Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
La evoluo de mikrobaj parazitoj implikas kontraŭagadon inter natura selektado, kiu igas parazitojn pliboniĝi, kaj genetika drivo, kiu igas parazitojn perdi genojn kaj akumuli malutilajn mutaciojn.Ĉi tie, por kompreni kiel tiu kontraŭago okazas sur la skalo de ununura makromolekulo, ni priskribas la krio-EM-strukturon de la ribosomo de Encephalitozoon cuniculi, eŭkariota organismo kun unu el la plej malgrandaj genaroj en naturo.La ekstrema redukto de rRNA en E. cuniculi ribosomoj estas akompanita per senprecedencaj strukturaj ŝanĝoj, kiel ekzemple la evoluo de antaŭe nekonataj kunfanditaj rRNA-ligiloj kaj rRNA sen tuberoj.Krome, la E. cuniculi ribosomo postvivis la perdon de rRNA-fragmentoj kaj proteinoj evoluigante la kapablon utiligi malgrandajn molekulojn kiel strukturajn imitantojn de degraditaj rRNA-fragmentoj kaj proteinoj.Ĝenerale, ni montras, ke molekulaj strukturoj longe opiniitaj kiel reduktitaj, degeneritaj kaj submetitaj al malfortigaj mutacioj havas kelkajn kompensajn mekanismojn, kiuj tenas ilin aktivaj malgraŭ ekstremaj molekulaj kuntiriĝoj.
Ĉar la plej multaj grupoj de mikrobaj parazitoj havas unikajn molekulajn ilojn por ekspluati siajn gastigantojn, ni ofte devas evoluigi malsamajn terapiojn por malsamaj grupoj de parazitoj1,2.Tamen, nova indico indikas ke kelkaj aspektoj de parazita evoluo estas konverĝaj kaj plejparte antaŭvideblaj, indikante eblan bazon por larĝaj terapiaj intervenoj en mikrobaj parazitoj3,4,5,6,7,8,9.
Antaŭa laboro identigis oftan evoluan tendencon en mikrobaj parazitoj nomitaj genarredukto aŭ genarmalboniĝo10,11,12,13.Nuna esplorado montras, ke kiam mikroorganismoj rezignas sian libervivan vivstilon kaj fariĝas intraĉelaj parazitoj (aŭ endosimbiontoj), iliaj genaroj spertas malrapidajn sed mirindajn metamorfozojn dum milionoj da jaroj9,11.En procezo konata kiel genoma kadukiĝo, mikrobaj parazitoj akumulas malutilajn mutaciojn kiuj igas multajn antaŭe gravajn genojn pseŭdogenojn, kondukante al laŭpaŝa genperdo kaj mutacia kolapso14,15.Tiu kolapso povas detrui ĝis 95% de la genoj en la plej malnovaj intraĉelaj organismoj kompare kun proksime rilataj libervivaj specioj.Tiel, la evoluo de intraĉelaj parazitoj estas ŝnurŝnuro inter du kontraŭstaraj fortoj: darvinisma natura selektado, kondukanta al la plibonigo de parazitoj, kaj la kolapso de la genaro, ĵetante parazitojn en forgeson.Kiel la parazito sukcesis eliri el ĉi tiu ŝnur-milito kaj reteni la agadon de sia molekula strukturo restas neklara.
Kvankam la mekanismo de genoma kadukiĝo ne estas plene komprenita, ĝi ŝajnas okazi ĉefe pro ofta genetika drivo.Ĉar parazitoj vivas en malgrandaj, senseksaj, kaj genetike limigitaj populacioj, ili ne povas efike elimini malutilajn mutaciojn kiuj foje okazas dum DNA-reproduktado.Ĉi tio kondukas al nemaligebla amasiĝo de damaĝaj mutacioj kaj redukto de la parazita genaro.Kiel rezulto, la parazito ne nur perdas genojn kiuj ne plu estas necesaj por sia supervivo en la intraĉela medio.Estas la malkapablo de parazitpopulacioj efike elimini sporadajn malutilajn mutaciojn kiu igas tiujn mutaciojn akumuliĝi ĉie en la genaro, inkluzive de iliaj plej gravaj genoj.
Multo de nia nuna kompreno de genarredukto baziĝas nur sur komparoj de genarsekvencoj, kun malpli atento al ŝanĝoj en faktaj molekuloj kiuj plenumas mastrumadfunkciojn kaj funkcias kiel eblaj drogceloj.Komparaj studoj montris, ke la ŝarĝo de malutilaj intraĉelaj mikrobaj mutacioj ŝajnas predisponi proteinojn kaj nukleajn acidojn misfaldi kaj kuniĝi, igante ilin pli dependaj kaj hipersentemaj al varmo19,20,21,22,23.Krome, diversaj parazitoj — sendependa evoluo foje apartigita de eĉ 2,5 miliardoj da jaroj — spertis similan perdon de kvalitkontrolcentroj en siaj proteinsintezo5,6 kaj DNA-riparmekanismoj24.Tamen, malmulto estas konata ĉirkaŭ la efiko de intraĉela vivstilo sur ĉiuj aliaj trajtoj de ĉelaj makromolekuloj, inkluzive de molekula adaptado al kreskanta ŝarĝo de malutilaj mutacioj.
En ĉi tiu laboro, por pli bone kompreni la evoluon de proteinoj kaj nukleaj acidoj de intraĉelaj mikroorganismoj, ni determinis la strukturon de ribosomoj de la intraĉela parazito Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi estas fungosimila organismo apartenanta al grupo de parazitaj mikrosporidioj kiuj havas nekutime malgrandajn eŭkariotajn genarojn kaj estas tial utiligitaj kiel modelorganismoj por studi genarkadukiĝon25,26,27,28,29,30.Lastatempe, krio-EM-ribosoma strukturo estis determinita por modere reduktitaj genaroj de Microsporidia, Paranosema locustae, kaj Vairimorpha necatrix31,32 (~3.2 Mb genaro).Tiuj strukturoj indikas ke iu perdo de rRNA-plifortigo estas kompensita per la evoluo de novaj kontaktoj inter najbaraj ribosomaj proteinoj aŭ la akiro de novaj msL131,32 ribosomaj proteinoj.Specio Encephalitozoon (genomo 2.5 milionoj da bp), kune kun ilia plej proksima parenco Ordospora, montras la finfinan gradon da genarredukto en eŭkariotoj - ili havas malpli ol 2000 protein-kodigajn genojn, kaj estas atendite ke iliaj ribosomoj estas ne nur sen rRNA-vastfragmentoj (rRNA-vastiĝofragmentoj) kiuj ankaŭ distingas kvar ribosome-ribo-fragmentojn de eukaryomaj bakterioj kiuj distingas kvar ribosome-ribo-fragmentojn de eukaryomaj bakterioj. s pro ilia manko de homologoj en la genaro de E. cuniculi26,27,28.Tial, ni konkludis, ke la E. cuniculi-ribosomo povas riveli antaŭe nekonatajn strategiojn por molekula adaptado al genoma kadukiĝo.
