Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η γονιμότητα των πτηνών εξαρτάται από την ικανότητά τους να αποθηκεύουν αρκετό βιώσιμο σπέρμα για μεγάλο χρονικό διάστημα στους σωλήνες αποθήκευσης σπέρματος (SST). Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο τα σπερματοζωάρια εισέρχονται, παραμένουν και εξέρχονται από τον SST παραμένει αμφιλεγόμενος. Το σπέρμα των κοτόπουλων sharkasi έδειξε υψηλή τάση για συγκόλληση, σχηματίζοντας κινητές νηματώδεις δέσμες που περιέχουν πολλά κύτταρα. Λόγω της δυσκολίας παρατήρησης της κινητικότητας και της συμπεριφοράς των σπερματοζωαρίων σε μια αδιαφανή σάλπιγγα, χρησιμοποιήσαμε μια μικρορευστομηχανική συσκευή με διατομή μικροκαναλιού παρόμοια με αυτή των σπερματοζωαρίων για να μελετήσουμε τη συγκόλληση και την κινητικότητα των σπερματοζωαρίων. Αυτή η μελέτη συζητά πώς σχηματίζονται οι δέσμες σπερματοζωαρίων, πώς κινούνται και τον πιθανό ρόλο τους στην παράταση της παραμονής του σπέρματος στον SST. Διερευνήσαμε την ταχύτητα και τη ρεολογική συμπεριφορά του σπέρματος όταν δημιουργήθηκε ροή υγρού μέσα σε ένα μικρορευστομηχανικό κανάλι από υδροστατική πίεση (ρυθμός ροής = 33 µm/s). Τα σπερματοζωάρια τείνουν να κολυμπούν κόντρα στο ρεύμα (θετική ρεολογία) και η ταχύτητα της δέσμης σπερματοζωαρίων μειώνεται σημαντικά σε σύγκριση με τα μεμονωμένα σπερματοζωάρια. Έχει παρατηρηθεί ότι οι δέσμες σπερματοζωαρίων κινούνται σπειροειδώς και αυξάνονται σε μήκος και πάχος καθώς στρατολογούνται περισσότερα μεμονωμένα σπερματοζωάρια. Παρατηρήθηκαν δέσμες σπερματοζωαρίων να πλησιάζουν και να προσκολλώνται στα πλευρικά τοιχώματα των μικρορευστομηχανικών καναλιών για να αποφευχθεί η σάρωση με ταχύτητα ροής υγρού > 33 µm/s. Παρατηρήθηκαν δέσμες σπερματοζωαρίων να πλησιάζουν και να προσκολλώνται στα πλευρικά τοιχώματα των μικρορευστομηχανικών καναλιών για να αποφευχθεί η σάρωση με ταχύτητα ροής υγρού > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / σ. Έχει παρατηρηθεί ότι δέσμες σπερματοζωαρίων πλησιάζουν και προσκολλώνται στα πλευρικά τοιχώματα των μικρορευστομηχανικών καναλιών για να αποφύγουν την παράσυρσή τους σε ρυθμούς ροής υγρού >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 μm/s33 μm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Έχει παρατηρηθεί ότι δέσμες σπερματοζωαρίων πλησιάζουν και προσκολλώνται στα πλευρικά τοιχώματα του μικρορευστομηχανικού καναλιού για να αποφύγουν την παράσυρσή τους από τη ροή υγρού με ταχύτητα >33 µm/s.Η μικροσκοπία σάρωσης και ηλεκτρονικής διαπερατότητας αποκάλυψε ότι οι δέσμες σπερματοζωαρίων στηρίζονταν σε άφθονο πυκνό υλικό. Τα δεδομένα που ελήφθησαν καταδεικνύουν τη μοναδική κινητικότητα των σπερματοζωαρίων κοτόπουλου Sharkazi, καθώς και την ικανότητα των σπερματοζωαρίων να συγκολλώνται και να σχηματίζουν κινητές δέσμες, γεγονός που συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της μακροχρόνιας αποθήκευσης των σπερματοζωαρίων σε SMT.
Για να επιτευχθεί η γονιμοποίηση στους ανθρώπους και στα περισσότερα ζώα, το σπέρμα και τα ωάρια πρέπει να φτάσουν στο σημείο της γονιμοποίησης την κατάλληλη στιγμή. Επομένως, το ζευγάρωμα πρέπει να συμβεί πριν ή κατά τη στιγμή της ωορρηξίας. Από την άλλη πλευρά, ορισμένα θηλαστικά, όπως οι σκύλοι, καθώς και μη θηλαστικά είδη, όπως έντομα, ψάρια, ερπετά και πτηνά, αποθηκεύουν σπέρμα στα αναπαραγωγικά τους όργανα για μεγάλο χρονικό διάστημα μέχρι τα ωάρια τους να είναι έτοιμα για γονιμοποίηση (ασύγχρονη γονιμοποίηση 1 ). Τα πτηνά είναι σε θέση να διατηρήσουν τη βιωσιμότητα των σπερματοζωαρίων που είναι ικανά να γονιμοποιήσουν ωάρια για 2-10 εβδομάδες 2 .
Αυτό είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό που διακρίνει τα πτηνά από άλλα ζώα, καθώς παρέχει υψηλή πιθανότητα γονιμοποίησης μετά από μία μόνο σπερματέγχυση για αρκετές εβδομάδες χωρίς ταυτόχρονο ζευγάρωμα και ωορρηξία. Το κύριο όργανο αποθήκευσης σπέρματος, που ονομάζεται σωληνάριο αποθήκευσης σπέρματος (SST), βρίσκεται στις εσωτερικές βλεννογονικές πτυχές στη μητροκολπική συμβολή. Μέχρι σήμερα, οι μηχανισμοί με τους οποίους το σπέρμα εισέρχεται, παραμένει και εξέρχεται από την τράπεζα σπέρματος δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Με βάση προηγούμενες μελέτες, έχουν διατυπωθεί πολλές υποθέσεις, αλλά καμία από αυτές δεν έχει επιβεβαιωθεί.
Ο Forman4 υπέθεσε ότι τα σπερματοζωάρια διατηρούν την παραμονή τους στην κοιλότητα SST μέσω συνεχούς ταλαντωτικής κίνησης αντίθετα προς την κατεύθυνση της ροής του υγρού μέσω πρωτεϊνικών καναλιών που βρίσκονται στα επιθηλιακά κύτταρα SST (ρεολογία). Το ATP εξαντλείται λόγω της σταθερής δραστηριότητας των μαστιγίων που απαιτείται για να διατηρηθεί το σπέρμα στον αυλό του SST και η κινητικότητα τελικά μειώνεται μέχρι το σπέρμα να απομακρυνθεί από την τράπεζα σπερματοζωαρίων μέσω της ροής του υγρού και να ξεκινήσει ένα νέο ταξίδι κατά μήκος της ανιούσας σάλπιγγας για να γονιμοποιήσει το σπέρμα. Ωάριο (Forman4). Αυτό το μοντέλο αποθήκευσης σπέρματος υποστηρίζεται από την ανίχνευση με ανοσοκυτταροχημεία των ακουαπορινών 2, 3 και 9 που υπάρχουν στα επιθηλιακά κύτταρα SST. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν μελέτες σχετικά με τη ρεολογία του σπέρματος των κοτόπουλων και τον ρόλο του στην αποθήκευση SST, την επιλογή κολπικού σπέρματος και τον ανταγωνισμό σπέρματος. Στα κοτόπουλα, το σπέρμα εισέρχεται στον κόλπο μετά το φυσικό ζευγάρωμα, αλλά περισσότερο από το 80% των σπερματοζωαρίων εξωθείται από τον κόλπο λίγο μετά το ζευγάρωμα. Αυτό υποδηλώνει ότι ο κόλπος είναι η κύρια θέση για την επιλογή σπέρματος στα πτηνά. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι λιγότερο από το 1% των σπερματοζωαρίων που γονιμοποιούνται στον κόλπο καταλήγουν σε SSTs2. Στην τεχνητή γονιμοποίηση νεοσσών στον κόλπο, ο αριθμός των σπερματοζωαρίων που φτάνουν στο SST τείνει να αυξάνεται 24 ώρες μετά τη γονιμοποίηση. Μέχρι στιγμής, ο μηχανισμός επιλογής σπερματοζωαρίων κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας είναι ασαφής και η κινητικότητα του σπέρματος μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόσληψη σπέρματος από το SST. Λόγω των παχιών και αδιαφανών τοιχωμάτων των σαλπίγγων, είναι δύσκολο να παρακολουθηθεί άμεσα η κινητικότητα του σπέρματος στις σάλπιγγες των πτηνών. Επομένως, δεν έχουμε βασικές γνώσεις για το πώς τα σπερματοζωάρια μεταβαίνουν στο SST μετά τη γονιμοποίηση.
