Dankon pro via vizito al Nature.com. La retumilversio, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu kongruecan reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montros la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Genvektoroj por la traktado de mukoviskozeca pulma malsano devus celi la kondukajn aervojojn, ĉar periferia pulma transdukto ne provizas terapian utilon. Virusa transdukta efikeco estas rekte rilata al vektora restadtempo. Tamen, liverfluidoj kiel genportantoj nature difuzas en la alveolojn dum inspiro, kaj terapiaj partikloj de iu ajn formo estas rapide forigitaj per mukociliara transporto. Plilongigi la restadtempon de genportantoj en la aervojoj estas grava sed malfacile atingebla. Genportanto-konjugitaj magnetaj partikloj, kiuj povas esti direktitaj al la surfaco de la aervojoj, povas plibonigi regionan celadon. Pro la defioj de en viva bildigo, la konduto de tiaj malgrandaj magnetaj partikloj sur la aervoja surfaco en la ĉeesto de aplikata magneta kampo estas malbone komprenata. La celo de ĉi tiu studo estis uzi sinkrotronan bildigon por bildigi la en vivan moviĝon de serio de magnetaj partikloj en la trakeo de narkotitaj ratoj por ekzameni la dinamikon kaj ŝablonojn de individua kaj amasa partikla konduto en vivo. Ni tiam ankaŭ taksis ĉu la livero de lentivirusaj magnetaj partikloj en la ĉeesto de magneta kampo pliigus la transduktan efikecon en la rata trakeo. Sinkrotrono Rentgenfota bildigo rivelas la konduton de magnetaj partikloj en senmovaj kaj moviĝantaj magnetaj kampoj in vitro kaj in vivo. Partikloj ne povas esti facile trenitaj laŭ la surfaco de la vivanta aervojo per magnetoj, sed dum transporto, la deponaĵoj koncentriĝas en la vidkampo kie la magneta kampo estas plej forta. La transdukta efikeco ankaŭ sesobliĝis kiam lentivirusaj magnetaj partikloj estis liveritaj en la ĉeesto de magneta kampo. Kune, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke lentivirusaj magnetaj partikloj kaj magnetaj kampoj povus esti valoraj aliroj por plibonigi genan vektoran celadon kaj pliigi transduktajn nivelojn en kondukantaj aervojoj in vivo.
Mista fibrozo (CF) estas kaŭzata de vario en ununura geno nomata la CF-transmembrana konduktanca regulilo (CFTR). La CFTR-proteino estas jonkanalo, kiu ĉeestas en multaj epiteliaj ĉeloj tra la tuta korpo, inkluzive de la konduktaj aervojoj, grava loko de CF-patogenezo. CFTR-difektoj kondukas al nenormala akvotransporto, senakvigante la aervojan surfacon kaj reduktante la profundon de la likva tavolo de la aervoja surfaco (ASL). Ĉi tio ankaŭ difektas la kapablon de la mukociliara transporta (MCT) sistemo forigi enspiritajn partiklojn kaj patogenojn el la aervojoj. Nia celo estas disvolvi lentivirusan (LV) genterapion por liveri la ĝustan kopion de la CFTR-geno kaj plibonigi ASL, MCT kaj pulman sanon, kaj daŭre disvolvi novajn teknologiojn kapablajn mezuri ĉi tiujn parametrojn en vivo1.
LV-vektoroj estas unu el la ĉefaj kandidatoj por CF-aervoja genterapio, ĉefe ĉar ili povas permanente integri la terapian genon en la bazajn ĉelojn de la aervojoj (aervojaj stamĉeloj). Ĉi tio gravas ĉar ili povas restarigi normalan hidratadon kaj mukoforigon per diferenciĝo en funkciajn gen-korektitajn CF-asociitajn aervojajn surfacajn ĉelojn, rezultante en dumvivaj avantaĝoj. LV-vektoroj devus esti direktitaj kontraŭ la kondukanta aervojo, ĉar tie komenciĝas CF-pulma malsano. Liverado de la vektoro pli profunde en la pulmon povas rezultigi alveolaran transdukton, sed ĉi tio ne havas terapian utilon en CF. Tamen, fluidoj kiel genportantoj nature migras al la alveoloj post inspiro post liverado3,4 kaj terapiaj partikloj estas rapide forigitaj en la buŝkavon per MCT. La efikeco de LV-transdukto estas rekte rilata al la daŭro de la tempo, kiun la vektoro restas apud celĉeloj por permesi ĉelan sorbadon - la "restadtempon"5 - kiu estas facile reduktita per tipa regiona aerfluo same kiel kunordigita partikla mukokapto kaj MCT. Por CF, la kapablo plilongigi la restadtempon de la LV ene de la aervojo estas grava por atingi altajn nivelojn de transdukto en ĉi tiu regiono, sed ĝis nun estis malfacila.
Por superi ĉi tiun obstaklon, ni sugestas, ke LV magnetaj partikloj (MP) povus helpi laŭ du komplementaj manieroj. Unue, ili povas esti magnete gvidataj al la aervoja surfaco por plibonigi celadon kaj helpi la gen-portantajn partiklojn loĝi en la dezirata aervoja regiono; kaj (ASL) moviĝi al ĉeltavolo 6. MP-oj estis vaste uzataj kiel celitaj medikamentenhavaj vehikloj kiam ili ligiĝas al antikorpoj, kemoterapiaj drogoj aŭ aliaj malgrandaj molekuloj, kiuj ligiĝas al ĉelmembranoj aŭ ligiĝas al koncernaj ĉelsurfacaj receptoroj kaj akumuliĝas ĉe tumorlokoj en la ĉeesto de statika elektro. Magnetaj Kampoj por Kancera Traktado 7. Aliaj "hipertermikaj" teknikoj celas varmigi mikroskopiajn (MP) kiam ili estas eksponitaj al oscilantaj magnetaj kampoj, tiel detruante tumorĉelojn. La principo de magneta transfekto, en kiu magneta kampo estas uzata kiel transfekta agento por plibonigi la translokigon de DNA al ĉeloj, estas ofte uzata in vitro uzante gamon da ne-virusaj kaj virusaj genvektoroj por malfacile transdukteblaj ĉellinioj. La efikeco de LV-magnetotransfekto estis establita, kun in vitro liverado de LV-MP al homa bronka epitelia ĉellinio en la ĉeesto de statika magneta kampo, pliigante la transduktan efikecon je 186-oble kompare kun LV-vektoro sole. LV-MP ankaŭ estis aplikita al in vitro CF-modelo, kie magneta transfekto pliigis LV-transdukton en aero-likvaĵaj interfacaj kulturoj je 20-oble en la ĉeesto de CF-eksperkaĵo10. Tamen, in vivo magnetotransfekto de organoj ricevis relative malmulte da atento kaj estis taksita nur en kelkaj bestaj studoj11,12,13,14,15, precipe en la pulmoj16,17. Tamen, la ŝancoj por magneta transfekto en CF-pulma terapio estas klaraj. Tan et al. (2020) deklaris, ke "pruvo-de-konceptstudo pri efika magneta nanopartikla pulma liverado pavimos la vojon por estontaj CFTR-enspiraj strategioj por plibonigi klinikajn rezultojn en CF-pacientoj"6.
