Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Υπάρχει ανάγκη για ένα αξιόπιστο σύστημα in vitro που να μπορεί να αναπαράγει με ακρίβεια το φυσιολογικό περιβάλλον της καρδιάς για τον έλεγχο φαρμάκων. Η περιορισμένη διαθεσιμότητα συστημάτων καλλιέργειας ιστών ανθρώπινης καρδιάς έχει οδηγήσει σε ανακριβείς ερμηνείες των καρδιακών επιδράσεων των φαρμάκων. Εδώ, έχουμε αναπτύξει ένα μοντέλο καλλιέργειας ιστών καρδιάς (CTCM) που διεγείρει ηλεκτρομηχανικά τις καρδιακές τομές και υφίσταται φυσιολογική διάταση κατά τη διάρκεια της συστολικής και διαστολικής φάσης του καρδιακού κύκλου. Μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας, αυτή η προσέγγιση βελτίωσε εν μέρει τη βιωσιμότητα των καρδιακών τμημάτων, αλλά δεν διατήρησε πλήρως τη δομική τους ακεραιότητα. Επομένως, μετά από έλεγχο μικρών μορίων, διαπιστώσαμε ότι η προσθήκη 100 nM τριιωδοθυρονίνης (T3) και 1 μM δεξαμεθαζόνης (Dex) στο μέσο μας διατήρησε τη μικροδομή των τμημάτων για 12 ημέρες. Σε συνδυασμό με την επεξεργασία με T3/Dex, το σύστημα CTCM διατήρησε τα μεταγραφικά προφίλ, τη βιωσιμότητα, τη μεταβολική δραστηριότητα και τη δομική ακεραιότητα στο ίδιο επίπεδο με τον φρέσκο ​​καρδιακό ιστό για 12 ημέρες. Επιπλέον, η υπερβολική διάταση του καρδιακού ιστού στην καλλιέργεια προκαλεί υπερτροφική καρδιακή σηματοδότηση, παρέχοντας στοιχεία για την ικανότητα του CTCM να μιμείται υπερτροφικές καταστάσεις που προκαλούνται από την καρδιακή διάταση. Συμπερασματικά, η CTCM μπορεί να μοντελοποιήσει τη φυσιολογία και την παθοφυσιολογία της καρδιάς σε καλλιέργεια για μεγάλα χρονικά διαστήματα, επιτρέποντας τον αξιόπιστο έλεγχο φαρμάκων.
Πριν από την κλινική έρευνα, απαιτούνται αξιόπιστα συστήματα in vitro που μπορούν να αναπαράγουν με ακρίβεια το φυσιολογικό περιβάλλον της ανθρώπινης καρδιάς. Τέτοια συστήματα θα πρέπει να μιμούνται την αλλοιωμένη μηχανική έκταση, τον καρδιακό ρυθμό και τις ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες. Τα ζωικά μοντέλα χρησιμοποιούνται συνήθως ως πλατφόρμα διαλογής για την καρδιακή φυσιολογία με περιορισμένη αξιοπιστία στην απεικόνιση των επιδράσεων των φαρμάκων στην ανθρώπινη καρδιά1,2. Τελικά, το Ιδανικό Πειραματικό Μοντέλο Καλλιέργειας Καρδιακού Ιστού (CTCM) είναι ένα μοντέλο που είναι εξαιρετικά ευαίσθητο και ειδικό για διάφορες θεραπευτικές και φαρμακολογικές παρεμβάσεις, αναπαράγοντας με ακρίβεια τη φυσιολογία και την παθοφυσιολογία της ανθρώπινης καρδιάς3. Η απουσία ενός τέτοιου συστήματος περιορίζει την ανακάλυψη νέων θεραπειών για την καρδιακή ανεπάρκεια4,5 και έχει οδηγήσει στην καρδιοτοξικότητα των φαρμάκων ως κύριο λόγο εξόδου από την αγορά6.
Την τελευταία δεκαετία, οκτώ μη καρδιαγγειακά φάρμακα έχουν αποσυρθεί από την κλινική χρήση επειδή προκαλούν παράταση του διαστήματος QT που οδηγεί σε κοιλιακές αρρυθμίες και αιφνίδιο θάνατο7. Έτσι, υπάρχει αυξανόμενη ανάγκη για αξιόπιστες προκλινικές στρατηγικές διαλογής για την αξιολόγηση της καρδιαγγειακής αποτελεσματικότητας και τοξικότητας. Η πρόσφατη χρήση καρδιομυοκυττάρων που προέρχονται από ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (hiPS-CM) στον έλεγχο φαρμάκων και στις δοκιμές τοξικότητας παρέχει μια μερική λύση σε αυτό το πρόβλημα. Ωστόσο, η ανώριμη φύση των hiPS-CM και η έλλειψη πολυκυτταρικής πολυπλοκότητας του καρδιακού ιστού αποτελούν σημαντικούς περιορισμούς αυτής της μεθόδου. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι αυτός ο περιορισμός μπορεί να ξεπεραστεί εν μέρει χρησιμοποιώντας πρώιμο hiPS-CM για τον σχηματισμό υδρογέλων καρδιακού ιστού λίγο μετά την έναρξη των αυθόρμητων συσπάσεων και σταδιακά αυξάνοντας την ηλεκτρική διέγερση με την πάροδο του χρόνου. Ωστόσο, αυτοί οι μικροιστοί hiPS-CM δεν έχουν τις ώριμες ηλεκτροφυσιολογικές και συσταλτικές ιδιότητες του ενήλικου μυοκαρδίου. Επιπλέον, ο ανθρώπινος καρδιακός ιστός έχει μια πιο σύνθετη δομή, που αποτελείται από ένα ετερογενές μείγμα διαφορετικών τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων ενδοθηλιακών κυττάρων, νευρώνων και στρωματικών ινοβλαστών, που διασυνδέονται με συγκεκριμένα σύνολα πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας. Αυτή η ετερογένεια των πληθυσμών μη καρδιομυοκυττάρων11,12,13 στην καρδιά ενήλικων θηλαστικών αποτελεί σημαντικό εμπόδιο στη μοντελοποίηση του καρδιακού ιστού χρησιμοποιώντας μεμονωμένους κυτταρικούς τύπους. Αυτοί οι σημαντικοί περιορισμοί υπογραμμίζουν τη σημασία της ανάπτυξης μεθόδων για την καλλιέργεια άθικτου μυοκαρδιακού ιστού υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες.
Οι καλλιεργημένες λεπτές (300 µm) τομές της ανθρώπινης καρδιάς έχουν αποδειχθεί ένα πολλά υποσχόμενο μοντέλο άθικτου ανθρώπινου μυοκαρδίου. Αυτή η μέθοδος παρέχει πρόσβαση σε ένα πλήρες τρισδιάστατο πολυκυτταρικό σύστημα παρόμοιο με τον ανθρώπινο καρδιακό ιστό. Ωστόσο, μέχρι το 2019, η χρήση καλλιεργημένων καρδιακών τομών περιοριζόταν από τη σύντομη (24 ώρες) επιβίωση της καλλιέργειας. Αυτό οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, όπως η έλλειψη φυσικο-μηχανικής έκτασης, η διεπαφή αέρα-υγρού και η χρήση απλών μέσων που δεν υποστηρίζουν τις ανάγκες του καρδιακού ιστού. Το 2019, αρκετές ερευνητικές ομάδες απέδειξαν ότι η ενσωμάτωση μηχανικών παραγόντων σε συστήματα καλλιέργειας καρδιακού ιστού μπορεί να παρατείνει τη διάρκεια ζωής της καλλιέργειας, να βελτιώσει την καρδιακή έκφραση και να μιμηθεί την καρδιακή παθολογία. Δύο κομψές μελέτες 17 και 18 δείχνουν ότι η μονοαξονική μηχανική φόρτιση έχει θετική επίδραση στον καρδιακό φαινότυπο κατά την καλλιέργεια. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες δεν χρησιμοποίησαν τη δυναμική τρισδιάστατη φυσικο-μηχανική φόρτιση του καρδιακού κύκλου, καθώς οι καρδιακές τομές φορτώθηκαν είτε με ισομετρικές δυνάμεις εφελκυσμού 17 είτε με γραμμική αυξοτονική φόρτιση 18. Αυτές οι μέθοδοι τάνυσης των ιστών είχαν ως αποτέλεσμα την καταστολή πολλών καρδιακών γονιδίων ή την υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με ανώμαλες αποκρίσεις τάνυσης. Αξιοσημείωτα, οι Pitoulis et al. 19 ανέπτυξαν ένα δυναμικό λουτρό καλλιέργειας καρδιακών τομών για την ανακατασκευή του καρδιακού κύκλου χρησιμοποιώντας ανατροφοδότηση μετατροπέα δύναμης και κινητήριες δυνάμεις τάσης. Αν και αυτό το σύστημα επιτρέπει πιο ακριβή μοντελοποίηση καρδιακού κύκλου in vitro, η πολυπλοκότητα και η χαμηλή απόδοση της μεθόδου περιορίζουν την εφαρμογή αυτού του συστήματος. Το εργαστήριό μας ανέπτυξε πρόσφατα ένα απλοποιημένο σύστημα καλλιέργειας χρησιμοποιώντας ηλεκτρική διέγερση και ένα βελτιστοποιημένο μέσο για τη διατήρηση της βιωσιμότητας τομών καρδιακού ιστού χοίρου και ανθρώπου για έως και 6 ημέρες20,21.
Στο παρόν χειρόγραφο, περιγράφουμε ένα μοντέλο καλλιέργειας καρδιακού ιστού (CTCM) χρησιμοποιώντας τομές της καρδιάς χοίρου που ενσωματώνει χυμικά ερεθίσματα για την ανακεφαλαίωση της τρισδιάστατης καρδιακής φυσιολογίας και της παθοφυσιολογικής διάτασης κατά τη διάρκεια του καρδιακού κύκλου. Αυτό το CTCM μπορεί να αυξήσει την ακρίβεια της προκλινικής πρόβλεψης φαρμάκων σε ένα επίπεδο που δεν έχει επιτευχθεί ποτέ πριν, παρέχοντας ένα οικονομικά αποδοτικό, μεσαίας απόδοσης καρδιακό σύστημα που μιμείται τη φυσιολογία/παθοφυσιολογία της καρδιάς των θηλαστικών για προκλινικές δοκιμές φαρμάκων.
Τα αιμοδυναμικά μηχανικά σήματα παίζουν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της λειτουργίας των καρδιομυοκυττάρων in vitro 22,23,24. Στο παρόν χειρόγραφο, αναπτύξαμε ένα CTCM (Σχήμα 1α) που μπορεί να μιμηθεί το καρδιακό περιβάλλον των ενηλίκων προκαλώντας ηλεκτρική και μηχανική διέγερση σε φυσιολογικές συχνότητες (1,2 Hz, 72 παλμοί ανά λεπτό). Για να αποφευχθεί η υπερβολική διάταση των ιστών κατά τη διαστολή, χρησιμοποιήθηκε μια συσκευή τρισδιάστατης εκτύπωσης για την αύξηση του μεγέθους του ιστού κατά 25% (Εικ. 1β). Η ηλεκτρική βηματοδότηση που επάγεται από το σύστημα C-PACE χρονικά ρυθμίστηκε ώστε να ξεκινήσει 100 ms πριν από τη συστολή χρησιμοποιώντας ένα σύστημα συλλογής δεδομένων για την πλήρη αναπαραγωγή του καρδιακού κύκλου. Το σύστημα καλλιέργειας ιστών χρησιμοποιεί έναν προγραμματιζόμενο πνευματικό ενεργοποιητή (LB Engineering, Γερμανία) για την κυκλική επέκταση μιας εύκαμπτης μεμβράνης σιλικόνης για να προκαλέσει διαστολή των καρδιακών τομών στον άνω θάλαμο. Το σύστημα συνδέθηκε με μια εξωτερική γραμμή αέρα μέσω ενός μετατροπέα πίεσης, ο οποίος κατέστησε δυνατή την ακριβή ρύθμιση της πίεσης (± 1 mmHg) και του χρόνου (± 1 ms) (Εικ. 1γ).
