Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecan reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Homa intesta morfogenezo establas kripto-vilajn trajtojn de 3D epitelia mikroarkitekturo kaj spaca organizado. Ĉi tiu unika strukturo estas necesa por konservi intestan homeostazon protektante la stamĉelan niĉon en la baza kripto de eksogenaj mikrobaj antigenoj kaj iliaj metabolitoj. Krome, intestaj viloj kaj sekrecianta muko prezentas funkcie diferencigitajn epiteliajn ĉelojn kun protekta bariero sur la intesta mukoza surfaco. Tial, rekrei 3D epiteliajn strukturojn estas decida por la konstruado de en vitraj intestaj modeloj. Rimarkinde, la organika mimetika intesto-sur-ĉipo povas indukti spontanean 3D morfogenezon de la intesta epitelio kun plibonigitaj fiziologiaj funkcioj kaj biomekaniko. Ĉi tie, ni provizas reprodukteblan protokolon por fortike indukti intestan morfogenezon en la intesto sur mikrofluida ĉipo same kiel en Transwell-enigita hibrida ĉipo. Ni priskribas detalajn metodojn por aparatfabrikado, kultivado de Caco-2 aŭ intestaj organoidaj epiteliaj ĉeloj en konvenciaj kontekstoj same kiel sur mikrofluida platformo, indukto de 3D morfogenezo kaj karakterizado de establitaj 3D epitelioj. uzante plurajn bildigajn modalecojn. Ĉi tiu protokolo atingas regeneradon de funkcia intesta mikroarkitekturo per kontrolado de bazolaterala fluida fluo dum 5 tagoj. Nia in vitro morfogeneza metodo uzas fiziologie signifan ŝerstreĉon kaj mekanikan moviĝon kaj ne postulas kompleksan ĉelan inĝenieradon aŭ manipuladon, kio povus superi aliajn ekzistantajn teknikojn. Ni antaŭvidas, ke nia proponita protokolo povus havi larĝajn implicojn por la biomedicina esplora komunumo, provizante metodon por regeneri 3D intestajn epiteliajn tavolojn in vitro por biomedicinaj, klinikaj kaj farmaciaj aplikoj.
Eksperimentoj montras, ke intestaj epiteliaj Caco-2-ĉeloj kultivitaj en intesto-sur-ĉipo1,2,3,4,5 aŭ dutavolaj mikrofluidaj aparatoj6,7 povas sperti spontanean 3D-morfogenezon in vitro sen klara kompreno pri la subesta mekanismo. En nia lastatempa studo, ni trovis, ke forigo de bazolaterale sekreciitaj morfogenaj antagonistoj el kulturaparatoj estas necesa kaj sufiĉa por indukti 3D-epitelian morfogenezon in vitro, kio estis montrita per Caco-2 kaj paciento-derivitaj intestaj organoidoj. Epiteliaj ĉeloj estis validigitaj. En ĉi tiu studo, ni specife fokusiĝis al la ĉelproduktado kaj koncentriĝa distribuo de potenca Wnt-antagonisto, Dickkopf-1 (DKK-1), en intesto-sur-ĉipo kaj modifitaj mikrofluidaj aparatoj enhavantaj Transwell-enigaĵojn, nomataj "Hibrida Ĉipo". Ni montras, ke aldono de eksogenaj Wnt-antagonistoj (kiel DKK-1, Wnt-represoro 1, sekreciita krispigita rilata proteino 1, aŭ Soggy-1) al la sur-ĉipa intesto inhibas morfogenezon aŭ interrompas la antaŭstrukturitan 3D epitelian tavolon, sugestante, ke antagonisma streso dum kulturo respondecas pri intesta morfogenezo in vitro. Tial, praktika aliro por atingi fortikan morfogenezon ĉe la epitelia interfaco estas forigi aŭ minimume konservi la nivelojn de Wnt-antagonistoj en la bazolaterala kupeo per aktiva flulavado (ekz., en intesto-sur-ĉipo aŭ hibrida-sur-ĉipo platformoj) aŭ difuzo. Bazolateralaj medioj (ekz., de Transwell-enigaĵoj en grandajn bazolateralajn rezervujojn en putoj).
En ĉi tiu protokolo, ni provizas detalan metodon por fabriki intesto-sur-ĉipajn mikroaparatojn kaj Transwell-enmeteblajn hibridajn ĉipojn (paŝoj 1-5) por kultivi intestajn epiteliajn ĉelojn sur polidimetilsiloksano (PDMS)-bazitaj poraj membranoj (paŝoj 6A, 7A, 8, 9) aŭ poliesteraj membranoj de Transwell-enmetaĵoj (paŝoj 6B, 7B, 8, 9) kaj indukti 3D-morfogenezon in vitro (paŝo 10). Ni ankaŭ identigis ĉelajn kaj molekulajn trajtojn indikantajn histo-specifan histogenezon kaj stirpo-dependan ĉelan diferenciĝon aplikante plurajn bildigajn modalecojn (paŝoj 11-24). Ni induktas morfogenezon uzante homajn intestajn epiteliajn ĉelojn, kiel ekzemple Caco-2 aŭ intestaj organoidoj, en du kulturformatoj kun teknikaj detaloj inkluzive de surfaca modifo de poraj membranoj, kreado de 2D-unutavolaĵoj, kaj intesta biokemiaĵo kaj reproduktado de la biomekanika mikromedio in vitro. Por indukti 3D-morfogenezon el 2D-epiteliaj unutavolaĵoj, ni forigis morfogenajn antagonistojn en ambaŭ kultivitaj... formiĝas per fluigo de la medio en la bazolateralan kupeon de la kulturo. Fine, ni provizas reprezentaĵon de la utileco de regenerebla 3D epitelia tavolo, kiu povas esti uzata por modeli morfogen-dependan epitelian kreskon, longitudajn gastiganto-mikrobiomajn kunkulturojn, patogenan infekton, inflaman vundon, epitelian barilmisfunkcion kaj probiotikajn terapiojn. Ekzemplo.influoj.
