Dankon pro via vizito al Nature.com. Vi uzas retumilan version kun limigita CSS-subteno. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Montras karuselon de tri lumbildoj samtempe. Uzu la butonojn Antaŭa kaj Sekva por moviĝi tra tri lumbildoj samtempe, aŭ uzu la butonojn de la ŝovilo ĉe la fino por moviĝi tra tri lumbildoj samtempe.
La sango-cerba bariero kaj la sango-cerba bariero malhelpas bioterapiajn agentojn atingi siajn celojn en la centra nerva sistemo, tiel malhelpante efikan traktadon de neŭrologiaj malsanoj. Por malkovri novajn cerbotransportilojn in vivo, ni enkondukis T7-fagan peptidbibliotekon kaj serie kolektis sangon kaj cerbo-spinan likvaĵon (CSL) uzante kanulitan konscian grandan aromodelon de ratoj. Specifaj fagoklonoj estis tre riĉigitaj en CSL post kvar rondoj de selektado. Testado de individuaj kandidatpeptidoj rivelis pli ol 1000-oblan riĉiĝon en CSL. La bioaktiveco de la peptid-mediaciita liverado al la cerbo estis konfirmita per 40% redukto en la nivelo de amiloido-β en la cerbo-spina likvaĵo uzante BACE1-peptidinhibitoron ligitan al la identigita nova transitpeptido. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke la peptidoj identigitaj per in vivo fagaj selektadmetodoj povus esti utilaj vehikloj por sistema liverado de makromolekuloj al la cerbo kun terapia efiko.
Esplorado pri celita terapio al la centra nerva sistemo (CNS) plejparte fokusiĝis al identigo de optimumaj drogoj kaj agentoj, kiuj montras CNS-celantajn ecojn, kun malpli da peno por malkovri la mekanismojn, kiuj pelas aktivan liveradon de drogoj al la cerbo. Ĉi tio komencas ŝanĝiĝi nun, ĉar la liverado de drogoj, precipe grandaj molekuloj, estas integrita parto de moderna neŭroscienca disvolviĝo de drogoj. La medio de la centra nerva sistemo estas bone protektita de la cerbovaskula barilsistemo, konsistanta el la sango-cerba bariero (BBB) ​​kaj la sango-cerba bariero (BCBB)1, kio malfaciligas la liveron de drogoj al la cerbo1,2. Oni taksas, ke preskaŭ ĉiuj grandmolekulaj drogoj kaj pli ol 98% de malgrandmolekulaj drogoj estas forigitaj el la cerbo3. Tial estas tre grave identigi novajn cerbajn transportsistemojn, kiuj provizas efikan kaj specifan liveradon de terapiaj drogoj al la CNS4,5. Tamen, la BBB kaj BCSFB ankaŭ prezentas bonegan ŝancon por drogliverado, ĉar ili penetras kaj eniras ĉiujn strukturojn de la cerbo tra ĝia ampleksa angiaro. Tiel, la nunaj klopodoj uzi neinvaziajn metodojn de liverado al la cerbo estas plejparte bazitaj sur la mekanismo de receptor-mediaciita transporto (PMT) uzante la endogenan BBB6-receptoron. Malgraŭ lastatempaj ŝlosilaj progresoj uzante la transferinan receptoran vojon7,8, plua disvolviĝo de novaj liveraj sistemoj kun plibonigitaj ecoj estas necesa. Por ĉi tiu celo, nia celo estis identigi peptidojn kapablajn mediacii CSF-transporton, ĉar ili principe povus esti uzataj por liveri makromolekulojn al la CNS aŭ por malfermi novajn receptorajn vojojn. Aparte, specifaj receptoroj kaj transportiloj de la cerbovaskula sistemo (BBB kaj BSCFB) povas servi kiel eblaj celoj por la aktiva kaj specifa liverado de bioterapiaj drogoj. Cerbo-spina likvaĵo (CSF) estas sekrecia produkto de la koroida plekso (CS) kaj estas en rekta kontakto kun la interstica likvaĵo de la cerbo tra la subaraknoida spaco kaj ventrikla spaco4. Lastatempe estis montrite, ke subaraknoida cerbo-spina likvaĵo troe difuzas en la intersticon de la cerbo9. Ni esperas atingi la parenkiman spacon uzante ĉi tiun subaraknoidan enfluan vojon aŭ rekte tra la BBB. Por atingi tion, ni efektivigis fortikan strategion por elekti fagojn en vivo, kiu ideale identigas peptidojn transportitajn per ambaŭ ĉi tiuj du apartaj vojoj.
Ni nun priskribas sinsekvan en vivan fago-ekranan rastrummetodon kun cerbo-spina likvaĵo (CSF) kunligita kun alt-traira sekvencado (HTS) por monitori komencajn selektorandojn kun la plej alta biblioteka diverseco. Rastrumo estis farita sur konsciaj ratoj per permanente enplantita granda cisterna (CM) kanulo por eviti sangopoluadon. Grave, ĉi tiu aliro selektas kaj cerbo-celajn kaj peptidojn kun transportagado trans la cerbovaskulan baron. Ni uzis T7-fagojn pro ilia eta grandeco (~60 nm)10 kaj sugestis, ke ili taŭgas por la transporto de vezikoj, kiuj permesas transĉelan transiron de la endotela kaj/aŭ epiteli-medola baro. Post kvar raŭndoj de filtrado, fago-populacioj estis izolitaj, montrante fortan en vivan CSF-riĉigon kaj cerban mikrovaskulan asociiĝon. Grave, ni povis konfirmi niajn trovojn montrante, ke la preferataj kaj kemie sintezitaj plej bonaj kandidataj peptidoj kapablas transporti proteinan kargon en la cerbo-spinan likvaĵon. Unue, la farmakodinamikaj efikoj de la centra nerva sistemo (CNS) estis establitaj kombinante ĉefan transitpeptidon kun inhibitoro de la BACE1-peptido. Aldone al montrado, ke en vivo funkciaj rastrumstrategioj povas identigi novajn cerbajn transportpeptidojn kiel efikajn proteinajn kargoportantojn, ni atendas, ke similaj funkciaj selektadmetodoj ankaŭ fariĝos gravaj por identigi novajn cerbajn transportvojojn.
Surbaze de plak-formaj unuoj (PFU), post la pakado de la fago, oni desegnis kaj kreis bibliotekon de hazardaj 12-meraj linearaj T7-fagaj peptidoj kun diverseco de proksimume 109 (vidu Materialojn kaj Metodojn). Gravas noti, ke ni zorge analizis ĉi tiun bibliotekon antaŭ ol en viva paningo. PCR-amplifikado de fagaj bibliotekaj specimenoj uzante modifitajn komencilojn generis amplikonojn, kiuj estis rekte aplikeblaj al HTS (Aldona Figuro 1a). Pro a) eraroj en HTS11-sekvencado, b) efiko sur la kvalito de komenciloj (NNK)1-12, kaj c) la ĉeesto de sovaĝ-tipa (wt) fago (skeletaj enigaĵoj) en la rezerva biblioteko, oni efektivigis sekvencan filtran proceduron por ĉerpi nur konfirmitajn sekvencajn informojn (Aldona Figuro 1b). Ĉi tiuj filtraj paŝoj validas por ĉiuj HTS-sekvencaj bibliotekoj. Por la norma biblioteko, oni akiris entute 233 868 legaĵoj, el kiuj 39% pasis la filtrilajn kriteriojn kaj estis uzitaj por biblioteka analizo kaj selektado por postaj rondoj (Aldona Figuro 1c-e). La legaĵoj estis ĉefe obloj de 3 bazaj paroj laŭ longo kun pinto je 36 nukleotidoj (Aldona Figuro 1c), konfirmante la bibliotekan dezajnon (NNK) 1-12. Rimarkinde, proksimume 11% de la bibliotekaj membroj enhavis 12-dimensian sovaĝ-tipan (wt) ĉefan PAGISRELVDKL-enigaĵon, kaj preskaŭ duono de la sekvencoj (49%) enhavis enigaĵojn aŭ forigojn. La alt-ranga taksado (HTS) de la biblioteka biblioteko konfirmis la altan diversecon de peptidoj en la biblioteko: pli ol 81% de la peptidaj sekvencoj estis trovitaj nur unufoje kaj nur 1.5% okazis en ≥4 kopioj (Aldona Figuro 2a). La frekvencoj de aminoacidoj (aa) ĉe ĉiuj 12 pozicioj en la repertuaro bone korelaciis kun la frekvencoj atenditaj por la nombro de kodonoj generitaj de la degenerita NKK-repertuaro (Aldona Figuro 2b). La observita frekvenco de aa-restaĵoj ĉifritaj de ĉi tiuj enigaĵoj bone korelaciis kun la kalkulita frekvenco (r = 0.893) (Aldona Figuro 2c). La preparado de fagobibliotekoj por injekto inkluzivas la paŝojn de amplifikado kaj forigo de endotoksino. Antaŭe oni montris, ke ĉi tio eble reduktas la diversecon de fagobibliotekoj12,13. Tial, ni sekvencis plat-ampligitan fagobibliotekon, kiu spertis endotoksinan forigon, kaj komparis ĝin kun la originala biblioteko por taksi la oftecon de AA. Forta korelacio (r = 0,995) estis observita inter la originala aro kaj la amplifikita kaj purigita aro (Aldona Figuro 2d), indikante, ke konkurenco inter klonoj amplifikitaj sur platoj uzante T7-fagon ne kaŭzis gravan biason. Ĉi tiu komparo baziĝas sur la ofteco de tripeptidaj motivoj en ĉiu biblioteko, ĉar la diverseco de bibliotekoj (~109) ne povas esti plene kaptita eĉ per HTS. Frekvenca analizo de aa ĉe ĉiu pozicio rivelis malgrandan pozici-dependan biason en la lastaj tri pozicioj de la enigita repertuaro (Aldona Figuro 2e). Konklude, ni konkludis, ke la kvalito kaj diverseco de la biblioteko estis akcepteblaj kaj nur malgrandaj ŝanĝoj en diverseco estis observitaj pro amplifikado kaj preparado de fagobibliotekoj inter pluraj rondoj de selektado.
