Dankon pro vizito de Nature.com.Vi uzas retumilon kun limigita CSS-subteno.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Montras karuselon de tri diapozitivoj samtempe.Uzu la butonojn Antaŭa kaj Sekva por moviĝi tra tri diapozitivoj samtempe, aŭ uzu la glitilbutonojn ĉe la fino por moviĝi tra tri diapozitivoj samtempe.
La sango-cerba baro kaj la sango-cerba baro malhelpas bioterapiajn agentojn atingi siajn celojn en la centra nerva sistemo, tiel malhelpante efikan traktadon de neŭrologiaj malsanoj.Por malkovri novajn cerbtransportilojn en vivo, ni enkondukis T7-fagpeptidan bibliotekon kaj serie kolektis sangon kaj cerbo-spinan likvaĵon (CSF) uzante kanelitan konscian grandan naĝejmodelon de ratoj.Specifaj fagklonoj estis tre riĉigitaj en CSF post kvar raŭndoj de selektado.Testado de individuaj kandidatoj peptidoj malkaŝis pli ol 1000-oblan riĉigon en CSF.La bioaktiveco de la peptid-mediaciita livero al la cerbo estis konfirmita per 40% redukto en la nivelo de amiloido-β en la cerbo-spina likvaĵo uzante BACE1-peptidan inhibitoron ligitan al la identigita nova transitpeptido.Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke la peptidoj identigitaj per en vivaj fagselektaj metodoj povas esti utilaj vehikloj por ĉiea livero de makromolekuloj al la cerbo kun terapia efiko.
Centra nervoza sistemo (CNS) laŭcela terapio-esplorado plejparte temigis identigadon de optimumigitaj medikamentoj kaj agentoj kiuj elmontras CNS-celajn propraĵojn, kun malpli da fortostreĉo por malkovrado de la mekanismoj kiuj kondukas aktivan drogliveron al la cerbo.Ĉi tio komencas ŝanĝiĝi nun ĉar liveraĵo de medikamentoj, precipe grandaj molekuloj, estas integra parto de la moderna neŭroscienca drog-evoluo.La medio de la centra nerva sistemo estas bone protektita de la cerbovaskula bariera sistemo, konsistanta el la sango-cerba baro (BBB) ​​kaj la sango-cerba baro (BCBB)1, igante ĝin malfacila liveri drogojn al la cerbo1,2.Oni taksas, ke preskaŭ ĉiuj grandaj molekulaj drogoj kaj pli ol 98% de malgrandaj molekulaj drogoj estas forigitaj el la cerbo3.Tial estas tre grave identigi novajn cerbajn transportsistemojn, kiuj provizas efikan kaj specifan liveron de terapiaj drogoj al la CNS 4,5.Tamen, la BBB kaj BCSFB ankaŭ prezentas bonegan ŝancon por liveraĵo de drogoj kiam ili penetras kaj eniras ĉiujn strukturojn de la cerbo tra ĝia ampleksa vaskulaturo.Tiel, la nunaj klopodoj uzi ne-enpenetrajn metodojn de liveraĵo al la cerbo estas plejparte bazitaj sur la mekanismo de receptor-mediaciita transporto (PMT) uzanta la endogenan BBB6-receptoron.Malgraŭ lastatempaj ŝlosilaj progresoj uzantaj la transferrin-ricevilon7,8, pluevoluigo de novaj liversistemoj kun plibonigitaj trajtoj estas postulata.Tiucele, nia celo estis identigi peptidojn kapablajn peri CSF-transporton, ĉar ili principe povus esti uzitaj por liveri makromolekulojn al la CNS aŭ por malfermi novajn receptorvojojn.Aparte, specifaj riceviloj kaj transportiloj de la cerebrovaskula sistemo (BBB kaj BSCFB) povas funkcii kiel eblaj celoj por la aktiva kaj specifa livero de bioterapiaj medikamentoj.Cebrospina likvaĵo (CSF) estas sekrecia produkto de la korida plekso (CS) kaj estas en rekta kontakto kun la interstica likvaĵo de la cerbo tra la subaraknoida spaco kaj ventrikla spaco4.Lastatempe montriĝis, ke subaraknoida cerbo-spina likvaĵo disvastiĝas troe en la intersticon de la cerbo9.Ni esperas aliri la parenkiman spacon uzante ĉi tiun subaraknoidan enfluan vojon aŭ rekte tra la BBB.Por atingi tion, ni efektivigis fortikan en vivo-fag-elektadstrategion, kiu ideale identigas peptidojn transportitajn per iu el ĉi tiuj du apartaj vojoj.
Ni nun priskribas sinsekvan en-vivan fagan ekranan ekzamenan metodon kun CSF-specimenigo kunligita kun alta traflua sekvencado (HTS) por monitori komencajn elektorondojn kun la plej alta biblioteka diverseco.Rastrumo estis farita sur konsciaj ratoj kun permanente enplantita granda cisterno (CM) kanulo por eviti sangopoluadon.Grave, ĉi tiu aliro elektas kaj cerb-celadon kaj peptidojn kun transportagado trans la cerbovaskula baro.Ni uzis T7-fagojn pro ilia eta grandeco (~60 nm)10 kaj sugestis, ke ili taŭgas por la transporto de vezikoj, kiuj permesas transĉelan transiron de la endotelia kaj/aŭ epiteli-medola baro.Post kvar raŭndoj de panorado, fagpopulacioj estis izolitaj montrante fortan en vivo-riĉigon de CSF kaj cerba mikrovasula asocio.Grave, ni povis konfirmi niajn trovojn pruvante, ke la preferataj kaj kemie sintezitaj plej bonaj kandidatoj peptidoj kapablas transporti proteinkargon en la cerbo-spinan fluidon.Unue, la farmacodinamikaj efikoj de la CNS estis establitaj kombinante gvidan transitpeptidon kun inhibitoro de la BACE1-peptido.Krom pruvi, ke en vivo funkciaj ekzamenaj strategioj povas identigi novajn cerbtransportajn peptidojn kiel efikajn proteinajn kargoportistojn, ni atendas ke similaj funkciaj elektaj aliroj ankaŭ fariĝu gravaj por identigi novajn cerbtransportajn vojojn.
Surbaze de plakformaj unuoj (PFU), post la fago-pakaĵpaŝo, biblioteko de hazardaj 12-mer linearaj T7-fagpeptidoj kun diverseco de proksimume 109 estis dizajnita kaj kreita (vidu Materialoj kaj Metodoj).Gravas noti, ke ni zorge analizis ĉi tiun bibliotekon antaŭ en-viva panorado.PCR-plifortigo de fagbibliotekaj specimenoj uzante modifitajn enkondukojn generis amplikonojn, kiuj estis rekte aplikeblaj al HTS (Suplementa Fig. 1a).Pro a) HTS11-sekvencaj eraroj, b) efiko al la kvalito de enkondukoj (NNK) 1-12, kaj c) la ĉeesto de sovaĝ-speca (wt) fago (skeletaj enigaĵoj) en la standby-biblioteko, sekvenco-filtrila proceduro estis efektivigita por ĉerpi nur kontrolitajn sekvencon-informojn (Sulementa Fig. 1b).Ĉi tiuj filtrilaj paŝoj validas por ĉiuj HTS-sekvencaj bibliotekoj.Por la norma biblioteko, entute 233,868 legaĵoj estis akiritaj, el kiuj 39% trapasis la filtrilkriteriojn kaj estis uzataj por biblioteka analizo kaj elekto por postaj ĉirkaŭvojoj (Aldona Figuro 1c–e).La legaĵoj estis ĉefe multobloj de 3 bazparoj longaj kun pinto ĉe 36 nukleotidoj (Suplementa Fig. 1c), konfirmante la biblioteko-dezajnon (NNK) 1-12.Precipe, proksimume 11% de la bibliotekmembroj enhavis 12-dimensian sovaĝ-specan (wt) spinon PAGISRELVDKL-enigaĵon, kaj preskaŭ duono de la sekvencoj (49%) enhavis enmetojn aŭ forigojn.La HTS de la biblioteka biblioteko konfirmis la altan diversecon de peptidoj en la biblioteko: pli ol 81% de peptidaj sekvencoj estis trovitaj nur unufoje kaj nur 1.5% okazis en ≥4 kopioj (Suplementa Fig. 2a).La frekvencoj de aminoacidoj (aa) ĉe ĉiuj 12 pozicioj en la repertuaro bone korelaciis kun la frekvencoj atenditaj por la nombro da kodonoj generitaj de la degenerita NKK-repertuaro (Suplementa Fig. 2b).La observita ofteco de aa restaĵoj koditaj per ĉi tiuj enigaĵoj bone korelaciis kun la kalkulita frekvenco (r = 0.893) (Suplementa Fig. 2c).La preparado de fagbibliotekoj por injekto inkludas la ŝtupojn de plifortigo kaj forigo de endotoksino.Ĉi tio antaŭe pruviĝis eble redukti la diversecon de fagbibliotekoj12,13.Tial, ni sekvencis plat-amplifitan fagbibliotekon kiu spertis endotoksin forigon kaj komparis ĝin kun la origina biblioteko por taksi la oftecon de AA.Forta korelacio (r = 0.995) estis observita inter la origina naĝejo kaj la plifortigita kaj purigita naĝejo (Suplementa Fig. 2d), indikante, ke konkuro inter klonoj plifortigitaj sur platoj uzantaj T7-fagon ne kaŭzis gravan biason.Tiu komparo estas bazita sur la ofteco de tripeptidaj ĉeftemoj en ĉiu biblioteko, ĉar la diverseco de bibliotekoj (~109) ne povas esti plene kaptita eĉ kun HTS.Frekvenca analizo de aa ĉe ĉiu pozicio malkaŝis malgrandan pozicio-dependan biason en la lastaj tri pozicioj de la enirita repertuaro (Suplementa Fig. 2e).Konklude, ni konkludis, ke la kvalito kaj diverseco de la biblioteko estis akcepteblaj kaj nur malgrandaj ŝanĝoj en diverseco estis observitaj pro plifortigo kaj preparado de fagbibliotekoj inter pluraj rondoj de elekto.
