Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Πορώδη σωματίδια πυριτίας παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο sol-gel με κάποιες τροποποιήσεις για να ληφθούν μακροπορώδη σωματίδια. Αυτά τα σωματίδια παραγωγοποιήθηκαν με πολυμερισμό αναστρέψιμης προσθήκης-κατακερματισμού αλυσίδας μεταφοράς (RAFT) με Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο-μεθυλοβινυλισοκυανικό (PMI) και στυρένιο για την παρασκευή παρεμβολής Ν-φαινυλομαλεϊμιδίου της στατικής φάσης πολυστυρενίου (PMP). Στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα στενής διαμέτρου (100 × 1,8 mm id) συσκευάστηκαν με συσκευασία πολτού. Αξιολογήθηκε ο διαχωρισμός στήλης PMP ενός μείγματος πεπτιδίων που αποτελείται από πέντε πεπτίδια (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, λευκίνη εγκεφαλίνη (χρωματογραφική απόδοση) και η πέψη ανθρώπινης ορολευκωματίνης (HAS) με τρυψίνη. Υπό βέλτιστες συνθήκες έκλουσης, ο θεωρητικός αριθμός πλακών του μείγματος πεπτιδίων φτάνει τις 280.000 πλάκες/m². Συγκρίνοντας την απόδοση διαχωρισμού της αναπτυγμένης στήλης με την εμπορική Ascentis. Στη στήλη Express RP-Amide, παρατηρήθηκε ότι η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP ήταν ανώτερη από την εμπορική στήλη όσον αφορά την απόδοση διαχωρισμού και την ανάλυση.
Τα τελευταία χρόνια, η βιοφαρμακευτική βιομηχανία έχει γίνει μια αναπτυσσόμενη παγκόσμια αγορά με σημαντική αύξηση του μεριδίου αγοράς. Με την εκρηκτική ανάπτυξη της βιοφαρμακευτικής βιομηχανίας1,2,3, η ανάλυση πεπτιδίων και πρωτεϊνών είναι ιδιαίτερα επιθυμητή. Εκτός από το πεπτίδιο-στόχο, παράγονται αρκετές ακαθαρσίες κατά τη διάρκεια της σύνθεσης πεπτιδίων, απαιτώντας έτσι χρωματογραφικό καθαρισμό για την απόκτηση πεπτιδίων της επιθυμητής καθαρότητας. Η ανάλυση και ο χαρακτηρισμός πρωτεϊνών σε σωματικά υγρά, ιστούς και κύτταρα είναι ένα εξαιρετικά δύσκολο έργο λόγω του μεγάλου αριθμού δυνητικά ανιχνεύσιμων ειδών σε ένα μόνο δείγμα. Αν και η φασματομετρία μάζας είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την αλληλούχιση πεπτιδίων και πρωτεϊνών, εάν τέτοια δείγματα εγχυθούν στον φασματόμετρο μάζας με ένα πέρασμα, ο διαχωρισμός δεν θα είναι ιδανικός. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να μετριαστεί με την εφαρμογή διαχωρισμών υγρής χρωματογραφίας (LC) πριν από την ανάλυση MS, η οποία θα μειώσει τον αριθμό των αναλυτών που εισέρχονται στον φασματόμετρο μάζας σε μια δεδομένη χρονική στιγμή4,5,6. Επιπλέον, κατά τον διαχωρισμό υγρής φάσης, οι αναλυτές μπορούν να εστιαστούν σε στενές περιοχές, συγκεντρώνοντας έτσι αυτούς τους αναλυτές και βελτιώνοντας την ευαισθησία ανίχνευσης MS. Η υγρή χρωματογραφία (LC) έχει προχωρήσει σημαντικά. την τελευταία δεκαετία και έχει γίνει μια δημοφιλής τεχνική στην πρωτεωμική ανάλυση7,8,9,10.
