Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Το λούπινο Angustifolius (NLL, Lupinus angustifolius L.) είναι ένα όσπριο που χρησιμοποιείται για την παραγωγή τροφίμων και τη βελτίωση του εδάφους.Η παγκόσμια επέκταση της NLL ως καλλιέργεια έχει προσελκύσει πολλούς παθογόνους μύκητες, συμπεριλαμβανομένης της ανθρακνόζης του λούπινου, η οποία προκαλεί την καταστροφική ασθένεια της ανθρακνόζης.Δύο αλληλόμορφα, τα Lanr1 και AnMan, τα οποία προσδίδουν αυξημένη αντίσταση, έχουν χρησιμοποιηθεί στην αναπαραγωγή NLL, αλλά οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν άγνωστοι.Σε αυτή τη μελέτη, οι δείκτες Lanr1 και AnMan χρησιμοποιήθηκαν για τη διαλογή ευρωπαϊκών δειγμάτων NLL.Η δοκιμή του εμβολίου σε ελεγχόμενο περιβάλλον επιβεβαίωσε την αποτελεσματικότητα και των δύο ανθεκτικών δοτών.Το προφίλ διαφορικής γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε σε αντιπροσωπευτικές ανθεκτικές και ευαίσθητες γραμμές.Η αντίσταση στην ανθρακνόζη σχετίστηκε με την υπερέκφραση των όρων γονιδιακής οντολογίας «GO:0006952 Defense Response», «GO:0055114 Redox Process» και «GO:0015979 Photosynthesis».Επιπλέον, η γραμμή Lanr1(83A:476) έδειξε σημαντικό επαναπρογραμματισμό μεταγραφομέτρων ταχέως μετά τον εμβολιασμό, ενώ οι άλλες γραμμές εμφάνισαν καθυστέρηση σε αυτή την απόκριση κατά περίπου 42 ώρες.Οι αμυντικές αποκρίσεις σχετίζονται με τα γονίδια TIR-NBS, CC-NBS-LRR και NBS-LRR, 10 πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην παθογένεση, πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων, ενδογλυκάνη-1,3-β-γλυκοσιδάση, πλούσιες σε γλυκίνη πρωτεΐνες κυτταρικού τοιχώματος και γονίδια από την αντιδραστική οδό του οξυγόνου.Οι πρώιμες αποκρίσεις στο 83A:476, συμπεριλαμβανομένης της προσεκτικής καταστολής των γονιδίων που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση, συνέπεσαν με την επιτυχή προστασία κατά τη φάση της βλαστικής ανάπτυξης της μυκητιακής βιολογίας, υποδηλώνοντας ότι ένας τελεστής ενεργοποιεί την ανοσία.Η αντίδραση Mandeloop επιβραδύνεται, όπως και η συνολική οριζόντια οπισθέλκουσα.
Το στενόφυλλο λούπινο (NLL, Lupinus angustifolius L.) είναι ένα δημητριακό υψηλής πρωτεΐνης που προέρχεται από την περιοχή της δυτικής Μεσογείου1,2.Σήμερα καλλιεργείται ως τροφή για ζώα και ανθρώπους.Θεωρείται επίσης πράσινη λίπανση στα συστήματα αμειψισποράς λόγω της αζωτοδέσμευσης από συμβιωτικά αζωτομονωτικά βακτήρια και της συνολικής βελτίωσης της δομής του εδάφους.Το NLL έχει υποστεί μια ταχεία διαδικασία εξημέρωσης τον περασμένο αιώνα και εξακολουθεί να βρίσκεται υπό υψηλή αναπαραγωγική πίεση3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Με την ευρεία καλλιέργεια του NLL, η διαδοχή παθογόνων μυκήτων ανέπτυξε νέες γεωργικές κόγχες και προκάλεσε νέες ασθένειες που καταστρέφουν τις καλλιέργειες. Το πιο αξιοσημείωτο για τους αγρότες και τους κτηνοτρόφους λούπινου ήταν η εμφάνιση ανθρακόζης, που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Το πιο αξιοσημείωτο για τους αγρότες και τους κτηνοτρόφους λούπινου ήταν η εμφάνιση ανθρακόζης, που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракноза, вызванного патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Πιο αξιοσημείωτη στους αγρότες και τους κτηνοτρόφους λούπινου ήταν η εμφάνιση της ανθρακνόζης που προκλήθηκε από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由i λουλουτ. , Feiler & Hagedorn13 引起的.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由irich) Μαλλιαρός. 1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракноза, вызываемого патогенным грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Το πιο εντυπωσιακό για τους αγρότες και τους κτηνοτρόφους λούπινου είναι η εμφάνιση ανθρακόζης που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Οι πρώτες αναφορές της νόσου προέρχονταν από τη Βραζιλία και τις Ηνωμένες Πολιτείες, με τυπικά συμπτώματα να εμφανίζονται το 1912 και το 1929 αντίστοιχα.Ωστόσο, μετά από περίπου 30 χρόνια, το παθογόνο ορίστηκε ως Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., τηλεόμορφο Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., τηλεόμορφο Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., τηλεόμορφο του Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .και H. Schrenk. & H.施伦克，. & H.施伦克，.και H. Schlenk, .Ο προκαταρκτικός φαινοτυπικός προσδιορισμός της νόσου που έγινε στα μέσα του 20ού αιώνα έδειξε κάποια αντίσταση σε προσαρτήσεις NLL και κίτρινου λούπινου (L. luteus L.), αλλά όλες οι προσαρτήσεις λευκού λούπινου (L. albus L.) που δοκιμάστηκαν ήταν εξαιρετικά ευαίσθητες15,16.Μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη της ανθρακνόζης σχετίζεται με αυξημένη βροχόπτωση (υγρασία αέρα) και θερμοκρασία (στην περιοχή από 12-28°C), που οδηγεί σε παραβίαση της αντίστασης σε υψηλότερες θερμοκρασίες17, 18. Στην πραγματικότητα, ο χρόνος που απαιτείται για να βλαστήσουν τα κονίδια και να ξεκινήσει η ασθένεια ήταν τέσσερις φορές μικρότερος στους 24°C (10°C σε συνθήκες υψηλής υγρασίας από 2 ώρες από 1°C (4 ώρες).Έτσι, η συνεχιζόμενη υπερθέρμανση του πλανήτη έχει οδηγήσει στην εξάπλωση της ανθρακόζης.Ωστόσο, η ασθένεια παρατηρήθηκε στη Γαλλία (1982) και στην Ουκρανία (1983) ως προάγγελος μιας επικείμενης απειλής, αλλά προφανώς αγνοήθηκε από τη βιομηχανία του λούπινου εκείνη την εποχή20,21.Λίγα χρόνια αργότερα, αυτή η καταστροφική ασθένεια εξαπλώθηκε σε όλο τον κόσμο και επηρέασε επίσης μεγάλες χώρες παραγωγής λούπινου όπως η Αυστραλία, η Πολωνία και η Γερμανία22,23,24.Μετά από ένα ξέσπασμα ανθρακνόζης στα μέσα της δεκαετίας του 1990, ο εκτενής έλεγχος οδήγησε στην ταυτοποίηση αρκετών ανθεκτικών δοτών σε δείγματα NLL19.Η αντίσταση του NLL στην ανθρακνόζη ελέγχεται από δύο ξεχωριστά κυρίαρχα αλληλόμορφα που βρίσκονται σε διαφορετικές πηγές γεννητικού πλάσματος: Lanr1 στην ποικιλία Tanjil και Wonga και AnMan στην ποικιλία.Mandalay 25, 26. Αυτά τα αλληλόμορφα συμπληρώνουν τους μοριακούς δείκτες που υποστηρίζουν την επιλογή ανθεκτικού γεννητικού πλάσματος σε προγράμματα αναπαραγωγής25,26,27,28,29,30.Η ανθεκτική γραμμή αναπαραγωγής 83A:476 που φέρει το αλληλόμορφο Lanr1 διασταυρώθηκε με την ευαίσθητη άγρια ​​γραμμή P27255 για να ληφθεί ένας πληθυσμός RIL που διαχωρίζεται για αντοχή στην ανθρακνόζη, ο οποίος κατέστησε δυνατή την αντιστοίχιση του τόπου Lanr1 στο χρωμόσωμα NLL-1131, 32, αντιστοίχιση αντιστοίχισης αντιστοίχισης 32, αντιστοίχιση αντιστοίχισης 32. ένα γονιδιωματικό πλαίσιο, το NLL αποκάλυψε τη θέση και των τριών αλληλόμορφων στο ίδιο χρωμόσωμα (NLL-11), αλλά σε διαφορετικές θέσεις29,34,35.Ωστόσο, λόγω του μικρού αριθμού RIL και της μεγάλης γενετικής απόστασης μεταξύ των δεικτών και των αντίστοιχων αλληλόμορφων, δεν μπορούν να εξαχθούν αξιόπιστα συμπεράσματα σχετικά με τα υποκείμενα γονίδια τους.Από την άλλη πλευρά, η χρήση της αντίστροφης γενετικής στα λούπινα είναι δύσκολη λόγω του πολύ χαμηλού δυναμικού αναγέννησής τους, γεγονός που καθιστά τη γενετική χειραγώγηση δυσκίνητη37.
Η ανάπτυξη εξημερωμένου γεννητικού πλάσματος που φέρει το επιθυμητό αλληλόμορφο σε ομόζυγη κατάσταση, όπως το 83A:476 (Lanr1) και το Mandelup (AnMan), άνοιξε την πόρτα στη μελέτη της αντοχής στην ανθρακνόζη ενόψει της παρουσίας αντίθετων συνδυασμών αλληλόμορφων σε άγριους πληθυσμούς.Δυνατότητες μοριακών μηχανισμών.Συγκρίνετε τις αμυντικές αποκρίσεις που δημιουργούνται από συγκεκριμένους γονότυπους.Αυτή η μελέτη αξιολόγησε την πρώιμη μεταγραφική απόκριση του NLL στον εμβολιασμό με C. lupini.Πρώτον, ένα ευρωπαϊκό πάνελ βλαστικού πλάσματος NLL που περιέχει 215 γραμμές εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μοριακούς δείκτες που επισημαίνουν τα αλληλόμορφα Lanr1 και AnMan.Ο φαινοτυπικός προσδιορισμός της ανθρακνόζης πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια σε 50 γραμμές NLL, που είχαν προηγουμένως επιλεγεί για μοριακούς δείκτες, υπό ελεγχόμενες συνθήκες.Με βάση αυτά τα πειράματα, επιλέχθηκαν τέσσερις γραμμές που διαφέρουν ως προς την αντίσταση στην ανθρακνόζη και την αλληλική σύνθεση Lanr1/AnMan για το προφίλ έκφρασης γονιδίων διαφορικής άμυνας χρησιμοποιώντας δύο συμπληρωματικές προσεγγίσεις: προσδιορισμό αλληλουχίας RNA υψηλής απόδοσης και ποσοτικοποίηση PCR σε πραγματικό χρόνο.
