό στρες, στο οποίο τα μύδια εκτέθηκαν για λίγο σε θερμοκρασία 30 °C.Πραγματοποιήσαμε αυτήν την ανάλυση σε τρεις διαφορετικούς τύπους μυδιών σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.Ωστόσο, δεν βρήκαμε καμία αλλαγή στα επίπεδα ccfDNA μετά από οξύ θερμικό στρες (βλ. Εικόνα S5, πρόσθετες πληροφορίες).Αυτή η ανακάλυψη μπορεί να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, το γεγονός ότι τα μύδια έχουν ένα ημι-ανοικτό κυκλοφορικό σύστημα και συσσωρεύουν μεγάλες ποσότητες ξένου DNA λόγω της υψηλής δραστικότητας φιλτραρίσματος τους.Από την άλλη πλευρά, τα μύδια, όπως πολλά ασπόνδυλα, μπορεί να είναι πιο ανθεκτικά στη βλάβη των ιστών που προκαλείται από το στρες, περιορίζοντας έτσι την απελευθέρωση του ccfDNA στην αιμολέμφη τους [70, 71].
Μέχρι σήμερα, η ανάλυση DNA της βιοποικιλότητας στα υδάτινα οικοσυστήματα έχει επικεντρωθεί κυρίως στη μεταγραμμική κωδικοποίηση του DNA του περιβάλλοντος (eDNA).Ωστόσο, αυτή η μέθοδος είναι συνήθως περιορισμένη στην ανάλυση βιοποικιλότητας όταν χρησιμοποιούνται εκκινητές.Η χρήση της αλληλουχίας κυνηγετικών όπλων παρακάμπτει τους περιορισμούς της PCR και την προκατειλημμένη επιλογή σετ εκκινητών.Έτσι, κατά μία έννοια, η μέθοδός μας είναι πιο κοντά στην πρόσφατα χρησιμοποιούμενη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας eDNA Shotgun υψηλής απόδοσης, η οποία είναι σε θέση να αναλύει απευθείας την αλληλουχία κατακερματισμένου DNA και να αναλύει σχεδόν όλους τους οργανισμούς [72, 73].Ωστόσο, υπάρχει μια σειρά θεμελιωδών ζητημάτων που διακρίνουν την LB από τις τυπικές μεθόδους eDNA.Φυσικά, η κύρια διαφορά μεταξύ eDNA και LB είναι η χρήση φυσικών κεντρικών φίλτρων.Έχει αναφερθεί η χρήση θαλάσσιων ειδών όπως οι σφουγγάρια και τα δίθυρα (Dresseina spp.) ως φυσικό φίλτρο για τη μελέτη του eDNA [74, 75].Ωστόσο, η μελέτη του Dreissena χρησιμοποίησε βιοψίες ιστού από τις οποίες εξήχθη DNA.Η ανάλυση του ccfDNA από το LB δεν απαιτεί βιοψία ιστού, εξειδικευμένο και μερικές φορές ακριβό εξοπλισμό και υλικοτεχνική υποστήριξη που σχετίζονται με το eDNA ή τη βιοψία ιστού.Στην πραγματικότητα, πρόσφατα αναφέραμε ότι το ccfDNA από το LB μπορεί να αποθηκευτεί και να αναλυθεί με υποστήριξη FTA χωρίς τη διατήρηση μιας ψυχρής αλυσίδας, κάτι που αποτελεί σημαντική πρόκληση για την έρευνα σε απομακρυσμένες περιοχές [76].Η εξαγωγή του ccfDNA από υγρές βιοψίες είναι επίσης απλή και παρέχει υψηλής ποιότητας DNA για προσδιορισμό αλληλουχίας κυνηγετικών όπλων και ανάλυση PCR.Αυτό είναι ένα μεγάλο πλεονέκτημα δεδομένων ορισμένων από τους τεχνικούς περιορισμούς που σχετίζονται με την ανάλυση eDNA [77].Η απλότητα και το χαμηλό κόστος της μεθόδου δειγματοληψίας είναι επίσης ιδιαίτερα κατάλληλη για μακροπρόθεσμα προγράμματα παρακολούθησης.Εκτός από την υψηλή ικανότητα φιλτραρίσματος, ένα άλλο γνωστό χαρακτηριστικό των δίθυρων είναι η χημική σύνθεση βλεννοπολυσακχαριτών της βλέννας τους, η οποία προάγει την απορρόφηση των ιών [78, 79].Αυτό καθιστά τα δίθυρα ένα ιδανικό φυσικό φίλτρο για τον χαρακτηρισμό της βιοποικιλότητας και των επιπτώσεων της κλιματικής αλλαγής σε ένα δεδομένο υδάτινο οικοσύστημα.