Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη για CSS. Για την καλύτερη εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Τα πορώδη σωματίδια πυριτίου παρασκευάστηκαν με μια μέθοδο κολλοειδούς πήγματος με ορισμένες τροποποιήσεις για τη λήψη μακροπορωδών σωματιδίων. Αυτά τα σωματίδια παραγωγοποιήθηκαν με πολυμερισμό με αναστρέψιμη προσθήκη μεταφοράς αλυσίδας κατακερματισμού (RAFT) με Ν-φαινυλομηλεϊμίδιο-μεθυλβινυλισοκυανικό (PMI) και στυρόλιο για την παρασκευή Ν-φαινυλοκαλεορειριμικής φάσης του πολυμερισμού (διαφαινυλο-βορινορμυλο) λιγότερες στήλες από χάλυβα (100 × 1,8 mm id) συσκευάστηκαν με πλήρωση πολτού. Αξιολογήθηκε ο διαχωρισμός στήλης PMP ενός μίγματος πεπτιδίων που αποτελείται από πέντε πεπτίδια (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Serphalin) και ανθρώπινη απόδοση di sero-Ile-Gly-Ser-Argin λευκωματίνη (HAS). Κάτω από βέλτιστες συνθήκες έκλουσης, ο θεωρητικός αριθμός πλακών του μίγματος πεπτιδίων είναι τόσο υψηλός όσο 280.000 πλάκες/m². Συγκρίνοντας την απόδοση διαχωρισμού της ανεπτυγμένης στήλης με την εμπορική στήλη Ascentis Express RP-Amide, παρατηρήθηκε ότι η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP ήταν ανώτερη από την εμπορική απόδοση διαχωρισμού της στήλης από άποψη διαχωρισμού διαχωρισμού της στήλης.
Τα τελευταία χρόνια, η βιοφαρμακευτική βιομηχανία έχει γίνει μια διευρυνόμενη παγκόσμια αγορά με σημαντική αύξηση του μεριδίου αγοράς. Με την εκρηκτική ανάπτυξη της βιοφαρμακευτικής βιομηχανίας1,2,3, η ανάλυση πεπτιδίων και πρωτεϊνών είναι ιδιαίτερα επιθυμητή. Εκτός από το πεπτίδιο-στόχο, δημιουργούνται αρκετές ακαθαρσίες κατά τη σύνθεση πεπτιδίων, απαιτώντας έτσι τον επιθυμητό καθαρισμό των πεπτιδίων. πρωτεΐνες σε σωματικά υγρά, ιστούς και κύτταρα είναι ένα εξαιρετικά δύσκολο έργο λόγω του μεγάλου αριθμού δυνητικά ανιχνεύσιμων ειδών σε ένα μόνο δείγμα. Αν και η φασματομετρία μάζας είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας πεπτιδίων και πρωτεϊνών, εάν τέτοια δείγματα εγχυθούν στο φασματόμετρο μάζας με ένα πέρασμα, ο διαχωρισμός δεν θα είναι ιδανικός. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να μετριαστεί αναλυτές που εισέρχονται στο φασματόμετρο μάζας σε μια δεδομένη χρονική στιγμή4,5,6.Επιπλέον, κατά τον διαχωρισμό υγρής φάσης, οι αναλυτές μπορούν να εστιαστούν σε στενές περιοχές, συγκεντρώνοντας έτσι αυτές τις αναλυόμενες ουσίες και βελτιώνοντας την ευαισθησία ανίχνευσης MS. Η υγρή χρωματογραφία (LC) έχει προχωρήσει σημαντικά την τελευταία δεκαετία και έχει γίνει μια δημοφιλής τεχνική ανάλυσης σε πρωτεΐνες7.9,9.