Seria cerboespina fluida specimenigo povas esti farita per kirurgie enplantante kanulon en la CM de konsciaj ratoj por faciligi identigon de T7-fago injektita intravejne (iv) per la BBB kaj/aŭ BCSFB (Fig. 1a-b).Ni uzis du sendependajn elektajn brakojn (brakoj A kaj B) en la unuaj tri ĉirkaŭvojoj de en viva elekto (Fig. 1c).Ni iom post iom pliigis la severecon de la elekto malpliigante la totalan kvanton de fago enkondukita en la unuaj tri raŭndoj de elekto.Por la kvara raŭndo de panorado, ni kombinis specimenojn de branĉoj A kaj B kaj faris tri pliajn sendependajn elektojn.Por studi la en vivajn trajtojn de T7-fagpartikloj en tiu modelo, sovaĝ-speca fago (PAGISRELVDKL-majstra enigaĵo) estis injektita en ratojn per la vostvejno.Reakiro de fagoj de cerbo-spina likvaĵo kaj sango en malsamaj tempopunktoj montris, ke relative malgrandaj T7-ikozaedraj fagoj havis rapidan komencan forigon de la sangosekcio (Suplementa Fig. 3).Surbaze de la titoloj administritaj kaj la sangovolumo de la ratoj, ni kalkulis ke nur proksimume 1% pezo.fago de la administrita dozo estis detektita en la sango 10 minutojn post intravejna injekto.Post ĉi tiu komenca rapida malkresko, pli malrapida primara senigo estis mezurita kun duoniĝotempo de 27.7 minutoj.Grave, nur tre malmultaj fagoj estis prenitaj de la CSF-kupeo, indikante malaltan fonon por sovaĝa fago-migrado en la CSF-kupeon (Suplementa Fig. 3).Averaĝe, nur proksimume 1 x 10-3%-titoloj de T7-fago en la sango kaj 4 x 10-8% de komence infuzitaj fagoj estis detektitaj en la cerbo-spina likvaĵo dum la tuta prova periodo (0-250 min).Precipe, la duoniĝotempo (25.7 min) de sovaĝ-speca fago en cerbo-spina likvaĵo estis simila al tio observita en sango.Tiuj datenoj pruvas ke la bariero apartiganta la CSF-sekcion de la sango estas sendifekta en CM-kanulitaj ratoj, permesante en viva selektado de fagbibliotekoj identigi klonojn kiuj estas facile transportitaj de la sango en la CSF-sekcion.
(a) Starigante metodon por re-specimenigo de cerbo-spina likvaĵo (CSF) de granda naĝejo.(b) Diagramo montranta la ĉelan lokon de la centra nervosistemo (CNS) baro kaj la elekta strategio uzata por identigi peptidojn kiuj transiras la sango-cerbo-barieron (BBB) ​​​​ kaj la sango-cerbo-barieron.(c) En vivo phage ekrano ekrano diagramo.En ĉiu raŭndo de selektado, fagoj (bestaj identigiloj ene de la sagoj) estis injektitaj intravejne.Du sendependaj alternativaj branĉoj (A, B) estas konservitaj aparte ĝis la 4-a raŭndo de elekto.Por selektadoj 3 kaj 4, ĉiu fagoklono eltirita de CSF estis mane sekvencita.(d) Kinetiko de fago izolita de sango (ruĝaj cirkloj) kaj cerbo-spina likvaĵo (verdaj trianguloj) dum la unua raŭndo de elekto en du kanulitaj ratoj post intravejna injekto de la T7-peptidbiblioteko (2 x 1012 fagoj/besto).Bluaj kvadratoj indikas la mezan komencan koncentriĝon de fago en la sango, kalkulita de la kvanto de injektita fago, konsiderante la totalan sangan volumon.La nigraj kvadratoj indikas la intersekcpunkton de la y-linio eksterpolita de sangaj fagkoncentriĝoj.(e,f) Prezentu la relativan frekvencon kaj distribuadon de ĉiuj eblaj imbrikitaj tripeptidaj ĉeftemoj trovitaj en la peptido.La nombro da motivoj trovitaj en 1000 legaĵoj estas montrita.Signife (p < 0.001) riĉigitaj motivoj estas markitaj per ruĝaj punktoj.(e) Korelacia disvastigo komparanta la relativan frekvencon de la tripeptida ĉeftemo de la injektita biblioteko kun sang-derivita fago de bestoj #1.1 kaj #1.2.(f) Korelacia disvortigo komparanta la relativajn frekvencojn de bestfagaj tripeptidaj ĉeftemoj #1.1 kaj #1.2 izolitaj en sango kaj cerbo-spina likvaĵo.(g, h) Sekvencidentigprezentado de fago riĉigita en sango (g) kontraŭ injektitaj bibliotekoj kaj fago riĉigita en CSF (h) kontraŭ sango post rondo de en viva selektado en ambaŭ bestoj.La grandeco de la unu-letera kodo indikas kiom ofte tiu aminoacido okazas ĉe tiu pozicio.Verda = polusa, purpura = neŭtrala, blua = baza, ruĝa = acida kaj nigra = hidrofobaj aminoacidoj.Figuro 1a, b estis dizajnita kaj produktita fare de Eduard Urich.
Ni injektis fagan peptidan bibliotekon en du CM-instrumentajn ratojn (kladoj A kaj B) kaj izolis fagon de cerbo-spina fluido kaj sango (Figuro 1d).La komenca rapida senigo de la biblioteko estis malpli okulfrapa komparite kun la sovaĝ-speca fago.La averaĝa duoniĝotempo de la injektita biblioteko en ambaŭ bestoj estis 24.8 minutoj en sango, simila al sovaĝ-speca fago, kaj 38.5 minutoj en CSF.Sangaj kaj cerbospinaj fluidaj fagprovaĵoj de ĉiu besto estis submetitaj al HTS kaj ĉiuj identigitaj peptidoj estis analizitaj por la ĉeesto de mallonga tripeptida motivo.Tripeptidaj ĉeftemoj estis elektitaj ĉar ili provizas minimuman bazon por strukturformado kaj peptid-proteinaj interagoj14,15.Ni trovis bonan korelacion en la distribuado de motivoj inter la injektita fagobiblioteko kaj klonoj ĉerpitaj el la sango de ambaŭ bestoj (Fig. 1e).La datumoj indikas, ke la konsisto de la biblioteko estas nur marĝene riĉigita en la sangosekcio.Frekvencoj de aminoacidoj kaj konsentaj sekvencoj estis plu analizitaj ĉe ĉiu pozicio uzante adapton de la programaro Weblogo16.Interese, ni trovis fortan riĉiĝon en sangaj glicinaj restaĵoj (Fig. 1g).Kiam sango estis komparita kun klonoj elektitaj el CSF, oni observis fortan elekton kaj iom da deselektado de motivoj (Fig. 1f), kaj certaj aminoacidoj ĉeestis prefere ĉe antaŭdeterminitaj pozicioj en la 12-membro (Fig. 1h).Precipe, individuaj bestoj signife diferencis en cerbo-spina likvaĵo, dum sanga glicina riĉiĝo estis observita en ambaŭ bestoj (Suplementa Fig. 4a-j).Post strikta filtrado de sekvenco-datumoj en la cerbo-spina fluido de bestoj #1.1 kaj #1.2, entute 964 kaj 420 unikaj 12-mer-peptidoj estis akiritaj (Suplementa Fig. 1d-e).La izolitaj fagklonoj estis plifortigitaj kaj submetitaj al dua raŭndo de en viva selektado.Fagoj ĉerpitaj de la dua raŭndo de elekto estis submetitaj al HTS en ĉiu besto kaj ĉiuj identigitaj peptidoj estis uzataj kiel enigo al motivo-rekonoprogramo por analizi la aperon de tripeptidaj motivoj (Fig. 2a, b, ef).Kompare kun la unua ciklo de la fago reakirita de CSF, ni observis plian elekton kaj malelekton de multaj motivoj en CSF en branĉoj A kaj B (Fig. 2).Reta identiga algoritmo estis aplikita por determini ĉu ili reprezentis malsamajn padronojn de konsekvenca sekvenco.Klara simileco estis observita inter la 12-dimensiaj sekvencoj reakiritaj de CSF en alternativa klado A (Fig. 2c, d) kaj klado B (Fig. 2g, h).La kunigita analizo en ĉiu branĉo malkaŝis malsamajn elektajn profilojn por 12-mer-peptidoj (Suplementa Fig. 5c, d) kaj pliiĝon en la CSF/sanga titolo-proporcio laŭlonge de la tempo por kunigitaj klonoj post la dua raŭndo de elekto kompare kun la unua raŭndo de elekto (Suplementa Fig. 5e).).