Η διαλογή ενός συνόλου βλαστικού πλάσματος NLL (N = 215) με δείκτες Lanr1 (Anseq3 και Anseq4) και AnMan (Anseq4) και AnMan (AnManM1) έδειξε ότι μόνο μία γραμμή (95726, κοντά στη Salamanca-b) ενισχύει την «αντίσταση» των αλληλόμορφων αλληλόμορφων, ενώ η ένδειξη «allelesus» σε 158 (~73,5%) γραμμές.Δεκατρείς γραμμές παρήγαγαν δύο «ανθεκτικά» αλληλόμορφα του δείκτη Lanr1 και 8 σειρές παρήγαγαν «ανθεκτικά» αλληλόμορφα του Lanr1.σημάδι.Το αλληλόμορφο «αντίστασης» του δείκτη AnMan (Συμπληρωματικός Πίνακας S1).Δύο γραμμές ήταν ετερόζυγες για τον δείκτη Anseq3 και μία ετερόζυγη για τον δείκτη AnManM1.42 γραμμές (19,5%) έφεραν αντίθετες φάσεις των αλληλόμορφων Anseq3 και Anseq4, υποδεικνύοντας υψηλή συχνότητα ανασυνδυασμού μεταξύ αυτών των δύο τόπων.Οι φαινότυποι της ανθρακνόζης υπό ελεγχόμενες συνθήκες (Συμπληρωματικός Πίνακας S2) αποκάλυψαν μεταβλητότητα στην αντοχή των ελεγχόμενων γονότυπων, η οποία αντικατοπτρίστηκε στη σοβαρότητα της ανθρακνόζης.Οι διαφορές στις μέσες βαθμολογίες κυμαίνονταν από 1,8 (μέτρια ανθεκτικό) έως 6,9 (ευαίσθητο) και οι διαφορές βάρους των φυτών κυμαίνονταν από 0,62 (ευαίσθητο) έως 4,45 g (ανθεκτικό). Υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν σε δύο επαναλήψεις του πειράματος (0,51 για τις βαθμολογίες σοβαρότητας της νόσου, P = 0,00017 και 0,61 για το βάρος των φυτών, P < 0,0001) καθώς και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (− 0,59 και − 0,77, P < 0,000). Υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν σε δύο επαναλήψεις του πειράματος (0,51 για βαθμολογίες σοβαρότητας ασθένειας, P = 0,00017 και 0,61 για βάρος φυτού, P < 0,0001) καθώς και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (− 0,59 και − 0,77, P < 0,0). Выявлена ​​Достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностях эksperimenta (0,51 για μπαλλό тяжести болεσίες, P = 0,00017 και 0,61 για κάθε μάσο, 0,51 για κάθε μάθηση, P = 0,00017 και 0,61 για κάθε μάσο, 0,00 ετησίως), умя параметри (-0,59 и -0,77, Р < 0,0001) 0,0001). Βρέθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν σε δύο επαναλήψεις του πειράματος (0,51 για βαθμολογίες σοβαρότητας ασθένειας, P = 0,00017 και 0,61 για βάρος φυτού, P < 0,0001), καθώς και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (- 0,59 και -0,77, P <110,0).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评P.10，0P.10，0.物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77，P <0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程庈 严重 程庈 5 踺. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（0（0（ （（（（0（0（（（（（0（（（（（））和– 0,59 和- 0,77, P < 0,0001). Ενημερωθείτε σημαντικά 001) 0,77, P <0,0001. Υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που παρατηρήθηκαν εις διπλούν (βαθμολογία σοβαρότητας ασθένειας 0,51, P = 0,00017 και βάρος φυτού 0,61, P < 0,0001) και μεταξύ αυτών των δύο παραμέτρων (-0,59 και -0,0001) 0,77, P1,0001, P<0,00 ).Τα τυπικά συμπτώματα που παρατηρούνται σε ευαίσθητα φυτά περιλαμβάνουν συστροφή και συστροφή του στελέχους που μοιάζει με δομή «βοσκού τόξου», ακολουθούμενα από οβάλ βλάβες με πορτοκαλί/ροζ σποροζωίτες (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).Οι αυστραλιανές προσαρτήσεις που φέρουν τα γονίδια Lanr1 (83A:476 και Tanjil) και AnMan (Mandelup) είναι μέτρια ανθεκτικά, 0,0331 και 0,0036).Ορισμένες γραμμές που φέρουν επίσης «ανθεκτικά» αλληλόμορφα Lanr1 ή/και AnMan εμφανίζουν συμπτώματα της νόσου.
Είναι ενδιαφέρον ότι μερικές γραμμές NLL που δεν είχαν κανένα «ανθεκτικό» αλληλόμορφο δείκτη αποκάλυψαν υψηλό επίπεδο αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμο ή υψηλότερο από ό,τι για τους γονότυπους Lanr1 ή AnMan), όπως το Boregine (τιμή P < 0,0001 και για τις δύο παραμέτρους), το Bojar (τιμή P < 0,0001 και την τιμή B01 για το φυτό και το 01 < 9) και 0. .0001 για βαθμολογία και μη σημαντικό για βάρος). Είναι ενδιαφέρον ότι μερικές γραμμές NLL που δεν είχαν κανένα «ανθεκτικό» αλληλόμορφο δείκτη αποκάλυψαν υψηλό επίπεδο αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμο ή υψηλότερο από ό,τι για τους γονότυπους Lanr1 ή AnMan), όπως το Boregine (τιμή P < 0,0001 και για τις δύο παραμέτρους), το Bojar (τιμή P < 0,0001 και την τιμή B01 για το φυτό και το 01 < 9) και 0. .0001 για βαθμολογία και μη σημαντικό για βάρος). Interesno, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» μαρκερνό αλέλλια, показали высокий уровень устойчивости к antraknozu (сопоставимый или более высокий, чем дл. P <0,0001 для обоих параметров), Bojar (σημασία P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) και δημοτικότητα B-549/79b (σημασία P <0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения). Είναι ενδιαφέρον ότι αρκετές σειρές NLL που δεν είχαν κανένα «ανθεκτικό» αλληλόμορφο δείκτη έδειξαν υψηλό επίπεδο αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμο ή υψηλότερο από ό,τι για τους γονότυπους Lanr1 ή AnMan), όπως το Boregine (τιμή P < 0,0001 και για τις δύο παραμέτρους ), το Bojar (τιμή P < 0,0001 βάρος < 0,0001 για το φυτό) 0,0001 για αξιολόγηση και μη σημαντικό για το βάρος).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭 抗性an 基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得0分0 .001）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）。 Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένα συστήματα NLL που δεν έχουν «αντιγονικούς» δείκτες εμφανίζουν υψηλή οριζόντια αντίσταση (ισοδύναμη με τα γονίδια Lanr1 ή AnMan ή υψηλότερη), όπως το Boregine (και οι δύο παράμετροι P < 0,0001), το Bojar (τιμή P < 0,0001, το βάρος του φυτού 0,001) και το στέλεχος <7, όχι σημαντική τιμή βάρους (Β-54). Interesno, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентности», показали высокие уровни устойчивости к antraknozu (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 ή AnM ров <0,0001), Bojar (σημασία P <0,0001, масса растения 0,001) και δημοτικότητα B-549/79b (оценка P-σημεία <0,0001, масса незначительна). Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένες γραμμές NLL που δεν είχαν οποιαδήποτε αλληλόμορφα δείκτη «αντίστασης» έδειξαν υψηλά επίπεδα αντοχής στην ανθρακνόζη (συγκρίσιμη ή υψηλότερη από το LANR1 ή τους γονότυπους Anman), όπως η Boregine (P-exto και για τις δύο παραμέτρους <0,0001), το Bojar (P-Value <0,0001, το βάρος των φυτών 0,001) και τον πληθυσμό Β-549/79b (P-Value <0,000.Αυτό το φαινόμενο υποδηλώνει την πιθανότητα μιας νέας γενετικής πηγής αντίστασης, εξηγώντας την παρατηρούμενη έλλειψη συσχέτισης μεταξύ των γονότυπων δεικτών και των φαινοτύπων της νόσου (τιμές P από ~0,42 έως ~0,98).Έτσι, η δοκιμή Kolmogorov-Smirnov έδειξε ότι τα δεδομένα για την αντοχή στην ανθρακνόζη κατανέμονταν περίπου κανονικά για βαθμολογίες (P-τιμές 0,25 και 0,11) και μάζα φυτών (P-τιμές 0,47 και 0,55), υποδηλώνοντας ότι υποθέτω ότι εμπλέκονται περισσότερα αλληλόμορφα από τα Lanr1 και AnMan.
Με βάση τα αποτελέσματα της διαλογής αντίστασης στην ανθρακνόζη, επιλέχθηκαν 4 γραμμές για ανάλυση μεταγραφώματος: 83A:476, Boregine, Mandelup και Πληθυσμός 22660. Αυτές οι γραμμές δοκιμάστηκαν ξανά για αντοχή στον άνθρακα σε πειράματα ενοφθαλμισμού με αλληλουχία RNA, με την προϋπόθεση ότι ήταν ίδιες όπως στην προηγούμενη δοκιμή.Οι τιμές βαθμολογίας ήταν οι εξής: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) και πληθυσμός 22660 (6,11 ± 1,29).
Το πρωτόκολλο Illumina NovaSeq 6000 πέτυχε κατά μέσο όρο 40,5 ζεύγη Mread ανά δείγμα (29,7 έως 54,4 Mreads) (Συμπληρωματικός Πίνακας S3).Οι βαθμολογίες ευθυγράμμισης στην ακολουθία αναφοράς κυμαίνονταν από 75,5% έως 88,6%.Η μέση συσχέτιση των δεδομένων μέτρησης ανάγνωσης μεταξύ πειραματικών παραλλαγών μεταξύ βιολογικών αντιγράφων κυμάνθηκε από 0,812 έως 0,997 (μέση τιμή 0,959). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν αποκάλυψαν έκφραση και τα άλλα 4785 γονίδια εκφράστηκαν σε αμελητέο επίπεδο (μέσος όρος βάσης < 5). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν αποκάλυψαν έκφραση και τα άλλα 4785 γονίδια εκφράστηκαν σε αμελητέο επίπεδο (μέσος όρος βάσης < 5). Από 35 170 proanalyzirovannыh genov 2917 ne proyavlyali эkspresssii, a ostalьnыe 4785 genov эkspressirovalisь на незначительном уровне (базовое среднее <5). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν έδειξαν έκφραση και τα υπόλοιπα 4785 γονίδια εκφράστηκαν σε αμελητέο επίπεδο (μέσος όρος βάσης <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忽值< 5）.35.170 Από 35 170 αναλυόμενοι γενέθλιοι 2917, δεν είναι εκφραστές, και 4785 γενόμετρα δεν έχουν σημασία (βασική μέση τιμή <5). Από τα 35.170 γονίδια που αναλύθηκαν, τα 2917 δεν εκφράστηκαν και τα υπόλοιπα 4785 γονίδια είχαν αμελητέα έκφραση (μέσος όρος βάσης <5).Έτσι, ο αριθμός των γονιδίων που θεωρήθηκαν εκφρασμένα (μέση βάση ≥ 5) κατά τη διάρκεια του πειράματος ήταν 27.468 (78,1%) (Συμπληρωματικός Πίνακας S4).