La konduto de malgrandaj magnetaj partikloj sur aervojaj surfacoj en la ĉeesto de aplikata magneta kampo estas malfacile bildigebla kaj studebla, kaj tial malbone komprenata. En aliaj studoj, ni evoluigis sinkrotron-disvastiĝ-bazitan fazkontrastan rentgenan bildigan (PB-PCXI) metodon por neinvazie bildigi kaj kvantigi etajn en vivajn ŝanĝojn en ASL-profundo18 kaj MCT-konduto19,20 por rekte mezuri gaskanalan surfacan hidratiĝon kaj uzi ĝin kiel fruan indikilon de kuracefikeco. Krome, nia MCT-taksmetodo uzas 10-35 µm diametrajn partiklojn konsistantajn el alumino-tero aŭ alt-refraktaindica vitro kiel MCT-signojn videblajn uzante PB-PCXI21. Ambaŭ teknikoj taŭgas por bildigo de diversaj partiklaj tipoj, inkluzive de MP.
Pro ĝia alta spaca kaj tempa distingivo, niaj PB-PCXI-bazitaj ASL kaj MCT analizaj teknikoj bone taŭgas por ekzameni la dinamikon kaj ŝablonojn de konduto de unuopaj kaj amasaj partikloj in vivo por helpi nin kompreni kaj optimumigi teknikojn de MP-genliverado. La aliro, kiun ni uzas ĉi tie, devenas de niaj studoj uzante la SPring-8 BL20B2-lumlinion, en kiu ni bildigis fluidan movadon post ŝajnvektora dozoliverado en la nazajn kaj pulmajn aervojojn de musoj por helpi klarigi niajn neunuformajn genekspresio-ŝablonojn observitajn en niaj bestostudoj pri genportantaj dozoj 3,4.
La celo de ĉi tiu studo estis uzi la sinkrotronon PB-PCXI por bildigi la en vivajn movojn de serio de magnetaj kampopartikloj (MP) en la trakeo de vivantaj ratoj. Ĉi tiuj PB-PCXI-bildigaj studoj estis desegnitaj por testi gamon da MP-oj, magnetajn kampajn fortojn kaj lokojn por determini ilian efikon sur la moviĝo de MP-oj. Ni hipotezis, ke ekstere aplikata magneta kampo helpus la liveritan MP-on resti aŭ moviĝi al la cela areo. Ĉi tiuj studoj ankaŭ permesis al ni identigi magnetajn konfiguraciojn, kiuj maksimumigas la nombron da partikloj retenitaj en la trakeo post deponado. En dua serio de studoj, ni celis uzi ĉi tiun optimuman konfiguracion por demonstri la transduktan ŝablonon rezultantan de en viva liverado de LV-MP-oj al la aervojo de la ratoj, bazite sur la supozo, ke la liverado de LV-MP-oj en la kunteksto de celado de la aervojo rezultigus plibonigitan LV-transduktan efikecon.
Ĉiuj bestostudoj estis faritaj laŭ protokoloj aprobitaj de la Universitato de Adelajdo (M-2019-060 kaj M-2020-022) kaj la SPring-8 Sinkrotrona Besto-Etika Komitato. Eksperimentoj estis faritaj laŭ ARRIVE-gvidlinioj.
Ĉiuj rentgenaj bildoj estis faritaj ĉe la BL20XU-lumlinio ĉe la SPring-8-sinkrotrono en Japanio, uzante aranĝon similan al tiu priskribita antaŭe21,22. Mallonge, la eksperimenta skatolo situis 245 m de la sinkrotrona stokringo. Distanco inter specimeno kaj detektilo de 0.6 m estas uzata por partiklaj bildigaj studoj kaj 0.3 m por en vivaj bildigaj studoj por generi fazkontrastajn efikojn. Monokromata radienergio de 25 keV estis uzata. Bildoj estis kaptitaj uzante alt-rezolucian rentgen-konvertilon (SPring-8 BM3) kunligitan al sCMOS-detektilo. La konvertilo konvertas rentgen-radiojn al videbla lumo uzante 10 µm dikan scintililon (Gd3Al2Ga3O12), kiu poste estas direktita al sCMOS-sensilo uzante × 10 mikroskopan celon (NA 0.3). La sCMOS-detektilo estis Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japanio) kun arograndeco de 2048 × 2048 rastrumeroj kaj kruda rastrumera grandeco de 6,5 × 6,5 µm. Ĉi tiu aranĝo donas efikan izotropan rastrumeran grandecon de 0,51 µm kaj vidkampon de proksimume 1,1 mm × 1,1 mm. Ekspona daŭro de 100 ms estis elektita por maksimumigi la signalo-bruo-rilatumon de magnetaj partikloj ene kaj ekster la aervojo, minimumigante spirad-induktitajn moviĝartefaktojn. Por en vivaj studoj, rapida rentgen-obturatoro estis metita en la rentgen-vojon por limigi la radiaddozon blokante la rentgen-faskon inter eksponigoj.