Nia krio-EM-strukturo reprezentas la plej malgrandan eŭkariotan citoplasman ribosomon por esti karakterizita kaj disponigas sciojn pri kiel la finfina grado de genarredukto influas la strukturon, kunigon kaj evoluon de la molekula maŝinaro kiu estas integrita al la ĉelo.Ni trovis ke la E. cuniculi-ribosomo malobservas multajn el la vaste konservitaj principoj de RNA-faldado kaj ribosoma asembleo, kaj malkovris novan, antaŭe nekonatan ribosoman proteinon.Tute neatendite, ni montras ke mikrosporidia ribosomoj evoluis la kapablon ligi malgrandajn molekulojn, kaj hipotezas ke detranĉigoj en rRNA kaj proteinoj ekigas evoluajn inventojn kiuj finfine povas doni utilajn kvalitojn al la ribosomo.
Por plibonigi nian komprenon pri la evoluo de proteinoj kaj nukleaj acidoj en intraĉelaj organismoj, ni decidis izoli E. cuniculi sporojn de kulturoj de infektitaj mamulaj ĉeloj por purigi iliajn ribosomojn kaj determini la strukturon de tiuj ribosomoj.Estas malfacile akiri grandan nombron da parazitaj mikrosporidoj ĉar mikrosporidioj ne povas esti kultivitaj en nutra medio.Anstataŭe, ili kreskas kaj reproduktiĝas nur ene de la gastiga ĉelo.Tial, por akiri E. cuniculi-biomason por ribosoma purigo, ni infektis la mamulan renan ĉellinion RK13 per E. cuniculi sporoj kaj kulturis ĉi tiujn infektitajn ĉelojn dum kelkaj semajnoj por permesi al E. cuniculi kreski kaj multiĝi.Uzante infektitan ĉelan monotavolon de ĉirkaŭ duona kvadrata metro, ni povis purigi ĉirkaŭ 300 mg da Microsporidia sporoj kaj uzi ilin por izoli ribosomojn.Ni tiam interrompis la purigitajn sporojn per vitraj bidoj kaj izolis la krudajn ribosomojn uzante laŭpaŝan polietilenglikol-frakcion de la lisatoj.Tio permesis al ni akiri proksimume 300 µg da krudaj E. cuniculi ribosomoj por struktura analizo.
Ni tiam kolektis krio-EM-bildojn uzante la rezultajn ribosomajn specimenojn kaj prilaboris ĉi tiujn bildojn uzante maskojn respondajn al la granda ribosoma subunuo, malgranda subunua kapo kaj malgranda subunuo.Dum ĉi tiu procezo, ni kolektis bildojn de ĉirkaŭ 108,000 ribosomaj partikloj kaj komputis krio-EM-bildojn kun rezolucio de 2.7 Å (Suplementaj Bildoj 1-3).Ni tiam uzis krioEM-bildojn por modeligi rRNA, ribosoma proteinon kaj vintrofaktoron Mdf1 asociitan kun E. cuniculi ribosomoj (Fig. 1a, b).
a Strukturo de la E. cuniculi ribosomo en komplekso kun la vintrodorma faktoro Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapo de vintrodorma faktoro Mdf1 asociita kun la E. cuniculi ribosomo.c Sekundara strukturmapo komparanta reakirita rRNA en Microsporidian specioj al konataj ribosomaj strukturoj.La paneloj montras la lokon de la plifortigitaj rRNA-fragmentoj (ES) kaj ribosomajn aktivajn ejojn, inkluzive de la malkoda ejo (DC), la sarcinicin-buklo (SRL), kaj la peptidiltransferazcentron (PTC).d La elektrondenseco egalrilatanta al la peptidiltransferazcentro de la E. cuniculi ribosomo indikas ke tiu kataliza ejo havas la saman strukturon en la E. cuniculi parazito kaj ĝiaj gastigantoj, inkluzive de H. sapiens.e, f La ekvivalenta elektrondenseco de la malkoda centro (e) kaj la skema strukturo de la malkoda centro (f) indikas ke E. cuniculi havas restaĵojn U1491 anstataŭe de A1491 (E. coli numerado) en multaj aliaj eŭkariotoj.Tiu ŝanĝo indikas ke E. cuniculi povas esti sentema al antibiotikoj kiuj celas tiun aktivan ejon.
Kontraste al la antaŭe establitaj strukturoj de V. necatrix kaj P. locustae ribosomoj (ambaŭ strukturoj reprezentas la saman mikrosporidia familion Nosematidae kaj estas tre similaj unu al la alia), 31,32 E. cuniculi ribosomoj spertas multajn procesojn de rRNA kaj proteinfragmentiĝo.Plia denaturado (Suplementaj Figuroj 4-6).En rRNA, la plej okulfrapaj ŝanĝoj inkludis kompletan perdon de la plifortigita 25S rRNA fragmento ES12L kaj partan degeneron de h39, h41, kaj H18 helicoj (Fig. 1c, Suplementa Fig. 4).Inter ribosomaj proteinoj, la plej okulfrapaj ŝanĝoj inkludis kompletan perdon de la proteino eS30 kaj mallongigon de la proteinoj eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, kaj eS7 (Kuplej 4, 5).
