Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια πλατφόρμα αντιμικροβιακών χωρίς χημικά, βασισμένη στη νανοτεχνολογία που χρησιμοποιεί τεχνητές νανοδομές νερού (EWNS). Τα EWNS έχουν υψηλό επιφανειακό φορτίο και είναι πλούσια σε δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που μπορούν να αλληλεπιδράσουν με και να απενεργοποιήσουν έναν αριθμό μικροοργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των τροφιμογενών παθογόνων. Εδώ αποδεικνύεται ότι οι ιδιότητές τους κατά τη σύνθεση μπορούν να βελτιωθούν και να βελτιστοποιηθούν για την περαιτέρω ενίσχυση του αντιβακτηριακού τους δυναμικού. Η εργαστηριακή πλατφόρμα EWNS σχεδιάστηκε για να βελτιώνει τις ιδιότητες των EWNS αλλάζοντας τις παραμέτρους σύνθεσης. Ο χαρακτηρισμός των ιδιοτήτων των EWNS (φορτίο, μέγεθος και περιεκτικότητα σε ROS) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας σύγχρονες αναλυτικές μεθόδους. Επιπλέον, μικροοργανισμοί τροφίμων όπως Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum και Saccharomyces cerevisiae εμβολιάστηκαν στην επιφάνεια βιολογικών ντοματών για να αξιολογηθεί το δυναμικό μικροβιακής απενεργοποίησης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ καταδεικνύουν ότι οι ιδιότητες των EWNS μπορούν να βελτιωθούν κατά τη σύνθεση, με αποτέλεσμα μια εκθετική αύξηση της αποτελεσματικότητας απενεργοποίησης. Συγκεκριμένα, το επιφανειακό φορτίο αυξήθηκε κατά ένα συντελεστή τεσσάρων, και η περιεκτικότητα σε ROS αυξήθηκε. Ο ρυθμός απομάκρυνσης μικροβίων ήταν μικροβιακά εξαρτώμενος και κυμαινόταν από 1,0 έως 3,8 log μετά από 45 λεπτά έκθεσης σε δόση αερολύματος 40.000 #/cm3 EWNS.
Η μικροβιακή μόλυνση είναι η κύρια αιτία των τροφιμογενών ασθενειών που προκαλούνται από την κατάποση παθογόνων ή των τοξινών τους. Οι τροφιμογενείς ασθένειες ευθύνονται για περίπου 76 εκατομμύρια ασθένειες, 325.000 νοσηλείες και 5.000 θανάτους κάθε χρόνο μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες1. Επιπλέον, το Υπουργείο Γεωργίας των Ηνωμένων Πολιτειών (USDA) εκτιμά ότι η αυξημένη κατανάλωση φρέσκων προϊόντων ευθύνεται για το 48% όλων των τροφιμογενών ασθενειών που αναφέρονται στις Ηνωμένες Πολιτείες2. Το κόστος των ασθενειών και των θανάτων από τροφιμογενείς παθογόνους παράγοντες στις Ηνωμένες Πολιτείες είναι πολύ υψηλό, με εκτιμήσεις από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) σε περισσότερα από 15,6 δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ ετησίως3.
Επί του παρόντος, οι χημικές4, ακτινοβολίες5 και θερμικές6 αντιμικροβιακές παρεμβάσεις για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων εφαρμόζονται κυρίως σε περιορισμένα κρίσιμα σημεία ελέγχου (CCP) στην αλυσίδα παραγωγής (συνήθως μετά τη συγκομιδή ή/και κατά τη συσκευασία) αντί να εφαρμόζονται συνεχώς με τέτοιο τρόπο ώστε τα φρέσκα προϊόντα να υπόκεινται σε διασταυρούμενη μόλυνση7. Οι αντιμικροβιακές παρεμβάσεις είναι απαραίτητες για τον καλύτερο έλεγχο των τροφιμογενών ασθενειών και της αλλοίωσης των τροφίμων και έχουν τη δυνατότητα να εφαρμοστούν σε ολόκληρο το φάσμα από το αγρόκτημα στο τραπέζι. Λιγότερος αντίκτυπος και κόστος.