La LV-portanto ne estis uzata en iuj ajn bildigaj studoj de SPring-8 PB-PCXI, ĉar la bildiga ĉambro BL20XU ne estas atestita laŭ Biosekureca Nivelo 2. Anstataŭe, ni elektis gamon da bone karakterizitaj mikromagnetaj (MP) de du komercaj provizantoj — kovrantaj gamon da grandecoj, materialoj, ferkoncentriĝoj kaj aplikoj — unue por kompreni kiel magnetaj kampoj influas MP-moviĝon ene de vitraj kapilaroj, kaj poste en vivantaj aervojoj. sur la surfaco. MP-oj varias en grandeco de 0,25 ĝis 18 μm kaj estas faritaj el diversaj materialoj (vidu Tabelon 1), sed la konsisto de ĉiu specimeno, inkluzive de la grandeco de la magnetaj partikloj ene de la MP, estas nekonata. Bazite sur niaj ampleksaj MCT-studoj 19, 20, 21, 23, 24, ni atendas, ke MP-oj eĉ nur 5 μm videblas sur la surfaco de la traĥea aervojo, ekzemple subtrahante sinsekvajn kadrojn por vidi plibonigitan videblecon de la MP-moviĝo. Ununura 0,25 μm-granda MP estas pli malgranda ol la rezolucio de la bildiga aparato, sed oni atendas, ke PB-PCXI detektos ilian volumenan kontraston kaj la movadon de la surfaca fluido, sur kiu ili estas deponitaj post la deponado.
Specimenoj por ĉiu MP en Tabelo 1 estis preparitaj en 20 μl vitraj kapilaroj (Drummond Microcaps, PA, Usono) kun interna diametro de 0.63 mm. Korpuskulaj partikloj estas haveblaj en akvo, dum CombiMag-partikloj estas haveblaj en la proprieta fluido de la fabrikanto. Ĉiu tubo estas duone plenigita per likvaĵo (ĉirkaŭ 11 μl) kaj metita sur la specimenan tenilon (vidu Figuron 1). La vitraj kapilaroj estis metitaj horizontale sur la specimenan scenejon en la bildiga skatolo, respektive, kaj poziciigitaj laŭ la randoj de la fluido. 19 mm diametro (28 mm longa) nikela ŝelo rara tera neodima fera bora (NdFeB) magneto (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Aŭstralio) kun resta magnetigo de 1.17 Tesloj estis ligita al aparta translacia scenejo por atingi ŝanĝon de ĝia pozicio malproksime dum bildigo. Rentgen-bilda akiro komenciĝas kiam la magneto estas poziciigita ĉirkaŭ 30 mm super la specimeno, kaj bildoj estas akiritaj kun rapideco de 4 kadroj por sekundo. Dum bildigo, la magneto estis alportita proksime al la vitra kapilara tubo (ĉirkaŭ 1 mm for) kaj poste translokigita laŭlonge de la tubo por taksi la efikojn de kampoforto kaj pozicio.
Envitra bildiga aranĝo enhavanta MP-provaĵojn en vitraj kapilaroj sur la provaĵa xy-tradukada scenejo. La vojo de la rentgen-fasko estas markita per ruĝa streketo.
Post kiam la *in vitro* videbleco de MP-oj estis establita, subaro de ili estis testita *in vivo* en sovaĝ-tipaj inaj albinaj Wistar-ratoj (~12 semajnojn aĝaj, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidino (Domitor®, Zenoaq, Japanio), 3,2 mg/kg midazolamo (Dormicum®, Astellas Pharma, Japanio) kaj 4 mg/kg butorfanolo (Vetorphale®, Meiji Seika). Ratoj estis anestezitaj per miksaĵo de *Pharma*, Japanio) per intraperitonea injekto. Post anestezo, ili estis preparitaj por bildigo per forigo de la felo ĉirkaŭ la trakeo, enmeto de endotrakea tubo (ET; 16 Ga intravejna kanulo, Terumo BCT) kaj senmovigado de ili kuŝante sur speciale farita bildiga plato enhavanta termikan sakon por konservi korpan temperaturon [22]. La bildiga plato estis poste ligita al la provaĵa traduka scenejo en la bildiga skatolo laŭ iometa angulo por vicigi la trakeon horizontale en la rentgen-bildo, kiel montrite en Figuro. 2a.
(a) En viva bildiga aranĝo en la SPring-8-bildiga skatolo, la vojo de la rentgen-fasko estas markita per ruĝa streketo. (b,c) Magneta lokalizo sur la trakeo estis farita malproksime uzante du ortogonale muntitajn IP-fotilojn. Maldekstre de la ekrana bildo, la drata buklo tenanta la kapon videblas, kaj la liverkanulo en loko ene de la ET-tubo.
Teleregata injektilpumpilo (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) uzanta 100 μl vitran injektilon estis konektita al PE10-tubo (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) per 30 Ga-pinglo. Marku la tubon por certigi, ke la pinto estas en la ĝusta pozicio en la trakeo dum enmeto de la ET-tubo. Uzante la mikropumpilon, la injektilpiŝto estis retirita dum la pinto de la tubo estis mergita en la MP-specimenon liverotan. La ŝarĝita livertubo tiam estis enigita en la endotrakean tubon, metante la pinton ene de la plej forta parto de nia atendata aplikata magneta kampo. Bildakiro estis kontrolita per spiraddetektilo konektita al nia Arduino-bazita tempiga skatolo, kaj ĉiuj signaloj (ekz. temperaturo, spirado, obturatormalfermo/fermo kaj bildakiro) estis registritaj uzante Powerlab kaj LabChart (AD Instruments, Sidnejo, Aŭstralio) 22. Dum bildigado... Kiam la enfermaĵo estis neatingebla, du IP-fotiloj (Panasonic BB-SC382) estis poziciigitaj je proksimume 90° unu de la alia kaj estis uzitaj por monitori la pozicion de la magneto relative... al la trakeo dum bildigo (Fig. 2b,c). Por minimumigi moviĝajn artefaktojn, unu bildo estis akirita por ĉiu spiro dum la fina tajda fluo-altebenaĵo.