Tiel, la ekstrema redukto de la genaroj de Encephalotozoon/Ordospora specioj estas reflektita en ilia ribosoma strukturo: E. cuniculi ribosomoj spertas la plej dramecan perdon de proteinenhavo en eŭkariotaj citoplasmaj ribosomoj kondiĉigitaj de struktura karakterizado, kaj ili ne eĉ havas tiujn rRNA kaj proteinfragmentojn kiuj estas ne nur en la eŭkariofagmentoj kiuj estas vaste konservataj en la vivdomajnoj ne nur en la eŭkaryo-domajnoj.La strukturo de la E. cuniculi-ribosomo provizas la unuan molekulan modelon por ĉi tiuj ŝanĝoj kaj malkaŝas evoluajn eventojn, kiuj estis preteratentitaj de kaj kompara genomiko kaj studoj de intraĉela biomolekula strukturo (Suplementa Fig. 7).Malsupre, ni priskribas ĉiun el ĉi tiuj eventoj kune kun iliaj verŝajnaj evoluaj originoj kaj ilia ebla efiko al ribosoma funkcio.
Ni tiam trovis ke, krom grandaj rRNA-tranĉaĵoj, E. cuniculi ribosomoj havas rRNA-variojn ĉe unu el siaj aktivaj lokoj.Kvankam la peptidiltransferazo-centro de la E. cuniculi-ribosomo havas la saman strukturon kiel aliaj eŭkariotaj ribosomoj (Fig. 1d), la malkoda centro malsamas pro sekvencovario ĉe nukleotido 1491 (E. coli numerado, Fig. 1e, f).Tiu observado estas grava ĉar la malĉifra loko de eŭkariotaj ribosomoj tipe enhavas restaĵojn G1408 kaj A1491 komparite kun bakteri-specaj restaĵoj A1408 kaj G1491.Tiu vario subestas la malsaman sentemon de bakteriaj kaj eŭkariotaj ribosomoj al la aminoglikozidfamilio de ribosomaj antibiotikoj kaj aliaj malgrandaj molekuloj kiuj celas la malkodan ejon.En la malkodigo de la E. cuniculi ribosomo, restaĵo A1491 estis anstataŭigita kun U1491, eble kreante unikan liga interfacon por malgrandaj molekuloj celantaj tiun aktivan ejon.La sama A14901-variaĵo ankaŭ ĉeestas en aliaj microsporidia kiel ekzemple P. locustae kaj V. necatrix, sugestante ke ĝi estas ĝeneraligita inter mikrosporidia specioj (Fig. 1f).
Ĉar niaj ribosomaj specimenoj de E. cuniculi estis izolitaj de metabola neaktivaj sporoj, ni testis la krio-EM-mapon de E. cuniculi por antaŭe priskribita ribosoma ligado sub streso aŭ malsato kondiĉoj.Hibernado-faktoroj 31,32,36,37, 38. Ni kongruis la antaŭe establitan strukturon de la vintrovintra ribosomo kun la krio-EM-mapo de la E. cuniculi-ribosomo.Por aldokiĝo, S. cerevisiae ribosomoj estis uzitaj en komplekso kun vintrodorma faktoro Stm138, akridoj ribosomoj en komplekso kun Lso232-faktoro, kaj V. necatrix-ribosomoj en komplekso kun Mdf1 kaj Mdf231-faktoroj.Samtempe, ni trovis la krio-EM-densecon respondan al la ripozfaktoro Mdf1.Simila al Mdf1 liganta al la V. necatrix-ribosomo, Mdf1 ankaŭ ligas al la E. cuniculi-ribosomo, kie ĝi blokas la E-lokon de la ribosomo, eventuale helpante igi ribosomojn haveblaj kiam parazitsporoj iĝas metabola neaktivaj sur korpomalaktivigo (Figuro 2).).
Mdf1 blokas la E-lokon de la ribosomo, kiu ŝajnas helpi malaktivigi la ribosomon kiam parazitsporoj iĝas metabola neaktivaj.En la strukturo de la E. cuniculi-ribosomo, ni trovis ke Mdf1 formas antaŭe nekonatan kontakton kun la L1-ribosoma tigo, la parto de la ribosomo kiu faciligas la liberigon de malakiligita tRNA de la ribosomo dum proteinsintezo.Tiuj kontaktoj indikas ke Mdf1 disiĝas de la ribosomo uzante la saman mekanismon kiel deacetilateita tRNA, disponigante eblan klarigon por kiel la ribosomo forigas Mdf1 por reaktivigi proteinsintezon.
Tamen, nia strukturo malkaŝis nekonatan kontakton inter Mdf1 kaj la L1-ribosoma kruro (la parto de la ribosomo, kiu helpas liberigi malakilitan tRNA de la ribosomo dum proteinsintezo).Aparte, Mdf1 uzas la samajn kontaktojn kiel la kubuto-segmento de la deaciligita tRNA-molekulo (Fig. 2).Tiu antaŭe nekonata molekula modeligado montris ke Mdf1 disiĝas de la ribosomo uzante la saman mekanismon kiel deacetilateita tRNA, kiu klarigas kiel la ribosomo forigas tiun vintrodorman faktoron por reaktivigi proteinsintezon.
Konstruante la rRNA-modelon, ni trovis, ke la E. cuniculi-ribosomo havas nenormale falditajn rRNA-fragmentojn, kiujn ni nomis kunfandita rRNA (Fig. 3).En ribosomoj kiuj ampleksas la tri domajnojn de vivo, rRNA faldas en strukturojn en kiuj plej multaj bazoj de rRNA aŭ bazpariĝas kaj faldiĝas unu kun la alia aŭ interagas kun ribosomaj proteinoj38,39,40.Tamen, en E. cuniculi ribosomoj, rRNA ŝajnas malobservi tiun faldprincipon konvertante kelkajn el siaj helicoj en disfalditajn rRNA-regionojn.
Strukturo de la H18 25S rRNA-helico en S. cerevisiae, V. necatrix, kaj E. cuniculi.Tipe, en ribosomoj enhavantaj la tri vivdomajnojn, tiu ligilo volviĝas en RNA-helikon kiu enhavas 24 ĝis 34 restaĵojn.En Microsporidia, kontraste, tiu rRNA-ligilo estas iom post iom reduktita al du unu-fadenaj uridin-riĉaj ligiloj enhavantaj nur 12 restaĵojn.La plej multaj el tiuj restaĵoj estas eksponitaj al solviloj.La figuro montras ke parazitaj mikrosporidia ŝajnas malobservi la ĝeneralajn principojn de rRNA-faldado, kie rRNA-bazoj estas kutime kunligitaj al aliaj bazoj aŭ implikitaj en rRNA-proteinaj interagoj.En mikrosporidia, kelkaj rRNA-fragmentoj prenas malfavoran faldon, en kiu la antaŭa rRNA-helico iĝas unu-fadena fragmento plilongigita preskaŭ en rekta linio.La ĉeesto de tiuj nekutimaj regionoj permesas al microsporidia rRNA ligi malproksimajn rRNA-fragmentojn uzante minimuman nombron da RNA-bazoj.