Riĉigo de ĉeftemoj kaj peptidoj en cerbo-spina likvaĵo per du sinsekvaj raŭndoj de en vivo funkcia fago-montra elekto.
Ĉiuj cerbo-spinaj fluidaj fagoj reakiritaj de la unua raŭndo de ĉiu besto (bestoj #1.1 kaj #1.2) estis kunigitaj, plifortigitaj, HT-sekvencigitaj kaj reinjektitaj kune (2 x 1010 fagoj/besto) 2 SM-kanulitaj ratoj (#1.1 → #).2.1 kaj 2.2, 1.2 → 2.3 kaj 2.4).(a,b,e,f) Korelaciaj disvortegoj komparantaj la relativan frekvencon de tripeptidaj ĉeftemoj de ĉiuj CSF-derivitaj fagoj en la unua kaj dua selektadoj.Relativa ofteco kaj distribuado de ĉeftemoj reprezentantaj ĉiujn eblajn imbrikitajn tripeptidojn trovitajn en peptidoj en ambaŭ orientiĝoj.La nombro da motivoj trovitaj en 1000 legaĵoj estas montrita.Motivoj kiuj estis signife (p < 0.001) elektitaj aŭ ekskluditaj en unu el la komparitaj bibliotekoj estas emfazitaj per ruĝaj punktoj.(c, d, g, h) Sekvenca emblemo-reprezentado de ĉiuj CSF-riĉaj 12 aminoacido longaj sekvencoj bazitaj sur raŭndoas 2 kaj 1 de en viva selektado.La grandeco de la unu-letera kodo indikas kiom ofte tiu aminoacido okazas ĉe tiu pozicio.Por reprezenti la emblemon, la ofteco de CSF-sekvencoj ĉerpitaj de individuaj bestoj inter du selektadoj estas komparata kaj la riĉigitaj sekvencoj en la dua raŭndo estas montritaj: (c) #1.1-#2.1 (d) #1.1-#2.2 (g) #1.2-#2.3 kaj (h) #1.2-#2.4.La plej riĉigitaj aminoacidoj ĉe difinita pozicio en (c, d) bestoj ne.2.1 kaj ne.2.2 aŭ (g, h) ĉe bestoj ne.2.3 kaj ne.2.4 estas montritaj en koloro.Verda = polusa, purpura = neŭtrala, blua = baza, ruĝa = acida kaj nigra = hidrofobaj aminoacidoj.
Post la tria raŭndo de elekto, ni identigis 124 unikajn peptidajn sekvencojn (n° 3.1 kaj n-ro 3.2) el 332 CSF-rekonstruitaj fagklonoj izolitaj de du bestoj (Suplementa Fig. 6a).La sekvenco LGSVS (18.7%) havis la plej altan relativan proporcion, sekvita per la sovaĝ-specaj enigaĵoj PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), kaj SARGSWREIVSLS (2.2%).En la fina kvara raŭndo, ni kunigis du sendepende elektitajn branĉojn el tri apartaj bestoj (Fig. 1c).El la 925 sekvencitaj fagklonoj reakiritaj de CSF, en la kvara raŭndo ni trovis 64 unikajn peptidajn sekvencojn (Suplementa Fig. 6b), inter kiuj la relativa proporcio de sovaĝ-tipa fago falis al 0.8%.La plej oftaj CSF-klonoj en la kvara raŭndo estis LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) kaj RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).La longintervalo de la elektitaj peptidoj ŝuldiĝas al nukleotidaj enmetoj/foriĝoj aŭ trofruaj haltkodonoj en la bibliotekkomencoj dum uzado de degeneritaj kodonoj por NNK-biblioteka dezajno.Trofruaj haltkodonoj generas pli mallongajn peptidojn kaj estas elektitaj ĉar ili enhavas la favoran aa ĉeftemon.Pli longaj peptidoj povas rezulti el enmetoj/foriĝoj en la enkondukoj de la sintezaj bibliotekoj.Tio poziciigas la dizajnitan haltkodonon ekster la kadro kaj legas ĝin ĝis nova haltkodono aperas laŭflue.Ĝenerale, ni kalkulis riĉigajn faktorojn por ĉiuj kvar elektaj rondoj komparante la enigajn datumojn kun la specimenaj eligodatenoj.Por la unua raŭndo de ekzamenado, ni uzis sovaĝajn fagajn titolojn kiel nespecifan fonan referencon.Kurioze, negativa fago-selektado estis tre forta en la unua CSF-ciklo, sed ne en sango (Fig. 3a), kiu povas esti pro la malalta probablo de pasiva disvastigo de la plej multaj membroj de la peptidbiblioteko en la CSF-sekcion aŭ relativaj fagoj tendencas esti pli efike retenitaj aŭ forigitaj de la sangocirkulado ol bakteriofagoj.Tamen, en la dua raŭndo de panorado, forta selektado de fagoj en CSF estis observita en ambaŭ kladoj, sugestante ke la antaŭa raŭndo estis riĉigita en fagoj montrantaj peptidojn kiuj antaŭenigas CSF-subprenon (Fig. 3a).Denove, sen grava sango-riĉigo.Ankaŭ en la tria kaj kvara raŭndoj, la fagklonoj estis signife riĉigitaj en CSF.Komparante la relativan oftecon de ĉiu unika peptida sekvenco inter la lastaj du raŭndoj de elekto, ni trovis, ke la sekvencoj estis eĉ pli riĉigitaj en la kvara raŭndo de elekto (Fig. 3b).Entute 931 tripeptidaj ĉeftemoj estis ĉerpita de ĉiuj 64 unikaj peptidsekvencoj uzante ambaŭ peptidajn orientiĝojn.La plej riĉigitaj motivoj en la kvara raŭndo estis pli atente ekzamenitaj por siaj riĉigaj profiloj tra ĉiuj ĉirkaŭvojoj kompare kun la injektita biblioteko (tranĉo: 10% riĉiĝo) (Suplementa Fig. 6c).Ĝeneralaj ŝablonoj de selektado montris ke la plej multaj el la studitaj motivoj estis riĉigitaj en ĉiuj antaŭaj rondoj de ambaŭ elektbranĉoj.Tamen, kelkaj ĉeftemoj (ekz. SGL, VSG, LGS GSV) estis ĉefe de alternativa klado A, dum aliaj (ekz. FGW, RTN, WGF, NTR) estis riĉigitaj en alternativa klado B.
Valumado de CSF-transporto de CSF-riĉigitaj fag-montritaj peptidoj kaj biotinilateitaj ĉefpeptidoj konjugitaj al streptavidin-utilaj ŝarĝoj.