Η υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RP-LC) χρησιμοποιείται ευρέως για τον καθαρισμό και τον διαχωρισμό μειγμάτων πεπτιδίων χρησιμοποιώντας τροποποιημένο με οκταδεκύλιο πυρίτιο (ODS) ως στατική φάση11,12,13. Ωστόσο, οι στατικές φάσεις RP δεν παρέχουν ικανοποιητικό διαχωρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών λόγω της σύνθετης δομής και της αμφιφιλικής τους φύσης14,15. Επομένως, απαιτούνται ειδικά σχεδιασμένες στατικές φάσεις για την ανάλυση πεπτιδίων και πρωτεϊνών με πολικές και μη πολικές ομάδες για να αλληλεπιδράσουν και να διατηρήσουν αυτές τις αναλυόμενες ουσίες16. Η χρωματογραφία μικτής λειτουργίας, η οποία παρέχει πολυτροπικές αλληλεπιδράσεις, μπορεί να αποτελέσει εναλλακτική λύση στην RP-LC για τον διαχωρισμό πεπτιδίων, πρωτεϊνών και άλλων σύνθετων μειγμάτων. Έχουν παρασκευαστεί αρκετές στατικές φάσεις μικτής λειτουργίας και στήλες γεμισμένες με αυτές τις φάσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμούς πεπτιδίων και πρωτεϊνών17,18,19,20,21. Οι στατικές φάσεις μικτής λειτουργίας (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, πολική παρεμβολή/RPLC) είναι κατάλληλες για διαχωρισμούς πεπτιδίων και πρωτεϊνών λόγω της παρουσίας τόσο πολικών όσο και μη πολικών. ομάδες22,23,24,25,26,27,28. Ομοίως, οι πολικές παρεμβαλλόμενες στατικές φάσεις με ομοιοπολικά συνδεδεμένες πολικές ομάδες παρουσιάζουν καλή ισχύ διαχωρισμού και μοναδική επιλεκτικότητα για πολικούς και μη πολικούς αναλυτές, καθώς ο διαχωρισμός εξαρτάται από την αλληλεπίδραση μεταξύ του αναλύτη και της στατικής φάσης. Πολυτροπικές αλληλεπιδράσεις 29, 30, 31, 32. Πρόσφατα, οι Zhang et al. 30 παρασκεύασαν μια στατική φάση πολυαμίνης με δωδεκυλο-τελική ομάδα και διαχώρισαν με επιτυχία υδρογονάνθρακες, αντικαταθλιπτικά, φλαβονοειδή, νουκλεοσίδια, οιστρογόνα και αρκετούς άλλους αναλυτές. Ο πολικός παρεμβολέας έχει τόσο πολικές όσο και μη πολικές ομάδες, επομένως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών που έχουν τόσο υδρόφοβες όσο και υδρόφιλες ομάδες. Οι πολικές ενσωματωμένες στήλες (π.χ., στήλες C18 με ενσωματωμένες αμίδες) διατίθενται στο εμπόριο με την εμπορική ονομασία στήλες Ascentis Express RP-Amide, αλλά αυτές οι στήλες χρησιμοποιούνται μόνο για την ανάλυση της αμίνης 33.
Στην παρούσα μελέτη, παρασκευάστηκε και αξιολογήθηκε μια πολική ενσωματωμένη στατική φάση (πολυστυρένιο ενσωματωμένο σε Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο) για τον διαχωρισμό πεπτιδίων και προϊόντων πέψης τρυψίνης της HSA. Η στατική φάση παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη στρατηγική. Τα πορώδη σωματίδια πυριτίας παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία που δίνεται στην προηγούμενη δημοσίευσή μας με ορισμένες τροποποιήσεις στο πρωτόκολλο παρασκευής. Η αναλογία ουρίας, πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), TMOS, νερού και οξικού οξέος ρυθμίστηκε για την παρασκευή σωματιδίων πυριτίας με μεγάλο μέγεθος πόρων. Δεύτερον, συντέθηκε ένας νέος υποκαταστάτης, φαινυλομαλεϊμίδιο-μεθυλοβινυλ ισοκυανικό, και χρησιμοποιήθηκε για την παραγώγιση σωματιδίων πυριτίας για την παρασκευή μιας πολικής ενσωματωμένης στατικής φάσης. Η προκύπτουσα στατική φάση συσκευάστηκε σε μια στήλη από ανοξείδωτο χάλυβα (100 × 1,8 mm id) χρησιμοποιώντας το βελτιστοποιημένο σχήμα συσκευασίας. Η συσκευασία της στήλης υποβοηθείται από μηχανικούς κραδασμούς για να διασφαλιστεί ότι σχηματίζεται μια ομοιογενής κλίνη μέσα στη στήλη. Αξιολόγηση του διαχωρισμού μειγμάτων πεπτιδίων που αποτελούνται από πέντε πεπτίδια σε συσκευασμένες στήλες. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Λευκίνη Εγκεφαλίνη) και προϊόν πέψης με τρυψίνη της ανθρώπινης αλβουμίνης ορού (HAS). Το μείγμα πεπτιδίων και το προϊόν πέψης με τρυψίνη της HSA παρατηρήθηκαν να διαχωρίζονται με καλή διακριτική ικανότητα και αποτελεσματικότητα. Η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP συγκρίθηκε με αυτή της στήλης Ascentis Express RP-Amide. Τόσο τα πεπτίδια όσο και οι πρωτεΐνες παρατηρήθηκαν να διαχωρίζονται καλά και να είναι αποτελεσματικές στη στήλη PMP, η οποία ήταν πιο αποτελεσματική από τη στήλη Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Πολυαιθυλενογλυκόλη), Ουρία, Οξικό Οξύ, Τριμεθοξυ Ορθοπυριτικό (TMOS), Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο (TMCS), Τρυψίνη, Αλβουμίνη Ανθρώπινου Ορού (HSA), Χλωριούχο Αμμώνιο, Ουρία, Εξάνιο Μεθυλοδισιλαζάνιο (HMDS), Μεθακρυλοϋλοχλωρίδιο (MC), Στυρένιο, 4-Υδροξυ-TEMPO, Υπεροξείδιο του Βενζοϋλίου (BPO), Ακετονιτρίλιο Βαθμού HPLC (ACN), Μεθανόλη, 2-Προπανόλη και Ακετόνη. Αγορά από την Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ).