Από το πρώτο χρονικό σημείο, όλες οι γραμμές NLL ανταποκρίθηκαν στον ενοφθαλμισμό του C. lupini (στέλεχος Col-08) με επαναπρογραμματισμό του μεταγραφώματος (Πίνακας 1), ωστόσο, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των γραμμών.Έτσι, η γραμμή αντίστασης 83A:476 (που φέρει το γονίδιο Lanr1) έδειξε σημαντικό επαναπρογραμματισμό μεταγραφώματος στο πρώτο χρονικό σημείο (6 hpi) με 31-69 φορές αύξηση στον αριθμό των απομονωμένων γονιδίων άνω και κάτω σε σύγκριση με άλλα χρονικά σημεία σε αυτό το χρονικό σημείο.Επιπλέον, αυτή η κορυφή ήταν βραχύβια, καθώς η έκφραση μόνο μερικών γονιδίων παρέμεινε σημαντικά αλλαγμένη στο δεύτερο χρονικό σημείο (12 hpi).Είναι ενδιαφέρον ότι το Boregine, το οποίο επίσης έδειξε υψηλό επίπεδο αντίστασης στη δοκιμή μοσχεύματος, δεν υποβλήθηκε σε τέτοιο μαζικό μεταγραφικό επαναπρογραμματισμό κατά τη διάρκεια του πειράματος.Ωστόσο, ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (DEG) ήταν ο ίδιος για το Boregine και 83A:476 σε 12 HPI.Τόσο το Mandelup όσο και ο πληθυσμός 22660 έδειξαν κορυφές DEG στο τελευταίο χρονικό σημείο (48 l/s), υποδεικνύοντας σχετική καθυστέρηση στις αμυντικές αποκρίσεις.
Επειδή το 83A:476 υποβλήθηκε σε μαζικό επαναπρογραμματισμό μεταγραφώματος σε απόκριση στο C. lupini σε 6 HPI σε σύγκριση με όλες τις άλλες γραμμές, ~ 91% των DEG που παρατηρήθηκαν σε αυτό το χρονικό σημείο ήταν ειδικά για τη γενεαλογία (Εικ. 1).Ωστόσο, υπήρξε κάποια επικάλυψη στις πρώιμες αποκρίσεις μεταξύ των γραμμών μελέτης, καθώς 68,5%, 50,9% και 52,6% DEG στο Boregine, στο Mandelup και στον πληθυσμό 22660, αντίστοιχα, επικαλύπτονταν με εκείνες που βρέθηκαν στο 83A:476 σε ορισμένα χρονικά σημεία.Ωστόσο, αυτά τα DEG αντιπροσώπευαν μόνο ένα μικρό κλάσμα (0,97–1,70%) όλων των DEG που ανιχνεύθηκαν επί του παρόντος χρησιμοποιώντας το 83A:476.Επιπλέον, 11 DEGs από όλες τις σειρές ήταν συνεκτικές εκείνη τη στιγμή (Συμπληρωματικοί πίνακες S4-S6), συμπεριλαμβανομένων κοινών συστατικών των αποκρίσεων άμυνας των φυτών: πρωτεΐνη μεταφοράς λιπιδίων (TanjilG_32225), ένζυμο ενδογλυκάνη-1,3-β-γλυκοζίτη (TanjilG_23384), δύο πρωτεΐνες όπως το stress-3anjil22 31531), βασική πρωτεΐνη λατέξ (TanjilG_32352) και δύο πρωτεΐνες δομικού κυτταρικού τοιχώματος πλούσιες σε γλυκίνη (TanjilG_19701 και TanjilG_19702).Υπήρχε επίσης μια σχετικά υψηλή επικάλυψη στις αποκρίσεις μεταγραφώματος μεταξύ 83A:476 και Boregine στους 24 HPI (σύνολο 16-38% DEG) και μεταξύ Mandelup και πληθυσμού 22660 στους 48 HPI (συνολικά 14-20% DEG).
Διάγραμμα Venn που δείχνει τον αριθμό των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (DEG) σε γραμμές στενόφυλλου λούπινου (NLL) εμβολιασμένες με Colletotrichum lupini (στέλεχος Col-08 που ελήφθη από πεδία λούπινου στο Wierzhenice, Πολωνία, 1999).Οι σειρές NLL που αναλύθηκαν ήταν: 83A:476 (ανθεκτικές, που φέρουν το αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτικό, γενετικό υπόβαθρο άγνωστο), Mandelup (μέτρια ανθεκτικό, που φέρει το αλληλόμορφο AnMan) και πληθυσμός 22660 (πολύ ευαίσθητος).Η συντομογραφία hpi είναι για ώρες μετά τον εμβολιασμό.Οι μηδενικές τιμές έχουν αφαιρεθεί για να απλοποιηθεί το γράφημα.
Το σύνολο των υπερεκφρασμένων γονιδίων στα 6 hpi αναλύθηκε για την παρουσία κανονικών περιοχών γονιδίου R (Συμπληρωματικός Πίνακας S7).Αυτή η μελέτη αποκάλυψε επαγωγή μεταγραφώματος κλασικών γονιδίων αντοχής σε νόσο με περιοχές NBS-LRR μόνο στο 83A:476.Αυτό το σύνολο αποτελούνταν από ένα γονίδιο TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), πέντε γονίδια CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 και tanjilg_16ur16-L), και NBS16-L), LRRE (tanjilg_16162) καθώς και Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) και Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Όλα αυτά τα γονίδια έχουν κανονικές περιοχές διατεταγμένες σε διατηρημένες αλληλουχίες.Εκτός από τα γονίδια του τομέα NBS-LRR, αρκετές κινάσες RLL ενεργοποιήθηκαν στους 6 hpi, συγκεκριμένα μία στο Boregine (TanjilG_19877), δύο στο Mandelup (TanjilG_07141 και TanjilG_19877) και στον πληθυσμό 22660 (TanjilG_1983) και TanjilG_22660 (TanjilG_1913) και TanjilG0 7:476.
Γονίδια με σημαντικά αλλαγμένη έκφραση σε απόκριση στον εμβολιασμό με C. lupini (στέλεχος Col-08) υποβλήθηκαν σε ανάλυση εμπλουτισμού Οντολογίας Γονιδίων (GO) (Συμπληρωματικός Πίνακας S8). Ο πιο συχνά υπερεκπροσωπούμενος όρος βιολογικής διεργασίας ήταν «GO:0006952 αμυντική απόκριση» που εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γραμμή) με υψηλή σημασία (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2). Ο πιο συχνά υπερεκπροσωπούμενος όρος βιολογικής διεργασίας ήταν «GO:0006952 αμυντική απόκριση» που εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γραμμή) με υψηλή σημασία (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 защитный ответ», который появлялся σε 6 από 16 (време × линя) συνδιασμός με высокой (0006952). Ο πιο συχνά υπερεκπροσωπούμενος όρος βιολογικής διεργασίας ήταν «GO:0006952 αμυντική απόκριση», ο οποίος εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γενεαλογία) με υψηλή σημασία (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2).最常被过度代表的生物过程术语是"GO:0006952 防御反应"，它出现在16 个（×旻个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. Ο πιο αντιπροσωπευτικός όρος βιολογικής διεργασίας είναι «GO:0006952 αμυντική απόκριση», που εμφανίζεται σε 6 από τους 16 (时间×线) συνδυασμούς, με υψηλή σημασία (τιμή P < 0,001) (图2) . Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defence Response», который появлялся во 6 из 16 συνδυασμούς (время × линя) со высокой значимостью (σημαίνει 1). Ο πιο συχνά υπερεκπροσωπούμενος όρος βιολογικής διεργασίας ήταν «GO:0006952 Defense Response», ο οποίος εμφανίστηκε σε 6 από τους 16 συνδυασμούς (χρόνος × γραμμή) με υψηλή σημασία (τιμή P < 0,001) (Εικ. 2).Αυτός ο όρος υπερεκπροσωπήθηκε σε δύο χρονικά σημεία στο 83A: 476 και Boregine (6 και 24 hpi) και σε ένα χρονικό σημείο στο Mandelup και τον πληθυσμό 22660 (12 και 6 hpi, αντίστοιχα).Αυτό είναι ένα αναμενόμενο αποτέλεσμα, υπογραμμίζοντας την αντιμυκητιακή απόκριση των ανθεκτικών γραμμών.Επιπλέον, το 83A:476 ανταποκρίθηκε στο C. lupini προκαλώντας ταχέως γονίδια που σχετίζονται με την οξειδωτική έκρηξη που αντιπροσωπεύεται από τον όρο «GO:0055114 οξειδοαναγωγική διεργασία», υποδεικνύοντας μια συγκεκριμένη αμυντική απόκριση, ενώ ο Boregine αποκάλυψε συγκεκριμένες αμυντικές αποκρίσεις, που σχετίζονται με τον όρο «GO».:0006950 Απόκριση στρες».Ο πληθυσμός 22660 ενεργοποίησε την οριζόντια απόκριση αντίστασης που περιελάμβανε δευτερογενείς μεταβολίτες, τονίζοντας τον υπερβολικό αριθμό όρων «GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis» και «GO:0006722 Process of triterpene metabolism» (και οι δύο όροι ανήκουν στο ίδιο σύνολο γονιδίων, λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της ανάλυσης και του όρου enrich Mandelup. 22660. Επιπλέον, η πρώιμη αντίδραση 83A:476 (6 hpi) και η καθυστερημένη αντίδραση Mandelup and Population 22660 περιλαμβάνουν τον όρο GO:0015979 «φωτοσύνθεση» και άλλες σχετικές βιολογικές διεργασίες.
Οι όροι γονιδιακής οντολογίας της βιοδιεργασίας που επιλέχθηκαν στον σχολιασμό των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων κατά τις αποκρίσεις μεταγραφής του στενόφυλλου λούπινου (NLL) εμβολιασμένου με λούπινο άνθρακα (στέλεχος Col-08 που ελήφθη από πεδία λούπινου στο Wierzhenice, Πολωνία, το 1999) είναι σε μεγάλο βαθμό.Οι σειρές NLL που αναλύθηκαν ήταν: 83A:476 (ανθεκτικές, που φέρουν το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτικό, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).
Επειδή αυτή η μελέτη στόχευε στον εντοπισμό γονιδίων που συμβάλλουν στην αντίσταση στην ανθρακνόζη, τα γονίδια που αποδίδονται στους όρους GO «GO: 0006952 Αμυντικές αποκρίσεις» και «GO: 0055114 Διεργασίες οξειδοαναγωγής» αναλύθηκαν με διαχωρισμούς δεδομένου ότι η τιμή αναφοράς σημαίνει ≥ 30 με τουλάχιστον μία γραμμή.× σημείο στο χρόνο που συνδυάζει στατιστικά σημαντικές τιμές του log2 (πλάσια αλλαγή).Ο αριθμός των γονιδίων που πληρούσαν αυτά τα κριτήρια ήταν 65 για το GO:0006952 και 524 για το GO:0055114.