Magneto estas ligita al dua ŝtupo, kiu povas esti lokita malproksime de ekster la bildiga enfermaĵo. Diversaj magnetpozicioj kaj konfiguracioj estis testitaj, inkluzive de: Muntita laŭ angulo de proksimume 30° super la trakeo (konfiguracioj montritaj en Figuroj 2a kaj 3a); unu magneto super la besto kaj la alia sube, kun polusoj agorditaj por altiri (Figuro 3b); unu magneto super la besto kaj la alia sube, kun la polusoj agorditaj por forpuŝi (Figuro 3c); kaj unu magneto super kaj perpendikulare al la trakeo (Figuro 3d). Post kiam la besto kaj magneto estas agorditaj kaj la testota MP estas ŝarĝita en la injektilpumpilon, donu 50 μl dozon je rapideco de 4 μl/sek dum vi akiras bildojn. La magneto tiam estas movita tien kaj reen laŭ aŭ laterale trans la trakeo dum vi daŭre akiras bildojn.
Magneta konfiguracio por en viva bildigo (a) ununura magneto super la trakeo laŭ angulo de proksimume 30°, (b) du magnetoj agorditaj por altiri, (c) du magnetoj agorditaj por forpuŝi, (d) ununura magneto super kaj perpendikulare en la trakeo. La observanto rigardis malsupren de la buŝo al la pulmoj tra la trakeo, kaj la rentgen-fasko trapasis la maldekstran flankon de la rato kaj eliris la dekstran flankon. La magneto estas aŭ movita laŭlonge de la aervojo aŭ maldekstren kaj dekstren super la trakeo en la direkto de la rentgen-fasko.
Ni ankaŭ celis determini la videblecon kaj konduton de partikloj en la aervojoj en la foresto de konfuziga spirado kaj kora movo. Tial, ĉe la fino de la bildiga periodo, bestoj estis humane mortigitaj pro superdozo de pentobarbitalo (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Usono; ~65 mg/kg ip). Kelkaj bestoj estis lasitaj sur la bildiga platformo, kaj post kiam spirado kaj korbato ĉesis, la bildiga procezo estis ripetata, aldonante plian dozon de MP se neniu MP estis videbla sur la aervoja surfaco.
La akiritaj bildoj estis korektitaj laŭ plata kaj malhela kampo kaj poste kunmetitaj en filmon (20 kadroj por sekundo; 15-25 × normala rapido depende de la spirfrekvenco) uzante specialan skripton skribitan en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ĉiuj studoj pri liverado de LV-genaj vektoroj estis faritaj ĉe la Laboratoria Besto-Esplorinstalaĵo ĉe la Universitato de Adelajdo kaj celis uzi la rezultojn de la SPring-8 eksperimento por taksi ĉu LV-MP-liverado en la ĉeesto de magneta kampo povus plifortigi gentransdonon in vivo. Por taksi la efikojn de MP kaj magneta kampo, du grupoj de bestoj estis traktitaj: unu grupo ricevis LV-MP kun magneto, kaj la alia grupo ricevis kontrolgrupon kun LV-MP sen magneto.
LV-genaj vektoroj estis generitaj uzante antaŭe priskribitajn metodojn 25, 26. La LacZ-vektoro esprimas la nukle-lokalizitan beta-galaktozidazan genon pelatan de la konstitua MPSV-reklamanto (LV-LacZ), kiu produktas bluan reakcian produkton en transduktitaj ĉeloj, videblan en pulmaj histaj frontoj kaj histaj sekcioj. Titrado estis farita en ĉelkulturoj per mana kalkulado de la nombro de LacZ-pozitivaj ĉeloj per hemocitometro por kalkuli la titron en TU/ml. Portiloj estas kriokonservitaj je -80 °C, degelitaj antaŭ uzo, kaj ligitaj al CombiMag per miksado je 1:1 proporcio kaj kovado sur glacio dum almenaŭ 30 minutoj antaŭ livero.
Normalaj Sprague Dawley-ratoj (n = 3/grupo, ~2-3 estis narkotitaj intraperitonee per miksaĵo de 0.4 mg/kg medetomidino (Domitor, Ilium, Aŭstralio) kaj 60 mg/kg ketamino (Ilium, Aŭstralio) (monataj) ip) injekto kaj nekirurgia buŝa kanulado per 16 Ga intravejna kanulo. Por certigi, ke la traĥea aervoja histo ricevas LV-transdukton, ĝi estis kondiĉigita uzante nian antaŭe priskribitan mekanikan perturboprotokolon, en kiu la traĥea aervoja surfaco estis frotita akse per drata korbo (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, Usono) 30 s28. Traĥea administrado de LV-MP estis poste farita en biologia sekureca ŝranko ĉirkaŭ 10 minutojn post la perturbo.
La magneta kampo uzita en ĉi tiu eksperimento estis agordita simile al la en viva rentgena bildiga studo, kun la samaj magnetoj tenataj super la trakeo uzante distilajn stentajn agrafojn (Figuro 4). 50 μl volumeno (2 × 25 μl alikvotoj) de LV-MP estis enmetita en la trakeon (n = 3 bestoj) uzante pipeton enhavantan ĝelan pinton kiel antaŭe priskribite. Kontrola grupo (n = 3 bestoj) ricevis la samajn LV-MP-ojn sen la uzo de magneto. Post kiam la infuzaĵo estas kompleta, la kanulo estas forigita de la ET-tubo kaj la besto estas ekstubatigita. La magneto restas en la loko dum 10 minutoj, poste ĝi estas forigita. Ratoj ricevis subhaŭtan dozon de meloksikamo (1 ml/kg) (Ilium, Aŭstralio) sekvata de inversigo de anestezo per intraperitonea injekto de 1 mg/kg atipamazola hidroklorido (Antisedan, Zoetis, Aŭstralio). Ratoj estis tenataj varmaj kaj monitorataj ĝis plena resaniĝo de anestezo.