La plej okulfrapa ekzemplo de ĉi tiu evolua transiro povas esti observita en la H18 25S rRNA-helico (Fig. 3).En specioj de E. coli ĝis homoj, la bazoj de tiu rRNA-helico enhavas 24-32 nukleotidojn, formante iomete neregulan helicon.En antaŭe identigitaj ribosomaj strukturoj de V. necatrix kaj P. locustae,31,32 la bazoj de la H18-helico estas parte malvolvitaj, sed nukleotida bazpariĝo estas konservita.Tamen, en E. cuniculi tiu rRNA fragmento iĝas la plej mallongaj ligiloj 228UUUUUU232 kaj 301UUUUUUUU307.Male al tipaj rRNA-fragmentoj, tiuj uridin-riĉaj ligiloj ne volviĝas aŭ faras ampleksan kontakton kun ribosomaj proteinoj.Anstataŭe, ili adoptas solvi-malfermajn kaj plene disfalditajn strukturojn en kiuj la rRNA-fadenoj estas etenditaj preskaŭ rekte.Tiu streĉita formo klarigas kiel E. cuniculi uzas nur 12 RNA-bazojn por plenigi la 33 Å interspacon inter la H16 kaj H18 rRNA-helicoj, dum aliaj specioj postulas almenaŭ duoble pli multajn rRNA-bazojn por plenigi la interspacon.
Tiel, ni povas pruvi ke, per energie malfavora faldado, parazitaj mikrosporidioj evoluigis strategion por kuntiri eĉ tiujn rRNA-segmentojn kiuj restas larĝe konservitaj trans specioj en la tri domajnoj de vivo.Ŝajne, per akumulado de mutacioj kiuj transformas rRNA-helicojn en mallongajn poli-U ligilojn, E. cuniculi povas formi nekutimajn rRNA-fragmentojn enhavantajn kiel malmultajn nukleotidojn kiel eble por ligado de distalaj rRNA-fragmentoj.Ĉi tio helpas klarigi kiel microsporidia atingis dramecan redukton en ilia baza molekula strukturo sen perdi ilian strukturan kaj funkcian integrecon.
Alia nekutima trajto de E. cuniculi rRNA estas la aspekto de rRNA sen dikiĝo (Fig. 4).Buloj estas nukleotidoj sen bazparoj kiuj tordas el la RNA-helico anstataŭ kaŝi en ĝi.La plej multaj rRNA-elstaraĵoj funkcias kiel molekulaj gluoj, helpante ligi apudajn ribosomajn proteinojn aŭ aliajn rRNA-fragmentojn.Kelkaj el la ŝvelaĵoj funkcias kiel ĉarniroj, permesante al la rRNA-helico fleksi kaj faldi optimume por produktiva proteinsintezo 41 .
a rRNA-elstaraĵo (S. cerevisiae numerado) estas forestanta de la E. cuniculi ribosoma strukturo, sed ĉeestas en la plej multaj aliaj eŭkariotoj b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, kaj E. cuniculi internaj ribosomoj.al parazitoj mankas multaj el la antikvaj, tre konservitaj rRNA-ŝvelaĵoj.Tiuj dikiĝo stabiligas la ribosomstrukturon;tial, ilia foresto en microsporidia indikas reduktitan stabilecon de rRNA faldiĝanta en mikrosporidia parazitoj.Komparo kun P-tigoj (L7/L12-tigoj en bakterioj) montras ke la perdo de rRNA-tubetoj foje koincidas kun la apero de novaj tuberoj apud la perditaj tuberoj.La H42-helico en la 23S/28S rRNA havas antikvan ŝvelaĵon (U1206 en Saccharomyces cerevisiae) taksitan esti almenaŭ 3.5 miliardojn da jaroj aĝa pro sia protekto en tri domajnoj de vivo.En mikrosporidia, ĉi tiu ŝvelaĵo estas forigita.Tamen, nova ŝvelaĵo aperis apud la perdita ŝvelaĵo (A1306 en E. cuniculi).
Frape, ni trovis, ke al E. cuniculi ribosomoj mankas la plej multaj el la rRNA-bulboj trovitaj en aliaj specioj, inkluzive de pli ol 30 ŝvelaĵoj konservitaj en aliaj eŭkariotoj (Fig. 4a).Ĉi tiu perdo forigas multajn kontaktojn inter ribosomaj subunuoj kaj apudaj rRNA-helicoj, foje kreante grandajn kavajn malplenojn ene de la ribosomo, igante la E. cuniculi ribosomon pli pora kompare kun pli tradiciaj ribosomoj (Fig. 4b).Precipe, ni trovis, ke la plej multaj el ĉi tiuj ŝvelaĵoj ankaŭ estis perditaj en la antaŭe identigitaj V. necatrix kaj P. locustae ribosomaj strukturoj, kiuj estis preteratentitaj de antaŭaj strukturaj analizoj31,32.
Foje la perdo de rRNA-tubetoj estas akompanata de la evoluo de novaj tuberoj apud la perdita tubero.Ekzemple, la ribosoma P-tigo enhavas U1208-tubeton (en Saccharomyces cerevisiae ) kiu pluvivis de E. coli ĝis homoj kaj estas tial taksita esti 3.5 miliardoj da jaroj aĝa.Dum proteinsintezo, tiu ŝvelaĵo helpas la P-tigon moviĝi inter malfermaj kaj fermitaj formoj tiel ke la ribosomo povas rekruti tradukfaktorojn kaj liveri ilin al la aktiva loko.En E. cuniculi ribosomoj, tiu dikiĝo estas forestanta;tamen, nova dikiĝo (G883) situanta nur en tri bazaj paroj povas kontribui al la restarigo de la optimuma fleksebleco de la P-tigo (Fig. 4c).