Nia protokolo povas esti utila al vasta gamo da sciencistoj en baza (ekz., intesta mukoza biologio, stamĉela biologio, kaj disvolviĝa biologio) kaj aplikata esplorado (ekz., antaŭklinika drogtestado, malsanmodelado, hista inĝenierarto, kaj gastroenterologio) kun larĝa efiko. Pro la reproduktebleco kaj fortikeco de nia protokolo por indukti 3D-morfogenezon de la intesta epitelio in vitro, ni antaŭvidas, ke nia teknika strategio povas esti disvastigita al publiko studanta la dinamikon de ĉela signalado dum intesta disvolviĝo, regenerado aŭ homeostazo. Krome, nia protokolo estas utila por pridemandi infekton sub diversaj infektaj agentoj kiel Noroviruso 8, Severa Akuta Spira Sindromo Koronaviruso 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 aŭ Vibrio cholerae. Aŭdantaroj pri malsanpatologio kaj patogenezo ankaŭ estas utilaj. La uzo de surĉipa intesta mikrofiziologia sistemo povas permesi longitudan kun-kultivadon 10 kaj postan taksadon de gastiga defendo, imunreagoj kaj patogen-rilata vundoriparo en la gastrointesta (GI) vojo 11. Aliaj gastrointestaj malsanoj asociitaj kun lika intesta sindromo, celiakio, Crohn-malsano, ulceriga kolito, poukito aŭ agaciĝema intesta sindromo povas esti simulitaj kiam 3D intestaj epiteliaj tavoloj estas preparitaj uzante la 3D intestajn epiteliajn tavolojn de la paciento, ĉi tiuj malsanoj inkluzivas vilosatrofion, kriptan mallongigon, mukozan difekton aŭ difektitan epitelian baron. Biopsio aŭ stamĉel-derivitaj intestaj organoidoj 12,13. Por pli bone modeli la pli altan kompleksecon de la malsana medio, legantoj povas konsideri aldoni malsan-rilatajn ĉeltipojn, kiel ekzemple pacientaj periferiaj sangaj mononukleaj ĉeloj (PBMC-oj), al modeloj enhavantaj 3D intestajn viluso-kriptajn mikroarkitekturojn. histo-specifaj imunĉeloj, 5.
Ĉar 3D epitelia mikrostrukturo povas esti fiksita kaj bildigita sen la sekcia procezo, spektantoj laborantaj pri spaca transkriptomiko kaj alt-rezolucia aŭ super-rezolucia bildigo eble interesiĝos pri nia mapado de la spactempa dinamiko de genoj kaj proteinoj sur epiteliaj niĉoj. Interesiĝas pri teknologio. Respondo al mikrobaj aŭ imunaj stimuloj. Krome, longitudala gastiganto-mikrobioma krucparolado 10, 14, kiu kunordigas intestan homeostazon, povas esti establita en la 3D intesta mukoza tavolo per kunkultivado de diversaj mikrobaj specioj, mikrobaj komunumoj aŭ feka mikrobioto, precipe en la intesto-sur-ĉipo. en la platformo. Ĉi tiu aliro estas precipe alloga por publiko studanta mukozan imunologion, gastroenterologion, homan mikrobiomon, kulturomikecon kaj klinikan mikrobiologion, kiu celas kultivi antaŭe nekulturitan intestan mikrobioton en la laboratorio. Se nia in vitro morfogeneza protokolo povas esti adaptita al skaleblaj kulturformatoj, kiel ekzemple plurputaj enigaĵoj en 24, 96 aŭ 384 putaj platoj, kiuj kontinue replenigas bazolateralajn kupeojn, la protokolo ankaŭ povas esti disvastigita al tiuj, kiuj disvolvas farmaciajn, biomedicinajn aŭ alt-trairajn rastrumajn aŭ validigajn platformojn por la nutraĵa industrio. Kiel pruvo de principo, ni ĵus montris la fareblecon de plurflanka alt-traira morfogeneza sistemo skalebla al 24-puta plata formato. Krome, pluraj organo-sur-ĉipaj produktoj estis komercigitaj16,17,18. Tial, la validigo de nia in vitro morfogeneza metodo povas esti akcelita kaj eble adoptita de multaj esplorlaboratorioj, industrio aŭ registaraj kaj reguligaj agentejoj por kompreni ĉelan reprogramadon de in vitro intesta morfogenezo je la transkriptoma nivelo por testi drogojn aŭ bioterapiaĵoj La sorbado kaj transporto de medikamentokandidatoj estis taksitaj uzante 3D intestajn surogatojn aŭ uzante kutimajn aŭ komercajn organo-sur-ĉipajn modelojn por taksi la reprodukteblecon de la intesta morfogeneza procezo.
Limigita nombro da hom-rilataj eksperimentaj modeloj estis uzata por studi intestan epitelian morfogenezon, ĉefe pro la manko de efektivigeblaj protokoloj por indukti 3D-morfogenezon in vitro. Fakte, multe de la nuna scio pri intesta morfogenezo baziĝas sur bestaj studoj (ekz., zebrofiŝo20, musoj21 aŭ kokoj22). Tamen, ili estas labor- kaj kosto-intensaj, povas esti etike pridubindaj, kaj plej grave, ne precize determinas homajn disvolviĝajn procezojn. Ĉi tiuj modeloj ankaŭ estas tre limigitaj en sia kapablo esti testitaj laŭ plurvoje skalebla maniero. Tial, nia protokolo por regeneri 3D-histajn strukturojn in vitro superas in vivajn bestajn modelojn same kiel aliajn tradiciajn statikajn 2D-ĉelkulturmodelojn. Kiel antaŭe priskribite, la uzado de 3D-epiteliaj strukturoj permesis al ni ekzameni la spacan lokalizon de diferencigitaj ĉeloj en la kripto-villus-akso responde al diversaj mukozaj aŭ imunaj stimuloj. 3D-epiteliaj tavoloj povas provizi spacon por studi kiel mikrobaj ĉeloj konkurencas por formi spacajn niĉojn kaj ekologian evoluon responde al gastigantaj faktoroj (ekz., internaj kontraŭ eksteraj mukoza tavoloj, sekrecio...). de IgA kaj antimikrobaj peptidoj). Plue, 3D epitelia morfologio povas permesi al ni kompreni kiel la intesta mikrobioto strukturas siajn komunumojn kaj sinergie produktas mikrobajn metabolitojn (ekz., mallongĉenajn grasacidojn) kiuj formas ĉelan organizon kaj stamĉelajn niĉojn en la bazaj kriptoj. Ĉi tiuj trajtoj povas esti montritaj nur kiam 3D epiteliaj tavoloj estas establitaj in vitro.
Aldone al nia metodo por krei 3D intestajn epiteliajn strukturojn, ekzistas pluraj in vitro metodoj. Intesta organoida kulturo estas pintnivela hista inĝenierarta tekniko bazita sur la kultivado de intestaj stamĉeloj sub specifaj morfogenaj kondiĉoj23,24,25. Tamen, la uzo de 3D organoidaj modeloj por transportanalizo aŭ gastiganto-mikrobioma kunkulturoj ofte estas malfacila ĉar la intesta lumeno estas enfermita ene de la organoido kaj, tial, la enkonduko de lumenaj komponantoj kiel mikrobaj ĉeloj aŭ eksogenaj antigenoj estas limigita. Aliro al organoidaj lumenoj povas esti plibonigita uzante mikroinjektilon,26,27 sed ĉi tiu metodo estas invada kaj laborintensa kaj postulas specialigitan scion por plenumi. Krome, tradiciaj organoidaj kulturoj konservitaj en hidroĝelaj skafaldoj sub statikaj kondiĉoj ne precize reflektas aktivan in vivo biomekanikon.