LV-MP-liverilo en biologia sekureca ŝranko. La helgriza Luer-nabo de la ET-tubo videblas elstaranta el la buŝo kaj la ĝelpinto de la pipeto montrita en la bildo estas enigita tra la ET-tubo ĝis la dezirata profundo en la trakeon.
Unu semajnon post la doza proceduro de LV-MP, la bestoj estis humane mortigitaj per 100% CO2-enspiro kaj la esprimo de LacZ estis taksita uzante nian norman X-gal-traktadon. La tri kaŭdalaj plej kartilagaj ringoj estis forigitaj por certigi, ke ajna mekanika difekto aŭ fluida reteno pro la lokigo de la endotraĥea tubo ne estis inkludita en la analizo. Ĉiu trakeo estis tranĉita laŭlonge por krei du duonojn por analizo, kaj ili estis muntitaj en plado enhavanta silikonan kaŭĉukon (Sylgard, Dow Inc) uzante Minutien-pinglon (Fine Science Tools) por bildigi la lumenan surfacon. La distribuo kaj padrono de transduktitaj ĉeloj estis konfirmitaj per fronta fotado uzante Nikon-mikroskopon (SMZ1500) kun DigiLite-fotilo kaj TCapture-programaro (Tucsen Photonics, Ĉinio). Bildoj estis akiritaj je 20-obla pligrandigo (inkluzive de la plej alta agordo por la plena larĝo de la trakeo), kun la tuta longo de la trakeo bildigita paŝon post paŝo, certigante sufiĉan interkovron inter ĉiu bildo por permesi bildan "kudradon". Bildoj de ĉiu trakeo estis poste kunmetitaj. en unuopan komponitan bildon uzante la Bildan Kompozitan Redaktilon v2.0.3 (Microsoft Research) utiligantan ebenan movadalgoritmon. LacZ-esprimaj areoj en komponitaj bildoj de la trakeo de ĉiu besto estis kvantigitaj uzante aŭtomatigitan MATLAB-skripton (R2020a, MathWorks) kiel antaŭe priskribite, uzante agordojn de 0.35 < Nuanco < 0.58, Saturiĝo > 0.15, kaj Valoro < 0.7. Spurante la konturojn de la histo, masko estis mane generita en GIMP v2.10.24 por ĉiu komponita bildo por identigi la histareon kaj malhelpi iujn ajn falsajn detektojn de ekster la trakea histo. La makulitaj areoj de ĉiuj komponitaj bildoj de ĉiu besto estis sumigitaj por generi la totalan makulitan areon por tiu besto. La makulita areo estis tiam dividita per la totala maskareo por generi la normigitan areon.
Ĉiu trakeo estis enigita en parafinon kaj 5 μm sekcioj estis tranĉitaj. Sekcioj estis kontraŭkolorigitaj per neŭtrala rapida ruĝo dum 5 minutoj kaj bildoj estis akiritaj per mikroskopo Nikon Eclipse E400, fotilo DS-Fi3 kaj NIS-elementa kapta programaro (versio 5.20.00).
Ĉiuj statistikaj analizoj estis faritaj per GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistika signifeco estis difinita je p ≤ 0.05. Normaleco estis kontrolita per la Shapiro-Wilk-testo, kaj diferencoj en LacZ-kolorigo estis taksitaj per la nepara t-testo.
La ses mikropartikloj (MP) priskribitaj en Tabelo 1 estis ekzamenitaj per PCXI, kaj la videbleco estas priskribita en Tabelo 2. Du polistirenaj MP-oj (MP1 kaj MP2; 18 μm kaj 0.25 μm, respektive) ne estis videblaj sub PCXI, sed la ceteraj specimenoj estis identigeblaj (ekzemploj estas montritaj en Figuro 5). MP3 kaj MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm kaj 0.9 μm, respektive) estas apenaŭ videblaj. Kvankam enhavante kelkajn el la plej malgrandaj testitaj partikloj, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) estis la plej okulfrapa. La CombiMag-produkto MP6 estas malfacile videbla. En ĉiuj kazoj, nia kapablo detekti MP estis signife plibonigita per translacio de la magneto tien kaj reen paralele al la kapilaro. Kiam la magnetoj moviĝis for de la kapilaro, la partikloj etendiĝis en longaj ŝnuroj, sed kiam la magnetoj alproksimiĝis kaj la magneta kampa forto pliiĝis, la partiklaj ŝnuroj mallongiĝis dum la partikloj migris al la supra surfaco de la kapilaro (vidu Aldonan Videon). S1: MP4), pliigante la partiklan densecon de la surfaco. Male, kiam la magneto estas forigita el la kapilaro, la kampa forto malpliiĝas kaj la MP-oj rearanĝas en longajn ŝnurojn etendiĝantajn de la supra surfaco de la kapilaro (vidu Aldonan Videon S2:MP4). Post kiam la magneto ĉesas moviĝi, la partikloj daŭre moviĝas dum mallonga tempo post atingado de la ekvilibra pozicio. Dum la MP moviĝas al kaj for de la supra surfaco de la kapilaro, la magnetaj partikloj tipe trenas la derompaĵojn tra la fluido.
La videbleco de MP sub PCXI varias signife inter specimenoj. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 kaj (d) MP6. Ĉiuj bildoj montritaj ĉi tie estis prenitaj per magneto situanta ĉirkaŭ 10 mm rekte super la kapilaro. La ŝajnaj grandaj cirkloj estas aervezikoj kaptitaj en la kapilaroj, klare montrante la nigrajn kaj blankajn randajn trajtojn de fazkontrasta bildigo. La ruĝa skatolo enhavas la kontrast-plibonigan pligrandigon. Notu, ke la diametroj de la magnetaj skemoj en ĉiuj figuroj ne estas laŭskalaj kaj estas ĉirkaŭ 100 fojojn pli grandaj ol montritaj.