Ένα μείγμα ουρίας (8 g), πολυαιθυλενογλυκόλης (8 g) και 8 mL οξικού οξέος 0,01 N αναδεύτηκε για 10 λεπτά και στη συνέχεια προστέθηκαν 24 mL TMOS σε αυτό υπό συνθήκες πάγου. Το μείγμα αντίδρασης θερμάνθηκε στους 40°C για 6 ώρες και στη συνέχεια στους 120°C για 8 ώρες σε αυτόκλειστο από ανοξείδωτο χάλυβα. Το νερό αποχύθηκε και το υπολειμματικό υλικό ξηράνθηκε στους 70°C για 12 ώρες. Η ξηραμένη μαλακή μάζα αλέστηκε λεία σε φούρνο και φρύχθηκε στους 550°C για 12 ώρες. Παρασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν τρεις παρτίδες για να εξεταστεί η αναπαραγωγιμότητα ως προς το μέγεθος των σωματιδίων, το μέγεθος των πόρων και την επιφάνεια.
Με επιφανειακή τροποποίηση σωματιδίων πυριτίας με προ-συνθετικό υποκαταστάτη φαινυλομαλεϊμίδιο-μεθυλοβινυλισοκυανικό (PCMP) ακολουθούμενη από ακτινικό πολυμερισμό με στυρένιο, παρασκευάστηκε μια ένωση που περιέχει πολική ομάδα. Στατική φάση για αδρανή και αλυσίδες πολυστυρενίου. Η διαδικασία παρασκευής περιγράφεται παρακάτω.
Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο (200 mg) και ισοκυανικό μεθυλοβινύλιο (100 mg) διαλύθηκαν σε ξηρό τολουόλιο και προστέθηκαν 0,1 mL 2,2′-αζοϊσοβουτυρονιτριλίου (AIBN) στη φιάλη αντίδρασης για την παρασκευή συμπολυμερούς φαινυλομαλεϊμιδίου-ισοκυανικού μεθυλοβινυλίου (PMCP). Το μείγμα θερμάνθηκε στους 60°C για 3 ώρες, διηθήθηκε και ξηράνθηκε σε φούρνο στους 40°C για 3 ώρες.
Αποξηραμένα σωματίδια πυριτίας (2 g) διασκορπίστηκαν σε ξηρό τολουόλιο (100 mL), αναδεύτηκαν και υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε σφαιρική φιάλη των 500 mL για 10 λεπτά. PMCP (10 mg) διαλύθηκε σε τολουόλιο και προστέθηκε στάγδην στη φιάλη αντίδρασης μέσω χωνιού σταγόνας. Το μείγμα θερμάνθηκε με κάθετο ψυκτήρα στους 100°C για 8 ώρες, διηθήθηκε και πλύθηκε με ακετόνη και ξηράνθηκε στους 60°C για 3 ώρες. Στη συνέχεια, σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με PMCP (100 g) διαλύθηκαν σε τολουόλιο (200 ml) και προστέθηκε 4-υδροξυ-TEMPO (2 mL) παρουσία 100 μL διβουτυλοκασσιτερικού διλαυρικού άλατος ως καταλύτη. Το μείγμα αναδεύτηκε στους 50°C για 8 ώρες, διηθήθηκε και ξηράνθηκε στους 50°C για 3 ώρες.
Στυρένιο (1 mL), υπεροξείδιο του βενζοϋλίου BPO (0,5 mL) και σωματίδια πυριτίας προσαρτημένα στο TEMPO-PMCP (1,5 g) διασκορπίστηκαν σε τολουόλιο και καθαρίστηκαν με άζωτο. Ο πολυμερισμός του στυρενίου πραγματοποιήθηκε στους 100°C για 12 ώρες. Το προκύπτον προϊόν πλύθηκε με μεθανόλη και ξηράνθηκε στους 60°C όλη τη νύχτα. Το συνολικό σχήμα αντίδρασης φαίνεται στο Σχήμα 1.
Τα δείγματα απαερώθηκαν στους 393 K για 1 ώρα για να επιτευχθεί υπολειμματική πίεση μικρότερη από 10-3 Torr. Η ποσότητα N2 που προσροφήθηκε σε σχετική πίεση P/P0 = 0,99 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του συνολικού όγκου πόρων. Η μορφολογία των γυμνών και των σωματιδίων πυριτίας με δεσμούς υποκαταστάτη εξετάστηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (Hitachi High Technologies, Τόκιο, Ιαπωνία). Τα αποξηραμένα δείγματα (γυμνό πυρίτιο και σωματίδια πυριτίας με δεσμούς υποκαταστάτη) τοποθετήθηκαν σε στήλη αλουμινίου χρησιμοποιώντας κολλητική ταινία άνθρακα. Τα δείγματα επιχρυσώθηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή επίστρωσης με ψεκασμό Q150T και ένα στρώμα Au 5 nm εναποτέθηκε στα δείγματα. Αυτό βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας χρησιμοποιώντας χαμηλές τάσεις και παρέχει λεπτόκοκκο, ψυχρό ψεκασμό. Για τη στοιχειακή ανάλυση χρησιμοποιήθηκε ένας στοιχειακός αναλυτής Thermo Electron (Waltham, MA, ΗΠΑ) Flash EA1112. Για τη στοιχειακή ανάλυση χρησιμοποιήθηκε ένας αναλυτής μεγέθους σωματιδίων Malvern (Worcestershire, Ηνωμένο Βασίλειο) Mastersizer 2000. Γυμνά σωματίδια πυριτίας και πυριτία με δεσμούς υποκαταστάτη Τα σωματίδια (5 mg το καθένα) διασκορπίστηκαν σε 5 mL ισοπροπανόλης, υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά, στροβιλίστηκαν για 5 λεπτά και τοποθετήθηκαν στον οπτικό πάγκο του Mastersizer. Η θερμοβαρυμετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ρυθμό 5 °C ανά λεπτό σε εύρος θερμοκρασίας από 30 έως 800 °C.