(a) Riĉigaj proporcioj kalkulitaj en ĉiuj kvar ĉirkaŭvojoj (R1-R4) bazitaj sur injektitaj (enigaĵo = I) fago (PFU) titoloj kaj determinitaj CSF fagotitoloj (produktaĵo = O).Riĉigaj faktoroj por la lastaj tri raŭndoj (R2-R4) estis kalkulitaj kompare kun la antaŭa raŭndo kaj la unua raŭndo (R1) kun pezdatumoj.Malfermaj stangoj estas cerbo-spina likvaĵo, ombritaj stangoj estas plasmo.(***p<0.001, surbaze de la t-testo de Studento).(b) Listo de la plej abundaj fagpeptidoj, vicigitaj laŭ ilia relativa proporcio al ĉiuj fagoj kolektitaj en CSF post raŭndo 4 de selektado.La ses plej oftaj fagklonoj estas elstarigitaj en koloro, numeritaj kaj siaj riĉigfaktoroj inter raŭndoj 3 kaj 4 de selektado (enmetoj).(c,d) La ses plej riĉigitaj fagklonoj, malplena fago kaj gepatraj fagpeptidbibliotekoj de raŭndo 4 estis analizitaj individue en CSF-specimena modelo.CSF kaj sangospecimenoj estis kolektitaj en la indikitaj tempopunktoj.(c) Egalaj kvantoj de 6 kandidatoj fagoklonoj (2 x 1010 fagoj/bestoj), malplenaj fagoj (n-ro 1779) (2 x 1010 fagoj/bestoj) kaj stokfagaj peptidbibliotekoj (2 x 1012 fagoj/bestoj) Injektu almenaŭ 3 CM al la ladvosto administrita aparte al la ladvosto.La CSF-farmakokinetiko de ĉiu injektita fagklono kaj fagpeptidbiblioteko dum tempo estas montrita.(d) montras la mezan CSF/sangoproporcion por ĉiuj reakiritaj fagoj/mL dum la prova tempo.(e) Kvar sintezaj gvidaj peptidoj kaj unu miksita kontrolo estis ligitaj kun biotino al streptavidin tra sia N-finaĵo (tetramer-ekrano) sekvita per injekto (vostvejno iv, 10 mg streptavidin/kg).Almenaŭ tri intubataj ratoj (N = 3).).CSF-provaĵoj estis kolektitaj ĉe la indikitaj tempopunktoj kaj streptavidin-koncentriĝoj estis mezuritaj per CSF kontraŭ-streptavidin ELISA (nd = ne detektita).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, bazita sur ANOVA-testo).(f) Komparo de la aminoacidsekvenco de la plej riĉigita fagopeptida klono numero 2002 (purpura) kun aliaj elektitaj fagpeptidaj klonoj de la 4-a raŭndo de selektado.Identaj kaj similaj aminoacidfragmentoj estas kolorkodigitaj.
El ĉiuj riĉigitaj fagoj en la kvara raŭndo (Fig. 3b), ses kandidatoj klonoj estis elektitaj por plia individua analizo en la CSF-specimena modelo.Egalaj kvantoj de ses kandidataj fagoj, malplenaj fagoj (neniu enmetaĵo) kaj prophagaj peptidaj bibliotekoj estis injektitaj en tri kanulitajn CM-bestojn, kaj farmakokinetiko estis determinita en CSF (Fig. 3c) kaj sango (Suplementa Fig. 7) provoj.Ĉiuj fagklonoj testitaj celis la CSF-kupeon je nivelo 10-1000 fojojn pli alta ol tiu de la malplena kontrolfago (#1779).Ekzemple, klonoj #2020 kaj #2077 havis proksimume 1000 fojojn pli altajn CSF-titolojn ol kontrolfago.La farmakokinetika profilo de ĉiu elektita peptido estas malsama, sed ĉiuj el ili havas altan CSF-hejman kapablon.Ni observis konstantan malkreskon laŭlonge de la tempo por klonoj #1903 kaj #2011, dum por klonoj #2077, #2002 kaj #2009 pliiĝo dum la unuaj 10 minutoj povus indiki aktivan transporton sed devas esti kontrolita.Klonoj #2020, #2002, kaj #2077 stabiligis sur altaj niveloj, dum la CSF-koncentriĝo de klono #2009 malrapide malpliiĝis post la komenca pliiĝo.Ni tiam komparis la relativan oftecon de ĉiu CSF-kandidato kun ĝia sanga koncentriĝo (Fig. 3d).La korelacio de la averaĝa titolo de ĉiu CSF-kandidato kun ĝia sango-titro en ĉiuj provaj tempoj montris ke tri el la ses kandidatoj estis signife riĉigitaj en sanga CSF.Interese, klono #2077 montris pli altan sangan stabilecon (Kuldona Figuro 7).Por konfirmi, ke la peptidoj mem kapablas aktive transporti kargon krom fagaj partikloj en la CSF-kupeon, ni sintezis kvar ĉefpeptidojn derivitajn kun biotino ĉe la N-finaĵo kie la peptidoj aliĝas al la fagpartiklo.Biotinilateitaj peptidoj (n-roj 2002, 2009, 2020 kaj 2077) estis konjugitaj kun streptavidin (SA) por akiri multimerajn formojn iom imitantajn faggeometrion.Ĉi tiu formato ankaŭ permesis al ni mezuri SA-malkovron en sango kaj cerbo-spina likvaĵo kiel kargo-transportaj proteinpeptidoj.Grave, fagaj datumoj ofte povus esti reproduktitaj kiam sintezaj peptidoj estis administritaj en ĉi tiu SA-konjugacia formato (Fig. 3e).La miksitaj peptidoj havis malpli komencan ekspozicion kaj pli rapidan forigon de CSF kun nerimarkeblaj niveloj ene de 48 horoj.Por akiri enrigardon pri la liveraj vojoj de ĉi tiuj peptidfagaj klonoj en la CSF-spacon, ni analizis la lokalizon de individuaj fagpeptidaj sukcesoj uzante imunohistokemion (IHC) por rekte detekti fagpartiklojn 1 horon post intravejna injekto en vivo.Precipe, klonoj #2002, #2077, kaj #2009 povus esti detektitaj per forta makulo en cerbaj kapilaroj, dum kontrolfago (#1779) kaj klono #2020 ne estis detektitaj (Suplementa Bildo 8).Ĉi tio sugestas, ke ĉi tiuj peptidoj kontribuas al la efiko sur la cerbo ĝuste per krucado de la BBB.Plia detala analizo estas postulata por testi tiun hipotezon, ĉar la BSCFB-itinero ankaŭ povas esti implikita.Komparante la aminoacidsekvencon de la plej riĉigita klono (n° 2002) kun aliaj elektitaj peptidoj, oni rimarkis, ke kelkaj el ili havas similajn aminoacidajn etendaĵojn, kiuj povas indiki similan transportan mekanismon (Fig. 3f).
Pro ĝia unika plasmoprofilo kaj signifa pliiĝo en CSF laŭlonge de la tempo, fago-montra klono #2077 estis plue esplorita dum pli longa 48-hora periodo kaj povis reprodukti la rapidan pliiĝon en CSF observita en asocio kun daŭraj SA-niveloj (Fig. 4a).Koncerne aliajn identigitajn fagklonojn, #2077 forte makulis por cerbaj kapilaroj kaj montris signifan kolokigon kun kapilara markilo-lektino kiam rigardite kun pli alta rezolucio kaj eble iom da makulo en la parenkima spaco (Figuro 4b).Por esplori ĉu peptid-mediaciitaj farmakologiaj efikoj povus esti akiritaj en la CNS, ni faris eksperimenton en kiu biotinilateitaj versioj de i) la #2077-transira peptido kaj ii) la BACE1-inhibitopeptido estis miksitaj kun SA ĉe du malsamaj proporcioj.Por unu kombinaĵo ni uzis nur la BACE1-peptidan inhibitoron kaj por la alia ni uzis 1:3-proporcion de BACE1-peptida inhibitoro al #2077-peptido.Ambaŭ specimenoj estis administritaj intravejne kaj sangaj kaj cerbo-spinaj fluidaj niveloj de beta-amiloida peptido 40 (Abeta40) estis mezuritaj laŭlonge de la tempo.Abeta40 estis mezurita en CSF ĉar ĝi reflektas BACE1-inhibicion en la cerba parenkimo.Kiel atendite, ambaŭ kompleksoj signife reduktis sangajn nivelojn de Abeta40 (Fig. 4c, d).Tamen, nur specimenoj enhavantaj miksaĵon de peptido Nr.2077 kaj inhibitoro de la BACE1-peptido konjugaciita al SA kaŭzis signifan malkreskon en Abeta40 en la cerboespina fluido (Fig. 4c).La datumoj montras, ke peptido ne.2077 povas transporti la 60 kDa SA proteinon en la CNS kaj ankaŭ induktas farmakologiajn efikojn kun SA-konjugaciitaj inhibidores de la BACE1-peptido.