Seria cerbo-spina fluido-specimenigo povas esti farita per kirurgia enplantado de kanulo en la mamzonon de konsciaj ratoj por faciligi la identigon de T7-fago injektita intravejne (iv) per la BBB kaj/aŭ BCSFB (Fig. 1a-b). Ni uzis du sendependajn selektajn brakojn (brakoj A kaj B) en la unuaj tri raŭndoj de en viva selektado (Fig. 1c). Ni iom post iom pliigis la severecon de la selektado malpliigante la totalan kvanton de fago enkondukita en la unuaj tri raŭndoj de selektado. Por la kvara raŭndo de panelado, ni kombinis specimenojn de branĉoj A kaj B kaj faris tri pliajn sendependajn selektadojn. Por studi la en vivajn ecojn de T7-fagaj partikloj en ĉi tiu modelo, sovaĝ-tipa fago (PAGISRELVDKL-majstra enigaĵo) estis injektita en ratojn per la vostvejno. Reakiro de fagoj el cerbo-spina fluido kaj sango je malsamaj tempopunktoj montris, ke relative malgrandaj T7-dukosahedraj fagoj havis rapidan komencan forigan fazon el la sangosekcio (Aldona Fig. 3). Surbaze de la administritaj titroj kaj la sangovolumeno de la ratoj, ni kalkulis, ke nur proksimume 1% da pez-fago el la administrita dozo estis detektita en la sango 10 minutojn post intravejna injekto. Post ĉi tiu komenca rapida malkresko, pli malrapida primara forigo estis mezurita kun duoniĝotempo de 27.7 minutoj. Grave, nur tre malmultaj fagoj estis prenitaj el la cerbo-spina fako, indikante malaltan fonon por migrado de sovaĝ-tipa fago en la cerbo-spinan likvaĵon (Aldona Figuro 3). Averaĝe, nur proksimume 1 x 10⁻³% da titroj de T7-fago en la sango kaj 4 x 10⁻⁸% de la komence infuzitaj fagoj estis detektitaj en la cerbo-spina likvaĵo dum la tuta prova periodo (0-250 min). Rimarkinde, la duoniĝotempo (25.7 min) de sovaĝ-tipa fago en la cerbo-spina likvaĵo estis simila al tiu observita en sango. Ĉi tiuj datumoj montras, ke la bariero apartiganta la cerbospindan kupeon de la sango estas sendifekta en CM-kanulitaj ratoj, permesante en vivan selektadon de pHaĝbibliotekoj por identigi klonojn, kiuj estas facile transportataj de la sango en la cerbospindan kupeon.
(a) Starigo de metodo por re-specimeni cerbo-spinan likvaĵon (CSL) el granda kvanto. (b) Diagramo montranta la ĉelan lokon de la centra nerva sistemo (CNS) kaj la selektan strategion uzatan por identigi peptidojn, kiuj transiras la sango-cerban barieron (BBB) ​​kaj la sango-cerban barieron. (c) En viva fago-ekzameno-fludiagramo. En ĉiu raŭndo de selektado, fagoj (bestaj identigiloj ene de la sagoj) estis injektitaj intravejne. Du sendependaj alternativaj branĉoj (A, B) estas konservitaj aparte ĝis la 4a raŭndo de selektado. Por selektaj raŭndoj 3 kaj 4, ĉiu fago-klono ekstraktita el CSL estis mane sekvencita. (d) Kinetiko de fago izolita el sango (ruĝaj cirkloj) kaj cerbo-spina likvaĵo (verdaj trianguloj) dum la unua raŭndo de selektado en du kanuligitaj ratoj post intravejna injekto de la T7-peptida biblioteko (2 x 1012 fagoj/besto). Bluaj kvadratoj indikas la mezan komencan koncentriĝon de fago en la sango, kalkulitan el la kvanto de injektita fago, konsiderante la totalan sangovolumenon. La nigraj kvadratoj indikas la intersekciĝon de la y-linio ekstrapolita el sangaj fagaj koncentriĝoj. (e,f) Prezentas la relativan frekvencon kaj distribuon de ĉiuj eblaj interkovrantaj tripeptidaj motivoj trovitaj en la peptido. La nombro da motivoj trovitaj en 1000 legaĵoj estas montrita. Signife (p < 0.001) riĉigitaj motivoj estas markitaj per ruĝaj punktoj. (e) Korelacia dispersa diagramo komparanta la relativan frekvencon de la tripeptida motivo de la injektita biblioteko kun sango-derivita fago de bestoj #1.1 kaj #1.2. (f) Korelacia dispersa diagramo komparanta la relativajn frekvencojn de bestaj fagaj tripeptidaj motivoj #1.1 kaj #1.2 izolitaj en sango kaj cerbo-spina likvaĵo. (g, h) Sekvenca ID-reprezentado de fago riĉigita en sango (g) kontraŭ injektitaj bibliotekoj kaj fago riĉigita en cerbo-spina likvaĵo (h) kontraŭ sango post rondo de en viva selektado en ambaŭ bestoj. La grandeco de la unulitera kodo indikas kiom ofte tiu aminoacido troviĝas ĉe tiu pozicio. Verda = polusa, viola = neŭtrala, blua = baza, ruĝa = acida kaj nigra = hidrofobaj aminoacidoj. Figuro 1a, b estis desegnita kaj produktita de Eduard Urich.
Ni injektis fagan peptidan bibliotekon en du CM-instrumentajn ratojn (kladoj A kaj B) kaj izolis fagon el cerbo-spina likvaĵo kaj sango (Figuro 1d). La komenca rapida forigo de la biblioteko estis malpli okulfrapa kompare kun la sovaĝ-tipa fago. La averaĝa duoniĝotempo de la injektita biblioteko en ambaŭ bestoj estis 24.8 minutoj en sango, simile al sovaĝ-tipa fago, kaj 38.5 minutoj en cerbo-spina likvaĵo. Sangaj kaj cerbo-spina likvaĵo-fagaj specimenoj de ĉiu besto estis submetitaj al HTS kaj ĉiuj identigitaj peptidoj estis analizitaj por la ĉeesto de mallonga tripeptida ĉeftemo. Tripeptidaj ĉeftemoj estis elektitaj ĉar ili provizas minimuman bazon por strukturformado kaj peptido-proteinaj interagoj14,15. Ni trovis bonan korelacion en la distribuo de ĉeftemoj inter la injektita faga biblioteko kaj klonoj ekstraktitaj el la sango de ambaŭ bestoj (Figuro 1e). La datumoj indikas, ke la konsisto de la biblioteko estas nur marĝene riĉigita en la sangosekcio. Aminoacidaj frekvencoj kaj konsensaj sekvencoj estis plue analizitaj ĉe ĉiu pozicio uzante adapton de la programaro Weblogo16. Interese, ni trovis fortan riĉiĝon en sangaj glicinaj restaĵoj (Fig. 1g). Kiam sango estis komparita kun klonoj selektitaj el cerbo-spina likvaĵo (CSF), forta selektado kaj iom da malselektado de motivoj estis observitaj (Fig. 1f), kaj certaj aminoacidoj ĉeestis prefere ĉe antaŭdifinitaj pozicioj en la 12-membra (Fig. 1h). Rimarkinde, individuaj bestoj signife diferencis en cerbo-spina likvo, dum sanga glicina riĉiĝo estis observita en ambaŭ bestoj (Aldona Fig. 4a-j). Post rigora filtrado de sekvencaj datumoj en la cerbo-spina likvo de bestoj n-ro 1.1 kaj n-ro 1.2, entute 964 kaj 420 unikaj 12-meraj peptidoj estis akiritaj (Aldona Fig. 1d-e). La izolitaj fagoklonoj estis amplifitaj kaj submetitaj al dua raŭndo de en viva selektado. Fago ekstraktita de la dua raŭndo de selektado estis submetita al HTS en ĉiu besto kaj ĉiuj identigitaj peptidoj estis uzitaj kiel enigaĵo al ĉefmotiva rekona programo por analizi la okazon de tripeptidaj motivoj (Fig. 2a, b, ef). Kompare kun la unua ciklo de la fago reakirita el cerbo-spina likvaĵo (CSF), ni observis plian selektadon kaj malselektadon de multaj ĉeftemoj en CSF en branĉoj A kaj B (Fig. 2). Reta identigalgoritmo estis aplikita por determini ĉu ili reprezentis malsamajn ŝablonojn de kohera sekvenco. Klara simileco estis observita inter la 12-dimensiaj sekvencoj reakiritaj per CSF en alternativa klado A (Fig. 2c, d) kaj klado B (Fig. 2g, h). La kunigita analizo en ĉiu branĉo rivelis malsamajn selektadprofilojn por 12-meraj peptidoj (Aldona Fig. 5c,d) kaj pliiĝon en la CSF/sangotitra proporcio laŭlonge de la tempo por kunigitaj klonoj post la dua raŭndo de selektado kompare kun la unua raŭndo de selektado (Aldona Fig. 5e).
