Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Εμφανίζει ένα καρουζέλ τριών διαφανειών ταυτόχρονα. Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά Προηγούμενο και Επόμενο για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά ή χρησιμοποιήστε τα κουμπιά ρυθμιστικού στο τέλος για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά.
Πορώδη σωματίδια πυριτίας παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο sol-gel με κάποιες τροποποιήσεις για να ληφθούν σωματίδια με ευρείς πόρους. Αυτά τα σωματίδια παραγωγοποιήθηκαν με Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο-ισοκυανικό μεθυλοβινύλιο (PMI) και στυρένιο μέσω πολυμερισμού αντίστροφης μεταφοράς αλυσίδας-θραυσματοποίησης (RAFT) για την παραγωγή πολυαμιδίων με παρεμβολή Ν-φαινυλομαλεϊμιδίου. Στατική φάση στυρενίου (PMP). Στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα στενής διαμέτρου (εσωτερική διάμετρος 100 × 1,8 mm) γεμίστηκαν με ένα γέμισμα πολτού. Η χρωματογραφική απόδοση της στήλης PMP αξιολογήθηκε για τον διαχωρισμό ενός μείγματος συνθετικών πεπτιδίων που αποτελείται από πέντε πεπτίδια (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, αμινοξύ Leu εγκεφαλίνη) και τρυπτικό υδρόλυμα λευκωματίνης ανθρώπινου ορού (HAS). Υπό βέλτιστες συνθήκες έκλουσης, ο θεωρητικός αριθμός πλακών με μείγμα πεπτιδίων έφτασε τις 280.000 πλάκες/τ.μ. Συγκρίνοντας την απόδοση διαχωρισμού της αναπτυγμένης στήλης με την εμπορική στήλη Ascentis Express RP-Amide, παρατηρήθηκε ότι η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP ήταν ανώτερη από την εμπορική στήλη όσον αφορά την απόδοση διαχωρισμού και την ανάλυση.
Η βιοφαρμακευτική βιομηχανία έχει γίνει μια αναπτυσσόμενη παγκόσμια αγορά με σημαντική αύξηση του μεριδίου αγοράς τα τελευταία χρόνια. Με την εκρηκτική ανάπτυξη της βιοφαρμακευτικής βιομηχανίας1,2,3 υπάρχει μεγάλη ανάγκη για ανάλυση πεπτιδίων και πρωτεϊνών. Εκτός από το πεπτίδιο-στόχο, σχηματίζονται διάφορες ακαθαρσίες κατά τη σύνθεση πεπτιδίων, επομένως απαιτείται χρωματογραφικός καθαρισμός για την επίτευξη της επιθυμητής καθαρότητας του πεπτιδίου. Η ανάλυση και ο χαρακτηρισμός πρωτεϊνών σε σωματικά υγρά, ιστούς και κύτταρα είναι ένα εξαιρετικά δύσκολο έργο λόγω του μεγάλου αριθμού δυνητικά ανιχνεύσιμων ειδών που υπάρχουν σε ένα μόνο δείγμα. Αν και η φασματομετρία μάζας είναι ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την αλληλούχιση πεπτιδίων και πρωτεϊνών, εάν τέτοια δείγματα εισάγονται απευθείας στον φασματόμετρο μάζας, ο διαχωρισμός δεν θα είναι ικανοποιητικός. Αυτό το πρόβλημα μπορεί να λυθεί με την εκτέλεση υγρής χρωματογραφίας (LC) πριν από την ανάλυση MS, η οποία θα μειώσει την ποσότητα των αναλυτών που εισέρχονται στον φασματόμετρο μάζας σε μια δεδομένη χρονική στιγμή4,5,6. Επιπλέον, οι αναλυτές μπορούν να συγκεντρωθούν σε μια στενή περιοχή κατά τον διαχωρισμό υγρής φάσης, συγκεντρώνοντας έτσι αυτούς τους αναλυτές και αυξάνοντας την ευαισθησία της ανίχνευσης MS. Η υγρή χρωματογραφία (LC) έχει εξελιχθεί σημαντικά την τελευταία δεκαετία και έχει γίνει μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την πρωτεωμική ανάλυση7,8,9,10.
Η υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RP-LC) χρησιμοποιείται ευρέως για τον καθαρισμό και τον διαχωρισμό μειγμάτων πεπτιδίων χρησιμοποιώντας τροποποιημένο με οκταδεκυλικό διοξείδιο του πυριτίου (ODS) ως στατική φάση11,12,13. Ωστόσο, λόγω της πολύπλοκης δομής και της αμφοτερικής τους φύσης,14,15 οι στατικές φάσεις RP δεν μπορούν να παρέχουν ικανοποιητικό διαχωρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών. Επομένως, η ανάλυση πεπτιδίων και πρωτεϊνών με πολικά και μη πολικά θραύσματα απαιτεί ειδικά σχεδιασμένες στατικές φάσεις για να αλληλεπιδρούν και να συγκρατούν αυτούς τους αναλυτές16. Η μικτή χρωματογραφία, η οποία προσφέρει πολυτροπικές αλληλεπιδράσεις, μπορεί να αποτελέσει μια εναλλακτική λύση στην RP-LC για τον διαχωρισμό πεπτιδίων, πρωτεϊνών και άλλων σύνθετων μειγμάτων. Παρασκευάστηκαν αρκετές στατικές φάσεις μικτού τύπου και χρησιμοποιήθηκαν στήλες γεμάτες με αυτές τις στατικές φάσεις για τον διαχωρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών17,18,19,20,21. Λόγω της παρουσίας πολικών και μη πολικών ομάδων, οι μικτής λειτουργίας στατικές φάσεις (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, πολική παρεμβολή/RPLC) είναι κατάλληλες για τον διαχωρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών22,23,24,25,26,27,28. , οι πολικές παρεμβαλλόμενες στατικές φάσεις με ομοιοπολικά συνδεδεμένες πολικές ομάδες παρουσιάζουν καλές δυνατότητες διαχωρισμού και μοναδική επιλεκτικότητα για πολικούς και μη πολικούς αναλυτές, επειδή ο διαχωρισμός εξαρτάται από την αλληλεπίδραση μεταξύ του αναλύτη και της στατικής φάσης. Πολυτροπικές αλληλεπιδράσεις29,30,31,32. Πρόσφατα, οι Zhang et al. 30 έλαβαν στατικές φάσεις πολυαμινών με τερματισμό βεχενυλίου και διαχώρισαν με επιτυχία υδρογονάνθρακες, αντικαταθλιπτικά, φλαβονοειδή, νουκλεοσίδια, οιστρογόνα και ορισμένους άλλους αναλυτές. Το πολικά ενσωματωμένο στατικό υλικό έχει τόσο πολικές όσο και μη πολικές ομάδες, επομένως μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό πεπτιδίων και πρωτεϊνών σε υδρόφοβα και υδρόφιλα μέρη. Οι πολικές εν σειρά στήλες (π.χ. στήλες C18 με εν σειρά αμίδιο) διατίθενται με την εμπορική ονομασία στήλες Ascentis Express RP-Amide, αλλά αυτές οι στήλες έχουν χρησιμοποιηθεί μόνο για την ανάλυση της αμίνης 33.