Niaj datumoj pri rRNA sen ŝvelaĵoj sugestas, ke rRNA-minimumigo ne estas limigita al la perdo de rRNA-elementoj sur la surfaco de la ribosomo, sed ankaŭ povas impliki la ribosomkernon, kreante parazit-specifan molekulan difekton kiu ne estis priskribita en libervivaj ĉeloj.oni observas vivantajn speciojn.
Post modeligado de kanonikaj ribosomaj proteinoj kaj rRNA, ni trovis ke konvenciaj ribosomaj komponentoj ne povas klarigi la tri partojn de la krio-EM-bildo.Du el ĉi tiuj fragmentoj estas malgrandaj molekuloj en grandeco (Fig. 5, Suplementa Fig. 8).La unua segmento estas krampita inter la ribosomaj proteinoj uL15 kaj eL18 en pozicio kutime okupita per la C-finaĵo de eL18, kiu estas mallongigita en E. cuniculi.Kvankam ni ne povas determini la identecon de ĉi tiu molekulo, la grandeco kaj formo de ĉi tiu densecinsulo estas bone klarigitaj per la ĉeesto de spermidinmolekuloj.Ĝia ligado al la ribosomo estas stabiligita per mikrosporidia-specifaj mutacioj en la uL15-proteinoj (Asp51 kaj Arg56), kiuj ŝajnas pliigi la afinecon de la ribosomo por tiu malgranda molekulo, ĉar ili permesas al uL15 envolvi la malgrandan molekulon en ribosoman strukturon.Suplementa Figuro 2).8, pliaj datumoj 1, 2).
Krio-EM bildigo montrante la ĉeeston de nukleotidoj ekster la riboso ligita al la E. cuniculi ribosomo.En la E. cuniculi ribosomo, tiu nukleotido okupas la saman lokon kiel la 25S rRNA A3186 nukleotido (Saccharomyces cerevisiae numerado) en la plej multaj aliaj eŭkariotaj ribosomoj.b En la ribosoma strukturo de E. cuniculi, tiu nukleotido situas inter la ribosoma proteinoj uL9 kaj eL20, tiel stabiligante la kontakton inter la du proteinoj.cd eL20-sekvenca konservadanalizo inter mikrosporidia specioj.La filogenetika arbo de Microsporidia specioj (c) kaj multobla sekvencparaleligo de la eL20-proteino (d) montras ke nukleotid-ligaj restaĵoj F170 kaj K172 estas konservitaj en la plej multaj tipaj Microsporidia, kun la escepto de S. lophii, kun la escepto de frua disbranĉado Microsporidia, kiu retenis la etendon de ES39L.e Ĉi tiu figuro montras, ke nukleotid-ligaj restaĵoj F170 kaj K172 ĉeestas nur en eL20 de la tre reduktita microsporidia genaro, sed ne en aliaj eŭkariotoj.Ĝenerale, ĉi tiuj datumoj sugestas, ke Microsporidianaj ribosomoj evoluigis nukleotidan liglokon, kiu ŝajnas ligi AMP-molekulojn kaj uzi ilin por stabiligi protein-proteinajn interagojn en la ribosoma strukturo.La alta konservado de tiu ligloko en Microsporidia kaj ĝia foresto en aliaj eŭkariotoj indikas ke tiu ejo povas disponigi selekteman supervivantavantaĝon por Microsporidia.Tiel, la nukleotid-deviga poŝo en la mikrosporidia ribosomo ne ŝajnas esti degenerita trajto aŭ finformo de rRNA-degenero kiel antaŭe priskribite, sed prefere utila evolua novigado kiu permesas al la mikrosporidia ribosomo rekte ligi malgrandajn molekulojn, uzante ilin kiel molekulaj konstrubriketoj.konstrubriketoj por ribosomoj.Tiu eltrovaĵo igas la microsporidia ribosomon la nura ribosomo konata utiligi ununuran nukleotidon kiel sian strukturan konstrubriketon.f Hipoteza evolua vojo derivita de nukleotida ligado.
La dua malalta molekula pezo denseco situas ĉe la interfaco inter ribosoma proteinoj uL9 kaj eL30 (Fig. 5a).Ĉi tiu interfaco antaŭe estis priskribita en la strukturo de la Saccharomyces cerevisiae-ribosomo kiel ligoloko por la 25S-nukleotido de rRNA A3186 (parto de la ES39L rRNA etendaĵo)38.Estis montrite ke en degeneritaj P. locustae ES39L-ribosomoj, tiu interfaco ligas nekonatan ununuran nukleotidon 31, kaj estas supozite ke tiu nukleotido estas reduktita fina formo de rRNA, en kiu la longo de rRNA estas ~130-230 bazoj.ES39L estas reduktita al ununura nukleotido 32.43.Niaj krio-EM-bildoj subtenas la ideon ke denseco povas esti klarigita per nukleotidoj.Tamen, la pli alta rezolucio de nia strukturo montris, ke ĉi tiu nukleotido estas eksterribosoma molekulo, eble AMP (Fig. 5a, b).
Ni tiam demandis ĉu la nukleotida ligoloko aperis en la E. cuniculi ribosomo aŭ ĉu ĝi ekzistis antaŭe.Ĉar nukleotidligado estas plejparte mediaciita per la Phe170 kaj Lys172-restaĵoj en la eL30-ribosoma proteino, ni taksis la konservadon de tiuj restaĵoj en 4396 reprezentaj eŭkariotoj.Kiel en la kazo de uL15 supre, ni trovis, ke la Phe170 kaj Lys172-restaĵoj estas tre konservitaj nur en tipaj Microsporidia, sed forestantaj en aliaj eŭkariotoj, inkluzive de maltipaj Microsporidia Mitosporidium kaj Amphiamblys, en kiuj la ES39L rRNA-fragmento ne estas reduktita 44, 45, 454c.-e).
Kunigitaj, tiuj datumoj apogas la ideon ke E. cuniculi kaj eventuale aliaj kanonikaj mikrosporidia evoluis la kapablon efike kapti grandajn nombrojn da malgrandaj metabolitoj en la ribosoma strukturo por kompensi la malkreskon en rRNA kaj proteinniveloj.Farante tion, ili evoluigis unikan kapablon ligi nukleotidojn ekster la ribosomo, montrante ke parazitaj molekulaj strukturoj kompensas kaptante abundajn malgrandajn metabolitojn kaj utiligante ilin kiel strukturajn imitantojn de degradita RNA kaj proteinfragmentoj..