Μια αντιμικροβιακή πλατφόρμα χωρίς χημικά, βασισμένη στη νανοτεχνολογία, αναπτύχθηκε πρόσφατα για την απενεργοποίηση βακτηρίων σε επιφάνειες και στον αέρα χρησιμοποιώντας τεχνητές νανοδομές νερού (EWNS). Για τη σύνθεση των EVNS, χρησιμοποιήθηκαν δύο παράλληλες διαδικασίες: ηλεκτροψεκασμός και ιονισμός νερού (Εικ. 1α). Έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι τα EWNS διαθέτουν ένα μοναδικό σύνολο φυσικών και βιολογικών ιδιοτήτων8,9,10. Τα EWNS έχουν κατά μέσο όρο 10 ηλεκτρόνια ανά δομή και μέσο μέγεθος νανομέτρου 25 nm (Εικ. 1β,γ)8,9,10. Επιπλέον, ο συντονισμός σπιν ηλεκτρονίων (ESR) έδειξε ότι τα EWNS περιέχουν μεγάλη ποσότητα δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), κυρίως ρίζες υδροξυλίου (OH•) και υπεροξειδίου (O2-) (Εικ. 1γ)8. Τα EWNS παρέμειναν στον αέρα για μεγάλο χρονικό διάστημα και μπορούσαν να συγκρουστούν με μικρόβια που αιωρούνται στον αέρα και υπάρχουν σε επιφάνειες, απελευθερώνοντας το ωφέλιμο φορτίο ROS τους και προκαλώντας μικροβιακή απενεργοποίηση (Εικ. 1δ). Αυτές οι προηγούμενες μελέτες έδειξαν επίσης ότι το EWNS μπορεί να αλληλεπιδράσει και να απενεργοποιήσει διάφορα αρνητικά κατά Gram και θετικά κατά Gram βακτήρια που έχουν σημασία για τη δημόσια υγεία, συμπεριλαμβανομένων των μυκοβακτηρίων, σε επιφάνειες και στον αέρα8,9. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης έδειξε ότι η απενεργοποίηση προκλήθηκε από διαταραχή της κυτταρικής μεμβράνης. Επιπλέον, μελέτες οξείας εισπνοής έχουν δείξει ότι οι υψηλές δόσεις EWNS δεν προκαλούν βλάβη στους πνεύμονες ή φλεγμονή8.
(α) Ο ηλεκτροψεκασμός συμβαίνει όταν εφαρμόζεται υψηλή τάση μεταξύ ενός τριχοειδούς που περιέχει υγρό και ενός αντίθετου ηλεκτροδίου. (β) Η εφαρμογή υψηλής τάσης έχει ως αποτέλεσμα δύο διαφορετικά φαινόμενα: (i) ηλεκτροψεκασμό νερού και (ii) παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ιόντων) παγιδευμένων στο EWNS. (γ) Η μοναδική δομή του EWNS. (δ) Τα EWNS είναι ιδιαίτερα κινητά λόγω της νανοκλίμακας φύσης τους και μπορούν να αλληλεπιδράσουν με αερομεταφερόμενα παθογόνα.
Η ικανότητα της αντιμικροβιακής πλατφόρμας EWNS να απενεργοποιεί τους τροφιμογενείς μικροοργανισμούς στην επιφάνεια των φρέσκων τροφίμων έχει επίσης αποδειχθεί πρόσφατα. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το επιφανειακό φορτίο EWNS μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με ένα ηλεκτρικό πεδίο για στοχευμένη χορήγηση. Το πιο σημαντικό είναι ότι παρατηρήθηκε ένα πολλά υποσχόμενο αρχικό αποτέλεσμα μείωσης περίπου 1,4 log στη δραστικότητα της οργανικής ντομάτας έναντι διαφόρων μικροοργανισμών τροφίμων όπως το E. coli και η Listeria εντός 90 λεπτών από την έκθεση στο EWNS σε συγκέντρωση περίπου 50.000#/cm311. Επιπλέον, οι προκαταρκτικές οργανοληπτικές δοκιμές αξιολόγησης δεν έδειξαν οργανοληπτική επίδραση σε σύγκριση με την ντομάτα ελέγχου. Αν και αυτά τα αρχικά αποτελέσματα απενεργοποίησης υπόσχονται ασφάλεια τροφίμων ακόμη και σε πολύ χαμηλές δόσεις EWNS των 50.000#/cc, είναι σαφές ότι ένα υψηλότερο δυναμικό απενεργοποίησης θα ήταν πιο ωφέλιμο για την περαιτέρω μείωση του κινδύνου μόλυνσης και αλλοίωσης.
Εδώ, θα εστιάσουμε την έρευνά μας στην ανάπτυξη μιας πλατφόρμας δημιουργίας EWNS για την τελειοποίηση των παραμέτρων σύνθεσης και τη βελτιστοποίηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των EWNS, με στόχο την ενίσχυση του αντιβακτηριακού τους δυναμικού. Συγκεκριμένα, η βελτιστοποίηση έχει επικεντρωθεί στην αύξηση του επιφανειακού τους φορτίου (για βελτίωση της στοχευμένης χορήγησης) και της περιεκτικότητας σε ROS (για βελτίωση της αποτελεσματικότητας απενεργοποίησης). Χαρακτηρισμός βελτιστοποιημένων φυσικοχημικών ιδιοτήτων (μέγεθος, φορτίο και περιεκτικότητα σε ROS) χρησιμοποιώντας σύγχρονες αναλυτικές μεθόδους και κοινούς μικροοργανισμούς τροφίμων όπως E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae και M. parafortuitum.
Το EVNS συντέθηκε με ταυτόχρονο ηλεκτροψεκασμό και ιονισμό νερού υψηλής καθαρότητας (18 MΩ cm–1). Ο ηλεκτρικός ψεκαστήρας 12 χρησιμοποιείται συνήθως για τον ψεκασμό υγρών και συνθετικών πολυμερών και κεραμικών σωματιδίων 13 και ινών 14 ελεγχόμενου μεγέθους.
Όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε προηγούμενες δημοσιεύσεις 8, 9, 10, 11, σε ένα τυπικό πείραμα, εφαρμόζεται υψηλή τάση μεταξύ ενός μεταλλικού τριχοειδούς και ενός γειωμένου αντίθετου ηλεκτροδίου. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, συμβαίνουν δύο διαφορετικά φαινόμενα: 1) ηλεκτροψεκασμός και 2) ιονισμός του νερού. Ένα ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων προκαλεί τη συσσώρευση αρνητικών φορτίων στην επιφάνεια του συμπυκνωμένου νερού, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό κώνων Taylor. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζονται σταγονίδια νερού με υψηλό φορτίο, τα οποία συνεχίζουν να διασπώνται σε μικρότερα σωματίδια, σύμφωνα με τη θεωρία Rayleigh16. Ταυτόχρονα, ένα ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο προκαλεί τη διάσπαση και την απογύμνωση ηλεκτρονίων από ορισμένα από τα μόρια του νερού (ιονισμός), παράγοντας έτσι μια μεγάλη ποσότητα δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS)17. Τα ταυτόχρονα δημιουργημένα πακέτα ROS18 ενθυλακώθηκαν σε EWNS (Εικ. 1c).
Στο σχήμα 2α φαίνεται το σύστημα παραγωγής EWNS που αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε στη σύνθεση EWNS σε αυτή τη μελέτη. Καθαρισμένο νερό αποθηκευμένο σε κλειστή φιάλη τροφοδοτήθηκε μέσω ενός σωλήνα Teflon (εσωτερικής διαμέτρου 2 mm) σε μια βελόνα από ανοξείδωτο χάλυβα 30G (μεταλλικό τριχοειδές). Όπως φαίνεται στο σχήμα 2β, η ροή του νερού ελέγχεται από την πίεση του αέρα μέσα στη φιάλη. Η βελόνα είναι προσαρτημένη σε μια κονσόλα Teflon που μπορεί να ρυθμιστεί χειροκίνητα σε μια ορισμένη απόσταση από το αντίθετο ηλεκτρόδιο. Το αντίθετο ηλεκτρόδιο είναι ένας δίσκος από γυαλισμένο αλουμίνιο με μια οπή στη μέση για δειγματοληψία. Κάτω από το αντίθετο ηλεκτρόδιο υπάρχει μια χοάνη δειγματοληψίας αλουμινίου, η οποία συνδέεται με την υπόλοιπη πειραματική διάταξη μέσω μιας θύρας δειγματοληψίας (Εικ. 2β). Όλα τα εξαρτήματα του δειγματολήπτη είναι ηλεκτρικά γειωμένα για να αποφευχθεί η συσσώρευση φορτίου που θα μπορούσε να υποβαθμίσει τη δειγματοληψία σωματιδίων.
(α) Σύστημα Παραγωγής Νανοδομών Τεχνολογικού Νερού (EWNS). (β) Διατομή δειγματολήπτη και μονάδας ηλεκτροψεκασμού που δείχνει τις πιο σημαντικές παραμέτρους. (γ) Πειραματική διάταξη για την απενεργοποίηση βακτηρίων.
Το σύστημα παραγωγής EWNS που περιγράφεται παραπάνω είναι ικανό να αλλάζει βασικές λειτουργικές παραμέτρους για να διευκολύνει τη λεπτή ρύθμιση των ιδιοτήτων του EWNS. Ρυθμίστε την εφαρμοζόμενη τάση (V), την απόσταση μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου (L) και τη ροή του νερού (φ) μέσω του τριχοειδούς για να λεπτορυθμίσετε τα χαρακτηριστικά του EWNS. Τα σύμβολα [V (kV), L (cm)] χρησιμοποιούνται για να δηλώσουν διαφορετικούς συνδυασμούς. Ρυθμίστε τη ροή του νερού για να λάβετε έναν σταθερό κώνο Taylor ενός συγκεκριμένου συνόλου [V, L]. Για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης, το άνοιγμα του αντίθετου ηλεκτροδίου (D) ορίστηκε σε 0,5 ίντσες (1,29 cm).
Λόγω της περιορισμένης γεωμετρίας και ασυμμετρίας, η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου δεν μπορεί να υπολογιστεί από τις πρώτες αρχές. Αντ' αυτού, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό QuickField™ (Svendborg, Δανία)19 για τον υπολογισμό του ηλεκτρικού πεδίου. Το ηλεκτρικό πεδίο δεν είναι ομοιόμορφο, επομένως η τιμή του ηλεκτρικού πεδίου στην άκρη του τριχοειδούς χρησιμοποιήθηκε ως τιμή αναφοράς για διάφορες διαμορφώσεις.
Κατά τη διάρκεια της μελέτης, αξιολογήθηκαν διάφοροι συνδυασμοί τάσης και απόστασης μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου όσον αφορά τον σχηματισμό κώνου Taylor, τη σταθερότητα του κώνου Taylor, τη σταθερότητα παραγωγής EWNS και την αναπαραγωγιμότητα. Διάφοροι συνδυασμοί παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.