Riĉigo de ĉeftemoj kaj peptidoj en cerbo-spina likvo per du sinsekvaj rondoj de en viva funkcia pHaĝa ekranselektado.
Ĉiuj cerbo-spinaj fluidaj fagoj reakiritaj de la unua raŭndo de ĉiu besto (bestoj n-ro 1.1 kaj n-ro 1.2) estis kunigitaj, amplifitaj, HT-sekvencitaj kaj reinjektitaj kune (2 x 1010 fagoj/besto) al 2 SM-kanulitaj ratoj (n-ro 1.1 → n-ro). 2.1 kaj 2.2, 1.2 → 2.3 kaj 2.4). (a,b,e,f) Korelaciaj dispersaj diagramoj komparantaj la relativan frekvencon de tripeptidaj motivoj de ĉiuj CSF-derivitaj fagoj en la unua kaj dua selektado-raŭndo. Relativa frekvenco kaj distribuo de motivoj reprezentantaj ĉiujn eblajn interkovrantajn tripeptidojn trovitajn en peptidoj en ambaŭ orientiĝoj. La nombro da motivoj trovitaj en 1000 legaĵoj estas montrita. Motivoj, kiuj estis signife (p < 0.001) elektitaj aŭ ekskluditaj en unu el la komparitaj bibliotekoj, estas elstarigitaj per ruĝaj punktoj. (c, d, g, h) Reprezentado de la sekvenca emblemo de ĉiuj CSF-riĉaj 12 aminoacidaj longaj sekvencoj bazitaj sur raŭndoj 2 kaj 1 de en viva selektado. La grandeco de la unu-litera kodo indikas kiom ofte tiu aminoacido troviĝas ĉe tiu pozicio. Por reprezenti la emblemon, la frekvenco de CSF-sekvencoj eltiritaj de individuaj bestoj inter du selektadaj raŭndoj estas komparita kaj la riĉigitaj sekvencoj en la dua raŭndo estas montritaj: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 kaj (h) #1.2–#2.4. La plej riĉigitaj aminoacidoj ĉe difinita pozicio en (c, d) bestoj n-ro 2.1 kaj n-ro 2.2 aŭ (g, h) en bestoj n-ro 2.3 kaj n-ro 2.4 estas montritaj en koloro. Verda = polusa, viola = neŭtrala, blua = baza, ruĝa = acida kaj nigra = hidrofobaj aminoacidoj.
Post la tria raŭndo de selektado, ni identigis 124 unikajn peptidajn sekvencojn (n-ro 3.1 kaj n-ro 3.2) el 332 CSF-rekonstruitaj fagoklonoj izolitaj de du bestoj (Aldona Figuro 6a). La sekvenco LGSVS (18.7%) havis la plej altan relativan proporcion, sekvata de la sovaĝ-tipaj enigaĵoj PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), kaj SARGSWREIVSLS (2.2%). En la fina kvara raŭndo, ni kunigis du sendepende elektitajn branĉojn de tri apartaj bestoj (Figuro 1c). El la 925 sekvencitaj fagoklonoj reakiritaj de CSF, en la kvara raŭndo ni trovis 64 unikajn peptidajn sekvencojn (Aldona Figuro 6b), inter kiuj la relativa proporcio de sovaĝ-tipa fago falis al 0.8%. La plej oftaj CSF-klonoj en la kvara raŭndo estis LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) kaj RLSSVDSDLSGC (3,2%). La longogamo de la elektitaj peptidoj ŝuldiĝas al nukleotidaj enmetoj/forigoj aŭ trofruaj stopkodonoj en la bibliotekaj enkondukoj kiam oni uzas degeneritajn kodonojn por NNK-biblioteka dezajno. Trofruaj stopkodonoj generas pli mallongajn peptidojn kaj estas elektitaj ĉar ili enhavas la favoran aa-motivon. Pli longaj peptidoj povas rezulti el enmetoj/forigoj en la enkondukoj de la sintezaj bibliotekoj. Ĉi tio poziciigas la desegnitan stopkodonon ekster la kadro kaj legas ĝin ĝis nova stopkodono aperas poste. Ĝenerale, ni kalkulis riĉigfaktorojn por ĉiuj kvar selektadoraŭndoj komparante la enigajn datumojn kun la specimenaj eligaj datumoj. Por la unua raŭndo de rastrumo, ni uzis sovaĝ-tipajn fagajn titolojn kiel nespecifan fonan referencon. Interese, negativa fagoselektado estis tre forta en la unua cerbo-spina ciklo, sed ne en sango (Fig. 3a), kio eble ŝuldiĝas al la malalta probableco de pasiva difuzo de la plej multaj membroj de la peptidbiblioteko en la cerbo-spinan kupeon, aŭ relativaj fagoj emas esti pli efike retenitaj aŭ forigitaj el la sangocirkulado ol bakteriofagoj. Tamen, en la dua raŭndo de panelanalizo, forta selektado de fagoj en cerbo-spina ciklo estis observita en ambaŭ kladoj, sugestante, ke la antaŭa raŭndo estis riĉigita je fagoj montrantaj peptidojn, kiuj antaŭenigas cerbo-spinan sorbadon (Fig. 3a). Denove, sen signifa sangoriĉiĝo. Ankaŭ en la tria kaj kvara raŭndoj, la fagoklonoj estis signife riĉigitaj je cerbo-spina ciklo. Komparante la relativan oftecon de ĉiu unika peptidsekvenco inter la lastaj du raŭndoj de selektado, ni trovis, ke la sekvencoj estis eĉ pli riĉigitaj en la kvara raŭndo de selektado (Fig. 3b). Entute 931 tripeptidĉeftemoj estis ekstraktitaj el ĉiuj 64 unikaj peptidsekvencoj uzante ambaŭ peptidorientiĝojn. La plej riĉigitaj motivoj en la kvara raŭndo estis pli detale ekzamenitaj pri siaj riĉigaj profiloj tra ĉiuj raŭndoj kompare kun la injektita biblioteko (limigo: 10% riĉigo) (Aldona Figuro 6c). Ĝeneralaj selektadaj ŝablonoj montris, ke la plej multaj el la studitaj motivoj estis riĉigitaj en ĉiuj antaŭaj raŭndoj de ambaŭ selektadaj branĉoj. Tamen, iuj motivoj (ekz. SGL, VSG, LGS GSV) devenis ĉefe de alternativa klado A, dum aliaj (ekz. FGW, RTN, WGF, NTR) estis riĉigitaj en alternativa klado B.
Validigo de CSF-transporto de CSF-riĉigitaj phage-montritaj peptidoj kaj biotinilitaj gvidaj peptidoj konjugitaj al streptavidinaj ŝarĝoj.