(a) Klona injekto (2 × 10 fagoj/besto) de T7-fago montranta longperspektivajn farmakokinetikajn profilojn de CSF-peptido numero 2077 (RLSSVDSDLSGC) kaj neinjektita kontrolfago (numero 1779) en almenaŭ tri CM-intubitaj ratoj.(b) Konfokusa mikroskopa bildo de reprezentaj kortikalaj mikroŝipoj en fago-injektitaj ratoj (2 × 10 10 fagoj/besto) montrante kontraŭmakuladon de peptido numero 2077 kaj vazojn (lektino).Ĉi tiuj fagklonoj estis administritaj al 3 ratoj kaj permesitaj cirkuli dum 1 horo antaŭ trafluo.Cerboj estis sekcigitaj kaj makulitaj kun policlonaj FITC-etikeditaj antikorpoj kontraŭ la T7-fagkapsido.Dek minutojn antaŭ perfuzo kaj posta fiksado, DyLight594-etikedita lektino estis administrita intravejne.Fluoreskaj bildoj montrantaj lektinmakuladon (ruĝa) de la luminala flanko de mikrovasoj kaj fagoj (verdaj) en la lumeno de kapilaroj kaj perivaskula cerba histo.La skalstango egalrilatas al 10 µm.(c, d) Biotinilata BACE1-inhiba peptido sole aŭ en kombinaĵo kun biotinilata transitpeptido #2077 estis kunligita al streptavidin sekvita per intravejna injekto de almenaŭ tri kanulitaj CM-ratoj (10 mg streptavidin/kg).BACE1-peptida inhibitor-mediaciita redukto en Aβ40 estis mezurita per Aβ1-40 ELISA en sango (ruĝa) kaj cerbo-spina likvaĵo (oranĝa) ĉe la indikitaj tempopunktoj.Por pli bona klareco, punktita linio estas desegnita sur la grafeo je skalo de 100%.(c) Procenta redukto en Aβ40 en sango (ruĝaj trianguloj) kaj cerbo-spina likvaĵo (oranĝaj trianguloj) en ratoj traktitaj kun streptavidin konjugaciita al transita peptido #2077 kaj BACE1-inhiba peptido en proporcio 3:1.(d) Procenta redukto en sango Aβ40 (ruĝaj cirkloj) kaj cerbo-spina likvaĵo (oranĝaj cirkloj) de ratoj traktitaj kun streptavidin kunligita al BACE1-inhiba peptido nur.La koncentriĝo de Aβ en la kontrolo estis 420 pg/ml (norma devio = 101 pg/ml).
Phage-ekrano estis sukcese aplikata en pluraj areoj de biomedicina esplorado17.Ĉi tiu metodo estis uzata por envivaj vaskulaj diversecaj studoj18,19 kaj ankaŭ por studoj celantaj cerbajn angiojn20,21,22,23,24,25,26.En ĉi tiu studo, ni etendis la aplikon de ĉi tiu elekta metodo ne nur al la rekta identigo de peptidoj celantaj cerbajn vaskulojn, sed ankaŭ al la malkovro de kandidatoj kun aktivaj transportaj propraĵoj por transiri la sango-cerban baron.Ni nun priskribas la evoluon de enviva elekta proceduro en CM-intubitaj ratoj kaj pruvas ĝian eblon identigi peptidojn kun CSF-relokaj propraĵoj.Uzante la T7-fago montranta bibliotekon de 12-mer hazardaj peptidoj, ni povis pruvi, ke la T7-fago estas sufiĉe malgranda (ĉirkaŭ 60 nm en diametro)10 por esti adaptita al la sango-cerba baro, tiel rekte transirante la sango-cerban baron aŭ koridan plekson.Ni observis, ke CSF-rikoltlaboro de kanuligitaj CM-ratoj estis bone kontrolita en vivo funkcia kribra metodo, kaj ke la ĉerpita fago ne nur ligita al la vaskulaturo sed ankaŭ funkciis kiel transportilo trans la sango-cerba baro.Krome, samtempe kolektante sangon kaj aplikante HTS al CSF kaj sangodevenaj fagoj, ni konfirmis, ke nia elekto de CSF ne estis influita de sangoriĉigo aŭ taŭgeco por ekspansio inter vicoj de elekto.Tamen, la sangosekcio estas parto de la elektoproceduro, ĉar fagoj kapablaj atingi la CSF-sekcion devas pluvivi kaj cirkuli en la sangocirkulado sufiĉe longe por riĉigi sin en la cerbo.Por ĉerpi fidindajn sinsekvajn informojn de krudaj HTS-datumoj, ni efektivigis filtrilojn adaptitajn al platform-specifaj sekvencaj eraroj en la analiza laborfluo.Enkorpigante kinetikajn parametrojn en la ekzamenan metodon, ni konfirmis la rapidan farmacokinetikon de sovaĝaj T7-fagoj (t½ ~ 28 min) en sango24, 27, 28 kaj ankaŭ determinis ilian duoniĝotempon en cerbo-spina likvaĵo (t½ ~ 26 min) je minuto).Malgraŭ similaj farmakokinetaj profiloj en sango kaj CSF, nur 0.001% de la sangokoncentriĝo de fago povus esti detektitaj en CSF, indikante malaltan fonan moviĝeblon de sovaĝ-speca T7-fago trans la sango-cerba bariero.Ĉi tiu laboro elstarigas la gravecon de la unua raŭndo de selektado dum uzado de en-vivaj panoraj strategioj, precipe por fagsistemoj kiuj estas rapide malbaritaj de la cirkulado, ĉar malmultaj klonoj povas atingi la CNS-kupeon.Tiel, en la unua raŭndo, la redukto en biblioteka diverseco estis tre granda, ĉar nur limigita nombro da klonoj estis poste kolektita en tiu tre strikta CSF-modelo.Ĉi tiu en viva panorama strategio inkludis plurajn elektajn paŝojn kiel aktivan amasiĝon en la CSF-sekcio, klonan postvivadon en la sangosekcio kaj rapidan forigon de T7-fagklonoj de la sango ene de la unuaj 10 minutoj (Fig. 1d kaj Suplementa Fig. 4M).).Tiel, post la unua raŭndo, malsamaj fagklonoj estis identigitaj en CSF, kvankam la sama komenca naĝejo estis uzita por individuaj bestoj.Tio indikas ke multoblaj striktaj selektpaŝoj por fontbibliotekoj kun nombregoj de bibliotekmembroj rezultigas signifan redukton en diverseco.Tial hazardaj eventoj fariĝos integra parto de la komenca elektoprocezo, tre influante la rezulton.Estas verŝajne ke multaj el la klonoj en la origina biblioteko havis tre similan CSF-riĉigan tendencon.Tamen, eĉ sub la samaj eksperimentaj kondiĉoj, selektadrezultoj povas malsami pro la malmulto de ĉiu speciala klono en la komenca naĝejo.