α Συνδέστε το τμήμα ιστού στον δακτύλιο στήριξης 7 mm, που φαίνεται με μπλε χρώμα, μέσα στον θάλαμο καλλιέργειας της συσκευής. Ο θάλαμος καλλιέργειας διαχωρίζεται από τον θάλαμο αέρα με μια λεπτή εύκαμπτη μεμβράνη σιλικόνης. Τοποθετήστε μια φλάντζα μεταξύ κάθε θαλάμου για να αποφύγετε διαρροές. Το καπάκι της συσκευής περιέχει ηλεκτρόδια γραφίτη που παρέχουν ηλεκτρική διέγερση. β Σχηματική αναπαράσταση της μεγάλης συσκευής ιστού, του δακτυλίου οδηγού και του δακτυλίου στήριξης. Τα τμήματα ιστού (καφέ) τοποθετούνται στη υπερμεγέθη συσκευή με τον δακτύλιο οδηγό τοποθετημένο στην αυλάκωση στην εξωτερική άκρη της συσκευής. Χρησιμοποιώντας τον οδηγό, τοποθετήστε προσεκτικά τον δακτύλιο στήριξης επικαλυμμένο με ακρυλική κόλλα ιστού πάνω από το τμήμα του καρδιακού ιστού. γ Γράφημα που δείχνει τον χρόνο ηλεκτρικής διέγερσης ως συνάρτηση της πίεσης του θαλάμου αέρα που ελέγχεται από έναν προγραμματιζόμενο πνευματικό ενεργοποιητή (PPD). Χρησιμοποιήθηκε μια συσκευή λήψης δεδομένων για τον συγχρονισμό της ηλεκτρικής διέγερσης χρησιμοποιώντας αισθητήρες πίεσης. Όταν η πίεση στον θάλαμο καλλιέργειας φτάσει στο καθορισμένο όριο, ένα παλμικό σήμα αποστέλλεται στο C-PACE-EM για να ενεργοποιήσει την ηλεκτρική διέγερση. δ Εικόνα τεσσάρων CTCM τοποθετημένων σε ένα ράφι επωαστήρα. Τέσσερις συσκευές συνδέονται με ένα PPD μέσω ενός πνευματικού κυκλώματος και αισθητήρες πίεσης εισάγονται στην αιμοστατική βαλβίδα για την παρακολούθηση της πίεσης στο πνευματικό κύκλωμα. Κάθε συσκευή περιέχει έξι τμήματα ιστού.
Χρησιμοποιώντας έναν μόνο πνευματικό ενεργοποιητή, καταφέραμε να ελέγξουμε 4 συσκευές CTCM, καθεμία από τις οποίες μπορούσε να χωρέσει 6 τομές ιστού (Εικ. 1δ). Στην CTCM, η πίεση του αέρα στον θάλαμο αέρα μετατρέπεται σε σύγχρονη πίεση στον θάλαμο υγρού και προκαλεί φυσιολογική διαστολή της τομής της καρδιάς (Σχήμα 2α και Συμπληρωματικό Βίντεο 1). Αξιολόγηση της διάτασης του ιστού στα 80 mm Hg. Το σχέδιο έδειξε διάταση των τμημάτων ιστού κατά 25% (Εικ. 2β). Αυτό το ποσοστό διάτασης έχει αποδειχθεί ότι αντιστοιχεί σε ένα φυσιολογικό μήκος σαρκομερίου 2,2–2,3 μm για φυσιολογική συσταλτικότητα της καρδιακής τομής17,19,25. Η κίνηση του ιστού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες ρυθμίσεις κάμερας (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Το πλάτος και η ταχύτητα της κίνησης του ιστού (Εικ. 2γ, δ) αντιστοιχούσαν στη διάταση κατά τη διάρκεια του καρδιακού κύκλου και στον χρόνο κατά τη διάρκεια της συστολής και της διαστολής (Εικ. 2β). Η διάταση και η ταχύτητα του καρδιακού ιστού κατά τη συστολή και τη χαλάρωση παρέμειναν σταθερές για 12 ημέρες σε καλλιέργεια (Εικ. 2στ). Για να αξιολογήσουμε την επίδραση της ηλεκτρικής διέγερσης στη συσταλτικότητα κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, αναπτύξαμε μια μέθοδο για τον προσδιορισμό της ενεργού παραμόρφωσης χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο σκίασης (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α,β) και καταφέραμε να διακρίνουμε μεταξύ παραμορφώσεων με και χωρίς ηλεκτρική διέγερση. Το ίδιο τμήμα της καρδιάς (Σχήμα 2στ). Στην κινητή περιοχή της τομής (R6-9), η τάση κατά τη διάρκεια της ηλεκτρικής διέγερσης ήταν 20% υψηλότερη από ό,τι απουσία ηλεκτρικής διέγερσης, γεγονός που υποδηλώνει τη συμβολή της ηλεκτρικής διέγερσης στη συσταλτική λειτουργία.
Αντιπροσωπευτικά ίχνη πίεσης στον αεροθάλαμο, την πίεση στον θάλαμο υγρού και τις μετρήσεις κίνησης ιστού επιβεβαιώνουν ότι η πίεση στον θάλαμο υγρού αλλάζει την πίεση στον θάλαμο υγρού, προκαλώντας αντίστοιχη κίνηση της τομής ιστού. β Αντιπροσωπευτικά ίχνη ποσοστού διάτασης (μπλε) των τμημάτων ιστού που αντιστοιχούν στο ποσοστό διάτασης (πορτοκαλί). γ Η μετρούμενη κίνηση της καρδιακής τομής είναι σύμφωνη με τη μετρούμενη ταχύτητα κίνησης. (δ) Αντιπροσωπευτικές τροχιές κυκλικής κίνησης (μπλε γραμμή) και ταχύτητας (πορτοκαλί διακεκομμένη γραμμή) σε μια τομή της καρδιάς. ε Ποσοτικοποίηση του χρόνου κύκλου (n = 19 τομές ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), του χρόνου συστολής (n = 19 τομές ανά ομάδα), του χρόνου χαλάρωσης (n = 19 τομές ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), της κίνησης του ιστού (n = 25 τομές)/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους), της μέγιστης συστολικής ταχύτητας (n = 24(D0), 25(D12) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους) και του μέγιστου ρυθμού χαλάρωσης (n=24(D0), 25(D12) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους). Το t-test του Student με δύο ουρές δεν έδειξε σημαντική διαφορά σε καμία παράμετρο. f Αντιπροσωπευτικά ίχνη ανάλυσης παραμόρφωσης τομών ιστών με (κόκκινο) και χωρίς (μπλε) ηλεκτρική διέγερση, δέκα περιφερειακές περιοχές τομών ιστών από την ίδια τομή. Τα κάτω πλαίσια δείχνουν την ποσοτικοποίηση της ποσοστιαίας διαφοράς στην παραμόρφωση σε τομές ιστών με και χωρίς ηλεκτρική διέγερση σε δέκα περιοχές από διαφορετικές τομές. (n = 8 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται αμφίπλευρο t-test Student· ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται αμφίπλευρο t-test Student· ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, αμφίπλευρο t-test του Student; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，5p <0,01， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，5p <0,01， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 τομές/ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους, αμφίπλευρο t-test του Student; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.
Στο προηγούμενο στατικό βιομιμητικό σύστημα καλλιέργειας καρδιακών τομών [20, 21], διατηρήσαμε τη βιωσιμότητα, τη λειτουργία και τη δομική ακεραιότητα των καρδιακών τομών για 6 ημέρες εφαρμόζοντας ηλεκτρική διέγερση και βελτιστοποιώντας τη σύνθεση του μέσου. Ωστόσο, μετά από 10 ημέρες, αυτά τα στοιχεία μειώθηκαν απότομα. Θα αναφερθούμε σε τομές που καλλιεργήθηκαν στο προηγούμενο στατικό βιομιμητικό σύστημα καλλιέργειας 20, 21 σε συνθήκες ελέγχου (Ctrl) και θα χρησιμοποιήσουμε το προηγουμένως βελτιστοποιημένο μέσο μας ως συνθήκες MC και καλλιέργεια υπό ταυτόχρονη μηχανική και ηλεκτρική διέγερση (CTCM). που ονομάζεται . Πρώτον, διαπιστώσαμε ότι η μηχανική διέγερση χωρίς ηλεκτρική διέγερση ήταν ανεπαρκής για να διατηρήσει τη βιωσιμότητα των ιστών για 6 ημέρες (Συμπληρωματικό Σχήμα 3α,β). Είναι ενδιαφέρον ότι, με την εισαγωγή φυσικο-μηχανικής και ηλεκτρικής διέγερσης χρησιμοποιώντας STCM, η βιωσιμότητα των καρδιακών τομών 12 ημερών παρέμεινε η ίδια όπως στις φρέσκες καρδιακές τομές υπό συνθήκες MS, αλλά όχι υπό συνθήκες Ctrl, όπως φαίνεται από την ανάλυση MTT (Εικ. 1). 3α). Αυτό υποδηλώνει ότι η μηχανική διέγερση και η προσομοίωση του καρδιακού κύκλου μπορούν να διατηρήσουν τις τομές ιστών βιώσιμες για διπλάσιο χρονικό διάστημα από ό,τι αναφέρθηκε στο προηγούμενο στατικό σύστημα καλλιέργειας. Ωστόσο, η αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας των τομών ιστών με ανοσοσήμανση της καρδιακής τροπονίνης Τ και της κοννεξίνης 43 έδειξε ότι η έκφραση της κοννεξίνης 43 ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ιστούς MC την 12η ημέρα από ό,τι στους μάρτυρες την ίδια ημέρα. Ωστόσο, η ομοιόμορφη έκφραση της κοννεξίνης 43 και ο σχηματισμός του δίσκου Ζ δεν διατηρήθηκαν πλήρως (Εικ. 3b). Χρησιμοποιούμε ένα πλαίσιο τεχνητής νοημοσύνης (AI) για την ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας των ιστών26, έναν αγωγό βαθιάς μάθησης βασισμένο σε εικόνα που βασίζεται στη χρώση τροπονίνης-Τ και κοννεξίνης43 για την αυτόματη ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας και του φθορισμού των καρδιακών τομών όσον αφορά την ισχύ του εντοπισμού. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα Συνελικτικό Νευρωνικό Δίκτυο (CNN) και ένα πλαίσιο βαθιάς μάθησης για την αξιόπιστη ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με αυτοματοποιημένο και αμερόληπτο τρόπο, όπως περιγράφεται στην αναφορά. 26. Ο ιστός MC έδειξε βελτιωμένη δομική ομοιότητα με την ημέρα 0 σε σύγκριση με τις στατικές τομές ελέγχου. Επιπλέον, η τριχρωμική χρώση Masson αποκάλυψε ένα σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό ίνωσης υπό συνθήκες MS σε σύγκριση με τις συνθήκες ελέγχου την 12η ημέρα καλλιέργειας (Εικ. 3c). Ενώ η CTCM αύξησε τη βιωσιμότητα των τομών καρδιακού ιστού την 12η ημέρα σε επίπεδο παρόμοιο με αυτό του φρέσκου καρδιακού ιστού, δεν βελτίωσε σημαντικά τη δομική ακεραιότητα των καρδιακών τομών.