(a) Riĉigaj proporcioj kalkulitaj en ĉiuj kvar raŭndoj (R1-R4) surbaze de injektitaj (enigo = I) fago- (PFU) titoloj kaj determinitaj CSF-fago-titoloj (eligo = O). Riĉigaj faktoroj por la lastaj tri raŭndoj (R2-R4) estis kalkulitaj per komparo kun la antaŭa raŭndo kaj la unua raŭndo (R1) kun pezdatumoj. Malfermaj stangoj estas cerbo-spina likvaĵo, ombritaj stangoj estas plasmo. (***p<0.001, surbaze de la t-testo de Student). (b) Listo de la plej abundaj fago-peptidoj, rangigitaj laŭ ilia relativa proporcio al ĉiuj fagoj kolektitaj en CSF post la 4-a raŭndo de selektado. La ses plej oftaj fago-klonoj estas kolorigitaj, numeritaj kaj iliaj riĉigaj faktoroj inter la 3-a kaj 4-a raŭndoj de selektado (enmetitaj). (c,d) La ses plej riĉigitaj fago-klonoj, malplenaj fago- kaj gepatraj fago-peptidaj bibliotekoj de la 4-a raŭndo estis analizitaj individue en CSF-specimena modelo. Cerbo-spinaj kaj sangospecimenoj estis kolektitaj je la indikitaj tempoj. (c) Egalaj kvantoj de 6 kandidataj fagoklonoj (2 x 1010 fagoj/bestoj), malplenaj fagoj (n-ro 1779) (2 x 1010 fagoj/bestoj) kaj stokaj fagopeptidaj bibliotekoj (2 x 1012 fagoj/bestoj). Injekti almenaŭ 3 CM estas administrata al la kanuligita besto aparte per la vostvejno. La cerbo-spina farmakokinetiko de ĉiu injektita fagoklono kaj fagopeptida biblioteko laŭlonge de la tempo estas montrita. (d) montras la mezan cerbo-spinan/sangan proporcion por ĉiuj reakiritaj fagoj/mL dum la prova tempo. (e) Kvar sintezaj gvidaj peptidoj kaj unu miksita kontrolo estis ligitaj kun biotino al streptavidino tra ilia N-finaĵo (tetramera montrado) sekvata de injekto (vostvejno intravejne, 10 mg streptavidino/kg). Almenaŭ tri intubitaj ratoj (N = 3). Cerbspinaj likvaj specimenoj estis kolektitaj je la indikitaj tempoj kaj streptavidinaj koncentriĝoj estis mezuritaj per CSF-kontraŭ-streptavidina ELISA (nd = ne detektita). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, bazita sur ANOVA-testo). (f) Komparo de la aminoacida sekvenco de la plej riĉigita fagopeptida klono #2002 (viola) kun aliaj elektitaj fagopeptidaj klonoj el la 4a raŭndo de selektado. Identaj kaj similaj aminoacidaj fragmentoj estas kolor-koditaj.
El ĉiuj riĉigitaj fagoj en la kvara raŭndo (Fig. 3b), ses kandidataj klonoj estis elektitaj por plia individua analizo en la CSF-specimena modelo. Egalaj kvantoj de ses kandidataj fagoj, malplenaj fagoj (sen enigaĵo) kaj profaj peptidaj bibliotekoj estis injektitaj en tri kanuligitajn CM-bestojn, kaj farmakokinetiko estis determinita per CSF (Fig. 3c) kaj sango (Aldona Fig. 7) analizoj. Ĉiuj testitaj fagoklonoj celis la CSF-sekcion je nivelo 10-1000 fojojn pli alta ol tiu de la malplena kontrola fago (n-ro 1779). Ekzemple, klonoj n-ro 2020 kaj n-ro 2077 havis ĉirkaŭ 1000 fojojn pli altajn CSF-koncentriĝojn ol la kontrola fago. La farmakokinetika profilo de ĉiu elektita peptido estas malsama, sed ĉiuj havas altan CSF-hejmecan kapablon. Ni observis konstantan malpliiĝon laŭlonge de la tempo por klonoj #1903 kaj #2011, dum por klonoj #2077, #2002 kaj #2009 pliiĝo dum la unuaj 10 minutoj eble indikas aktivan transporton, sed ĝi bezonas esti kontrolita. Klonoj #2020, #2002, kaj #2077 stabiliĝis je altaj niveloj, dum la cerbo-spina koncentriĝo de klono #2009 malrapide malpliiĝis post la komenca pliiĝo. Ni tiam komparis la relativan oftecon de ĉiu cerbo-spina kandidato kun ĝia sangokoncentriĝo (Fig. 3d). La korelacio de la meza titrado de ĉiu cerbo-spina kandidato kun ĝia sangotirado dum ĉiuj provaj tempoj montris, ke tri el la ses kandidatoj estis signife riĉigitaj per sanga cerbo-spina likvaĵo. Interese, klono #2077 montris pli altan sangostabilecon (Aldona Figuro 7). Por konfirmi, ke la peptidoj mem kapablas aktive transporti kargon krom fagopartikloj en la cerbo-spinan kupeon, ni sintezis kvar gvidajn peptidojn derivitigitajn per biotino ĉe la N-finaĵo, kie la peptidoj alkroĉiĝas al la fagopartiklo. Biotinilitaj peptidoj (n-roj 2002, 2009, 2020 kaj 2077) estis konjugitaj kun streptavidino (SA) por akiri multimerajn formojn iom imitante la geometrion de la fago. Ĉi tiu formato ankaŭ permesis al ni mezuri SA-ekspozicion en sango kaj cerbo-spina likvaĵo kiel kargo-transportantaj proteinaj peptidoj. Grave, fagaj datumoj ofte povus esti reproduktitaj kiam sintezaj peptidoj estis administritaj en ĉi tiu SA-konjugita formato (Fig. 3e). La miksitaj peptidoj havis malpli da komenca ekspozicio kaj pli rapidan forigon de la cerbo-spina likvaĵo kun nedetekteblaj niveloj ene de 48 horoj. Por akiri komprenon pri la livervojoj de ĉi tiuj peptidaj fagaj klonoj en la cerbo-spinan spacon, ni analizis la lokalizon de individuaj fagaj peptidaj trafoj uzante imunohistokemion (IHC) por rekte detekti fagajn partiklojn 1 horon post intravejna injekto in vivo. Rimarkinde, klonoj #2002, #2077, kaj #2009 povus esti detektitaj per forta kolorado en cerbaj kapilaroj, dum kontrola fago (#1779) kaj klono #2020 ne estis detektitaj (Aldona Figuro 8). Ĉi tio sugestas, ke ĉi tiuj peptidoj kontribuas al la efiko sur la cerbo ĝuste per transiro de la BBB. Plia detala analizo estas necesa por testi ĉi tiun hipotezon, ĉar la BSCFB-vojo ankaŭ povus esti implikita. Komparante la aminoacidan sekvencon de la plej riĉigita klono (#2002) kun aliaj elektitaj peptidoj, oni rimarkis, ke kelkaj el ili havas similajn aminoacidajn etendaĵojn, kio povus indiki similan transportmekanismon (Fig. 3f).
Pro ĝia unika plasma profilo kaj signifa pliiĝo de cerbo-spina likvaĵo (CSF) laŭlonge de la tempo, la fago-eksponada klono n-ro 2077 estis plue esplorita dum pli longa 48-hora periodo kaj kapablis reprodukti la rapidan pliiĝon de CSF observita rilate al daŭraj SA-niveloj (Fig. 4a). Koncerne aliajn identigitajn fago-klonojn, n-ro 2077 forte koloriĝis por cerbaj kapilaroj kaj montris signifan kunlokalizon kun kapilara markilo lektino kiam rigardite je pli alta rezolucio kaj eble iom da kolorado en la parenkima spaco (Figuro 4b). Por esplori ĉu peptid-mediaciitaj farmakologiaj efikoj povus esti akiritaj en la centra nerva sistemo (CNS), ni faris eksperimenton en kiu biotinilitaj versioj de i) la transitpeptido n-ro 2077 kaj ii) la BACE1-inhibitora peptido estis miksitaj kun SA je du malsamaj proporcioj. Por unu kombinaĵo ni uzis nur la BACE1-peptidinhibitoron kaj por la alia ni uzis proporcion de 1:3 de BACE1-peptidinhibitoro al peptido n-ro 2077. Ambaŭ specimenoj estis administritaj intravejne kaj sango- kaj cerbo-spina fluido-niveloj de beta-amiloida peptido 40 (Abeta40) estis mezuritaj laŭlonge de la tempo. Abeta40 estis mezurita en cerbo-spina likvaĵo (CSF), ĉar ĝi reflektas BACE1-inhibicion en la cerba parenkimo. Kiel atendite, ambaŭ kompleksoj signife reduktis sango-nivelojn de Abeta40 (Fig. 4c, d). Tamen, nur specimenoj enhavantaj miksaĵon de peptido n-ro 2077 kaj inhibiciilon de la BACE1-peptido konjugita al SA kaŭzis signifan malpliiĝon de Abeta40 en la cerbo-spina fluido (Fig. 4c). La datumoj montras, ke peptido n-ro 2077 kapablas transporti la 60 kDa SA-proteinon en la centran nervan sistemon (CNS) kaj ankaŭ induktas farmakologiajn efikojn kun SA-konjugitaj inhibiciiloj de la BACE1-peptido.