Η υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RP-LC) χρησιμοποιείται ευρέως για τον καθαρισμό και τον διαχωρισμό πεπτιδικών μιγμάτων χρησιμοποιώντας οκταδεκυλο-τροποποιημένο πυρίτιο (ODS) ως σταθερή φάση11,12,13. Ωστόσο, οι στατικές φάσεις RP δεν παρέχουν ικανοποιητικό διαχωρισμό των πεπτιδίων, της ειδικής δομής και των πρωτεϊνών τους λόγω της ειδικής δομής1,5 και πρωτεϊνών τους. Οι σχεδιασμένες σταθερές φάσεις απαιτούνται για την ανάλυση πεπτιδίων και πρωτεϊνών με πολικά και μη πολικά τμήματα για να αλληλεπιδράσουν και να διατηρήσουν αυτές τις αναλυόμενες ουσίες16. Η χρωματογραφία μικτού τρόπου, η οποία παρέχει πολυτροπικές αλληλεπιδράσεις, μπορεί να είναι μια εναλλακτική λύση στο RP-LC για τον διαχωρισμό πεπτιδίων, πρωτεϊνών και άλλων μιγμάτων. και διαχωρισμοί πρωτεϊνών17,18,19,20,21. Στατικές φάσεις μικτού τρόπου λειτουργίας (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, πολική παρεμβολή/RPLC) είναι κατάλληλες για διαχωρισμούς πεπτιδίων και πρωτεϊνών λόγω της παρουσίας τόσο πολικών όσο και μη πολικών ομάδων22,23,24,25,25,26,26,27, με πολική στάθμη. Οι ομάδες lar δείχνουν καλή δύναμη διαχωρισμού και μοναδική εκλεκτικότητα για πολικούς και μη πολικούς αναλύτες, καθώς ο διαχωρισμός εξαρτάται από την αλληλεπίδραση μεταξύ αναλυόμενης ουσίας και στατικής φάσης.Πολυτροπικές αλληλεπιδράσεις 29, 30, 31, 32. Πρόσφατα, οι Zhang et al.30 ετοίμασε μια στατική φάση πολυαμίνης τερματισμένης με δωδεκύλιο και διαχώρισε επιτυχώς υδρογονάνθρακες, αντικαταθλιπτικά, φλαβονοειδή, νουκλεοσίδες, οιστρογόνα και αρκετούς άλλους αναλύτες. Ο πολικός παρεμβολέας έχει τόσο πολικές όσο και μη πολικές ομάδες, επομένως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών που έχουν υδρόφοβες και υδρόφοβες στήλες (π.χ. ed C18 στήλες) διατίθενται στο εμπόριο με την εμπορική ονομασία Ascentis Express RP-Amide στήλες, αλλά αυτές οι στήλες χρησιμοποιούνται μόνο για την ανάλυση της αμίνης 33.
Στην τρέχουσα μελέτη, μια πολική-ενσωματωμένη στατική φάση (Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο-ενσωματωμένο πολυστυρόλιο) παρασκευάστηκε και αξιολογήθηκε για διαχωρισμό πεπτιδίων και χωνευμάτων θρυψίνης του HSA. Η στατική φάση παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη στρατηγική. Παρασκευάστηκαν σωματίδια πορώδους πυριτίου σύμφωνα με τη διαδικασία που δόθηκε στην προηγούμενη δημοσίευσή μας για την πολυαιθυλενιοόλη. G), TMOS, οξικό οξύ νερού προσαρμόστηκε για να παρασκευάσει σωματίδια πυριτίας με μεγάλο μέγεθος πόρων. Δεύτερον, συντέθηκε ένας νέος συνδετήρας, ισοκυανικός φαινυλομαλεϊμίδης-μεθυλβινυλεστέρας και χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγοποίηση σωματιδίων πυριτίου για την παρασκευή μιας πολικής ενσωματωμένης στατικής φάσης. Σχήμα συσκευασίας. Η πλήρωση της στήλης υποβοηθάται με μηχανικούς κραδασμούς για να διασφαλιστεί ο σχηματισμός ομοιογενούς κλίνης εντός της στήλης. Αξιολογήστε τον διαχωρισμό συσκευασμένης στήλης των πεπτιδικών μιγμάτων που αποτελούνται από πέντε πεπτίδια.(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) και τρυψίνη αφέψημα της ανθρώπινης ορού λευκωματίνης (HAS). Τόσο τα πεπτίδια όσο και οι πρωτεΐνες παρατηρήθηκε ότι ήταν καλά διαχωρισμένα και αποτελεσματικά στη στήλη PMP, η οποία ήταν πιο αποτελεσματική από τη στήλη Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Πολυαιθυλενογλυκόλη), Ουρία, Οξικό Οξύ, Ορθοπυριτικό Τριμεθοξυ (TMOS), Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο (TMCS), Τρυψίνη, Ανθρώπινη Λευκωματίνη Ορού (HSA), Χλωριούχο Αμμώνιο, Ουρία, Εξάνιο Μεθυλδισιλαζάνιο (HMDS), Μεθακρυλοϋλ-υπεροξείδιο (Mεθακρυλοϋλο-υδροξείδιο (MCS) BPO), ακετονιτρίλιο ποιότητας HPLC (ACN), μεθανόλη, 2-προπανόλη και ακετόνη που αγοράζονται από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ).