Η έξοδος του συστήματος παραγωγής EWNS συνδέθηκε απευθείας με έναν μετρητή σωματιδίων σάρωσης κινητικότητας (SMPS, μοντέλο 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) για τη μέτρηση της συγκέντρωσης αριθμού σωματιδίων και χρησιμοποιήθηκε με ένα ηλεκτρόμετρο αερολύματος Faraday (TSI, μοντέλο 3068B, Shoreview, ΗΠΑ). MN) για τη μέτρηση των ροών αερολυμάτων, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη δημοσίευσή μας9. Τόσο το SMPS όσο και το ηλεκτρόμετρο αερολύματος ελήφθησαν δείγματα με ρυθμό ροής 0,5 L/min (συνολική ροή δείγματος 1 L/min). Οι συγκεντρώσεις σωματιδίων και οι ροές αερολυμάτων μετρήθηκαν για 120 s. Επαναλάβετε τη μέτρηση 30 φορές. Το συνολικό φορτίο αερολύματος υπολογίζεται από τις τρέχουσες μετρήσεις και το μέσο φορτίο EWNS εκτιμάται από τον συνολικό αριθμό σωματιδίων EWNS που ελήφθησαν δείγματα. Το μέσο κόστος του EWNS μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την Εξίσωση (1):
όπου IEl είναι το μετρούμενο ρεύμα, NSMPS είναι η αριθμητική συγκέντρωση που μετριέται με το SMPS και φEl είναι ο ρυθμός ροής προς το ηλεκτρόμετρο.
Επειδή η σχετική υγρασία (RH) επηρεάζει το επιφανειακό φορτίο, η θερμοκρασία και η (RH) διατηρήθηκαν σταθερές στους 21°C και 45%, αντίστοιχα, κατά τη διάρκεια του πειράματος.
Για τη μέτρηση του μεγέθους και της διάρκειας ζωής του EWNS χρησιμοποιήθηκαν μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) και ανιχνευτής AC260T (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία). Ο ρυθμός σάρωσης AFM είναι 1 Hz και η περιοχή σάρωσης είναι 5 µm×5 µm με 256 γραμμές σάρωσης. Όλες οι εικόνες υποβλήθηκαν σε ευθυγράμμιση εικόνας πρώτης τάξης χρησιμοποιώντας το λογισμικό Asylum (μάσκα με εύρος 100 nm και όριο 100 pm).
Αφαιρέστε τη χοάνη δειγματοληψίας και τοποθετήστε την επιφάνεια του μαρμαρυγία σε απόσταση 2,0 cm από το αντίθετο ηλεκτρόδιο για μέσο χρόνο 120 s για να αποφύγετε τη συγχώνευση σωματιδίων και τον σχηματισμό ακανόνιστων σταγονιδίων στην επιφάνεια του μαρμαρυγία. Το EWNS εφαρμόστηκε απευθείας σε φρεσκοκομμένες επιφάνειες μαρμαρυγία (Ted Pella, Redding, CA). Αμέσως μετά τον ψεκασμό, η επιφάνεια του μαρμαρυγία απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας AFM. Η γωνία επαφής της επιφάνειας του φρεσκοκομμένου μη τροποποιημένου μαρμαρυγία είναι κοντά στις 0°, επομένως το EWNS διαδίδεται πάνω από την επιφάνεια του μαρμαρυγία σε θολωτό σχήμα20. Η διάμετρος (a) και το ύψος (h) των σταγονιδίων διάχυσης μετρήθηκαν απευθείας από την τοπογραφία AFM και χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του θολωτού όγκου διάχυσης EWNS χρησιμοποιώντας την προηγουμένως επικυρωμένη μέθοδό μας8. Υποθέτοντας ότι το ενσωματωμένο EVNS έχει τον ίδιο όγκο, η ισοδύναμη διάμετρος μπορεί να υπολογιστεί από την εξίσωση (2):
Σύμφωνα με την προηγουμένως αναπτυγμένη μέθοδό μας, χρησιμοποιήθηκε μια παγίδα σπιν ηλεκτρονικού συντονισμού σπιν (ESR) για την ανίχνευση της παρουσίας βραχύβιων ενδιάμεσων ριζών σε EWNS. Τα αερολύματα διήλθαν μέσω ενός διαλύματος που περιείχε 235 mM DEPMPO (5-(διαιθοξυφωσφορυλ)-5-μεθυλ-1-πυρρολιν-Ν-οξείδιο) (Oxis International Inc., Πόρτλαντ, Όρεγκον). Όλες οι μετρήσεις EPR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ΗΠΑ) και συστοιχίες επίπεδων κυψελών. Το λογισμικό Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για τη συλλογή και την ανάλυση των δεδομένων. Ο χαρακτηρισμός ROS πραγματοποιήθηκε μόνο για ένα σύνολο συνθηκών λειτουργίας [-6,5 kV, 4,0 cm]. Οι συγκεντρώσεις EWNS μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας SMPS αφού λήφθηκε υπόψη η απώλεια EWNS στον κρουστήρα.