Ένα ραβδόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας MTT φρέσκων τεμαχίων καρδιάς (D0) ή καλλιέργειας τεμαχίων καρδιάς για 12 ημέρες είτε σε στατική καλλιέργεια (D12 Ctrl) είτε σε CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) τεμάχια/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl). Ένα ραβδόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας MTT φρέσκων τεμαχίων καρδιάς (D0) ή καλλιέργειας τεμαχίων καρδιάς για 12 ημέρες είτε σε στατική καλλιέργεια (D12 Ctrl) είτε σε CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) τεμάχια/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης· ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl).Το ιστόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας φρέσκων καρδιακών τομών MTT (D0) ή καλλιέργειας καρδιακών τομών για 12 ημέρες είτε σε στατική καλλιέργεια (μάρτυρας D12) είτε σε CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (μάρτυρας D12). ) , 12 (D12 MC) τομών/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, εκτελείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA.####p < 0,0001 по сравнению με D0 και **p < 0,01 по сравнению με D12 Ctrl). ####p < 0,0001 σε σύγκριση με το D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με το D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，VA化测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#####p < 0,0 tr C10相比,**p.)Ιστόγραμμα που δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας MTT σε φρέσκες καρδιακές τομές (D0) ή καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν για 12 ημέρες σε στατική καλλιέργεια (μάρτυρας D12) ή CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (μάρτυρας D12)), 12 (D12 MC) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, δοκιμή μονόδρομης ANOVA.####p < 0,0001 по сравнению με D0, **p < 0,01 по сравнению με D12 Ctrl). ####p < 0,0001 σε σύγκριση με το D0, **p < 0,01 σε σύγκριση με το D12 Ctrl).β Τροπονίνη-Τ (πράσινη), κοννεξίνη 43 (κόκκινη) και DAPI (μπλε) σε πρόσφατα απομονωμένες καρδιακές τομές (D0) ή καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες (Ctrl) ή συνθήκες CTCM (MC) για 12 ημέρες) αντιπροσωπευτικών εικόνων ανοσοφθορισμού (κλίμακα κενού = 100 µm). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με τεχνητή νοημοσύνη (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) τομές/ομάδα από διαφορετικό χοίρο η καθεμία, πραγματοποιήθηκε μονόδρομη δοκιμή ANOVA· ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με τεχνητή νοημοσύνη (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους η καθεμία, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA· ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/групп от разных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού μέσω τεχνητής νοημοσύνης (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) τομές/ομάδες από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε μονόδρομη δοκιμή ANOVA· ####p < 0,0001 έναντι D0 και ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) φέτες/ομάδα κάθε ένα από διαφορετικά pig, μονόδρομη δοκιμή ANOVA.#0#0D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) φέτες/ομάδα κάθε διαφορετικού χοίρους, μονόδρομη δοκιμή ANOVA;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/группу каждой из разных свиней, συσχέτιση ##0 A#000 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Τεχνητή νοημοσύνη για την ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, μονόδρομη δοκιμή ANOVA· ####p<0,0001 έναντι .D0 Για σύγκριση ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικοποίηση (δεξιά) για φέτες καρδιάς χρωματισμένες με τριχρωμική χρώση Masson (Κλίμακα γυμνή = 500 µm) (n = 10 φέτες/ομάδα η καθεμία από διαφορετικό χοίρο, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικοποίηση (δεξιά) για φέτες καρδιάς χρωματισμένες με τριχρωμική χρώση Masson (Κλίμακα bare = 500 µm) (n = 10 φέτες/ομάδα η καθεμία από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. #### p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштаб без покрытия = 500 μ.κ.μ.) (n = 10 συντρίψεις/γκρουπ. односторонний тест ANOVA; γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικοποίηση (δεξιά) καρδιακών τομών χρωματισμένων με τριχρωμική χρώση Masson (κλίμακα χωρίς επικάλυψη = 500 µm) (n = 10 τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε μονοκατευθυντική δοκιμή ANOVA. #### p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸）（裸））（裸就个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相010 相0 1.相比）. C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度度裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单# 向 p#ﵑ Anova 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c помощью однофакторного дисперсионного ανάλυση ;### #p < 0,0001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению με D12 Ctrl). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες (αριστερά) και ποσοτικοποίηση (δεξιά) καρδιακών τομών χρωματισμένων με τριχρωμική χρώση Masson (τυφλό = 500 µm) (n = 10 τομές/ομάδα, καθεμία από διαφορετικό χοίρο, δοκιμασμένες με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης ;### # p < 0,0001 σε σύγκριση με D0, ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 Ctrl).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.
Υποθέσαμε ότι με την προσθήκη μικρών μορίων στο μέσο καλλιέργειας, η ακεραιότητα των καρδιομυοκυττάρων θα μπορούσε να βελτιωθεί και η ανάπτυξη ίνωσης να μειωθεί κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας CTCM. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε για μικρά μόρια χρησιμοποιώντας τις στατικές καλλιέργειες ελέγχου μας20,21 λόγω του μικρού αριθμού συγχυτικών παραγόντων. Για αυτήν την εξέταση επιλέχθηκαν η δεξαμεθαζόνη (Dex), η τριιωδοθυρονίνη (T3) και η SB431542 (SB). Αυτά τα μικρά μόρια έχουν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως σε καλλιέργειες hiPSC-CM για την πρόκληση ωρίμανσης καρδιομυοκυττάρων αυξάνοντας το μήκος των σαρκομερών, τα Τ-σωληνάρια και την ταχύτητα αγωγιμότητας. Επιπλέον, τόσο η Dex (ένα γλυκοκορτικοειδές) όσο και η SB είναι γνωστό ότι καταστέλλουν τη φλεγμονή29,30. Επομένως, εξετάσαμε εάν η συμπερίληψη ενός ή ενός συνδυασμού αυτών των μικρών μορίων θα βελτίωνε τη δομική ακεραιότητα των καρδιακών τομών. Για την αρχική εξέταση, η δόση κάθε ένωσης επιλέχθηκε με βάση τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται συνήθως σε μοντέλα κυτταροκαλλιέργειας (1 μM Dex27, 100 nM T327 και 2,5 μM SB31). Μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας, ο συνδυασμός Τ3 και Dex είχε ως αποτέλεσμα τη βέλτιστη δομική ακεραιότητα των καρδιομυοκυττάρων και την ελάχιστη ινώδη αναδιαμόρφωση (Συμπληρωματικά Σχήματα 4 και 5). Επιπλέον, η χρήση διπλάσιων ή διπλάσιων αυτών συγκεντρώσεων Τ3 και Dex προκάλεσε επιβλαβείς επιδράσεις σε σύγκριση με τις φυσιολογικές συγκεντρώσεις (Συμπληρωματικό Σχήμα 6α,β).
Μετά την αρχική διαλογή, πραγματοποιήσαμε μια άμεση σύγκριση 4 συνθηκών καλλιέργειας (Σχήμα 4α): Ctrl: καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν στην προηγουμένως περιγραφείσα στατική καλλιέργεια μας χρησιμοποιώντας το βελτιστοποιημένο μέσο μας. 20,21 TD: T3 και Ctrl που προστέθηκαν Dex την Τετάρτη. MC: καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν σε CTCM χρησιμοποιώντας το προηγουμένως βελτιστοποιημένο μέσο μας. και MT: CTCM με προσθήκη T3 και Dex στο μέσο. Μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας, η βιωσιμότητα των ιστών MS και MT παρέμεινε η ίδια όπως και στους φρέσκους ιστούς που αξιολογήθηκαν με δοκιμασία MTT (Εικ. 4β). Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη T3 και Dex σε καλλιέργειες transwell (TD) δεν οδήγησε σε σημαντική βελτίωση της βιωσιμότητας σε σύγκριση με τις συνθήκες Ctrl, υποδεικνύοντας έναν σημαντικό ρόλο της μηχανικής διέγερσης στη διατήρηση της βιωσιμότητας των καρδιακών τομών.
ένα διάγραμμα πειραματικού σχεδιασμού που απεικονίζει τις τέσσερις συνθήκες καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των επιδράσεων της μηχανικής διέγερσης και της συμπλήρωσης T3/Dex σε μέσο για 12 ημέρες. β Το ραβδόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), 12 (D12 MC) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ####p < 0,0001, ###p < 0,001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl). β Το ραβδόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), 12 (D12 MC) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ####p < 0,0001, ###p < 0,001 σε σύγκριση με D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 ημερών μετά την ολοκλήρωση των 4 όρων (έλεγχος, TD, MC και MT) μετά από 12 ημέρες μετά την ολοκλήρωση της ζωής (D10 (D10) (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу од разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ###p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с. 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). β Το ραβδόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της βιωσιμότητας 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (έλεγχος, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), 12 (D12 MC) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, μονόδρομη δοκιμή ANOVA· ####p < 0,0001, ###p < 0,001 έναντι D0 και **p < 0,01 σε σύγκριση με D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D5) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,000#001Ｘ相比，**p < 0,01 与D12控制）.β 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (έλεγχος, TD, MC και MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12), (1 D12 TD και D12). MC) срезы/группа, односотронний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению со D0, **p <0,01 по сравнению со контрола D12). β Ιστόγραμμα που δείχνει και τις 4 συνθήκες καλλιέργειας (μάρτυρας, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD και D12 MT), από διαφορετικούς χοίρους 12 (D12 MC) τομές/ομάδα, μονόδρομη δοκιμή ANOVA· ####p<0,0001, ###p<0,001 έναντι D0, **p<0,01 έναντι μάρτυρα D12). c Το ραβδόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 6 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ###p < 0,001, σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). c Το ραβδόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (Ctrl, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες φέτες καρδιάς (D0) (n = 6 φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ###p < 0,001, σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 ημερών μετά την ολοκλήρωση των 4 όρων (έλεγχος, TD, MC και MT) μετά από 12 ημέρες μετά την ολοκλήρωση της ομάδας (60% των ατόμων) разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; Το ιστόγραμμα δείχνει την ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και στις 4 συνθήκες καλλιέργειας (έλεγχος, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 6 τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε μονόδρομη δοκιμή ANOVA· ###p < 0,001 σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹弌弌天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0#0p < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 ημερών μετά την ολοκλήρωση των μαθημάτων για όλα τα 4 προϋποθέσεις (έλεγχος, TD, MC και MT) μετά από 12 ημέρες (60 ημέρες) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 (κοντρόλ). γ Ιστόγραμμα που δείχνει την ποσοτικοποίηση της ροής γλυκόζης 12 ημέρες μετά την καλλιέργεια και για τις 4 συνθήκες καλλιέργειας (έλεγχος, TD, MC και MT) σε σύγκριση με φρέσκες τομές καρδιάς (D0) (n = 6 τομές/ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους, μονομερείς. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ANOVA, ###p < 0,001 σε σύγκριση με D0, ***p < 0,001 σε σύγκριση με D12 (έλεγχος).δ Διαγράμματα ανάλυσης στελέχους φρέσκων (μπλε), ιστών MC 12 (πράσινο) και ιστών MT 12 (κόκκινο) σε δέκα περιφερειακά σημεία τομής ιστού (n = 4 τομές/ομάδα, δοκιμή μονόδρομης ANOVA· δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων). ε Διάγραμμα Volcano που δείχνει διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σε φρέσκες τομές καρδιάς (D0) σε σύγκριση με τομές καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές συνθήκες (Ctrl) ή υπό συνθήκες MT (MT) για 10-12 ημέρες. στ Χάρτης θερμότητας γονιδίων σαρκομεριδίου για τομές καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό καθεμία από τις συνθήκες καλλιέργειας. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
Η μεταβολική εξάρτηση από τη μετάβαση από την οξείδωση λιπαρών οξέων στη γλυκόλυση είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της αποδιαφοροποίησης των καρδιομυοκυττάρων. Τα ανώριμα καρδιομυοκύτταρα χρησιμοποιούν κυρίως γλυκόζη για την παραγωγή ATP και έχουν υποπλαστικά μιτοχόνδρια με λίγους κρυστάλλους5,32. Οι αναλύσεις αξιοποίησης γλυκόζης έδειξαν ότι υπό συνθήκες MC και MT, η αξιοποίηση γλυκόζης ήταν παρόμοια με αυτή στους ιστούς της ημέρας 0 (Σχήμα 4γ). Ωστόσο, τα δείγματα Ctrl έδειξαν σημαντική αύξηση στη αξιοποίηση γλυκόζης σε σύγκριση με τον φρέσκο ​​ιστό. Αυτό δείχνει ότι ο συνδυασμός CTCM και T3/Dex ενισχύει τη βιωσιμότητα των ιστών και διατηρεί τον μεταβολικό φαινότυπο των καλλιεργημένων καρδιακών τομών 12 ημερών. Επιπλέον, η ανάλυση στελέχους έδειξε ότι τα επίπεδα στελέχους παρέμειναν τα ίδια όπως στον φρέσκο ​​καρδιακό ιστό για 12 ημέρες υπό συνθήκες MT και MS (Εικ. 4δ).