Aliaj aliroj uzitaj de pluraj esplorgrupoj uzas antaŭstrukturitajn 3D-hidroĝelajn skafaldojn por imiti la intestan epitelian strukturon per kultivado de izolitaj homaj intestaj ĉeloj sur la ĝela surfaco. Fabriku hidroĝelajn skafaldojn uzante 3D-presitajn, mikro-muelitajn aŭ litografie fabrikitajn ŝimojn. Ĉi tiu metodo montras la mem-organizitan aranĝon de izolitaj epiteliaj ĉeloj in vitro kun fiziologie signifaj morfogenaj gradientoj, establante altan bildformatan epitelian strukturon kaj stromo-epitelian krucparoladon per inkludo de stromaj ĉeloj en la skafaldo. Tamen, la naturo de antaŭstrukturitaj skafaldoj povas malhelpi la montradon de la spontanea morfogenetika procezo mem. Ĉi tiuj modeloj ankaŭ ne provizas dinamikan luminalan aŭ interstican fluon, malhavante la fluidan ŝeran streĉon, kiun intestaj ĉeloj bezonas por sperti morfogenezon kaj akiri fiziologian funkcion. Alia lastatempa studo uzis hidroĝelajn skafaldojn en mikrofluida platformo kaj strukturizis intestajn epiteliajn strukturojn uzante laser-gratadajn teknikojn. Musaj intestaj organoidoj sekvas gratitajn ŝablonojn por formi intestajn tubajn strukturojn, kaj intralumina fluida fluo povas esti resumita uzante mikrofluidan modulon. Tamen, ĉi tiu modelo nek... montras spontaneajn morfogenetikajn procezojn nek inkluzivas mekanobiologiajn movojn de intestoj. 3D-presteknikoj de la sama grupo kapablis krei miniaturajn intesttubojn kun spontaneaj morfogenetikaj procezoj. Malgraŭ la kompleksa fabrikado de malsamaj intestsegmentoj ene de la tubo, al ĉi tiu modelo ankaŭ mankas luminala fluida fluo kaj mekanika deformado. Plie, la modelfunkciebleco povas esti limigita, precipe post kiam la biopresprocezo estas kompleta, perturbante eksperimentajn kondiĉojn aŭ ĉel-al-ĉelajn interagojn. Anstataŭe, nia proponita protokolo provizas spontanean intestan morfogenezon, fiziologie signifan ŝerstreĉon, biomekanikon kiu imitas intestan motilecon, alireblecon de sendependaj apeksaj kaj bazolateralaj kupeoj, kaj rekreon de kompleksaj biologiaj mikromedioj de moduleco. Tial, nia en vitro 3D-morfogeneza protokolo povas provizi komplementan aliron por superi la defiojn de ekzistantaj metodoj.
Nia protokolo tute fokusiĝas al 3D epitelia morfogenezo, kun nur epiteliaj ĉeloj en kulturo kaj neniuj aliaj specoj de ĉirkaŭaj ĉeloj kiel mezenkimaj ĉeloj, endotelaj ĉeloj kaj imunaj ĉeloj. Kiel antaŭe priskribite, la kerno de nia protokolo estas la indukto de epitelia morfogenezo per forigo de morfogenaj inhibitoroj sekreciitaj ĉe la bazolaterala flanko de la enkondukita medio. Dum la fortika modulareco de nia intesto-sur-ĉipo kaj hibrido-sur-ĉipo permesas al ni rekrei la ondiĝantan 3D epitelian tavolon, pliaj biologiaj kompleksecoj kiel epiteli-mezenkimaj interagoj33,34, eksterĉela matrico (ECM) deponado35 kaj, en nia modelo, kripto-villus-trajtoj, kiuj transdonas stamĉelajn niĉojn en bazaj kriptoj, restas plue konsiderotaj. Stromalaj ĉeloj (ekz., fibroblastoj) en la mezenkimo ludas ŝlosilan rolon en la produktado de ECM-proteinoj kaj reguligo de intesta morfogenezo en vivo35,37,38. La aldono de mezenkimaj ĉeloj al nia modelo plibonigis la morfogenezan procezon. kaj ĉelalligefikeco. La endotela tavolo (t.e., kapilaroj aŭ limfatikoj) ludas gravan rolon en reguligo de molekula transporto39 kaj imunĉela rekrutado40 en la intesta mikromedio. Krome, angiaj komponantoj, kiuj povas esti konektitaj inter histaj modeloj, estas antaŭkondiĉo kiam histaj modeloj estas desegnitaj por montri plurorganajn interagojn. Tial, endotelaj ĉeloj eble bezonos esti inkluditaj por modeli pli precizajn fiziologiajn trajtojn kun organnivela distingivo. Paciento-derivitaj imunĉeloj ankaŭ estas esencaj por montri denaskajn imunajn respondojn, antigenan prezentadon, denaskan adaptan imunan krucparoladon kaj histo-specifan imunecon en la kunteksto de imitado de intesta malsano.
La uzo de hibridaj ĉipoj estas pli simpla ol intesto-sur-ĉipo ĉar la aranĝo de la aparato estas pli simpla kaj la uzo de Transwell-enigaĵoj ebligas skaleblan kulturon de intesta epitelio. Tamen, komerce haveblaj Transwell-enigaĵoj kun poliesteraj membranoj ne estas elastaj kaj ne povas simuli peristaltismajn movojn. Krome, la apeksa kupeo de la Transwell-enigaĵo metita en la hibridan ĉipon restis senmova sen ŝerstreĉo sur la apeksa flanko. Klare, la statikaj ecoj en la apeksa kupeo malofte ebligas longdaŭran bakterian kunkultivadon en hibridaj ĉipoj. Dum ni povas fortike indukti 3D-morfogenezon en Transwell-enigaĵoj uzante hibridajn ĉipojn, la manko de fiziologie signifa biomekaniko kaj apeksa fluida fluo povas limigi la fareblecon de hibridaj ĉipplatformoj por eblaj aplikoj.
Plenskalaj rekonstruoj de la homa kripto-vilusa akso en intesto-sur-ĉipo kaj hibrido-sur-ĉipo kulturoj ankoraŭ ne estas plene establitaj. Ĉar morfogenezo komenciĝas de epitelia unutavolo, 3D mikroarkitekturoj ne nepre provizas morfologian similecon al kriptoj in vivo. Kvankam ni karakterizis la proliferantan ĉelpopulacion proksime de la baza kripta domajno en la mikroinĝenierita 3D epitelio, la kriptaj kaj vilusaj regionoj ne estis klare difinitaj. Kvankam pli altaj supraj kanaloj sur la ĉipo kondukas al pliigita alteco de la mikroinĝenierita epitelio, la maksimuma alteco ankoraŭ estas limigita al ~300-400 µm. La fakta profundo de homaj intestaj kriptoj en la maldika kaj dika intestoj estas ~135 µm kaj ~400 µm, respektive, kaj la alteco de la maldikaj intestaj viloj estas ~600 µm41.