Στήλες στενής οπής από ανοξείδωτο χάλυβα με επένδυση από γυαλί, διαστάσεων (100 × 1,8 mm εσωτ. διάμετρος) συσκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συσκευασίας με πολτό, εφαρμόζοντας την ίδια διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε στην Αναφ. 31. Μια στήλη από ανοξείδωτο χάλυβα (με επένδυση από γυαλί, εσωτ. διάμετρος 100 × 1,8 mm) με εξάρτημα εξόδου που περιέχει υαλοκαθαριστήρα 1 µm συνδέθηκε με ένα σύστημα πλήρωσης πολτού (Alltech Deerfield, IL, ΗΠΑ). Παρασκευάστε ένα πολτό στατικής φάσης με εναιώρηση 150 mg στατικής φάσης σε 1,2 mL μεθανόλης και στείλτε το στη στήλη αποθήκευσης. Χρησιμοποιήθηκε μεθανόλη ως διαλύτης πολτού καθώς και ως προωθητικός διαλύτης. Γεμίστε τη στήλη διαδοχικά εφαρμόζοντας πιέσεις 100 MP για 10 λεπτά, 80 MP για 15 λεπτά και 60 MP για 30 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της πλήρωσης, εφαρμόστηκε μηχανική δόνηση με δύο αναδευτήρες στήλης GC (Alltech, Deerfield, IL, ΗΠΑ) για να διασφαλιστεί η ομοιόμορφη πλήρωση της στήλης. Κλείστε το σύστημα πλήρωσης πολτού και απελευθερώστε αργά την πίεση για να αποφύγετε τυχόν ζημιά εντός της στήλης. Αποσυνδέστε τη στήλη από τη μονάδα πλήρωσης πολτού και συνδέστε ένα άλλο εξάρτημα στην είσοδο και στο σύστημα LC για να ελέγξετε την απόδοσή του.
Κατασκευάστηκε αντλία LC (10AD Shimadzu, Ιαπωνία), εγχυτήρας (Valco (USA) C14 W.05) με βρόχο έγχυσης 50nL, απαερωτή μεμβράνης (Shimadzu DGU-14A), τριχοειδές παράθυρο UV-VIS, ειδική συσκευή ανιχνευτή µLC (UV-2075) και μικροστήλες με γυάλινη επένδυση. Χρησιμοποιήθηκαν πολύ στενοί και κοντοί σωλήνες σύνδεσης για την ελαχιστοποίηση της επίδρασης της επιπλέον διεύρυνσης της ζώνης της στήλης. Μετά τη συσκευασία, εγκαταστάθηκαν τριχοειδή (50 μm id 365) και τριχοειδή αναγωγικής ένωσης (50 μm) στην έξοδο 1/16″ της αναγωγικής ένωσης. Η συλλογή δεδομένων και η χρωματογραφική επεξεργασία έγιναν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Multichro 2000. Παρακολούθηση στα 254 nm. Οι αναλυτές ελέγχθηκαν για απορρόφηση UV. Τα χρωματογραφικά δεδομένα αναλύθηκαν με OriginPro8 (Northampton, MA).
Αλβουμίνη από ανθρώπινο ορό, λυοφιλοποιημένη σκόνη, ≥ 96% (ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης) 3 mg αναμεμειγμένη με θρυψίνη (1,5 mg), ουρία 4,0 M (1 mL) και όξινο ανθρακικό αμμώνιο 0,2 M (1 mL). Το διάλυμα αναδεύτηκε για 10 λεπτά και διατηρήθηκε σε υδατόλουτρο στους 37°C για 6 ώρες, στη συνέχεια σβήστηκε με 1 mL 0,1% TFA. Διηθήστε το διάλυμα και φυλάξτε το κάτω από τους 4 °C.
Ο διαχωρισμός των μειγμάτων πεπτιδίων και των προϊόντων πέψης θρυψίνης HSA αξιολογήθηκε ξεχωριστά σε στήλες PMP. Ελέγξτε τον διαχωρισμό του μείγματος πεπτιδίων και του προϊόντος πέψης θρυψίνης της HSA από τη στήλη PMP και συγκρίνετε τα αποτελέσματα με τη στήλη Ascentis Express RP-Amide. Ο θεωρητικός αριθμός πλάκας υπολογίζεται ως εξής:
Εικόνες SEM γυμνών σωματιδίων πυριτίας και σωματιδίων πυριτίας με δεσμούς υποκαταστάτη φαίνονται στο ΣΧ. 2. Οι εικόνες SEM γυμνών σωματιδίων πυριτίας (Α, Β) δείχνουν ότι, σε αντίθεση με τις προηγούμενες μελέτες μας, αυτά τα σωματίδια είναι σφαιρικά, στα οποία τα σωματίδια είναι επιμήκη ή έχουν ακανόνιστη συμμετρία. Η επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας με δεσμούς υποκαταστάτη (C, D) είναι πιο λεία από αυτή των γυμνών σωματιδίων πυριτίας, κάτι που μπορεί να οφείλεται στην επικάλυψη αλυσίδων πολυστυρενίου στην επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας.