Αν και η παρουσία θραυσμάτων DNA που προέρχονται από ξενιστή μπορεί να θεωρηθεί ως περιορισμός της μεθόδου σε σύγκριση με το eDNA, το κόστος που σχετίζεται με την ύπαρξη ενός τέτοιου φυσικού ccfDNA σε σύγκριση με το eDNA είναι ταυτόχρονα κατανοητό για τον τεράστιο όγκο πληροφοριών που είναι διαθέσιμες για μελέτες υγείας.offset host.Αυτό περιλαμβάνει την παρουσία ιικών αλληλουχιών ενσωματωμένων στο γονιδίωμα του ξενιστή.Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τα μύδια, δεδομένης της παρουσίας οριζόντια μεταδιδόμενων λευχαιμικών ρετροϊών στα δίθυρα [80, 81].Ένα άλλο πλεονέκτημα του LB έναντι του eDNA είναι ότι εκμεταλλεύεται τη φαγοκυτταρική δραστηριότητα των κυκλοφορούντων αιμοσφαιρίων στην αιμολέμφο, η οποία καταπίνει τους μικροοργανισμούς (και τα γονιδιώματά τους).Η φαγοκυττάρωση είναι η κύρια λειτουργία των αιμοσφαιρίων στα δίθυρα [82].Τέλος, η μέθοδος εκμεταλλεύεται την υψηλή ικανότητα φιλτραρίσματος των μυδιών (μέσος όρος 1,5 l/h θαλασσινού νερού) και τη διήμερη κυκλοφορία, που αυξάνουν την ανάμειξη διαφορετικών στρωμάτων θαλασσινού νερού, επιτρέποντας τη σύλληψη ετερόλογου eDNA.[83, 84].Έτσι, η ανάλυση ccfDNA μυδιών είναι μια ενδιαφέρουσα οδός δεδομένων των διατροφικών, οικονομικών και περιβαλλοντικών επιπτώσεων των μυδιών.Παρόμοια με την ανάλυση του LB που συλλέγεται από ανθρώπους, αυτή η μέθοδος ανοίγει επίσης τη δυνατότητα μέτρησης γενετικών και επιγενετικών αλλαγών στο DNA του ξενιστή ως απόκριση σε εξωγενείς ουσίες.Για παράδειγμα, μπορούν να προβλεφθούν τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας τρίτης γενιάς για την εκτέλεση ανάλυσης μεθυλίωσης σε όλο το γονιδίωμα σε φυσικό ccfDNA χρησιμοποιώντας αλληλούχιση νανοπόρου.Αυτή η διαδικασία θα πρέπει να διευκολυνθεί από το γεγονός ότι το μήκος των θραυσμάτων ccfDNA μυδιών είναι ιδανικά συμβατό με πλατφόρμες προσδιορισμού αλληλουχίας μακράς ανάγνωσης που επιτρέπουν ανάλυση μεθυλίωσης DNA σε όλο το γονιδίωμα από μία μόνο σειρά αλληλουχίας χωρίς την ανάγκη χημικών μετασχηματισμών.Ως εκ τούτου, μπορεί να παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για τους υποκείμενους μηχανισμούς που διέπουν την απόκριση μετά την έκθεση στην κλιματική αλλαγή ή στους ρύπους [87].Ωστόσο, η χρήση του LB δεν είναι χωρίς περιορισμούς.Περιττό να πούμε ότι αυτό απαιτεί την παρουσία ειδών δεικτών στο οικοσύστημα.Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η χρήση του LB για την αξιολόγηση της βιοποικιλότητας ενός δεδομένου οικοσυστήματος απαιτεί επίσης έναν αυστηρό αγωγό βιοπληροφορικής που λαμβάνει υπόψη την παρουσία θραυσμάτων DNA από την πηγή.Ένα άλλο σημαντικό πρόβλημα είναι η διαθεσιμότητα γονιδιωμάτων αναφοράς για θαλάσσια είδη.Ελπίζεται ότι πρωτοβουλίες όπως το Marine Mammal Genomes Project και το πρόσφατα συσταθέν έργο Fish10k [88] θα διευκολύνουν μια τέτοια ανάλυση στο μέλλον.Η εφαρμογή της ιδέας LB σε θαλάσσιους οργανισμούς που τροφοδοτούνται με φίλτρα είναι επίσης συμβατή με τις πιο πρόσφατες εξελίξεις στην τεχνολογία αλληλούχισης, καθιστώντας την κατάλληλη για την ανάπτυξη βιοδεικτών πολλαπλών ohm για την παροχή σημαντικών πληροφοριών σχετικά με την υγεία των θαλάσσιων οικοτόπων ως απόκριση στο περιβαλλοντικό στρες.