Στην παρούσα μελέτη, παρασκευάστηκε και αξιολογήθηκε μια πολική στατική φάση ενσωμάτωσης (Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο, πολυστυρένιο ενσωμάτωσης) για τον διαχωρισμό πεπτιδίων και την διάσπαση τρυπτικής HSA. Η ακόλουθη στρατηγική χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή της στατικής φάσης. Πορώδη σωματίδια πυριτίας παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφονται στις προηγούμενες δημοσιεύσεις μας, με κάποιες αλλαγές στα σχήματα παρασκευής 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Οι αναλογίες ουρίας, πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), TMOS και υδατικού οξικού οξέος προσαρμόστηκαν για να ληφθούν σωματίδια πυριτίας με μεγάλα μεγέθη πόρων. Δεύτερον, συντέθηκε ένας νέος υποκαταστάτης φαινυλομαλεϊμιδίου-μεθυλοβινυλ ισοκυανικού εστέρα και τα παράγωγα σωματίδια πυριτίας του χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή πολικών ενσωματωμένων στατικών φάσεων. Η ληφθείσα στατική φάση συσκευάστηκε σε μια στήλη από ανοξείδωτο χάλυβα (εσωτερική διάμετρος 100 × 1,8 mm) σύμφωνα με ένα βελτιστοποιημένο σχήμα συσκευασίας. Η συσκευασία της στήλης υποβοηθείται από μηχανικούς κραδασμούς για να εξασφαλιστεί ένα ομοιόμορφο στρώμα μέσα στη στήλη. Η συσκευασμένη στήλη αξιολογήθηκε για τον διαχωρισμό ενός μείγματος πεπτιδίων που αποτελείται από πέντε πεπτίδια (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, πεπτίδιο λευκίνης-εγκεφαλίνης) και τρυπτικών υδρολυμάτων ανθρώπινης αλβουμίνης ορού (HSA). Παρατηρήθηκε ότι το μείγμα πεπτιδίων και το τρυπτικό προϊόν πέψης HSA διαχωρίστηκαν με καλή διακριτική ικανότητα και αποτελεσματικότητα. Η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP συγκρίθηκε με αυτή της στήλης Ascentis Express RP-Amide. Παρατηρήθηκε ότι τα πεπτίδια και οι πρωτεΐνες έχουν καλή διακριτική ικανότητα και υψηλή απόδοση διαχωρισμού στη στήλη PMP, και η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP είναι υψηλότερη από αυτή της στήλης Ascentis Express RP-Amide.
PEG (πολυαιθυλενογλυκόλη), ουρία, οξικό οξύ, τριμεθοξυορθοπυριτικό άλας (TMOS), τριμεθυλοχλωροσιλάνιο (TMCS), θρυψίνη, ανθρώπινη ορολευκωματίνη (HSA), χλωριούχο αμμώνιο, ουρία, εξαμεθυλομεθακρυλοϋλσιλαζάνιο (HMDS), μεθακρυλοϋλοχλωρίδιο (MC), στυρένιο, 4-υδροξυ-TEMPO, υπεροξείδιο του βενζοϋλίου (BPO), ακετονιτρίλιο (ACN) για HPLC, μεθανόλη, 2-προπανόλη και ακετόνη. Sigma-Aldrich Company (Σεντ Λούις, Μιζούρι, ΗΠΑ).
Ένα μείγμα ουρίας (8 g), πολυαιθυλενογλυκόλης (8 g) και 8 ml 0,01 N οξικού οξέος αναδεύτηκε για 10 λεπτά και προστέθηκαν 24 ml TMOS υπό ψύξη με πάγο. Το μείγμα αντίδρασης θερμάνθηκε στους 40°C για 6 ώρες και στη συνέχεια στους 120°C για 8 ώρες σε αυτόκλειστο από ανοξείδωτο χάλυβα. Το νερό αποχύθηκε και το υπόλειμμα ξηράνθηκε στους 70°C για 12 ώρες. Τα αποξηραμένα μαλακά μπλοκ αλέστηκαν ομαλά και φρύχθηκαν σε φούρνο στους 550°C για 12 ώρες. Παρασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν τρεις παρτίδες για να ελεγχθεί η αναπαραγωγιμότητα των μεγεθών των σωματιδίων, του μεγέθους των πόρων και της επιφάνειας.
Πολική ομάδα και στατική φάση για αλυσίδες πολυστυρενίου. Η διαδικασία παρασκευής περιγράφεται παρακάτω.