83A:476 αποκάλυψε δύο κορυφές DEG που σχολιάστηκαν με τον όρο GO:0006952, η πρώτη με 6 γονίδια ανά ίντσα (64 γονίδια, ρύθμιση πάνω και κάτω) και η δεύτερη με 24 γονίδια ανά ίντσα (15 γονίδια, μόνο ρύθμιση προς τα πάνω).Το Boregine έδειξε επίσης ότι το GO:0006952 κορυφώθηκε στο ίδιο χρονικό σημείο, αλλά με λιγότερες DEG (11 και 8) και προνομιακή ενεργοποίηση.Ο Mandeloop έδειξε δύο κορυφές GO:0006952 σε 12 και 48 HPI, και οι δύο φέρουν 12 γονίδια (το πρώτο με γονίδια ενεργοποίησης και το δεύτερο με μόνο κατασταλτικά γονίδια), ενώ ο πληθυσμός 22660 με 6 HPI (13 γονίδια) είχε μεγαλύτερη κυριαρχία της αιχμής αύξησης.κανονισμός λειτουργίας.Πρέπει να σημειωθεί ότι το 96,4% του GO:0006952 DEG σε αυτές τις κορυφές είχε τον ίδιο τύπο απόκρισης (πάνω ή κάτω), υποδηλώνοντας σημαντική επικάλυψη στις αμυντικές αποκρίσεις παρά τις διαφορές στον αριθμό των εμπλεκόμενων γονιδίων.Η μεγαλύτερη ομάδα αλληλουχιών που σχετίζεται με τον όρο GO:0006952 κωδικοποιεί την πρωτεΐνη 22 του μηνύματος που σχετίζεται με το στρες της πείνας (SAM22-like), η οποία ανήκει στην κατηγορία 10 πρωτεϊνών που σχετίζεται με την παθογένεση (PR-10) και το λάτεξ της βασικής πρωτεΐνης.παρόμοια (όμοια με MLP) πρωτεΐνη) πρωτεΐνη (Εικ. 3).Οι δύο ομάδες διέφεραν ως προς τη φύση της έκφρασης και την κατεύθυνση της απόκρισης.Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες τύπου SAM22 έδειξαν συνεπή και σημαντική επαγωγή σε πρώιμα χρονικά σημεία (6 ή 12 hpi) και γενικά δεν ανταποκρίθηκαν στο τέλος του πειράματος (48 hpi), ενώ οι πρωτεΐνες που μοιάζουν με MLP έδειξαν συντονισμό στα 6 hpi.hpi.83A:476 και Mandelup με 48 hp/in, σχεδόν όλα τα άλλα σημεία δεδομένων δεν ανταποκρίθηκαν.Επιπλέον, οι διαφορές στα προφίλ έκφρασης των γονιδίων πρωτεΐνης τύπου SAM22 ακολούθησαν παρατηρούμενη μεταβλητότητα στην αντίσταση στην ανθρακνόζη, καθώς οι πιο ανθεκτικές γραμμές είχαν περισσότερα χρονικά σημεία που επάγουν σημαντικά αυτά τα γονίδια από τα πιο ευαίσθητα γονίδια.Ένα άλλο γονίδιο PR-10 που μοιάζει με LlR18A/B έδειξε ένα πολύ παρόμοιο πρότυπο έκφρασης με το γονίδιο πρωτεΐνης τύπου SAM22.
Τα κύρια συστατικά του όρου βιολογικής διεργασίας «GO:0006952 Defense Response» και τα πρότυπα έκφρασης των υποψηφίων γονιδίων των αλληλόμορφων Lanr1 και AnMan ταυτοποιήθηκαν.Η κλίμακα Log2 αντιπροσωπεύει τις τιμές log2 (πτυχιακή αλλαγή) μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από αγρούς λούπινου, Wizhenica, Πολωνία, 1999) και των φυτών ελέγχου (εικονικά εμβολιασμένα) στο ίδιο χρονικό σημείο.Αναλύθηκαν οι ακόλουθες στενόφυλλες γραμμές λούπινου: 83A:476 (ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτικό, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).
Επιπλέον, αξιολογήθηκαν τα προφίλ έκφρασης των υποψήφιων γονιδίων RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) και AnMan (TanjilG_12861) (Εικ. 3).Το γονίδιο TanjilG_05042 έδειξε σημαντική απόκριση (ενεργοποίηση) στο 83A:476 μόνο στο πρώτο χρονικό σημείο (6 hpi), ενώ το TanjilG_12861 ήταν σημαντικό στο Mandeloop μόνο σε δύο χρονικά σημεία: 6 hpi (κάτω ρύθμιση) και 24 hpi (6 hpi).Με.).ρυθμιζόμενο) ).
Τα πιο υπερεκφρασμένα γονίδια στον όρο GO:0055114 «διεργασία οξειδοαναγωγής» ήταν γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες του κυτοχρώματος P450 και την υπεροξειδάση (Εικ. 4).Για δείγματα που απομονώθηκαν από το 83A:476 σε 6 HPI, παρατηρήθηκαν γενικά μέγιστες ή ελάχιστες τιμές log2 (για το 86,6% των γονιδίων) μεταξύ των εμβολιασμένων φυτών και των φυτών ελέγχου, υπογραμμίζοντας την υψηλή απόκριση αυτού του γονότυπου στο φύλο εμβολιασμού.83A:476 έδειξε το πιο σημαντικό GO: 0055114 DEG στα 6 hpi (503 γονίδια), ενώ οι υπόλοιπες γραμμές σε 48 hpi (Boregine, 31 γονίδια, Mandelup, 85 γονίδια και Πληθυσμός 22660, 78 γονίδια)).Στα περισσότερα γονίδια της οικογένειας GO:0055114, παρατηρήθηκαν δύο τύποι ανταποκρίσεων στον εμβολιασμό (ενεργοποίηση και αναστολή).Είναι ενδιαφέρον ότι έως και 97,6% των DEG που προσδιορίστηκαν για τον όρο GO: 0055114 στο Mandelupe στους 48 ίππους Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι, παρά τη σημαντικά μικρότερη κλίμακα (δηλ. τον αριθμό των μεταλλαγμένων γονιδίων οξειδοαναγωγής, 85 έναντι 503), το μοτίβο της καθυστερημένης απόκρισης της μεταγραφής της μεταγραφής σε: 76.Στο Boregine και στον πληθυσμό 22660, αυτή η σύγκλιση είναι χαμηλότερη στο 51,6% και 75,6%, αντίστοιχα.
Αποκαλύφθηκαν τα πρότυπα έκφρασης των κύριων συστατικών του όρου της βιολογικής διεργασίας «GO:0055114 Οξειδοαναγωγική διεργασία».Η κλίμακα Log2 αντιπροσωπεύει τις τιμές log2 (πτυχιακή αλλαγή) μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από αγρούς λούπινου, Wizhenica, Πολωνία, 1999) και των φυτών ελέγχου (εικονικά εμβολιασμένα) στο ίδιο χρονικό σημείο.Αναλύθηκαν οι ακόλουθες στενόφυλλες γραμμές λούπινου: 83A:476 (ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτικό, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).
83A:476 Οι μεταγραφικές αποκρίσεις στον ενοφθαλμισμό με C. lupini (στέλεχος Col-08) περιελάμβαναν επίσης συντονισμένη σίγαση των γονιδίων που αποδίδονται στον όρο GO:0015979 «φωτοσύνθεση» και άλλες σχετικές βιολογικές διεργασίες (Εικόνα 5).Αυτό το σετ GO:0015979 DEG περιείχε 105 γονίδια που καταπιέστηκαν σημαντικά σε 6 hpi στο 83A:476.Σε αυτό το υποσύνολο, 37 γονίδια υπορυθμίστηκαν επίσης στο Mandelup σε 48 HPI και 35 στο ίδιο χρονικό σημείο στον πληθυσμό 22660, συμπεριλαμβανομένων 19 DEG κοινών και στους δύο γονότυπους.Δεν ενεργοποιήθηκαν σημαντικά DEG που σχετίζονται με τον όρο GO: 0015979 σε κανένα συνδυασμό (γραμμή x χρόνος).
Αποκαλύφθηκαν τα πρότυπα έκφρασης των κύριων συστατικών του όρου της βιολογικής διαδικασίας «GO:0015979 Photosynthesis».Η κλίμακα Log2 αντιπροσωπεύει τις τιμές log2 (πτυχιακή αλλαγή) μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που ελήφθη από αγρούς λούπινου, Wizhenica, Πολωνία, 1999) και των φυτών ελέγχου (εικονικά εμβολιασμένα) στο ίδιο χρονικό σημείο.Αναλύθηκαν οι ακόλουθες στενόφυλλες γραμμές λούπινου: 83A:476 (ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Boregine (ανθεκτικό, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο), Mandelup (μέτρια ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).
Με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης διαφορικής έκφρασης και πιθανώς εμπλέκεται σε αμυντικές αποκρίσεις έναντι παθογόνων μυκήτων, αυτό το σύνολο επτά γονιδίων επιλέχθηκε για ποσοτικοποίηση των προφίλ έκφρασης με PCR πραγματικού χρόνου (Συμπληρωματικός Πίνακας S9).
Το υποτιθέμενο γονίδιο πρωτεΐνης TanjilG_10657 προκλήθηκε σημαντικά σε όλες τις υπό μελέτη γραμμές και χρονικά σημεία σε σύγκριση με τα φυτά ελέγχου (μιμητικά) (Συμπληρωματικοί πίνακες S10, S11).Επιπλέον, το προφίλ έκφρασης του TanjilG_10657 έδειξε μια αυξητική τάση κατά τη διάρκεια του πειράματος για όλες τις γραμμές.Ο πληθυσμός 22660 έδειξε την υψηλότερη ευαισθησία του TanjilG_10657 στον εμβολιασμό με 114 φορές ενεργοποίηση και το υψηλότερο επίπεδο σχετικής έκφρασης (4,4 ± 0,4) σε 24 HPI (Εικ. 6a).Το γονίδιο πρωτεΐνης PR10 LlR18A TanjilG_27015 έδειξε επίσης ενεργοποίηση σε όλες τις γραμμές και τα χρονικά σημεία, με στατιστική σημασία στα περισσότερα σημεία δεδομένων (Εικ. 6β).Παρόμοια με το TanjilG_10657, το υψηλότερο σχετικό επίπεδο έκφρασης του TanjilG_27015 παρατηρήθηκε στον 22660 εμβολιασμένο πληθυσμό στους 24 HPI (19,5 ± 2,4).Το γονίδιο όξινης ενδοχιτινάσης TanjilG_04706 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω σε όλες τις γραμμές και σε όλα τα χρονικά σημεία εκτός από το Boregine 6 hpi (Εικ. 6c).Προκλήθηκε έντονα στο πρώτο χρονικό σημείο (6 HPI) στα 83A:476 (κατά 10,5 φορές) και αυξήθηκε μέτρια σε άλλες γραμμές (κατά 6,6-7,5 φορές).Κατά τη διάρκεια του πειράματος, η έκφραση του TanjilG_04706 παρέμεινε σε παρόμοια επίπεδα στο 83A:476 και στο Boregine, ενώ στο Mandelup και τον πληθυσμό 22660 αυξήθηκε σημαντικά, φτάνοντας σε σχετικά υψηλές τιμές (5,9 ± 1,5 και 6,2 ± 1,5, αντίστοιχα).Το γονίδιο που μοιάζει με ενδογλυκάνη-1,3-β-γλυκοσιδάση TanjilG_23384 έδειξε υψηλή ενεργοποίηση στα δύο πρώτα χρονικά σημεία (6 και 12 hpi) σε όλες τις γραμμές εκτός του πληθυσμού 22660 (Εικ. 6δ).Τα υψηλότερα επίπεδα σχετικής έκφρασης του TanjilG_23384 παρατηρήθηκαν στο δεύτερο χρονικό σημείο (12 hpi) στο Mandelup (2,7 ± 0,3) και στο 83A:476 (1,5 ± 0,1).Σε 24 HPI, η έκφραση TanjilG_23384 ήταν σχετικά χαμηλή σε όλες τις υπό μελέτη γραμμές (από 0,04 ± 0,009 έως 0,44 ± 0,12).