La tria nesimulita parto de nia krio-EM mapo, trovita en la granda ribosoma subunuo.La relative alta rezolucio (2.6 Å) de nia mapo sugestas, ke ĉi tiu denseco apartenas al proteinoj kun unikaj kombinaĵoj de grandaj flankaj ĉenaj restaĵoj, kio permesis al ni identigi ĉi tiun densecon kiel antaŭe nekonatan ribosoma proteinon, kiun ni identigis kiel ĝi estis nomita msL2 (Microsporidia-specifa proteino L2) (metodoj, figuro 6).Nia homologioserĉo montris ke msL2 estas konservita en la Microsporidia klado de la genro Encephaliter kaj Orosporidium, sed forestanta en aliaj specioj, inkluzive de aliaj Microsporidia.En la ribosoma strukturo, msL2 okupas interspacon formitan per la perdo de la plilongigita ES31L rRNA.En ĉi tiu malpleno, msL2 helpas stabiligi rRNA-faldon kaj povas kompensi la perdon de ES31L (Figuro 6).
a Elektrondenseco kaj modelo de la Microsporidia-specifa ribosoma proteino msL2 trovita en E. cuniculi ribosomoj.b La plej multaj eŭkariotaj ribosomoj, inkluzive de la 80S ribosomo de Saccharomyces cerevisiae, havas ES19L-rRNA-plifortigon perdita en la plej multaj Microsporidianaj specioj.La antaŭe establita strukturo de la V. necatrix microsporidia ribosomo indikas ke la perdo de ES19L en tiuj parazitoj estas kompensita per la evoluo de la nova msL1 ribosoma proteino.En ĉi tiu studo, ni trovis ke la E. cuniculi-ribosomo ankaŭ evoluigis kroman ribosoma RNA-imita proteino kiel ŝajna kompenso por la perdo de ES19L.Tamen, msL2 (nuntempe komentita kiel la hipoteza ECU06_1135-proteino) kaj msL1 havas malsamajn strukturajn kaj evoluajn originojn.c Tiu eltrovo de la generacio de evolue senrilataj msL1 kaj msL2 ribosoma proteinoj indikas ke se ribosomoj akumulas malutilajn mutaciojn en sia rRNA, ili povas atingi senprecedencajn nivelojn de kompona diverseco en eĉ malgranda subaro de proksime rilataj specioj.Tiu eltrovaĵo povus helpi klarigi la originon kaj evoluon de la mitokondria ribosomo, kiu estas konata pro sia tre reduktita rRNA kaj nenormala ŝanĝebleco en proteinkonsisto trans specioj.
Ni tiam komparis la msL2-proteinon kun la antaŭe priskribita msL1-proteino, la nura konata mikrosporidia-specifa ribosoma proteino trovita en la V. necatrix-ribosomo.Ni volis testi ĉu msL1 kaj msL2 estas evolue rilataj.Nia analizo montris, ke msL1 kaj msL2 okupas la saman kavon en la ribosoma strukturo, sed havas malsamajn primarajn kaj terciarajn strukturojn, kio indikas ilian sendependan evoluan originon (Fig. 6).Tiel, nia eltrovo de msL2 disponigas indicon ke grupoj de kompaktaj eŭkariotaj specioj povas sendepende evolui strukture apartajn ribosomajn proteinojn por kompensi la perdon de rRNA-fragmentoj.Tiu trovo estas rimarkinda en tio, ke la plej multaj citoplasmaj eŭkariotaj ribosomoj enhavas senvarian proteinon, inkluzive de la sama familio de 81 ribosomaj proteinoj.La aspekto de msL1 kaj msL2 en diversaj kladoj de mikrosporidioj en respondo al la perdo de plilongigitaj rRNA-segmentoj indikas ke degenero de la molekula arkitekturo de la parazito igas parazitojn serĉi kompensajn mutaciojn, kiuj povas poste kaŭzi sian akiron en malsamaj parazitpopulacioj.strukturoj.
Fine, kiam nia modelo estis kompletigita, ni komparis la konsiston de la E. cuniculi ribosomo kun tiu antaŭdirita de la genoma sekvenco.Pluraj ribosomaj proteinoj, inkluzive de eL14, eL38, eL41, kaj eS30, antaŭe laŭsupoze mankis de la E. cuniculi genaro pro la ŝajna foresto de siaj homologoj de la E. cuniculi genaro.Perdo de multaj ribosomaj proteinoj ankaŭ estas antaŭdirita en la plej multaj aliaj tre reduktitaj intraĉelaj parazitoj kaj endosimbiontoj.Ekzemple, kvankam la plej multaj libervivaj bakterioj enhavas la saman familion de 54 ribosomaj proteinoj, nur 11 el tiuj proteinfamilioj havas konstateblajn homologojn en ĉiu analizita genaro de gastigant-restriktitaj bakterioj.En subteno de tiu nocio, perdo de ribosomaj proteinoj estis eksperimente observita en V. necatrix kaj P. locustae microsporidia, al kiuj mankas la eL38 kaj eL4131,32 proteinoj.
Tamen, niaj strukturoj montras ke nur eL38, eL41, kaj eS30 estas fakte perditaj en la E. cuniculi ribosomo.La proteino eL14 estis konservita kaj nia strukturo montris kial ĉi tiu proteino ne povus esti trovita en la homologioserĉo (Fig. 7).En E. cuniculi ribosomoj, la plej granda parto de la eL14 ligloko estas perdita pro degenero de la rRNA-plifortigita ES39L.En la foresto de ES39L, eL14 perdis la plej grandan parton de sia sekundara strukturo, kaj nur 18% de la eL14-sekvenco estis identaj en E. cuniculi kaj S. cerevisiae.Tiu malbona sekvencokonservado estas rimarkinda ĉar eĉ Saccharomyces cerevisiae kaj Homo sapiens - organismoj kiuj evoluis 1.5 miliardojn da jaroj dise - dividas pli ol 51% de la samaj restaĵoj en eL14.Tiu nenormala perdo de konservado klarigas kial E. cuniculi eL14 estas nuntempe komentita kiel la supoza M970_061160 proteino kaj ne kiel la eL1427 ribosoma proteino.