Ν-φαινυλομαλεϊμίδιο (200 mg) και ισοκυανικό μεθυλοβινύλιο (100 mg) διαλύθηκαν σε άνυδρο τολουόλιο και στη συνέχεια προστέθηκαν 0,1 ml 2,2′-αζοϊσοβουτυρονιτριλίου (AIBN) στη φιάλη αντίδρασης για να ληφθεί ένα συμπολυμερές φαινυλομαλεϊμιδίου και ισοκυανικού μεθυλοβινυλίου (PMCP). Το μείγμα θερμάνθηκε στους 60°C για 3 ώρες, διηθήθηκε και ξηράνθηκε σε φούρνο στους 40°C για 3 ώρες.
Αποξηραμένα σωματίδια πυριτίας (2 g) διασκορπίστηκαν σε ξηρό τολουόλιο (100 ml), αναδεύτηκαν και υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά σε σφαιρική φιάλη των 500 ml. Το PMCP (10 mg) διαλύθηκε σε τολουόλιο και προστέθηκε στάγδην στη φιάλη αντίδρασης μέσω χωνιού προσθήκης. Το μείγμα θερμάνθηκε με κάθετο ψυκτήρα στους 100°C για 8 ώρες, διηθήθηκε, πλύθηκε με ακετόνη και ξηράνθηκε στους 60°C για 3 ώρες. Στη συνέχεια, τα σωματίδια πυριτίας που σχετίζονται με το PMCP (100 g) διαλύθηκαν σε τολουόλιο (200 ml) και προστέθηκε σε αυτό 4-υδροξυ-TEMPO (2 ml) παρουσία 100 μl διβουτυλοκασσιτερικού διλαυρικού άλατος ως καταλύτη. Το μείγμα αναδεύτηκε στους 50°C για 8 ώρες, διηθήθηκε και ξηράνθηκε στους 50°C για 3 ώρες.
Στυρένιο (1 ml), υπεροξείδιο του βενζοϋλίου BPO (0,5 ml) και σωματίδια πυριτίας προσαρτημένα στο TEMPO-PMCP (1,5 g) διασκορπίστηκαν σε τολουόλιο και καθαρίστηκαν με άζωτο. Ο πολυμερισμός του στυρενίου πραγματοποιήθηκε στους 100°C για 12 ώρες. Το προκύπτον προϊόν πλύθηκε με μεθανόλη και ξηράνθηκε όλη τη νύχτα στους 60°C. Το γενικό σχήμα της αντίδρασης φαίνεται στο σχήμα 1.
Τα δείγματα απαερώθηκαν στους 393 K για 1 ώρα μέχρι να επιτευχθεί υπολειμματική πίεση μικρότερη από 10–3 Torr. Η ποσότητα N2 που προσροφήθηκε σε σχετική πίεση P/P0 = 0,99 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του συνολικού όγκου πόρων. Η μορφολογία των καθαρών και δεσμευμένων με υποκαταστάτες σωματιδίων πυριτίας εξετάστηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (Hitachi High Technologies, Τόκιο, Ιαπωνία). Ξηρά δείγματα (καθαρό πυρίτιο και σωματίδια πυριτίας δεσμευμένα με υποκαταστάτες) τοποθετήθηκαν σε ράβδους αλουμινίου χρησιμοποιώντας ταινία άνθρακα. Χρυσός εναποτέθηκε στο δείγμα χρησιμοποιώντας συσκευή ψεκασμού Q150T και ένα στρώμα Au πάχους 5 nm εναποτέθηκε στο δείγμα. Αυτό βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της διαδικασίας χαμηλής τάσης και παρέχει λεπτό ψεκασμό εν ψυχρώ. Η στοιχειακή ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή στοιχειακής σύνθεσης Thermo Electron (Waltham, MA, ΗΠΑ) Flash EA1112. Ένας αναλυτής μεγέθους σωματιδίων Malvern (Worcestershire, Ηνωμένο Βασίλειο) Mastersizer 2000 χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η κατανομή μεγέθους σωματιδίων. Μη επικαλυμμένα σωματίδια πυριτίας και σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με υποκαταστάτες (5 mg το καθένα) διασκορπίστηκαν σε 5 ml ισοπροπανόλης, υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά, αναδεύτηκαν για 5 λεπτά και τοποθετήθηκαν σε οπτικό πάγκο Mastersizer. Η θερμοβαρυμετρική ανάλυση πραγματοποιείται με ρυθμό 5 °C ανά λεπτό σε εύρος θερμοκρασίας από 30 έως 800 °C.
Στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα στενής οπής με επένδυση από υαλονήματα και διαστάσεις (ID 100 × 1,8 mm) συσκευάστηκαν με τη μέθοδο πλήρωσης πολτού ακολουθώντας την ίδια διαδικασία όπως στην αναφορά 31. Η στήλη από ανοξείδωτο χάλυβα (με επένδυση από γυαλί, ID 100 × 1,8 mm) και μια έξοδος που περιείχε υαλόπλεγμα 1 µm συνδέθηκε με μια μηχανή συσκευασίας πολτού (Alltech Deerfield, IL, ΗΠΑ). Παρασκευάστε ένα εναιώρημα της στατικής φάσης εναιωρώντας 150 mg της στατικής φάσης σε 1,2 ml μεθανόλης και τροφοδοτώντας την σε μια στήλη δεξαμενής. Η μεθανόλη χρησιμοποιήθηκε ως διαλύτης πολτού και διαλύτης ελέγχου. Συσκευάστε τη στήλη εφαρμόζοντας μια ακολουθία πίεσης 100 MP για 10 λεπτά, 80 MP για 15 λεπτά και 60 MP για 30 λεπτά. Η διαδικασία συσκευασίας χρησιμοποίησε δύο δονητές στήλης αεριοχρωματογραφίας (Alltech, Deerfield, IL, ΗΠΑ) για μηχανική δόνηση για να διασφαλιστεί η ομοιόμορφη συσκευασία της στήλης. Κλείστε τον συσκευαστή πολτού και απελευθερώστε αργά την πίεση για να αποφύγετε ζημιά στη χορδή. Η στήλη αποσυνδέθηκε από το ακροφύσιο πολτού και ένα άλλο εξάρτημα προσαρτήθηκε στην είσοδο και συνδέθηκε με το σύστημα LC για να ελεγχθεί η λειτουργία του.