Τα επίπεδα όζοντος παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Για όλες τις ιδιότητες EWNS, η τιμή μέτρησης είναι ο μέσος όρος των μετρήσεων και το σφάλμα μέτρησης είναι η τυπική απόκλιση. Πραγματοποιήθηκε t-test για να συγκριθεί η τιμή του βελτιστοποιημένου χαρακτηριστικού EWNS με την αντίστοιχη τιμή του βασικού EWNS.
Το Σχήμα 2c δείχνει ένα προηγουμένως αναπτυγμένο και χαρακτηρισμένο Σύστημα Διέλευσης Ηλεκτροστατικής Καθίζησης (EPES) που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη στόχευση του EWNS11 σε επιφάνειες. Το EPES χρησιμοποιεί ένα φορτίο EWNS σε συνδυασμό με ένα ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο για να «δείξει» απευθείας στην επιφάνεια του στόχου. Λεπτομέρειες του συστήματος EPES παρουσιάζονται σε πρόσφατη δημοσίευση των Pyrgiotakis et al.11. Έτσι, το EPES αποτελείται από έναν τρισδιάστατα εκτυπωμένο θάλαμο PVC με κωνικά άκρα που περιέχουν δύο παράλληλες μεταλλικές πλάκες από ανοξείδωτο χάλυβα (ανοξείδωτος χάλυβας 304, γυαλισμένος με καθρέφτη) στη μέση, σε απόσταση 15,24 cm μεταξύ τους. Οι πλάκες συνδέονταν σε μια εξωτερική πηγή υψηλής τάσης (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), η κάτω πλάκα ήταν πάντα θετική και η πάνω πλάκα ήταν πάντα γειωμένη (αιωρούμενη). Τα τοιχώματα του θαλάμου είναι καλυμμένα με αλουμινόχαρτο, το οποίο είναι ηλεκτρικά γειωμένο για να αποτρέπεται η απώλεια σωματιδίων. Ο θάλαμος διαθέτει μια σφραγισμένη μπροστινή πόρτα φόρτωσης που επιτρέπει την τοποθέτηση των επιφανειών δοκιμής σε πλαστικές σχάρες, ανασηκώνοντάς τες από την κάτω μεταλλική πλάκα για να αποφεύγονται οι παρεμβολές υψηλής τάσης.
Η αποτελεσματικότητα εναπόθεσης του EWNS σε EPES υπολογίστηκε σύμφωνα με ένα προηγουμένως αναπτυγμένο πρωτόκολλο που περιγράφεται λεπτομερώς στο Συμπληρωματικό Σχήμα S111.
Ως θάλαμος ελέγχου, η δεύτερη ροή μέσω του κυλινδρικού θαλάμου συνδέεται σε σειρά με το σύστημα EPES χρησιμοποιώντας ένα ενδιάμεσο φίλτρο HEPA για την αφαίρεση του EWNS. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2γ, το αερόλυμα EWNS αντλήθηκε μέσω δύο θαλάμων συνδεδεμένων σε σειρά. Το φίλτρο μεταξύ του θαλάμου ελέγχου και του EPES αφαιρεί τυχόν υπολειπόμενα EWNS, με αποτέλεσμα την ίδια θερμοκρασία (T), σχετική υγρασία (RH) και επίπεδα όζοντος.
Σημαντικοί τροφιμογενείς μικροοργανισμοί έχουν βρεθεί ότι μολύνουν φρέσκα προϊόντα, όπως το Escherichia coli (ATCC #27325), ένας δείκτης κοπράνων, η Salmonella enterica (ATCC #53647), ένα τροφιμογενές παθογόνο, η Listeria innocua (ATCC #33090), μια εναλλακτική λύση για την παθογόνο Listeria monocytogenes. , ο Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) ως εναλλακτική λύση για τη μαγιά που προκαλεί αλλοίωση, και το Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) ως πιο ανθεκτικό ζωντανό βακτήριο αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, Virginia).
Αγοράστε τυχαία κουτιά με βιολογικές ντομάτες από την τοπική σας αγορά και βάλτε τις στο ψυγείο στους 4°C μέχρι να τις χρησιμοποιήσετε (έως και 3 ημέρες). Επιλέξτε ντομάτες για να πειραματιστείτε με ένα μέγεθος, διαμέτρου περίπου 1,5 εκατοστού.
Τα πρωτόκολλα για την επώαση, τον εμβολιασμό, την έκθεση και την καταμέτρηση αποικιών έχουν περιγραφεί λεπτομερώς σε προηγούμενες δημοσιεύσεις μας και εξηγούνται λεπτομερώς στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 11. Η απόδοση του EWNS αξιολογήθηκε εκθέτοντας τις εμβολιασμένες ντομάτες σε 40.000 #/cm3 για 45 λεπτά. Εν συντομία, σε χρόνο t = 0 λεπτά, χρησιμοποιήθηκαν τρεις ντομάτες για την αξιολόγηση των επιζώντων μικροοργανισμών. Τρεις ντομάτες τοποθετήθηκαν σε EPES και εκτέθηκαν σε EWNS στα 40.000 #/cc (ντομάτες εκτεθειμένες σε EWNS) και τρεις άλλες τοποθετήθηκαν στον θάλαμο ελέγχου (ντομάτες ελέγχου). Καμία από τις ομάδες ντομάτας δεν υποβλήθηκε σε πρόσθετη επεξεργασία. Οι ντομάτες και οι μάρτυρες που εκτέθηκαν σε EWNS αφαιρέθηκαν μετά από 45 λεπτά για να αξιολογηθεί η επίδραση του EWNS.
Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα.
Δείγματα βακτηρίων E. coli, Enterobacter και L. innocua που εκτέθηκαν σε EWNS (45 λεπτά, συγκέντρωση αερολύματος EWNS 40.000 #/cm3) και δεν είχαν εκτεθεί, σφαιροποιήθηκαν για την αξιολόγηση των μηχανισμών απενεργοποίησης. Το ίζημα σταθεροποιήθηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε διάλυμα κακοδυλικού νατρίου 0,1 M (pH 7,4) με σταθεροποιητικό 2,5% γλουταραλδεΰδης, 1,25% παραφορμαλδεΰδης και 0,03% πικρικού οξέος. Μετά το πλύσιμο, σταθεροποιήθηκαν με 1% τετροξείδιο του οσμίου (OsO4)/1,5% σιδηροκυανιούχο κάλιο (KFeCN6) για 2 ώρες, πλύθηκαν 3 φορές με νερό και επωάστηκαν σε 1% οξικό ουρανύλιο για 1 ώρα και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με νερό. Επακόλουθη αφυδάτωση 10 λεπτών η καθεμία με 50%, 70%, 90%, 100% αλκοόλη. Στη συνέχεια, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε προπυλενοξείδιο για 1 ώρα και εμποτίστηκαν με ένα μείγμα 1:1 προπυλενοξειδίου και TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Τα δείγματα ενσωματώθηκαν σε TAAB Epon και πολυμερίστηκαν στους 60°C για 48 ώρες. Η σκληρυμένη κοκκώδης ρητίνη κόπηκε και απεικονίστηκε με TEM χρησιμοποιώντας ένα JEOL 1200EX (JEOL, Τόκιο, Ιαπωνία), ένα συμβατικό ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης εξοπλισμένο με κάμερα AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, ΗΠΑ).
Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Για κάθε χρονικό σημείο, τα βακτηριακά εκπλύματα τοποθετήθηκαν σε τρεις πλάκες, με αποτέλεσμα συνολικά εννέα σημεία δεδομένων ανά σημείο, ο μέσος όρος των οποίων χρησιμοποιήθηκε ως η βακτηριακή συγκέντρωση για τον συγκεκριμένο οργανισμό. Η τυπική απόκλιση χρησιμοποιήθηκε ως το σφάλμα μέτρησης. Όλα τα σημεία μετρώνται.
Ο λογάριθμος της μείωσης της συγκέντρωσης των βακτηρίων σε σύγκριση με t = 0 λεπτά υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:
όπου C0 είναι η συγκέντρωση βακτηρίων στο δείγμα ελέγχου τη χρονική στιγμή 0 (δηλαδή μετά την ξήρανση της επιφάνειας αλλά πριν τοποθετηθεί στον θάλαμο) και Cn είναι η συγκέντρωση βακτηρίων στην επιφάνεια μετά από n λεπτά έκθεσης.
Για να ληφθεί υπόψη η φυσική αποικοδόμηση των βακτηρίων κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης των 45 λεπτών, υπολογίστηκε επίσης η λογαριθμική μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο στα 45 λεπτά ως εξής:
Όπου Cn είναι η συγκέντρωση των βακτηρίων στο δείγμα ελέγχου τη χρονική στιγμή n και Cn-Control είναι η συγκέντρωση των βακτηρίων ελέγχου τη χρονική στιγμή n. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως λογαριθμική μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο (χωρίς έκθεση σε EWNS).
Κατά τη διάρκεια της μελέτης, αξιολογήθηκαν διάφοροι συνδυασμοί τάσης και απόστασης μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου ως προς τον σχηματισμό κώνου Taylor, τη σταθερότητα του κώνου Taylor, τη σταθερότητα παραγωγής EWNS και την αναπαραγωγιμότητα. Διάφοροι συνδυασμοί παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Επιλέχθηκαν δύο περιπτώσεις για μια πλήρη μελέτη που δείχνει σταθερές και αναπαραγώγιμες ιδιότητες (κώνος Taylor, παραγωγή EWNS και σταθερότητα με την πάροδο του χρόνου). Στο σχήμα 3 φαίνονται τα αποτελέσματα σχετικά με το φορτίο, το μέγεθος και την περιεκτικότητα των ROS για δύο περιπτώσεις. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται επίσης στον Πίνακα 1. Για αναφορά, το Σχήμα 3 και ο Πίνακας 1 περιλαμβάνουν τις ιδιότητες του προηγουμένως συντεθειμένου μη βελτιστοποιημένου EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS). Οι υπολογισμοί στατιστικής σημαντικότητας χρησιμοποιώντας ένα t-test διπλής ουράς αναδημοσιεύονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Επιπλέον, πρόσθετα δεδομένα περιλαμβάνουν μελέτες σχετικά με την επίδραση της διαμέτρου της οπής δειγματοληψίας του αντίθετου ηλεκτροδίου (D) και της απόστασης μεταξύ του ηλεκτροδίου γείωσης και της άκρης της βελόνας (L) (Συμπληρωματικά Σχήματα S2 και S3).