El bildiga vidpunkto, surloka super-rezolucia bildigo de 3D mikroarkitekturoj povas esti limigita al la intesto sur ĉipo, ĉar la postulata labordistanco de la objektiva lenso ĝis la epitelia tavolo estas de la ordo de kelkaj milimetroj. Por superi ĉi tiun problemon, malproksima objektivo povas esti necesa. Krome, fari maldikajn sekciojn por bildiga specimenpreparado estas malfacila pro la alta elasteco de PDMS. Krome, ĉar la tavol-post-tavola mikrofabrikado de la intesto sur ĉipo implikas permanentan adheron inter ĉiu tavolo, estas ekstreme malfacile malfermi aŭ forigi la supran tavolon por ekzameni la surfacan strukturon de la epitelia tavolo. Ekzemple, per uzado de skana elektrona mikroskopo (SEM).
La hidrofobeco de PDMS estis limiganta faktoro en mikrofluidaĵ-bazitaj studoj traktantaj hidrofobajn malgrandajn molekulojn, ĉar PDMS povas nespecife adsorbi tiajn hidrofobajn molekulojn. Alternativoj al PDMS povas esti konsiderataj kun aliaj polimeraj materialoj. Alternative, surfaca modifo de PDMS (ekz., tegaĵo per lipofilaj materialoj 42 aŭ poli(etilena glikolo) 43) povas esti konsiderata por minimumigi adsorbadon de hidrofobaj molekuloj.
Fine, nia metodo ne estas bone karakterizita rilate al provizado de alt-traira ekzamena aŭ "unu-grandeco-taŭgas-por-ĉiujn" uzanto-amika eksperimenta platformo. La nuna protokolo postulas injektilpumpilon por ĉiu mikroaparato, kiu okupas spacon en CO2-inkubatoro kaj malhelpas grandskalajn eksperimentojn. Ĉi tiu limigo povas esti signife plibonigita per la skalebleco de novigaj kulturformatoj (ekz., 24-putaj, 96-putaj aŭ 384-putaj poraj enigaĵoj, kiuj permesas kontinuan replenigon kaj forigon de bazolateralaj medioj).
Por indukti 3D-morfogenezon de homa intesta epitelio in vitro, ni uzis mikrofluidan intestan aparaton enhavantan du paralelajn mikrokanalojn kaj elastan poran membranon inter ili por krei lumen-kapilaran interfacon. Ni ankaŭ montras la uzon de unu-kanala mikrofluida aparato (hibrida peceto), kiu provizas kontinuan bazolateralan fluon sub polarigitaj epiteliaj tavoloj kreskigitaj sur Transwell-enigaĵoj. En ambaŭ platformoj, morfogenezo de diversaj homaj intestaj epiteliaj ĉeloj povas esti montrita per aplikado de direkta manipulado de fluo por forigi morfogenajn antagonistojn el la bazolaterala kupeo. La tuta eksperimenta proceduro (Figuro 1) konsistas el kvin partoj: (i) mikrofabrikado de la intesta peceto aŭ Transwell-enigebla hibrida peceto (paŝoj 1-5; Skatolo 1), (ii) preparado de intestaj epiteliaj ĉeloj (Caco-2-ĉeloj) aŭ homaj intestaj organoidoj; skatoloj 2-5), (iii) kultivado de intestaj epiteliaj ĉeloj sur intestaj blatoj aŭ hibridaj blatoj (paŝoj 6-9), (iv) indukto de 3D morfogenezo in vitro (paŝo 10) kaj (v)) por karakterizi la 3D epitelian mikrostrukturon (paŝoj 11-24). Fine, taŭga kontrolgrupo (diskutita pli sube) estis kreita por validigi la efikecon de in vitro morfogenezo komparante epitelian morfogenezon kun spacaj, tempaj, kondiĉaj aŭ proceduraj kontroloj.
Ni uzis du malsamajn kulturplatformojn: intesto-sur-ĉipo kun rektaj kanaloj aŭ nelinearaj interplektitaj kanaloj, aŭ hibridaj ĉipoj enhavantaj Transwell (TW) enigaĵojn en mikrofluida aparato, fabrikitaj kiel priskribite en Kadro 1, kaj paŝoj 1-5. "Aparata Fabrikado" montras la ĉefajn paŝojn en fabrikado de unuopa ĉipo aŭ hibrida ĉipo. "Kulturo de Homaj Intestaj Epiteliaj Ĉeloj" klarigas la ĉelfonton (Caco-2 aŭ homaj intestaj organoidoj) kaj kulturproceduron uzatan en ĉi tiu protokolo. "In vitro morfogenezo" montras la ĝeneralajn paŝojn en kiuj Caco-2 aŭ organoid-derivitaj epiteliaj ĉeloj estas kultivataj sur intesta ĉipo aŭ sur Transwell-enigaĵoj de hibrida ĉipo, sekvataj de indukto de 3D morfogenezo kaj la formado de karakterizita epitelia strukturo. La programpaŝnumero aŭ kadranumero estas montrata sub ĉiu sago. La aplikaĵo provizas ekzemplojn pri kiel establitaj intestaj epiteliaj tavoloj povas esti uzataj, ekzemple, en ĉeldiferenciga karakterizado, studoj pri intesta fiziologio, establado de gastiganto-mikrobiomaj ekosistemoj kaj malsanmodelado. Imunofluoreskaj bildoj en "Ĉela..." "Diferenciĝo" montranta nukleojn, F-aktinon kaj MUC2 esprimitajn en la 3D Caco-2 epitelia tavolo generita sur la intesta ĉipo. MUC2-signalado ĉeestas en kalikaj ĉeloj kaj muko sekreciita de mukozaj surfacoj. Fluoreskaj bildoj en Gut Physiology montras mukon produktitan per tinkturado por sialacido kaj N-acetilglukozaminaj restaĵoj uzante fluoreskan tritikĝerman aglutininon. La du interkovrantaj bildoj en "Gastiganto-Mikrobaj Kunkulturoj" montras reprezentajn gastiganto-mikrobiomajn kunkulturojn en la intesto sur ĉipo. La maldekstra panelo montras la kunkulturon de E. coli esprimanta verdan fluoreskan proteinon (GFP) kun mikroinĝenieritaj 3D Caco-2 epiteliaj ĉeloj. La dekstra panelo montras la lokalizon de GFP E. coli kunkulturita kun 3D Caco-2 epiteliaj ĉeloj, sekvita de imunofluoreska tinkturado kun F-aktino (ruĝa) kaj nukleoj (blua). Malsanmodelado ilustras sanan kontraŭ likan inteston en intestaj inflamo-ĉipoj sub fiziologia defio kun bakteriaj antigenoj (ekz., lipopolisakarido, LPS) kaj imunĉeloj (ekz., PBMC; verda). Caco-2-ĉeloj estis kultivitaj por establi 3D epitelian tavolon. Skalbreto, 50 µm. Bildoj en la suba vico: "Diferencigo de ĉeloj" adaptita kun permeso de referenco. 2. Oxford University Press; Reproduktita kun permeso de Ref. 5. NAS; "Ko-kulturo inter gastiganto kaj mikrobo" adaptita kun permeso de ref. 3. NAS; "Modelado de malsanoj" adaptita kun permeso de referenco. 5. NAS.