Η ρεολογία έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ένας σημαντικός παράγοντας που ελέγχει τη μεταφορά σπέρματος στα γεννητικά όργανα των θηλαστικών. Με βάση την ικανότητα των κινητών σπερματοζωαρίων να μεταναστεύουν αντίθετα προς το ρεύμα, οι Zaferani et al8 χρησιμοποίησαν ένα μικρορευστομηχανικό σύστημα corra για να απομονώσουν παθητικά τα κινητά σπερματοζωάρια από δείγματα σπέρματος που συλλέχθηκαν με γραφομηχανή. Αυτός ο τύπος διαλογής σπέρματος είναι απαραίτητος για την ιατρική θεραπεία της υπογονιμότητας και την κλινική έρευνα και προτιμάται έναντι των παραδοσιακών μεθόδων που απαιτούν πολύ χρόνο και εργασία και μπορούν να θέσουν σε κίνδυνο τη μορφολογία και τη δομική ακεραιότητα του σπέρματος. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, δεν έχουν διεξαχθεί μελέτες σχετικά με την επίδραση των εκκρίσεων από τα γεννητικά όργανα των κοτόπουλων στην κινητικότητα του σπέρματος.
Ανεξάρτητα από τον μηχανισμό που διατηρεί το σπέρμα αποθηκευμένο στο SST, πολλοί ερευνητές έχουν παρατηρήσει ότι τα σπερματοζωάρια που βρίσκονται εκεί συγκολλώνται κεφάλι με κεφάλι στο SST των κοτόπουλων 9, 10, των ορτυκιών 2 και των γαλοπούλων 11 για να σχηματίσουν συγκολλημένες δέσμες σπέρματος. Οι συγγραφείς υποστηρίζουν ότι υπάρχει σύνδεση μεταξύ αυτής της συγκόλλησης και της μακροχρόνιας αποθήκευσης σπερματοζωαρίων στο SST.
Οι Tingari και Lake12 ανέφεραν μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των σπερματοζωαρίων στον αδένα υποδοχής σπέρματος του κοτόπουλου και αμφισβήτησαν το κατά πόσον τα σπερματοζωάρια των πτηνών συγκολλώνται με τον ίδιο τρόπο όπως τα σπερματοζωάρια των θηλαστικών. Πιστεύουν ότι οι βαθιές συνδέσεις μεταξύ των σπερματοζωαρίων στον σπερματικό πόρο μπορεί να οφείλονται στο στρες που προκαλείται από την παρουσία μεγάλου αριθμού σπερματοζωαρίων σε μικρό χώρο.
Κατά την αξιολόγηση της συμπεριφοράς των σπερματοζωαρίων σε φρέσκες κρεμαστές γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες, παρατηρούνται παροδικά σημάδια συγκόλλησης, ειδικά στις άκρες των σταγονιδίων σπέρματος. Ωστόσο, η συγκόλληση συχνά διαταράσσεται από την περιστροφική δράση που σχετίζεται με τη συνεχή κίνηση, γεγονός που εξηγεί την παροδική φύση αυτού του φαινομένου. Οι ερευνητές παρατήρησαν επίσης ότι όταν το αραιωτικό προστέθηκε στο σπέρμα, εμφανίστηκαν επιμήκη συσσωματώματα κυττάρων που μοιάζουν με νήματα.
Οι πρώτες προσπάθειες μίμησης ενός σπερματοζωαρίου έγιναν αφαιρώντας ένα λεπτό σύρμα από μια κρεμαστή σταγόνα, το οποίο είχε ως αποτέλεσμα ένα επίμηκες κυστίδιο που έμοιαζε με σπερματοζωάριο να προεξέχει από τη σταγόνα του σπέρματος. Τα σπερματοζωάρια παρατάχθηκαν αμέσως παράλληλα μέσα στο κυστίδιο, αλλά ολόκληρη η μονάδα εξαφανίστηκε γρήγορα λόγω του τρισδιάστατου περιορισμού. Επομένως, για να μελετηθεί η συγκόλληση των σπερματοζωαρίων, είναι απαραίτητο να παρατηρηθεί η κινητικότητα και η συμπεριφορά των σπερματοζωαρίων απευθείας σε απομονωμένους σωληνίσκους αποθήκευσης σπέρματος, κάτι που είναι δύσκολο να επιτευχθεί. Επομένως, είναι απαραίτητο να αναπτυχθεί ένα όργανο που μιμείται τα σπερματοζωάρια για να υποστηρίξει μελέτες κινητικότητας και συμπεριφοράς συγκόλλησης του σπέρματος. Οι Brillard et al13 ανέφεραν ότι το μέσο μήκος των σωληνίσκων αποθήκευσης σπέρματος σε ενήλικα κοτόπουλα είναι 400-600 µm, αλλά ορισμένα SSTs μπορεί να έχουν μήκος έως και 2000 µm. Οι Mero και Ogasawara14 χώρισαν τους σπερματοδόχους αδένες σε διευρυμένους και μη διευρυμένους σωληνίσκους αποθήκευσης σπέρματος, οι οποίοι είχαν το ίδιο μήκος (~500 µm) και πλάτος λαιμού (~38 µm), αλλά η μέση διάμετρος του αυλού των σωληνίσκων ήταν 56,6 και 56,6 µm. . , αντίστοιχα 11,2 μm, αντίστοιχα. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια μικρορευστομηχανική συσκευή με μέγεθος καναλιού 200 µm × 20 µm (Π × Υ), της οποίας η διατομή είναι κάπως κοντά σε αυτή του ενισχυμένου SST. Επιπλέον, εξετάσαμε την κινητικότητα του σπέρματος και τη συμπεριφορά συγκόλλησης σε ρέον υγρό, κάτι που συνάδει με την υπόθεση του Foreman ότι το υγρό που παράγεται από τα επιθηλιακά κύτταρα SST διατηρεί το σπέρμα στον αυλό σε αντίθετη κατεύθυνση (ρεολογική).
Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να ξεπεραστούν τα προβλήματα παρατήρησης της κινητικότητας των σπερματοζωαρίων στις σάλπιγγες και να αποφευχθούν οι δυσκολίες μελέτης της ρεολογίας και της συμπεριφοράς των σπερματοζωαρίων σε ένα δυναμικό περιβάλλον. Χρησιμοποιήθηκε μια μικρορευστολογική συσκευή που δημιουργεί υδροστατική πίεση για την προσομοίωση της κινητικότητας του σπέρματος στα γεννητικά όργανα ενός κοτόπουλου.
Όταν μια σταγόνα αραιωμένου δείγματος σπέρματος (1:40) φορτώθηκε στη συσκευή μικροκαναλιού, μπορούσαν να αναγνωριστούν δύο τύποι κινητικότητας σπέρματος (απομονωμένο σπέρμα και δεσμευμένο σπέρμα). Επιπλέον, τα σπερματοζωάρια έτειναν να κολυμπούν κόντρα στο ρεύμα (θετική ρεολογία· βίντεο 1, 2). Αν και οι δέσμες σπερματοζωαρίων είχαν χαμηλότερη ταχύτητα από αυτή των μεμονωμένων σπερματοζωαρίων (p < 0,001), αύξησαν το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που εμφάνισαν θετική ρεοταξία (p < 0,001, Πίνακας 2). Αν και οι δέσμες σπερματοζωαρίων είχαν χαμηλότερη ταχύτητα από αυτή των μεμονωμένων σπερματοζωαρίων (p < 0,001), αύξησαν το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που εμφάνισαν θετική ρεοταξία (p < 0,001, Πίνακας 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001). Αν και οι δέσμες σπερματοζωαρίων είχαν χαμηλότερη ταχύτητα από αυτή των μεμονωμένων σπερματοζωαρίων (p < 0,001), αύξησαν το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που εμφάνισαν θετική ρεοταξία (p < 0,001, Πίνακας 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p <0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显礧 阾 度百分比 (p <0,001 ； 2。…………………………………………………… Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов со положительной реологией (p < 0,001; Πίνακας 2). Αν και η ταχύτητα των δεσμίδων σπερματοζωαρίων ήταν χαμηλότερη από αυτή των μεμονωμένων σπερματοζωαρίων (p < 0,001), αύξησαν το ποσοστό των σπερματοζωαρίων με θετική ρεολογία (p < 0,001· Πίνακας 2).Η θετική ρεολογία για μεμονωμένα σπερματοζωάρια και συστάδες εκτιμάται σε περίπου 53% και 85% αντίστοιχα.