La ĉeftemoj riĉigitaj en CSF diferencas de tiuj en la sango.Interese, ni rimarkis la unuan ŝanĝon al glicina-riĉaj peptidoj en la sango de individuaj bestoj.(Fig. 1g, Suplementaj Fig. 4e, 4f).Fago enhavanta glicinajn peptidojn povas esti pli stabilaj kaj malpli verŝajne esti prenitaj el cirkulado.Tamen, ĉi tiuj glicin-riĉaj peptidoj ne estis detektitaj en la specimenoj de cerbo-spina likvaĵo, sugestante ke la vikariitaj bibliotekoj trapasis du malsamajn elektajn paŝojn: unu en la sango kaj alia permesita akumuliĝi en la cerbo-spina likvaĵo.CSF-riĉigitaj klonoj rezultiĝantaj el la kvara raŭndo de selektado estis grandskale testitaj.Preskaŭ ĉiuj el la individue testitaj klonoj estis konfirmitaj esti riĉigitaj en CSF kompare kun malplena kontrolfago.Unu peptida sukceso (#2077) estis ekzamenita pli detale.Ĝi montris pli longan plasman duoniĝotempon kompare kun aliaj sukcesoj (Figuro 3d kaj Suplementa Figuro 7), kaj interese, ĉi tiu peptido enhavis cisteinan restaĵon ĉe la C-finaĵo.Lastatempe montriĝis, ke la aldono de cisteino al peptidoj povas plibonigi iliajn farmakokinetikajn ecojn per ligado al albumino 29 .Ĉi tio estas nuntempe nekonata por peptido #2077 kaj postulas plian studon.Kelkaj peptidoj montris valent-dependecon en CSF-riĉigo (datenoj ne montritaj), kiu povas esti rilatita al la montrita surfacgeometrio de la T7-kapsido.La T7-sistemo, kiun ni uzis, montris 5-15 kopiojn de ĉiu peptido per faga partiklo.IHC estis farita sur kandidatoj plumbofagaj klonoj injektitaj intravejne en la cerba kortekso de ratoj (Suplementa Fig. 8).La datumoj montris, ke almenaŭ tri klonoj (n-ro 2002, n-ro 2009 kaj n-ro 2077) interagis kun la BBB.Restas determini ĉu tiu BBB-interagado rezultigas la amasiĝon de CSF aŭ la movadon de tiuj klonoj rekte al la BCSFB.Grave, ni montras, ke la elektitaj peptidoj retenas sian transportkapaciton de CSF kiam ili estas sintezitaj kaj ligitaj al la proteina kargo.Ligado de N-finaj biotinilaj peptidoj al SA esence ripetas la rezultojn akiritajn per siaj respektivaj fagklonoj en sango kaj cerbo-spina fluido (Fig. 3e).Fine, ni montras, ke plumba peptido #2077 kapablas antaŭenigi la cerban agon de biotinilata peptida inhibitoro de BACE1 konjugita al SA, kaŭzante prononcitajn farmacodinamiajn efikojn en la CNS signife reduktante Abeta40-nivelojn en CSF (Fig. 4).Ni ne povis identigi iujn ajn homologojn en la datumbazo farante peptidan sekvencon-homologioserĉon de ĉiuj sukcesoj.Gravas noti, ke la grandeco de la T7-biblioteko estas proksimume 109, dum la teoria biblioteka grandeco por 12-mers estas 4 x 1015. Tial ni elektis nur malgrandan frakcion de la diversecspaco de la 12-mer-peptidbiblioteko, kio povas signifi, ke pli optimumigitaj peptidoj povas esti identigitaj per taksado de la apuda sukcessekva spaco de ĉi tiuj identigitaj sekvencospaco.Hipoteze, unu el la kialoj kial ni ne trovis iujn ajn naturajn homologojn de tiuj peptidoj povas esti malselektado dum evoluo por malhelpi la nekontrolitan eniron de certaj peptidĉeftemoj en la cerbon.
Kunigitaj, niaj rezultoj provizas bazon por estonta laboro por identigi kaj karakterizi la transportsistemojn de la cerbovaskula baro en vivo pli detale.La baza aranĝo de tiu metodo estas bazita sur funkcia selektadstrategio kiu ne nur identigas klonojn kun cerbaj vaskulaj ligaj trajtoj, sed ankaŭ inkludas kritikan paŝon en kiu sukcesaj klonoj havas internan agadon por transiri biologiajn barierojn en vivo en la CNS-sekcion.estas pliklarigi la mekanismon de transporto de tiuj peptidoj kaj ilian preferon por ligado al la mikrovaskulaturo specifa por la cerba regiono.Tio povas konduki al la eltrovo de novaj padoj por la transporto de la BBB kaj receptoroj.Ni atendas, ke la identigitaj peptidoj povas rekte ligi al cerebrovaskulaj receptoroj aŭ al cirkulantaj Perantoj transportitaj tra la BBB aŭ BCSFB.La peptidvektoroj kun CSF-transporta agado malkovritaj en ĉi tiu laboro estos plu esploritaj.Ni nuntempe esploras la cerban specifecon de ĉi tiuj peptidoj por ilia kapablo transiri la BBB kaj/aŭ BCSFB.Ĉi tiuj novaj peptidoj estos ekstreme valoraj iloj por la ebla malkovro de novaj riceviloj aŭ vojoj kaj por la disvolviĝo de novaj tre efikaj platformoj por livero de makromolekuloj, kiel biologiaj, al la cerbo.
Kanulu la grandan cisternon (CM) uzante modifon de la antaŭe priskribita metodo.Anestezigitaj Wistar-ratoj (200-350 g) estis muntitaj sur stereotaksa aparato kaj meza incizo estis farita super la razita kaj asepsie preta skalpo por elmontri la kranion.Boru du truojn en la areo de la supra skarpo kaj fiksu la fiksajn ŝraŭbojn en la truojn.Plia truo estis borita en la laterala okcipitala spino por stereotaksa gvidado de rustorezistaŝtala kanulo en la CM.Apliku dentan cementon ĉirkaŭ la kanulo kaj sekurigu per ŝraŭboj.Post fotokuracado kaj cemento-malmoliĝo, la haŭtvundo estis fermita per 4/0 suprameza suturo.Ĝusta lokigo de la kanulo estas konfirmita per spontanea elfluo de cerbo-spina likvaĵo (CSF).Forigu la raton el la stereotaksa aparato, ricevu taŭgan postoperacian prizorgon kaj doloro-administradon, kaj lasu ĝin resaniĝi dum almenaŭ unu semajno ĝis signoj de sango estas observataj en la cerbo-spina likvaĵo.Wistar-ratoj (Crl:WI/Han) estis akiritaj de Karla Rivero (Francio).Ĉiuj ratoj estis konservitaj sub specifaj senpatogenaj kondiĉoj.Ĉiuj bestaj eksperimentoj estis aprobitaj de la Veterinara Oficejo de la Urbo de Bazelo, Svislando, kaj estis faritaj laŭ Besta Licenco n-ro 2474 (Taksado de Aktiva Cerba Transporto per Mezurado de Niveloj de Terapiaj Kandidatoj en la Cerebrospina Fluido kaj Cerbo de Rato).
Milde tenu la raton konscia kun la CM-kanulo en la mano.Forigu Daturan de la kanulo kaj kolektu 10 µl da spontanee fluanta cerbo-spina likvaĵo.Ĉar la pervimeco de la kanulo estis finfine endanĝerigita, nur klaraj cerbospinaj fluidaj specimenoj kun neniuj signoj de sangopoluado aŭ senkoloriĝo estis inkluditaj en ĉi tiu studo.Paralele, proksimume 10-20 μl da sango estis prenitaj de malgranda incizo ĉe la pinto de la vosto en tubojn kun heparino (Sigma-Aldrich).CSF kaj sango estis kolektitaj ĉe diversaj tempopunktoj post intravejna injekto de T7-fago.Proksimume 5-10 μl da likvaĵo estis forĵetitaj antaŭ ol ĉiu CSF-provaĵo estis kolektita, kio respondas al la morta volumeno de la katetero.
Bibliotekoj estis generitaj uzante la T7Select 10-3b vektoron kiel priskribite en la T7Select sistemmanlibro (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Nelonge, hazarda 12-mer DNA-enigaĵo estis sintezita en la sekva formato:
La NNK-kodono estis uzita por eviti duoblajn haltkodonojn kaj aminoacidtroesprimon en la enigaĵo.N estas mane miksita ekvimolara rilatumo de ĉiu nukleotido, kaj K estas mane miksita ekvimolara rilatumo de adenino kaj citozinnukleotidoj.Unu-senhelpaj regionoj estis konvertitaj al duoble senhelpa DNA per plia kovado kun dNTP (Novagen) kaj Klenow-enzimo (New England Biolabs) en Klenow-bufro (New England Biolabs) dum 3 horoj je 37 °C.Post la reago, duoble-fadena DNA estis reakirita per EtOH-pluvo.La rezulta DNA estis digestita kun restriktaj enzimoj EcoRI kaj HindIII (ambaŭ de Roche).La fendita kaj purigita (QIAquick, Qiagen) enigaĵo (T4-ligazo, New England Biolabs) tiam estis ligita en-kadro en antaŭ-fenditan T7-vektoron post aminoacido 348 de la 10B kapsidgeno.Ligadaj reagoj estis kovataj je 16° C dum 18 horoj antaŭ envitra pakado.Fagpakado en vitro estis farita laŭ la instrukcioj liveritaj kun la T7Select 10-3b-klona ilaro (Novagen) kaj la paka solvo estis plifortigita unufoje al lizo uzante Escherichia coli (BLT5615, Novagen).La lisatoj estis centrifugataj, titolitaj kaj frostigitaj je -80° C kiel proviza solvaĵo de glicerolo.
Rekta PCR-plifortigo de fagaj variaj regionoj plifortigitaj en buljono aŭ telero uzanta proprietajn 454/Roche-amplikon-fuziajn enkondukojn.La antaŭa kunfanda enkonduko enhavas sekvencojn laŭflankantajn la varian regionon (NNK) 12 (ŝablo-specifa), GS FLX Titanium Adapter A, kaj kvar-bazan bibliotekan ŝlosilsekvencon (TCAG) (Suplementa Bildo 1a):
La inversa fuzia enkonduko ankaŭ enhavas biotinon ligitan por kapti bidojn kaj la GS FLX Titanian Adapter B necesan por klona plifortigo dum emulsia PCR:
La amplikonoj tiam estis submetitaj al 454/Roche-pirosekvencado laŭ la 454 GS-FLX Titanium-protokolo.Por mana Sanger-sekvencado (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA-Analizilo), T7-fago-DNA estis plifortigita per PCR kaj sekvencita kun la sekvaj amorparoj:
Enigaĵoj de individuaj plakoj estis submetitaj al PCR-plifortigo uzante la Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (laŭ la instrukcioj de la produktanto).Faru varman ekfunkciigon (10 min je 95 °C) kaj 35 akcelciklojn (50 s je 95 °C, 1 min je 50 °C, kaj 1 min je 72 °C).