kaj La Microsporidia ribosomo perdis la ES39L rRNA-etendaĵon, kiu parte eliminis la eL14-ribosoma proteinan liglokon.En la foresto de ES39L, la eL14 mikrosporproteino spertas perdon de sekundara strukturo, en kiu la antaŭa rRNA-liganta α-helico degeneras en minimuman longobuklon.b Multobla sekvencparaleligo montras ke la eL14-proteino estas tre konservita en eŭkariotaj specioj (57% sekvencidenteco inter gisto kaj homaj homologoj), sed nebone konservita kaj diverĝa en mikrosporidia (en kiuj ne pli ol 24% de restaĵoj estas identaj al la eL14-homologo).de S. cerevisiae aŭ H. sapiens).Tiu malbona sekvencokonservado kaj sekundara strukturŝanĝebleco klarigas kial la eL14-homologo neniam estis trovita en E. cuniculi kaj kial tiu proteino supozeble estis perdita en E. cuniculi.En kontrasto, E. cuniculi eL14 antaŭe estis komentita kiel supoza M970_061160 proteino.Tiu ĉi observado sugestas, ke mikrosporidia genardiverseco estas nuntempe supertaksita: kelkaj genoj nuntempe supozitaj esti perditaj en mikrosporidia estas fakte konservitaj, kvankam en tre diferencigitaj formoj;anstataŭe, iuj supozeble kodas por mikrosporidia genoj por vermaj specifaj proteinoj (ekz., la hipoteza proteino M970_061160) fakte kodas por la tre diversaj proteinoj trovitaj en aliaj eŭkariotoj.
Tiu trovo indikas ke rRNA-denaturigo povas kaŭzi dramecan perdon de sekvenckonservado en apudaj ribosomaj proteinoj, igante tiujn proteinojn nerimarkeblaj por homologioserĉoj.Tiel, ni povas supertaksi la realan gradon da molekula degenero en malgrandaj genarorganismoj, ĉar kelkaj proteinoj supozitaj esti perditaj fakte daŭras, kvankam en tre ŝanĝitaj formoj.
Kiel povas parazitoj reteni la funkcion de siaj molekulaj maŝinoj sub kondiĉoj de ekstrema genarredukto?Nia studo respondas ĉi tiun demandon priskribante la kompleksan molekula strukturon (ribosomo) de E. cuniculi, organismo kun unu el la plej malgrandaj eŭkariotaj genaroj.
Estas konata dum preskaŭ du jardekoj ke proteino kaj RNA-molekuloj en mikrobaj parazitoj ofte devias de siaj homologaj molekuloj en libervivaj specioj ĉar al ili mankas kvalitkontrolcentroj, estas reduktitaj al 50% de sia grandeco en libervivaj mikroboj, ktp.multaj malfortigaj mutacioj kiuj difektas faldiĝon kaj funkcion.Ekzemple, al la ribosomoj de malgrandaj genarorganismoj, inkluzive de multaj intraĉelaj parazitoj kaj endosimbiontoj, estas atenditaj malhavi plurajn ribosomalproteinojn kaj ĝis unu triono de rRNA-nukleotidoj kompare kun libervivaj specioj 27, 29, 30, 49. Tamen, la maniero kiel tiuj molekuloj funkcias en parazito restas kompare grandege studita en parazito restas kompare genoma.
Nia studo montras, ke la strukturo de makromolekuloj povas malkaŝi multajn aspektojn de evoluado, kiuj malfacilas ĉerpi el tradiciaj komparaj genomaj studoj pri intraĉelaj parazitoj kaj aliaj mastro-restriktitaj organismoj (Suplementa Fig. 7).Ekzemple, la ekzemplo de la eL14-proteino montras ke ni povas supertaksi la realan gradon da degenero de la molekula aparato en parazitaj specioj.Encefalitaj parazitoj nun verŝajne havas centojn da mikrosporidi-specifaj genoj.Tamen, niaj rezultoj montras, ke iuj el ĉi tiuj ŝajne specifaj genoj estas fakte nur tre malsamaj variantoj de genoj, kiuj estas oftaj en aliaj eŭkariotoj.Krome, la ekzemplo de la proteino msL2 montras kiel ni preteratentas novajn ribosomajn proteinojn kaj subtaksas la enhavon de parazitaj molekulaj maŝinoj.La ekzemplo de malgrandaj molekuloj montras kiel ni povas preteratenti la plej inĝeniajn novigojn en parazitaj molekulaj strukturoj, kiuj povas doni al ili novan biologian agadon.
Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj plibonigas nian komprenon pri la diferencoj inter la molekulaj strukturoj de mastro-restriktitaj organismoj kaj iliaj ekvivalentoj en libervivaj organismoj.Ni montras, ke molekulaj maŝinoj, longe supozeble reduktitaj, degeneritaj kaj submetitaj al diversaj malfortigaj mutacioj, anstataŭe havas aron de sisteme preteratentitaj nekutimaj strukturaj trajtoj.
Aliflanke, la ne-grandaj rRNA-fragmentoj kaj kunfanditaj fragmentoj, kiujn ni trovis en la ribosomoj de E. cuniculi, sugestas, ke genarredukto povas ŝanĝi eĉ tiujn partojn de la baza molekula maŝinaro, kiuj estas konservitaj en la tri domajnoj de vivo - post preskaŭ 3.5 miliardoj da jaroj.sendependa evoluo de specioj.
La ŝvelaĵo-liberaj kaj kunfanditaj rRNA-fragmentoj en E. cuniculi ribosomoj estas de speciala intereso en la lumo de antaŭaj studoj de RNA-molekuloj en endosimbiozaj bakterioj.Ekzemple, en la afido endosimbionto Buchnera aphidicola, rRNA kaj tRNA-molekuloj pruviĝis havi temperatur-sentemajn strukturojn pro A+T-kunmetaĵbiaso kaj alta proporcio de ne-kanonikaj bazparoj20,50.Ĉi tiuj ŝanĝoj en RNA, same kiel ŝanĝoj en proteinaj molekuloj, nun supozeble respondecas pri la trodependeco de endosimbiontoj sur partneroj kaj la malkapablo de endosimbiontoj transdoni varmecon 21, 23 .Kvankam parazitaj microsporidia rRNA havas strukture apartajn ŝanĝojn, la naturo de tiuj ŝanĝoj indikas ke reduktita termika stabileco kaj pli alta dependeco de ŝaperonproteinoj povas esti oftaj trajtoj de RNA-molekuloj en organismoj kun reduktitaj genaroj.