Kaj intesto-sur-ĉipo kaj hibridaj ĉipoj estis fabrikitaj uzante PDMS-kopiojn, kiuj estis malmulditaj el siliciaj muldiloj per mola litografio1,44 kaj strukturizitaj per SU-8. La dezajno de la mikrokanaloj en ĉiu ĉipo estas determinita per konsidero de hidrodinamiko kiel ŝerstreĉo kaj hidrodinamika premo1,4,12. La originala intesto-sur-ĉipo dezajno (Etenditaj Datumoj Fig. 1a), kiu konsistis el du apudmetitaj paralelaj rektaj mikrokanaloj, evoluis al kompleksa intesto-sur-ĉipo (Etenditaj Datumoj Fig. 1b), kiu inkluzivas paron da kurbaj mikrokanaloj por indukti pliigitan fluidan restadtempon, nelinearajn flupadronojn kaj multaksan deformadon de kultivitaj ĉeloj (Fig. 2a-f)12. Kiam pli kompleksa intesta biomekaniko bezonas esti rekreita, kompleksaj intesto-sur-ĉipoj povas esti elektitaj. Ni montris, ke la interplektita Intesto-Ĉipo ankaŭ forte induktas 3D-morfogenezon en simila tempokadro kun simila grado de epitelia kresko kompare kun la originala... Intesto-Ĉipo, sendepende de la kultivita ĉeltipo. Tial, por indukti 3D-morfogenezon, liniaj kaj kompleksaj surĉipaj intesto-dezajnoj estas interŝanĝeblaj. PDMS-kopioj harditaj sur siliciaj muldiloj kun SU-8-ŝablonoj provizis negativajn trajtojn post malmuldado (Fig. 2a). Por fabriki la inteston sur ĉipo, la preparita supra PDMS-tavolo estis sinsekve ligita al pora PDMS-filmo kaj poste vicigita kun la malsupra PDMS-tavolo per nemaligebla ligado uzante koronan traktanton (Fig. 2b-f). Por fabriki hibridajn ĉipojn, harditaj PDMS-kopioj estis ligitaj al vitraj lameloj por krei unu-kanalajn mikrofluidajn aparatojn, kiuj povis akomodi Transwell-enigaĵojn (Fig. 2h kaj Plilongigitaj Datumoj Fig. 2). La ligprocezo estas efektivigita per traktado de la surfacoj de la PDMS-kopio kaj vitro per oksigena plasmo aŭ korona traktado. Post steriligo de la mikrofabrikita aparato fiksita al la silikona tubo, la aparataro estis preta por efektivigi 3D-morfogenezon de la intesta epitelio (Figuro 2g).
a, Skemo pri la preparado de PDMS-partoj el SU-8-strukturizitaj siliciaj muldiloj. La nekuracita PDMS-solvaĵo estis verŝita sur silician muldilon (maldekstre), kuraĉita je 60 °C (meze) kaj malmuldita (dekstre). La malmuldita PDMS estis tranĉita en pecojn kaj purigita por plia uzo. b, Foto de la silicia muldilo uzata por prepari la supran tavolon de PDMS. c, Foto de la silicia muldilo uzata por fabriki la poran membranon de PDMS. d, Serio de fotoj de la supraj kaj malsupraj PDMS-komponantoj kaj la kunmetita surĉipa intesta aparato. e, Skemo pri la vicigo de la supraj, membranaj kaj malsupraj PDMS-komponantoj. Ĉiu tavolo estas nerevokeble ligita per plasmo aŭ korona traktado. f, Skemo pri la fabrikita intesto-sur-ĉipa aparato kun supermetitaj interplektitaj mikrokanaloj kaj vakuaj ĉambroj. g, Aranĝo de intesto-sur-ĉipo por mikrofluida ĉelkultivado. La fabrikita intesto-sur-ĉipo kunmetita per silikona tubo kaj injektilo estis metita sur kovrovitron. La ica aparato estis metita sur la kovrilo de 150 mm Petri-plado por prilaborado. La ligilo estas uzata por fermi la silikonan tubon. h, Vidaj momentfotoj de hibrida ico-fabrikado kaj 3D-morfogenezo uzante hibridajn ĉipojn. Transwell-enigaĵoj preparitaj sendepende por kultivi 2D-unutavolaĵojn de intestaj epiteliaj ĉeloj estis enigitaj en la hibridan ĉipon por indukti intestan 3D-morfogenezon. La medio estas trafluita tra mikrokanaloj sub la ĉeltavolo establita sur la Transwell-enigaĵo. Skalbreto, 1 cm. h Represita kun permeso de referenco. 4. Elsevier.
En ĉi tiu protokolo, la ĉellinio Caco-2 kaj intestaj organoidoj estis uzataj kiel epiteliaj fontoj (Fig. 3a). Ambaŭ ĉeltipoj estis kultivitaj sendepende (Skatolo 2 kaj Skatolo 5) kaj uzitaj por semi la ECM-kovritajn mikrokanalojn de surĉipaj intesto- aŭ Transwell-enigaĵoj. Kiam ĉeloj estas konfluaj (>95% kovro en flakonoj), rutine kultivitaj Caco-2-ĉeloj (inter trairejoj 10 kaj 50) en T-flakonoj estas rikoltitaj por prepari disociitajn ĉelsuspendojn per tripsiniga fluido (skatolo 2). Homaj intestaj organoidoj de intestaj biopsioj aŭ kirurgiaj resekcoj estis kultivitaj en Matrigel-skafaldaj kupoloj en 24-putaj platoj por subteni la strukturan mikromedion. Medio enhavanta esencajn morfogenojn (kiel Wnt, R-spondino kaj Noggin) kaj kreskofaktorojn preparitajn kiel priskribite en Skatolo 3 estis suplementita ĉiun duan tagon ĝis la organoidoj kreskis ĝis ~500 µm en diametro. Plenkreskaj organoidoj estas rikoltitaj kaj disociitaj en unuopajn ĉelojn por semado sur... intesto aŭ Transwell-enigaĵoj sur ĉipo (Skatolo 5). Kiel ni antaŭe raportis, ĝi povas esti diferencigita laŭ malsantipo12,13 (ekz. ulceriga kolito, Crohn-malsano, kolorekta kancero aŭ normala donanto), lezoloko (ekz. lezo kontraŭ ne-lezita areo) kaj gastrointesta loko en la trakto (ekz. duodeno, jejuno, ileo, cekumo, dika intesto aŭ rekto). Ni provizas optimumigitan protokolon en Skatolo 5 por kultivi dikajn organoidojn (koloidojn), kiuj tipe postulas pli altajn koncentriĝojn de morfogenoj ol maldikaj intestaj organoidoj.