Εικόνες ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης γυμνών σωματιδίων πυριτίας (A, B) και σωματιδίων πυριτίας με δεσμούς υποκαταστάτη (C, D).
Οι κατανομές μεγέθους σωματιδίων των γυμνών σωματιδίων πυριτίας και των σωματιδίων πυριτίας που συνδέονται με υποκαταστάτες φαίνονται στο Σχήμα 3(Α). Οι καμπύλες κατανομής μεγέθους σωματιδίων με βάση τον όγκο έδειξαν ότι το μέγεθος των σωματιδίων πυριτίας αυξήθηκε μετά από χημική τροποποίηση (Σχήμα 3Α). Τα δεδομένα κατανομής μεγέθους σωματιδίων των σωματιδίων πυριτίας από την παρούσα μελέτη και την προηγούμενη μελέτη συγκρίνονται στον Πίνακα 1(Α). Το μέγεθος σωματιδίων με βάση τον όγκο, d(0,5), του PMP είναι 3,36 μm, σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας με τιμή ad(0,5) 3,05 μm (σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με πολυστυρένιο)34. Αυτή η παρτίδα είχε στενότερη κατανομή μεγέθους σωματιδίων σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας λόγω των μεταβαλλόμενων αναλογιών PEG, ουρίας, TMOS και οξικού οξέος στο μείγμα αντίδρασης. Το μέγεθος σωματιδίων της φάσης PMP είναι ελαφρώς μεγαλύτερο από αυτό της φάσης σωματιδίων πυριτίας συνδεδεμένης με πολυστυρένιο που μελετήσαμε προηγουμένως. Αυτό σημαίνει ότι η επιφανειακή λειτουργικοποίηση των σωματιδίων πυριτίας με στυρένιο εναπόθεσε μόνο ένα στρώμα πολυστυρενίου (0,97 μm) στην επιφάνεια του πυριτίου, ενώ στη φάση PMP το πάχος του στρώματος ήταν 1,38 μm.
Κατανομή μεγέθους σωματιδίων (Α) και κατανομή μεγέθους πόρων (Β) γυμνών σωματιδίων πυριτίας και σωματιδίων πυριτίας συνδεδεμένων με υποκαταστάτες.
Το μέγεθος πόρων, ο όγκος πόρων και η επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας της παρούσας μελέτης δίνονται στον Πίνακα 1(Β). Τα προφίλ PSD των γυμνών σωματιδίων πυριτίας και των σωματιδίων πυριτίας που συνδέονται με υποκαταστάτες φαίνονται στο Σχήμα 3(Β). Τα αποτελέσματα είναι συγκρίσιμα με την προηγούμενη μελέτη μας. Τα μεγέθη πόρων των γυμνών και των σωματιδίων πυριτίας που συνδέονται με υποκαταστάτες είναι 310 και 241, αντίστοιχα, γεγονός που δείχνει ότι το μέγεθος πόρων μειώνεται κατά 69 μετά από χημική τροποποίηση, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1(Β), και η αλλαγή της καμπύλης φαίνεται στο Σχήμα 3(Β). Ομοίως, ο όγκος πόρων των σωματιδίων πυριτίας μειώθηκε από 0,67 σε 0,58 cm3/g μετά από χημική τροποποίηση. Η ειδική επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας που μελετώνται αυτήν τη στιγμή είναι 116 m2/g, η οποία είναι συγκρίσιμη με την προηγούμενη μελέτη μας (124 m2/g). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1(Β), η επιφάνεια (m2/g) των σωματιδίων πυριτίας μειώθηκε επίσης από 116 m2/g σε 105 m2/g μετά χημική τροποποίηση.
Τα αποτελέσματα της στοιχειακής ανάλυσης της στατικής φάσης παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Το φορτίο άνθρακα της τρέχουσας στατικής φάσης είναι 6,35%, το οποίο είναι χαμηλότερο από το φορτίο άνθρακα της προηγούμενης μελέτης μας (σωματίδια πυριτίας με δεσμό πολυστυρενίου, 7,93%35 και 10,21%, αντίστοιχα)42. Το φορτίο άνθρακα της τρέχουσας στατικής φάσης είναι χαμηλό, επειδή στην παρασκευή του τρέχοντος SP, εκτός από το στυρένιο, χρησιμοποιήθηκαν ορισμένοι πολικοί υποκαταστάτες όπως το φαινυλομαλεϊμίδιο-μεθυλοβινυλισοκυανικό (PCMP) και το 4-υδροξυ-TEMPO. Το ποσοστό βάρους αζώτου της τρέχουσας στατικής φάσης είναι 2,21%, σε σύγκριση με 0,1735 και 0,85% κατά βάρος αζώτου σε προηγούμενες μελέτες, αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι το ποσοστό βάρους αζώτου είναι υψηλότερο στην τρέχουσα στατική φάση λόγω του φαινυλομαλεϊμιδίου. Ομοίως, τα φορτία άνθρακα των προϊόντων (4) και (5) ήταν 2,7% και 2,9%, αντίστοιχα, ενώ το φορτίο άνθρακα του τελικού προϊόντος (6) ήταν 6,35%, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Η απώλεια βάρους ελέγχθηκε με στατική φάση PMP και η καμπύλη TGA φαίνεται στο Σχήμα 4. Η καμπύλη TGA δείχνει απώλεια βάρους 8,6%, η οποία συμφωνεί με το φορτίο άνθρακα (6,35%) επειδή οι υποκαταστάτες περιέχουν όχι μόνο C αλλά και N, O και H.