Μίγμα ουρίας (8 g), πολυαιθυλενογλυκόλης (8 g) και 8 mL 0,01 Ν οξικού οξέος αναδεύτηκε για 10 λεπτά και στη συνέχεια προστέθηκαν 24 mL TMOS υπό παγωμένες συνθήκες. Το μίγμα της αντίδρασης θερμάνθηκε στους 40°C για 6 ώρες και στη συνέχεια στους 120°C το υλικό στάθηκε αυτόματα σε νερό για 8 ώρες. ξηράνθηκε στους 70°C για 12 ώρες. Η ξηρανθείσα μαλακή μάζα αλέστηκε λεία σε φούρνο και πυρώθηκε στους 550°C για 12 ώρες. Τρεις παρτίδες παρασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν για να εξεταστεί η αναπαραγωγιμότητα στο μέγεθος σωματιδίων, το μέγεθος των πόρων και την επιφάνεια.
Με επιφανειακή τροποποίηση σωματιδίων πυριτίας με προσυντεθειμένο συνδετήρα φαινυλομηλεϊμίδιο-μεθυλβινυλισοκυανικό (PCMP) που ακολουθείται από ακτινωτό πολυμερισμό με στυρόλιο, παρασκευάστηκε μια ένωση που περιέχει πολική ομάδα.Στατική φάση για αδρανή και αλυσίδες πολυστυρενίου. Η διαδικασία παρασκευής περιγράφεται παρακάτω.
Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο (200 mg) και ισοκυανικός μεθυλ-βινυλεστέρας (100 mg) διαλύθηκαν σε ξηρό τολουόλιο και 0,1 ml 2,2'-αζοϊσοβουτυρονιτριλίου (ΑΙΒΝ) προστέθηκαν στη φιάλη αντίδρασης για να παρασκευαστεί φαινυλομηλεϊμίδιο-μεθυλ βινυλικό μίγμα (διηθήθηκε το μίγμα ισοκυανικού μεθυλεστέρα σε 6°C, το μίγμα διηθήθηκε σε 30°C συν-κυανιούχο εστέρα). στεγνώνει σε φούρνο στους 40°C για 3 ώρες.
Ξηρά σωματίδια πυριτίας (2 g) διασκορπίστηκαν σε ξηρό τολουόλιο (100 mL), αναδεύτηκαν και υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε φιάλη 500 mL με στρογγυλό πυθμένα για 10 λεπτά. PMCP (10 mg) διαλύθηκε σε τολουόλιο και προστέθηκε στάγδην στη φιάλη αντίδρασης μέσω σταγονομετρικής χοάνης. 60°C για 3 ώρες. Στη συνέχεια, σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με PMCP (100 g) διαλύθηκαν σε τολουόλιο (200 ml) και προστέθηκε 4-υδροξυ-TEMPO (2 mL) παρουσία 100 μL διλαυρικού διβουτυλκασσιτέρου ως καταλύτης. Το μίγμα αναδεύτηκε στους 5°C στους 5°C και αναδεύτηκε στους 5°C για 3°C. .
Στυρένιο (1 mL), υπεροξείδιο του βενζοϋλίου BPO (0,5 mL) και σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με TEMPO-PMCP (1,5 g) διασκορπίστηκαν σε τολουόλιο και καθαρίστηκαν με άζωτο. Ο πολυμερισμός του στυρολίου πραγματοποιήθηκε στους 100°C για 12 ώρες. το me φαίνεται στο σχήμα 1.