Έχει παρατηρηθεί ότι τα σπερματοζωάρια των κοτόπουλων sharkasi αμέσως μετά την εκσπερμάτιση σχηματίζουν γραμμικές δέσμες, που αποτελούνται από δεκάδες άτομα. Αυτές οι δέσμες αυξάνονται σε μήκος και πάχος με την πάροδο του χρόνου και μπορεί να παραμείνουν in vitro για αρκετές ώρες πριν διαλυθούν (βίντεο 3). Αυτές οι νηματώδεις δέσμες έχουν σχήμα σπερματοζωαρίων έχιδνας που σχηματίζονται στο τέλος της επιδιδυμίδας. Έχει βρεθεί ότι το σπέρμα των κοτόπουλων sharkashi έχει υψηλή τάση να συγκολλάται και να σχηματίζει μια δικτυωτή δέσμη σε λιγότερο από ένα λεπτό μετά τη συλλογή. Αυτές οι δέσμες είναι δυναμικές και μπορούν να κολλήσουν σε κοντινά τοιχώματα ή στατικά αντικείμενα. Αν και οι δέσμες σπερματοζωαρίων μειώνουν την ταχύτητα των σπερματοζωαρίων, είναι σαφές ότι μακροσκοπικά αυξάνουν τη γραμμικότητά τους. Το μήκος των δεσμίδων ποικίλλει ανάλογα με τον αριθμό των σπερματοζωαρίων που συλλέγονται σε δέσμες. Απομονώθηκαν δύο μέρη της δέσμης: το αρχικό μέρος, συμπεριλαμβανομένης της ελεύθερης κεφαλής του συγκολλημένου σπερματοζωαρίου, και το τελικό μέρος, συμπεριλαμβανομένης της ουράς και ολόκληρου του περιφερικού άκρου του σπερματοζωαρίου. Χρησιμοποιώντας μια κάμερα υψηλής ταχύτητας (950 fps), παρατηρήθηκαν ελεύθερες κεφαλές συγκολλημένων σπερματοζωαρίων στο αρχικό μέρος της δέσμης, υπεύθυνες για την κίνηση της δέσμης λόγω της ταλαντωτικής τους κίνησης, παρασύροντας τα υπόλοιπα μέσα στη δέσμη με ελικοειδή κίνηση (Βίντεο 4). Ωστόσο, σε μακριές δέσμες, έχει παρατηρηθεί ότι ορισμένες ελεύθερες κεφαλές σπερματοζωαρίων προσκολλημένες στο σώμα και το τελικό τμήμα της δέσμης λειτουργεί ως πτερύγια για να βοηθήσει στην προώθηση της δέσμης.
Ενώ βρίσκονται σε μια αργή ροή υγρού, οι δέσμες σπερματοζωαρίων κινούνται παράλληλα μεταξύ τους, ωστόσο, αρχίζουν να επικαλύπτονται και να κολλάνε σε οτιδήποτε είναι ακίνητο, έτσι ώστε να μην παρασυρθούν από τη ροή του ρεύματος καθώς αυξάνεται η ταχύτητα ροής. Οι δέσμες σχηματίζονται όταν μια χούφτα σπερματοζωαρίων πλησιάζουν η μία την άλλη, αρχίζουν να κινούνται συγχρονισμένα και να τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη, και στη συνέχεια κολλάνε σε μια κολλώδη ουσία. Τα Σχήματα 1 και 2 δείχνουν πώς τα σπερματοζωάρια πλησιάζουν η μία την άλλη, σχηματίζοντας μια ένωση καθώς οι ουρές τυλίγονται η μία γύρω από την άλλη.
Οι ερευνητές εφάρμοσαν υδροστατική πίεση για να δημιουργήσουν ροή υγρού σε ένα μικροκανάλι για να μελετήσουν τη ρεολογία του σπέρματος. Χρησιμοποιήθηκε ένα μικροκανάλι μεγέθους 200 µm × 20 µm (Π × Υ) και μήκους 3,6 µm. Χρησιμοποιήστε μικροκανάλια μεταξύ των δοχείων με σύριγγες τοποθετημένες στα άκρα. Χρησιμοποιήθηκε χρωστική τροφίμων για να γίνουν τα κανάλια πιο ορατά.
Δέστε τα καλώδια διασύνδεσης και τα αξεσουάρ στον τοίχο. Το βίντεο τραβήχτηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Με κάθε εικόνα, παρουσιάζονται εικόνες μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης και χαρτογράφησης. (Α) Η σύνδεση μεταξύ δύο ρευμάτων αντιστέκεται στη ροή λόγω ελικοειδούς κίνησης (κόκκινο βέλος). (Β) Η σύνδεση μεταξύ της δέσμης σωλήνα και του τοιχώματος του καναλιού (κόκκινα βέλη), ενώ ταυτόχρονα συνδέονται με δύο άλλες δέσμες (κίτρινα βέλη). (Γ) Οι δέσμες σπερματοζωαρίων στο μικρορευστομηχανικό κανάλι αρχίζουν να συνδέονται μεταξύ τους (κόκκινα βέλη), σχηματίζοντας ένα πλέγμα δεσμίδων σπερματοζωαρίων. (Δ) Σχηματισμός ενός δικτύου δεσμίδων σπερματοζωαρίων.
Όταν μια σταγόνα αραιωμένου σπερματοζωαρίου φορτώθηκε στη μικρορευστομηχανική συσκευή και δημιουργήθηκε ροή, η δέσμη σπερματοζωαρίων παρατηρήθηκε να κινείται αντίθετα προς την κατεύθυνση της ροής. Οι δέσμες εφαρμόζουν άνετα στα τοιχώματα των μικροκαναλιών και οι ελεύθερες κεφαλές στο αρχικό μέρος των δεσμίδων εφαρμόζουν άνετα σε αυτές (βίντεο 5). Επίσης, προσκολλώνται σε τυχόν ακίνητα σωματίδια στην πορεία τους, όπως υπολείμματα, για να αντισταθούν στο να παρασυρθούν από το ρεύμα. Με την πάροδο του χρόνου, αυτές οι δέσμες γίνονται μακριές ίνες παγιδεύοντας άλλα μεμονωμένα σπερματοζωάρια και μικρότερες δέσμες (Βίντεο 6). Καθώς η ροή αρχίζει να επιβραδύνεται, μακριές γραμμές σπερματοζωαρίων αρχίζουν να σχηματίζουν ένα δίκτυο γραμμών σπερματοζωαρίων (Βίντεο 7, Σχήμα 2).
Σε υψηλή ταχύτητα ροής (V > 33 µm/s), οι σπειροειδείς κινήσεις των νημάτων αυξάνονται ως προσπάθεια να συλλεχθούν πολλές μεμονωμένες δέσμες σπερματοζωαρίων που σχηματίζουν, οι οποίες αντιστέκονται καλύτερα στη δύναμη μετατόπισης της ροής. Σε υψηλή ταχύτητα ροής (V > 33 µm/s), οι σπειροειδείς κινήσεις των νημάτων αυξάνονται ως προσπάθεια να συλλεχθούν πολλές μεμονωμένες δέσμες σπερματοζωαρίων που σχηματίζουν, οι οποίες αντιστέκονται καλύτερα στη δύναμη μετατόπισης της ροής. При высокой скорости потока (V > 33 μ.κ.μ.) силе потока. Σε υψηλούς ρυθμούς ροής (V > 33 µm/s), οι ελικοειδής κινήσεις των κλώνων αυξάνονται καθώς προσπαθούν να πιάσουν πολλά μεμονωμένα σπερματοζωάρια σχηματίζοντας δέσμες που είναι σε καλύτερη θέση να αντισταθούν στη δύναμη μετατόπισης της ροής.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 μm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/σ) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих путочки, чтобый движение ный увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих путочки, чтобыщих путочки, т. Σε υψηλούς ρυθμούς ροής (V > 33 µm/s), η ελικοειδής κίνηση των νηματίων αυξάνεται σε μια προσπάθεια να συλληφθούν πολλά μεμονωμένα σπερματοζωάρια που σχηματίζουν δέσμες για να αντισταθούν καλύτερα στις δυνάμεις μετατόπισης της ροής.Προσπάθησαν επίσης να συνδέσουν μικροκανάλια στα πλευρικά τοιχώματα.
Οι δέσμες σπερματοζωαρίων ταυτοποιήθηκαν ως συστάδες κεφαλών σπερματοζωαρίων και σγουρών ουρών χρησιμοποιώντας οπτική μικροσκοπία (LM). Δέσμες σπερματοζωαρίων με διάφορα συσσωματώματα έχουν επίσης ταυτοποιηθεί ως στριμμένες κεφαλές και συσσωματώματα μαστιγίων, πολλαπλές συγχωνευμένες ουρές σπερματοζωαρίων, κεφαλές σπερματοζωαρίων προσαρτημένες σε ουρά και κεφαλές σπερματοζωαρίων με λυγισμένους πυρήνες ως πολλαπλοί συγχωνευμένοι πυρήνες. Ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (TEM). Η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) έδειξε ότι οι δέσμες σπερματοζωαρίων ήταν συσσωματώματα κεφαλών σπερματοζωαρίων με περίβλημα και τα συσσωματώματα σπερματοζωαρίων έδειξαν ένα συνδεδεμένο δίκτυο τυλιγμένων ουρών.
Η μορφολογία και η υπερδομή των σπερματοζωαρίων, καθώς και ο σχηματισμός δεσμίδων σπερματοζωαρίων μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτική μικροσκοπία (μισή τομή), ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) και ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (TEM), τα επιχρίσματα σπέρματος χρωματίστηκαν με πορτοκαλί ακριδίνης και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία επιφθορισμού.