(a–c) Κατανομή μεγέθους AFM. (d – f) Χαρακτηριστικό επιφανειακού φορτίου. (g) Χαρακτηρισμός ROS και ESR.
Είναι επίσης σημαντικό να σημειωθεί ότι για όλες τις παραπάνω συνθήκες, τα μετρούμενα ρεύματα ιονισμού κυμαίνονταν από 2-6 µA και οι τάσεις κυμαίνονταν από -3,8 έως -6,5 kV, με αποτέλεσμα η κατανάλωση ενέργειας για αυτό το μονοτερματικό EWNS να είναι μικρότερη από 50 mW. Παρόλο που το EWNS συντέθηκε υπό υψηλή πίεση, τα επίπεδα όζοντος ήταν πολύ χαμηλά, χωρίς ποτέ να υπερβαίνουν τα 60 ppb.
Το συμπληρωματικό Σχήμα S4 δείχνει τα προσομοιωμένα ηλεκτρικά πεδία για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα. Τα πεδία σύμφωνα με τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm] υπολογίζονται ως 2 × 105 V/m και 4,7 × 105 V/m, αντίστοιχα. Αυτό είναι αναμενόμενο, καθώς ο λόγος τάσης προς απόσταση είναι πολύ υψηλότερος στη δεύτερη περίπτωση.
Στο σχήμα 3α,β φαίνεται η διάμετρος του EWNS που μετρήθηκε με το AFM8. Οι μέσες διάμετροι του EWNS για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm] υπολογίστηκαν ως 27 nm και 19 nm, αντίστοιχα. Οι γεωμετρικές τυπικές αποκλίσεις των κατανομών για τις περιπτώσεις [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm] είναι 1,41 και 1,45, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας μια στενή κατανομή μεγέθους. Τόσο το μέσο μέγεθος όσο και η γεωμετρική τυπική απόκλιση είναι πολύ κοντά στο EWNS βάσης, όντας 25 nm και 1,41, αντίστοιχα. Στο σχήμα 3γ φαίνεται η κατανομή μεγέθους του EWNS βάσης που μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο υπό τις ίδιες συνθήκες.
Στο σχήμα 3δ, ε φαίνονται τα αποτελέσματα του χαρακτηρισμού φορτίου. Τα δεδομένα είναι μέσες μετρήσεις 30 ταυτόχρονων μετρήσεων συγκέντρωσης (#/cm3) και ρεύματος (I). Η ανάλυση δείχνει ότι το μέσο φορτίο στο EWNS είναι 22 ± 6 e- και 44 ± 6 e- για [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα. Σε σύγκριση με το Baseline-EWNS (10 ± 2 e-), το επιφανειακό τους φορτίο είναι σημαντικά υψηλότερο, διπλάσιο από το σενάριο [-6,5 kV, 4,0 cm] και τετραπλάσιο από το σενάριο [-3,8 kV, 0,5 cm]. Το 3στ δείχνει βασικά δεδομένα πληρωμής EWNS.
Από τους χάρτες συγκέντρωσης αριθμού EWNS (Συμπληρωματικά Σχήματα S5 και S6), φαίνεται ότι η σκηνή [-6,5 kV, 4,0 cm] έχει σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό σωματιδίων από τη σκηνή [-3,8 kV, 0,5 cm]. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι οι συγκεντρώσεις αριθμού EWNS παρακολουθήθηκαν για έως και 4 ώρες (Συμπληρωματικά Σχήματα S5 και S6), όπου η σταθερότητα παραγωγής EWNS έδειξε τα ίδια επίπεδα συγκεντρώσεων αριθμού σωματιδίων και στις δύο περιπτώσεις.
Το Σχήμα 3g δείχνει το φάσμα EPR μετά την αφαίρεση του ελέγχου (υποβάθρου) για βελτιστοποιημένο EWNS στα [-6,5 kV, 4,0 cm]. Το φάσμα ROS συγκρίνεται επίσης με την αρχική τιμή του EWNS σε μια προηγουμένως δημοσιευμένη εργασία. Ο υπολογιζόμενος αριθμός EWNS που αντιδρούν με την παγίδα σπιν είναι 7,5 × 104 EWNS/s, ο οποίος είναι παρόμοιος με την προηγουμένως δημοσιευμένη αρχική τιμή-EWNS8. Τα φάσματα EPR έδειξαν σαφώς την παρουσία δύο τύπων ROS, όπου κυριαρχούσε το O2-, ενώ το OH• υπήρχε σε μικρότερη ποσότητα. Επιπλέον, μια άμεση σύγκριση των εντάσεων κορυφής έδειξε ότι το βελτιστοποιημένο EWNS είχε σημαντικά υψηλότερη περιεκτικότητα σε ROS σε σύγκριση με το αρχικό EWNS.