Για να αναλύσουμε τη συνολική επίδραση των CTCM και T3/Dex στο συνολικό μεταγραφικό τοπίο του ιστού καρδιακής τομής, πραγματοποιήσαμε RNAseq σε καρδιακές τομές και από τις τέσσερις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας (Συμπληρωματικά Δεδομένα 1). Είναι ενδιαφέρον ότι οι τομές MT έδειξαν υψηλή μεταγραφική ομοιότητα με τον φρέσκο ​​καρδιακό ιστό, με μόνο 16 διαφορικά εκφρασμένα από τα 13.642 γονίδια. Ωστόσο, όπως δείξαμε νωρίτερα, οι τομές Ctrl εμφάνισαν 1229 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια μετά από 10-12 ημέρες σε καλλιέργεια (Εικόνα 4ε). Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώθηκαν με qRT-PCR γονιδίων καρδιάς και ινοβλαστών (Συμπληρωματικό Σχήμα 7a-c). Είναι ενδιαφέρον ότι οι τομές Ctrl έδειξαν μείωση της ρύθμισης των γονιδίων του καρδιακού και του κυτταρικού κύκλου και ενεργοποίηση προγραμμάτων φλεγμονωδών γονιδίων. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αποδιαφοροποίηση, η οποία κανονικά συμβαίνει μετά από μακροχρόνια καλλιέργεια, εξασθενεί πλήρως υπό συνθήκες MT (Συμπληρωματικό Σχήμα 8a,b). Η προσεκτική μελέτη των γονιδίων του σαρκομερίου έδειξε ότι μόνο υπό συνθήκες MT διατηρούνται τα γονίδια που κωδικοποιούν το σαρκομέριο (Εικόνα 4f) και το ιοντικό κανάλι (Συμπληρωματικό Σχήμα 9), προστατεύοντάς τα από την καταστολή υπό συνθήκες Ctrl, TD και MC. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι με συνδυασμό μηχανικής και χυμικής διέγερσης (T3/Dex), το μεταγραφόγραμμα της τομής καρδιάς μπορεί να παραμείνει παρόμοιο με τις φρέσκες τομές καρδιάς μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας.
Αυτά τα μεταγραφικά ευρήματα υποστηρίζονται από το γεγονός ότι η δομική ακεραιότητα των καρδιομυοκυττάρων σε καρδιακές τομές διατηρείται καλύτερα υπό συνθήκες MT για 12 ημέρες, όπως φαίνεται από την άθικτη και εντοπισμένη κοννεξίνη 43 (Εικ. 5α). Επιπλέον, η ίνωση σε καρδιακές τομές υπό συνθήκες MT μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την Ctrl και παρόμοια με τις φρέσκες καρδιακές τομές (Εικ. 5β). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι ο συνδυασμός μηχανικής διέγερσης και θεραπείας με T3/Dex διατηρεί αποτελεσματικά την καρδιακή δομή σε καρδιακές τομές σε καλλιέργεια.
Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοφθορισμού της τροπονίνης-Τ (πράσινο), της κοννεξίνης 43 (κόκκινο) και της DAPI (μπλε) σε πρόσφατα απομονωμένες καρδιακές τομές (D0) ή καλλιεργημένες για 12 ημέρες και στις τέσσερις συνθήκες καλλιέργειας καρδιακών τομών (ράβδος κλίμακας = 100 µm). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με τεχνητή νοημοσύνη (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και *p < 0,05, ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με τεχνητή νοημοσύνη (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε μονόδρομη δοκιμή ANOVA. #### p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και *p < 0,05, ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца со помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) сорезов/группу от разных свифаней, провоц. 0,0001 με σπασίματα με D0 και *p < 0,05 ή ****p < 0,0001 με στροφές με D12 Ctrl). Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού με χρήση τεχνητής νοημοσύνης (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε μονοκατευθυντική δοκιμή ANOVA· #### p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και *p < 0,05 ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和0*p <0,0001 与D0 和0*p <. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 (d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc ）2 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p <0,00. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Ποσοτικοποίηση της δομικής ακεραιότητας του καρδιακού ιστού χρησιμοποιώντας τεχνητή νοημοσύνη σε διαφορετικούς χοίρους (n = 7 (D0 και D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC και D12 MT) τομές/ομάδα) με μονόδρομη δοκιμή ANOVA.#### p < 0,0001 по сравнению со D0 και *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению με D12 Ctrl). #### p < 0,0001 σε σύγκριση με το D0 και *p < 0,05 ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με το D12 Ctrl). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση για καρδιακές φέτες χρωματισμένες με τριχρωμική χρώση Masson (γραμμή κλίμακας = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 (D12 MT) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση για καρδιακές φέτες χρωματισμένες με τριχρωμική χρώση Masson (γραμμή κλίμακας = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 (D12 MT) φέτες/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται μονόδρομη δοκιμή ANOVA. ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0 και ***p < 0,001 ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12D2 MT9), και D12D2MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA. β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση καρδιακών τομών χρωματισμένων με τριχρωμική χρώση Masson (κλίμακα = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 (D12 MT) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, που εκτελέστηκαν με μονόδρομη ανάλυση ANOVA· ####p < 0,0001 έναντι D0 και ***p < 0,001 ή ****p < 0,0001 έναντι D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（0D = Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差的9#p.与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 μασόνος 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析方差分析；0.#00p <1##0P相比，***p <0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихром Massona (масштабная линейка = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 TD και D12 MC), / группы, один- способ ANOVA; β Αντιπροσωπευτικές εικόνες και ποσοτικοποίηση τομών καρδιάς που χρωματίστηκαν με τριχρωμία Masson (κλίμακα = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD και D12 MC), 9 τομές (D12 MT) από διαφορετικούς χοίρους/ομάδα, μία μέθοδος ANOVA· ####p < 0,0001 σε σύγκριση με D0, ***p < 0,001 ή ****p < 0,0001 σε σύγκριση με D12 Ctrl).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.
Τέλος, η ικανότητα της CTCM να μιμείται την καρδιακή υπερτροφία αξιολογήθηκε αυξάνοντας την έκταση του καρδιακού ιστού. Στην CTCM, η μέγιστη πίεση στον αεροθάλαμο αυξήθηκε από 80 mmHg σε 80 mmHg. Αρ. (φυσιολογική έκταση) έως 140 mmHg. Αρ. (Εικ. 6α). Αυτό αντιστοιχεί σε αύξηση 32% στην έκταση (Εικ. 6β), η οποία προηγουμένως είχε δειχθεί ως το αντίστοιχο ποσοστό έκτασης που απαιτείται για τις καρδιακές τομές για να επιτευχθεί μήκος σαρκομερίου παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στην υπερτροφία. Η έκταση και η ταχύτητα του καρδιακού ιστού κατά τη συστολή και τη χαλάρωση παρέμειναν σταθερές κατά τη διάρκεια έξι ημερών καλλιέργειας (Εικ. 6γ). Ο καρδιακός ιστός από συνθήκες MT υποβλήθηκε σε κανονική έκταση (MT (Κανονική)) ή σε συνθήκες υπερέκτασης (MT (OS)) για έξι ημέρες. Ήδη μετά από τέσσερις ημέρες καλλιέργειας, ο υπερτροφικός βιοδείκτης NT-ProBNP ήταν σημαντικά αυξημένος στο μέσο υπό συνθήκες MT (OS) σε σύγκριση με τις συνθήκες MT (φυσιολογικές) (Εικ. 7α). Επιπλέον, μετά από έξι ημέρες καλλιέργειας, το μέγεθος των κυττάρων σε MT (OS) (Εικ. 7b) αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τις τομές καρδιάς MT (φυσιολογική). Επιπλέον, η πυρηνική μετατόπιση του NFATC4 αυξήθηκε σημαντικά σε υπερδιατεταμένους ιστούς (Εικ. 7c). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την προοδευτική ανάπτυξη παθολογικής αναδιαμόρφωσης μετά από υπερδιάταση και υποστηρίζουν την ιδέα ότι η συσκευή CTCM μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πλατφόρμα για τη μελέτη της σηματοδότησης καρδιακής υπερτροφίας που προκαλείται από διάταση.
Αντιπροσωπευτικά ίχνη της πίεσης του θαλάμου αέρα, της πίεσης του θαλάμου υγρού και των μετρήσεων κίνησης ιστού επιβεβαιώνουν ότι η πίεση του θαλάμου αλλάζει την πίεση του θαλάμου υγρού, προκαλώντας αντίστοιχη κίνηση της τομής ιστού. β Αντιπροσωπευτικές καμπύλες ποσοστού διάτασης και ρυθμού διάτασης για κανονικά τεντωμένες (πορτοκαλί) και υπερτεντωμένες (μπλε) τομές ιστού. γ Ραβδόγραμμα που δείχνει τον χρόνο κύκλου (n = 19 τομές ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), τον χρόνο συστολής (n = 18-19 τομές ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), τον χρόνο χαλάρωσης (n = 19 τομές ανά ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους)), το πλάτος της κίνησης του ιστού (n = 14 τομές/ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους), τη μέγιστη συστολική ταχύτητα (n = 14 τομές/ομάδα, από διαφορετικούς χοίρους) και τον μέγιστο ρυθμό χαλάρωσης (n = 14 (D0), 15 (D6) τομές/ομάδες) από διαφορετικούς χοίρους), το αμφίπλευρο t-test του Student δεν έδειξε σημαντική διαφορά σε καμία παράμετρο, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι παράμετροι παρέμειναν σταθερές κατά τη διάρκεια 6 ημερών καλλιέργειας με υπέρταση. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση ± τυπική απόκλιση.
Ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης NT-ProBNP σε ιστόγραμμα με μπάρες σε μέσο καλλιέργειας από καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής διάτασης (Norm) ή υπερδιάτασης (OS) της MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm και D4 MTOS) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους. Πραγματοποιείται αμφίδρομη ανάλυση ANOVA. **p < 0,01 σε σύγκριση με την κανονική διάταση). Ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης NT-ProBNP σε ιστόγραμμα με μπάρες σε καλλιεργητικά μέσα από καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής διάτασης (Norm) ή υπερδιάτασης (OS) της MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm και D4 MTOS) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους. Πραγματοποιείται αμφίδρομη ανάλυση ANOVA. **p < 0,01 σε σύγκριση με την κανονική διάταση).Ποσοτικό ιστόγραμμα της συγκέντρωσης NT-ProBNP σε μέσο καλλιέργειας από καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες φυσιολογικής έκτασης MT (κανονική) ή υπερβολικής έκτασης (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm και D4).MTOS) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιείται διπαραγοντική ανάλυση διακύμανσης.**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 σε σύγκριση με την κανονική διάταση). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). μια ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης NT-ProBNP σε φέτες καρδιάς που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες κανονικής διάτασης (Νορμ) ή υπερέντασης (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) από διαφορετικές猪的切片/组，可以双向方方发发动 **σε σύγκριση με το κανονικό τέντωμα, p <0,01).Ιστόγραμμα Ποσοτικοποίηση των συγκεντρώσεων NT-ProBNP σε καρδιακές τομές που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες φυσιολογικής διάτασης MT (κανονική) ή υπερβολικής διάτασης (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) και D4 MTOS) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης.**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 σε σύγκριση με την κανονική διάταση). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες για καρδιακές τομές χρωματισμένες με τροπονίνη-Τ και WGA (αριστερά) και ποσοτικοποίηση μεγέθους κυττάρων (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) κύτταρα/ομάδα από 10 διαφορετικές τομές από διαφορετικούς χοίρους, Πραγματοποιείται αμφίπλευρο t-test Student. ****p < 0,0001 σε σύγκριση με την κανονική έκταση). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες για καρδιακές τομές χρωματισμένες με τροπονίνη-Τ και WGA (αριστερά) και ποσοτικοποίηση μεγέθους κυττάρων (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) κύτταρα/ομάδα από 10 διαφορετικές τομές από διαφορετικούς χοίρους, Πραγματοποιείται αμφίπλευρο t-test Student. ****p < 0,0001 σε σύγκριση με την κανονική έκταση). b Representaтивnыe isobrazheniya srezov serdca, okrashennыh troponinom-T and AZP (sleva) and colichestvennogo καθορισμός клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες καρδιακών τομών χρωματισμένων με τροπονίνη-Τ και AZP (αριστερά) και ποσοτικοποίηση μεγέθους κυττάρων (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) κύτταρα/ομάδα από 10 διαφορετικές τομές από διαφορετικούς χοίρους, πραγματοποιήθηκε αμφίπλευρο t-test του Student. ****p < 0,0001 σε σύγκριση με το φυσιολογικό στέλεχος). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表片的代表 33 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες τομών καρδιάς χρωματισμένων με ασβεστεΐνη-Τ και WGA (αριστερά) και μέγεθος κυττάρων (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 από 10 διαφορετικές τομές (D6 MTNorm)). Cells/My, δοκιμή μοριακού βάρους t σε σύγκριση με φυσιολογικό τέντωμα, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных troponinom-Т и AZP (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) εκ 10 Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). β Αντιπροσωπευτικές εικόνες καρδιακών τομών χρωματισμένων με τροπονίνη-Τ και AZP (αριστερά) και ποσοτικοποίηση του μεγέθους των κυττάρων (δεξιά) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) από 10 διαφορετικές τομές από διαφορετικούς χοίρους) Κύτταρα/ομάδα, αμφίπλευρο κριτήριο Student's t; ****p < 0,0001 σε σύγκριση με το φυσιολογικό στέλεχος). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες για τις καρδιακές τομές MTOS 0 και 6 ημέρας ανοσοσημασμένες για τροπονίνη-Τ και NFATC4 και ποσοτικοποίηση της μετατόπισης του NFATC4 στους πυρήνες των CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, Πραγματοποιείται αμφίπλευρο t-test Student; *p < 0,05). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες για τις καρδιακές τομές MTOS 0 και 6 ημέρας ανοσοσημασμένες για τροπονίνη-Τ και NFATC4 και ποσοτικοποίηση της μετατόπισης του NFATC4 στους πυρήνες των CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους, Πραγματοποιείται αμφίπλευρο t-test Student, *p < 0,05). c. срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες για καρδιακές τομές στις ημέρες MTOS 0 και 6, ανοσοσημασμένες για τροπονίνη-Τ και NFATC4, και ποσοτικοποίηση της μετατόπισης NFATC4 στον πυρήνα των σπηλαιωδών κυττάρων (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) τομές/ομάδα από διαφορετικούς χοίρους) πραγματοποίησαν αμφίπλευρο t-test Student's; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (44（0D)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)». γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοσήμανσης καλκανίνης-Τ και NFATC4 第0天和第6天MTOS 第6天MTOS και NFATC4 από διαφορετικούς πυρήνες κυττάρων NFATC4 易位至CM 的 ποσότητα化 (n = 3 (D6 MTOS),时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c. хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0,05). γ Αντιπροσωπευτικές εικόνες καρδιακών τομών MTOS την ημέρα 0 και 6 για ανοσοσήμανση τροπονίνης-Τ και NFATC4 και ποσοτικοποίηση της μετατόπισης NFATC4 στον πυρήνα του CM από διαφορετικούς χοίρους (n = 4 (D0), 3 (D6) τομών MTOS/ομάδα, αμφίπλευρο t-κριτήριο Student's; *p < 0,05).Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο ± τυπική απόκλιση.
Η μεταφραστική καρδιαγγειακή έρευνα απαιτεί κυτταρικά μοντέλα που αναπαράγουν με ακρίβεια το καρδιακό περιβάλλον. Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύχθηκε και χαρακτηρίστηκε μια συσκευή CTCM που μπορεί να διεγείρει εξαιρετικά λεπτές τομές της καρδιάς. Το σύστημα CTCM περιλαμβάνει φυσιολογικά συγχρονισμένη ηλεκτρομηχανική διέγερση και εμπλουτισμό με υγρό T3 και Dex. Όταν τομές καρδιάς χοίρου εκτέθηκαν σε αυτούς τους παράγοντες, η βιωσιμότητά τους, η δομική ακεραιότητα, η μεταβολική δραστηριότητα και η μεταγραφική τους έκφραση παρέμειναν οι ίδιες όπως στον φρέσκο ​​καρδιακό ιστό μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας. Επιπλέον, η υπερβολική διάταση του καρδιακού ιστού μπορεί να προκαλέσει υπερτροφία της καρδιάς που προκαλείται από υπερέκταση. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τον κρίσιμο ρόλο των φυσιολογικών συνθηκών καλλιέργειας στη διατήρηση ενός φυσιολογικού καρδιακού φαινοτύπου και παρέχουν μια πλατφόρμα για τον έλεγχο φαρμάκων.
Πολλοί παράγοντες συμβάλλουν στη δημιουργία ενός βέλτιστου περιβάλλοντος για τη λειτουργία και την επιβίωση των καρδιομυοκυττάρων. Οι πιο προφανείς από αυτούς τους παράγοντες σχετίζονται με (1) τις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις, (2) την ηλεκτρομηχανική διέγερση, (3) τους χυμικούς παράγοντες και (4) τα μεταβολικά υποστρώματα. Οι φυσιολογικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων απαιτούν πολύπλοκα τρισδιάστατα δίκτυα πολλαπλών κυτταρικών τύπων που υποστηρίζονται από μια εξωκυτταρική μήτρα. Τέτοιες πολύπλοκες κυτταρικές αλληλεπιδράσεις είναι δύσκολο να ανακατασκευαστούν in vitro με συνκαλλιέργεια μεμονωμένων κυτταρικών τύπων, αλλά μπορούν εύκολα να επιτευχθούν χρησιμοποιώντας την οργανοτυπική φύση των καρδιακών τομών.
Η μηχανική διάταση και η ηλεκτρική διέγερση των καρδιομυοκυττάρων είναι κρίσιμες για τη διατήρηση του καρδιακού φαινοτύπου33,34,35. Ενώ η μηχανική διέγερση έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την προετοιμασία και την ωρίμανση του hiPSC-CM, αρκετές κομψές μελέτες έχουν πρόσφατα επιχειρήσει μηχανική διέγερση καρδιακών τομών σε καλλιέργεια χρησιμοποιώντας μονοαξονική φόρτιση. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η μονοαξονική μηχανική φόρτιση 2D έχει θετική επίδραση στον φαινότυπο της καρδιάς κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας. Σε αυτές τις μελέτες, τμήματα της καρδιάς είτε φορτώθηκαν με ισομετρικές δυνάμεις εφελκυσμού17, γραμμική αυξοτονική φόρτιση18, είτε ο καρδιακός κύκλος αναδημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ανατροφοδότηση μετατροπέα δύναμης και οδηγούς τάσης. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούν μονοαξονική διάταση ιστού χωρίς περιβαλλοντική βελτιστοποίηση, με αποτέλεσμα την καταστολή πολλών καρδιακών γονιδίων ή την υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με ανώμαλες αποκρίσεις διάτασης. Η CTCM που περιγράφεται εδώ παρέχει ένα τρισδιάστατο ηλεκτρομηχανικό ερέθισμα που μιμείται τον φυσικό καρδιακό κύκλο όσον αφορά τον χρόνο κύκλου και τη φυσιολογική διάταση (25% διάταση, 40% συστόλη, 60% διαστολή και 72 παλμοί ανά λεπτό). Αν και αυτή η τρισδιάστατη μηχανική διέγερση από μόνη της δεν επαρκεί για τη διατήρηση της ακεραιότητας των ιστών, απαιτείται ένας συνδυασμός χυμικής και μηχανικής διέγερσης με τη χρήση T3/Dex για την επαρκή διατήρηση της βιωσιμότητας, της λειτουργίας και της ακεραιότητας των ιστών.
Οι χυμικοί παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση του φαινοτύπου της καρδιάς των ενηλίκων. Αυτό επισημάνθηκε σε μελέτες HiPS-CM στις οποίες προστέθηκαν Τ3 και Dex σε καλλιεργητικά μέσα για την επιτάχυνση της ωρίμανσης των κυττάρων. Η Τ3 μπορεί να επηρεάσει τη μεταφορά αμινοξέων, σακχάρων και ασβεστίου διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών36. Επιπλέον, η Τ3 προάγει την έκφραση MHC-α και την αρνητική ρύθμιση της MHC-β, προάγοντας τον σχηματισμό μυοϊνιδίων ταχείας συστολής σε ώριμα καρδιομυοκύτταρα σε σύγκριση με μυοϊνίδια αργής συστολής σε εμβρυϊκό CM. Η ανεπάρκεια Τ3 σε ασθενείς με υποθυρεοειδισμό έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια μυοϊνιδιακών ζωνών και μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης τόνου37. Η Dex δρα στους υποδοχείς γλυκοκορτικοειδών και έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τη συσταλτικότητα του μυοκαρδίου σε απομονωμένες καρδιές που αιματώνονται.38 Αυτή η βελτίωση πιστεύεται ότι σχετίζεται με την επίδραση στην είσοδο που προκαλείται από εναπόθεση ασβεστίου (SOCE)39,40. Επιπλέον, η Dex συνδέεται με τους υποδοχείς της, προκαλώντας μια ευρεία ενδοκυτταρική απόκριση που καταστέλλει την ανοσολογική λειτουργία και τη φλεγμονή30.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η φυσική μηχανική διέγερση (MS) βελτίωσε τη συνολική απόδοση της καλλιέργειας σε σύγκριση με την Ctrl, αλλά απέτυχε να διατηρήσει τη βιωσιμότητα, τη δομική ακεραιότητα και την καρδιακή έκφραση για 12 ημέρες σε καλλιέργεια. Σε σύγκριση με την Ctrl, η προσθήκη T3 και Dex σε καλλιέργειες CTCM (MT) βελτίωσε τη βιωσιμότητα και διατήρησε παρόμοια προφίλ μεταγραφής, δομική ακεραιότητα και μεταβολική δραστηριότητα με φρέσκο ​​καρδιακό ιστό για 12 ημέρες. Επιπλέον, ελέγχοντας τον βαθμό τάνυσης του ιστού, δημιουργήθηκε ένα μοντέλο καρδιακής υπερτροφίας που προκαλείται από υπερέκταση χρησιμοποιώντας STCM, το οποίο καταδεικνύει την ευελιξία του συστήματος STCM. Πρέπει να σημειωθεί ότι παρόλο που η καρδιακή αναδιαμόρφωση και η ίνωση συνήθως περιλαμβάνουν άθικτα όργανα των οποίων τα κυκλοφορούντα κύτταρα μπορούν να παρέχουν τις κατάλληλες κυτοκίνες καθώς και φαγοκυττάρωση και άλλους παράγοντες αναδιαμόρφωσης, τμήματα της καρδιάς μπορούν ακόμα να μιμούνται την ινωτική διαδικασία σε απόκριση στο στρες και το τραύμα σε μυοϊνοβλάστες. Αυτό έχει αξιολογηθεί προηγουμένως σε αυτό το μοντέλο καρδιακής τομής. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι παράμετροι CTCM μπορούν να διαμορφωθούν αλλάζοντας την πίεση/ηλεκτρικό πλάτος και συχνότητα για να προσομοιώσουν πολλές καταστάσεις όπως ταχυκαρδία, βραδυκαρδία και μηχανική κυκλοφορική υποστήριξη (μηχανική καρδιά χωρίς φορτίο). Αυτό καθιστά το σύστημα ένα μέσο απόδοσης για δοκιμές φαρμάκων. Η ικανότητα του CTCM να μοντελοποιεί την καρδιακή υπερτροφία που προκαλείται από υπερκόπωση ανοίγει το δρόμο για τη δοκιμή αυτού του συστήματος για εξατομικευμένη θεραπεία. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει ότι η μηχανική διάταση και η χυμική διέγερση είναι κρίσιμες για τη διατήρηση της καλλιέργειας των τομών καρδιακού ιστού.