Η χρώση επιχρίσματος σπέρματος με πορτοκαλί ακριδίνης (Εικ. 3Β) έδειξε ότι οι κεφαλές των σπερματοζωαρίων ήταν κολλημένες μεταξύ τους και καλυμμένες με εκκριτικό υλικό, γεγονός που οδήγησε στο σχηματισμό μεγάλων τούφων (Εικ. 3D). Οι δέσμες σπερματοζωαρίων αποτελούνταν από συσσωματώματα σπερματοζωαρίων με ένα δίκτυο προσαρτημένων ουρών (Εικ. 4A-C). Οι δέσμες σπερματοζωαρίων αποτελούνται από τις ουρές πολλών σπερματοζωαρίων κολλημένες μεταξύ τους (Εικ. 4D). Μυστικά (Εικ. 4E,F) κάλυπταν τις κεφαλές των δεσμίδων σπερματοζωαρίων.
Σχηματισμός της δέσμης σπερματοζωαρίων. Χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης και επιχρίσματα σπερματοζωαρίων χρωματισμένα με πορτοκαλί ακριδίνης, έδειξε ότι οι κεφαλές των σπερματοζωαρίων κολλάνε μεταξύ τους. (Α) Ο πρώιμος σχηματισμός δέσμης σπερματοζωαρίων ξεκινά με ένα σπερματοζωάριο (λευκός κύκλος) και τρία σπερματοζωάρια (κίτρινος κύκλος), με την σπείρα να ξεκινά από την ουρά και να καταλήγει στην κεφαλή. (Β) Φωτομικρογραφία ενός επιχρίσματος σπερματοζωαρίων χρωματισμένου με πορτοκαλί ακριδίνης που δείχνει προσκολλημένες κεφαλές σπερματοζωαρίων (βέλη). Η έκκριση καλύπτει την/τις κεφαλή/ες. Μεγέθυνση × 1000. (Γ) Ανάπτυξη μιας μεγάλης δέσμης που μεταφέρεται με ροή σε ένα μικρορευστομηχανικό κανάλι (χρησιμοποιώντας κάμερα υψηλής ταχύτητας στα 950 fps). (Δ) Μικρογραφία ενός επιχρίσματος σπερματοζωαρίων χρωματισμένου με πορτοκαλί ακριδίνης που δείχνει μεγάλες δέσμες (βέλη). Μεγέθυνση: ×200.
Ηλεκτρονική μικρογραφία σάρωσης δέσμης σπερματοζωαρίων και επιχρίσματος σπερματοζωαρίων χρωματισμένου με πορτοκαλί ακριδίνης. (A, B, D, E) είναι ψηφιακές έγχρωμες ηλεκτρονικές μικρογραφίες σάρωσης σπερματοζωαρίων, και C και F είναι μικρογραφίες επιχρισμάτων σπερματοζωαρίων χρωματισμένων με πορτοκαλί ακριδίνης που δείχνουν την προσκόλληση πολλαπλών σπερματοζωαρίων που τυλίγουν τον ουραίο ιστό. (AC) Τα συσσωματώματα σπερματοζωαρίων εμφανίζονται ως δίκτυο προσκολλημένων ουρών (βέλη). (D) Προσκόλληση αρκετών σπερματοζωαρίων (με συγκολλητική ουσία, ροζ περίγραμμα, βέλος) που τυλίγονται γύρω από την ουρά. (E και F) Συσσωματώματα κεφαλής σπερματοζωαρίων (δείκτες) καλυμμένα με συγκολλητικό υλικό (δείκτες). Τα σπερματοζωάρια σχημάτισαν δέσμες με αρκετές στροβιλοειδείς δομές (F). (C) μεγεθύνσεις ×400 και (F) ×200.
Χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης, διαπιστώσαμε ότι οι δέσμες σπερματοζωαρίων είχαν προσαρτημένες ουρές (Εικ. 6Α, Γ), κεφαλές προσαρτημένες σε ουρές (Εικ. 6Β) ή κεφαλές προσαρτημένες σε ουρές (Εικ. 6Δ). Οι κεφαλές των σπερματοζωαρίων στη δέσμη είναι καμπύλες, παρουσιάζοντας στην τομή δύο πυρηνικές περιοχές (Εικ. 6Δ). Στη δέσμη τομής, τα σπερματοζωάρια είχαν μια στριμμένη κεφαλή με δύο πυρηνικές περιοχές και πολλαπλές μαστιγωτές περιοχές (Εικ. 5Α).
Ψηφιακή έγχρωμη ηλεκτρονική μικρογραφία που δείχνει τις συνδετικές ουρές στη δέσμη σπερματοζωαρίων και το υλικό συγκόλλησης που συνδέει τις κεφαλές των σπερματοζωαρίων. (Α) Προσκολλημένη ουρά μεγάλου αριθμού σπερματοζωαρίων. Παρατηρήστε πώς φαίνεται η ουρά τόσο σε κατακόρυφη (βέλος) όσο και σε οριζόντια (βέλος) προβολή. (Β) Η κεφαλή (βέλος) του σπερματοζωαρίου συνδέεται με την ουρά (βέλος). (Γ) Είναι προσκολλημένες αρκετές ουρές σπερματοζωαρίων (βέλη). (Δ) Το υλικό συγκόλλησης (AS, μπλε) συνδέει τέσσερις κεφαλές σπερματοζωαρίων (μωβ).
Η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση κεφαλών σπερματοζωαρίων σε δέσμες σπερματοζωαρίων καλυμμένες με εκκρίσεις ή μεμβράνες (Σχήμα 6Β), υποδεικνύοντας ότι οι δέσμες σπερματοζωαρίων ήταν αγκυρωμένες από εξωκυτταρικό υλικό. Το συγκολλημένο υλικό συμπυκνώθηκε στην κεφαλή του σπερματοζωαρίου (σύνολο που μοιάζει με κεφαλή μέδουσας· Σχήμα 5Β) και επεκτάθηκε περιφερικά, δίνοντας μια λαμπερή κίτρινη εμφάνιση υπό μικροσκοπία φθορισμού όταν χρωματίστηκε με πορτοκαλί ακριδίνης (Σχήμα 6C). Αυτή η ουσία είναι καθαρά ορατή υπό μικροσκόπιο σάρωσης και θεωρείται συνδετικό υλικό. Ημίλεπτες τομές (Σχήμα 5C) και επιχρίσματα σπερματοζωαρίων χρωματισμένα με πορτοκαλί ακριδίνης έδειξαν δέσμες σπερματοζωαρίων που περιείχαν πυκνά συσκευασμένες κεφαλές και καμπυλωτές ουρές (Σχήμα 5D).
Διάφορες φωτομικρογραφίες που δείχνουν συσσωμάτωση κεφαλών σπερματοζωαρίων και διπλωμένων ουρών χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους. (Α) Εγκάρσια τομή ψηφιακής έγχρωμης ηλεκτρονικής μικρογραφίας μετάδοσης μιας δέσμης σπερματοζωαρίων που δείχνει μια σπειροειδή κεφαλή σπερματοζωαρίων με έναν πυρήνα δύο μερών (μπλε) και πολλά μαστιγωτά μέρη (πράσινο). (Β) Ψηφιακή έγχρωμη ηλεκτρονική μικρογραφία σάρωσης που δείχνει μια συστάδα κεφαλών σπερματοζωαρίων που μοιάζουν με μέδουσες (βέλη) που φαίνεται να είναι καλυμμένες. (Γ) Ημιλεπτή τομή που δείχνει συσσωματωμένες κεφαλές σπερματοζωαρίων (βέλη) και κυρτές ουρές (βέλη). (Δ) Μικρογραφία ενός επιχρίσματος σπερματοζωαρίων βαμμένου με πορτοκαλί ακριδίνης που δείχνει συσσωματώματα κεφαλών σπερματοζωαρίων (βέλη) και κυρτές προσκολλημένες ουρές (βέλη). Σημειώστε ότι μια κολλώδης ουσία (S) καλύπτει την κεφαλή του σπερματοζωαρίου. (Δ) Μεγέθυνση × 1000.
Χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (Εικ. 7Α), παρατηρήθηκε επίσης ότι οι κεφαλές των σπερματοζωαρίων ήταν στριμμένες και οι πυρήνες είχαν σπειροειδές σχήμα, όπως επιβεβαιώθηκε από επιχρίσματα σπέρματος που χρωματίστηκαν με πορτοκαλί ακριδίνης και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Εικ. 7Β).
(Α) Ψηφιακή έγχρωμη ηλεκτρονική μικρογραφία μετάδοσης και (Β) Επίχρισμα σπέρματος χρωματισμένο με πορτοκαλί ακριδίνης που δείχνει κουλουριασμένες κεφαλές και προσκόλληση κεφαλών και ουρών σπέρματος (βέλη). (Β) Μεγέθυνση × 1000.