Προφίλ έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων (ag) που αποκαλύφθηκαν με ποσοτική PCR.Οι αριθμοί 6, 12 και 24 αντιπροσωπεύουν ώρες μετά τον εμβολιασμό.Τα γονίδια LanDExH7 και LanTUB6 χρησιμοποιήθηκαν για κανονικοποίηση και το LanTUB6 για βαθμονόμηση μεταξύ των σειρών.Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση που βασίζεται σε τρία βιολογικά αντίγραφα, καθένα από τα οποία είναι ο μέσος όρος τριών τεχνικών επαναλήψεων. Η στατιστική σημασία των διαφορών στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που λήφθηκε το 1999 από το χωράφι λούπινου στη Wierzenica, Πολωνία) και των φυτών ελέγχου (ψευδώς εμβολιασμένα) σημειώνονται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*P value < 0,05, **P τιμή *** 0.0). Η στατιστική σημασία των διαφορών στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που λήφθηκε το 1999 από το χωράφι λούπινου στη Wierzenica, Πολωνία) και των φυτών ελέγχου (ψευδώς εμβολιασμένα) σημειώνονται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*P value < 0,05, **P τιμή *** 0.0). Статистическая значитемость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, πόλουчен το 1999 γ. με πολιά λюπινα σε Βερζενιτσέ, Πολλьша) και ανενόχλητο και έλεγχος х (*σημασία P < 0,05, **σημασία P ≤ 0,01, ***σημασία P ≤ 0,001). Στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που λήφθηκε το 1999 από χωράφι λούπινου στο Wierzhenice, Πολωνία) και των φυτών μάρτυρα (ψευδώς εμβολιασμένα) σημειώνονται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*P value < 0,05, **P-value ≤ 1,0,00).接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模觋水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 倂0≤ 1.00≥)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对煰）平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001) Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, штамм Col-08, полученный со полей люпина в Верженице, Πολωνία, σε 1999 γ.) нных (* σημασία P < 0,05, ** P-σημασία ≤ 0,01, ***P-σημασία ≤ 0,001). Στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που λήφθηκε από αγρούς λούπινου στο Verzhenice, Πολωνία, το 1999) και των φυτών μάρτυρα (πλαστικά εμβολιασμένα) σημειώνονται πάνω από τα σημεία δεδομένων (*P value < 0,05 , **P-value ≥0-0,0,0).Οι σειρές NLL που αναλύθηκαν ήταν: 83A:476 (ανθεκτικές, φέρουσες το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Mandelup (μέτρια ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan), Boregine (ανθεκτικό, άγνωστο γενετικό υπόβαθρο) και πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).
Το υποψήφιο γονίδιο TanjilG_05042 στον τόπο Lanr1 έδειξε ένα αξιοσημείωτα διαφορετικό πρότυπο έκφρασης από τα προφίλ που ελήφθησαν από μελέτες RNA-seq (Εικ. 6e).Σημαντική ενεργοποίηση αυτού του γονιδίου παρατηρήθηκε στο Mandelup και στον πληθυσμό των 22660 (έως 39,7 και 11,7 φορές, αντίστοιχα), με αποτέλεσμα σχετικά υψηλά επίπεδα έκφρασης (έως 1,4 ± 0,14 και 7,2 ± 1,3, αντίστοιχα).Το 83A:476 αποκάλυψε επίσης κάποια ανοδική ρύθμιση του γονιδίου TanjilG_05042 (έως και 3,8 φορές), ωστόσο, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης που επιτεύχθηκαν (0,044 ± 0,002) ήταν περισσότερο από 30 φορές χαμηλότερα από αυτά που παρατηρήθηκαν στο Mandelup και στον πληθυσμό 22660.που αναλύθηκε με qPCR έδειξε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ γονότυπων σε ψευδοεμβολιασμένες παραλλαγές (μάρτυρας), φτάνοντας σε 58 φορές διαφορά μεταξύ των πληθυσμών 22660 και 83A:476, καθώς και μεταξύ των πληθυσμών 22660 και 22660. Επιτεύχθηκε διπλή διαφορά μεταξύ Boregine και Mandalup.
Το υποψήφιο γονίδιο στον τόπο AnMan, TanjilG_12861, ενεργοποιήθηκε ως απόκριση στον εμβολιασμό στο 83A:476 και το Mandelup, ήταν ουδέτερο στον πληθυσμό των 22660 και ρυθμίστηκε προς τα κάτω στο Boregine (Εικ. 6στ).Η σχετική έκφραση του γονιδίου TanjilG_12861 ήταν η υψηλότερη στο εμβολιασμένο 83Α: 476 (0,14±0,01).Το γονίδιο πρωτεΐνης θερμικού σοκ κατηγορίας Ι 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 έδειξε χαμηλότερα σχετικά επίπεδα έκφρασης σε όλα τα στελέχη και χρονικά σημεία που μελετήθηκαν (Εικ. 6g).Η υψηλότερη τιμή παρατηρήθηκε στους 24 HPI στον πληθυσμό 22660 (0,14 ± 0,02, μια οκταπλάσια αύξηση ως απόκριση στον εμβολιασμό).
Η σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης (Εικ. 7) αποκάλυψε μια υψηλή συσχέτιση μεταξύ TanjilG_10657 και τεσσάρων άλλων γονιδίων: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,700 (r = 0,80)Τέτοια αποτελέσματα μπορεί να υποδεικνύουν συν-ρύθμιση αυτών των γονιδίων κατά τη διάρκεια των αμυντικών αποκρίσεων.Τα γονίδια TanjilG_12861 και TanjilG_23384 έδειξαν διαφορετικά προφίλ έκφρασης με χαμηλότερες τιμές συντελεστών συσχέτισης Pearson (από 0,08 έως 0,43 και -0,19 έως 0,28, αντίστοιχα) σε σύγκριση με άλλα γονίδια.
Οι συσχετίσεις μεταξύ των προφίλ γονιδιακής έκφρασης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR.Αναλύθηκαν οι ακόλουθες στενόφυλλες γραμμές λούπινου: 83A:476 (ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο Lanr1), Mandelup (μέτρια ανθεκτικό, που φέρει το ομόζυγο αλληλόμορφο AnMan), Boregine (ανθεκτικό, γενετικό υπόβαθρο άγνωστο) και Πληθυσμός 22660 (ευαίσθητος).Υπολογίστηκαν τρία χρονικά σημεία (6, 12 και 24 ώρες μετά τον εμβολιασμό), συμπεριλαμβανομένων των εμβολιασμένων (Colletotrichum lupini, στέλεχος Col-08, που λήφθηκαν από αγρούς λούπινου στο Wierzhenice, Πολωνία, το 1999) και των φυτών ελέγχου (εμβολιασμένα με ψευδή τρόπο).Η κλίμακα δείχνει την τιμή του συντελεστή συσχέτισης Pearson.
Με βάση τα δεδομένα που ελήφθησαν σε 6 ίππους ανά ίντσα, το WGCNA διεξήχθη σε 9981 DEG που ταυτοποιήθηκαν συγκρίνοντας τα εμβολιασμένα φυτά και τα φυτά ελέγχου για να επικεντρωθούν στις πρώιμες αποκρίσεις άμυνας (Συμπληρωματικός Πίνακας S12).Βρέθηκαν είκοσι δύο γονιδιακές ενότητες (συστάδες) με συσχετισμένα (θετικά ή αρνητικά) προφίλ έκφρασης μεταξύ γονότυπων και πειραματικών παραλλαγών. Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μειώνονταν με τη σειρά 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (και στις δύο παραλλαγές, ωστόσο, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου). Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μειώνονταν με τη σειρά 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (και στις δύο παραλλαγές, ωστόσο, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (в обоих варијантах, однако, эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μειώθηκαν με τη σειρά 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (και στις δύο παραλλαγές, ωστόσο, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 的顺序下降（然而，在两在对照植物中更强）.平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> πληθυσμός 22660 的 顺序 下降 （， 下降 （， 在在 植物 中 更）………………………………………….. В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (однако в обоих вариантах эта тенденция была сильнее у контрольных растений). Κατά μέσο όρο, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μειώθηκαν στη σειρά 83A:476 > Mandelup > Boregine > Πληθυσμός 22660 (ωστόσο, και στις δύο παραλλαγές, αυτή η τάση ήταν ισχυρότερη στα φυτά ελέγχου).Ο εμβολιασμός είχε ως αποτέλεσμα την ανοδική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ειδικά στις ενότητες 18, 19, 14, 6 και 1 (με φθίνουσα σειρά επίδρασης), αρνητική ρύθμιση (π.χ. ενότητες 9 και 20) ή με ουδέτερα αποτελέσματα (π.χ. ενότητες 11, 22, 8 και 13).Η ανάλυση εμπλουτισμού όρων GO (Συμπληρωματικός Πίνακας S13) αποκάλυψε "GO: 0006952 Προστατευτικές αποκρίσεις" για την εμβολιασμένη μονάδα (18) με μέγιστη ενεργοποίηση, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που αναλύθηκαν με qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_23384, TanjilG_1065, καθώς και701065). συμπιεσμένες μονάδες φωτοσύνθεσης (9).Ο συγκεντρωτής ενότητας 18 (Εικ. 8) ταυτοποιήθηκε ως το γονίδιο TanjilG_26536 που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη LlR18B που μοιάζει με PR-10, και ο συμπυκνωτής ενότητας 9 ταυτοποιήθηκε ως το γονίδιο TanjilG_28955 που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη PsbQ του φωτοσυστήματος II.Ένα υποψήφιο γονίδιο αντοχής στην ανθρακνόζη Lanr1, TanjilG_05042, βρέθηκε στην ενότητα 22 (Εικ. 9) και σχετίζεται με τους όρους «GO:0044260 Κυτταρικές μακρομοριακές μεταβολικές διεργασίες» και «GO:0006355 Μεταγραφική ρύθμιση, πρότυπο DNA» που φέρουν το hu01212G Tanjil.b.b.το γονίδιο κωδικοποιεί τον παράγοντα μεταγραφής θερμικού στρες A-4a (HSFA4a).
Σταθμισμένη δικτυακή ανάλυση της γονιδιακής συνέκφρασης μονάδων με υπερεκπροσωπούμενους όρους βιολογικής διεργασίας «GO: 0006952 Defence Responsions».Η σύνδεση απλοποιήθηκε για να επισημανθούν τα τέσσερα γονίδια που αναλύθηκαν με qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 και TanjilG_27015).