Κατασκευάστηκε μια προσαρμοσμένη MLC χρησιμοποιώντας μια αντλία LC (10AD Shimadzu, Ιαπωνία), έναν δειγματολήπτη με βρόχο έγχυσης 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), έναν απαερωτή μεμβράνης (Shimadzu DGU-14A) και ένα τριχοειδές παράθυρο UV-VIS. Συσκευή ανίχνευσης (UV-2075) και εμαγιέ μικροστήλη. Χρησιμοποιήστε πολύ στενούς και κοντούς σωλήνες σύνδεσης για να ελαχιστοποιήσετε την επίδραση της πρόσθετης διαστολής της στήλης. Μετά την πλήρωση της στήλης, εγκαταστήστε ένα τριχοειδές (50 µm id 365) στην έξοδο της αναγωγικής σύνδεσης 1/16″ και εγκαταστήστε ένα τριχοειδές (50 µm) της αναγωγικής σύνδεσης. Η συλλογή δεδομένων και η επεξεργασία χρωματογραφήματος πραγματοποιούνται χρησιμοποιώντας το λογισμικό Multichro 2000. Στα 254 nm, η απορρόφηση UV των αναλυόμενων ουσιών παρακολουθήθηκε στο 0. Τα χρωματογραφικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το OriginPro8 (Northampton, MA).
Ανθρώπινη ορολευκωματίνη, λυοφιλοποιημένη σκόνη, ≥ 96% (ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης) 3 mg αναμεμειγμένη με θρυψίνη (1,5 mg), ουρία 4,0 M (1 ml) και όξινο ανθρακικό αμμώνιο 0,2 M (1 ml). Το διάλυμα αναδεύτηκε για 10 λεπτά και διατηρήθηκε σε υδατόλουτρο στους 37°C για 6 ώρες, στη συνέχεια σβήστηκε με 1 ml TFA 0,1%. Διηθήστε το διάλυμα και φυλάξτε το κάτω από τους 4°C.
Ο διαχωρισμός ενός μείγματος πεπτιδίων και θρυπτικής πέψης HSA σε στήλη PMP αξιολογήθηκε ξεχωριστά. Ελέγξτε την τρυπτική υδρόλυση ενός μείγματος πεπτιδίων και HSA που διαχωρίζονται από μια στήλη PMP και συγκρίνετε τα αποτελέσματα με μια στήλη Ascentis Express RP-Amide. Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:
Εικόνες SEM σωματιδίων καθαρού πυριτίου και σωματιδίων πυριτίου συνδεδεμένων με υποκαταστάτη παρουσιάζονται στο Σχήμα 2. Οι εικόνες SEM σωματιδίων καθαρού πυριτίου (A, B) δείχνουν ένα σφαιρικό σχήμα στο οποίο τα σωματίδια είναι επιμήκη ή έχουν ακανόνιστη συμμετρία σε σύγκριση με τις προηγούμενες μελέτες μας. Η επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίου που συνδέονται με τον υποκαταστάτη (C, D) είναι πιο λεία από αυτή των σωματιδίων καθαρού πυριτίου, κάτι που μπορεί να οφείλεται στις αλυσίδες πολυστυρενίου που καλύπτουν την επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας.
Ηλεκτρονικές μικρογραφίες σάρωσης καθαρών σωματιδίων πυριτίας (A, B) και σωματιδίων πυριτίας συνδεδεμένων με υποκαταστάτες (C, D).
Η κατανομή μεγέθους σωματιδίων καθαρού πυριτίου και σωματιδίων πυριτίου συνδεδεμένων με υποκαταστάτες φαίνεται στο Σχήμα 2.3(A). Οι ογκομετρικές καμπύλες κατανομής μεγέθους σωματιδίων έδειξαν ότι το μέγεθος των σωματιδίων πυριτίας αυξήθηκε μετά από χημική τροποποίηση (Σχήμα 3Α). Τα δεδομένα κατανομής μεγέθους σωματιδίων πυριτίας από την παρούσα μελέτη και την προηγούμενη μελέτη συγκρίνονται στον Πίνακα 1(A). Το ογκομετρικό μέγεθος σωματιδίων d(0,5) του PMP ήταν 3,36 µm, σε σύγκριση με την τιμή ad(0,5) των 3,05 µm στην προηγούμενη μελέτη μας (σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με πολυστυρένιο)34. Λόγω της αλλαγής στην αναλογία PEG, ουρίας, TMOS και οξικού οξέος στο μείγμα αντίδρασης, η κατανομή μεγέθους σωματιδίων αυτής της παρτίδας ήταν στενότερη σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας. Το μέγεθος σωματιδίων της φάσης PMP είναι ελαφρώς μεγαλύτερο από αυτό της φάσης σωματιδίων πυριτίου συνδεδεμένης με πολυστυρένιο που μελετήσαμε νωρίτερα. Αυτό σημαίνει ότι η επιφανειακή λειτουργικοποίηση σωματιδίων πυριτίας με στυρένιο εναπόθεσε μόνο ένα στρώμα πολυστυρενίου (0,97 µm) στην επιφάνεια του πυριτίου, ενώ στη φάση PMP το πάχος του στρώματος ήταν 1,38 µm.
Κατανομή μεγέθους σωματιδίων (Α) και κατανομή μεγέθους πόρων (Β) σωματιδίων καθαρού πυριτίου και σωματιδίων πυριτίου συνδεδεμένων με υποκαταστάτες.