Ο υποκαταστάτης φαινυλομαλεϊμιδίου-μεθυλοβινυλισοκυανικού επιλέχθηκε για την επιφανειακή τροποποίηση σωματιδίων πυριτίας επειδή έχει πολικές ομάδες φαινυλομαλεϊμιδίου και ομάδες βινυλισοκυανικού. Οι ομάδες ισοκυανικού βινυλίου μπορούν περαιτέρω να αντιδράσουν με το στυρένιο μέσω πολυμερισμού ζωντανής ρίζας. Ο δεύτερος λόγος είναι η εισαγωγή μιας ομάδας που έχει μέτρια αλληλεπίδραση με τον αναλύτη και καμία ισχυρή ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ του αναλύτη και της στατικής φάσης, καθώς το τμήμα φαινυλομαλεϊμιδίου δεν έχει εικονικό φορτίο σε κανονικό pH. Η πολικότητα της στατικής φάσης μπορεί να ελεγχθεί από τη βέλτιστη ποσότητα στυρενίου και τον χρόνο αντίδρασης του πολυμερισμού ελεύθερων ριζών. Το τελευταίο βήμα της αντίδρασης (πολυμερισμός ελεύθερων ριζών) είναι κρίσιμο και μπορεί να αλλάξει την πολικότητα της στατικής φάσης. Πραγματοποιήθηκε στοιχειακή ανάλυση για να ελεγχθεί το φορτίο άνθρακα αυτών των στατικών φάσεων. Παρατηρήθηκε ότι η αύξηση της ποσότητας στυρενίου και του χρόνου αντίδρασης αύξησε το φορτίο άνθρακα της στατικής φάσης και αντίστροφα. Τα SP που παρασκευάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις στυρενίου έχουν διαφορετικά φορτία άνθρακα. Και πάλι, φορτώστε αυτές τις στατικές φάσεις σε στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα και ελέγξτε τη χρωματογραφική τους... απόδοση (επιλεκτικότητα, διακριτική ικανότητα, τιμή N, κ.λπ.). Με βάση αυτά τα πειράματα, επιλέχθηκε μια βελτιστοποιημένη σύνθεση για την παρασκευή της στατικής φάσης PMP, ώστε να διασφαλιστεί ελεγχόμενη πολικότητα και καλή κατακράτηση αναλυόμενης ουσίας.
Πέντε μείγματα πεπτιδίων (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, λευκίνη εγκεφαλίνη) αξιολογήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας στήλη PMP με κινητή φάση. 60/40 (v/v) ακετονιτρίλιο/νερό (0,1% TFA) με ρυθμό ροής 80 μL/min. Υπό βέλτιστες συνθήκες έκλουσης, ο θεωρητικός αριθμός πλακών (N) ανά στήλη (100 × 1,8 mm εσωτερικές διαστάσεις) είναι 20.000 ± 100 (200.000 πλάκες/m²). Ο Πίνακας 3 δίνει τις τιμές N για τις τρεις στήλες PMP και τα χρωματογραφήματα φαίνονται στο Σχήμα 5Α. Γρήγορη ανάλυση σε στήλη PMP με υψηλό ρυθμό ροής (700 μL/min), πέντε πεπτίδια εκλούστηκαν εντός ενός λεπτού, οι τιμές N ήταν πολύ καλές, 13.500 ± 330 ανά στήλη (100 × 1,8 mm εσωτερικές διαστάσεις), που αντιστοιχεί σε 135.000 πλάκες/m² (Σχήμα 5Β). Τρεις στήλες ίδιου μεγέθους (100 × 1,8 mm εσωτερικές διαστάσεις) γεμίστηκαν με τρεις διαφορετικές παρτίδες στατικής φάσης PMP για έλεγχο της αναπαραγωγιμότητας. Η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας για κάθε στήλη καταγράφηκε χρησιμοποιώντας τις βέλτιστες συνθήκες έκλουσης και τον αριθμό των θεωρητικών πλακών N και τον χρόνο κατακράτησης για τον διαχωρισμό του ίδιου μείγματος δοκιμής σε κάθε στήλη. Τα δεδομένα αναπαραγωγιμότητας για τις στήλες PMP παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Η αναπαραγωγιμότητα της στήλης PMP συσχετίζεται καλά με πολύ χαμηλές τιμές %RSD, όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.
Διαχωρισμός μείγματος πεπτιδίων σε στήλη PMP (Β) και στήλη Ascentis Express RP-Amide (Α). κινητή φάση 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), διαστάσεις στήλης PMP (100 × 1,8 mm εσωτ. διάμ.). αναλυτικός. Η σειρά έκλουσης των ενώσεων: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) και 5 (λευκίνη) οξύ εγκεφαλίνη).