Fago de bibliotekoj, sovaĝa fago, fago savitaj de CSF kaj sango, aŭ individuaj klonoj estis plifortigitaj en Escherichia coli BL5615 en TB-buljono (Sigma Aldrich) aŭ en 500 cm2 pladoj (Thermo Scientific) dum 4 h je 37 °C.Fagoj estis ĉerpitaj de la platoj lavante la platojn kun Tris-EDTA-bufro (Fluka Analytical) aŭ kolektante la plakojn per sterilaj pipetpintoj.Fagoj estis izolitaj de kultura supernatant aŭ ekstrakta bufro kun unu rondo de polietilenglikolo (PEG 8000) precipitaĵo (Promega) kaj resuspenditaj en Tris-EDTA bufro.
La plifortigita fago estis submetita al 2-3 raŭndooj de endotoksina forigo uzante endotoksinforigajn bidojn (Miltenyi Biotec) antaŭ intravejna (IV) injekto (500 μl/besto).En la unua raŭndo, 2×1012 fagoj estis lanĉitaj;en la dua, 2×1010 fagoj;en la tria kaj kvara selektado preterpasas, 2×109 fagoj per besto.Fagenhavo en CSF kaj sangospecimenoj kolektitaj ĉe la indikitaj tempopunktoj estis determinita per plakkalkulado laŭ la instrukcioj de la fabrikanto (T7Select-sistemo-manlibro).Fago-selektado estis farita per intravejna injekto de purigitaj bibliotekoj en la vostvejnon aŭ per re-injekto de fago ĉerpita el CSF de la antaŭa selekta rondo, kaj postaj rikoltoj estis faritaj je 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, kaj 240 min CSF kaj sangospecimenoj respektive.Entute kvar raŭndoj de en-viva panorado estis farita en kiuj la du elektitaj branĉoj estis aparte stokitaj kaj analizitaj dum la unuaj tri raŭndoj de selektado.Ĉiuj fagaj enigaĵoj eltiritaj de CSF de la unuaj du raŭndoj de selektado estis submetitaj al 454/Roche-pirosekvencado, dum ĉiuj klonoj eltiritaj de CSF de la lastaj du raŭndoj de selektado estis mane sekvencitaj.Ĉiuj sangofagoj de la unua raŭndo de selektado ankaŭ estis submetitaj al 454/Roche-pirosekvencado.Por injekto de fagoklonoj, elektitaj fagoj estis plifortigitaj en E. coli (BL5615) sur 500 cm2 teleroj je 37 °C dum 4 horoj.Individue elektitaj kaj mane sekvencitaj klonoj estis disvastigitaj en TB-medio.Post fago-ekstraktado, purigo kaj forigo de endotoksino (kiel priskribite supre), 2×1010 fagoj/besto en 300 μl estis injektitaj intravejne en unu vostovejnon.
Antaŭprilaborado kaj kvalita filtrado de sekvencdatenoj.Krudaj 454/Roche-datenoj estis konvertitaj de binara norma fluo-mapformato (sff) al Pearson homlegebla formato (fasta) uzante vendistan softvaron.Plia pretigo de la nukleotidsekvenco estis farita uzante proprietajn C-programojn kaj manuskriptojn (nepublikigita programarpakaĵo) kiel priskribite malsupre.La analizo de primaraj datumoj inkluzivas striktajn plurstadiajn filtrajn procedurojn.Por filtri legaĵojn kiuj ne enhavis validan 12mer-enigaĵan DNA-sekvencon, la legaĵoj estis sinsekve vicigitaj por komenci etikedon (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), haltetikedon (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) kaj fonenigaĵon (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) uzante la tutmondan Needleman-teston.paraleligo permesante ĝis 2 nekonsekvencojn per paraleligo31.Tial, legaĵoj sen startaj kaj haltaj etikedoj kaj legaĵoj enhavantaj fonajn enmetojn, t.e., alineojn kiuj superas la permesitan nombron da miskongruoj, estis forigitaj el la biblioteko.Koncerne la ceterajn legadojn, la N-mer DNA-sekvenco etendiĝanta de la komenca marko kaj finiĝanta antaŭ la haltmarko estis eltranĉita de la origina legita sekvenco kaj plue prilaborita (ĉi-poste referita kiel "enigaĵo").Post traduko de la enigaĵo, la parto post la unua haltkodono ĉe la 5′ fino de la enigaĵo estas forigita de la enigaĵo.Krome, nukleotidoj kondukantaj al nekompletaj kodonoj ĉe la 3′ fino de la enkonduko ankaŭ estis forigitaj.Por ekskludi enigaĵojn enhavantajn nur fonsekvencojn, tradukitaj enigaĵoj komencantaj kun la aminoacidpadrono "PAG" ankaŭ estis forigitaj.Peptidoj kun post-traduka longo de malpli ol 3 aminoacidoj estis forigitaj de la biblioteko.Fine, forigu redundon en la enmetaĵa naĝejo kaj determini la oftecon de ĉiu unika enmetaĵo.La rezultoj de ĉi tiu analizo inkludis liston de nukleotidaj sekvencoj (enigaĵoj) kaj iliaj (legitaj) frekvencoj (Suplementaj Figuroj 1c kaj 2).
Grupo N-mer DNA-enigaĵoj laŭ sekvencsimileco: Por elimini 454/Roche-specifajn sekvencerarojn (kiel ekzemple problemoj kun sekvencado de homopolimer-etendaĵoj) kaj forigi malpli gravajn redundojn, antaŭe filtritaj N-mer DNA-sekvenenigaĵoj (enigaĵoj) estas ordigitaj laŭ simileco.enmetoj (ĝis 2 ne-kongruaj bazoj permesitaj) uzante ripetan algoritmon difinitan jene: enmetoj estas ordigitaj unue laŭ sia frekvenco (plej alta ĝis plej malsupra), kaj se ili estas la samaj, laŭ sia sekundara ordigo laŭ longo (plej longa ĝis plej mallonga) ).Tiel, la plej oftaj kaj plej longaj enmetoj difinas la unuan "grupon".La grupfrekvenco estas agordita al la ŝlosila frekvenco.Tiam, ĉiu enmeto restanta en la ordigita listo estis provita esti aldonita al la grupo per duopa Needleman-Wunsch vicigo.Se la nombro da miskongruoj, enmetoj aŭ forigoj en paraleligo ne superas sojlon de 2, enmeto estas aldonita al la grupo, kaj la totala grupfrekvenco estas pliigita per kiom ofte la enmeto estis aldonita.Enigaĵoj aldonitaj al grupo estas markitaj kiel uzataj kaj ekskluditaj de plua prilaborado.Se la enmetsekvenco ne povas esti aldonita al jam ekzistanta grupo, la enmetsekvenco estas uzata por krei novan grupon kun la taŭga enmetofteco kaj markita kiel uzata.La ripeto finiĝas kiam ĉiu enmetsekvenco aŭ estis uzita por formi novan grupon aŭ povas esti inkludita en jam ekzistanta grupo.Post ĉio, grupigitaj enigaĵoj konsistantaj el nukleotidoj estas poste tradukitaj en peptidsekvencojn (peptidbibliotekoj).La rezulto de ĉi tiu analizo estas aro de enmetoj kaj iliaj respondaj frekvencoj, kiuj konsistigas la nombron da sinsekvaj legadoj (Suplementa Fig. 2).