Ένα ενδιαφέρον εύρημα είναι ότι το σπέρμα του Sharkazi συσσωματώνεται σχηματίζοντας κινητές νηματώδεις δέσμες. Οι ιδιότητες αυτών των δεσμίδων μας επιτρέπουν να κατανοήσουμε τον πιθανό ρόλο τους στην απορρόφηση και αποθήκευση των σπερματοζωαρίων στο SST.
Μετά το ζευγάρωμα, τα σπερματοζωάρια εισέρχονται στον κόλπο και υφίστανται μια έντονη διαδικασία επιλογής, με αποτέλεσμα μόνο ένας περιορισμένος αριθμός σπερματοζωαρίων να εισέρχεται στο SST15,16. Μέχρι σήμερα, οι μηχανισμοί με τους οποίους τα σπερματοζωάρια εισέρχονται και εξέρχονται από το SST είναι ασαφείς. Στα πουλερικά, τα σπερματοζωάρια αποθηκεύονται στο SST για παρατεταμένη περίοδο 2 έως 10 εβδομάδων, ανάλογα με το είδος6. Παραμένει η διαμάχη σχετικά με την κατάσταση του σπέρματος κατά την αποθήκευση στο SST. Είναι σε κίνηση ή σε ηρεμία; Με άλλα λόγια, πώς διατηρούν τα σπερματοζωάρια τη θέση τους στο SST για τόσο μεγάλο χρονικό διάστημα;
Ο Forman4 πρότεινε ότι η παραμονή και η εξώθηση των SST θα μπορούσαν να εξηγηθούν με βάση την κινητικότητα του σπέρματος. Οι συγγραφείς υποθέτουν ότι το σπέρμα διατηρεί τη θέση του κολυμπώντας αντίθετα στη ροή του υγρού που δημιουργείται από το επιθήλιο του SST και ότι τα σπερματοζωάρια εξωθούνται από το SST όταν η ταχύτητά τους πέσει κάτω από το σημείο στο οποίο αρχίζουν να κινούνται προς τα πίσω λόγω έλλειψης ενέργειας. Ο Zaniboni5 επιβεβαίωσε την παρουσία των ακουαπορινών 2, 3 και 9 στο κορυφαίο τμήμα των επιθηλιακών κυττάρων του SST, κάτι που μπορεί έμμεσα να υποστηρίζει το μοντέλο αποθήκευσης σπέρματος του Foreman. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι σχεδόν τα μισά σπερματοζωάρια του Sharkashi εμφανίζουν θετική ρεολογία στο ρέον υγρό και ότι οι συγκολλημένες δέσμες σπερματοζωαρίων αυξάνουν τον αριθμό των σπερματοζωαρίων που εμφανίζουν θετική ρεολογία, αν και η συγκόλληση τις επιβραδύνει. Ο τρόπος με τον οποίο τα σπερματοζωάρια ταξιδεύουν στις σάλπιγγες του πουλιού προς το σημείο γονιμοποίησης δεν είναι πλήρως κατανοητός. Στα θηλαστικά, το ωοθυλακικό υγρό χημειοελκυστικά σπερματοζωάρια. Ωστόσο, πιστεύεται ότι τα χημειοελκυστικά κατευθύνουν τα σπερματοζωάρια να προσεγγίσουν μεγάλες αποστάσεις7. Επομένως, άλλοι μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι για τη μεταφορά σπέρματος. Η ικανότητα του σπέρματος να προσανατολίζεται και να ρέει αντίθετα στο υγρό των σαλπίγγων που απελευθερώνεται μετά το ζευγάρωμα έχει αναφερθεί ότι αποτελεί σημαντικό παράγοντα στη στόχευση του σπέρματος σε ποντίκια. Ο Parker 17 υπέδειξε ότι τα σπερματοζωάρια διασχίζουν τους ωαγωγούς κολυμπώντας αντίθετα στο ακτινωτό ρεύμα στα πτηνά και τα ερπετά. Αν και δεν έχει αποδειχθεί πειραματικά σε πτηνά, ο Adolphi 18 ήταν ο πρώτος που διαπίστωσε ότι το σπέρμα των πτηνών δίνει θετικά αποτελέσματα όταν δημιουργείται ένα λεπτό στρώμα υγρού μεταξύ μιας καλυπτρίδας και μιας αντικειμενοφόρου πλάκας με μια λωρίδα διηθητικού χαρτιού. Ρεολογία. Οι Hino και Yanagimachi [19] τοποθέτησαν ένα σύμπλεγμα ωοθήκης-σαλπίγγων-μήτρας ποντικού σε έναν δακτύλιο έγχυσης και ενέχυσαν 1 µl μελάνης στον ισθμό για να απεικονίσουν τη ροή υγρού στις σάλπιγγες. Παρατήρησαν μια πολύ ενεργή κίνηση συστολής και χαλάρωσης στις σάλπιγγες, στην οποία όλες οι μπάλες μελάνης κινούνταν σταθερά προς την αμπούλα των σαλπίγγων. Οι συγγραφείς τονίζουν τη σημασία της ροής του υγρού των σαλπίγγων από τις κάτω προς τις άνω σάλπιγγες για την ανύψωση και τη γονιμοποίηση του σπέρματος. Ο Brillard20 ανέφερε ότι στα κοτόπουλα και τις γαλοπούλες, τα σπερματοζωάρια μεταναστεύουν με ενεργητική κίνηση από την είσοδο του κόλπου, όπου αποθηκεύονται, προς τη μητροκολπική συμβολή, όπου αποθηκεύονται. Ωστόσο, αυτή η κίνηση δεν απαιτείται μεταξύ της μητροκολπικής συμβολής και του κώνου, επειδή τα σπερματοζωάρια μεταφέρονται με παθητική μετατόπιση. Γνωρίζοντας αυτές τις προηγούμενες συστάσεις και τα αποτελέσματα που ελήφθησαν στην παρούσα μελέτη, μπορεί να υποτεθεί ότι η ικανότητα των σπερματοζωαρίων να κινούνται προς τα πάνω (ρεολογία) είναι μία από τις ιδιότητες στις οποίες βασίζεται η διαδικασία επιλογής. Αυτό καθορίζει τη διέλευση των σπερματοζωαρίων μέσω του κόλπου και την είσοδό τους στο CCT για αποθήκευση. Όπως πρότεινε ο Forman4, αυτό μπορεί επίσης να διευκολύνει τη διαδικασία εισόδου του σπέρματος στο SST και στο περιβάλλον του για ένα χρονικό διάστημα και στη συνέχεια την έξοδό του όταν η ταχύτητά του αρχίσει να επιβραδύνεται.
Από την άλλη πλευρά, οι Matsuzaki και Sasanami 21 υπέδειξαν ότι τα σπερματοζωάρια των πτηνών υφίστανται αλλαγές στην κινητικότητα από την κατάσταση λήθαργου στην κινητικότητα στις αρσενικές και θηλυκές αναπαραγωγικές οδούς. Η αναστολή της κινητικότητας του σπέρματος στο SST έχει προταθεί για να εξηγήσει τον μεγάλο χρόνο αποθήκευσης του σπέρματος και στη συνέχεια την αναζωογόνηση μετά την έξοδο από το SST. Υπό υποξικές συνθήκες, οι Matsuzaki et al. 1 ανέφεραν υψηλή παραγωγή και απελευθέρωση γαλακτικού οξέος στο SST, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε αναστολή της κινητικότητας του σπέρματος. Σε αυτήν την περίπτωση, η σημασία της ρεολογίας του σπέρματος αντικατοπτρίζεται στην επιλογή και την απορρόφηση των σπερματοζωαρίων και όχι στην αποθήκευσή τους.
Το πρότυπο συγκόλλησης σπέρματος θεωρείται μια εύλογη εξήγηση για τη μακρά περίοδο αποθήκευσης του σπέρματος στο SST, καθώς αυτό είναι ένα συνηθισμένο πρότυπο συγκράτησης σπέρματος στα πουλερικά2,22,23. Οι Bakst et al. 2 παρατήρησαν ότι τα περισσότερα σπερματοζωάρια προσκολλώνται μεταξύ τους, σχηματίζοντας συσσωματώματα, και μεμονωμένα σπερματοζωάρια σπάνια βρίσκονται στο CCM ορτυκιών. Από την άλλη πλευρά, οι Wen et al. 24 παρατήρησαν περισσότερα διάσπαρτα σπερματοζωάρια και λιγότερες συστάδες σπερματοζωαρίων στον αυλό του SST σε κοτόπουλα. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, μπορεί να υποτεθεί ότι η τάση για συγκόλληση σπέρματος διαφέρει μεταξύ των πτηνών και μεταξύ των σπερματοζωαρίων στο ίδιο εκσπερμάτισμα. Επιπλέον, οι Van Krey et al. 9 υπέδειξαν ότι η τυχαία αποσύνδεση των συγκολλημένων σπερματοζωαρίων είναι υπεύθυνη για τη σταδιακή διείσδυση των σπερματοζωαρίων στον αυλό της σάλπιγγας. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, τα σπερματοζωάρια με χαμηλότερη ικανότητα συγκόλλησης θα πρέπει να αποβάλλονται πρώτα από το SST. Σε αυτό το πλαίσιο, η ικανότητα των σπερματοζωαρίων να συγκολλούνται μπορεί να είναι ένας παράγοντας που επηρεάζει το αποτέλεσμα του ανταγωνισμού σπέρματος σε βρώμικα πτηνά. Επιπλέον, όσο περισσότερο αποσυνδέεται το συγκολλημένο σπέρμα, τόσο περισσότερο διατηρείται η γονιμότητα.