Μία στήλη PMP (100 × 1,8 mm id) αξιολογήθηκε για τον διαχωρισμό θρυπτικών προϊόντων πέψης ανθρώπινης ορολευκωματίνης σε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Το χρωματογράφημα στο Σχήμα 6 δείχνει ότι το δείγμα είναι καλά διαχωρισμένο και η διακριτική ικανότητα είναι πολύ καλή. Τα προϊόντα πέψης HSA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμό ροής 100 µL/min, κινητή φάση 70/30 ακετονιτρίλιο/νερό και 0,1% TFA. Όπως φαίνεται στο χρωματογράφημα (Σχήμα 6), η πέψη HSA έχει χωριστεί σε 17 κορυφές που αντιστοιχούν σε 17 πεπτίδια. Υπολογίστηκε η απόδοση διαχωρισμού κάθε κορυφής στο προϊόν πέψης HSA και οι τιμές δίνονται στον Πίνακα 5.
Ένα τρυπτικό προϊόν πέψης HSA (100 × 1,8 mm id) διαχωρίστηκε σε στήλη PMP. Ρυθμός ροής (100 µL/min), κινητή φάση 60/40 ακετονιτρίλιο/νερό με 0,1% TFA.
όπου L είναι το μήκος της στήλης, η είναι το ιξώδες της κινητής φάσης, ΔP είναι η αντίθλιψη της στήλης και u είναι η γραμμική ταχύτητα της κινητής φάσης. Η διαπερατότητα της στήλης PMP ήταν 2,5 × 10-14 m2, ο ρυθμός ροής ήταν 25 μL/min και χρησιμοποιήθηκε 60/40 v/v ACN/νερό. Η διαπερατότητα της στήλης PMP (100 × 1,8 mm id) ήταν παρόμοια με αυτή της προηγούμενης μελέτης μας Ref.34. Η διαπερατότητα της στήλης που είναι γεμάτη με επιφανειακά πορώδη σωματίδια είναι: 1,7 × 10-15 για σωματίδια 1,3 μm, 3,1 × 10-15 για σωματίδια 1,7 μm, 5,2 × 10-15 και 2,5 × 10-14 m2 για σωματίδια 2,6 μm Για σωματίδια 5 μm 43. Επομένως, η διαπερατότητα της φάσης PMP είναι παρόμοια με αυτή των σωματιδίων πυρήνα-κελύφους 5 μm.
όπου Wx είναι το βάρος της στήλης που είναι γεμάτη με χλωροφόρμιο, Wy είναι το βάρος της στήλης που είναι γεμάτη με μεθανόλη και ρ είναι η πυκνότητα του διαλύτη. Πυκνότητες μεθανόλης (ρ = 0,7866) και χλωροφορμίου (ρ = 1,484). Το συνολικό πορώδες των στηλών SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 και των στηλών C18-ουρίας 31 που μελετήσαμε προηγουμένως ήταν 0,63 και 0,55, αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι η παρουσία υποκαταστατών ουρίας μειώνει τη διαπερατότητα της στατικής φάσης. Από την άλλη πλευρά, το συνολικό πορώδες της στήλης PMP (100 × 1,8 mm id) είναι 0,60. Η διαπερατότητα των στηλών PMP είναι χαμηλότερη από αυτή των στηλών που είναι γεμάτες με σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με C18, επειδή στις στατικές φάσεις τύπου C18 οι υποκαταστάτες C18 συνδέονται με τα σωματίδια πυριτίας ως γραμμικές αλυσίδες, ενώ στις στατικές φάσεις τύπου πολυστυρενίου, σχηματίζεται ένα σχετικά παχύ στρώμα πολυμερούς. γύρω από αυτό. Σε ένα τυπικό πείραμα, το πορώδες της στήλης υπολογίζεται ως:
Τα Σχήματα 7Α,Β δείχνουν τη στήλη PMP (100 × 1,8 mm εσωτ.) και τη στήλη Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm εσωτ.) χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες έκλουσης (δηλαδή, 60/40 ACN/H2O και 0,1% TFA). ) του διαγράμματος van Deemter. Επιλεγμένα μείγματα πεπτιδίων (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Λευκίνη Εγκεφαλίνη) παρασκευάστηκαν σε 20 µL. Ο ελάχιστος ρυθμός ροής και για τις δύο στήλες είναι 800 µL/min. Οι ελάχιστες τιμές HETP στον βέλτιστο ρυθμό ροής (80 µL/min) για τη στήλη PMP και τη στήλη Ascentis Express RP-Amide ήταν 2,6 µm και 3,9 µm, αντίστοιχα. Οι τιμές HETP δείχνουν ότι η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP (100 × 1,8 mm id) είναι πολύ καλύτερη από την εμπορικά διαθέσιμη στήλη Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id). Το διάγραμμα van Deemter στο Σχήμα 7(A) δείχνει ότι η μείωση της τιμής N με την αυξανόμενη ροή δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας. Η υψηλότερη απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP (100 × 1,8 mm id) σε σύγκριση με τη στήλη Ascentis Express RP-Amide βασίζεται σε βελτιώσεις στο σχήμα, το μέγεθος των σωματιδίων και στις πολύπλοκες διαδικασίες συσκευασίας στήλης που χρησιμοποιούνται στην τρέχουσα εργασία34.