Το μέγεθος πόρων, ο όγκος πόρων και η επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 1 (Β). Τα προφίλ PSD των σωματιδίων καθαρού πυριτίου και των σωματιδίων πυριτίας που είναι συνδεδεμένα με υποκαταστάτες παρουσιάζονται στα Σχήματα 3(Β). Τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα με την προηγούμενη μελέτη μας34. Τα μεγέθη πόρων των σωματιδίων καθαρού πυριτίου και των σωματιδίων πυριτίας που είναι συνδεδεμένα με υποκαταστάτες ήταν 310 Å και 241 Å, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι μετά τη χημική τροποποίηση, το μέγεθος πόρων μειώθηκε κατά 69 Å, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 (Β), και η καμπύλη μετατόπισης φαίνεται στο Σχήμα 1. Η ειδική επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας στην παρούσα μελέτη είναι 116 m2/g, η οποία είναι συγκρίσιμη με την προηγούμενη μελέτη μας (124 m2/g). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1(Β), η επιφάνεια (m2/g) των σωματιδίων πυριτίας μετά τη χημική τροποποίηση μειώθηκε επίσης από 116 m2/g σε 105 m2/g.
Τα αποτελέσματα της στοιχειακής ανάλυσης της στατικής φάσης παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Η περιεκτικότητα σε άνθρακα της τρέχουσας στατικής φάσης είναι 6,35%, η οποία είναι χαμηλότερη από ό,τι στην προηγούμενη μελέτη μας (σωματίδια πυριτίου που σχετίζονται με πολυστυρένιο, 7,93%35 και 10,21%, αντίστοιχα) 42. Η περιεκτικότητα σε άνθρακα της τρέχουσας στατικής φάσης παρακάτω, καθώς ορισμένοι πολικοί υποκαταστάτες όπως το φαινυλομαλεϊμίδιο, το μεθυλοβινυλισοκυανικό (PCMP) και το 4-υδροξυ-TEMPO έχουν χρησιμοποιηθεί εκτός από το στυρένιο στην παρασκευή SP. Το ποσοστό βάρους του αζώτου στην τρέχουσα στατική φάση είναι 2,21% σε σύγκριση με 0,1735 και 0,85% σε προηγούμενες μελέτες 42. Αυτό σημαίνει ότι η τρέχουσα στατική φάση έχει υψηλό ποσοστό βάρους αζώτου λόγω του φαινυλομαλεϊμιδίου. Ομοίως, τα προϊόντα (4) και (5) έχουν περιεκτικότητα σε άνθρακα 2,7% και 2,9% αντίστοιχα, ενώ το τελικό προϊόν (6) έχει περιεκτικότητα σε άνθρακα 6,35%, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2. Χρησιμοποιήθηκε θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA) στη στατική φάση του PMP για να ελεγχθεί η απώλεια βάρους και η καμπύλη TGA φαίνεται στο Σχήμα 4. Η καμπύλη TGA δείχνει απώλεια βάρους 8,6%, η οποία συμφωνεί με την περιεκτικότητα σε άνθρακα (6,35%), καθώς οι υποκαταστάτες περιέχουν όχι μόνο C, αλλά και N, O και H.
Ο υποκαταστάτης φαινυλομαλεϊμίδιο-μεθυλοβινυλ ισοκυανικό επιλέχθηκε για να τροποποιήσει την επιφάνεια των σωματιδίων πυριτίας λόγω των πολικών ομάδων φαινυλομαλεϊμιδίου και βινυλισοκυανικού. Οι ομάδες βινυλ ισοκυανικού μπορούν να αντιδράσουν περαιτέρω με το στυρένιο μέσω πολυμερισμού ζωντανών ριζών. Ο δεύτερος λόγος είναι η εισαγωγή μιας ομάδας που έχει μέτριες αλληλεπιδράσεις με τον αναλύτη και καμία ισχυρή ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση μεταξύ του αναλύτη και της στατικής φάσης, καθώς το τμήμα φαινυλομαλεϊμιδίου δεν έχει εικονικό φορτίο σε κανονικό pH. Η πολικότητα της στατικής φάσης μπορεί να ελεγχθεί από τη βέλτιστη ποσότητα στυρενίου και τον χρόνο αντίδρασης του πολυμερισμού ελεύθερων ριζών. Το τελικό βήμα της αντίδρασης (πολυμερισμός ελεύθερων ριζών) είναι κρίσιμο καθώς αλλάζει την πολικότητα της στατικής φάσης. Πραγματοποιήθηκε στοιχειακή ανάλυση για να ελεγχθεί η περιεκτικότητα σε άνθρακα σε αυτές τις στατικές φάσεις. Έχει παρατηρηθεί ότι η αύξηση της ποσότητας στυρενίου και του χρόνου αντίδρασης αυξάνει την περιεκτικότητα σε άνθρακα της στατικής φάσης και αντίστροφα. Τα SP που παρασκευάζονται με διαφορετικές συγκεντρώσεις στυρενίου έχουν διαφορετικά φορτία άνθρακα. Ομοίως, αυτές οι στατικές φάσεις τοποθετήθηκαν σε στήλες από ανοξείδωτο χάλυβα και ελέγχθηκαν τα χρωματογραφικά τους χαρακτηριστικά (επιλεκτικότητα, διακριτική ικανότητα, τιμή Ν, κ.λπ.). Με βάση αυτά τα πειράματα, επιλέχθηκε μια βελτιστοποιημένη σύνθεση για την παρασκευή της στατικής φάσης PMP για να παρέχει ελεγχόμενη πολικότητα και καλή συγκράτηση του αναλύτη.