(a) Klona injekto (2 × 10⁶ fagoj/besto) de T7-fago montranta longdaŭrajn farmakokinetajn profilojn de CSF-peptido #2077 (RLSSVDSDLSGC) kaj neinjektita kontrola fago (#1779) en almenaŭ tri CM-intubitaj ratoj. (b) Konfokusa mikroskopa bildo de reprezentaj kortikaj mikrovaskuloj en fago-injektitaj ratoj (2 × 10⁶ fagoj/besto) montranta kontraŭkolorigon de peptido #2077 kaj vaskuloj (lektino). Ĉi tiuj fagoklonoj estis administritaj al 3 ratoj kaj lasitaj cirkuli dum 1 horo antaŭ perfuzado. Cerboj estis sekcigitaj kaj koloritaj per poliklonaj FITC-markitaj antikorpoj kontraŭ la T7-faga kapsido. Dek minutojn antaŭ perfuzado kaj posta fiksado, DyLight594-markita lektino estis administrita intravejne. Fluoreskaj bildoj montrantaj lektinan koloradon (ruĝa) de la lumena flanko de mikrovaskuloj kaj fagoj (verdaj) en la lumeno de kapilaroj kaj perivaskula cerba histo. La skalbreto respondas al 10 µm. (c, d) Biotinilita BACE1-inhibiciiga peptido sole aŭ kombine kun biotinilita transitpeptido #2077 estis kunligita al streptavidino sekvata de intravejna injekto de almenaŭ tri kanuligitaj CM-ratoj (10 mg streptavidino/kg). BACE1-peptida inhibiciilo-mediaciita redukto en Aβ40 estis mezurita per Aβ1-40 ELISA en sango (ruĝa) kaj cerbo-spina likvaĵo (oranĝa) je la indikitaj tempopunktoj. Por pli bona klareco, punktita linio estas desegnita sur la grafikaĵo je skalo de 100%. (c) Procenta redukto de Aβ40 en sango (ruĝaj trianguloj) kaj cerbo-spina likvo (oranĝaj trianguloj) en ratoj traktitaj per streptavidino konjugita al transitpeptido #2077 kaj BACE1-inhibiciiga peptido en proporcio de 3:1. (d) Procenta redukto de sanga Aβ40 (ruĝaj cirkloj) kaj cerbo-spina likvo (oranĝaj cirkloj) de ratoj traktitaj per streptavidino kunligita nur al BACE1-inhibiciiga peptido. La Aβ-koncentriĝo en la kontrolo estis 420 pg/ml (norma devio = 101 pg/ml).
Faga montrado estis sukcese aplikita en pluraj kampoj de biomedicina esplorado17. Ĉi tiu metodo estis uzata por studoj pri angia diverseco *in vivo*18,19 same kiel por studoj celantaj cerbajn angiojn20,21,22,23,24,25,26. En ĉi tiu studo, ni etendis la aplikon de ĉi tiu selektmetodo ne nur al la rekta identigo de peptidoj celantaj cerbajn angiojn, sed ankaŭ al la malkovro de kandidatoj kun aktivaj transportaj ecoj por transiri la sango-cerban barieron. Ni nun priskribas la disvolvon de *in vivo* selektproceduro en *CM*-intubitaj ratoj kaj montras ĝian potencialon identigi peptidojn kun cerbo-spinaj cel-aliraj ecoj. Uzante la T7-fagon montrantan bibliotekon de 12-meraj hazardaj peptidoj, ni povis montri, ke la T7-fago estas sufiĉe malgranda (ĉirkaŭ 60 nm en diametro)10 por esti adaptita al la sango-cerba bariero, tiel rekte transirante la sango-cerban barieron aŭ koroidan plekson. Ni observis, ke cerbo-spina likvaĵo (CSF) rikoltado de kanuligitaj CM-ratoj estis bone kontrolita funkcia ekzamena metodo en vivo, kaj ke la ekstraktita fago ne nur ligis sin al la vaskularo, sed ankaŭ funkciis kiel transportilo trans la sango-cerba bariero. Krome, per samtempa kolektado de sango kaj aplikado de alta temperaturo en sango (HTS) al CSF kaj sang-derivitaj fagoj, ni konfirmis, ke nia elekto de CSF ne estis influita de sangoriĉigo aŭ taŭgeco por ekspansio inter selektaj rondoj. Tamen, la sangosekcio estas parto de la selekta proceduro, ĉar fagoj kapablaj atingi la CSF-sekcion devas pluvivi kaj cirkuli en la sango sufiĉe longe por riĉigi sin en la cerbo. Por ekstrakti fidindajn sekvencajn informojn el krudaj HTS-datumoj, ni efektivigis filtrilojn adaptitajn al platformo-specifaj sekvencaj eraroj en la analiza laborfluo. Enkorpigante kinetikajn parametrojn en la ekzamenan metodon, ni konfirmis la rapidan farmakokinetikon de sovaĝ-tipaj T7-fagoj (t½ ~ 28 min) en sango24, 27, 28 kaj ankaŭ determinis ilian duoniĝotempon en cerbo-spina likvaĵo (t½ ~ 26 min) por minuto. Malgraŭ similaj farmakokinetaj profiloj en sango kaj cerbo-spina likvaĵo (CSF), nur 0.001% de la sangokoncentriĝo de fago povus esti detektita en CSF, indikante malaltan fonan moveblecon de sovaĝ-tipa T7-fago trans la sango-cerban barieron. Ĉi tiu laboro emfazas la gravecon de la unua raŭndo de selektado kiam oni uzas en vivajn panelajn strategiojn, precipe por fagosistemoj, kiuj estas rapide forigitaj el la cirkulado, ĉar malmultaj klonoj kapablas atingi la centran nervosisteman sistemon. Tiel, en la unua raŭndo, la redukto en biblioteka diverseco estis tre granda, ĉar nur limigita nombro da klonoj estis fine kolektitaj en ĉi tiu tre strikta CSF-modelo. Ĉi tiu en viva panela strategio inkluzivis plurajn selektadajn paŝojn kiel aktiva amasiĝo en la CSF-sekcio, klona supervivo en la sangosekcio, kaj rapida forigo de T7-fagoklonoj el la sango ene de la unuaj 10 minutoj (Fig. 1d kaj Aldona Fig. 4M). Tiel, post la unua raŭndo, malsamaj fagoklonoj estis identigitaj en CSF, kvankam la sama komenca aro estis uzata por individuaj bestoj. Ĉi tio sugestas, ke pluraj striktaj selektaj paŝoj por fontaj bibliotekoj kun granda nombro da bibliotekaj membroj rezultas en signifa redukto de diverseco. Tial, hazardaj eventoj fariĝos integrita parto de la komenca selekta procezo, multe influante la rezulton. Estas probable, ke multaj el la klonoj en la originala biblioteko havis tre similan inklinon al riĉigo de CSF. Tamen, eĉ sub la samaj eksperimentaj kondiĉoj, la selektaj rezultoj povas diferenci pro la malgranda nombro de ĉiu aparta klono en la komenca aro.