Στο σχήμα 4 φαίνεται η απόδοση εναπόθεσης του EWNS σε EPES. Τα δεδομένα συνοψίζονται επίσης στον Πίνακα Ι και συγκρίνονται με τα αρχικά δεδομένα EWNS. Και για τις δύο περιπτώσεις EUNS, η εναπόθεση ήταν κοντά στο 100% ακόμη και σε χαμηλή τάση 3,0 kV. Συνήθως, τα 3,0 kV επαρκούν για να επιτευχθεί 100% εναπόθεση ανεξάρτητα από την αλλαγή του επιφανειακού φορτίου. Υπό τις ίδιες συνθήκες, η απόδοση εναπόθεσης του Baseline-EWNS ήταν μόνο 56% λόγω του χαμηλότερου φορτίου (μέσος όρος 10 ηλεκτρόνια ανά EWNS).
Το Σχήμα 5 και ο Πίνακας 2 συνοψίζουν τον βαθμό απενεργοποίησης των μικροοργανισμών που εμβολιάστηκαν στην επιφάνεια των τοματών μετά από έκθεση σε περίπου 40.000 #/cm3 EWNS για 45 λεπτά στο βέλτιστο σενάριο [-6,5 kV, 4,0 cm]. Τα εμβολιασμένα E. coli και L. innocua έδειξαν σημαντική μείωση 3,8 log μετά από 45 λεπτά έκθεσης. Υπό τις ίδιες συνθήκες, το S. enterica έδειξε χαμηλότερη λογαριθμική μείωση 2,2 log, ενώ τα S. cerevisiae και M. parafortuitum έδειξαν μείωση 1,0 log.
Ηλεκτρονικές μικρογραφίες (Σχήμα 6) που απεικονίζουν τις φυσικές αλλαγές που προκαλούνται από το EWNS σε κύτταρα E. coli, Salmonella enterica και L. innocua, οι οποίες οδηγούν σε απενεργοποίηση. Τα βακτήρια ελέγχου έδειξαν άθικτες κυτταρικές μεμβράνες, ενώ τα εκτεθειμένα βακτήρια είχαν κατεστραμμένες εξωτερικές μεμβράνες.
Η ηλεκτρονική μικροσκοπική απεικόνιση των βακτηρίων ελέγχου και των εκτεθειμένων βακτηρίων αποκάλυψε βλάβη στη μεμβράνη.
Τα δεδομένα σχετικά με τις φυσικοχημικές ιδιότητες του βελτιστοποιημένου EWNS δείχνουν συλλογικά ότι οι ιδιότητες του EWNS (επιφανειακό φορτίο και περιεκτικότητα σε ROS) βελτιώθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα προηγουμένως δημοσιευμένα βασικά δεδομένα του EWNS8,9,10,11. Από την άλλη πλευρά, το μέγεθός τους παρέμεινε στην περιοχή των νανομέτρων, κάτι που είναι πολύ παρόμοιο με τα προηγουμένως δημοσιευμένα αποτελέσματα, επιτρέποντάς τους να παραμένουν στον αέρα για μεγάλο χρονικό διάστημα. Η παρατηρούμενη πολυδιασπορά μπορεί να εξηγηθεί από αλλαγές στο επιφανειακό φορτίο, οι οποίες καθορίζουν το μέγεθος του φαινομένου Rayleigh, την τυχαιότητα και την πιθανή συγχώνευση του EWNS. Ωστόσο, όπως περιγράφεται λεπτομερώς από τους Nielsen et al.22, το υψηλό επιφανειακό φορτίο μειώνει την εξάτμιση αυξάνοντας αποτελεσματικά την επιφανειακή ενέργεια/τάση της σταγόνας νερού. Αυτή η θεωρία επιβεβαιώθηκε πειραματικά για μικροσταγονίδια22 και EWNS στην προηγούμενη δημοσίευσή μας8. Η απώλεια χρόνου μπορεί επίσης να επηρεάσει το μέγεθος και να συμβάλει στην παρατηρούμενη κατανομή μεγέθους.
Επιπλέον, το φορτίο ανά δομή είναι περίπου 22–44 e-, ανάλογα με τις περιστάσεις, το οποίο είναι σημαντικά υψηλότερο σε σύγκριση με το βασικό EWNS, το οποίο έχει μέσο φορτίο 10 ± 2 ηλεκτρόνια ανά δομή. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι αυτό είναι το μέσο φορτίο του EWNS. Seto et al. Έχει αποδειχθεί ότι το φορτίο δεν είναι ομοιόμορφο και ακολουθεί μια λογαριθμική-κανονική κατανομή21. Σε σύγκριση με την προηγούμενη εργασία μας, ο διπλασιασμός του επιφανειακού φορτίου διπλασιάζει την απόδοση εναπόθεσης στο σύστημα EPES σε σχεδόν 100%11.