Τα δείγματα απαερώθηκαν στους 393 Κ για 1 ώρα για να ληφθεί μια υπολειμματική πίεση μικρότερη από 10-3 Torr. Η ποσότητα του Ν2 που προσροφήθηκε σε σχετική πίεση P/P0 = 0,99 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του συνολικού όγκου πόρων. Αποξηραμένα δείγματα (γυμνό πυρίτιο και σωματίδια διοξειδίου του πυριτίου συνδεδεμένα με πρόσδεμα) τοποθετήθηκαν σε στήλη αλουμινίου χρησιμοποιώντας κολλητική ταινία άνθρακα. Επιστρώθηκε χρυσός στα δείγματα χρησιμοποιώντας επικάλυψη διασκορπισμού Q150T και ένα στρώμα Au 5 nm εναποτέθηκε στα δείγματα. ham, MA, USA) Flash EA1112 στοιχειακός αναλυτής χρησιμοποιήθηκε για στοιχειακή ανάλυση. Ένας αναλυτής μεγέθους σωματιδίων Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η κατανομή μεγέθους σωματιδίων. Γυμνά σωματίδια πυριτίου και σωματίδια διοξειδίου του πυριτίου συνδεδεμένα με συνδέτη (5 mg το καθένα) διασπείρονται mL για 0,5 mg, διασπείρονται 5 mg min, και τοποθετήθηκε στον οπτικό πάγκο του Mastersizer. Η θερμοβαρυμετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ρυθμό 5 °C ανά λεπτό σε ένα εύρος θερμοκρασίας από 30 έως 800 °C.
Στήλες στενής οπής από ανοξείδωτο χάλυβα με επένδυση υάλου διαστάσεων (100 × 1,8 mm id) συσκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συσκευασίας πολτού, εφαρμόζοντας την ίδια διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε στην Αναφ.31. Μια στήλη από ανοξείδωτο χάλυβα (με γυάλινη επένδυση, 100 × 1,8 mm id) με εξάρτημα εξόδου που περιείχε φριτάκι 1 μm συνδέθηκε σε συσκευαστή πολτού (Alltech Deerfield, IL, ΗΠΑ). χρησιμοποιείται ως διαλύτης πολτού καθώς και ως προωθητικός διαλύτης. Γεμίστε τη στήλη διαδοχικά εφαρμόζοντας πιέσεις 100 MP για 10 λεπτά, 80 MP για 15 λεπτά και 60 MP για 30 λεπτά. συσκευάστε και απελευθερώστε την πίεση αργά για να αποφύγετε οποιαδήποτε ζημιά μέσα στη στήλη. Αποσυνδέστε τη στήλη από τη μονάδα συσκευασίας πολτού και συνδέστε ένα άλλο εξάρτημα στην είσοδο και στο σύστημα LC για να ελέγξετε την απόδοσή του.
Κατασκευάστηκε αντλία LC (10AD Shimadzu, Ιαπωνία), εγχυτήρας (Valco (ΗΠΑ) C14 W.05) με βρόχο έγχυσης 50nL, απαερωτή μεμβράνης (Shimadzu DGU-14A), τριχοειδές παράθυρο UV-VIS. Μετά τη συσκευασία, εγκαταστάθηκαν τριχοειδή αγγεία (50 μm id 365 και αναγωγικά τριχοειδή ένωσης (50 μm) στην έξοδο 1/16″ της αναγωγικής ένωσης. Η συλλογή δεδομένων και η χρωματογραφική επεξεργασία έγιναν χρησιμοποιώντας Multichro 2000. Η παρακολούθηση έγινε με το λογισμικό 254V απορροφήση δεδομένων Ch. inPro8 (Northampton, MA).
Λευκωματίνη από ανθρώπινο ορό, λυοφιλοποιημένη σκόνη, ≥ 96% (ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης) 3 mg αναμεμειγμένη με θρυψίνη (1,5 mg), 4,0 Μ ουρία (1 mL) και 0,2 Μ διττανθρακικό αμμώνιο (1 mL). 0,1% TFA. Διηθήστε το διάλυμα και φυλάξτε σε θερμοκρασία κάτω των 4 °C.
Ο διαχωρισμός των πεπτιδικών μιγμάτων και των χωνευμάτων θρυψίνης HSA αξιολογήθηκαν ξεχωριστά σε στήλες PMP. Ελέγξτε τον διαχωρισμό του μίγματος πεπτιδίων και της πέψης θρυψίνης του HSA από τη στήλη PMP και συγκρίνετε τα αποτελέσματα με τη στήλη Ascentis Express RP-Amide. Ο θεωρητικός αριθμός πλάκας υπολογίζεται ως εξής:
Εικόνες SEM γυμνών σωματιδίων διοξειδίου του πυριτίου και σωματιδίων διοξειδίου του πυριτίου που συνδέονται με συνδέτη φαίνονται στο ΣΧ.2 .Εικόνες SEM γυμνών σωματιδίων πυριτίου (A, B) δείχνουν ότι, σε αντίθεση με τις προηγούμενες μελέτες μας, αυτά τα σωματίδια είναι σφαιρικά στα οποία τα σωματίδια είναι επιμήκη ή έχουν ακανόνιστη συμμετρία. Η επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίου που συνδέονται με συνδέτη (C, D) είναι πιο λεία από αυτή των γυμνών σωματιδίων πυριτίου σωματίδια.