Σταθμισμένη δικτυακή ανάλυση γονιδιακής συνέκφρασης μιας ενότητας με υπερεκπροσωπούμενο όρο βιολογικής διεργασίας «GO: 0006355: Μεταγραφική ρύθμιση, πρότυπο DNA» και που φέρει ένα υποψήφιο γονίδιο αντίστασης στην ανθρακνόζη Lanr1 TanjilG_05042.Η σύνδεση απλοποιήθηκε για να απομονωθεί το γονίδιο TanjilG_05042 και το κεντρικό γονίδιο TanjilG_01212.
Ο έλεγχος αντοχής στην ανθρακνόζη που συλλέχθηκε στην Αυστραλία έδειξε ότι οι περισσότερες ποικιλίες που απελευθερώθηκαν πρώιμα ήταν ευαίσθητες.Τα Kalya, Coromup και Mandelup έχουν περιγραφεί ως μέτρια ανθεκτικά, ενώ τα Wonga, Tanjil και 83A:476 έχουν περιγραφεί ως εξαιρετικά ανθεκτικά26,27,31.είχαν το ίδιο αλληλόμορφο αντίστασης, που ονομαζόταν Lanr1, και οι Coromup και Mandelup είχαν διαφορετικό αλληλόμορφο, ονομαζόμενο AnMan10, 26, 39, ενώ η Kalya πέρασε σε διαφορετικό αλληλόμορφο., Lanr2.Ο έλεγχος για αντοχή στην ανθρακνόζη στη Γερμανία είχε ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση μιας ανθεκτικής γραμμής Bo7212 με ένα υποψήφιο αλληλόμορφο διαφορετικό από το Lanr1, που ονομάζεται LanrBo36.
Η μελέτη μας αποκάλυψε μια πολύ χαμηλή συχνότητα (περίπου 6%) του αλληλόμορφου Lanr1 στο εξεταζόμενο γεννητικό πλάσμα.Αυτή η παρατήρηση είναι σύμφωνη με τα αποτελέσματα της διαλογής του ανατολικοευρωπαϊκού βλαστικού πλάσματος χρησιμοποιώντας τους δείκτες Anseq3 και Anseq4, οι οποίοι έδειξαν ότι το αλληλόμορφο Lanr1 υπάρχει μόνο σε δύο Λευκορωσικές γραμμές.Αυτό υποδηλώνει ότι το αλληλόμορφο Lanr1 δεν χρησιμοποιείται ακόμη ευρέως από τοπικά προγράμματα αναπαραγωγής, σε αντίθεση με την Αυστραλία, όπου είναι ένα από τα βασικά αλληλόμορφα για αναπαραγωγή με υποβοήθηση δεικτών.Αυτό μπορεί να οφείλεται στο χαμηλότερο επίπεδο αντίστασης που παρέχει το αλληλόμορφο Lanr1 σε ευρωπαϊκές συνθήκες πεδίου σε σύγκριση με την αυστραλιανή έκθεση.Επιπλέον, μελέτες της ανθρακνόζης σε περιοχές με υψηλή βροχόπτωση στην Αυστραλία έχουν δείξει ότι οι αποκρίσεις αντίστασης που μεσολαβούνται από το αλληλόμορφο Lanr1 μπορεί να μην είναι αποτελεσματικές σε καιρικές συνθήκες που ευνοούν την ανάπτυξη και την ταχεία ανάπτυξη του παθογόνου19,42.Στην πραγματικότητα, στην παρούσα μελέτη, ορισμένα συμπτώματα ανθρακνόζης παρατηρήθηκαν επίσης σε γονότυπους που φέρουν το αλληλόμορφο Lanr1, υποδηλώνοντας ότι η αντοχή μπορεί να εξαφανιστεί υπό βέλτιστες συνθήκες για την ανάπτυξη του C. lupini.Επιπλέον, είναι πιθανές ψευδώς θετικές ερμηνείες της παρουσίας δεικτών Anseq3 και Anseq4, οι οποίοι απέχουν περίπου 1 cm από τον τόπο Lanr1 28,30,43.
Η μελέτη μας έδειξε ότι το 83A:476, που φέρει το αλληλόμορφο Lanr1, ανταποκρίθηκε στον εμβολιασμό του C. lupini με μεγάλης κλίμακας επαναπρογραμματισμό μεταγραφώματος στο πρώτο αναλυόμενο χρονικό σημείο (6 hpi), ενώ στο Mandelup, που φέρει το αλληλόμορφο AnMan, παρατηρήθηκαν μεταγραφικές αποκρίσεις πολύ αργότερα.(από 24 έως 48 ίππους).Αυτές οι χρονικές παραλλαγές στις αμυντικές αποκρίσεις σχετίζονται με διαφορές στα συμπτώματα της νόσου, υπογραμμίζοντας τη σημασία της έγκαιρης αναγνώρισης του παθογόνου για μια επιτυχημένη απόκριση στην αντίσταση.Για να μολύνουν τον φυτικό ιστό, τα σπόρια του άνθρακα πρέπει να περάσουν από διάφορα αναπτυξιακά στάδια στην επιφάνεια του ξενιστή, συμπεριλαμβανομένης της βλάστησης, της κυτταρικής διαίρεσης και του σχηματισμού ενός appressorium.Ένα προσάρτημα είναι μια μολυσματική δομή που προσκολλάται στην επιφάνεια του ξενιστή και διευκολύνει τη διείσδυση στους ιστούς του ξενιστή.Έτσι, τα σπόρια του C. gloeosporioides στο εκχύλισμα μπιζελιού έδειξαν την πρώτη διαίρεση του πυρήνα μετά από 75-90 λεπτά επώασης, το σχηματισμό ενός βλαστικού σωλήνα μετά από 90-120 λεπτά και την καταστολή μετά από 4 ώρες 45 .Το Mango C. gloeosporioides έδειξε περισσότερο από 40% βλάστηση κονιδίων μετά από 3 ώρες επώασης και περίπου 20% σχηματισμό καταπιεστών μετά από 4 ώρες.Το σχετιζόμενο με τη λοιμογόνο δράση γονίδιο CAP20 του C. gloeosporioides έδειξε μεταγραφική δραστηριότητα σε κονίδια που σχηματίζουν επίφυτα μετά από 3,5 ώρες επώαση σε επιφανειακό κερί αβοκάντο με υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης CAP20 μετά από 4 ώρες και 46 λεπτά.Ομοίως, η δραστηριότητα των γονιδίων βιοσύνθεσης μελανίνης στο C. trifolii προκλήθηκε κατά τη διάρκεια μιας επώασης 2 ωρών που ακολουθήθηκε από το σχηματισμό ενός appressorium μετά από 1 ώρα.Μελέτες στους ιστούς των φύλλων έχουν δείξει ότι οι φράουλες που έχουν ενοφθαλμιστεί με C. acutatum έχουν πρώτη καταστολή στους 8 hpi, ενώ οι ντομάτες που εμβολιάζονται με C. coccodes έχουν πρώτη καταστολή στους 4 hpi48,49.σε μεγάλο βαθμό συνεπής με τη χρονική κλίμακα του Colletotrichum spp.μολυσματική διαδικασία.Οι γρήγορες αποκρίσεις άμυνας στο 83A:476 υποδηλώνουν συμμετοχή γονιδίων αντίστασης φυτών και γονιδίων ανοσίας που προκαλείται από τελεστές (ETI) σε αυτή τη γραμμή, ενώ οι καθυστερημένες αποκρίσεις του Mandelup υποστηρίζουν την υπόθεση 50 που σχετίζεται με το μοριακό πρότυπο πυροδότησης (MTI). Πρώιμες αποκρίσεις στο 83A: 476Η μερική επικάλυψη μεταξύ γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω ή προς τα κάτω στην καθυστερημένη απόκριση υποστηρίζει επίσης αυτήν την ιδέα, καθώς η ETI θεωρείται συχνά ως μια επιταχυνόμενη και ενισχυμένη απόκριση MTI που καταλήγει στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο στο σημείο της μόλυνσης, γνωστό ως αναφυλακτικό σοκ 51,52 .
Τα περισσότερα από τα γονίδια που αποδίδονται στον υπερεκπροσωπούμενο όρο Gene Ontology GO:0006952 “Defense Response” είναι τα 11 ομόλογα της πρωτεΐνης νηστείας 22 που προκαλείται από το στρες (παρόμοια με το SAM22) και τα επτά κύρια λάτεξ που μοιάζουν με πρωτεΐνη (MLPs).Οι όμοιες πρωτεΐνες 31, 34, 43 και 423 έδειξαν ομοιότητα αλληλουχίας.Τα γονίδια που μοιάζουν με SAM22 έδειξαν σημαντική ενεργοποίηση που διήρκεσε περισσότερο, δείχνοντας αυξημένα επίπεδα αντοχής στην ανθρακνόζη (83A:476 και Boregine).Ωστόσο, γονίδια που μοιάζουν με MLP ρυθμίστηκαν προς τα κάτω μόνο σε γραμμές που φέρουν το υποψήφιο αλληλόμορφο αντίστασης (83A:476/Lanr1 στα 6 hpi και Mandelup/AnMan στα 24 hpi).Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όλα τα ταυτοποιημένα ομόλογα τύπου SAM22 προέρχονται από ένα σύμπλεγμα γονιδίων που εκτείνεται σε περίπου 105 kb, ενώ τα γονίδια που μοιάζουν με MLP προέρχονται από ξεχωριστές περιοχές του γονιδιώματος.Συντονισμένη ενεργοποίηση τέτοιων γονιδίων που μοιάζουν με SAM22 βρέθηκε επίσης στην προηγούμενη μελέτη μας για την αντίσταση NLL στον εμβολιασμό με Diaportthetoxica, υποδηλώνοντας ότι εμπλέκονται στα οριζόντια συστατικά της αμυντικής απόκρισης.Αυτό το συμπέρασμα υποστηρίζεται επίσης από αναφορές θετικής απόκρισης γονιδίων που μοιάζουν με SAM22 σε τραυματισμό ή θεραπεία με σαλικυλικό οξύ, μυκητιασικούς επαγωγείς ή υπεροξείδιο του υδρογόνου.
Τα γονίδια που μοιάζουν με MLP έχει αποδειχθεί ότι ανταποκρίνονται σε διάφορα αβιοτικά και βιοτικά στρες, συμπεριλαμβανομένων των βακτηριακών, ιογενών και παθογόνων μυκητιακών λοιμώξεων σε πολλά είδη φυτών55.Οι κατευθύνσεις απόκρισης σε ορισμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ φυτών και παθογόνων κυμαίνονταν από έντονα αυξανόμενες (δηλ. κατά τη διάρκεια προσβολής του βαμβακιού με Verticillium dahliae) έως σημαντικά μειωμένες (δηλαδή μετά τη μόλυνση της μηλιάς με Alternaria spp.)56,57.Σημαντική υπορρύθμιση του γονιδίου 423 που μοιάζει με MLP έχει παρατηρηθεί κατά τη διάρκεια της άμυνας του αβοκάντο στη μόλυνση από F. niger και κατά τη διάρκεια της μόλυνσης της μηλιάς Botryosphaeria berengeriana f.cn.Το piricola και το Alternaria alternata είναι παθότυποι μήλων58,59.Επιπλέον, οι κάλλοι της μηλιάς που υπερέκφραζαν το γονίδιο 423 που μοιάζει με MLP είχαν χαμηλότερη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την αντίσταση και ήταν πιο επιρρεπείς σε μυκητιασική μόλυνση59.Μετά το Fusarium oxysporum f, το γονίδιο 423 που μοιάζει με MLP καταστέλλεται επίσης σε ανθεκτικό βλαστικό πλάσμα φασολιών.cn.Μόλυνση από φασόλια 60.