Dum la magneto estas translaciita maldekstren kaj dekstren laŭ la supro de la kapilaro, la angulo de la MP-ŝnuro ŝanĝiĝas por akordiĝi kun la magneto (vidu Figuron 6), tiel difinante la magnetajn kampajn liniojn. Por MP3-5, post kiam la kordo atingas sojlan angulon, la partikloj estas trenitaj laŭ la supra surfaco de la kapilaro. Tio ofte rezultas en MP-oj grupiĝantaj en pli grandajn grupojn proksime al kie la magneta kampo estas plej forta (vidu Aldonan Videon S3:MP5). Tio ankaŭ estas precipe evidenta dum bildigo proksime al la kapilara fino, kio kaŭzas ke MP-oj agregiĝas kaj koncentriĝas ĉe la fluido-aera interfaco. Partikloj en MP6, kiujn estis pli malfacile distingi ol en MP3-5, ne estis trenitaj dum la magneto moviĝis laŭ la kapilaro, sed la MP-ŝnuroj disiĝis, lasante la partiklojn en la vidkampo (vidu Aldonan Videon S4:MP6). En iuj kazoj, kiam la aplikata magneta kampo estis reduktita per movado de la magneto je granda distanco de la bildiga loko, ĉiuj restantaj MP-oj malrapide descendis al la malsupra surfaco de la tubo per gravito restante en la ŝnuro (vidu Aldonan Videon S5: MP3).
La angulo de la MP-ŝnuro ŝanĝiĝas dum la magneto estas translaciita dekstren super la kapilaro. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 kaj (d) MP6. La ruĝa skatolo enhavas la kontrast-plibonigan pligrandigon. Notu, ke la suplementaj filmetoj estas informaj, ĉar ili malkaŝas gravajn partiklajn strukturojn kaj dinamikajn informojn, kiujn oni ne povas bildigi en ĉi tiuj senmovaj bildoj.
Niaj testoj montris, ke malrapida movado de la magneto tien kaj reen laŭlonge de la trakeo faciligas la bildigon de MP en la kunteksto de kompleksa movado in vivo. In vivo-testado ne estis farita, ĉar polistirenaj globetoj (MP1 kaj MP2) ne estis videblaj en la kapilaro. Ĉiu el la ceteraj kvar MP-oj estis testita in vivo kun la longa akso de la magneto konfigurita super la trakeo laŭ angulo de ĉirkaŭ 30° rilate al la vertikala (vidu Figurojn 2b kaj 3a), ĉar tio rezultigis pli longajn MP-ĉenojn kaj estis pli efika ol la magneta konfiguracio finita. MP3, MP4 kaj MP6 ne estis detektitaj en la trakeo de iuj vivaj bestoj. Kiam la aervojoj de ratoj estis bildigitaj post kiam la bestoj estis humane mortigitaj, la partikloj restis nevideblaj eĉ kiam plia volumeno estis aldonita per injektilpumpilo. MP5 havis la plej altan feroksidan enhavon kaj estis la sola videbla partiklo, kaj tial estis uzata por taksi kaj karakterizi la in vivan konduton de MP.
Metante la magneton super la trakeon dum la MP-liverado, multaj, sed ne ĉiuj, MP-oj koncentriĝis en la vidkampo. Partikloj enirantaj la trakeon estas plej bone observataj ĉe humane oferitaj bestoj. Figuro 7 kaj Aldona Vidbendo S6: MP5 montras rapidan magnetan kapton kaj vicigon de partikloj sur la surfaco de la ventra trakeo, indikante ke MP-oj povas esti direktitaj al dezirataj regionoj de la trakeo. Serĉante pli distale laŭlonge de la trakeo post la MP-liverado, kelkaj MP-oj estis trovitaj pli proksime al la karino, sugestante ke la magneta kampa forto estis nesufiĉa por kolekti kaj reteni ĉiujn MP-ojn, ĉar ili estis liveritaj tra la regiono de maksimuma magneta kampa forto dum la fluida procezo. Tamen, postnaskaj MP-koncentriĝoj estis pli altaj ĉirkaŭ la bildigita areo, sugestante ke multaj MP-oj restis en la aervojaj regionoj kie la aplikita magneta kampa forto estis plej alta.
Bildoj de (a) antaŭ kaj (b) post la livero de MP5 en la trakeon de ĵus eŭtanaziigita rato kun la magneto poziciigita rekte super la bildiga areo. La bildigita areo situas inter la du kartilagaj ringoj. Antaŭ la livero de MP, estas iom da fluido en la aervojo. La ruĝa skatolo enhavas la kontrast-plibonigan pligrandigon. Ĉi tiuj bildoj estas el la video montrita en Aldona Video S6:MP5.
Movado de la magneto laŭlonge de la trakeo en vivo kaŭzis, ke la MP-ĉeno ŝanĝis angulon ene de la aervoja surfaco simile al tio, kion oni vidas en kapilaroj (vidu Figuron 8 kaj Aldonan Videon S7:MP5). Tamen, en nia studo, MP-oj ne povis esti trenitaj laŭlonge de la surfaco de la vivanta aervojo kiel ili povus kun kapilaroj. En iuj kazoj, la MP-ĉeno plilongiĝas dum la magneto moviĝas maldekstren kaj dekstren. Interese, ni ankaŭ trovis, ke la partikla ĉeno ŝajnas ŝanĝi la profundon de la surfaca fluida tavolo kiam la magneto estas movita laŭlonge laŭ la trakeo, kaj disetendiĝas kiam la magneto estas movita rekte supre kaj la partikla ĉeno estas rotaciita al vertikala pozicio (vidu Aldonan Videon S7). : MP5 je 0:09, sube dekstre). La karakteriza movpadrono ŝanĝiĝis kiam la magneto estis translokigita trans la supron de la trakeo laterale (tio estas, maldekstren aŭ dekstren de la besto anstataŭ laŭlonge de la trakeo). La partikloj ankoraŭ estis klare videblaj dum ili moviĝis, sed kiam la magneto estis forigita de la trakeo, la pintoj de la partiklaj ĉenoj fariĝis videblaj (vidu Aldonan Videon S8:MP5, komencante je 0:08). Ĉi tio kongruas kun la MP-konduto, kiun ni observis sub aplikita magneta kampo en vitra kapilaro.