Η στήλη PMP αξιολογήθηκε επίσης για την ανάλυση πέντε μιγμάτων πεπτιδίων (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, λευκίνη-εγκεφαλίνη) χρησιμοποιώντας την χωρητικότητα της κινητής φάσης. 60/40 (v/v) ACN/νερό (0,1% TFA) με ρυθμό ροής 80 µl/min. Υπό βέλτιστες συνθήκες έκλουσης (200.000 πλάκες/m2), ο αριθμός των θεωρητικών πλακών (N) ανά στήλη (100 × 1,8 mm) είναι 20.000 ± 100. Οι τιμές N για τις τρεις στήλες PMP φαίνονται στον Πίνακα 3 και τα χρωματογραφήματα φαίνονται στο Σχήμα 5Α. Γρήγορη ανάλυση με υψηλό ρυθμό ροής (700 µl/min) σε στήλη PMP, πέντε πεπτίδια εκλούστηκαν εντός ενός λεπτού, εξαιρετική τιμή N 13.500 ± 330 ανά στήλη (διαμέτρου 100 x 1,8 mm), ισοδύναμη με 135.000 πλάκες/m2 (Εικ. 5Β). Τρεις στήλες ίδιου μεγέθους (εσωτερική διάμετρος 100 x 1,8 mm) γεμίστηκαν με τρεις διαφορετικές παρτίδες στατικής φάσης PMP για να ελεγχθεί η αναπαραγωγιμότητα. Οι αναλυτές καταγράφηκαν για κάθε στήλη διαχωρίζοντας το ίδιο μείγμα δοκιμής σε κάθε στήλη χρησιμοποιώντας βέλτιστες συνθήκες έκλουσης, αριθμό θεωρητικών πλακών N και χρόνο κατακράτησης. Τα δεδομένα αναπαραγωγιμότητας για τις στήλες PMP παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Η αναπαραγωγιμότητα της στήλης PMP συσχετίστηκε καλά με πολύ χαμηλές τιμές %RSD, όπως φαίνεται στον Πίνακα 3.
Διαχωρισμός μιγμάτων πεπτιδίων σε στήλη PMP (Β) και στήλη Ascentis Express RP-Amide (Α), κινητή φάση 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), διαστάσεις στήλης PMP (100 x 1,8 mm εσωτερικές διαστάσεις), ανάλυση. Σειρά έκλουσης ενώσεων: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) και 5 (λευκικό οξύ εγκεφαλίνη).
Μία στήλη PMP (εσωτερική διάμετρος 100 x 1,8 mm) αξιολογήθηκε για τον διαχωρισμό του τρυπτικού υδρολύματος της ανθρώπινης ορολευκωματίνης με HPLC. Το χρωματογράφημα στο Σχήμα 6 δείχνει ότι τα δείγματα είναι καλά διαχωρισμένα με πολύ καλή διακριτική ικανότητα. Τα διαλύματα HSA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμό ροής 100 μl/min, κινητή φάση 70/30 ακετονιτριλίου/νερού και 0,1% TFA. Η διάσπαση της HSA διαιρέθηκε σε 17 κορυφές, όπως φαίνεται στο χρωματογράφημα (Σχήμα 6), που αντιστοιχούν σε 17 πεπτίδια. Υπολογίστηκαν οι αποδόσεις διαχωρισμού μεμονωμένων κορυφών από το υδρολύσιμο HSA και οι τιμές παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.
Τα τρυπτικά υδρολύματα HSA διαχωρίστηκαν σε στήλη PMP (εσωτερική διάμετρος 100 x 1,8 mm), ρυθμός ροής (100 μl/min), κινητή φάση 60/40 ακετονιτρίλιο/νερό και 0,1% TFA.
όπου L είναι το μήκος της στήλης, η είναι το ιξώδες της κινητής φάσης, ΔP είναι η αντίθλιψη της στήλης και u είναι η γραμμική ταχύτητα της κινητής φάσης. Η διαπερατότητα της στήλης PMP ήταν 2,5 × 10–14 m2, ο ρυθμός ροής ήταν 25 µl/min, χρησιμοποιήθηκε 60/40 v/v. ACN/νερό. Η διαπερατότητα της στήλης PMP (ID 100 × 1,8 mm) ήταν παρόμοια με αυτή της προηγούμενης μελέτης μας Ref.34. Η διαπερατότητα μιας στήλης γεμάτης με επιφανειακά πορώδη σωματίδια είναι 1,7×10 0,6 µm, 2,5×10-14 m2 για σωματίδια 5 µm43. Επομένως, η διαπερατότητα της φάσης PMP είναι παρόμοια με τη διαπερατότητα σωματιδίων πυρήνα-κελύφους με μέγεθος 5 μm.
όπου Wx είναι η μάζα της στήλης που είναι γεμάτη με χλωροφόρμιο, Wy είναι η μάζα της στήλης που είναι γεμάτη με μεθανόλη και ρ είναι η πυκνότητα του διαλύτη. Πυκνότητα μεθανόλης (ρ = 0,7866) και χλωροφορμίου (ρ = 1,484). Το συνολικό πορώδες της στήλης σωματιδίων πυριτίας-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 και της προηγουμένως μελετημένης στήλης C18-ουρίας31 ήταν 0,63 και 0,55, αντίστοιχα. Αυτό σημαίνει ότι η παρουσία υποκαταστατών ουρίας μειώνει τη διαπερατότητα της στατικής φάσης. Από την άλλη πλευρά, το συνολικό πορώδες της στήλης PMP (εσωτερική διάμετρος 100 × 1,8 mm) είναι 0,60. Οι στήλες PMP είναι λιγότερο διαπερατές από τις στήλες που είναι γεμάτες με σωματίδια πυριτίας συνδεδεμένα με C18, επειδή στις στατικές φάσεις τύπου C18 οι υποκαταστάτες C18 συνδέονται με τα σωματίδια πυριτίας σε γραμμικές αλυσίδες, ενώ στις στατικές φάσεις τύπου πολυστυρενίου σχηματίζεται ένα σχετικά παχύ πολυμερές γύρω από τα σωματίδια. στρώμα Α. Σε ένα τυπικό πείραμα, το πορώδες της στήλης υπολογίζεται ως εξής:
Στα σχήματα 7Α, Β φαίνονται τα διαγράμματα Van Deemter για μια στήλη PMP (εσωτερικό μέγεθος 100 x 1,8 mm) και μια στήλη Ascentis Express RP-Amide (εσωτερικό μέγεθος 100 x 1,8 mm) υπό τις ίδιες συνθήκες έκλουσης, 60/40 ACN/H2O και 0,1% TFA 20 µl/min έως 800 µl/min και στις δύο στήλες. Οι ελάχιστες τιμές HETP στον βέλτιστο ρυθμό ροής (80 µl/min) ήταν 2,6 µm και 3,9 µm για τη στήλη PMP και τη στήλη Ascentis Express RP-Amide, αντίστοιχα. Οι τιμές HETP δείχνουν ότι η απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP (εσωτερικό μέγεθος 100 x 1,8 mm) είναι πολύ υψηλότερη από αυτή της εμπορικά διαθέσιμης στήλης Ascentis Express RP-Amide (εσωτερικό μέγεθος 100 x 1,8 mm). Το γράφημα van Deemter στο Σχήμα 7(Α) δείχνει ότι η μείωση της τιμής N δεν είναι σημαντικά υψηλότερη με την αύξηση της ροής σε σύγκριση με την προηγούμενη μελέτη μας. Η υψηλότερη απόδοση διαχωρισμού της στήλης PMP (id 100 × 1,8 mm) σε σύγκριση με τη στήλη Ascentis Express RP-Amide βασίζεται στο βελτιωμένο σχήμα και μέγεθος των σωματιδίων και στην εξελιγμένη διαδικασία συσκευασίας της στήλης που χρησιμοποιείται στην τρέχουσα εργασία34.