Παρόλο που τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ υποδηλώνουν ότι η CTCM είναι μια πολύ πολλά υποσχόμενη πλατφόρμα για τη μοντελοποίηση άθικτου μυοκαρδίου, αυτή η μέθοδος καλλιέργειας έχει ορισμένους περιορισμούς. Ο κύριος περιορισμός της καλλιέργειας CTCM είναι ότι επιβάλλει συνεχείς δυναμικές μηχανικές καταπονήσεις στις τομές, γεγονός που αποκλείει την ικανότητα ενεργής παρακολούθησης των συσπάσεων των καρδιακών τομών κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου. Επιπλέον, λόγω του μικρού μεγέθους των καρδιακών τομών (7 mm), η δυνατότητα αξιολόγησης της συστολικής λειτουργίας εκτός των συστημάτων καλλιέργειας χρησιμοποιώντας παραδοσιακούς αισθητήρες δύναμης είναι περιορισμένη. Στο παρόν χειρόγραφο, ξεπερνάμε εν μέρει αυτόν τον περιορισμό αξιολογώντας την οπτική τάση ως δείκτη της συσταλτικής λειτουργίας. Ωστόσο, αυτός ο περιορισμός θα απαιτήσει περαιτέρω εργασία και μπορεί να αντιμετωπιστεί στο μέλλον με την εισαγωγή μεθόδων για την οπτική παρακολούθηση της λειτουργίας των καρδιακών τομών σε καλλιέργεια, όπως η οπτική χαρτογράφηση χρησιμοποιώντας χρωστικές ασβεστίου και ευαίσθητες στην τάση. Ένας άλλος περιορισμός της CTCM είναι ότι το λειτουργικό μοντέλο δεν χειρίζεται το φυσιολογικό στρες (προφόρτιση και μεταφόρτιση). Στην CTCM, η πίεση προκλήθηκε σε αντίθετες κατευθύνσεις για να αναπαραχθεί 25% φυσιολογική έκταση στη διαστολή (πλήρης έκταση) και τη συστολή (διάρκεια συστολής κατά την ηλεκτρική διέγερση) σε πολύ μεγάλους ιστούς. Αυτός ο περιορισμός θα πρέπει να αρθεί σε μελλοντικά σχέδια CTCM με την άσκηση επαρκούς πίεσης στον καρδιακό ιστό και από τις δύο πλευρές και με την εφαρμογή των ακριβών σχέσεων πίεσης-όγκου που εμφανίζονται στις κοιλότητες της καρδιάς.
Η αναδιαμόρφωση που προκαλείται από υπερδιάταση και αναφέρεται σε αυτό το χειρόγραφο περιορίζεται στη μίμηση υπερτροφικών σημάτων υπερδιάτασης. Έτσι, αυτό το μοντέλο μπορεί να βοηθήσει στη μελέτη της υπερτροφικής σηματοδότησης που προκαλείται από διάταση χωρίς την ανάγκη χυμικών ή νευρικών παραγόντων (οι οποίοι δεν υπάρχουν σε αυτό το σύστημα). Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την αύξηση της πολλαπλότητας του CTCM, για παράδειγμα, η συνκαλλιέργεια με ανοσοκύτταρα, χυμικούς παράγοντες κυκλοφορίας πλάσματος και η εννεύρωση κατά την συνκαλλιέργεια με νευρωνικά κύτταρα θα βελτιώσει τις δυνατότητες μοντελοποίησης ασθενειών με CTCM.
Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δεκατρείς χοίροι. Όλες οι διαδικασίες σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του ιδρύματος και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου του Λούισβιλ. Το αορτικό τόξο σφραγίστηκε και η καρδιά αιματώθηκε με 1 λίτρο αποστειρωμένου καρδιοπληγικού διαλύματος (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL ηπαρίνη, pH έως 7,4). Οι καρδιές διατηρήθηκαν σε παγωμένο καρδιοπληγικό διάλυμα μέχρι τη μεταφορά τους στο εργαστήριο σε πάγο, ο οποίος συνήθως διαρκεί <10 λεπτά. Οι καρδιές διατηρήθηκαν σε παγωμένο καρδιοπληγικό διάλυμα μέχρι τη μεταφορά τους στο εργαστήριο σε πάγο, ο οποίος συνήθως διαρκεί <10 λεπτά. сердца хранили во ледяном кардиоплегическом διαλύεται μέχρι μεταφοράς σε εργαστήρια στο λьду, что обычно занимает <10 мин. Οι καρδιές αποθηκεύτηκαν σε παγωμένο καρδιοπληγικό διάλυμα μέχρι τη μεταφορά τους στο εργαστήριο σε πάγο, η οποία συνήθως διαρκεί <10 λεπτά.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до транспортировки во εργαστήρια του льду, обычно <10 мин. Διατήρηση καρδιών σε πάγο λόγω καρδιοπληγίας μέχρι τη μεταφορά τους στο εργαστήριο σε πάγο, συνήθως <10 λεπτά.
Η συσκευή CTCM αναπτύχθηκε στο λογισμικό σχεδιασμού με τη βοήθεια υπολογιστή (CAD) SolidWorks. Οι θάλαμοι καλλιέργειας, οι διαχωριστές και οι θάλαμοι αέρα είναι κατασκευασμένοι από διαφανές ακρυλικό πλαστικό CNC. Ο δακτύλιος υποστήριξης διαμέτρου 7 mm είναι κατασκευασμένος από πολυαιθυλένιο υψηλής πυκνότητας (HDPE) στο κέντρο και έχει μια αυλάκωση o-ring για να φιλοξενήσει τον δακτύλιο o-ring σιλικόνης που χρησιμοποιείται για τη σφράγιση του μέσου από κάτω. Μια λεπτή μεμβράνη πυριτίου διαχωρίζει τον θάλαμο καλλιέργειας από την πλάκα διαχωρισμού. Η μεμβράνη σιλικόνης είναι κομμένη με λέιζερ από φύλλο σιλικόνης πάχους 0,02″ και έχει σκληρότητα 35A. Οι κάτω και οι άνω φλάντζες σιλικόνης είναι κομμένες με λέιζερ από φύλλο σιλικόνης πάχους 1/16″ και έχουν σκληρότητα 50A. Βίδες και παξιμάδια από ανοξείδωτο χάλυβα 316L χρησιμοποιούνται για τη στερέωση του μπλοκ και τη δημιουργία αεροστεγούς σφράγισης.
Μια ειδική πλακέτα τυπωμένου κυκλώματος (PCB) έχει σχεδιαστεί για να ενσωματώνεται στο σύστημα C-PACE-EM. Οι υποδοχές σύνδεσης ελβετικής μηχανής στην πλακέτα τυπωμένου κυκλώματος συνδέονται με ηλεκτρόδια γραφίτη μέσω επαργυρωμένων χάλκινων καλωδίων και χάλκινων βιδών 0-60 βιδωμένων στα ηλεκτρόδια. Η πλακέτα τυπωμένου κυκλώματος τοποθετείται στο κάλυμμα του τρισδιάστατου εκτυπωτή.
Η συσκευή CTCM ελέγχεται από έναν προγραμματιζόμενο πνευματικό ενεργοποιητή (PPD) που δημιουργεί μια ελεγχόμενη κυκλοφορική πίεση παρόμοια με έναν καρδιακό κύκλο. Καθώς η πίεση μέσα στον αεροθάλαμο αυξάνεται, η εύκαμπτη μεμβράνη σιλικόνης διαστέλλεται προς τα πάνω, πιέζοντας το μέσο κάτω από την περιοχή του ιστού. Η περιοχή του ιστού θα τεντωθεί στη συνέχεια από αυτήν την αποβολή υγρού, μιμούμενη τη φυσιολογική διαστολή της καρδιάς κατά τη διαστολή. Στην κορυφή της χαλάρωσης, εφαρμόστηκε ηλεκτρική διέγερση μέσω ηλεκτροδίων γραφίτη, τα οποία μείωσαν την πίεση στον αεροθάλαμο και προκάλεσαν συστολή των τμημάτων των ιστών. Μέσα στον σωλήνα υπάρχει μια αιμοστατική βαλβίδα με αισθητήρα πίεσης για την ανίχνευση της πίεσης στο σύστημα αέρα. Η πίεση που ανιχνεύεται από τον αισθητήρα πίεσης εφαρμόζεται σε έναν συλλέκτη δεδομένων συνδεδεμένο με τον φορητό υπολογιστή. Αυτό επιτρέπει τη συνεχή παρακολούθηση της πίεσης μέσα στον θάλαμο αερίων. Όταν επιτεύχθηκε η μέγιστη πίεση στον θάλαμο (τυπική 80 mmHg, 140 mmHg OS), η συσκευή λήψης δεδομένων έλαβε εντολή να στείλει ένα σήμα στο σύστημα C-PACE-EM για να δημιουργήσει ένα διφασικό σήμα τάσης για 2 ms, ρυθμισμένο στα 4 V.
Ελήφθησαν καρδιακές τομές και οι συνθήκες καλλιέργειας σε 6 φρεάτια πραγματοποιήθηκαν ως εξής: Μεταφέρθηκαν οι συλλεγμένες καρδιές από το δοχείο μεταφοράς σε δίσκο που περιείχε ψυχρή (4°C) καρδιοπληγία. Η αριστερή κοιλία απομονώθηκε με αποστειρωμένη λεπίδα και κόπηκε σε κομμάτια των 1-2 cm3. Αυτά τα μπλοκ ιστού προσαρτήθηκαν σε υποστηρίγματα ιστών με κόλλα ιστών και τοποθετήθηκαν σε ένα δονούμενο λουτρό ιστών μικροτόμου που περιείχε διάλυμα Tyrode και οξυγονωνόταν συνεχώς (3 g/L 2,3-βουτανοδιόνη μονοοξίμη (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-γλυκόζη (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml διαλύματος 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml διαλύματος 1 M), έως 1 L ddH2O). Ο δονούμενος μικροτόμος ρυθμίστηκε για να κόβει φέτες πάχους 300 μm με συχνότητα 80 Hz, πλάτος οριζόντιας δόνησης 2 mm και ρυθμό προώθησης 0,03 mm/s. Το λουτρό ιστών περιβλήθηκε από πάγο για να διατηρείται το διάλυμα δροσερό και η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 4°C. Μεταφέρετε τις τομές ιστού από το λουτρό μικροτόμου σε ένα λουτρό επώασης που περιείχε συνεχώς οξυγονωμένο διάλυμα Tyrode σε πάγο μέχρι να ληφθούν αρκετές τομές για μία πλάκα καλλιέργειας. Για καλλιέργειες transwell, οι τομές ιστού προσαρτήθηκαν σε αποστειρωμένα υποστρώματα πολυουρεθάνης πλάτους 6 mm και τοποθετήθηκαν σε 6 ml βελτιστοποιημένου μέσου (μέσο 199, 1x συμπλήρωμα ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-αλκαλικό και 2X αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό). Ηλεκτρική διέγερση (10 V, συχνότητα 1,2 Hz) εφαρμόστηκε στις τομές ιστού μέσω του C-Pace. Για συνθήκες TD, προστέθηκαν φρέσκια T3 και Dex στα 100 nM και 1 μM σε κάθε αλλαγή μέσου. Το μέσο κορένεται με οξυγόνο πριν από την αντικατάστασή του 3 φορές την ημέρα. Οι τομές ιστού καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα στους 37°C και 5% CO2.
Για τις καλλιέργειες CTCM, οι τομές ιστών τοποθετήθηκαν σε έναν ειδικά κατασκευασμένο τρισδιάστατο εκτυπωτή σε ένα τρυβλίο Petri που περιείχε τροποποιημένο διάλυμα Tyrode. Η συσκευή έχει σχεδιαστεί για να αυξάνει το μέγεθος της τομής της καρδιάς κατά 25% της επιφάνειας του δακτυλίου στήριξης. Αυτό γίνεται έτσι ώστε οι τομές της καρδιάς να μην τεντώνονται μετά τη μεταφορά τους από το διάλυμα Tyrode στο μέσο και κατά τη διάρκεια της διαστολής. Χρησιμοποιώντας ιστοακρυλική κόλλα, τομές πάχους 300 µm στερεώθηκαν σε έναν δακτύλιο στήριξης διαμέτρου 7 mm. Αφού στερεώσετε τις τομές ιστού στον δακτύλιο στήριξης, κόψτε τις πλεονάζουσες τομές ιστού και τοποθετήστε τις προσαρτημένες τομές ιστού πίσω στο λουτρό διαλύματος Tyrode σε πάγο (4°C) μέχρι να προετοιμαστούν αρκετές τομές για μία συσκευή. Ο συνολικός χρόνος επεξεργασίας για όλες τις συσκευές δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 2 ώρες. Αφού στερεωθούν 6 τομές ιστού στους δακτυλίους στήριξης, συναρμολογήθηκε η συσκευή CTCM. Ο θάλαμος καλλιέργειας CTCM είναι προγεμισμένος με 21 ml προ-οξυγονωμένου μέσου. Μεταφέρετε τις τομές ιστών στον θάλαμο καλλιέργειας και αφαιρέστε προσεκτικά τυχόν φυσαλίδες αέρα με μια πιπέτα. Στη συνέχεια, το τμήμα ιστού οδηγείται στην οπή και πιέζεται απαλά στη θέση του. Τέλος, τοποθετείται το καπάκι του ηλεκτροδίου στη συσκευή και μεταφέρεται η συσκευή στον επωαστήρα. Στη συνέχεια, συνδέεται το CTCM στον σωλήνα αέρα και στο σύστημα C-PACE-EM. Ο πνευματικός ενεργοποιητής ανοίγει και η βαλβίδα αέρα ανοίγει το CTCM. Το σύστημα C-PACE-EM διαμορφώθηκε για να παρέχει 4 V στα 1,2 Hz κατά τη διάρκεια διφασικής βηματοδότησης για 2 ms. Το μέσο άλλαζε δύο φορές την ημέρα και τα ηλεκτρόδια άλλαζαν μία φορά την ημέρα για να αποφευχθεί η συσσώρευση γραφίτη στα ηλεκτρόδια. Εάν είναι απαραίτητο, οι τομές ιστού μπορούν να αφαιρεθούν από τα φρεάτια καλλιέργειάς τους για να αποβληθούν τυχόν φυσαλίδες αέρα που μπορεί να έχουν πέσει από κάτω. Για συνθήκες επεξεργασίας MT, προστέθηκε φρέσκο ​​T3/Dex με κάθε αλλαγή μέσου με 100 nM T3 και 1 μM Dex. Οι συσκευές CTCM καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα στους 37°C και 5% CO2.
Για την απόκτηση τεντωμένων τροχιών τομών καρδιάς, αναπτύχθηκε ένα ειδικό σύστημα κάμερας. Χρησιμοποιήθηκε μια κάμερα SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Τόκιο, Ιαπωνία) με έναν μακροφακό Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, Σαν Φρανσίσκο, Καλιφόρνια). Η οπτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου μετά την αντικατάσταση του μέσου με νέο μέσο. Η κάμερα τοποθετείται σε γωνία 51° και το βίντεο καταγράφεται στα 30 καρέ ανά δευτερόλεπτο. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε λογισμικό ανοιχτού κώδικα (MUSCLEMOTION43) με το Image-J για την ποσοτικοποίηση της κίνησης των τομών καρδιάς. Η μάσκα δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ΗΠΑ) για να ορίσει περιοχές ενδιαφέροντος για τις τομές καρδιάς που χτυπούν, ώστε να αποφευχθεί ο θόρυβος. Χειροκίνητα τμηματοποιημένες μάσκες εφαρμόζονται σε όλες τις εικόνες σε μια ακολουθία καρέ και στη συνέχεια διαβιβάζονται στο πρόσθετο MUSCLEMOTION. Το Muscle Motion χρησιμοποιεί τη μέση ένταση των pixel σε κάθε καρέ για να ποσοτικοποιήσει την κίνησή του σε σχέση με το καρέ αναφοράς. Τα δεδομένα καταγράφηκαν, φιλτραρίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του χρόνου κύκλου και την αξιολόγηση της έκτασης των ιστών κατά τη διάρκεια του καρδιακού κύκλου. Το καταγεγραμμένο βίντεο υποβλήθηκε σε μετεπεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό φίλτρο μηδενικής φάσης πρώτης τάξης. Για την ποσοτικοποίηση της έκτασης του ιστού (από κορυφή σε κορυφή), πραγματοποιήθηκε ανάλυση από κορυφή σε κορυφή για τη διάκριση μεταξύ κορυφών και κοιλοτήτων στο καταγεγραμμένο σήμα. Επιπλέον, η αποκλιμάκωση τάσης πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ένα πολυώνυμο 6ης τάξης για την εξάλειψη της μετατόπισης του σήματος. Ο κώδικας προγράμματος αναπτύχθηκε στο MATLAB για τον προσδιορισμό της συνολικής κίνησης των ιστών, του χρόνου κύκλου, του χρόνου χαλάρωσης και του χρόνου συστολής (Συμπληρωματικός Κωδικός Προγράμματος 44).
Για την ανάλυση της παραμόρφωσης, χρησιμοποιώντας τα ίδια βίντεο που δημιουργήθηκαν για την αξιολόγηση της μηχανικής έκτασης, αρχικά εντοπίσαμε δύο εικόνες που αντιπροσωπεύουν τις κορυφές κίνησης (τα υψηλότερα (άνω) και τα χαμηλότερα (κάτω) σημεία κίνησης) σύμφωνα με το λογισμικό MUSCLEMOTION. Στη συνέχεια, τμηματοποιήσαμε τις περιοχές των ιστών και εφαρμόσαμε μια μορφή αλγορίθμου σκίασης στον τμηματοποιημένο ιστό (Συμπληρωματικό Σχήμα 2α). Ο τμηματοποιημένος ιστός στη συνέχεια διαιρέθηκε σε δέκα υποεπιφάνειες και η τάση σε κάθε επιφάνεια υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: Παραμόρφωση = (Sup-Sdown)/Sdown, όπου Sup και Sdown είναι οι αποστάσεις του σχήματος από τις άνω και κάτω σκιές του υφάσματος, αντίστοιχα (Συμπληρωματικό Σχήμα 2β).
Οι καρδιακές τομές σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% για 48 ώρες. Οι σταθεροποιημένοι ιστοί αφυδατώθηκαν σε διάλυμα σακχαρόζης 10% και 20% για 1 ώρα και στη συνέχεια σε διάλυμα σακχαρόζης 30% όλη τη νύχτα. Οι τομές στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε διάλυμα βέλτιστης θερμοκρασίας κοπής (ένωση OCT) και καταψύχθηκαν σταδιακά σε λουτρό ισοπεντανίου/ξηρού πάγου. Αποθηκεύστε τα μπλοκ ενσωμάτωσης OCT στους -80 °C μέχρι τον διαχωρισμό. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες παρασκευάστηκαν ως τομές πάχους 8 μm.
Για να αφαιρέσετε το OCT από τις καρδιακές τομές, θερμάνετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε θερμαντικό μπλοκ στους 95 °C για 5 λεπτά. Προσθέστε 1 ml PBS σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια διαποτίστε τις τομές τοποθετώντας 0,1% Triton-X σε PBS για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Για να αποτρέψετε τη δέσμευση μη ειδικών αντισωμάτων στο δείγμα, προσθέστε 1 ml διαλύματος BSA 3% στις αντικειμενοφόρους πλάκες και επωάστε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, το BSA αφαιρέθηκε και οι αντικειμενοφόροι πλύθηκαν με PBS. Σημειώστε κάθε δείγμα με μολύβι. Πρωτογενή αντισώματα (αραιωμένα 1:200 σε 1% BSA) (κοννεξίνη 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) και τροπονίνη-Τ (Thermo Scientific; #MA5-12960) προστέθηκαν σε διάστημα 90 λεπτών, στη συνέχεια δευτερογενή αντισώματα (αραιωμένα 1:200 σε 1% BSA) έναντι Alexa Fluor 488 ποντικού (Thermo Scientific; #A16079), έναντι Alexa Fluor 594 κουνελιού (Thermo Scientific; #T6391) για επιπλέον 90 λεπτά. Πλύναμε 3 φορές με PBS Για να διακρίνουμε τη χρώση-στόχο από το φόντο, χρησιμοποιήσαμε μόνο το δευτερογενές αντίσωμα ως έλεγχο. Τέλος, προστέθηκε πυρηνική χρώση DAPI και οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετήθηκαν σε ένα vectashield (Vector Laboratories) και σφραγίστηκαν με βερνίκι νυχιών (μεγέθυνση -x) και μικροσκόπιο Keyence με μεγέθυνση 40x.
Για τη χρώση WGA χρησιμοποιήθηκε WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) σε συγκέντρωση 5 μg/ml σε PBS και εφαρμόστηκε σε σταθερές τομές για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και προστέθηκε μαύρο Σουδάν σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα και επωάστηκαν για 30 λεπτά. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και προστέθηκε μέσο ενσωμάτωσης vectashield. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες απεικονίστηκαν σε μικροσκόπιο Keyence σε μεγέθυνση 40x.
Το OCT αφαιρέθηκε από τα δείγματα όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά την αφαίρεση του OCT, βυθίστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες στο διάλυμα Bouin όλη τη νύχτα. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες ξεπλύθηκαν με απεσταγμένο νερό για 1 ώρα και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε διάλυμα φουξίνης αλόης οξέος Bibrich για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα 5% φωσφομολυβδαινίου/5% φωσφοβολφραμικού οξέος για 10 λεπτά. Χωρίς ξέπλυμα, μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες απευθείας στο διάλυμα μπλε ανιλίνης για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα οξικού οξέος 1% για 2 λεπτά. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες ξηράνθηκαν σε αιθανόλη 200 N και μεταφέρθηκαν σε ξυλόλιο. Οι χρωματισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Keyence με αντικειμενικό φακό 10x. Το ποσοστό επιφάνειας ίνωσης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Keyence Analyzer.
Δοκιμασία Βιωσιμότητας Κυττάρων CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), αριθμός καταλόγου V13154, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με ορισμένες τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε χειρουργικός διατρητής διαμέτρου 6 mm για να διασφαλιστεί ομοιόμορφο μέγεθος ιστού κατά την ανάλυση MTT. Οι ιστοί τοποθετήθηκαν ξεχωριστά στα φρεάτια μιας πλάκας 12 φρεατίων που περιείχε υπόστρωμα MTT σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι τομές επωάζονται στους 37°C για 3 ώρες και ο ζωντανός ιστός μεταβολίζει το υπόστρωμα MTT για να σχηματίσει μια πορφυρή ένωση φορμαζάνης. Αντικαταστήστε το διάλυμα MTT με 1 ml DMSO και επωάστε στους 37°C για 15 λεπτά για να εξαχθεί η πορφυρή φορμαζάνη από τις καρδιακές τομές. Τα δείγματα αραιώθηκαν 1:10 σε DMSO σε πλάκες διαφανούς πυθμένα 96 φρεατίων και η ένταση του πορφυρού χρώματος μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας Cytation (BioTek). Οι μετρήσεις ομαλοποιήθηκαν στο βάρος κάθε τομής της καρδιάς.
Το μέσο για την τοποθέτηση καρδιακών τεμαχίων αντικαταστάθηκε με μέσο που περιείχε 1 μCi/ml [5-3H]-γλυκόζη (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ΗΠΑ) για τη δοκιμασία αξιοποίησης γλυκόζης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Μετά από 4 ώρες επώασης, προσθέστε 100 μl μέσου σε έναν ανοιχτό σωλήνα μικροφυγοκέντρησης που περιείχε 100 μl 0,2 N HCl. Στη συνέχεια, ο σωλήνας τοποθετήθηκε σε έναν σωλήνα σπινθηρισμού που περιείχε 500 μl dH2O για εξάτμιση του [3H]2O για 72 ώρες στους 37°C. Στη συνέχεια, αφαιρέστε τον σωλήνα μικροφυγοκέντρησης από τον σωλήνα σπινθηρισμού και προσθέστε 10 ml υγρού σπινθηρισμού. Οι μετρήσεις σπινθηρισμού πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή υγρού σπινθηρισμού Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ΗΠΑ). Στη συνέχεια, υπολογίστηκε η χρήση γλυκόζης λαμβάνοντας υπόψη την ειδική δραστικότητα της [5-3H]-γλυκόζης, την ατελή ισορροπία και το υπόβαθρο, την αραίωση της [5-3H]-σε μη επισημασμένη γλυκόζη και την αποτελεσματικότητα του μετρητή σπινθηρισμού. Τα δεδομένα ομαλοποιούνται ως προς τη μάζα των τμημάτων της καρδιάς.
Μετά την ομογενοποίηση ιστού σε Trizol, το RNA απομονώθηκε από καρδιακές τομές χρησιμοποιώντας το Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης RNAsec, η αλληλούχιση και η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκαν ως εξής:
1 μg RNA ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκε ως αρχικό υλικό για την παρασκευή της βιβλιοθήκης RNA. Οι βιβλιοθήκες αλληλούχισης δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης RNA NEBNext UltraTM για την Illumina (NEB, ΗΠΑ) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή και προστέθηκαν κωδικοί ευρετηρίου στις αλληλουχίες χαρακτηριστικών για κάθε δείγμα. Εν συντομία, το mRNA καθαρίστηκε από το συνολικό RNA χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια συνδεδεμένα με πολυ-Τ ολιγονουκλεοτίδια. Η θραυσματοποίηση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας δισθενή κατιόντα σε υψηλή θερμοκρασία σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης σύνθεσης πρώτης αλυσίδας NEBNext (5X). Το cDNA της πρώτης αλυσίδας συντέθηκε χρησιμοποιώντας τυχαίους εξαμερείς εκκινητές και αντίστροφη μεταγραφάση M-MuLV (RNase H-). Το cDNA της δεύτερης αλυσίδας στη συνέχεια συντίθεται χρησιμοποιώντας DNA πολυμεράση Ι και RNase H. Οι υπόλοιπες προεξοχές μετατρέπονται σε αμβλέα άκρα με δραστικότητα εξωνουκλεάσης/πολυμεράσης. Μετά την αδενυλίωση του 3' άκρου του θραύσματος DNA, ένας προσαρμογέας NEBNext με δομή βρόχου φουρκέτας προσαρτάται σε αυτόν για να το προετοιμάσει για υβριδισμό. Για την επιλογή θραυσμάτων cDNA με προτιμώμενο μήκος 150-200 bp, τα θραύσματα της βιβλιοθήκης καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, ΗΠΑ). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν 3 μl USER Enzyme (NEB, ΗΠΑ) με επιλεγμένο μέγεθος cDNA συνδεδεμένο με έναν προσαρμογέα για 15 λεπτά στους 37°C και στη συνέχεια για 5 λεπτά στους 95°C πριν από την PCR. Στη συνέχεια, η PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πολυμεράση Phusion High-Fidelity DNA, καθολικούς εκκινητές PCR και εκκινητές Index (X). Τέλος, τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν (σύστημα AMPure XP) και η ποιότητα της βιβλιοθήκης αξιολογήθηκε σε ένα σύστημα Agilent Bioanalyzer 2100. Η βιβλιοθήκη cDNA στη συνέχεια αλληλουχήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αλληλουχητή Novaseq. Τα ακατέργαστα αρχεία εικόνας από την Illumina μετατράπηκαν σε ακατέργαστες αναγνώσεις χρησιμοποιώντας το CASAVA Base Calling. Τα ακατέργαστα δεδομένα αποθηκεύονται σε αρχεία μορφής FASTQ(fq) που περιέχουν αλληλουχίες ανάγνωσης και αντίστοιχες ιδιότητες βάσεων. Επιλέξτε HISAT2 για να αντιστοιχίσετε τις φιλτραρισμένες αναγνώσεις αλληλούχισης με το γονιδίωμα αναφοράς Sscrofa11.1. Γενικά, το HISAT2 υποστηρίζει γονιδιώματα οποιουδήποτε μεγέθους, συμπεριλαμβανομένων γονιδιωμάτων μεγαλύτερων από 4 δισεκατομμύρια βάσεις, και οι προεπιλεγμένες τιμές ορίζονται για τις περισσότερες παραμέτρους. Οι αναγνώσεις συρραφής από δεδομένα RNA Seq μπορούν να ευθυγραμμιστούν αποτελεσματικά χρησιμοποιώντας το HISAT2, το ταχύτερο σύστημα που διατίθεται αυτήν τη στιγμή, με την ίδια ή καλύτερη ακρίβεια από οποιαδήποτε άλλη μέθοδο.
Η αφθονία των μεταγράφων αντικατοπτρίζει άμεσα το επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης αξιολογούνται από την αφθονία των μεταγράφων (αριθμός αλληλούχισης) που σχετίζονται με το γονιδίωμα ή τα εξόνια. Ο αριθμός των αναγνώσεων είναι ανάλογος με τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης, το μήκος του γονιδίου και το βάθος αλληλούχισης. Υπολογίστηκαν τα FPKM (θραύσματα ανά χίλια ζεύγη βάσεων μεταγράφων που έχουν αλληλουχηθεί ανά εκατομμύριο ζεύγη βάσεων) και οι τιμές P της διαφορικής έκφρασης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο DESeq2. Στη συνέχεια, υπολογίσαμε το ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) για κάθε τιμή P χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Benjamini-Hochberg9 με βάση την ενσωματωμένη συνάρτηση R "p.adjust".
Το RNA που απομονώθηκε από καρδιακές τομές μετατράπηκε σε cDNA σε συγκέντρωση 200 ng/μl χρησιμοποιώντας το SuperScript IV Vilo Master mix από την Thermo (Thermo, αρ. καταλ. 11756050). Η ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια διαφανή πλάκα αντίδρασης Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 φρεατίων (Thermo, αρ. καταλ. 4483319) και οπτική κόλλα microamp (Thermo, αρ. καταλ. 4311971). Το μείγμα αντίδρασης αποτελούνταν από 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, αρ. καταλ. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer και 3,5 µl H2O αναμεμειγμένο ανά φρεάτιο. Διεξήχθησαν τυπικοί κύκλοι qPCR και οι τιμές CT μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο PCR πραγματικού χρόνου Quantstudio 5 της Applied Biosystems (μονάδα 384 φρεατίων· αριθμός προϊόντος A28135). Οι εκκινητές Taqman αγοράστηκαν από την Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Οι τιμές CT όλων των δειγμάτων ομαλοποιήθηκαν ως προς το γονίδιο housekeeping GAPDH.
Η απελευθέρωση του NT-ProBNP από το μέσο αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ NT-ProBNP (pig) (Αρ. Καταλόγου MBS2086979, MyBioSource) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 250 µl από κάθε δείγμα και πρότυπο προστέθηκαν εις διπλούν σε κάθε φρεάτιο. Αμέσως μετά την προσθήκη του δείγματος, προσθέστε 50 µl Αντιδραστηρίου Δοκιμασίας Α σε κάθε φρεάτιο. Ανακινήστε απαλά την πλάκα και σφραγίστε με στεγανωτικό. Στη συνέχεια, τα δισκία επωάστηκαν στους 37°C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, αναρροφήστε το διάλυμα και πλύνετε τα φρεάτια 4 φορές με 350 µl διαλύματος πλύσης 1X, επωάζοντας το διάλυμα πλύσης για 1-2 λεπτά κάθε φορά. Στη συνέχεια, προσθέστε 100 µl Αντιδραστηρίου Δοκιμασίας Β ανά φρεάτιο και σφραγίστε με στεγανωτικό πλάκας. Το δισκίο ανακινήθηκε απαλά και επωάστηκε στους 37°C για 30 λεπτά. Αναρροφήστε το διάλυμα και πλύνετε τα φρεάτια 5 φορές με 350 µl διαλύματος πλύσης 1X. Προσθέστε 90 µl διαλύματος υποστρώματος σε κάθε φρεάτιο και σφραγίστε την πλάκα. Επωάστε την πλάκα στους 37°C για 10-20 λεπτά. Προσθέστε 50 µl διαλύματος διακοπής σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα μετρήθηκε αμέσως χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης πλακών Cytation (BioTek) ρυθμισμένη στα 450 nm.
Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ισχύος για την επιλογή των μεγεθών ομάδων που θα παρέχουν >80% ισχύ για την ανίχνευση απόλυτης αλλαγής 10% στην παράμετρο με ποσοστό σφάλματος Τύπου Ι 5%. Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ισχύος για την επιλογή των μεγεθών ομάδων που θα παρέχουν >80% ισχύ για την ανίχνευση απόλυτης αλλαγής 10% στην παράμετρο με ποσοστό σφάλματος Τύπου Ι 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечатување >80% δυνατοτήτων для обнаружения 10% апсолютного изменения параметри со 5% частотой ошибок τύπου I. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ισχύος για την επιλογή μεγεθών ομάδων που θα παρείχαν >80% ισχύ για την ανίχνευση 10% απόλυτης αλλαγής παραμέτρου με ποσοστό σφάλματος Τύπου Ι 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% αδυναμία για ανεπάρκεια 10% absolutnogo изменения параметров и 5% частоты ошибок τύπος I. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ισχύος για την επιλογή ενός μεγέθους ομάδας που θα παρείχε >80% ισχύ για την ανίχνευση 10% απόλυτης αλλαγής παραμέτρου και 5% ποσοστού σφάλματος τύπου Ι.Οι τομές ιστού επιλέχθηκαν τυχαία πριν από το πείραμα. Όλες οι αναλύσεις ήταν τυφλές ως προς την κατάσταση και τα δείγματα αποκωδικοποιήθηκαν μόνο αφού είχαν αναλυθεί όλα τα δεδομένα. Για την εκτέλεση όλων των στατιστικών αναλύσεων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό GraphPad Prism (Σαν Ντιέγκο, Καλιφόρνια). Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05. Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Για όλα τα στατιστικά στοιχεία, οι τιμές p θεωρήθηκαν σημαντικές σε τιμές <0,05.Το αμφίπλευρο t-test του Student πραγματοποιήθηκε στα δεδομένα με μόνο 2 συγκρίσεις. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ή αμφίδρομη ANOVA για τον προσδιορισμό της σημαντικότητας μεταξύ πολλαπλών ομάδων. Κατά την εκτέλεση δοκιμών post hoc, εφαρμόστηκε διόρθωση Tukey για να ληφθούν υπόψη πολλαπλές συγκρίσεις. Τα δεδομένα RNAsec έχουν ειδικές στατιστικές παραμέτρους κατά τον υπολογισμό του FDR και του p.adjust, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην περίληψη του Nature Research Report που συνδέεται με αυτό το άρθρο.