Motiva Generacio: Surbaze de listo de unikaj peptidoj, biblioteko estis kreita enhavanta ĉiujn eblajn aminoacidajn ŝablonojn (aa) kiel montrite sube.Ĉiu ebla ŝablono de longo 3 estis ĉerpita de la peptido kaj ĝia inversa ŝablono estis aldonita kune kun komuna ĉeftema biblioteko enhavanta ĉiujn ŝablonojn (tripeptidoj).Bibliotekoj de tre ripetemaj ĉeftemoj estis sekvencitaj kaj redundo forigita.Tiam, por ĉiu tripeptido en la ĉefbiblioteko, ni kontrolis ĝian ĉeeston en la biblioteko uzante komputilajn ilojn.En ĉi tiu kazo, la ofteco de la peptido enhavanta la trovitan ĉeftemotripeptidon estas aldonita kaj asignita al la ĉeftemo en la ĉeftema biblioteko ("nombro da ĉeftemoj").La rezulto de ĉeftemogeneracio estas dudimensia aro enhavanta ĉiujn okazojn de tripeptidoj (motivoj) kaj iliaj respektivaj valoroj, kiuj estas la nombro da sekvencaj legadoj kiuj rezultigas la ekvivalentan ĉeftemon kiam la legaĵoj estas filtritaj, grupigitaj kaj tradukitaj.Metriko kiel priskribite detale supre.
Normaligo de la nombro da ĉeftemoj kaj ekvivalentaj disvastigoj: La nombro da ĉeftemoj por ĉiu provaĵo estis normaligita uzante
kie ni estas la nombro da legoj enhavantaj temon i.Tiel, vi reprezentas la procentofrekvencon de legaĵoj (aŭ peptidoj) enhavantaj ĉeftemon i en la provaĵo.P-valoroj por la ne-normaligita nombro da motivoj estis kalkulitaj per la preciza testo de Fisher.Koncerne korelagramojn de la nombro da motivoj, la korelacioj de Spearman estis kalkulitaj uzante la normaligitan nombron da motivoj kun R.
Por bildigi la enhavon de aminoacidoj ĉe ĉiu pozicio en la peptidbiblioteko, retaj logogramoj 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) estis kreitaj.Unue, la enhavo de aminoacidoj ĉe ĉiu pozicio de la 12-mer-peptido estas stokita en 20×12 matrico.Tiam, aro de 1000 peptidoj enhavantaj la saman relativan enhavon de aminoacido ĉe ĉiu pozicio estas generita en fasta-sekva formato kaj disponigita kiel enigo al retlogo 3, kiu generas grafikan reprezentadon de la relativa aminoacidenhavo ĉe ĉiu pozicio.por donita peptidbiblioteko.Por bildigi plurdimensiajn datenojn, varmomapoj estis kreitaj uzante interne evoluigitan ilon en R (biosHeatmap, ankoraŭ-al-esti-liberigita R-pakaĵo).La dendrogramoj prezentitaj en la varmomapoj estis kalkulitaj uzante la hierarkian grupigmetodon de Ward kun la eŭklida distancmetriko.Por statistika analizo de motivo-poentado-datenoj, P-valoroj por nenormaligita poentado estis kalkulitaj per la preciza testo de Fisher.P-valoroj por aliaj datenoj estis kalkulitaj en R uzante la t-teston de Studento aŭ ANOVA.
Elektitaj fagklonoj kaj fagoj sen enigaĵoj estis injektitaj intravejne per la vostvejno (2 × 1010 fagoj/besto en 300 μl PBS).Dek minutojn antaŭ perfuzo kaj posta fiksado, la samaj bestoj estis intravejne injektitaj per 100 μl da DyLight594-etikedita lektino (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minutojn post faga injekto, ratoj estis trapenetritaj tra la koro kun 50 ml PBS sekvita de 50 ml 4% PFA/PBS.Cerbaj specimenoj estis aldone fiksitaj dum la nokto en 4% PFA/PBS kaj trempitaj en 30% sakarozo dum la nokto je 4 °C.Provaĵoj estas fulmfrostigitaj en la OCT-miksaĵo.Imunhistokemia analizo de frostaj provaĵoj estis farita ĉe ĉambra temperaturo sur 30 µm krioseekcioj blokitaj kun 1% BSA kaj kovataj kun policlonaj FITC-etikeditaj antikorpoj kontraŭ T7-fago (Novus NB 600-376A) je 4 °C.Kovu dum la nokto.Fine, la sekcioj estis lavitaj 3 fojojn per PBS kaj ekzamenitaj per konfokusa lasera mikroskopo (Leica TCS SP5).
Ĉiuj peptidoj kun minimuma pureco de 98% estis sintezitaj de GenScript USA, biotinilate kaj liofiligitaj.Biotino estas ligita per kroma triobla glicina interspacigilo ĉe la N-finaĵo.Kontrolu ĉiujn peptidojn uzante mas-spektrometrion.
Streptavidin (Sigma S0677) estis miksita kun 5-obla ekvimola troo de biotinilata peptido, biotinilata BACE1-inhiba peptido, aŭ kombinaĵo (3:1-proporcio) de biotinilata BACE1-inhiba peptido kaj BACE1-inhiba peptido en 5-10% DMSO/inkubata en PBS.1 horo ĉe ĉambra temperaturo antaŭ injekto.Streptavidin-konjugaciitaj peptidoj estis injektitaj intravejne kun dozo de 10 mg/kg en unu el la vostovejnoj de ratoj kun cerba kavo.
La koncentriĝo de streptavidin-peptidaj kompleksoj estis taksita per ELISA.Nunc Maxisorp-mikrotiterplatoj (Sigma) estis kovritaj dum la nokto je 4 °C per 1.5 μg/ml musa kontraŭ-streptavidina antikorpo (Thermo, MA1-20011).Post blokado (blokado-bufro: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelateno, 1% BSA) ĉe ĉambra temperaturo dum 2 horoj, lavu la teleron per 0.05% Tween-20/PBS (lavbufro) dum 3 sekundoj, CSF kaj plasmo-bufroj estis aldonitaj al bone blokaj specimenoj: CSF 1:115).La telero tiam estis kovita dum la nokto je 4 °C kun detekta antikorpo (1 μg/ml, kontraŭ-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Post tri lavaj paŝoj, streptavidino estis detektita per kovado en TMB-substrata solvo (Roche) dum ĝis 20 minutoj.Post ĉesigo de kolordisvolviĝo kun 1M H2SO4, mezuru la absorbadon ĉe 450 nm.
La funkcio de la komplekso de inhibitoro de streptavidin-peptido-BACE1 estis taksita de Aβ(1-40) ELISA laŭ la protokolo de la fabrikanto (Wako, 294-64701).Mallonge, CSF-provaĵoj estis diluitaj en norma diluaĵo (1:23) kaj kovataj dum la nokto je 4 °C en 96-putetaj platoj kovritaj per BNT77-kapta antikorpo.Post kvin lavaj ŝtupoj, HRP-konjugaciita BA27-antikorpo estis aldonita kaj kovita dum 2 horoj je 4°C, sekvita de kvin lavado-ŝtupoj.Aβ(1-40) estis detektita per kovado en TMB-solvo dum 30 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Post kiam kolordisvolviĝo estas ĉesigita kun halta solvo, mezuru la absorbadon je 450 nm.Plasmaj specimenoj estis submetitaj al solidfaza eltiro antaŭ Aβ(1-40) ELISA.Plasmo estis aldonita al 0.2% DEA (Sigma) en 96-putetaj teleroj kaj kovita ĉe ĉambra temperaturo dum 30 minutoj.Post sinsekve lavi la SPE-platojn (Oazo, 186000679) kun akvo kaj 100% metanolo, plasmaj specimenoj estis aldonitaj al la SPE-platoj kaj ĉio likvaĵo estis forigita.Provaĵoj estis lavitaj (unue kun 5% metanolo poste 30% metanolo) kaj eluitaj kun 2% NH4OH/90% metanolo.Post sekigado de la eluato je 55 °C dum 99 minutoj ĉe konstanta N2-fluo, la specimenoj estis reduktitaj en normaj diluaĵoj kaj Aβ (1-40) estis mezurita kiel priskribite supre.
Kiel citi ĉi tiun artikolon: Urich, E. et al.Kargolivero al la cerbo uzante transitpeptidojn identigitajn en vivo.la scienco.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB kaj Moos T. Livero de makromolekulaj medikamentoj al la cerbo uzante laŭcelan terapion.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., kaj Martinez-Martinez, P. Livero de peptidaj kaj proteinmedikamentoj trans la sango-cerba baro.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM La sango-cerba baro: proplemkolo en cerba drogo-evoluo.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, kaj Byrd, A. Perspektivoj por plibonigita droglivero kaj celado al la cerbo per la korida plekso-CSF-pado.Farmacia Esplorado 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernigo de biofarmaciaĵoj kun molekulaj trojaj ĉevaloj por cerba livero.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptor-mediaciita peptidtransporto trans la sango-cerba baro.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Pliigi cerban penetron kaj efikecon de terapiaj antikorpoj uzante monovalentajn molekulajn navedojn.Neŭrono 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrin-receptoro (TfR) transporto determinas cerban asimiladon de afinecvariaĵoj de TfR-antikorpoj.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).