(Α) Διάγραμμα Van Deemter (γραμμική ταχύτητα HETP έναντι κινητής φάσης) που ελήφθη σε στήλη PMP (id 100 x 1,8 mm) σε 60/40 ACN/H2O με 0,1% TFA. (Β) Διάγραμμα Van Deemter (γραμμική ταχύτητα HETP έναντι κινητής φάσης) που ελήφθη σε στήλη Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) σε 60/40 ACN/H2O με 0,1% TFA.
Μια πολική στατική φάση από παρεμβαλλόμενο πολυστυρένιο παρασκευάστηκε και αξιολογήθηκε για τον διαχωρισμό ενός μείγματος συνθετικών πεπτιδίων και τρυπτικού υδρολύματος ανθρώπινης ορολευκωματίνης (HSA) σε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Η χρωματογραφική απόδοση των στηλών PMP για μείγματα πεπτιδίων είναι εξαιρετική όσον αφορά την απόδοση και την ανάλυση διαχωρισμού. Η βελτιωμένη απόδοση διαχωρισμού των στηλών PMP οφείλεται σε διάφορους λόγους, όπως το μέγεθος των σωματιδίων πυριτίας και το μέγεθος των πόρων, η ελεγχόμενη σύνθεση στατικών φάσεων και τα σύνθετα υλικά συσκευασίας της στήλης. Εκτός από την υψηλή απόδοση διαχωρισμού, ένα άλλο πλεονέκτημα αυτής της στατικής φάσης είναι η χαμηλή αντίθλιψη της στήλης σε υψηλούς ρυθμούς ροής. Οι στήλες PMP είναι εξαιρετικά αναπαραγώγιμες και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση μειγμάτων πεπτιδίων και την τρυπτική πέψη διαφόρων πρωτεϊνών. Σκοπεύουμε να χρησιμοποιήσουμε αυτήν τη στήλη για τον διαχωρισμό βιοδραστικών ενώσεων από φυσικά προϊόντα, εκχυλίσματα φαρμακευτικών φυτών και μανιταριών σε υγρή χρωματογραφία. Στο μέλλον, οι στήλες PMP θα αξιολογηθούν επίσης για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών και μονοκλωνικών αντισωμάτων.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Διερεύνηση συστημάτων διαχωρισμού πεπτιδίων με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, μέρος Ι: Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για τον χαρακτηρισμό στήλης. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Διερεύνηση συστημάτων διαχωρισμού πεπτιδίων με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, μέρος Ι: Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για τον χαρακτηρισμό στήλης.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., και Petersson, P. Διερεύνηση συστημάτων διαχωρισμού πεπτιδίων με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, Μέρος Ι: Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για τον χαρακτηρισμό στήλης. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Διερεύνηση συστημάτων διαχωρισμού πεπτιδίων με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, μέρος Ι: Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για τα χαρακτηριστικά της στήλης. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Διερεύνηση συστημάτων διαχωρισμού πεπτιδίων με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, μέρος Ι: Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για τα χαρακτηριστικά της στήλης.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., και Petersson, P. Διερεύνηση συστημάτων διαχωρισμού πεπτιδίων με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, Μέρος Ι: Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για τον χαρακτηρισμό στήλης.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)".