Ekzemplaj bildoj montrantaj MP5 en la trakeo de viva narkotita rato. (a) La magneto estas uzata por akiri bildojn super kaj maldekstre de la trakeo, poste (b) post kiam la magneto estas movita dekstren. La ruĝa skatolo enhavas la kontrast-plibonigan pligrandigon. Ĉi tiuj bildoj estas el la video montrita en Aldona Video S7:MP5.
Kiam la du polusoj estis konfigurataj en nord-suda orientiĝo super kaj sub la trakeo (t.e., altirante; Fig. 3b), la MP-kordoj ŝajnis pli longaj kaj situis sur la flankmuro de la trakeo anstataŭ sur la dorsa trakea surfaco (vidu Suplementan Videon S9:MP5). Tamen, altaj koncentriĝoj de partikloj ĉe ununura loko (t.e., la dorsa surfaco de la trakeo) ne estis detektitaj post fluida liverado kiam duobla-magneta aparato estis uzata, kio tipe okazas kiam unu-magneta aparato estas uzata. Tiam, kiam unu magneto estis konfigurata por forpuŝi la polusojn inverse (Fig. 3c), la nombro da partikloj videblaj en la vidkampo ne ŝajnis pliiĝi post la liverado. La aranĝo de ambaŭ duobla-magnetaj konfiguracioj estas malfacila pro la altaj magnetaj kampaj fortoj, kiuj tiras aŭ puŝas la magnetojn, respektive. La aranĝo tiam estis ŝanĝita al ununura magneto paralela al la aervojo sed pasanta tra la aervojo je 90 gradoj tiel ke la kampolinioj transiris la trakean muron orte (Fig. 3d), orientiĝo desegnita por determini ĉu partikla agregaĵo sur la flanka muro povus esti observita. Tamen, en ĉi tio... konfiguracio, ne estis identigebla movado de MP-akumuliĝo aŭ magneta movado. Surbaze de ĉiuj ĉi tiuj rezultoj, unu-magneta, 30-grada orientiĝa konfiguracio (Figuro 3a) estis elektita por en vivaj gen-portantaj studoj.
Kiam la besto estis plurfoje bildigita tuj post humana buĉado, la foresto de konfuziga hista moviĝo signifis, ke pli fajnaj kaj pli mallongaj partiklaj linioj povus esti distingitaj en la klara interkondra kampo, "ŝanceliĝemaj" laŭ la translacia moviĝo de la magneto. Tamen, ankoraŭ ne eblas klare vidi la ĉeeston kaj moviĝon de MP6-partikloj.
La LV-LacZ-titro estis 1,8 × 10⁶ TU/ml, kaj post 1:1 miksado kun CombiMag MP (MP6), bestoj ricevis 50 μl traĥean dozon de 9 × 10⁷ TU/ml LV-vehiklo (t.e., 4,5 × 10⁶ TU/rato). En ĉi tiuj studoj, anstataŭ movi la magneton dum nasko, ni fiksis la magneton en unu pozicio por determini ĉu LV-transdukto (a) povus esti plibonigita kompare kun vektora liverado en la foresto de magneta kampo, kaj (b) povus esti enfokusigita. Aervojaj ĉeloj estas transduktataj al magnetaj celaj regionoj de la supra aervojo.
La ĉeesto de magnetoj kaj la uzo de CombiMag kombinita kun LV-vektoroj ŝajne ne havas negativajn efikojn sur la sanon de bestoj, same kiel nia norma protokolo pri liverado de LV-vektoroj. Frontaj bildoj de la traĥea regiono submetita al mekanika perturbo (Aldona Figuro 1) indikis, ke estis signife pli altaj niveloj de transdukcio en la grupo de bestoj traktitaj per LV-MP kiam la magneto ĉeestis (Figuro 9a). Nur malgranda kvanto de blua LacZ-kolorigo ĉeestis en la kontrolgrupo (Figuro 9b). Kvantigo de normaligitaj X-Gal-kolorigitaj areoj montris, ke administrado de LV-MP en la ĉeesto de magneta kampo produktis proksimume 6-oblan plibonigon (Figuro 9c).
Ekzemplaj komponitaj bildoj montrantaj traĥean transdukton per LV-MP (a) en la ĉeesto de magneta kampo kaj (b) en la foresto de magneto. (c) Statistike signifa plibonigo en normaligita LacZ-transdukta areo ene de la traĥeo uzante la magneton (*p = 0,029, t-testo, n = 3 por grupo, meznombro ± SEM).
Neŭtrale rapide ruĝ-makulitaj sekcioj (ekzemplo montrita en Aldona Figuro 2) montris LacZ-makulitajn ĉelojn ĉeestantajn en simila padrono kaj loko kiel antaŭe raportite.
Ŝlosila defio por aervoja genterapio restas la preciza lokalizo de portantopartikloj al regionoj de intereso kaj atingado de altaj niveloj de transdukta efikeco en la moviĝanta pulmo en la ĉeesto de aerfluo kaj aktiva mukoforigo. Por maldekstraj ventriklaj portantoj desegnitaj por trakti CF-aervojan malsanon, pliigi la restadtempon de portantopartikloj ene de la konduktaj aervojoj estis ĝis nun malfacile atingebla celo. Kiel atentigis Castellani et al., la uzo de magnetaj kampoj por plibonigi transdukton havas avantaĝojn kompare kun aliaj genliveraj metodoj kiel elektroporado, ĉar ĝi povas kombini simplecon, kostefikecon, liverlokigon, pliigitan efikecon kaj pli mallongajn inkubaciajn tempojn, kaj eble pli malgrandan portantodozon10. Tamen, la en vivo deponado kaj konduto de magnetaj partikloj en la aervojoj sub la influo de eksteraj magnetaj fortoj neniam estis priskribita, nek la farebleco de ĉi tiu metodo estis fakte montrita en vivo por plibonigi genekspresio-nivelojn en sendifektaj vivantaj aervojoj.