Παρόλο που η συσσωμάτωση και η συσσωμάτωση των σπερματοζωαρίων σε δέσμες έχει παρατηρηθεί σε αρκετές μελέτες2,22,24, δεν έχουν περιγραφεί λεπτομερώς λόγω της πολυπλοκότητας της κινηματικής τους παρατήρησης εντός του SST. Έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες για τη μελέτη της συγκόλλησης σπέρματος in vitro. Παρατηρήθηκε εκτεταμένη αλλά παροδική συσσωμάτωση όταν το λεπτό σύρμα αφαιρέθηκε από την κρεμαστή σταγόνα σπόρου. Αυτό οδηγεί στο γεγονός ότι μια επιμήκης φυσαλίδα προεξέχει από τη σταγόνα, μιμούμενη τον σπερματικό αδένα. Λόγω των τρισδιάστατων περιορισμών και των σύντομων χρόνων ξήρανσης με σταγόνες, ολόκληρο το μπλοκ γρήγορα ερειπώθηκε9. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας κοτόπουλα Sharkashi και μικρορευστικά τσιπ, καταφέραμε να περιγράψουμε πώς σχηματίζονται αυτές οι δέσμες και πώς κινούνται. Οι δέσμες σπέρματος σχηματίστηκαν αμέσως μετά τη συλλογή σπέρματος και βρέθηκαν να κινούνται σπειροειδώς, δείχνοντας θετική ρεολογία όταν υπάρχουν στη ροή. Επιπλέον, όταν παρατηρούνται μακροσκοπικά, έχει παρατηρηθεί ότι οι δέσμες σπέρματος αυξάνουν τη γραμμικότητα της κινητικότητας σε σύγκριση με τα μεμονωμένα σπερματοζωάρια. Αυτό υποδηλώνει ότι η συγκόλληση των σπερματοζωαρίων μπορεί να συμβεί πριν από τη διείσδυση του SST και ότι η παραγωγή σπέρματος δεν περιορίζεται σε μια μικρή περιοχή λόγω στρες, όπως έχει προταθεί προηγουμένως (Tingari και Lake12). Κατά τη διάρκεια του σχηματισμού των συστάδων, τα σπερματοζωάρια κολυμπούν συγχρονισμένα μέχρι να σχηματίσουν μια ένωση, στη συνέχεια οι ουρές τους τυλίγονται το ένα γύρω από το άλλο και η κεφαλή του σπερματοζωαρίου παραμένει ελεύθερη, αλλά η ουρά και το περιφερικό τμήμα του σπερματοζωαρίου κολλάνε μεταξύ τους με μια κολλώδη ουσία. Επομένως, η ελεύθερη κεφαλή του συνδέσμου είναι υπεύθυνη για την κίνηση, παρασύροντας τον υπόλοιπο σύνδεσμο. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης των δεσμίδων σπερματοζωαρίων έδειξε προσκολλημένες κεφαλές σπερματοζωαρίων καλυμμένες με πολύ κολλώδες υλικό, υποδηλώνοντας ότι οι κεφαλές σπερματοζωαρίων ήταν προσκολλημένες σε δεσμίδες ηρεμίας, κάτι που μπορεί να συνέβη μετά την επίτευξη του σημείου αποθήκευσης (SST).
Όταν ένα επίχρισμα σπέρματος χρωματίζεται με πορτοκαλί ακριδίνης, στο φθορίζον μικροσκόπιο μπορεί να παρατηρηθεί εξωκυτταρικό συγκολλητικό υλικό γύρω από τα σπερματοζωάρια. Αυτή η ουσία επιτρέπει στις δέσμες σπερματοζωαρίων να προσκολλώνται σε οποιεσδήποτε περιβάλλουσες επιφάνειες ή σωματίδια, έτσι ώστε να μην παρασύρονται με την περιβάλλουσα ροή. Έτσι, οι παρατηρήσεις μας δείχνουν τον ρόλο της προσκόλλησης των σπερματοζωαρίων με τη μορφή κινητών δεσμίδων. Η ικανότητά τους να κολυμπούν κόντρα στο ρεύμα και να προσκολλώνται σε κοντινές επιφάνειες επιτρέπει στο σπέρμα να παραμένει περισσότερο στο SST.
Ο Rothschild25 χρησιμοποίησε μια κάμερα αιμοκυτταρομετρίας για να μελετήσει την επιπλέουσα κατανομή του σπέρματος βοοειδών σε μια σταγόνα εναιωρήματος, λαμβάνοντας φωτομικρογραφίες μέσω μιας κάμερας με κατακόρυφο και οριζόντιο οπτικό άξονα του μικροσκοπίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα σπερματοζωάρια έλκονταν από την επιφάνεια του θαλάμου. Οι συγγραφείς υποδηλώνουν ότι μπορεί να υπάρχουν υδροδυναμικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του σπέρματος και της επιφάνειας. Λαμβάνοντας αυτό υπόψη, σε συνδυασμό με την ικανότητα του σπέρματος των νεοσσών Sharkashi να σχηματίζει κολλώδεις τούφες, μπορεί να αυξηθεί η πιθανότητα το σπέρμα να προσκολληθεί στο τοίχωμα SST και να αποθηκευτεί για μεγάλα χρονικά διαστήματα.
Οι Bccetti και Afzeliu26 ανέφεραν ότι ο γλυκοκάλυκας του σπέρματος είναι απαραίτητος για την αναγνώριση και συγκόλληση γαμετών. Ο Forman10 παρατήρησε ότι η υδρόλυση των α-γλυκοσιδικών δεσμών στις επικαλύψεις γλυκοπρωτεΐνης-γλυκολιπιδίων με την επεξεργασία του σπέρματος των πτηνών με νευραμινιδάση είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη γονιμότητα χωρίς να επηρεάζει την κινητικότητα του σπέρματος. Οι συγγραφείς υποστηρίζουν ότι η επίδραση της νευραμινιδάσης στον γλυκοκάλυκα επηρεάζει αρνητικά την απομόνωση του σπέρματος στη μητρο-κολπική συμβολή, μειώνοντας έτσι τη γονιμότητα. Οι παρατηρήσεις τους δεν μπορούν να αγνοήσουν την πιθανότητα ότι η θεραπεία με νευραμινιδάση μπορεί να μειώσει την αναγνώριση σπερματοζωαρίων και ωαρίων. Οι Forman και Engel10 διαπίστωσαν ότι η γονιμότητα μειώθηκε όταν οι κότες γονιμοποιήθηκαν ενδοκολπικά με σπέρμα που είχε υποστεί αγωγή με νευραμινιδάση. Ωστόσο, η εξωσωματική γονιμοποίηση με σπέρμα που είχε υποστεί αγωγή με νευραμινιδάση δεν επηρέασε τη γονιμότητα σε σύγκριση με τα κοτόπουλα ελέγχου. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι αλλαγές στην επικάλυψη γλυκοπρωτεΐνης-γλυκολιπιδίου γύρω από τη μεμβράνη του σπέρματος μείωσαν την ικανότητα του σπέρματος να γονιμοποιηθεί, επηρεάζοντας την απομόνωση του σπέρματος στη μητρο-κολπική συμβολή, η οποία με τη σειρά της αύξησε την απώλεια σπέρματος λόγω της ταχύτητας της μητρο-κολπικής συμβολής, αλλά δεν επηρέασε την αναγνώριση του σπέρματος και του ωαρίου.
Στις γαλοπούλες, οι Bakst και Bauchan 11 βρήκαν μικρά κυστίδια και θραύσματα μεμβράνης στον αυλό του SST και παρατήρησαν ότι ορισμένα από αυτά τα κοκκία είχαν συγχωνευθεί με τη μεμβράνη του σπέρματος. Οι συγγραφείς υποστηρίζουν ότι αυτές οι σχέσεις μπορεί να συμβάλλουν στη μακροχρόνια αποθήκευση των σπερματοζωαρίων στο SST. Ωστόσο, οι ερευνητές δεν διευκρίνισαν την πηγή αυτών των σωματιδίων, είτε εκκρίνονται από τα επιθηλιακά κύτταρα CCT, είτε παράγονται και εκκρίνονται από το αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα είτε παράγονται από το ίδιο το σπέρμα. Επίσης, αυτά τα σωματίδια είναι υπεύθυνα για τη συγκόλληση. Οι Grützner et al27 ανέφεραν ότι τα επιθηλιακά κύτταρα της επιδιδυμίδας παράγουν και εκκρίνουν μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη που απαιτείται για τον σχηματισμό σπερματικών οδών με έναν πόρο. Οι συγγραφείς αναφέρουν επίσης ότι η διασπορά αυτών των δεσμίδων εξαρτάται από την αλληλεπίδραση των επιδιδυμικών πρωτεϊνών. Οι Nixon et al28 διαπίστωσαν ότι τα εξαρτήματα εκκρίνουν μια πρωτεΐνη, την όξινη πλούσια σε κυστεΐνη οστεονεκτίνη. Η SPARC εμπλέκεται στο σχηματισμό συστάδων σπέρματος σε έχιδνες και πλατύποδες με κοντό ράμφος. Η σκέδαση αυτών των δεσμών σχετίζεται με την απώλεια αυτής της πρωτεΐνης.