(Α) Διάγραμμα van Deemter (γραμμική ταχύτητα HETP έναντι κινητής φάσης) που ελήφθη χρησιμοποιώντας στήλη PMP (100 × 1,8 mm εσωτ.) σε 60/40 ACN/H2O με 0,1% TFA. (Β) Διάγραμμα van Deemter (γραμμική ταχύτητα HETP έναντι κινητής φάσης) που ελήφθη χρησιμοποιώντας στήλη Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm εσωτ.) σε 60/40 ACN/H2O με 0,1% TFA.
Μια στατική φάση από πολικό πολυστυρένιο παρασκευάστηκε και αξιολογήθηκε για τον διαχωρισμό συνθετικών πεπτιδικών μιγμάτων και προϊόντων πέψης με θρυψίνη ανθρώπινης αλβουμίνης ορού (HAS) σε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Η χρωματογραφική απόδοση των στηλών PMP για μείγματα πεπτιδίων είναι εξαιρετική στην αποτελεσματικότητα και την ανάλυση διαχωρισμού. Η βελτιωμένη απόδοση διαχωρισμού των στηλών PMP οφείλεται σε διάφορους λόγους, όπως το μέγεθος των σωματιδίων και το μέγεθος των πόρων των σωματιδίων πυριτίας, η ελεγχόμενη σύνθεση της στατικής φάσης και η σύνθετη συσκευασία της στήλης. Εκτός από την υψηλή απόδοση διαχωρισμού, η χαμηλή αντίθλιψη στήλης σε υψηλούς ρυθμούς ροής είναι ένα άλλο πλεονέκτημα αυτής της στατικής φάσης. Οι στήλες PMP παρουσιάζουν καλή αναπαραγωγιμότητα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση πεπτιδικών μιγμάτων και την πέψη με θρυψίνη διαφόρων πρωτεϊνών. Σκοπεύουμε να χρησιμοποιήσουμε αυτήν τη στήλη για τον διαχωρισμό φυσικών προϊόντων, βιοδραστικών ενώσεων από φαρμακευτικά φυτά και εκχυλισμάτων μυκήτων σε υγρή χρωματογραφία. Στο μέλλον, οι στήλες PMP θα αξιολογηθούν επίσης για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών και μονοκλωνικών αντισωμάτων.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Έρευνα σε συστήματα διαχωρισμού πεπτιδίων με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης Μέρος Ι: Ανάπτυξη πρωτοκόλλου χαρακτηρισμού στήλης. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Βελτιωμένα ενεργά πεπτίδια σχεδιασμένα για τη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Συνθετικά θεραπευτικά πεπτίδια: επιστήμη και αγορά. ανακάλυψη φαρμάκων. 15 (1-2) σήμερα, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Προηγμένη Πρωτεωμική Υγρή Χρωματογραφία. J. Χρωματογραφία. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Η προηγμένη υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας επιτρέπει την ενσωμάτωση ευρέως στοχευμένων μεταβολομικών και πρωτεωμικών. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ο ρόλος της UHPLC στην ανάπτυξη φαρμάκων. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Βασικές και πρακτικές πτυχές της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής πίεσης για ταχείς διαχωρισμούς. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Εφαρμογή υγρής χρωματογραφίας εξαιρετικά υψηλής απόδοσης στην ανάπτυξη φαρμάκων. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Μονολιθικές μακροπορώδεις υδρογέλες που παρασκευάζονται από γαλακτώματα υψηλής εσωτερικής φάσης λαδιού σε νερό για αποτελεσματικό καθαρισμό εντεροϊών. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ο ρόλος της υγρής χρωματογραφίας στην πρωτεωμική. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Αναδυόμενες τάσεις στους διαχωρισμούς θεραπευτικών πεπτιδίων και πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης: θεωρία και εφαρμογές. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Δισδιάστατος διαχωρισμός πεπτιδίων χρησιμοποιώντας σύστημα RP-RP-HPLC χρησιμοποιώντας διαφορετικές τιμές pH στην πρώτη και δεύτερη διάσταση διαχωρισμού. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Διερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά μεταφοράς μάζας και η κινητική απόδοση χρωματογραφικών στηλών υψηλής απόδοσης γεμισμένων με πλήρως και επιφανειακά πορώδη σωματίδια C18 κάτω των 2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Πρόσφατες τάσεις και αναλυτικές προκλήσεις στην απομόνωση, την ταυτοποίηση και την επικύρωση φυτικών βιοδραστικών πεπτιδίων. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Το πρωτεωμικό τοπίο του βασιλείου της ζωής. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Επεξεργασία θεραπευτικών πεπτιδίων με παρασκευαστική υγρή χρωματογραφία. Molecule (Βασιλεία, Ελβετία) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Χρωματογραφία μικτού τρόπου και η εφαρμογή της σε βιοπολυμερή. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Υποκαταστάτες για χρωματογραφία μικτής πρωτεϊνικής λειτουργίας: αρχή, χαρακτηρισμός και σχεδιασμός. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).