Aliflanke, niaj strukturoj montras, ke parazitmikrosporidioj evoluis unikan kapablon rezisti larĝe konservitajn rRNA kaj proteinfragmentojn, evoluigante la kapablon uzi abundajn kaj facile haveblajn malgrandajn metabolitojn kiel strukturajn imitantojn de degeneritaj rRNA kaj proteinfragmentoj.Degenero de molekula strukturo..Tiu ĉi opinio estas subtenata de la fakto ke malgrandaj molekuloj kiuj kompensas por la perdo de proteinfragmentoj en la rRNA kaj ribosomoj de E. cuniculi ligas al mikrosporidia-specifaj restaĵoj en la uL15 kaj eL30 proteinoj.Tio indikas ke ligado de malgrandaj molekuloj al ribosomoj povas esti produkto de pozitiva selektado, en kiu Microsporidia-specifaj mutacioj en ribosomaj proteinoj estis selektitaj por sia kapablo pliigi la afinecon de ribosomoj por malgrandaj molekuloj, kiuj povas konduki al pli efikaj ribosomaj organismoj.La eltrovaĵo rivelas inteligentan novigon en la molekula strukturo de mikrobaj parazitoj kaj donas al ni pli bonan komprenon pri kiel parazitaj molekulaj strukturoj konservas sian funkcion malgraŭ reduktiva evoluo.
Nuntempe, la identigo de tiuj malgrandaj molekuloj restas neklara.Estas ne klare kial la aspekto de tiuj malgrandaj molekuloj en la ribosoma strukturo malsamas inter mikrosporidia specioj.Aparte, estas ne klare kial nukleotidligado estas observita en la ribosomoj de E. cuniculi kaj P. locustae, kaj ne en la ribosomoj de V. necatrix, malgraŭ la ĉeesto de la F170-restaĵo en la eL20 kaj K172-proteinoj de V. necatrix.Tiu forigo povas esti kaŭzita de restaĵo 43 uL6 (situanta najbara al la nukleotida ligpoŝo), kio estas tirozino en V. necatrix kaj ne treonino en E. cuniculi kaj P. locustae.La dika aroma flankĉeno de Tyr43 povas malhelpi nukleotidligadon pro stera interkovro.Alternative, la ŝajna nukleotidforigo povas ŝuldiĝi al la malalta rezolucio de krio-EM bildigo, kiu malhelpas la modeligadon de V. necatrix ribosomal fragmentoj.
Aliflanke, nia laboro sugestas, ke la procezo de genoma kadukiĝo povas esti inventa forto.Aparte, la strukturo de la E. cuniculi ribosomo indikas ke la perdo de rRNA kaj proteinfragmentoj en la microsporidia ribosomo kreas evoluan premon kiu antaŭenigas ŝanĝojn en ribosoma strukturo.Tiuj variaĵoj okazas malproksime de la aktiva loko de la ribosomo kaj ŝajnas helpi konservi (aŭ reestigi) optimuman ribosomasembleon kiu alie estus interrompita per reduktita rRNA.Tio indikas ke grava novigado de la mikrosporidia ribosomo ŝajnas esti evoluinta en bezonon tamponi genan drivon.
Eble tio estas plej bone ilustrita per nukleotida ligado, kiu ĝis nun neniam estis observita en aliaj organismoj.La fakto ke nukleotid-ligaj restaĵoj ĉeestas en tipaj mikrosporidia, sed ne en aliaj eŭkariotoj, indikas ke nukleotid-ligaj ejoj ne estas nur restaĵoj atendantaj por malaperi, aŭ la fina ejo por rRNA por esti reestigita al la formo de individuaj nukleotidoj.Anstataŭe, ĉi tiu retejo ŝajnas kiel utila trajto, kiu povus esti evoluinta dum pluraj rondoj de pozitiva elekto.Nukleotidaj liglokoj povas esti kromprodukto de natura selektado: post kiam ES39L estas degradita, mikrosporidia estas devigitaj serĉi kompenson por reestigi optimuman ribosombiogenezon en la foresto de ES39L.Ĉar tiu nukleotido povas imiti la molekulajn kontaktojn de la A3186-nukleotido en ES39L, la nukleotidmolekulo iĝas konstrubriketo de la ribosomo, kies ligado estas plue plibonigita per mutacio de la eL30-sekvenco.
Koncerne al la molekula evoluo de intraĉelaj parazitoj, nia studo montras, ke la fortoj de darvinisma natura selektado kaj genetika drivo de genoma kadukiĝo ne funkcias paralele, sed oscilas.Unue, genetika drivo forigas gravajn trajtojn de biomolekuloj, igante kompenson tre bezonata.Nur kiam parazitoj kontentigos ĉi tiun bezonon per darvinisma natura selektado, iliaj makromolekuloj havos ŝancon evoluigi siajn plej imponajn kaj novigajn trajtojn.Grave, la evoluo de nukleotidaj liglokoj en la E. cuniculi ribosomo indikas ke tiu perd-al-gajna padrono de molekula evoluo ne nur amorigas malutilajn mutaciojn, sed foje transigas totale novajn funkciojn al parazitaj makromolekuloj.
Tiu ĉi ideo kongruas kun la mova ekvilibra teorio de Sewell Wright, kiu asertas, ke strikta sistemo de natura selektado limigas la kapablon de la organismoj novigi51,52,53.Tamen, se genetika drivo interrompas naturan selektadon, tiuj drivoj povas produkti ŝanĝojn kiuj ne estas en si mem adaptaj (aŭ eĉ malutilaj) sed kondukas al pliaj ŝanĝoj kiuj disponigas pli altan taŭgecon aŭ novan biologian agadon.Nia kadro subtenas ĉi tiun ideon ilustrante, ke la sama tipo de mutacio, kiu reduktas la faldon kaj funkcion de biomolekulo, ŝajnas esti la ĉefa ellasilo por ĝia plibonigo.Konforme al la gajna-gajna evolua modelo, nia studo montras, ke genoma kadukiĝo, tradicie rigardata kiel degenera procezo, ankaŭ estas grava ŝoforo de novigado, foje kaj eble eĉ ofte permesante al makromolekuloj akiri novajn parazitajn agadojn.povas uzi ilin.