Niaj en vitro sinkrotronaj PCXI-eksperimentoj montris, ke ĉiuj partikloj, kiujn ni testis, escepte de polistirena MP, estis videblaj en la bildiga aranĝo, kiun ni uzis. Ĉe magneta kampo, MP-oj formas ŝnurojn, kies longoj rilatas al la partikla tipo kaj magneta kampa forto (t.e., proksimeco kaj moviĝo de la magneto). Kiel montrite en Figuro 10, la ŝnuroj, kiujn ni observas, formiĝas pro tio, ke ĉiu individua partiklo estas magnetigita kaj induktas sian propran lokan magnetan kampon. Ĉi tiuj apartaj kampoj kaŭzas, ke aliaj similaj partikloj agregiĝas kaj konektiĝas, kun grupaj ŝnur-similaj movoj pro lokaj fortoj de la lokaj allogaj kaj forpuŝaj fortoj de aliaj partikloj.
Skemo montranta (a,b) partiklajn trajnojn generitajn ene de fluidaĵplenaj kapilaroj kaj (c,d) aerplenan trakeon. Notu, ke la kapilaroj kaj trakeo ne estas desegnitaj laŭ skalo. Panelo (a) ankaŭ enhavas priskribon de la MP, kiu enhavas Fe3O4-partiklojn aranĝitajn en ĉenoj.
Kiam la magneto estis movita super la kapilaro, la angulo de la partikla ĉeno atingis kritikan sojlon por MP3-5 enhavanta Fe3O4, post kio la partikla ĉeno jam ne restis en la originala pozicio, sed moviĝis laŭ la surfaco al nova pozicio. Ĉi tiu efiko verŝajne okazas ĉar la vitra kapilara surfaco estas sufiĉe glata por permesi ĉi tiun movadon okazi. Interese, MP6 (CombiMag) ne kondutis tiel, eble ĉar la partikloj estis pli malgrandaj, havis malsamajn tegaĵojn aŭ surfacajn ŝargojn, aŭ proprieta portanta fluido influis ilian kapablon moviĝi. La bildkontrasto de CombiMag-partikloj ankaŭ estas pli malforta, sugestante ke la fluido kaj partikloj eble havas similajn densecojn kaj tial ne facile moviĝas unu al la alia. Partikloj ankaŭ povas algluiĝi se la magneto moviĝas tro rapide, indikante ke la magneta kampa forto ne ĉiam povas superi la frotadon inter partikloj en la fluido, sugestante ke eble ne estas surprize ke la magneta kampa forto kaj la distanco inter la magneto kaj la cela areo estas tre gravaj. Kune, ĉi tiuj rezultoj ankaŭ sugestas ke, dum magnetoj povas kapti multajn MP-ojn kiuj fluas tra la cela areo, estas neverŝajne ke magnetoj povas esti fidindaj por moviĝi. CombiMag-partikloj laŭlonge de la surfaco de la trakeo. Tial ni konkludas, ke en vivaj LV-MP-studoj devus uzi statikajn magnetajn kampojn por fizike celi specifajn regionojn de la aervoja arbo.
Kiam partikloj estas liveritaj en la korpon, ili malfacilas identigi en la kunteksto de kompleksa moviĝanta korpa histo, sed la kapablo detekti ilin estis plibonigita per translacio de la magneto horizontale super la trakeo por "svingi" la MP-ŝnurojn. Kvankam viva bildigo eblas, estas pli facile percepti partiklan moviĝon post kiam la besto estis humane mortigita. MP-koncentriĝoj estis ĝenerale plej altaj ĉe ĉi tiu loko kiam la magneto estis poziciigita super la bildiga areo, kvankam kelkaj partikloj kutime troviĝis pli for laŭlonge de la trakeo. Kontraste al en vitraj studoj, partikloj ne povas esti trenitaj laŭlonge de la trakeo per translacio de la magneto. Ĉi tiu trovo kongruas kun kiel la muko, kiu kovras la surfacon de la trakeo, tipe prilaboras enspiritajn partiklojn, kaptante ilin en la muko kaj poste forigitaj per la mukociliara senigmekanismo.
Ni hipotezis, ke la uzo de magnetoj por altiro super kaj sub la trakeo (Fig. 3b) povus rezultigi pli unuforman magnetan kampon, anstataŭ magneta kampo tre koncentrita je unu punkto, eble kondukante al pli unuforma distribuo de partikloj. Tamen, nia prepara studo ne trovis klarajn pruvojn por subteni ĉi tiun hipotezon. Simile, la konfiguracio de paro da magnetoj por forpuŝi (Fig. 3c) ne rezultigis pli da partikla deponado en la bildigita areo. Ĉi tiuj du trovoj montras, ke la dumagneta aranĝo ne signife plibonigas lokan kontrolon de MP-celado, kaj ke la rezultantaj fortaj magnetaj fortoj estas malfacile agordeblaj, igante ĉi tiun aliron malpli praktika. Simile, la orientigo de la magneto super kaj tra la trakeo (Fig. 3d) ankaŭ ne pliigis la nombron da partikloj retenitaj en la bildigita areo. Kelkaj el ĉi tiuj alternativaj konfiguracioj eble ne sukcesos, ĉar ili rezultigas pli malaltajn magnetajn kampajn fortojn ene de la deponada areo. Tial, la ununura 30-grada angula magneta konfiguracio (Figuro 3a) estas konsiderata la plej facila kaj plej efika metodo por en viva testado.
La studo LV-MP montris, ke kiam LV-vektoroj estis kombinitaj kun CombiMag kaj liveritaj post fizika perturbo en la ĉeesto de magneta kampo, la transdukciaj niveloj estis signife pliigitaj en la trakeo kompare kun kontroloj. Surbaze de la sinkrotronaj bildigaj studoj kaj LacZ-rezultoj, la magneta kampo ŝajne kapablis konservi la LV ene de la trakeo kaj redukti la nombron de vektorpartikloj, kiuj tuj penetris profunde en la pulmon. Tiaj celaj plibonigoj povas konduki al pli alta efikeco, samtempe reduktante liveritajn titrojn, ekstercelan transdukton, inflamajn kaj imunajn kromefikojn, kaj kostojn de gen-portantoj. Grave, laŭ la fabrikanto, CombiMag povas esti uzata kune kun aliaj gen-transdonaj metodoj, inkluzive de aliaj virusvektoroj (kiel AAV) kaj nukleaj acidoj.