Τα δεδομένα αλληλουχίας γονιδιώματος έχουν κατατεθεί στο αρχείο ανάγνωσης ακολουθίας NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 στο Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής στη θαλάσσια ζωή και τα οικοσυστήματα.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Εξετάστε τις συνδυασμένες επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής και άλλων τοπικών στρεσογόνων παραγόντων στο θαλάσσιο περιβάλλον.γενικό επιστημονικό περιβάλλον.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Επιστήμη της πρώτης Μαρτίου.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Η μειωμένη θερμική ανοχή υπό επαναλαμβανόμενες συνθήκες θερμικής καταπόνησης εξηγεί την υψηλή καλοκαιρινή θνησιμότητα των μπλε μυδιών.Επιστημονική έκθεση 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Πρόσφατες αλλαγές στη συχνότητα, τις αιτίες και την έκταση των θανάτων ζώων.Proc Natl Acad Sci ΗΠΑ.2015; 112: 1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Πολλαπλά παθογόνα μη ειδικά για το είδος μπορεί να έχουν προκαλέσει μαζική θνησιμότητα του Pinna nobilis.ΖΩΗ.2020; 10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Πιθανές επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής στις ζωονοσογόνες ασθένειες της Αρκτικής.Int J Circumpolar health.2005;64:468-77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus Α., Gomez Τ. et al.Τα μπλε μύδια (Mytilus edulis spp.) ως οργανισμοί σήμανσης στην παρακολούθηση της ρύπανσης των ακτών: μια ανασκόπηση.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Ενσωμάτωση υγρής βιοψίας στη θεραπεία του καρκίνου.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Ωρίμανση υγρής βιοψίας: Επιτρέπει την κυκλοφορία του DNA του όγκου.Nat Rev Καρκίνος.2017; 17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleic acids in human plasma.Πρακτικά συνεδριάσεων των θυγατρικών Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Ένας νέος ρόλος για το DNA χωρίς κύτταρα ως μοριακός δείκτης για τη θεραπεία του καρκίνου.Ποσοτικοποίηση βιομοριακής ανάλυσης.2019; 17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Η υγρή βιοψία εισέρχεται στην κλινική – θέματα εφαρμογής και μελλοντικές προκλήσεις.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW και άλλοι.Το εμβρυϊκό DNA υπάρχει στο μητρικό πλάσμα και στον ορό.Νυστέρι.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Μελέτη της πορείας της εγκυμοσύνης και των επιπλοκών της χρησιμοποιώντας κυκλοφορούν εξωκυττάριο RNA στο αίμα των γυναικών κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης.Ντοπαιδιατρική.2020; 8:605219.
Ollerich Μ, Sherwood Κ, Keown Ρ, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et αϊ.Υγρή βιοψία: DNA χωρίς κύτταρα δότη χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αλλογενών αλλοιώσεων σε νεφρικό μόσχευμα.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Καινοτομίες στην προγεννητική διάγνωση: αλληλουχία γονιδιώματος μητρικού πλάσματος.Anna MD.2016; 67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et αϊ.Ταχεία ανίχνευση παθογόνων με μεταγονιδιωματική αλληλουχία επόμενης γενιάς μολυσμένων σωματικών υγρών.Nat Medicine.2021; 27:115-24.