Στην παρούσα μελέτη, η υπερδομική ανάλυση με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έδειξε ότι τα σπερματοζωάρια προσκολλήθηκαν σε μεγάλη ποσότητα πυκνού υλικού. Αυτές οι ουσίες πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνες για τη συγκόλληση που συμπυκνώνεται μεταξύ και γύρω από τις προσκολλημένες κεφαλές, αλλά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις στην περιοχή της ουράς. Υποθέτουμε ότι αυτή η συγκολλητική ουσία απεκκρίνεται από το αρσενικό αναπαραγωγικό σύστημα (επιδιδυμίδα ή σπερματικό πόρο) μαζί με το σπέρμα, καθώς συχνά παρατηρούμε σπέρμα να διαχωρίζεται από τη λέμφο και το σπερματικό πλάσμα κατά την εκσπερμάτιση. Έχει αναφερθεί ότι καθώς τα σπερματοζωάρια των πτηνών διέρχονται από την επιδιδυμίδα και τον σπερματικό πόρο, υφίστανται αλλαγές που σχετίζονται με την ωρίμανση, οι οποίες υποστηρίζουν την ικανότητά τους να συνδέονται με πρωτεΐνες και να αποκτούν γλυκοπρωτεΐνες που σχετίζονται με το λήμμα του πλάσματος. Η παραμονή αυτών των πρωτεϊνών στις μεμβράνες του σπέρματος που βρίσκονται στο SST υποδηλώνει ότι αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να επηρεάσουν την απόκτηση σταθερότητας της μεμβράνης του σπέρματος 30 και να καθορίσουν τη γονιμότητά τους 31. Οι Ahammad et al32 ανέφεραν ότι τα σπερματοζωάρια που ελήφθησαν από διάφορα μέρη του αρσενικού αναπαραγωγικού συστήματος (από τους όρχεις έως τον περιφερικό σπερματικό πόρο) έδειξαν προοδευτική αύξηση της βιωσιμότητας υπό συνθήκες αποθήκευσης σε υγρά, ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία αποθήκευσης, και η βιωσιμότητα στα κοτόπουλα αυξάνεται επίσης στις σάλπιγγες μετά από τεχνητή γονιμοποίηση.
Οι τούφες σπέρματος των κοτόπουλων Sharkashi έχουν διαφορετικά χαρακτηριστικά και λειτουργίες από άλλα είδη, όπως οι έχιδνες, οι πλατύποδες, τα δασόποντα, οι αρουραίοι ελαφιών και τα ινδικά χοιρίδια. Στα κοτόπουλα sharkasi, ο σχηματισμός δεσμίδων σπερματοζωαρίων μείωσε την ταχύτητα κολύμβησής τους σε σύγκριση με τα μεμονωμένα σπερματοζωάρια. Ωστόσο, αυτές οι δέσμες αύξησαν το ποσοστό των ρεολογικά θετικών σπερματοζωαρίων και αύξησαν την ικανότητα των σπερματοζωαρίων να σταθεροποιούνται σε ένα δυναμικό περιβάλλον. Έτσι, τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν την προηγούμενη πρόταση ότι η συγκόλληση σπέρματος στο SST σχετίζεται με τη μακροχρόνια αποθήκευση σπέρματος. Υποθέτουμε επίσης ότι η τάση των σπερματοζωαρίων να σχηματίζουν τούφες μπορεί να ελέγχει τον ρυθμό απώλειας σπέρματος στο SST, γεγονός που μπορεί να μεταβάλει το αποτέλεσμα του ανταγωνισμού σπέρματος. Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, τα σπερματοζωάρια με χαμηλή ικανότητα συγκόλλησης απελευθερώνουν πρώτα το SST, ενώ τα σπερματοζωάρια με υψηλή ικανότητα συγκόλλησης παράγουν το μεγαλύτερο μέρος των απογόνων. Ο σχηματισμός δεσμίδων σπέρματος με έναν μόνο πόρο είναι ευεργετικός και επηρεάζει την αναλογία γονέα-παιδιού, αλλά χρησιμοποιεί διαφορετικό μηχανισμό. Στις έχιδνες και τους πλατύπους, τα σπερματοζωάρια είναι διατεταγμένα παράλληλα μεταξύ τους για να αυξήσουν την ταχύτητα κίνησης της δέσμης. Οι δέσμες έχιδνων κινούνται περίπου τρεις φορές πιο γρήγορα από τα μεμονωμένα σπερματοζωάρια. Πιστεύεται ότι ο σχηματισμός τέτοιων συστάδων σπερματοζωαρίων στις έχιδνες είναι μια εξελικτική προσαρμογή για τη διατήρηση της κυριαρχίας, καθώς τα θηλυκά είναι αχαλίνωτα και συνήθως ζευγαρώνουν με πολλά αρσενικά. Επομένως, τα σπερματοζωάρια από διαφορετικά εκσπερματώματα ανταγωνίζονται σκληρά για τη γονιμοποίηση του ωαρίου.
Τα συγκολλημένα σπερματοζωάρια των κοτόπουλων sharkasi είναι εύκολο να απεικονιστούν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, η οποία θεωρείται πλεονεκτική επειδή επιτρέπει την εύκολη μελέτη της συμπεριφοράς των σπερματοζωαρίων in vitro. Ο μηχανισμός με τον οποίο ο σχηματισμός συστάδων σπερματοζωαρίων προάγει την αναπαραγωγή στις κοτόπουλες sharkasi είναι επίσης διαφορετικός από αυτόν που παρατηρείται σε ορισμένα πλακουντιακά θηλαστικά που αντιπροσωπεύουν συνεργατική συμπεριφορά σπερματοζωαρίων, όπως τα δασικά ποντίκια, όπου ορισμένα σπερματοζωάρια φτάνουν στα αυγά, βοηθώντας άλλα συγγενικά άτομα να φτάσουν και να καταστρέψουν τα αυγά τους. να αποδείξετε τον εαυτό σας. αλτρουιστική συμπεριφορά. Αυτογονιμοποίηση 34. Ένα άλλο παράδειγμα συνεργατικής συμπεριφοράς στα σπερματοζωάρια βρέθηκε σε ποντίκια ελαφιών, όπου τα σπερματοζωάρια ήταν σε θέση να αναγνωρίσουν και να συνδυαστούν με τα πιο γενετικά συγγενικά σπερματοζωάρια και να σχηματίσουν συνεργατικές ομάδες για να αυξήσουν την ταχύτητά τους σε σύγκριση με τα μη σχετιζόμενα σπερματοζωάρια35.
Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη δεν έρχονται σε αντίθεση με τη θεωρία του Foman για τη μακροχρόνια αποθήκευση σπερματοζωαρίων στο SWS. Οι ερευνητές αναφέρουν ότι τα σπερματοζωάρια συνεχίζουν να κινούνται στη ροή των επιθηλιακών κυττάρων που καλύπτουν το SST για μεγάλο χρονικό διάστημα και, μετά από ένα ορισμένο χρονικό διάστημα, τα αποθέματα ενέργειας των σπερματοζωαρίων εξαντλούνται, με αποτέλεσμα τη μείωση της ταχύτητας, η οποία επιτρέπει την αποβολή ουσιών μικρού μοριακού βάρους. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ότι τα μισά από τα μεμονωμένα σπερματοζωάρια έδειξαν την ικανότητα να κολυμπούν ενάντια στα ρέοντα υγρά και η προσκόλλησή τους στη δέσμη αύξησε την ικανότητά τους να εμφανίζουν θετική ρεολογία. Επιπλέον, τα δεδομένα μας συμφωνούν με αυτά των Matsuzaki et al. 1, οι οποίοι ανέφεραν ότι η αυξημένη έκκριση γαλακτικού οξέος στο SST μπορεί να αναστείλει την κινητικότητα του σπέρματος. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας περιγράφουν τον σχηματισμό κινητικών συνδέσμων των σπερματοζωαρίων και τη ρεολογική τους συμπεριφορά παρουσία ενός δυναμικού περιβάλλοντος μέσα σε ένα μικροκανάλι, σε μια προσπάθεια να διευκρινιστεί η συμπεριφορά τους στο SST. Η μελλοντική έρευνα μπορεί να επικεντρωθεί στον προσδιορισμό της χημικής σύνθεσης και της προέλευσης του παράγοντα συγκόλλησης, κάτι που αναμφίβολα θα βοηθήσει τους ερευνητές να αναπτύξουν νέους τρόπους αποθήκευσης υγρού σπέρματος και αύξησης της διάρκειας της γονιμότητας.