La motivoj riĉigitaj en cerbo-spina likvaĵo (CSF) diferencas de tiuj en la sango. Interese, ni rimarkis la unuan ŝanĝon al glicinriĉaj peptidoj en la sango de individuaj bestoj. (Fig. 1g, Aldonaj Fig. 4e, 4f). Fago enhavanta glicinpeptidojn povas esti pli stabila kaj malpli verŝajne estos forigita el la cirkulado. Tamen, ĉi tiuj glicinriĉaj peptidoj ne estis detektitaj en la cerbo-spinaj fluidaj specimenoj, sugestante, ke la zorge elektitaj bibliotekoj trairis du malsamajn selektadajn paŝojn: unu en la sango kaj alia permesita akumuliĝi en la cerbo-spina likvaĵo. CSF-riĉigitaj klonoj rezultantaj el la kvara raŭndo de selektado estis amplekse testitaj. Preskaŭ ĉiuj individue testitaj klonoj estis konfirmitaj kiel riĉigitaj en CSF kompare kun blanka kontrolfago. Unu peptida trafo (n-ro 2077) estis ekzamenita pli detale. Ĝi montris pli longan plasman duoniĝotempon kompare kun aliaj trafoj (Figuro 3d kaj Aldonaj Figuroj 7), kaj interese, ĉi tiu peptido enhavis cisteinan restaĵon ĉe la C-finaĵo. Lastatempe oni montris, ke la aldono de cisteino al peptidoj povas plibonigi iliajn farmakokinetajn ecojn per ligado al albumino 29. Ĉi tio nuntempe estas nekonata por peptido n-ro 2077 kaj postulas plian studon. Kelkaj peptidoj montris valent-dependecon en cerbo-spina likvaĵo (CSF) riĉigo (datumoj ne montritaj), kiu eble rilatas al la montrita surfaca geometrio de la T7-kapsido. La T7-sistemo, kiun ni uzis, montris 5-15 kopiojn de ĉiu peptido por ĉiu fagopartiklo. IHC (IHC) estis farita sur kandidataj gvidaj fagoklonoj injektitaj intravejne en la cerban kortekson de ratoj (Aldona Figuro 8). La datumoj montris, ke almenaŭ tri klonoj (n-ro 2002, n-ro 2009 kaj n-ro 2077) interagis kun la BBB (beka hepara barelo). Restas determini, ĉu ĉi tiu BBB-interago rezultas en la amasiĝo de CSF aŭ la movado de ĉi tiuj klonoj rekte al la BCSFB (beka hepara barelo). Grave, ni montras, ke la elektitaj peptidoj retenas sian CSF-transportkapaciton kiam sintezitaj kaj ligitaj al la proteina kargo. La ligado de N-finaj biotinilitaj peptidoj al SA esence ripetas la rezultojn akiritajn kun iliaj respektivaj fagoklonoj en sango kaj cerbo-spina likvaĵo (Fig. 3e). Fine, ni montras, ke la ĉefa peptido #2077 kapablas antaŭenigi la cerban agadon de biotinilita peptida inhibiciilo de BACE1 konjugita al SA, kaŭzante okulfrapajn farmakodinamikajn efikojn en la centra nerva sistemo per signife reduktado de Abeta40-niveloj en cerbo-spina likvaĵo (Fig. 4). Ni ne povis identigi iujn ajn homologojn en la datumbazo per serĉo de peptida sekvenca homologio de ĉiuj trafoj. Gravas noti, ke la grandeco de la T7-biblioteko estas proksimume 109, dum la teoria biblioteka grandeco por 12-meroj estas 4 x 1015. Tial, ni selektis nur malgrandan frakcion de la diverseca spaco de la 12-mera peptida biblioteko, kio povas signifi, ke pli optimumigitaj peptidoj povas esti identigitaj per taksado de la apuda sekvenca spaco de ĉi tiuj identigitaj trafoj. Hipoteze, unu el la kialoj, kial ni ne trovis iujn ajn naturajn homologojn de ĉi tiuj peptidoj, povus esti malselektado dum evolucio por malhelpi la nekontrolitan eniron de certaj peptidaj motivoj en la cerbon.
Entute, niaj rezultoj provizas bazon por estonta laboro por identigi kaj karakterizi la transportsistemojn de la cerbovaskula bariero in vivo pli detale. La baza aranĝo de ĉi tiu metodo baziĝas sur funkcia selekta strategio, kiu ne nur identigas klonojn kun cerbovaskulaj ligaj ecoj, sed ankaŭ inkluzivas kritikan paŝon, en kiu sukcesaj klonoj havas internan agadon por transiri biologiajn barierojn in vivo en la CNS-sekcion. La celo estas klarigi la transportmekanismon de ĉi tiuj peptidoj kaj ilian preferon por ligado al la mikrovaskularo specifa por la cerba regiono. Ĉi tio povas konduki al la malkovro de novaj vojoj por la transporto de la BBB kaj receptoroj. Ni atendas, ke la identigitaj peptidoj povas rekte ligiĝi al cerbovaskulaj receptoroj aŭ al cirkulantaj ligandoj transportitaj tra la BBB aŭ BCSFB. La peptidaj vektoroj kun CSF-transporta agado malkovritaj en ĉi tiu laboro estos plue esploritaj. Ni nuntempe esploras la cerban specifecon de ĉi tiuj peptidoj rilate al ilia kapablo transiri la BBB kaj/aŭ BCSFB. Ĉi tiuj novaj peptidoj estos ekstreme valoraj iloj por la ebla malkovro de novaj receptoroj aŭ vojoj kaj por la disvolviĝo de novaj tre efikaj platformoj por la liverado de makromolekuloj, kiel ekzemple biologiaĵoj, al la cerbo.
Kanuligu la grandan cisternon (CM) uzante modifon de la antaŭe priskribita metodo. Anestezitaj Wistar-ratoj (200-350 g) estis muntitaj sur stereotaksian aparaton kaj mediana incizo estis farita super la razita kaj asepse preparita skalpo por malkovri la kranion. Boru du truojn en la areo de la supra kadro kaj fiksu la fiksajn ŝraŭbojn en la truojn. Plia truo estis borita en la laterala okcipita kresto por stereotaksia gvido de rustorezistŝtala kanulo en la CM. Apliku dentalan cementon ĉirkaŭ la kanulo kaj fiksu per ŝraŭboj. Post foto-polimerizado kaj cement-hardado, la haŭta vundo estis fermita per 4/0 supramid-suturo. Ĝusta lokigo de la kanulo estas konfirmita per spontanea elfluo de cerbo-spina likvaĵo (CSL). Forigu la raton de la stereotaksia aparato, ricevu taŭgan postoperacian prizorgon kaj dolor-traktadon, kaj lasu ĝin resaniĝi dum almenaŭ unu semajno ĝis signoj de sango estas observitaj en la cerbo-spina likvaĵo. Wistar-ratoj (Crl:WI/Han) estis akiritaj de Charles River (Francio). Ĉiuj ratoj estis tenataj sub specifaj patogen-liberaj kondiĉoj. Ĉiuj bestaj eksperimentoj estis aprobitaj de la Veterinara Oficejo de la Urbo Bazelo, Svislando, kaj estis faritaj laŭ Besta Permesilo N-ro 2474 (Takso de Aktiva Cerba Transporto per Mezurado de Niveloj de Terapiaj Kandidatoj en la Cerbo-spina Likvaĵo kaj Cerbo de Rato).
Milde tenu la raton konscia kun la CM-kanulo enmane. Forigu Datura el la kanulo kaj kolekti 10 µl da spontanee fluanta cerbo-spina likvaĵo. Ĉar la trairebleco de la kanulo finfine estis kompromitita, nur klaraj cerbo-spinaj likvaj specimenoj sen signoj de sangopoluado aŭ miskoloriĝo estis inkluditaj en ĉi tiu studo. Paralele, ĉirkaŭ 10-20 μl da sango estis prenita el malgranda incizo ĉe la pinto de la vosto en tubojn kun heparino (Sigma-Aldrich). Cerbo-spina likvaĵo (CSF) kaj sango estis kolektitaj je diversaj tempopunktoj post intravejna injekto de T7-fago. Ĉirkaŭ 5-10 μl da fluido estis forĵetitaj antaŭ ol ĉiu CSF-specimeno estis kolektita, kio korespondas al la morta volumeno de la katetero.
Bibliotekoj estis generitaj uzante la vektoron T7Select 10-3b kiel priskribite en la manlibro de la sistemo T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Mallonge, hazarda 12-mera DNA-enigaĵo estis sintezita en la jena formato:
La NNK-kodono estis uzata por eviti duoblajn haltigajn kodonojn kaj troesprimon de aminoacidoj en la enigaĵo. N estas mane miksita ekvimola proporcio de ĉiu nukleotido, kaj K estas mane miksita ekvimola proporcio de adenino- kaj citozino-nukleotidoj. Unufadenaj regionoj estis konvertitaj al duoblafadena DNA per plia inkubacio kun dNTP (Novagen) kaj Klenow-enzimo (New England Biolabs) en Klenow-bufro (New England Biolabs) dum 3 horoj je 37°C. Post la reakcio, duoblafadena DNA estis reakirita per EtOH-precipitado. La rezulta DNA estis digestita per restriktaj enzimoj EcoRI kaj HindIII (ambaŭ de Roche). La fendita kaj purigita (QIAquick, Qiagen) enigaĵo (T4-ligazo, New England Biolabs) estis poste ligita en-kadro en antaŭfenditan T7-vektoron post aminoacido 348 de la 10B-kapsidgeno. Ligaj reakcioj estis inkubitaj je 16°C dum 18 horoj antaŭ en vitro-pakado. Fago-enpakado in vitro estis efektivigita laŭ la instrukcioj liveritaj kun la klonada ilaro T7Select 10-3b (Novagen) kaj la enpaka solvaĵo estis amplifikita unufoje ĝis lizo uzante Escherichia coli (BLT5615, Novagen). La lizatoj estis centrifugitaj, titritaj kaj frostigitaj je -80°C kiel baza solvaĵo de glicerolo.