Εικόνες σάρωσης με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο γυμνών σωματιδίων πυριτίου (Α, Β) και σωματιδίων πυριτίου συνδεδεμένου με συνδετήρα (C, D).
Οι κατανομές μεγέθους σωματιδίων των γυμνών σωματιδίων πυριτίου και των σωματιδίων πυριτίου που συνδέονται με συνδέτη φαίνονται στο Σχήμα 3(Α). Οι καμπύλες κατανομής μεγέθους σωματιδίων με βάση τον όγκο έδειξαν ότι το μέγεθος των σωματιδίων πυριτίου αυξήθηκε μετά τη χημική τροποποίηση (Εικ. 3Α). (0,5), της PMP είναι 3,36 μm, σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας με τιμή ad(0,5) 3,05 μm (σωματίδια διοξειδίου του πυριτίου συνδεδεμένα με πολυστυρένιο)34. Αυτή η παρτίδα είχε στενότερη κατανομή μεγέθους σωματιδίων σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας λόγω των μεταβαλλόμενων αναλογιών PEG, ουρίας, σωματιδίου PEG που είναι ελαφρώς μεγαλύτερο από το μέγεθος της αντίδρασης σε πολυστυρένιο και ακμή. Φάση σωματιδίων διοξειδίου του πυριτίου που μελετήσαμε προηγουμένως. Αυτό σημαίνει ότι η επιφανειακή λειτουργικότητα των σωματιδίων πυριτίου με στυρόλιο εναπόθεσε μόνο ένα στρώμα πολυστυρενίου (0,97 μm) στην επιφάνεια του πυριτίου, ενώ στη φάση PMP το πάχος του στρώματος ήταν 1,38 μm.
Κατανομή μεγέθους σωματιδίων (Α) και κατανομή μεγέθους πόρων (Β) σωματιδίων γυμνού πυριτίου και σωματιδίων πυριτίου συνδεδεμένου με συνδετήρα.
Το μέγεθος πόρων, ο όγκος πόρων και το εμβαδόν επιφάνειας των σωματιδίων πυριτίου της τρέχουσας μελέτης δίνονται στον Πίνακα 1(Β). Τα προφίλ PSD των γυμνών σωματιδίων πυριτίου και των σωματιδίων διοξειδίου του πυριτίου που συνδέονται με συνδετήρα φαίνονται στο Σχήμα 3(Β). Τα αποτελέσματα είναι συγκρίσιμα με την προηγούμενη μελέτη μας. υποδεικνύει ότι το μέγεθος πόρων μειώνεται κατά 69 μετά τη χημική τροποποίηση, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1(Β), και η αλλαγή της καμπύλης φαίνεται στο Σχήμα 3(Β). Ομοίως, ο όγκος πόρων των σωματιδίων πυριτίου μειώθηκε από 0,67 σε 0,58 cm3/g μετά από χημική τροποποίηση. μελέτη (124 m2/g). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1(Β), η επιφάνεια (m2/g) των σωματιδίων πυριτίου μειώθηκε επίσης από 116 m2/g σε 105 m2/g μετά από χημική τροποποίηση.
Τα αποτελέσματα της στοιχειακής ανάλυσης της στατικής φάσης φαίνονται στον Πίνακα 2. Η φόρτωση άνθρακα της τρέχουσας στατικής φάσης είναι 6,35%, που είναι χαμηλότερη από τη φόρτωση άνθρακα της προηγούμενης μελέτης μας (σωματίδια πυριτίου με δεσμό πολυστυρενίου, 7,93%35 και 10,21%, αντίστοιχα) 42. δεν χρησιμοποιήθηκαν ορισμένοι πολικοί συνδέτες όπως το φαινυλομηλεϊμίδιο-μεθυλβινυλοϊσοκυανικό (PCMP) και το 4-υδροξυ-TEMPO. Το ποσοστό βάρους αζώτου της τρέχουσας στατικής φάσης είναι 2,21%, σε σύγκριση με 0,1735 και 0,85% κατά βάρος αζώτου σε προηγούμενες μελέτες, αντίστοιχα. Ομοίως, τα φορτία άνθρακα των προϊόντων (4) και (5) ήταν 2,7% και 2,9%, αντίστοιχα, ενώ η φόρτωση άνθρακα του τελικού προϊόντος (6) ήταν 6,35%, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Η απώλεια βάρους ελέγχθηκε με σταθερή φάση PMP, και η καμπύλη TGA φαίνεται στο Σχήμα 4. Η καμπύλη απώλειας βάρους 6 δείχνει καλή συμφωνία με την καμπύλη TGA 6. 35%) επειδή οι συνδέτες περιέχουν όχι μόνο C αλλά και Ν, Ο και Η.
Ο συνδέτης φαινυλομαλεϊμιδίου-μεθυλοβινυλοϊσοκυανικού επιλέχθηκε για τροποποίηση της επιφάνειας των σωματιδίων πυριτίου επειδή έχει πολικές ομάδες φαινυλομηλεϊμιδίου και βινυλοϊσοκυανικές ομάδες. Οι ομάδες ισοκυανικού βινυλεστέρα μπορούν περαιτέρω να αντιδράσουν με το στυρένιο μέσω πολυμερισμού ζωντανών ριζών. Ο δεύτερος λόγος είναι να εισαχθεί μια ομάδα που έχει μια ισχυρή αλληλοδιαλυτική φάση και την μη αναλυτική φάση. , δεδομένου ότι το τμήμα φαινυλομαλεϊμιδίου δεν έχει εικονικό φορτίο σε κανονικό pH. Η πολικότητα της στατικής φάσης μπορεί να ελεγχθεί από τη βέλτιστη ποσότητα στυρενίου και τον χρόνο αντίδρασης του πολυμερισμού ελεύθερων ριζών. Το τελευταίο βήμα της αντίδρασης (πολυμερισμός ελεύθερων ριζών) είναι κρίσιμο και μπορεί να αλλάξει την πολικότητα της στατικής φάσης. και ο χρόνος αντίδρασης αύξησε τη φόρτωση άνθρακα της στατικής φάσης και αντίστροφα. Τα SP που παρασκευάζονται με διαφορετικές συγκεντρώσεις στυρενίου έχουν διαφορετικά φορτία άνθρακα. Και πάλι, φορτώστε αυτές τις στατικές φάσεις σε στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα και ελέγξτε τη χρωματογραφική τους απόδοση (επιλεκτικότητα, ανάλυση, τιμή Ν, κ.λπ.).
Πέντε μίγματα πεπτιδίων (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, λευκίνη εγκεφαλίνη) αξιολογήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας μια στήλη PMP χρησιμοποιώντας μια κινητή φάση.60/40 (v/v) ακετονιτρίλιο/νερό (0,1% TFA) με ρυθμό ροής 80 μL/min. Κάτω από βέλτιστες συνθήκες έκλουσης, ο θεωρητικός αριθμός πλακών (N) ανά στήλη (100 × 1,8 mm id) είναι 20.000 ± 100 (200,000 πλάκες N) για τις στήλες (200,000 T). Τα χρωματογραφήματα φαίνονται στο Σχήμα 5Α. Γρήγορη ανάλυση σε στήλη PMP με υψηλή ταχύτητα ροής (700 μL/min), εκλούστηκαν πέντε πεπτίδια εντός ενός λεπτού, οι τιμές N ήταν πολύ καλές, 13.500 ± 330 ανά στήλη (100 × 1.8 mm ταυτόσημο μέγεθος), Αντιστοιχεί σε 00hree πλάκας 135. (100 × 1,8 mm id) συσκευάστηκαν με τρεις διαφορετικές παρτίδες σταθερής φάσης PMP για έλεγχο της αναπαραγωγιμότητας. Η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας για κάθε στήλη καταγράφηκε χρησιμοποιώντας τις βέλτιστες συνθήκες έκλουσης και τον αριθμό των θεωρητικών πλακών N και χρόνο συγκράτησης για τον διαχωρισμό του ίδιου μείγματος δοκιμής σε κάθε στήλη. στον Πίνακα 3.
Διαχωρισμός του μίγματος πεπτιδίων σε στήλη PMP (Β) και Ascentis Express RP-Amide στήλη (Α).κινητή φάση 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), διαστάσεις στήλης PMP (100 × 1,8 mm id).αναλυτική Η σειρά έκλουσης των ενώσεων: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) και 5 (λευκίνη) όξινη εγκεφαλίνη)).