Δεκαπέντε αρσενικά sharkasi ηλικίας 30 εβδομάδων με γυμνό λαιμό (ομόζυγα κυρίαρχα· Na Na) επιλέχθηκαν ως δότες σπέρματος στη μελέτη. Τα πτηνά εκτράφηκαν στο Ερευνητικό Πτηνοτροφείο της Σχολής Γεωργίας του Πανεπιστημίου Ashit, στο Κυβερνείο Ashit, στην Αίγυπτο. Τα πτηνά στεγάστηκαν σε ατομικά κλουβιά (30 x 40 x 40 cm), υποβλήθηκαν σε πρόγραμμα φωτισμού (16 ώρες φωτός και 8 ώρες σκότους) και τράφηκαν με μια διατροφή που περιείχε 160 g ακατέργαστης πρωτεΐνης, 2800 kcal μεταβολίσιμης ενέργειας, 35 g ασβεστίου το καθένα. 5 γραμμάρια διαθέσιμου φωσφόρου ανά κιλό διατροφής.
Σύμφωνα με τα δεδομένα 36, 37, συλλέχθηκε σπέρμα από άνδρες με κοιλιακό μασάζ. Συνολικά συλλέχθηκαν 45 δείγματα σπέρματος από 15 άνδρες σε διάστημα 3 ημερών. Το σπέρμα (n = 15/ημέρα) αραιώθηκε αμέσως 1:1 (v:v) με αραιωτικό σπέρματος Belsville Poultry, το οποίο περιέχει διφωσφορικό κάλιο (1,27 g), μονοένυδρο γλουταμινικό μονονάτριο (0,867 g), φρουκτόζη (0,5 d), άνυδρο οξικό νάτριο (0,43 g), τρις(υδροξυμεθυλ)αμινομεθάνιο (0,195 g), μονοένυδρο κιτρικό κάλιο (0,064 g), μονοφωσφορικό κάλιο (0,065 g), χλωριούχο μαγνήσιο (0,034 g) και H2O (100 ml), pH = 7,5, οσμωτικότητα 333 mOsm/kg38. Τα αραιωμένα δείγματα σπέρματος εξετάστηκαν αρχικά με οπτικό μικροσκόπιο για να διασφαλιστεί η καλή ποιότητα του σπέρματος (υγρασία) και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε υδατόλουτρο στους 37°C μέχρι να χρησιμοποιηθούν εντός μισής ώρας από τη συλλογή.
Η κινηματική και η ρεολογία των σπερματοζωαρίων περιγράφονται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μικρορευστομηχανικών συσκευών. Δείγματα σπέρματος αραιώθηκαν περαιτέρω σε αναλογία 1:40 σε αραιωτικό σπέρματος πτηνών Beltsville, φορτώθηκαν σε μια μικρορευστομηχανική συσκευή (βλ. παρακάτω) και οι κινητικές παράμετροι προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Υπολογιστικής Ανάλυσης Σπέρματος (CASA) που αναπτύχθηκε προηγουμένως για τον χαρακτηρισμό μικρορευστομηχανικών. Το πρόσθετο μπορεί να ληφθεί από τη διεύθυνση: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Μετρήθηκαν η ταχύτητα καμπύλης (VCL, μm/s), η γραμμική ταχύτητα (VSL, μm/s) και η μέση ταχύτητα τροχιάς (VAP, μm/s). Τα βίντεο των σπερματοζωαρίων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης Optika XDS-3 (με αντικειμενικό φακό 40x) συνδεδεμένο με μια κάμερα Tucson ISH1000 στα 30 fps για 3 δευτερόλεπτα. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό CASA για να μελετήσετε τουλάχιστον τρεις περιοχές και 500 τροχιές σπερματοζωαρίων ανά δείγμα. Το βίντεο που καταγράφηκε υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα αυτοσχέδιο CASA. Ο ορισμός της κινητικότητας στο πρόσθετο CASA βασίζεται στην ταχύτητα κολύμβησης του σπέρματος σε σύγκριση με τον ρυθμό ροής και δεν περιλαμβάνει άλλες παραμέτρους όπως η κίνηση από πλευρά σε πλευρά, καθώς αυτή έχει βρεθεί ότι είναι πιο αξιόπιστη στη ροή υγρών. Η ρεολογική κίνηση περιγράφεται ως η κίνηση των σπερματοζωαρίων αντίθετα προς την κατεύθυνση της ροής υγρών. Τα σπερματοζωάρια με ρεολογικές ιδιότητες διαιρέθηκαν με τον αριθμό των κινητών σπερματοζωαρίων. Τα σπερματοζωάρια που ήταν σε ηρεμία και τα σπερματοζωάρια που κινούνταν με συναγωγή εξαιρέθηκαν από την καταμέτρηση.
Όλες οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από την Elgomhoria Pharmaceuticals (Κάιρο, Αίγυπτος), εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. Η συσκευή κατασκευάστηκε όπως περιγράφεται από τους El-sherry et al. 40 με ορισμένες τροποποιήσεις. Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή των μικροκαναλιών περιελάμβαναν γυάλινες πλάκες (Howard Glass, Worcester, MA), αρνητικό ανθεκτικό SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), διακετονική αλκοόλη (Sigma Aldrich, Steinheim, Γερμανία) και πολυακετόνη. -184, Dow Corning, Midland, Michigan). Οι μικροκάναλοι κατασκευάζονται με μαλακή λιθογραφία. Αρχικά, μια διαφανής προστατευτική μάσκα προσώπου με το επιθυμητό σχέδιο μικροκαναλιού εκτυπώθηκε σε εκτυπωτή υψηλής ανάλυσης (Prismatic, Κάιρο, Αίγυπτος και Pacific Arts and Design, Markham, ON). Τα πρωτότυπα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας γυάλινες πλάκες ως υποστρώματα. Οι πλάκες καθαρίστηκαν σε ακετόνη, ισοπροπανόλη και απιονισμένο νερό και στη συνέχεια επικαλύφθηκαν με ένα στρώμα 20 µm SU8-25 με επίστρωση περιστροφής (3000 rpm, 1 λεπτό). Στη συνέχεια, τα στρώματα SU-8 ξηράνθηκαν ήπια (65°C, 2 λεπτά και 95°C, 10 λεπτά) και εκτέθηκαν σε υπεριώδη ακτινοβολία για 50 δευτερόλεπτα. Ακολούθησε ψήσιμο μετά την έκθεση στους 65°C και 95°C για 1 λεπτό και 4 λεπτά για τη διασταυρούμενη σύνδεση των εκτεθειμένων στρωμάτων SU-8, ακολουθούμενο από ανάπτυξη σε διακετονική αλκοόλη για 6,5 λεπτά. Ψήστε τις βάφλες σε δυνατή φωτιά (200°C για 15 λεπτά) για περαιτέρω στερεοποίηση του στρώματος SU-8.
Το PDMS παρασκευάστηκε με ανάμειξη του μονομερούς και του σκληρυντικού σε αναλογία βάρους 10:1, στη συνέχεια απαερώθηκε σε ξηραντήρα κενού και χύθηκε στο κύριο πλαίσιο του SU-8. Το PDMS σκληρύνθηκε σε φούρνο (120°C, 30 λεπτά), στη συνέχεια τα κανάλια κόπηκαν, διαχωρίστηκαν από το κύριο και τρυπήθηκαν για να επιτραπεί η σύνδεση των σωλήνων στην είσοδο και την έξοδο του μικροκαναλιού. Τέλος, τα μικροκανάλια PDMS συνδέθηκαν μόνιμα σε αντικειμενοφόρες πλάκες μικροσκοπίου χρησιμοποιώντας έναν φορητό επεξεργαστή κορώνας (Electro-Technic Products, Chicago, IL) όπως περιγράφεται αλλού. Το μικροκανάλι που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη έχει διαστάσεις 200 µm × 20 µm (Π × Υ) και έχει μήκος 3,6 cm.
Η ροή ρευστού που προκαλείται από την υδροστατική πίεση μέσα στο μικροκανάλι επιτυγχάνεται διατηρώντας τη στάθμη του ρευστού στη δεξαμενή εισόδου πάνω από τη διαφορά ύψους Δh39 στη δεξαμενή εξόδου (Εικ. 1).
όπου f είναι ο συντελεστής τριβής, που ορίζεται ως f = C/Re για στρωτή ροή σε ορθογώνιο κανάλι, όπου C είναι μια σταθερά που εξαρτάται από την αναλογία διαστάσεων του καναλιού, L είναι το μήκος του μικροκαναλιού, Vav είναι η μέση ταχύτητα μέσα στο μικροκανάλι, Dh είναι η υδραυλική διάμετρος του καναλιού, g – επιτάχυνση της βαρύτητας. Χρησιμοποιώντας αυτήν την εξίσωση, η μέση ταχύτητα του καναλιού μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: