Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecreĝimon en Internet Explorer).Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Homa intesta morfogenezo establas kripto-vilojn de 3D epitelia mikroarkitekturo kaj spaca organizo. Ĉi tiu unika strukturo estas postulata por konservi intestan homeostazon protektante la stamĉelniĉon en la baza kripto de eksogenaj mikrobaj antigenoj kaj iliaj metabolitoj. Krome, intestaj viloj kaj sekrecia muko prezentas funkcie diferencigitajn de la intesta surfaca ĉelo sur la epiteliaj surfacaj baroj rekreantaj la epiteliajn surfacajn ĉelojn. D-epiteliaj strukturoj estas decidaj por la konstruado de en vitro intestmodeloj. Precipe, la organika mimetika intesto-sur-peceto povas indukti spontanean 3D-morfogenezon de la intesta epitelio kun plifortigitaj fiziologiaj funkcioj kaj biomekaniko. Ĉi tie, ni provizas reprodukteblan protokolon por fortike indukti intestan morfogenezon en la intesta peceto ankaŭ priskribas detalan elpensaĵon en la intesta peceto-metodo de transflua peceto kiel bone enmetitan metodon en la intesta peceto. , kulturado de Caco-2 aŭ intestaj organoidaj epiteliĉeloj en konvenciaj agordoj same kiel sur mikrofluida platformo, indukto de 3D morfogenezo, kaj karakterizado de establitaj 3D epitelioj uzante multoblajn bildigajn kategoriojn. Ĉi tiu protokolo atingas regeneradon de funkcia intesta mikroarkitekturo per kontrolado de basoflanka fluida fluo por 5 d. postulas kompleksan ĉelan inĝenieristikon aŭ manipuladon, kiuj povas superi aliajn ekzistantajn teknikojn. Ni antaŭvidas, ke nia proponita protokolo povus havi larĝajn implicojn por la biomedicina esplorkomunumo, provizante metodon por regeneri 3D intestajn epiteliajn tavolojn en vitro por biomedicinaj, klinikaj kaj farmaciaj aplikoj.
Eksperimentoj pruvas, ke intestaj epiteliaj Caco-2-ĉeloj kultivitaj en intesto-sur-blato1,2,3,4,5 aŭ dutavolaj mikrofluidaj aparatoj6,7 povas sperti spontanean 3D-morfogenezon in vitro sen klara kompreno de la subesta mekanismo. En nia lastatempa studo, ni trovis, ke forigo de basolaterale sekreciata aparato estas necesa kaj necesas la forigo de basoflankaj sekreciaj aparatoj de la 3D-a morfogenezo in vitro. morfogenezo en vitro, kiu estis pruvita per Caco-2 kaj pacient-derivitaj intestaj organoidoj.Epiteliaj ĉeloj estis validigitaj. En ĉi tiu studo, ni specife koncentriĝis pri la ĉelproduktado kaj koncentriĝo distribuado de potenca Wnt-antagonisto, Dickkopf-1 (DKK-1), en intesto-sur-blato kaj modifitaj mikrofluidaj aparatoj enhavantaj Transwell-enigaĵojn, nomitajn "Hibrida Peceto". -rilata proteino 1, aŭ Soggy-1) al la sur-blata intesto malhelpas la morfogenezon aŭ interrompas la prestrukturitan 3D epitelian tavolon, sugestante, ke antagonisma streso dum kulturo respondecas pri intesta morfogenezo en vitro. Sekve, praktika aliro por atingi fortikan morfogenezon ĉe la epitelia interfaco estas minimume forigi la flankan nivelon de aktiva komparo en la flanka komparo. (ekz., en gut-sur-blato aŭ hibrida-sur-blato platformoj) aŭ disvastigo .Basolateral media (ekz, de Transwell enigaĵoj en grandaj basolateral rezervujoj en putoj).
En ĉi tiu protokolo, ni provizas detalan metodon por fabriki gut-sur-pecetajn mikroaparatojn kaj Transwell-enmeteblajn hibridajn blatojn (ŝtupoj 1-5) por kulturi intestajn epiteliajn ĉelojn sur poraj membranoj bazitaj en polidimetilsiloksano (PDMS) (ŝtupoj 6A, 7A, 8, 9) aŭ poliesteraj membranoj de Transwell induktitaj 6A, 7A, 8, 9 aŭ poliestera membranoj de Transwell, 38, 8B induktitaj (7, 3, 9, 7, 8, 8). morfogenezo in vitro (paŝo 10).Ni ankaŭ identigis ĉelajn kaj molekulan trajtojn indikajn de histo-specifa histogenezo kaj genlinio-dependa ĉela diferencigo aplikante multoblajn bildigajn kategoriojn (ŝtupoj 11-24).Ni induktas morfogenezon uzante homajn intestajn epiteliajn ĉelojn, kiel ekzemple Caco-2 aŭ intestajn organoidojn, en du kulturaj formatoj de intesta membrano kaj reproduktado de monoformaj membranoj, surfacaj modifoj kaj reproduktado de monokemiaj detaloj. de la biomekanika mikromedio.in vitro.Por indukti 3D morfogenezon de 2D epiteliaj monotavoloj, ni forigis morfogenantagonistojn en ambaŭ kulturitaj formoj fluante la medion en la basoflankan kupeon de la kulturo.Fine, ni disponigas reprezenton de la utileco de regenerebla 3D epiteliaj monotavoloj, kiu povas esti uzata laŭlonga epitelia kreska modelo, kiu povas esti uzata por laŭlonga epitelio-modelo-dependa kreska modelo-gastiganto-dependa. -kulturoj, patogeninfekto, inflama vundo, epitelia baro misfunkcio, kaj probiotik-bazitaj terapioj Ekzemplo.influoj.
Nia protokolo povas esti utila al larĝa gamo de sciencistoj en baza (ekz., intesta mukoza biologio, stamĉela biologio kaj evolua biologio) kaj aplikata esplorado (ekz., antaŭklinika drogtestado, malsano-modeligado, hista inĝenierado kaj gastroenterologio) larĝa efiko. Pro la reproduktebleco kaj fortikeco de nia protokolo por indukti 3D-an morfogenezon ni povas disvastigi nian teknikan strategion en la intesta morfogenezo en vitro. s studante la dinamikon de ĉela signalado dum intesta disvolviĝo, regenerado aŭ homeostazo. Krome, nia protokolo estas utila por pridemandi infekton sub diversaj infektaj agentoj kiel Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 aŭ Vibrio cholerae.Spektantaroj de malsanpatologio kaj patogenezo ankaŭ estas utilaj. La uzo de sur-blata intesta mikrofiziologia sistemo povas permesi longitudan kunkulturon 10 kaj postan taksadon de gastiga defendo, imunreagoj kaj patogen-rilata vundo-riparo en la gastrointestinal (GI) vojo 11. Aliaj GI-malsanoj asociitaj kun lika intesta malsano, kroĉitis-malsano, kolizito-malsano, kolizito-malsano. aŭ irritable intestsindromo povas esti simulita kiam 3D intestaj epiteliaj tavoloj estas preparitaj uzante la 3D intestajn epiteliajn tavolojn de la paciento , ĉi tiuj malsanoj inkluzivas vilozan atrofion, kriptan mallongigon, mukozan damaĝon aŭ difektitan epitelibaron.Biopsio aŭ stamĉelo-derivataj tavoloj povas konsideri la pli bonan modelon de malsanoj de la intesta malsano. tipoj, kiel ekzemple pacientaj periferiaj sango-mononukleaj ĉeloj (PBMCoj), al modeloj enhavantaj 3D intestajn vilo-kriptojn mikroarkitekturojn.histo-specifaj imunĉeloj, 5.
Ĉar 3D epitela mikrostrukturo povas esti fiksita kaj bildigita sen la sekcia procezo, spektantoj laborantaj pri spaca transcriptomics kaj alt-rezolucia aŭ super-rezolucia bildigo povas esti interesitaj pri nia mapado de la spatiotempa dinamiko de genoj kaj proteinoj sur epiteliaj niĉoj.Interesas pri teknologio.Respondo al mikrobaj aŭ imunaj stimuloj.Cetere, longituda gastiga-mikrobioma interkruciĝo 10, 14, kiuj kunordigas intestan homeostazon, povas esti establitaj en la 3D-intesta mukoza tavolo per kunkultivado de diversaj mikrobaj specioj, mikrobiaj komunumoj aŭ feka mikrobioto, precipe en la intesto-sur-ĉipo.en la platformo.Ĉi tiu aliro estas aparte alloga por spektantaroj studantaj mukozan imunologion, gastroenterologion, homan mikrobiomon, kulturomikon kaj klinikan mikrobiologion serĉantajn kultivi antaŭe nekulturitan intestmikrobioton en la laboratorio.Se nia en vitro-morfogenezo-protokolo povas esti adaptita al skaleblaj kulturformatoj, kiel plurputo enmetas en flankaj teleroj, kiuj replenigas bone en flankaj platoj aŭ kontinue replenigas. la protokolo ankaŭ povas esti disvastigita al tiuj, kiuj evoluigas farmaciajn, biomedicinajn Aŭ alt-produktajn kribradojn aŭ validigajn platformojn por la nutraĵa industrio.Kiel pruvo-de-principo, ni lastatempe pruvis la fareblecon de multipleksa alt-trafia morfogenezo-sistemo skalebla al 24-bona plato formato.Krome, multoblaj organo-sur-a-produktoj estis komercigitaj de niaj produktoj en vitro. morfogenezo-metodo povas esti akcelita kaj eble adoptita de multaj esplorlaboratorioj, industrio aŭ registaraj kaj reguligaj agentejoj por kompreni ĉelan reprogramadon de en vitro intesta morfogenezo ĉe la transcriptomic-nivelo por testi medikamentojn aŭ bioterapiojn.
Limigita nombro da hom-signifaj eksperimentaj modeloj estis uzata por studi intestan epitelian morfogenezon, ĉefe pro la manko de efektivigeblaj protokoloj por indukti 3D-morfogenezon en vitro. Fakte, multe de la nuna scio pri intesta morfogenezo baziĝas sur bestaj studoj (ekz. zebrofiŝo20, musoj21 aŭ kokidoj22). Determini homajn evoluajn procezojn. Ĉi tiuj modeloj ankaŭ estas tre limigitaj en sia kapablo esti testitaj en plurmaniera skalebla maniero. Sekve, nia protokolo por regenerado de 3D histostrukturoj en vitro superas en vivo-bestajn modelojn same kiel aliajn tradiciajn statikajn 2D ĉelkulturmodelojn. Kiel antaŭe priskribite, utiligado de 3D epiteliaj strukturoj permesis al ni ekzameni la diferencigan ĉelo-respondon en diversajn respondojn de diferenciga ĉelo por esplori la diferencigan ĉelon en kripto. mukozaj aŭ imunaj stimuloj.3D epiteliaj tavoloj povas disponigi spacon por studi kiel mikrobaj ĉeloj konkuras por formi spacajn niĉojn kaj ekologian evoluon en respondo al gastigaj faktoroj (ekz., internaj kontraŭ eksteraj mukotavoloj, sekrecio de IgA kaj kontraŭmikrobaj peptidoj). Krome, 3D epiteliaj peptidoj povas permesi al la mikrobiaj morfologioj kompreni kiel la mikrobiaj singeloj povas kompreni la mikrobiajn morfologiojn kaj la morfologion de la mikrobioj povas kompreni la strukturon de la mikrobioj. ekz., mallongĉenaj grasacidoj) kiuj formas ĉelan organizon kaj stamĉelniĉojn en la bazaj kriptoj. Ĉi tiuj trajtoj povas esti pruvitaj nur kiam 3D epiteliaj tavoloj estas establitaj en vitro.
Krom nia metodo krei 3D intestajn epiteliajn strukturojn, ekzistas pluraj en vitro metodoj. Intesta organoida kulturo estas pintnivela hista inĝenierarto tekniko bazita sur la kultivado de intestaj stamĉeloj sub specifaj morfogenkondiĉoj23,24,25. Tamen, la uzo de 3D organoidaj modeloj por transporta analizo aŭ gastigado estas ofte ene de la intesta organoido-mikrokulturo, ĉar la intesta organoido estas ofte enfermita ene de la intestaj stamĉeloj. tial, la enkonduko de luminalaj komponentoj kiel ekzemple mikrobaj ĉeloj aŭ eksogenaj antigenoj estas limigita.Aliro al organoidaj lumenoj povas esti plibonigita per mikroinjektilo,26,27 sed ĉi tiu metodo estas enpenetra kaj labor-intensa kaj postulas specialan scion por plenumi.Furthere, tradiciaj organoidaj kulturoj konservitaj en hidroĝelaj skafaldoj sub senmovaj kondiĉoj ne precize reflektas aktivan en vivo-biomekanikon.
Aliaj aliroj utiligitaj de pluraj esplorgrupoj utiligas prestrukturitajn 3D-hidroĝelajn eŝafodojn por imiti la intestan epitelian strukturon per kulturado de izolitaj homaj intestaj ĉeloj sur la ĝela surfaco. Fabriku hidroĝelaj eŝafodoj per 3D-presitaj, mikro-muelitaj aŭ litografie fabrikitaj muldiloj. Ĉi tiu metodo montras la mem-organizitan epitelian aranĝon de izolitaj epiliaj aranĝoj en vitra aranĝo de izolitaj epiliaj ĉeloj en vitra aranĝo. ing alta proporcio epitelia strukturo kaj stroma-epitelia interkruciĝo inkludante stromalĉelojn en la eŝafodo. Tamen, la naturo de prestrukturitaj skafaldoj povas malhelpi la montradon de la spontanea morfogenetika procezo mem. Ĉi tiuj modeloj ankaŭ ne disponigas dinamikan luminalan aŭ interstican fluon, malhavante la fluidan tondistreĉon, kiun la intesta morfogenezo bezonas por akiri la lastatempan funkcion de intesta morfogenezo. mikrofluida platformo kaj ŝablonaj intestaj epiteliaj strukturoj uzantaj laser-gravuradteknikojn. Musaj intestaj organoidoj sekvas gravuritajn ŝablonojn por formi intestajn tubformajn strukturojn, kaj intraluma fluida fluo povas esti resumita uzante mikrofluidikan modulon. Tamen, ĉi tiu modelo nek elmontras spontaneajn morfogenetikajn procezojn nek inkluzivas intestajn mekanobiologiajn movojn kreantajn de la samaj intestaj mekanobiologiaj teknikoj de la samaj intestaj mekanobiologiaj movoj el la samaj gut-mekanobiologiaj movadoj. tic-procezoj. Malgraŭ la kompleksa fabrikado de malsamaj intestsegmentoj ene de la tubo, ĉi tiu modelo ankaŭ malhavas lumfluan fluon kaj mekanikan deformadon. Aldone, modelfunkciebleco povas esti limigita, precipe post kiam la bioprinta procezo estas kompleta, perturbante eksperimentajn kondiĉojn aŭ ĉel-al-ĉelaj interagoj. Anstataŭe, nia proponita protokolo provizas spontanean intestmorfogenezon, fiziologie rilatan flankan streson, fiziologie rilatan flankan streĉon de s-intesta komparo, fiziologie rilata al flanka streso. tmentoj, kaj rekreado de kompleksaj biologiaj mikromedioj de modulareco. Sekve, nia en vitro 3D morfogeneza protokolo povas provizi komplementan aliron por venki la defiojn de ekzistantaj metodoj.
Nia protokolo estas tute fokusita al 3D epitelia morfogenezo, kun nur epiteliaj ĉeloj en kulturo kaj neniuj aliaj specoj de ĉirkaŭaj ĉeloj kiel mezenkimaj ĉeloj, endoteliaj ĉeloj kaj imunaj ĉeloj. Kiel antaŭe priskribite, la kerno de nia protokolo estas la indukto de epitelia morfogenezo per forigo de la morfogenaj sekreciaj flankaj inhibitoroj de niaj flankaj modulaj medioj. sur-peceto kaj hibrido-sur-peceto permesas al ni rekrei la ondigan 3D epitelian tavolon, kromajn biologiajn kompleksaĵojn kiel epiteli-mezenkimaj interagoj33,34, eksterĉela Matrico (ECM) deponaĵo 35 kaj, en nia modelo, kripto-villosaj trajtoj kiuj peras la stamĉelniĉojn, eg la fibrosaj mezenkimaj niĉoj restas konsiderataj en fibrosaj mezenkimaj niĉoj. kimo ludas ŝlosilan rolon en la produktado de ECM-proteinoj kaj reguligo de intesta morfogenezo en vivo35,37,38.La aldono de mezenkimaj ĉeloj al nia modelo plibonigis la morfogenetikan procezon kaj ĉelan alfiksan efikecon.La endotelia tavolo (t.e., kapilaroj aŭ limfatoj) ludas gravan rolon en reguligo de la regulado de la mezenkimaj ĉeloj al nia modelo en la vasigomolekulaj komponantoj en la transporto de molekulaj mikroimunuloj, la vasturismo, la mikroimunaj komponantoj. povas esti konektitaj inter histomodeloj estas antaŭkondiĉo kiam histomodeloj estas dizajnitaj por pruvi multi-organajn interagojn. Sekve, endoteliaj ĉeloj eble bezonos esti inkluzivitaj por modeligi pli precizajn fiziologiajn trajtojn kun organnivela rezolucio. Pacient-derivitaj imunĉeloj ankaŭ estas esencaj por montri denaskajn imunreagojn, antigenan prezenton, imunspecifan prezenton, imunan adaptiĝadon de transversa histo kaj intesta imuneca kunteksto. malsano.
La uzo de hibridaj blatoj estas pli simpla ol gut-sur-peceto ĉar la aparato-aranĝo estas pli simpla kaj la uzo de Transwell-enigaĵoj permesas skaleblan kulturon de intest-epitelio. Tamen, komerce haveblaj Transwell-enigaĵoj kun poliestermembranoj ne estas elastaj kaj ne povas simuli peristalt-similajn movojn. Krome, la apkika kupeo de la transwella streso restas metita en la apika streĉiĝo sur la trans-hibrida peceto en la stacio sur la apika streso. Arly, la statikaj propraĵoj en la apika kupeo malofte ebligas longperspektivan bakterian kunkulturon en hibridaj blatoj. Dum ni povas fortike indukti 3D-morfogenezon en Transwell-enigaĵoj dum uzado de hibridaj blatoj, la manko de fiziologie rilata biomekaniko kaj apika fluida fluo povas limigi la fareblecon de hibridaj blatoj por eblaj aplikoj.
Plenskalaj rekonstruoj de la homa kripto-vilo-akso en intesto-sur-blato kaj hibrido-sur-peceto kulturoj ne estas plene establitaj. Ĉar morfogenezo komenciĝas de epitelia monotavolo, 3D mikroarkitekturoj ne nepre disponigas morfologian similecon al kriptoj en vivo. la kripto kaj vilozaj regionoj ne estis klare demarkitaj.Kvankam pli altaj supraj kanaloj sur la blato kondukas al pliigita alteco de la mikroinĝenierita epitelio, la maksimuma alteco ankoraŭ estas limigita al ~300–400 µm. La reala profundo de homaj intestaj kriptoj en la maldika kaj dika intestoj estas ~135 µm kaj ~400 µm kaj la intesta alteco respektive ~400, µ0 µm estas ~400 µm.
De bildiga vidpunkto, surloka superrezolucia bildigo de 3D mikroarkitekturoj povas esti limigita al la intesto sur blato, ĉar la bezonata labordistanco de la objektiva lenso ĝis la epitelia tavolo estas en la ordo de kelkaj milimetroj. Por venki ĉi tiun problemon, malproksima celo povas esti postulata. Krome, fari maldikajn sekciojn por bildiga preparo pro tio ke MS estas la pli elasta tavolo de pli defio. mikrofabrikado de la intesto sur blato implikas konstantan aliĝon inter ĉiu tavolo, estas ege defie malfermi aŭ forigi la supran tavolon por ekzameni la surfacan strukturon de la epitelia tavolo.Ekzemple, uzante skanan elektronan mikroskopon (SEM).
La hidrofobeco de PDMS estis limiga faktoro en mikrofluid-bazitaj studoj traktantaj hidrofobajn malgrandajn molekulojn, ĉar PDMS povas nespecife adsorbi tiajn hidrofobiajn molekulojn. Alternativoj al PDMS povas esti konsiderataj kun aliaj polimeraj materialoj. Alternative, surfaca modifo de PDMS (ekz., tegaĵo kun lipofilaj materialoj povas esti konsiderata kiel hidrofoba 42 aŭ polietilglikolo 42 43 43 43 43 konsiderataj por minimumigi aŭ polietilglikolon). fobiaj molekuloj.
Fine, nia metodo ne estis bone karakterizita rilate al disponigado de alt-trafia kribrado aŭ "unu-granda taŭga por ĉiuj" uzant-amika eksperimenta platformo. La nuna protokolo postulas injektilon pumpilon per mikroaparato, kiu okupas spacon en CO2-inkubatoro kaj malhelpas grandskalajn eksperimentojn. Ĉi tiu limigo povas esti signife plibonigita per la skalebleco de pioniraj kulturoj formatoj (ekzemple, 92-3-bone, bone enmeti 92-3-bone aŭ 92-3-bone 92-3-bone enmetu 92-3-bone 92-3-bone 92-3-bone enmetu 92-3-bone 92-3-bone aŭ 92-3-bone 92-3-4-bone enmetu kiuj permesas kontinuan replenigon kaj forigon de bazflankaj amaskomunikiloj).
Por indukti 3D morfogenezon de homa intesta epitelio en vitro, ni uzis mikrofluidan blaton intestan aparaton enhavantan du paralelajn mikrokanalojn kaj elastan poran membranon intere por krei lumen-kapilaran interfacon. Ni ankaŭ pruvas la uzon de unukanala mikrofluida aparato (hibrida blato), kiu provizas kontinuan basoflankan fluon sub polarigitaj platformoj de intestoj, enmetas diversajn intestajn epiteliojn, enmetas en diversajn intestajn epiteliojn. epiteliĉeloj povas esti pruvitaj aplikante direktan manipuladon de fluo por forigi morfogenantagonistojn de la basoflanka kupeo.La tuta eksperimenta proceduro (Figuro 1) konsistas el kvin partoj: (i) mikrofabrikado de la intesta blato aŭ Transwell-enmegebla hibrida blato (ŝtupoj 1-5; Skatolo 1), (ii) preparado de intestaj ĉeloj epiteliaj aŭ intestaj organoidoj;skatoloj 2-5), (iii) kulturo de intestaj epiteliaj ĉeloj sur intestaj blatoj aŭ hibridaj blatoj (ŝtupoj 6-9), (iv) indukto de 3D morfogenezo in vitro (paŝo 10) kaj (v) ) por karakterizi la 3D epitelian mikrostrukturon (ŝtupoj 11-24). telia morfogenezo al spacaj, tempaj, kondiĉaj aŭ proceduraj kontroloj.
Ni uzis du malsamajn kulturplatformojn: intesto-sur-peceto kun rektaj kanaloj aŭ neliniaj kunvolvitaj kanaloj, aŭ hibridaj blatoj enhavantaj Transwell (TW) enigaĵojn en mikrofluida aparato, fabrikita kiel priskribite en Skatolo 1, kaj paŝo 1 -5 "Device Fabrication" montras la ĉefajn paŝojn en farado de ununura blato aŭ unuopa peceto aŭ klarigas la fonton de la homaj intestaj ĉeloj. ) kaj kultura proceduro uzata en ĉi tiu protokolo "In vitro morfogenezo" montras la ĝeneralajn paŝojn en kiuj Caco-2 aŭ organoid-derivataj epiteliĉeloj estas kultivitaj sur intesta blato aŭ sur Transwell-enigaĵoj de hibrida blato, sekvata de indukto de 3D morfogenezo kaj la formado de karakterizita epitelia strukturo. en ĉeldiferenciga karakterizado, intestaj fiziologiaj studoj, starigo de gastigant-mikrobiomaj ekosistemoj kaj malsanmodelado.Imunofluoreskecaj bildoj en "Cell Differentiation" montrante nukleojn, F-aktinon kaj MUC2 esprimitajn en la 3D Caco-2 epitelia tavolo generita sur la intesta blato.MUC2-signalsurfaco ĉeestas en mukosaj ĉeloj ĉeestantaj en mukosaj bildoj. Fiziologio montras mukon produktitan per makulado por sialacido kaj N-acetilglukozamina restaĵoj uzante fluoreskan tritikĝerman aglutininon. La du interkovrantaj bildoj en "Gastiganto-Mikroba Ko-Kulturoj" montras reprezentajn gastigantajn-mikrobiomajn kunkulturojn en la intesto sur blato. La maldekstra panelo montras la kunkulturon de E.-2-3-D-epikogeno esprimanta proteinon de E. lial ĉeloj.La dekstra panelo montras la lokalizon de GFP E. coli kunkulturita kun 3D Caco-2 epiteliĉeloj, sekvita de imunofluoreskeca makulado kun F-aktino (ruĝa) kaj kernoj (blua).Malsana modelado ilustras sanan kontraŭ likan inteston en intestinflamaj blatoj (ekz., antiinflamaj blatoj, fiziologiaj antiinflamaj blatoj) kaj antiinflamaj blatoj (ekz. ĉeloj (ekz., PBMC;verda).Kako-2-ĉeloj estis kultivitaj por establi 3D epitelian tavolon.Skalbreto, 50 µm.Bildoj en malsupra vico: "Diferenco de ĉeloj" adaptitaj kun permeso de referenco.2.Oxford University Press;Reproduktita kun permeso de Ref.5.NAS;"Gastiganto-Mikroba Kunkulturo" adaptita kun permeso de ref.3.NAS;"Malsana Modelado" adaptita kun permeso de referenco.5.NAS.
Kaj gut-sur-blato kaj hibridaj blatoj estis fabrikitaj uzante PDMS-kopiojn kiuj estis malmolditaj el siliciaj muldiloj per mola litografio1,44 kaj strukturitaj kun SU-8.La dezajno de la mikrokanaloj en ĉiu blato estas determinita konsiderante hidrodinamikon kiel ekzemple tonda streĉo kaj hidrodinamika premo1,4,12. , evoluis al kompleksa intesto-sur-peceto (Plilongigita Datumo Fig. 1b) kiu inkluzivas paron da kurbaj mikrokanaloj por indukti Pliigitan fluidan restadtempon, neliniajn fluajn ŝablonojn kaj multiaksan deformadon de kulturitaj ĉeloj (Fig. 2a–f) 12.Kiam pli kompleksaj intestoj-biomekanikoj devas esti rekreitaj, la intesto-biomeĥanikoj devas esti rekreitaj. voluta Gut-Chip ankaŭ forte induktas 3D-morfogenezon en simila tempokadro kun simila grado da epitelia kresko kompare kun la origina Gut-Chip, sendepende de la kulturita ĉeltipo. Tial, por indukti 3D-morfogenezon, liniaj kaj kompleksaj sur-blataj intestdezajnoj estas interŝanĝeblaj.2a).Por fabriki la inteston sur blato, la preta supra PDMS-tavolo estis sinsekve ligita al pora PDMS-filmo kaj tiam vicigita kun la malsupra PDMS-tavolo per neinversigebla ligado uzante korontraktilon (Fig. 2b-f). Por fabriki hibridajn blatojn, resanigitaj PDMS-replikoj estis kunligitaj al vitraj diapozitivoj, kiuj povis krei unuopajn aparatojn por enmeti transfluojn. Plilongigita Datumo Fig. 2).La kunliga procezo estas farita traktante la surfacojn de la PDMS-repliko kaj vitro per oksigena plasmo aŭ korona traktado.Post steriligo de la mikrofabrikita aparato ligita al la silikona tubo, la aparato-aranĝo estis preta por plenumi 3D-morfogenezon de la intesta epitelio (Figuro 2g).
a, Skema ilustraĵo de la preparado de PDMS-partoj el SU-8-ŝablonaj siliciaj muldiloj.La nekuracigita PDMS-solvo estis verŝita sur silician muldilon (maldekstre), resanigita je 60 °C (meze) kaj malmoldita (dekstre).La malmoldita PDMS estis tranĉita en pecojn kaj purigita por plua uzo.b, Foto de la muldilo uzata por prepari la membranon de silicio. d, Serio de fotoj de la supraj kaj malsupraj PDMS-komponentoj kaj la kunmetita sur-blata intesta aparato.e, Skemo de la vicigo de la supraj, membranoj kaj malsupraj PDMS-komponentoj.Ĉiu tavolo estas neinversigeble ligita per plasmo aŭ korona traktado.f, Skemo de la fabrikita gut-sur-peceta aparato kun supermetitaj kunvolvitaj, mikrokanaloj de mikrokanaloj. La fabrikita intesto sur blato kunmetita kun silikona tubo kaj injektilo estis metita sur kovrilon.La peceto-aparato estis metita sur la kovrilon de 150 mm Petri-plado por prilaborado.La ligilo estas uzata por fermi la silikonan tubon.h, Vidaj momentfotoj de hibrida peceto fabrikado kaj 3D-morfogenezo estis metita sendepende per hibridaj pecetoj enmetataj de intestaj blatoj2D sendepende enmetigi intestajn blatojn2D la ligilo estas uzata por fermi la silikonan tubon. ed en la hibridan blaton por indukti intestan 3D-morfogenezon.La medio estas trafuzita tra mikrokanaloj sub la ĉela tavolo establita sur la Transwell-enigaĵo.Skalstango, 1 cm.h Represita kun permeso de referenco.4.Elsevier.
En ĉi tiu protokolo, la ĉellinio Caco-2 kaj intestaj organoidoj estis uzataj kiel epiteliaj fontoj (Fig. 3a). Ambaŭ tipoj de ĉeloj estis kultivitaj sendepende (Kesto 2 kaj Skatolo 5) kaj uzataj por semi la ECM-tegitajn mikrokanalojn de sur-blata intesto aŭ enigaĵoj de Transwell. Kiam ĉeloj kunfluas (> 95% de ĉeloj), kovrado kaj rutino de ĉeloj (>95%) en ĉeloj (>95%) estas kovrado en ĉeloj. 50) en T-flakonoj estas rikoltitaj por prepari disigitajn ĉelpendadojn per tripsiniga fluido (kesto 2).Homaj intestaj organoidoj de intestaj biopsioj aŭ kirurgiaj resekcioj estis kultivitaj en Matrigel-skafodaj kupoloj en 24-putoj platoj por subteni la strukturan mikromedion.Mezulo enhavanta esencajn morfogenojn, kaj skatolojn priskribitajn kiel kreskojn, kaj skatolojn. estis kompletigita ĉiun duan tagon ĝis la organoidoj kreskis ĝis ~500 µm en diametro. Plene kreskitaj organoidoj estas rikoltitaj kaj disociigitaj en ununurajn ĉelojn por semado sur inteston aŭ Transwell-enigaĵojn sur blato (Kesto 5). Kiel ni antaŭe raportis, ĝi povas esti diferencigita laŭ malsano tipo12,13 (ekz. lezo kontraŭ ne-lezita areo) kaj gastrointestina loko en la vojo (ekz., duodeno, jejuno, ileo, cekumo, dupunkto aŭ rektumo).Ni provizas optimumigitan protokolon en Skatolo 5 por kulturado de kolonaj organoidoj (koloidoj), kiuj kutime postulas pli altajn koncentriĝojn de morfogenoj ol malgrand-intestaj organoidoj.
a, Laborfluo por la indukto de intesta morfogenezo en la intesta blato.Caco-2-homa intesta epitelio kaj intestaj organoidoj estas uzataj en ĉi tiu protokolo por pruvi 3D-morfogenezon.La izolitaj epiteliĉeloj estis semitaj en la preta gut-sur-peceto-aparato (ĉippreparo).Iam ĉeloj estas semitaj (semitaj) kaj alfiksitaj al membrano (PD000) tage (PD0000) ika (AP) fluo estas komencita kaj konservita dum la unuaj 2 tagoj (fluo, AP, D0-D2).Bazoflanka (BL) fluo ankaŭ estas komencita kune kun ciklaj streĉaj movoj (streĉado, fluo, AP kaj BL) kiam kompleta 2D monotavolo estas formita.Intesta 3D morfogenezo okazis spontanee post 5 tagoj de mikrofluidia ĉel-kulturo reprezentaj bildoj (P morfogenezo-25 ĉelaj reprezentaj bildoj). ĉiu eksperimenta paŝo aŭ tempopunkto (strekgrafiko, 100 µm). Kvar skemaj diagramoj ilustrantaj la respondajn kaskadojn de intesta morfogenezo (supre dekstre). La strekitaj sagoj en la skemo reprezentas la direkton de fluida fluo.b, SEM-bildo montranta la surfacan topologion de la establita 3D Caco-2 epitelio (maldekstre). tavolo (dekstra).c, Horizontala fronta vido de establitaj Caco-2 3D, klaŭdino (ZO-1, ruĝa) kaj kontinuaj brosaj limmembranoj etikeditaj F-aktino (verda) kaj kernoj (bluaj) Imunofluoreskeco konfokusa bildigo de epiteliaj ĉeloj sur intestaj blatoj. Sagoj montrantaj al la meza fokusa plano de la mezo-kulturo indikas la lokon de la meza kulturo skema vido. d sur blato akirita per faza kontrasta mikroskopio en tagoj 3, 7, 9, 11 kaj 13.La enmetita (supre dekstre) montras la altan pligrandigon de la provizita bildo.e, DIC-fotomikrofo de organoida 3D epitelio establita en la intesto sur tranĉaĵo prenita en la tago 7.f, Supermetitaj imunofluoreskaj bildoj por stel5 ĉeloj;magenta), pokalĉeloj (MUC2; verda), F-aktino (griza) kaj kernoj (ciano) kreskigitaj sur intestaj blatoj dum 3 tagoj, respektive (Maldekstre) kaj 13-tagaj (meza) organoidoj sur la epitelia tavolo.Vidu ankaŭ Plilongigitan Datumon Figuron 3, kiu elstarigas LGR5-signalon sen MUC2-signalado de organoidoj (MUC2-signalaj bildoj) de la mikrostrukturo de la organo-strukturo (MUC2). id-epitelio establita en la intesto sur blato makulante la plasmomembranon per CellMask-farbo (dekstre) en la tago 13 de kulturo.Skalstango estas 50 μm krom se alie dirite.b Represite kun permeso de referenco.2.Oxford University Press;c Adaptita kun permeso de Referenco.2.Oxford University Press;e kaj f adaptitaj kun permeso per referenco.12 Sub Creative Commons License CC BY 4.0.
En la intesto sur blato, necesas modifi la hidrofoban surfacon de la PDMS-pora membrano por sukcesa ECM-tegaĵo. En ĉi tiu protokolo, ni aplikas du malsamajn metodojn por modifi la hidrofobecon de PDMS-membranoj. Por kulturado de Caco-2-ĉeloj, surfacaktivigo per UV/ozona traktado sole sufiĉis por redukti la hidrofobecon de la PDMS-surfaco, almeti la ĉelon de PDMS kaj almeti la ĉelon de PDMS al mikrofobeco. Idic-kulturo de organoida epitelio postulas kemi-bazitan surfacfunkciigon por atingi efikan demetadon de ECM-proteinoj sinsekve aplikante polietilenimino (PEI) kaj glutaraldehido al PDMS-mikrokanaloj. Post surfacmodifo, ECM-proteinoj estis deponitaj por kovri la funkciigitan PDMS-surfacon kaj poste enkondukitaj en la izolitajn epiteliojn de la ĉeloj, la ĉeloj komencas nur per organoida epitelio. la medio en la supran mikrokanalon ĝis la ĉeloj formas kompletan monotavolon, dum la malsupra mikrokanalo konservas senmovajn kondiĉojn. Ĉi tiu optimumigita metodo por surfacaktivigo kaj ECM-tegaĵo ebligas la alfiksiĝon de organoida epitelio por indukti 3D-morfogenezon sur la PDMS-surfaco.
Transwell-kulturoj ankaŭ postulas ECM-tegaĵon antaŭ ĉelsemado;tamen, Transwell-kulturoj ne postulas kompleksajn antaŭtraktadajn paŝojn por aktivigi la surfacon de poraj enigaĵoj.Por kreskigado de Caco-2-ĉeloj sur Transwell-enigaĵoj, ECM-tegaĵo sur poraj enigaĵoj akcelas la alfiksiĝon de disigitaj Caco-2-ĉeloj (<1 horo) kaj malloza krucvojo bariero-formado (<1-2 tagoj). membransurfaco (<3 h) kaj konservita ĝis la organoidoj formas kompletan monotavolon kun bariera integreco .Transwell-kulturoj estas faritaj en 24-putaj platoj sen la uzo de hibridaj blatoj.
In vitro 3D morfogenezo povas esti komencita aplikante fluida fluo al la basolateral aspekto de establita epitelia tavolo.En la intesto sur blato, epitelial morfogenezo komenciĝis kiam la medio estis perfuzita en la supraj kaj malsupraj mikrokanaloj (Fig. 3a).Kiel antaŭe priskribite, estas kritike enkonduki fluida fluo en la malsupera (bazoflanka direkto) forigo de kontinua inhibicia sekreto provizis malsupera direkto. nutraĵoj kaj serumo al ĉeloj ligitaj sur poraj membranoj kaj generas luminal tondstreso, ni tipe aplikas duoblan fluon en la intesto sur blato.En hibridaj blatoj, Transwell enmetaĵoj enhavantaj epiteliajn monotavolojn estis enmetitaj en la hibridajn blatojn.Tiam, la medio estis aplikita sub la basolateral flanko de la pora Transwell enmetaĵo okazas tra la mikrokanalo. Ambaŭ intesta fluo morfogenezo tagojn post komencado de 3-5-5 tagojn intesta bazo de kulturo.
La morfologiaj trajtoj de mikroinĝenieritaj 3D epiteliaj tavoloj povas esti analizitaj aplikante diversajn bildigajn kategoriojn, inkluzive de fazkontrasta mikroskopio, diferenciala interferkontrasto (DIC) mikroskopio, SEM, aŭ imunofluoreskeca konfoka mikroskopio (Figures 3 kaj 4). al la optika travidebleco de PDMS kaj poliestera filmoj, ambaŭ la platformoj de intesto-sur-blato kaj hibrida blato povas disponigi realtempan surloke bildigon sen la bezono de sekco aŭ malmuntado de la aparato. Kiam oni faras imunofluoreskecan bildigon (Figuroj 1, 3c, f kaj 4b, c), ĉeloj estas tipe fiksitaj per PF/4% (paraformitaj kun PF/A). -100 kaj 2% (wt/vol) ) bova serumalbumino (BSA), en ordo. Depende de la ĉeltipo, malsamaj fiksiloj, trapenetriloj, kaj blokantaj agentoj povas esti uzataj. Primaraj antikorpoj celantaj genliniodependajn ĉelojn aŭ regionajn markilojn estas uzataj por reliefigi ĉelojn senmoviĝitajn surloke sur la blato, sekvitaj de malĉefaj kontraŭkorpoj kune kun malĉefaj antikorpoj (d-6′, 2, 2, 2, 4, 4, 4, 5, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8 ; -fenileno) indolo, DAPI) aŭ F-aktino (ekz., fluoreske etikedita faloidino). Fluoresk-bazita viva bildigo ankaŭ povas esti farita surloke por detekti mukoproduktadon (Fig.1, "Ĉeldiferencigo" kaj "Intesta fiziologio"), hazarda koloniigo de mikrobaj ĉeloj (Fig. 1, "Gastiganto-mikroba kunkulturo"), la varbado de imunĉeloj (Fig. 1, 'Malsana Modelado') aŭ la konturoj de 3D epitelia morfologio (Fig. 3c, la supraĵo modifas de la blato al la supraĵo). malsupra mikrokanala tavolo, kiel priskribite en ref.Kiel montrite en Fig. 2, la 3D epitelia morfologio same kiel la mikrovilli sur la apika broslimo povas esti bildigitaj per SEM (Fig. 3b).La esprimo de diferencigaj signoj povas esti taksita per plenumado de kvanta PCR5 aŭ unuĉela RNA-sekvenco. vestita per tripsinigo kaj tiam uzita por molekula aŭ genetika analizo.
a, Laborfluo por la indukto de intesta morfogenezo en hibrida peceto.Caco-2 kaj intestaj organoidoj estas uzataj en ĉi tiu protokolo por montri 3D-morfogenezon en hibrida peceta platformo.Disociigitaj epiteliĉeloj estis semitaj en pretaj Transwell-enigaĵoj (TW-prep; vidu figuron malsupre).Iam ĉeloj estis semitaj (semigitaj) kaj ĉiuj enigitaj membranoj estis almetitaj al transputokondiĉoj (t-aj membranoj alfiksitaj en membranokondiĉoj). W-kulturo).Post 7 tagoj, unuopa Transwell-enigaĵo enhavanta 2D monotavolon de epiteliĉeloj estis integrita en hibridan blaton por enkonduki basoflankan fluon (Flow, BL), kiu finfine kaŭzis la generacion de 3D epitelia tavolo (morfogenezo). Fazkontrastaj mikrografioj montrantaj morfologiajn trajtojn de homaj organoj aŭ epitelio-linio supreniranta de ĉiu eksperimenta ĉelo aŭ eksperimenta linio supreniranta 10-punkton de la normala ĉelo aŭ eksperimenta linio supreniranta 10-an. .La skemoj en la supraj tavoloj ilustras la eksperimentan agordon por ĉiu paŝo.b, Hibridaj blatoj (maldekstre skemoj) povas konduki al 3D morfogenezo de organoidaj epiteliĉeloj kun desupraj konfokusaj mikroskopiovidoj prenitaj ĉe malsamaj Z-pozicioj (supra, meza, kaj malsupra);vidu dekstrajn skemajn kaj respondajn punktliniojn).montris evidentajn morfologiajn trajtojn.F-aktino (ciano), nukleo (griza).c, Fluoreskecaj konfokusaj mikrografioj (3D angula vido) de organoid-derivitaj epiteliĉeloj kultivitaj en senmova Transwell (TW; enmetita ene de blanka strekita skatolo) kontraŭ hibrida blato (plej granda plena pafo) komparante 2D kontraŭ la vertikala morfologio, respektive en la kruco de 3D-aro en 3D-aro en vidpunktoj en 3D. supra dekstra angulo; "XZ") ankaŭ montras 2D kaj 3D funkciojn.Skalbreto, 100 µm.c Represita kun permeso de referenco.4.Elsevier.
Kontroloj povas esti preparitaj per kulturado de la samaj ĉeloj (Caco-2 aŭ intestaj organoidaj epiteliĉeloj) en dudimensiajn monotavolojn sub konvenciaj senmovaj kulturkondiĉoj. Precipe, nutra malplenigo povas rezulti pro la limigita volumenokapacito de la mikrokanaloj (te ~4 µL en la supra kanalo sur la originala intest-blata dezajno).
La mola litografioprocezo devus esti farita en pura ĉambro. Por ĉiu tavolo sur la blato (supraj kaj malsupraj tavoloj kaj membranoj) kaj hibridaj blatoj, malsamaj fotomaskoj estis uzitaj kaj fabrikitaj sur apartaj siliciaj oblatoj ĉar la altecoj de la mikrokanaloj estis malsamaj. La celalteco de la supra kaj malsupra mikrokanaloj de la intesto sur la blato estas 500 µm kaj la alteco de la hibrida peceto, respektive, estas 500 µm20 µm. µm.
Metu 3-colan silician oblaton en pladon kun acetono. Milde kirlu la teleron dum 30 sekundoj, poste aersekigu la oblaton. Transmetu la oblaton al telero kun IPA, poste turnu la teleron dum 30 s por purigi.
Piranjosolvo (miksaĵo de hidrogena peroksido kaj densa sulfata acido, 1:3 (vol/vol)) povas laŭvole esti uzita por maksimumigi la forigon de organikaj restaĵoj de la silicioblatsurfaco.
Piranha solvo estas ekstreme koroda kaj generas varmon.Aldonaj sekurecaj antaŭzorgoj estas necesaj.Por forigo de rubaĵoj, lasu la solvon malvarmigi kaj translokiĝi al pura, seka rubujo.Uzu malĉefajn ujojn kaj konvene etikedu rubujojn.Bonvolu sekvi la sekurecan gvidliniojn de la instalaĵo por pli detalaj proceduroj.
Senhidratigi la oblatojn metante ilin sur 200 °C varman teleron dum 10 min. Post dehidratiĝo, la oblato estis skuita kvin fojojn en aero por malvarmigi.
Verŝu ~10 g da fotorezisto SU-8 2100 sur la centron de la purigita silicia oblato.Uzu pinĉilojn por disvastigi la fotoreziston egale sur la oblaton.Foje metu la oblaton sur 65°C varman teleron por fari la fotoreziston malpli gluiĝema kaj pli facile disvastigi.Ne metu la oblaton rekte sur la varman teleron.
SU-8 estis egale distribuita sur la oblato per kurado de spina tegaĵo.Programu envenantan rotacion de la SU-8 dum 5–10 s por disvastigi je 500 rpm kun akcelo de 100 rpm/s. Agordu la ĉefan spinon por 200 µm dika ŝablono je 1,500 rpm, aŭ atingi la altecon de µm5 0 0 µm. yer de la intesto sur la peceto; vidu "Kritikajn paŝojn" malsupre) metita ĉe akcelo de 300 rpm/s 30 sekundoj je 1,200 rpm.
La ĉefa spinrapideco povas esti ĝustigita laŭ la cela dikeco de la SU-8-ŝablono sur la silicioblato.
Por fabriki SU-8-padronojn de 500 µm alteco por la supra tavolo de la intesto sur la blato, la spina tegaĵo kaj molaj bakpaŝoj de ĉi tiu Sketo (ŝtupoj 7 kaj 8) estis sinsekve ripetitaj (vidu paŝon 9) por produkti du tavolojn de 250 µm dika tavolo de SU-8, kiu povas esti tavoligita de UV500-skatolo, kunigita per tavolo de UV50012 en alta skatolo. .
Mole baku la SU-8 tegitajn oblatojn zorge metante la oblatojn sur varman teleron je 65 °C dum 5 minutoj, poste ŝanĝu la agordon al 95 °C kaj kovu dum pliaj 40 minutoj.
Por atingi 500 μm altecon de la SU-8-ŝablono en la supra mikrokanalo, ripetu paŝojn 7 kaj 8 por generi du 250 μm dikaj SU-8-tavoloj.
Uzante la UV Mask Aligner, faru lampteston laŭ la instrukcioj de la fabrikanto por kalkuli la ekspontempon de la oblato. (ekspontempo, ms) = (ekspondozo, mJ/cm2)/(lampo potenco, mW/cm2).
Post determini la malkovran tempon, metu la fotomaskon sur la maskotenilon de la UV-masko vicigilo kaj metu la fotomaskon sur la SU-8 kovrita oblato.
Metu la presitan surfacon de la fotomasko rekte sur la SU-8 kovritan flankon de la silicia oblato por minimumigi UV-disperson.
Eksponu la SU-8 kovritan oblaton kaj fotomaskon vertikale al 260 mJ/cm2 de UV-lumo por la antaŭdeterminita ekspontempo (vidu paŝon 10 de ĉi tiu skatolo).
Post UV-eksponiĝo, SU-8-tegitaj siliciaj oblatoj estis bakitaj je 65 °C dum 5 minutoj kaj 95 °C dum 15 minutoj sur ĉiu varma telero por fabriki ŝablonojn kun alteco de 200 μm. Plilongigi la post-bakadon je 95 °C ĝis 30 min por fabriki ŝablonojn kun alteco de 500 μm.
La programisto estas enverŝita en vitran pladon, kaj la bakita ondeto estas metita en la pladon. La volumo de SU-8-programisto povas varii depende de la grandeco de la vitra plato. Faru certe uzi sufiĉe da SU-8-programisto por tute forigi neeksponitajn SU-8. por ekzemple, kiam vi havas 150 mm-diametro-diametro kun 1 L-molulo.
Rinse la evoluinta ŝimo kun ~10 mL da freŝa ellaboranto sekvita de IPA ŝprucante la solvon per pipeto.
Metu la oblaton en plasmopurigilon kaj eksponu al oksigena plasmo (atmosfera gaso, cela premo 1 × 10−5 Torr, potenco 125 W) dum 1,5 min.
Metu la oblaton en vakuan elsekigilon kun vitra glito ene.Oblatoj kaj glitbildoj povas esti metitaj unu apud la alia.Se la vakua elsekigilo estas dividita en plurajn tavolojn per telero, metu la glitojn en la malsupran ĉambron kaj la oblatojn en la supran ĉambron.Faligi 100 μL da trikloro(1H-2H2H, 1H2H, 1H2H, 12H, 12H, 12H, 12H, 12.2H, 15.12. kaj apliki vakuon por silanigo.
Degelu fiolon da frostigitaj Caco-2-ĉeloj en akvobanon de 37°C, poste transdonu la degelitajn ĉelojn al T75-flako enhavanta 15 mL da 37°C antaŭvarmigita Caco-2-medio.
Por pasi Caco-2-ĉelojn ĉe ~90% kunfluejo, unue varmigu Caco-2-medion, PBS, kaj 0.25% tripsinon/1 mM EDTA en 37 °C akvobanon.
Aspiru la medion per vakua aspiro. Lavu ĉelojn dufoje kun 5 mL da varma PBS per ripetado de vakua aspiro kaj aldonante freŝan PBS.