Μια στήλη PMP (100 × 1,8 mm id) αξιολογήθηκε για διαχωρισμό τρυπτικών υπολειμμάτων της ανθρώπινης λευκωματίνης ορού σε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Το χρωματογράφημα στο Σχήμα 6 δείχνει ότι το δείγμα είναι καλά διαχωρισμένο και η ανάλυση είναι πολύ καλή. Οι πέψεις HSA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμό ροής 100 μL φάσης κινητού και 70 μL. .Όπως φαίνεται στο χρωματογράφημα (Εικόνα 6), η πέψη HSA έχει χωριστεί σε 17 κορυφές που αντιστοιχούν σε 17 πεπτίδια. Υπολογίστηκε η αποτελεσματικότητα διαχωρισμού κάθε κορυφής στην πέψη HSA και οι τιμές δίνονται στον Πίνακα 5.
Μια τρυπτική πέψη HSA (100 x 1,8 mm id) διαχωρίστηκε σε μια στήλη PMP.ρυθμός ροής (100 μL/min), κινητή φάση 60/40 ακετονιτρίλιο/νερό με 0,1% TFA.
όπου L είναι το μήκος της στήλης, η είναι το ιξώδες της κινητής φάσης, ΔP είναι η αντίθλιψη της στήλης και u είναι η γραμμική ταχύτητα της κινητής φάσης. Η διαπερατότητα της στήλης PMP ήταν 2,5 × 10-14 m2, ο ρυθμός ροής ήταν 25 μL/min και 60/40 v/v ACN × χρησιμοποιήθηκε η ικανότητα 1 mm. ήταν παρόμοια με αυτή της προηγούμενης μελέτης μας Αναφ. 34. Η διαπερατότητα της στήλης γεμάτη με επιφανειακά πορώδη σωματίδια είναι: 1,7 × 10-15 για σωματίδια 1,3 μm, 3,1 × 10-15 για σωματίδια 1,7 μm, 5,2 × 10-5 μm σωματίδια, 5,2 × 10-5 × 15 μm και 2 μm m σωματίδια 43. Επομένως, η διαπερατότητα της φάσης PMP είναι παρόμοια με αυτή των σωματιδίων πυρήνα-κελύφους 5 μm.
όπου Wx είναι το βάρος της στήλης με χλωροφόρμιο, Wy είναι το βάρος της στήλης με μεθανόλη και ρ είναι η πυκνότητα του διαλύτη. Πυκνότητες μεθανόλης (ρ = 0,7866) και χλωροφορμίου (ρ = 1,484). Το συνολικό πορώδες του SILICA × 08 στήλης Οι στήλες C18-ουρίας 31 που μελετήσαμε προηγουμένως ήταν 0,63 και 0,55, αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι η παρουσία προσδεμάτων ουρίας μειώνει τη διαπερατότητα της στατικής φάσης. Από την άλλη πλευρά, το συνολικό πορώδες της στήλης PMP (100 × 1,8 χιλιοστά id) είναι 0,60 η ικανότητα του 1 στηλών να είναι μικρότερη από τη συσκευασία της στήλης C1. ένα σωματίδιο γιατί σε στατικές φάσεις τύπου C18 οι συνδέτες C18 συνδέονται με τα σωματίδια πυριτίας ως γραμμικές αλυσίδες, ενώ σε στατικές φάσεις τύπου πολυστυρενίου σχηματίζεται γύρω από αυτό το ένα σχετικά παχύ στρώμα πολυμερούς. Σε ένα τυπικό πείραμα, το πορώδες της στήλης υπολογίζεται ως:
Το Σχήμα 7Α, Β δείχνει τη στήλη PMP (100 × 1,8 mm id) και τη στήλη Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες έκλουσης (δηλ. 60/40 ACN/H2O και 0,1% TFA).) του οικοπέδου van Deemter.Επιλεγμένα μείγματα πεπτιδίων (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Λευκίνη Εγκεφαλίνη) παρασκευάστηκαν σε 20 µL/ Ο ελάχιστος ρυθμός ροής και για τις δύο στήλες είναι 800 μL/λεπτό. Οι ελάχιστες τιμές HETPum για τη στήλη Optim 0 για την ταχύτητα ροής/λεπτό Η στήλη RP-Amide ήταν 2,6 μm και 3,9 μm, αντίστοιχα. Οι τιμές HETP υποδεικνύουν ότι η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP (100 × 1,8 mm id) είναι πολύ καλύτερη από τη στήλη Ascentis Express RP-Amide που διατίθεται στο εμπόριο (100 × 1,8 Demflow στη στήλη N) (Η τιμή vanA μειώνεται κατά 7 με μεγαλύτερη γραφική παράσταση). δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας. Η υψηλότερη απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP (100 × 1,8 mm id) σε σύγκριση με τη στήλη Ascentis Express RP-Amide βασίζεται σε βελτιώσεις στο σχήμα σωματιδίων, το μέγεθος και τις πολύπλοκες διαδικασίες πλήρωσης στηλών που χρησιμοποιούνται στην τρέχουσα εργασία34.