Rekta PCR-amplifikado de fagaj variaj regionoj amplifitaj en buljono aŭ telero uzante proprietajn 454/Roche-amplikonajn fuziajn komencilojn. La antaŭa fuzia komencilo enhavas sekvencojn laŭflankantajn la varian regionon (NNK) 12 (ŝablono-specifan), GS FLX Titanium Adapter A, kaj kvar-bazan bibliotekan ŝlosilsekvencon (TCAG) (Aldona Figuro 1a):
La inversa fuzia enkonduko ankaŭ enhavas biotinon ligitan al kaptogloboj kaj la GS FLX Titanium Adapter B necesa por klona amplifikado dum emulsia PCR:
La amplikonoj estis poste submetitaj al 454/Roche-pirosekvencado laŭ la 454 GS-FLX Titanium-protokolo. Por mana Sanger-sekvencado (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7-faga DNA estis amplifikita per PCR kaj sekvencita per la jenaj prajmeraj paroj:
Enigaĵoj de individuaj plakedoj estis submetitaj al PCR-amplifikado uzante la Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (laŭ la instrukcioj de la fabrikanto). Faru varman komencon (10 min je 95 °C) kaj 35 akcelciklojn (50 s je 95 °C, 1 min je 50 °C, kaj 1 min je 72 °C).
Fagoj el bibliotekoj, sovaĝ-tipa fago, fagoj savitaj el cerbo-spina likvaĵo kaj sango, aŭ individuaj klonoj estis amplifitaj en Escherichia coli BL5615 en TB-buljono (Sigma Aldrich) aŭ en 500 cm2-pladoj (Thermo Scientific) dum 4 horoj je 37°C. Fagoj estis ekstraktitaj el la platoj per lavado de la platoj per Tris-EDTA-bufro (Fluka Analytical) aŭ per kolektado de la plakoj per sterilaj pipetaj pintoj. Fagoj estis izolitaj el kultursupernatanto aŭ ekstrakta bufro per unu raŭndo de polietilen-glikola (PEG 8000) precipitaĵo (Promega) kaj resuspenditaj en Tris-EDTA-bufro.
La plifortigita fago estis submetita al 2-3 raŭndoj de endotoksinforigo uzante endotoksinforigajn globetojn (Miltenyi Biotec) antaŭ intravejna (IV) injekto (500 μl/besto). En la unua raŭndo, 2×10¹² fagoj estis enkondukitaj; en la dua, 2×10¹⁶ fagoj; en la tria kaj kvara selektadraŭndoj, 2×10⁶ fagoj por besto. La enhavo de fago en cerbo-spina likvaĵo (CSF) kaj sangospecimenoj kolektitaj je la indikitaj tempoj estis determinita per plakokventaro laŭ la instrukcioj de la fabrikanto (manlibro de la sistemo T7Select). Fagoselektado estis efektivigita per intravejna injekto de purigitaj bibliotekoj en la vostvejnon aŭ per re-injekto de fago ekstraktita el CSF de la antaŭa selektadraŭndo, kaj postaj rikoltoj estis efektivigitaj je 10 minutoj, 30 minutoj, 60 minutoj, 90 minutoj, 120 minutoj, 180 minutoj kaj 240 minutoj respektive por cerbo-spina likvaĵo kaj sangospecimenoj. Entute kvar raŭndoj de *in vivo*-panado estis faritaj, en kiuj la du elektitaj branĉoj estis aparte stokitaj kaj analizitaj dum la unuaj tri raŭndoj de selektado. Ĉiuj fagaj enigaĵoj eltiritaj el cerbo-spina likvaĵo (CSF) de la unuaj du raŭndoj de selektado estis submetitaj al 454/Roche-pirosekvencado, dum ĉiuj klonoj eltiritaj el CSF de la lastaj du raŭndoj de selektado estis mane sekvencitaj. Ĉiuj sangaj fagoj de la unua raŭndo de selektado ankaŭ estis submetitaj al 454/Roche-pirosekvencado. Por injekto de fagaj klonoj, elektitaj fagoj estis amplifitaj en E. coli (BL5615) sur 500 cm2-platoj je 37°C dum 4 horoj. Individue elektitaj kaj mane sekvencitaj klonoj estis disvastigitaj en TB-medio. Post faga ekstraktado, purigo kaj forigo de endotoksino (kiel priskribite supre), 2×1010 fagoj/besto en 300 μl estis injektitaj intravejne en unu vostvejnon.
Antaŭprilaborado kaj kvalita filtrado de sekvencaj datumoj. Krudaj 454/Roche-datumoj estis konvertitaj de duuma norma fluomapa formato (sff) al homlegebla formato de Pearson (fasta) uzante vendistan programaron. Plia prilaborado de la nukleotida sekvenco estis farita uzante proprietajn C-programojn kaj skriptojn (neeldonita programarpakaĵo) kiel priskribite sube. La analizo de primaraj datumoj inkluzivas striktajn plurŝtupajn filtrajn procedurojn. Por filtri legaĵojn, kiuj ne enhavis validan 12-meran enmetaĵan DNA-sekvencon, la legaĵoj estis sinsekve vicigitaj al komenca etikedo (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), fina etikedo (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) kaj fona enmetaĵo (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) uzante la tutmondan Needleman-Wunsch-teston. vicigo permesanta ĝis 2 malkonsekvencojn por vicigo31. Tial, legaĵoj sen komencaj kaj fina etikedoj kaj legaĵoj enhavantaj fonajn enmetaĵojn, t.e., vicigoj kiuj superas la permesitan nombron da miskongruoj, estis forigitaj el la biblioteko. Koncerne la ceterajn legaĵoj, la N-mera DNA-sekvenco etendiĝanta de la komenca marko kaj finiĝanta antaŭ la halta marko estis forigita de la originala legata sekvenco kaj plue prilaborita (ĉi-poste nomata "enigaĵo"). Post traduko de la enigaĵo, la parto post la unua halta kodono ĉe la 5'-fino de la komencilo estas forigita de la enigaĵo. Krome, nukleotidoj kondukantaj al nekompletaj kodonoj ĉe la 3'-fino de la komencilo ankaŭ estis forigitaj. Por ekskludi enigaĵojn enhavantajn nur fonajn sekvencojn, tradukitaj enigaĵoj komenciĝantaj per la aminoacida ŝablono "PAG" ankaŭ estis forigitaj. Peptidoj kun post-tradukada longo malpli ol 3 aminoacidoj estis forigitaj de la biblioteko. Fine, forigi redundon en la enigaĵa aro kaj determini la frekvencon de ĉiu unika enigaĵo. La rezultoj de ĉi tiu analizo inkluzivis liston de nukleotidsekvencoj (enigaĵoj) kaj iliajn (legatajn) frekvencojn (Aldonaj Figuroj 1c kaj 2).
Grupigi N-merajn DNA-enigaĵojn laŭ sekvencsimileco: Por elimini 454/Roche-specifajn sekvencerarojn (kiel problemojn kun sekvencaj homopolimeraj etendaĵoj) kaj forigi malpli gravajn redundojn, antaŭe filtritaj N-meraj DNA-sekvencaj enigaĵoj (enigaĵoj) estas ordigitaj laŭ simileco. enigaĵoj (ĝis 2 nekongruaj bazoj permesitaj) uzante ripetan algoritmon difinitan jene: enigaĵoj estas ordigitaj unue laŭ sia frekvenco (de la plej alta al la plej malalta), kaj se ili estas samaj, laŭ sia sekundara ordigo laŭ longo (de la plej longa al la plej mallonga). Tiel, la plej oftaj kaj plej longaj enigaĵoj difinas la unuan "grupon". La grupfrekvenco estas agordita al la ŝlosila frekvenco. Poste, ĉiu enigaĵo restanta en la ordigita listo estis provita esti aldonita al la grupo per para Needleman-Wunsch-aranĝo. Se la nombro da miskongruoj, enigaĵoj aŭ forigoj en aranĝo ne superas sojlon de 2, enigaĵo estas aldonita al la grupo, kaj la ĝenerala grupfrekvenco estas pliigita laŭ kiom ofte la enigaĵo estis aldonita. Enigaĵoj aldonitaj al grupo estas markitaj kiel uzitaj kaj ekskluditaj de plia prilaborado. Se la enigita sekvenco ne povas esti aldonita al jam ekzistanta grupo, la enigita sekvenco estas uzata por krei novan grupon kun la taŭga eniga frekvenco kaj markita kiel uzita. La iteracio finiĝas kiam ĉiu eniga sekvenco estas aŭ uzata por formi novan grupon aŭ povas esti inkludita en jam ekzistanta grupo. Fine, grupigitaj enigaĵoj konsistantaj el nukleotidoj estas fine tradukitaj en peptidajn sekvencojn (peptidaj bibliotekoj). La rezulto de ĉi tiu analizo estas aro da enigaĵoj kaj iliaj respondaj frekvencoj, kiuj konsistigas la nombron de sinsekvaj legaĵoj (Aldona Figuro 2).