a, Laborfluo por la indukto de intesta morfogenezo en la intesta ico. Caco-2 homa intesta epitelio kaj intestaj organoidoj estas uzataj en ĉi tiu protokolo por demonstri 3D morfogenezon. La izolitaj epiteliaj ĉeloj estis semitaj en la preparita intesto-sur-ico aparato (ico-preparado). Post kiam la ĉeloj estas semitaj kaj alkroĉitaj al la PDMS-pora membrano en tago 0 (D0), apeksa (AP) fluo estas iniciatita kaj konservita dum la unuaj 2 tagoj (fluo, AP, D0-D2). Bazolaterala (BL) fluo ankaŭ estas iniciatita kune kun ciklaj streĉaj movoj (streĉo, fluo, AP kaj BL) kiam kompleta 2D monotavolo estas formita. Intesta 3D morfogenezo okazis spontanee post 5 tagoj da mikrofluida kulturo (morfogenezo, D5). Fazkontrastaj bildoj montras reprezentan morfologion de Caco-2 ĉeloj ĉe ĉiu eksperimenta paŝo aŭ tempopunkto (stanggrafikaĵo, 100 µm). Kvar skemaj diagramoj ilustrantaj la respondajn kaskadojn de intesta morfogenezo (supre dekstre). La streketitaj sagoj En la skemo reprezentas la direkton de fluida fluo.b, SEM-bildo montranta la surfacan topologion de la establita 3D Caco-2-epitelio (maldekstre).La enmetitaĵo elstariganta la pligrandigitan areon (blanka streketo) montras la regeneritajn mikrovilojn sur la 3D Caco-2-tavolo (dekstre).c, Horizontala fronta vido de establita Caco-2 3D, klaŭdino (ZO-1, ruĝa) kaj kontinuaj broslimaj membranoj etikeditaj per F-aktino (verda) kaj nukleoj (blua) Imunofluoreska konfokusa bildigo de epiteliaj ĉeloj sur intestaj ĉipoj.Sagoj montrantaj al la meza skemo indikas la lokon de la fokusa ebeno por ĉiu konfokusa vido.d, Tempodaŭro de morfologiaj ŝanĝoj en organoidoj kultivitaj sur ĉipo akirita per fazkontrasta mikroskopio en tagoj 3, 7, 9, 11 kaj 13.La enmetitaĵo (supre dekstre) montras la altan pligrandigon de la provizita bildo.e, DIC-mikrofoto de organoida 3D-epitelio establita en la intesto sur tranĉaĵo prenita en tago 7.f, Supermetita imunofluoreskaj bildoj montrantaj markilojn por stamĉeloj (LGR5; magenta), kalikĉeloj (MUC2; verda), F-aktino (griza) kaj nukleoj (ciankoloraj) kreskigitaj sur intestaj blatoj dum 3 tagoj, respektive (maldekstre) kaj 13-tagaj (meze) organoidoj sur la epitelia tavolo. Vidu ankaŭ Etenditajn Datumojn Figuron 3, kiu elstarigas LGR5-signaladon sen MUC2-signalado. Fluoreskaj bildoj montrantaj la epitelian mikrostrukturon (dekstre) de 3D-organoida epitelio establita en la intesto sur blato per tinkturado de la plasmomembrano per CellMask-tinkturo (dekstre) en la 13-a tago de la kulturo. Skalbreto estas 50 μm krom se alie deklarite. b Represita kun permeso de referenco. 2. Oxford University Press; c Adaptita kun permeso de Referenco. 2. Oxford University Press; e kaj f adaptitaj kun permeso de referenco. 12 Sub Krea Komunaĵo-Licenco CC BY 4.0.
En la intesto sur ĉipo, necesas modifi la hidrofoban surfacon de la PDMS-pora membrano por sukcesa ECM-tegaĵo. En ĉi tiu protokolo, ni aplikas du malsamajn metodojn por modifi la hidrofobecon de PDMS-membranoj. Por kultivi Caco-2-ĉelojn, surfaca aktivigo per UV/ozona traktado sole sufiĉis por redukti la hidrofobecon de la PDMS-surfaco, kovri la ECM-on kaj alkroĉi Caco-2-ĉelojn al la PDMS-membrano. Tamen, mikrofluida kulturo de organoida epitelio postulas kemi-bazitan surfacan funkciigon por atingi efikan deponadon de ECM-proteinoj per sinsekva aplikado de polietilenimino (PEI) kaj glutaraldehido al PDMS-mikrokanaloj. Post surfaca modifo, ECM-proteinoj estis deponitaj por kovri la funkciigitan PDMS-surfacon kaj poste enkondukitaj en la izolitan organoidan epitelion. Post kiam la ĉeloj estas alkroĉitaj, la mikrofluida ĉelkulturo komenciĝas per perfuzado de nur la medio en la supran mikrokanalon ĝis la ĉeloj formas kompletan monotavolon, dum la malsupra mikrokanalo konservas statikajn kondiĉojn. Ĉi tiu optimumigita metodo por surfaca aktivigo kaj ECM-tegaĵo ebligas la alkroĉon de organoidoj. epitelio por indukti 3D morfogenezon sur la PDMS-surfaco.
Transwell-kulturoj ankaŭ postulas ECM-tegaĵon antaŭ ĉelsemado; tamen, Transwell-kulturoj ne postulas kompleksajn antaŭtraktadajn paŝojn por aktivigi la surfacon de poraj enigaĵoj. Por kreskigi Caco-2-ĉelojn sur Transwell-enigaĵoj, ECM-tegaĵo sur poraj enigaĵoj akcelas la alkroĉiĝon de disigitaj Caco-2-ĉeloj (<1 horo) kaj la formadon de malloza krucvoja bariero (<1-2 tagoj). Por kultivi organoidojn sur Transwell-enigaĵoj, izolitaj organoidoj estas semitaj sur ECM-kovritaj enigaĵoj, alkroĉitaj al la membransurfaco (<3 h) kaj konservitaj ĝis la organoidoj formas kompletan unutavolon kun bariera integreco. Transwell-kulturoj estas faritaj en 24-putaj platoj sen la uzo de hibridaj ĉipoj.