(Α) διάγραμμα van Deemter (HETP έναντι γραμμικής ταχύτητας κινητής φάσης) που λήφθηκε χρησιμοποιώντας στήλη PMP (100 × 1,8 mm id) σε 60/40 ACN/H2O με 0,1% TFA. ACN/H2O με 0,1% TFA.
Παρασκευάστηκε μια σταθερή φάση πολυστυρενίου με πολικό ενσωματωμένο και αξιολογήθηκε για διαχωρισμό μιγμάτων συνθετικών πεπτιδίων και πέψεων θρυψίνης της ανθρώπινης λευκωματίνης ορού (HAS) σε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Η χρωματογραφική απόδοση των στηλών PMP για μίγματα πεπτιδίων είναι εξαιρετική σε απόδοση διαχωρισμού και ανάλυση. των σωματιδίων πυριτίας, ελεγχόμενη σύνθεση της στατικής φάσης και σύνθετη πλήρωση στήλης. Εκτός από την υψηλή απόδοση διαχωρισμού, η χαμηλή αντίθλιψη στήλης σε υψηλούς ρυθμούς ροής είναι ένα άλλο πλεονέκτημα αυτής της στατικής φάσης. φυτά και εκχυλίσματα μυκήτων σε υγρή χρωματογραφία. Στο μέλλον, οι στήλες PMP θα αξιολογούνται επίσης για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών και μονοκλωνικών αντισωμάτων.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Research on Peptide Separation Systems by Reversed Phase Chromatography Μέρος Ι: Ανάπτυξη ενός Πρωτοκόλλου Χαρακτηρισμού Στήλων.J.Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Βελτιωμένα ενεργά πεπτίδια σχεδιασμένα για τη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: Science and the market.drug discovery.15 (1-2) today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.2009).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Υ. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J.Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Η προηγμένη υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας επιτρέπει την ενσωμάτωση ευρέως στοχευμένων μεταβολομικών και proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ο ρόλος του UHPLC στην ανάπτυξη φαρμάκων.J.Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Θεμελιώδεις και πρακτικές πτυχές της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής πίεσης για ταχείς διαχωρισμούς.J.Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Application of ultra-high performance liquid chromatography in drug development.J.Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, Η. et al. Μονολιθικές μακροπορώδεις υδρογέλες παρασκευασμένες από γαλακτώματα υψηλής εσωτερικής φάσης λάδι-σε-νερό για αποτελεσματικό καθαρισμό εντεροϊών. Chemical.Βριτανία.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ο ρόλος της υγρής χρωματογραφίας στην πρωτεομική. J.Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Αναδυόμενες τάσεις σε διαχωρισμούς υγρής χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης θεραπευτικών πεπτιδίων και πρωτεϊνών: θεωρία και εφαρμογές.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Δισδιάστατος διαχωρισμός πεπτιδίων με χρήση συστήματος RP-RP-HPLC χρησιμοποιώντας διαφορετικές τιμές pH στην πρώτη και τη δεύτερη διάσταση διαχωρισμού.J.Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Διερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά μεταφοράς μάζας και η κινητική απόδοση χρωματογραφικών στηλών υψηλής απόδοσης γεμάτες με πλήρως και επιφανειακά πορώδη σωματίδια C18 κάτω των 2 μm. J.Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Πρόσφατες τάσεις και αναλυτικές προκλήσεις στην απομόνωση, ταυτοποίηση και επικύρωση φυτικών βιοδραστικών πεπτιδίων.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s018x108.
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the kingdom of life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Downstream processing of therapeutic peptides by preparative liquid chromatography. Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Χρωματογραφία μικτού τρόπου και η εφαρμογή της σε βιοπολυμερή. J.Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands for mixed-mode protein chromatography: αρχή, χαρακτηρισμός και σχεδιασμός.J.Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).