Άλλα μέλη της οικογένειας PR-10 που ταυτοποιήθηκαν στη μελέτη μας RNA-seq ήταν τα γονίδια LlR18A και LlR18B σε απόκριση στην ανοδική ρύθμιση, καθώς και το γονίδιο που ρυθμίστηκε προς τα πάνω (1 γονίδιο) ή προς τα κάτω (3 γονίδια) για την πρωτεΐνη μεταφοράς λιπιδίων DIR1..Επιπλέον, το WGCNA υπογραμμίζει το γονίδιο LlR18B ως κόμβο σε αυτήν την ενότητα, το οποίο είναι πολύ ευαίσθητο στον εμβολιασμό και φέρει αρκετά γονίδια προστατευτικής απόκρισης.Τα γονίδια LlR18A και LlR18B προκλήθηκαν σε κίτρινα φύλλα λούπινου ως απόκριση σε παθογόνα βακτήρια, καθώς και σε στελέχη NLL μετά τον εμβολιασμό με D. toxica, ενώ το ομόλογο ρύζι αυτών των γονιδίων, RSOsPR10, προκλήθηκε γρήγορα από μια μυκητιασική λοίμωξη που πιθανώς εμπλέκεται στη γονιδιακή οδό D.61. για μη ειδικές πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων που απαιτούνται για την έναρξη συστηματικής επίκτητης αντίστασης (SAR).Με την ανάπτυξη προστατευτικών αντιδράσεων, η πρωτεΐνη DIR1 μεταφέρεται από το επίκεντρο της μόλυνσης μέσω του φυλλώματος για να προκαλέσει SAR σε απομακρυσμένα όργανα.Είναι ενδιαφέρον ότι το γονίδιο TanjilG_02313 DIR1 προκλήθηκε σημαντικά στο πρώτο χρονικό σημείο στις γραμμές 84A:476 και Πληθυσμός 22660, αλλά η αντίσταση στην ανθρακνόζη αναπτύχθηκε με επιτυχία μόνο στη γραμμή 84A:476.Αυτό μπορεί να υποδηλώνει κάποια υπολειτουργικότητα του γονιδίου DIR1 στο NLL, καθώς τα υπόλοιπα τρία ομόλογα ανταποκρίθηκαν στον ενοφθαλμισμό μόνο στη γραμμή 83A:476 στα 6 hpi και αυτή η απόκριση κατευθύνθηκε προς τα κάτω.
Στη μελέτη μας, τα πιο κοινά συστατικά που αντιστοιχούν στη βιολογική διαδικασία που ονομάζεται «διεργασία οξειδοαναγωγής GO:0055114» ήταν η πρωτεΐνη κυτοχρώματος P450, η υπεροξειδάση, η 9S-/13S-λιποξυγενάση λινολεϊκού οξέος και η οξειδάση του 1-αμινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικού οξέος.Επιπλέον, το WGCNA μας ορίζει το ομόλογο HSFA4a ως κόμβο που φέρει μονάδες όπως το υποψήφιο γονίδιο αντίστασης Lanr1 TanjilG_05042.Το HSFA4a είναι ένα συστατικό της οξειδοαναγωγικής ρύθμισης της πυρηνικής μεταγραφής στα φυτά.
Οι πρωτεΐνες του κυτοχρώματος P450 είναι οξειδοαναγωγάσες που καταλύουν αντιδράσεις υδροξυλίωσης εξαρτώμενες από NADPH και/ή Ο2 στον πρωτογενή και δευτερογενή μεταβολισμό, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού των ξενοβιοτικών, καθώς και των ορμονών, λιπαρών οξέων, στερολών, συστατικών κυτταρικού τοιχώματος, βιοπολυμερών και της βιοσύνθεσης των φυτικών ενώσεων. Η λειτουργία μειώθηκε από -10,6 log2 (πλάσια αλλαγή) σε 5,7 λόγω μεγάλου αριθμού αλλαγμένων ομολόγων (37) και διαφορών στα πρότυπα απόκρισης μεταξύ συγκεκριμένων γονιδίων, αντανακλώντας μια αναθεώρηση προς τα πάνω..Η χρήση μόνο δεδομένων RNA-seq για την αποσαφήνιση της υποτιθέμενης βιολογικής λειτουργίας των γονιδίων NLL σε μια τόσο μεγάλη πρωτεϊνική υπεροικογένεια θα ήταν πολύ εικαστικό.Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι ορισμένα γονίδια του κυτοχρώματος P450 σχετίζονται με αυξημένη αντοχή σε παθογόνους μύκητες ή βακτήρια, συμπεριλαμβανομένης της συμβολής σε αλλεργικές αντιδράσεις69,70,71.
Οι υπεροξειδάσες κατηγορίας III είναι πολυλειτουργικά φυτικά ένζυμα που εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα μεταβολικών διεργασιών κατά την ανάπτυξη και ανάπτυξη των φυτών, καθώς και σε απόκριση σε περιβαλλοντικές πιέσεις όπως αλατότητα, ξηρασία, υψηλή ένταση φωτός και προσβολή παθογόνων72.Οι υπεροξειδάσες εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση πολλών φυτικών ειδών με το Anthracis, συμπεριλαμβανομένων των Stylosanthes humilis και C. gloeosporioides, Lens culinaris και C. truncatum, Phaseolus vulgaris και C. lindemuthianum, Cucumis sativus και C. lagenarium73,76.75Η απόκριση είναι πολύ γρήγορη, μερικές φορές ακόμη και σε 4 HPI, πριν ο μύκητας διεισδύσει στον φυτικό ιστό73.Το γονίδιο υπεροξειδάσης ανταποκρίθηκε επίσης στον εμβολιασμό D. toxica NLL.Εκτός από τις τυπικές τους λειτουργίες για τη ρύθμιση της οξειδωτικής έκρηξης ή την εξάλειψη του οξειδωτικού στρες, οι υπεροξειδάσες μπορούν να επηρεάσουν την ανάπτυξη παθογόνων δημιουργώντας φυσικά εμπόδια με βάση την ενίσχυση του κυτταρικού τοιχώματος κατά τη διάρκεια της λιγνίωσης, της υπομονάδας ή της διασταύρωσης συγκεκριμένων ενώσεων.Αυτή η λειτουργία μπορεί να αποδοθεί στο silico στο γονίδιο TanjilG_03329 που κωδικοποιεί μια υποτιθέμενη υπεροξειδάση ανιόντων που σχηματίζει λιγνίνη που ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω στη μελέτη μας στην ανθεκτική γραμμή 83A:476 στους 6 HPI, αλλά όχι σε άλλα στελέχη και χρονικά σημεία που δεν ανταποκρίθηκαν.
Η 9S-/13S-λιποξυγενάση του λινολεϊκού οξέος είναι το πρώτο βήμα στην οξειδωτική οδό της βιοσύνθεσης λιπιδίων78.Τα προϊόντα αυτής της οδού έχουν πολλαπλές λειτουργίες στην άμυνα των φυτών, συμπεριλαμβανομένης της ενίσχυσης του κυτταρικού τοιχώματος μέσω του σχηματισμού εναποθέσεων καλλόζης και πηκτίνης και ρύθμιση του οξειδωτικού στρες μέσω της παραγωγής αντιδραστικών ειδών οξυγόνου79,80,81,82,83.Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση της 9S-/13S-λιποξυγενάσης του λινολεϊκού οξέος μεταβλήθηκε σε όλα τα στελέχη, αλλά στον ευαίσθητο πληθυσμό 22660, επικράτησε ανοδική ρύθμιση σε διαφορετικά χρονικά σημεία, ενώ σε στελέχη που φέρουν ανθεκτικό Lanr1 και το αλληλόμορφο AnMan, υπογραμμίζει τη διαφοροποίηση αυτών των λιποπρωτεϊνικών στοιβάδων intypeox.
Το ομόλογο της 1-αμινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικής οξειδάσης (ACO) ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω (9 γονίδια) ή μειώθηκε (2 γονίδια) όταν εμβολιάστηκε με λούπινο.Με δύο εξαιρέσεις, όλες αυτές οι αποκρίσεις εμφανίστηκαν στους 6 ίππους.στο 83A:476.Η ενζυματική αντίδραση με τη μεσολάβηση των πρωτεϊνών ACO είναι το στάδιο περιορισμού του ρυθμού στην παραγωγή αιθυλενίου και επομένως ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό84.Το αιθυλένιο είναι μια φυτική ορμόνη που παίζει διάφορους ρόλους στη ρύθμιση της ανάπτυξης και της ανταπόκρισης των φυτών σε συνθήκες αβιοτικού και βιοτικού στρες.Η επαγωγή της μεταγραφής ACO και η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης του αιθυλενίου εμπλέκονται στην αύξηση της αντίστασης του ρυζιού στον ημιβιοτροφικό μύκητα oryzae oryzae ρυθμίζοντας την παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου και φυτοαλεξινών.Μια πολύ παρόμοια διαδικασία μόλυνσης φύλλων που βρέθηκε μεταξύ του M. oryzae και του C. lupini88,89, με φόντο μια σημαντική ανοδική ρύθμιση των ομολόγων ACO στη γραμμή 83A:476 που αναφέρεται σε αυτή τη μελέτη, μετατοπίζει την πιθανότητα απόδοσης αντίστασης στο NLL ανθρακνόζη αιθυλένιο ένα κεντρικό βήμα σηματοδότησης στις μοριακές οδούς.
Στην παρούσα μελέτη, μεγάλης κλίμακας καταστολή πολλών γονιδίων που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση παρατηρήθηκε στους 6 hpi στο 83A:476 και στους 48 hpi στο Mandeloop και στον πληθυσμό 22660.Η έκταση και η εξέλιξη αυτών των αλλαγών είναι ανάλογη με το επίπεδο.Σε αυτό το πείραμα παρατηρήθηκε αντοχή στην ανθρακνόζη.Πρόσφατα, ισχυρή και πρώιμη καταστολή των μεταγραφών που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση έχει αναφερθεί σε πολλά μοντέλα αλληλεπιδράσεων φυτών-παθογόνων, συμπεριλαμβανομένων παθογόνων βακτηρίων και μυκήτων.Η βιασύνη (από 2 HPI σε ορισμένες αλληλεπιδράσεις) και η συνολική καταστολή των γονιδίων που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση ως απόκριση σε μόλυνση μπορεί να πυροδοτήσουν φυτική ανοσία με βάση την ανάπτυξη ενεργών ειδών οξυγόνου και την αλληλεπίδρασή τους με την οδό σαλικυλικού οξέος για τη μεσολάβηση αλλεργικών αντιδράσεων 90,94.