Gomez, B. et al. Μέθοδοι για τη δημιουργία βελτιωμένων ενεργών πεπτιδίων για τη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών. Βιοτεχνολογία. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Συνθετικά θεραπευτικά πεπτίδια: Επιστήμη και αγορά. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Συνθετικά θεραπευτικά πεπτίδια: Επιστήμη και αγορά.Vliege P, Lisowski V, Martinez J και Chreschatyski M. Συνθετικά θεραπευτικά πεπτίδια: επιστήμη και αγορά.Vliege P, Lisowski V, Martinez J και Khreschatsky M. Συνθετικά θεραπευτικά πεπτίδια: επιστήμη και αγορά. ανακάλυψη φαρμάκων. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Προηγμένη πρωτεωμική υγρή χρωματογραφία. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Προηγμένη πρωτεωμική υγρή χρωματογραφία.Βλέπε F., Smith RD και Shen Yu. Προηγμένη πρωτεωμική υγρή χρωματογραφία. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Προηγμένη σύνθεση πρωτεΐνης 液相色谱.Βλέπε F., Smith RD και Shen Yu. Προηγμένη πρωτεωμική υγρή χρωματογραφία.J. Χρωματογραφία. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Η προηγμένη υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας είναι σε θέση να συνδυάσει ευρείας βάσης μεταβολομική και πρωτεωμική. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ο ρόλος της UHPLC στην φαρμακευτική ανάπτυξη. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ο ρόλος της UHPLC στην φαρμακευτική ανάπτυξη.Chesnut, SM και Salisbury, JJ Ο ρόλος της UHPLC στην φαρμακευτική ανάπτυξη.Chesnut, SM και Salisbury, JJ Ο ρόλος της UHPLC στην ανάπτυξη φαρμάκων. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Βασικές και πρακτικές πτυχές της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής πίεσης για γρήγορους διαχωρισμούς. Wu, N. & Clausen, AM Βασικές και πρακτικές πτυχές της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής πίεσης για γρήγορους διαχωρισμούς.Wu, N. και Clausen, AM Βασικές και πρακτικές πτυχές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης για ταχύ διαχωρισμό. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Βασικές και πρακτικές πτυχές της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής πίεσης για ταχύ διαχωρισμό.Wu, N. και Clausen, AM Βασικές και πρακτικές πτυχές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης για ταχύ διαχωρισμό.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Χρήση υγρής χρωματογραφίας υπεραπόδοσης στην ανάπτυξη φαρμακευτικών προϊόντων. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Χρήση υγρής χρωματογραφίας υπεραπόδοσης στην ανάπτυξη φαρμακευτικών προϊόντων.Ren, SA και Chelischeff, P. Η χρήση υγρής χρωματογραφίας εξαιρετικά υψηλής απόδοσης στην ανάπτυξη φαρμακευτικών προϊόντων. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Ρεν, ΣΑ & Τσελίτσεφ, Π.Ren, SA και Chelischeff, P. Εφαρμογή της υγρής χρωματογραφίας υπεραπόδοσης στην ανάπτυξη φαρμάκων.J. Χρωματογραφία. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Μια μονολιθική μακροπορώδης υδρογέλη που προέρχεται από ένα γαλάκτωμα ελαίου σε νερό με υψηλή εσωτερική φάση για αποτελεσματικό καθαρισμό του εντεροϊού 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ο ρόλος της υγρής χρωματογραφίας στην πρωτεωμική. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ο ρόλος της υγρής χρωματογραφίας στην πρωτεωμική.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. και Wilkins, JA Ο ρόλος της υγρής χρωματογραφίας στην πρωτεωμική. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Υ., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. και Wilkins, JA Ο ρόλος της υγρής χρωματογραφίας στην πρωτεωμική.J. Χρωματογραφία. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Φέκετε, Σ., Βουτέι, Τζ.-Λ. & Guillarme, D. Νέες τάσεις στους διαχωρισμούς θεραπευτικών πεπτιδίων και πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης: Θεωρία και εφαρμογές. & Guillarme, D. Νέες τάσεις στους διαχωρισμούς θεραπευτικών πεπτιδίων και πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης: Θεωρία και εφαρμογές. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделени терапевтских пептидов и белков со помощью жидкостной хроматографии со обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Νέες τάσεις στον διαχωρισμό θεραπευτικών πεπτιδίων και πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης: θεωρία και εφαρμογές. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Γκιγιάρμε, Δ.και Guillarmé, D. Νέες τάσεις στον διαχωρισμό θεραπευτικών πεπτιδίων και πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία αντίστροφης φάσης: θεωρία και εφαρμογές.J. Pharm. Βιοϊατρική Επιστήμη. πρωκτός. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Δισδιάστατος διαχωρισμός πεπτιδίων χρησιμοποιώντας σύστημα RP-RP-HPLC με διαφορετικό pH στην πρώτη και δεύτερη διάσταση διαχωρισμού. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Δισδιάστατος διαχωρισμός πεπτιδίων χρησιμοποιώντας σύστημα RP-RP-HPLC με διαφορετικό pH στην πρώτη και δεύτερη διάσταση διαχωρισμού.Gilar M., Olivova P., Dali AE και Gebler JK Δισδιάστατος διαχωρισμός πεπτιδίων χρησιμοποιώντας το σύστημα RP-RP-HPLC με διαφορετικό pH στην πρώτη και δεύτερη διάσταση διαχωρισμού.Gilar M., Olivova P., Dali AE και Gebler JK Δισδιάστατος διαχωρισμός πεπτιδίων χρησιμοποιώντας διαφορετικές τιμές pH στην πρώτη και δεύτερη διάσταση διαχωρισμού χρησιμοποιώντας το σύστημα RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Διερεύνηση των χαρακτηριστικών μεταφοράς μάζας και κινητικής των στηλών χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης που είναι γεμάτες με πλήρως πορώδη και επιφανειακά πορώδη σωματίδια C18 μικρότερα από 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Πρόσφατες τάσεις και αναλυτικές προκλήσεις στην απομόνωση, την ταυτοποίηση και την επικύρωση φυτικών βιοδραστικών πεπτιδίων. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Πρωτεωμικό τοπίο του βασιλείου της ζωής. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Μετα-επεξεργασία θεραπευτικών πεπτιδίων με παρασκευαστική υγρή χρωματογραφία. Molecules (Βασιλεία, Ελβετία) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Χρωματογραφία μικτού τρόπου και οι εφαρμογές της σε βιοπολυμερή. Yang, Y. & Geng, X. Χρωματογραφία μικτού τρόπου και οι εφαρμογές της σε βιοπολυμερή.Yang, Yu. και Geng, X. Χρωματογραφία μικτού τρόπου και η εφαρμογή της σε βιοπολυμερή. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Χρωματογραφία μικτού τρόπου και η εφαρμογή της σε βιοπολυμερή.Yang, Yu. και Gene, X. Χρωματογραφία μικτού τρόπου και η εφαρμογή της σε βιοπολυμερή.J. Χρωματογραφία. A 1218(49), 8813–8825 (2011).