En vitro 3D morfogenezo povas esti iniciatita per aplikado de fluida fluo al la bazolaterala aspekto de establita epitelia tavolo. En la intesto sur ĉipo, epitelia morfogenezo komenciĝis kiam la medio estis perfuzita en la suprajn kaj malsuprajn mikrokanalojn (Fig. 3a). Kiel antaŭe priskribite, estas grave enkonduki fluidan fluon en la malsupran (bazolateralan) kompartmenton por kontinua forigo de direktaj sekreciitaj morfogenaj inhibitoroj. Por provizi sufiĉajn nutraĵojn kaj serumon al ĉeloj ligitaj sur poraj membranoj kaj generi luminalan ŝeran streĉon, ni tipe aplikas duoblan fluon en la intesto sur ĉipo. En hibridaj ĉipoj, Transwell-enigaĵoj enhavantaj epiteliajn unutavolaĵojn estis enigitaj en la hibridajn ĉipojn. Poste, la medio estis aplikita sub la bazolateralan flankon de la pora Transwell-enigaĵo tra la mikrokanalo. Intesta morfogenezo okazis 3-5 tagojn post la komenco de bazolaterala fluo en ambaŭ kulturplatformoj.
La morfologiaj trajtoj de mikroinĝenieritaj 3D epiteliaj tavoloj povas esti analizitaj per apliko de diversaj bildigaj modalecoj, inkluzive de fazkontrasta mikroskopio, diferenciga interferkontrasta (DIC) mikroskopio, SEM, aŭ imunofluoreska konfokusa mikroskopio (Figuroj 3 kaj 4). Fazkontrasta aŭ DIC-bildigo povas esti facile efektivigita iam ajn dum kulturo por monitori la formon kaj protrudiĝon de 3D epiteliaj tavoloj. Pro la optika travidebleco de PDMS kaj poliesteraj filmoj, kaj la intesto-sur-ĉipo kaj hibridaj ĉipo-platformoj povas provizi realtempan en situn bildigon sen la bezono de sekcado aŭ malmuntado de la aparato. Dum plenumado de imunofluoreska bildigo (Figuroj 1, 3c, f kaj 4b, c), ĉeloj estas tipe fiksitaj per 4% (pez/vol) paraformaldehido (PFA), sekvata de Triton X-100 kaj 2% (pez/vol) bova seruma albumino (BSA), laŭorde. Depende de la ĉeltipo, malsamaj fiksativoj, permeabiliziloj kaj blokaj agentoj povas esti uzataj. Primaraj Antikorpoj celantaj stirpo-dependajn ĉelajn aŭ regionajn markilojn estas uzataj por reliefigi ĉelojn senmovigitajn surloke sur la ĉipo, sekvataj de sekundaraj antikorpoj kune kun kontraŭmakula tinkturfarbo celanta aŭ nukleon (ekz., 4′,6-diamidino-2-fenileno) indolo, DAPI) aŭ F-aktinon (ekz., fluoreske markita faloidino). Fluoresk-bazita viva bildigo ankaŭ povas esti farita surloke por detekti mukproduktadon (Fig. 1, "Ĉela diferenciĝo" kaj "Intesta fiziologio"), hazardan koloniigon de mikrobaj ĉeloj (Fig. 1, "Gastiganto-mikroba kunkulturo"), la rekrutadon de imunĉeloj (Fig. 1, 'Malsana Modelado') aŭ la konturojn de 3D epitelia morfologio (Fig. 3c,f kaj 4b,c). Kiam oni modifas la inteston sur la ĉipo por apartigi la supran tavolon de la malsupra mikrokanala tavolo, kiel priskribite en ref. Kiel montrite en Fig. 2, la 3D epitelia morfologio same kiel la mikroviloj sur la apeksa broslimo povas esti bildigitaj per SEM (Fig. 3b). La esprimo de diferencigaj markiloj povas esti taksita per kvanta PCR5 aŭ unuĉela RNA-sekvencado. En ĉi tiu kazo, 3D-tavoloj de epiteliaj ĉeloj kreskigitaj en intestaj blatoj aŭ hibridaj blatoj estas rikoltitaj per tripsinigo kaj poste uzataj por molekula aŭ genetika analizo.
a, Laborfluo por la indukto de intesta morfogenezo en hibrida ĉipo. Caco-2 kaj intestaj organoidoj estas uzataj en ĉi tiu protokolo por demonstri 3D-morfogenezon en hibrida ĉipa platformo. Disigitaj epiteliaj ĉeloj estis semitaj en preparitaj Transwell-enigaĵoj (TW-preparo; vidu figuron sube). Post kiam la ĉeloj estis semitaj (semitaj) kaj alkroĉitaj al poliesteraj membranoj en Transwell-enigaĵoj, ĉiuj ĉeloj estis kultivitaj sub statikaj kondiĉoj (TW-kulturo). Post 7 tagoj, ununura Transwell-enigaĵo enhavanta 2D-unutavolon de epiteliaj ĉeloj estis integrita en hibridan ĉipon por enkonduki bazolateralan fluon (Fluo, BL), kiu finfine kondukis al la generado de 3D-epitelia tavolo (morfogenezo). Fazkontrastaj mikrografoj montrantaj morfologiajn trajtojn de homaj organaj epiteliaj ĉeloj derivitaj de normala donaca (C103-linio) ascendanta kolono ĉe ĉiu eksperimenta paŝo aŭ tempopunkto. La skemoj en la supraj tavoloj ilustras la eksperimentan konfiguracion por ĉiu paŝo. b, Hibridaj ĉipoj (maldekstra skemo) povas konduki al 3D-morfogenezo de organoidaj epiteliaj ĉeloj per desupraj konfokusaj mikroskopiaj vidoj. prenitaj ĉe malsamaj Z-pozicioj (supra, meza kaj malsupra; vidu dekstran skemon kaj respondajn punktitajn liniojn). montris evidentajn morfologiajn karakterizaĵojn. F-aktino (ciankolora), nukleo (griza). c, Fluoreskaj konfokusaj mikrografoj (3D anglita vido) de organoid-derivitaj epiteliĉeloj kultivitaj en statika Transwell (TW; enmetita en blanka streketo) kontraŭ hibrida ĉipo (plej granda plena vido) komparante 2D kontraŭ 3D morfologion, respektive. Paro de 2D vertikalaj kructranĉaj vidoj (enmetita en la supra dekstra angulo; "XZ") ankaŭ montras 2D kaj 3D trajtojn. Skalbreto, 100 µm. c Represita kun permeso de referenco. 4. Elsevier.
Kontroloj povas esti preparitaj per kultivado de la samaj ĉeloj (Caco-2 aŭ intestaj organoidaj epiteliĉeloj) en dudimensiajn unutavolaĵojn sub konvenciaj senmovaj kulturkondiĉoj. Rimarkinde, nutraĵa malplenigo povas rezulti pro la limigita volumena kapacito de la mikrokanaloj (t.e. ~4 µL en la supra kanalo sur la originala intest-ĉipa dezajno). Tial, epitelia morfologio antaŭ kaj post apliko de bazolaterala fluo ankaŭ povas esti komparita.