Συμπερασματικά, οι μηχανισμοί αμυντικής απόκρισης που προτείνονται για την πιο ανθεκτική γενεαλογία (83A:476) περιλαμβάνουν ταχεία αναγνώριση παθογόνου από το γονίδιο R (πιθανώς TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) και σηματοδότηση σαλικυλικού οξέος και αιθυλενίου που προκαλείται από αλλεργική απόκριση, ακολουθούμενη από δημιουργία SAR μεγάλης εμβέλειας.Η δράση υποστηρίζεται από την πρωτεΐνη DIR-1.Πρέπει να σημειωθεί ότι η βιοτροφική περίοδος για τη μόλυνση από C. lupini είναι πολύ μικρή (περίπου 2 ημέρες), ακολουθούμενη από νεκρωτική ανάπτυξη95.Η μετάβαση μεταξύ αυτών των σταδίων μπορεί να συσχετιστεί με νέκρωση και έκφραση πρωτεϊνών που επάγονται από αιθυλένιο που δρουν ως εναύσματα για αντιδράσεις υπερευαισθησίας στα φυτά ξενιστές.Επομένως, το χρονικό παράθυρο για την επιτυχή σύλληψη του C. lupini στο βιοτροφικό στάδιο είναι πολύ στενό.Ο επαναπρογραμματισμός των γονιδίων που σχετίζονται με την οξειδοαναγωγή και τη φωτοσύνθεση που παρατηρείται στο 83A:476 στα 6 hpi είναι συνεπής με την εξέλιξη των μυκητιακών υφών και προαναγγέλλει την ανάπτυξη μιας επιτυχημένης προστατευτικής απόκρισης στο βιοτροφικό στάδιο.Οι μεταγραφικές αποκρίσεις του Mandelup και του πληθυσμού 22660 μπορεί να καθυστερήσουν πολύ για να συλλάβουν τον μύκητα πριν από τη μετάβαση σε νεκρωτική ανάπτυξη, ωστόσο, το Mandelup μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικό από τον πληθυσμό 22660 επειδή η σχετικά γρήγορη ρύθμιση της πρωτεΐνης PR-10 προάγει την οριζόντια αντίσταση.
Το ETI, που καθοδηγείται από το κανονικό γονίδιο R, φαίνεται να είναι ένας κοινός μηχανισμός για την αντίσταση των φασολιών στην ανθρακνόζη.Έτσι, στο μοντέλο όσπριου Medicago truncatula, αντίσταση στην ανθρακνόζη αποδίδεται από το γονίδιο RCT1, μέλος της κατηγορίας γονιδίου R του φυτού TIR-NBS-LRR97.Αυτό το γονίδιο προσδίδει επίσης ευρέως φάσματος αντοχή στην ανθρακνόζη στη μηδική όταν μεταφέρεται σε ευαίσθητα φυτά.Στο κοινό φασόλι (P. vulgaris), μέχρι σήμερα έχουν εντοπιστεί περισσότερα από δύο δωδεκάδες γονίδια αντοχής στην ανθρακνόζη.Μερικά από αυτά τα γονίδια βρίσκονται σε περιοχές που δεν διαθέτουν κανένα κανονικό γονίδιο R, ωστόσο πολλά άλλα βρίσκονται στις άκρες των χρωμοσωμάτων που φέρουν το σύμπλεγμα γονιδίων NBS-LRR, συμπεριλαμβανομένου του TIR-NBS-LRRs99.Η μελέτη SSR σε όλο το γονιδίωμα επιβεβαίωσε επίσης τη συσχέτιση του γονιδίου NBS-LRR με την αντοχή στην ανθρακνόζη στο κοινό φασόλι.Το κανονικό γονίδιο R βρέθηκε επίσης στη γονιδιωματική περιοχή που φέρει τον κύριο τόπο αντοχής στην ανθρακνόζη στο λευκό λούπινο 101.
Η εργασία μας δείχνει ότι μια αντίδραση άμεσης αντίστασης, που ενεργοποιείται σε πρώιμο στάδιο μόλυνσης των φυτών (κατά προτίμηση όχι αργότερα από 12 hpi), προστατεύει αποτελεσματικά το στενόφυλλο λούπινο από την ανθρακνόζη που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Collelotrichum lupini.Χρησιμοποιώντας αλληλουχία υψηλής απόδοσης, επιδείξαμε προφίλ διαφορικής έκφρασης των γονιδίων αντοχής στην ανθρακνόζη σε φυτά NLL που διαμεσολαβούνται από τα γονίδια αντοχής Lanr1 και AnMan.Η επιτυχής άμυνα περιλαμβάνει τον προσεκτικό σχεδιασμό των γονιδίων για τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην οξειδοαναγωγή, τη φωτοσύνθεση και την παθογένεση μέσα σε λίγες ώρες από την πρώτη επαφή του φυτού με ένα παθογόνο.Παρόμοιες προστατευτικές αντιδράσεις, αλλά καθυστερημένες χρονικά, είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματικές στην προστασία των φυτών από ασθένειες.Η αντίσταση στον άνθρακα που προκαλείται από το γονίδιο Lanr1 μοιάζει με την τυπική ταχεία απόκριση του γονιδίου R (ανοσία που προκαλείται από τελεστή), ενώ το γονίδιο AnMan πιθανότατα παρέχει μια οριζόντια απόκριση (ανοσία που προκαλείται από ένα μοριακό σχέδιο που σχετίζεται με μικρόβια), παρέχοντας ένα μέτριο επίπεδο βιωσιμότητας.
Οι 215 σειρές NLL που χρησιμοποιήθηκαν για τη διαλογή για δείκτες ανθρακνόζης αποτελούνταν από 74 ποικιλίες, 60 σειρές που ελήφθησαν με διασταύρωση ή αναπαραγωγή, 5 μεταλλαγμένα και 76 άγρια ​​ή πρωτότυπα γεννητικά πλάσματα.Οι γραμμές προέρχονταν από 17 χώρες, κυρίως από την Πολωνία (58), την Ισπανία (47), τη Γερμανία (27), την Αυστραλία (26), τη Ρωσία (19), τη Λευκορωσία (7), την Ιταλία (5) και άλλες γραμμές.από 10 χώρες.Το σετ περιλαμβάνει επίσης ανθεκτικές σειρές αναφοράς: 83A:476, Tanjil, Wonga που φέρει το αλληλόμορφο Lanr1 και Mandelup που φέρει το αλληλόμορφο AnMan.Οι σειρές ελήφθησαν από την Ευρωπαϊκή Βάση Δεδομένων Γενετικών Πόρων Λούπινου που διατηρείται από την Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Πολωνία (Συμπληρωματικός Πίνακας S1).
Τα φυτά αναπτύχθηκαν υπό ελεγχόμενες συνθήκες (φωτοπερίοδος 16 ώρες, θερμοκρασία 25°C την ημέρα και 18°C ​​τη νύχτα).Αναλύθηκαν δύο βιολογικά αντίγραφα.Το DNA απομονώθηκε από φύλλα ηλικίας τριών εβδομάδων χρησιμοποιώντας το DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο.Η ποιότητα και η συγκέντρωση του απομονωθέντος DNA αξιολογήθηκε με φασματοφωτομετρικές μεθόδους (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).Ο δείκτης AnManM1 που σημαδεύει το γονίδιο αντίστασης στην ανθρακνόζη AnMan (που προέρχεται από το cv. Mandelup) και οι δείκτες Anseq3 και Anseq4 που πλευρίζουν το γονίδιο Lanr1 (που προέρχεται από το cv. Tanjil) αναλύθηκαν 11,26,28.Οι ομοζυγώτες για το ανθεκτικό αλληλόμορφο βαθμολογήθηκαν ως "1", οι ευαίσθητοι - ως "0" και οι ετεροζυγώτες - ως 0,5.
Με βάση τα αποτελέσματα της διαλογής για τους δείκτες AnManM1, AnSeq3 και AnSeq4 και τη διαθεσιμότητα των σπόρων για τα τελικά πειράματα παρακολούθησης, επιλέχθηκαν 50 γραμμές NLL για φαινοτυποποίηση αντοχής στην ανθρακνόζη.Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις διπλούν σε θερμοκήπιο ελεγχόμενο από υπολογιστή με φωτοπερίοδο 14 ωρών με εύρος θερμοκρασίας 22°C κατά τη διάρκεια της ημέρας και 19°C τη νύχτα.Οι σπόροι γρατσουνίζονται (κόβοντας το κάλυμμα του σπόρου στην αντίθετη πλευρά του εμβρύου με μια αιχμηρή λεπίδα) πριν από τη σπορά για να αποφευχθεί ο λήθαργος των σπόρων λόγω του πολύ σκληρού στρώματος του σπόρου και για να εξασφαλιστεί ομοιόμορφη βλάστηση.Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε γλάστρες (11 × 11 × 21 cm) με αποστειρωμένο χώμα (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Βαρσοβία, Πολωνία).Ο εμβολιασμός πραγματοποιήθηκε με το στέλεχος Colletotrichum lupini Col-08, που αναπτύχθηκε το 1999 από τους μίσχους στενόφυλλων φυτών λούπινου που αναπτύχθηκαν σε χωράφι στη Verzhenitsa, στην ευρύτερη Πολωνία (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Αποκτήστε μια περιοχή.Τα προϊόντα απομόνωσης καλλιεργήθηκαν σε μέσο SNA στους 20°C υπό μαύρο φως για 21 ημέρες για να προκληθεί σπορίωση.Τέσσερις εβδομάδες μετά τη σπορά, όταν τα φυτά είχαν φτάσει στο στάδιο των 4-6 φύλλων, ο εμβολιασμός πραγματοποιήθηκε με ψεκασμό με εναιώρημα κονιδίων σε συγκέντρωση 0,5 x 106 κονιδίων ανά ml.Μετά τον εμβολιασμό, τα φυτά διατηρήθηκαν στο σκοτάδι για 24 ώρες σε υγρασία περίπου 98% και θερμοκρασία 25°C για να διευκολυνθεί η βλάστηση των κονιδίων και η διαδικασία μόλυνσης.Τα φυτά στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε φωτοπερίοδο 14 ωρών στους 22°C ημέρα/19°C νύχτα και 70% υγρασία.Η βαθμολογία της νόσου έγινε 22 ημέρες μετά τον εμβολιασμό και κυμαινόταν από 0 (άνοση) έως 9 (πολύ ευαίσθητη) ανάλογα με την παρουσία ή την απουσία νεκρωτικών βλαβών στους μίσχους και τα φύλλα.Επιπλέον, μετά τη βαθμολόγηση μετρήθηκε το βάρος των φυτών.Οι σχέσεις μεταξύ γονότυπων δεικτών και φαινοτύπων ασθενειών υπολογίστηκαν ως συσχετίσεις δύο αλληλουχιών σημείων (απουσία ετερόζυγων δεικτών στο σύνολο των γραμμών για την ανάλυση του φαινοτύπου αντοχής στην ανθρακνόζη).