Generado de Motivoj: Surbaze de listo de unikaj peptidoj, oni kreis bibliotekon enhavantan ĉiujn eblajn aminoacidajn ŝablonojn (aa) kiel montrite sube. Ĉiu ebla ŝablono de longo 3 estis eltirita el la peptido kaj ĝia inversa ŝablono estis aldonita kune kun komuna biblioteko de motivoj enhavanta ĉiujn ŝablonojn (tripeptidoj). Bibliotekoj de tre ripetemaj motivoj estis sekvencitaj kaj redundo forigita. Poste, por ĉiu tripeptido en la biblioteko de motivoj, ni kontrolis ĝian ĉeeston en la biblioteko uzante komputilajn ilojn. En ĉi tiu kazo, la frekvenco de la peptido enhavanta la trovitan motivon tripeptido estas aldonita kaj asignita al la motivo en la biblioteko de motivoj ("nombro da motivoj"). La rezulto de la generado de motivoj estas dudimensia aro enhavanta ĉiujn okazojn de tripeptidoj (motivoj) kaj iliajn respektivajn valorojn, kiuj estas la nombro da sekvencaj legaĵoj kiuj rezultas en la responda motivo kiam la legaĵoj estas filtritaj, grupigitaj kaj tradukitaj. Metrikoj kiel detale priskribite supre.
Normaligo de la nombro de ĉeftemoj kaj respondaj dispersaj diagramoj: La nombro de ĉeftemoj por ĉiu specimeno estis normaligita uzante
kie ni estas la nombro da legaĵoj enhavantaj temon i. Tiel, vi reprezentas la procentan oftecon de legaĵoj (aŭ peptidoj) enhavantaj motivon i en la specimeno. P-valoroj por la ne-normaligita nombro da motivoj estis kalkulitaj uzante la precizan teston de Fisher. Koncerne korelogramojn de la nombro da motivoj, la korelacioj de Spearman estis kalkulitaj uzante la normaligitan nombron da motivoj kun R.
Por bildigi la enhavon de aminoacidoj ĉe ĉiu pozicio en la peptida biblioteko, oni kreis la ret-logogramojn 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Unue, la enhavo de aminoacidoj ĉe ĉiu pozicio de la 12-mera peptido estas stokita en 20×12-matrico. Poste, aro de 1000 peptidoj enhavantaj la saman relativan aminoacidan enhavon ĉe ĉiu pozicio estas generita en fasta-sekvenca formato kaj provizita kiel enigo al ret-logo 3, kiu generas grafikan reprezentaĵon de la relativa aminoacida enhavo ĉe ĉiu pozicio por difinita peptida biblioteko. Por bildigi plurdimensiajn datumaron, varmomapoj estis kreitaj uzante interne evoluigitan ilon en R (biosHeatmap, ankoraŭ ne publikigita R-pakaĵo). La dendrogramoj prezentitaj en la varmomapoj estis kalkulitaj uzante la hierarkian agregaciadan metodon de Ward kun la eŭklida distanca metriko. Por statistika analizo de motivo-poentadaj datumoj, P-valoroj por nenormaligita poentado estis kalkulitaj uzante la precizan teston de Fisher. P-valoroj por aliaj datumaroj estis kalkulitaj en R uzante la t-teston de Student aŭ ANOVA.
Selektitaj fagoklonoj kaj fagoj sen enigaĵoj estis injektitaj intravejne per la vostvejno (2×1010 fagoj/besto en 300 μl PBS). Dek minutojn antaŭ la perfuzado kaj posta fiksado, la samaj bestoj estis intravejne injektitaj per 100 μl da DyLight594-markita lektino (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minutojn post fagoinjektado, ratoj estis perfuzitaj tra la koro per 50 ml PBS sekvata de 50 ml 4% PFA/PBS. Cerbaj specimenoj estis plie fiksitaj dumnokte en 4% PFA/PBS kaj trempitaj en 30% sakarozo dumnokte je 4°C. Specimenoj estas rapide frostigitaj en la OCT-miksaĵo. Imunohistokemia analizo de frostaj specimenoj estis farita je ĉambra temperaturo sur 30 µm kriosekcioj blokitaj per 1% BSA kaj inkubaciitaj per poliklonaj FITC-markitaj antikorpoj kontraŭ T7-fago (Novus NB 600-376A) je 4 °C. Inkubu dumnokte. Fine, la sekcioj estis lavitaj 3 fojojn per PBS kaj ekzamenitaj per konfokusa lasera mikroskopo (Leica TCS SP5).
Ĉiuj peptidoj kun minimuma pureco de 98% estis sintezitaj de GenScript USA, biotinigitaj kaj liofiligitaj. Biotino estas ligita per plia triobla glicina interaĵo ĉe la N-finaĵo. Kontrolu ĉiujn peptidojn per masspektrometrio.
Streptavidino (Sigma S0677) estis miksita kun 5-obla ekvimola eksceso de biotinilita peptido, biotinilita BACE1-inhibiciiga peptido, aŭ kombinaĵo (proporcio 3:1) de biotinilita BACE1-inhibiciiga peptido kaj BACE1-inhibiciiga peptido en 5-10% DMSO/inkubita en PBS. 1 horon je ĉambra temperaturo antaŭ injekto. Streptavidino-konjugitaj peptidoj estis injektitaj intravejne je dozo de 10 mg/kg en unu el la vostaj vejnoj de ratoj kun cerba kavaĵo.
La koncentriĝo de streptavidin-peptidaj kompleksoj estis taksita per ELISA. Mikrotitraj platoj Nunc Maxisorp (Sigma) estis kovritaj dumnokte je 4°C per 1.5 μg/ml musa kontraŭ-streptavidina antikorpo (Thermo, MA1-20011). Post blokado (bloka bufro: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelateno, 1% BSA) je ĉambra temperaturo dum 2 horoj, lavis la platon per 0.05% Tween-20/PBS (lavbufro) dum 3 sekundoj, cerbo-spinaj kaj plasmo-provaĵoj estis aldonitaj al putoj diluitaj per bloka bufro (plasmo 1:10,000, cerbo-spinaj kaj plasmo-provaĵoj). La plato estis poste inkubita dumnokte je 4°C kun detektila antikorpo (1 μg/ml, kontraŭ-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Post tri lavadpaŝoj, streptavidino estis detektita per inkubacio en TMB-substrata solvaĵo (Roche) dum ĝis 20 minutoj. Post haltigo de kolorevoluo per 1M H2SO4, mezuru la absorbadon je 450 nm.
La funkcio de la streptavidino-peptido-BACE1-inhibitora komplekso estis taksita per Aβ(1-40) ELISA laŭ la protokolo de la fabrikanto (Wako, 294-64701). Mallonge, cerbospinaj specimenoj estis diluitaj en norma diluilo (1:23) kaj inkubaciitaj dumnokte je 4°C en 96-putaj platoj kovritaj per BNT77-kapta antikorpo. Post kvin lavpaŝoj, HRP-konjugita BA27-antikorpo estis aldonita kaj inkubaciita dum 2 horoj je 4°C, sekvata de kvin lavpaŝoj. Aβ(1–40) estis detektita per inkubacio en TMB-solvaĵo dum 30 minutoj je ĉambra temperaturo. Post kiam la kolordisvolviĝo estis haltigita per haltiga solvaĵo, mezuru la absorbadon je 450 nm. Plasmospecimenoj estis submetitaj al solidfaza ekstraktado antaŭ Aβ(1–40) ELISA. Plasmo estis aldonita al 0.2% DEA (Sigma) en 96-putaj platoj kaj inkubaciita je ĉambra temperaturo dum 30 minutoj. Post sinsekva lavado de la SPE-platoj (Oasis, 186000679) per akvo kaj 100% metanolo, plasmospecimenoj estis aldonitaj al la SPE-platoj kaj la tuta likvaĵo estis forigita. Specimenoj estis lavitaj (unue per 5% metanolo, poste per 30% metanolo) kaj eluitaj per 2% NH4OH/90% metanolo. Post sekigado de la eluato je 55°C dum 99 minutoj ĉe konstanta N2-kurento, la specimenoj estis reduktitaj en normaj diluiloj kaj Aβ(1–40) estis mezurita kiel priskribite supre.
Kiel citi ĉi tiun artikolon: Urich, E. et al. Kargoliverado al la cerbo uzante transitajn peptidojn identigitajn in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB kaj Moos T. Liverado de makromolekulaj drogoj al la cerbo uzante celitan terapion. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., kaj Martinez-Martinez, P. Liverado de peptidaj kaj proteinaj medikamentoj trans la sango-cerban barieron. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM La sango-cerba bariero: proplempunkto en la disvolviĝo de cerbaj medikamentoj. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, kaj Byrd, A. Perspektivoj por plibonigita liverado de medikamentoj kaj celado al la cerbo per la koroida plekso-cerbo-spina vojo. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernigo de biofarmaciaĵoj per molekulaj trojaj ĉevaloj por cerba liverado. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptor-mediaciita peptida transporto trans la sango-cerban barieron. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Pliigu cerban penetron kaj efikecon de terapiaj antikorpoj uzante monovalentajn molekulajn navedojn. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transporto de transferina receptoro (TfR) determinas cerban sorbadon de afinecaj variaĵoj de TfR-antikorpoj. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).