La mola litografia procezo devus esti plenumata en pura ĉambro. Por ĉiu tavolo sur la ĉipo (supraj kaj malsupraj tavoloj kaj membranoj) kaj hibridaj ĉipoj, malsamaj fotomaskoj estis uzitaj kaj fabrikitaj sur apartaj siliciaj obletoj ĉar la altoj de la mikrokanaloj estis malsamaj. La celaj altoj de la supraj kaj malsupraj mikrokanaloj de la intesto sur la ĉipo estas 500 µm kaj 200 µm, respektive. La kanala cela alto de la hibrida ĉipo estas 200 µm.
Metu 3-colan silician oblato en pladon kun acetono. Milde kirlu la platon dum 30 sekundoj, poste aersekigu la oblato. Translokigu la oblato al plato kun IPA, poste turnu la platon dum 30 sekundoj por purigi.
Piranja solvaĵo (miksaĵo de hidrogena peroksido kaj koncentrita sulfata acido, 1:3 (vol/vol)) laŭvole povas esti uzata por maksimumigi la forigon de organikaj restaĵoj de la silicia platsurfaco.
Piranja solvaĵo estas ekstreme koroda kaj generas varmon. Pliaj sekurecaj antaŭzorgoj estas necesaj. Por rubforigo, lasu la solvaĵon malvarmiĝi kaj translokigu ĝin al pura, seka rubujo. Uzu duarangajn ujojn kaj konvene etikedu la rubujojn. Bonvolu sekvi la sekurecajn gvidliniojn de la instalaĵo por pli detalaj proceduroj.
Senakvigu la oblatojn metante ilin sur varmplaton je 200 °C dum 10 minutoj. Post senakvigo, la oblato estis skuita kvin fojojn en aero por malvarmiĝi.
Verŝu ~10 g da fotorezistaĵo SU-8 2100 sur la centron de la purigita silicia oblato. Uzu pinĉilon por disvastigi la fotorezistaĵon egale sur la oblato. Foje metu la oblato sur 65°C varman platon por igi la fotorezistaĵon malpli glueca kaj pli facile disvastigebla. Ne metu la oblato rekte sur la varman platon.
SU-8 estis egale distribuita sur la blato per rotacia tegaĵo. Programu alvenantan rotacion de la SU-8 dum 5-10 sekundoj por disvastiĝi je 500 rpm kun akcelo de 100 rpm/s. Agordu la ĉefan spinon por 200 µm dikeco-strukturizado je 1,500 rpm, aŭ atingu 250 µm dikecon (farante 500 µm altecon por la supra tavolo de la intesto sur la blato; vidu "Kritikaj paŝoj" sube) agordite je akcelo de 300 rpm/s 30 sekundoj je 1,200 rpm.
La ĉefa rotacia rapido povas esti adaptita laŭ la cela dikeco de la SU-8-padrono sur la silicia oblato.
Por fabriki SU-8-padronojn kun alteco de 500 µm por la supra tavolo de la intesto sur la ĉipo, la paŝoj de rotacia tegaĵo kaj mola bakado de ĉi tiu skatolo (paŝoj 7 kaj 8) estis sinsekve ripetitaj (vidu paŝon 9) por produkti du tavolojn de 250 µm dika tavolo de SU-8, kiu povas esti tavoligita kaj kunigita per UV-eksponado en paŝo 12 de ĉi tiu skatolo, kreante tavolon 500 µm altan.
Mola baku la SU-8-kovritajn oblatojn zorge metante la oblatojn sur varmplaton je 65 °C dum 5 minutoj, poste ŝanĝu la agordon al 95 °C kaj kovu dum pliaj 40 minutoj.
Por atingi 500 μm altecon de la SU-8-padrono en la supra mikrokanalo, ripetu paŝojn 7 kaj 8 por generi du 250 μm dikajn SU-8-tavolojn.
Uzante la UV-Maskan Aligner, faru lampoteston laŭ la instrukcioj de la fabrikanto por kalkuli la ekspontempon de la sigelo. (ekspona tempo, ms) = (ekspona dozo, mJ/cm²)/(lampopovumo, mW/cm²).
Post determinado de la ekspontempo, metu la fotomaskon sur la maskotenilon de la UV-maskovicigilo kaj metu la fotomaskon sur la SU-8-tegitan obleon.
Metu la presitan surfacon de la fotomasko rekte sur la SU-8-kovritan flankon de la silicia oblato por minimumigi UV-disperson.
Vertikale eksponu la SU-8-kovritan obleon kaj fotomaskon al 260 mJ/cm² da UV-lumo dum la antaŭdestinita ekspontempo (vidu paŝon 10 de ĉi tiu kadro).
Post UV-eksponiĝo, SU-8-kovritaj siliciaj obletoj estis bakitaj je 65 °C dum 5 minutoj kaj 95 °C dum 15 minutoj sur ĉiu varmplato por fabriki ŝablonojn kun alteco de 200 µm. Plilongigu la post-baktempon je 95 °C ĝis 30 minutoj por fabriki ŝablonojn kun alteco de 500 µm.
La elvolvilo estas verŝita en vitran pladon, kaj la bakita oblato estas metita en la pladon. La volumeno de SU-8 elvolvilo povas varii depende de la grandeco de la vitra plato. Certigu uzi sufiĉe da SU-8 elvolvilo por tute forigi neeksponitan SU-8. Ekzemple, kiam vi uzas vitran pladon kun diametro de 150 mm kaj kapacito de 1 L, uzu ~300 mL da SU-8 elvolvilo. Elvolvu la muldilon dum 25 minutoj kun foja milda rotacio.
Lavu la evoluintan muldilon per ~10 mL da freŝa ellaboranto sekvata de IPA ŝprucante la solvaĵon per pipeto.
Metu la obleon en plasmopurigilon kaj eksponu ĝin al oksigena plasmo (atmosfera gaso, cela premo 1 × 10⁻⁵ Torr, povumo 125 W) dum 1,5 minutoj.
Metu la oblato en vakuan sekigilon kun vitrolameno interne. Oblato kaj lamenoj povas esti metitaj flank-al-flanke. Se la vakua sekigilo estas dividita en plurajn tavolojn per plato, metu la lamenojn en la malsupran ĉambron kaj la oblatojn en la supran ĉambron. Gutigu 100 μL da trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silana solvaĵo sur vitrolamenon kaj apliku vakuon por silanigo.
Degelu fioleton da frostaj Caco-2-ĉeloj en 37°C akvobano, poste transdonu la degelintajn ĉelojn al T75-flakono enhavanta 15 mL da 37°C antaŭvarmigita Caco-2-medio.
Por trapasi Caco-2-ĉelojn je ~90% konflueco, unue varmigu Caco-2-medion, PBS, kaj 0.25% tripsinon/1 mM EDTA en 37°C akvobano.
Aspiru la medion per vakua aspiro. Lavu la ĉelojn dufoje per 5 mL da varma PBS ripetante vakuan aspiron kaj aldonante freŝan PBS.