Kelkaj temoj pri LC-problemsolvado neniam eksdatas, ĉar ekzistas problemoj en LC-praktiko, eĉ dum instrumentteknologio pliboniĝas laŭlonge de la tempo. Ekzistas multaj manieroj, kiel problemoj povas ekesti en LC-sistemo kaj fini en malbona pinta formo. Kiam problemoj rilataj al pinta formo aperas, mallonga listo de eblaj kaŭzoj por ĉi tiuj rezultoj helpas simpligi nian sperton pri solvado.
Estis amuze verki ĉi tiun kolumnon "LC-Solvado de Problemoj" kaj pripensi temojn ĉiumonate, ĉar iuj temoj neniam eksmodiĝas. Dum en la kampo de kromatografia esplorado certaj temoj aŭ ideoj fariĝas malaktualaj, ĉar ili estas anstataŭataj de pli novaj kaj pli bonaj ideoj, en la kampo de problemsolvado, ekde la unua problemsolvada artikolo aperis en ĉi tiu revuo (la LC Journal tiutempe) (ĉar iuj temoj ankoraŭ estas aktualaj) en 1983 (1). Dum la pasintaj kelkaj jaroj, mi enfokusigis plurajn sekciojn pri LC-Solvado de Problemoj pri nuntempaj tendencoj, kiuj influas likvan kromatografion (LC) (ekzemple, la relativa komparo de nia kompreno pri la efiko de premo sur reteno [2] Novaj Progresoj) Nian interpreton de LC-rezultoj kaj kiel solvi problemojn per modernaj LC-instrumentoj. En ĉi tiu monata epizodo, mi daŭrigas mian serion (3), kiu komenciĝis en decembro 2021, kiu enfokusigis kelkajn el la "vivaj kaj mortaj" temoj de LC-solvado - elementoj, kiuj estas bonegaj por iu ajn problemsolvanto, estas esencaj, sendepende de la aĝo de la sistemo, kiun ni uzas. La kerna temo de ĉi tiu serio estas tre rilata al la fama mura diagramo "LC-Solvada Gvidilo" de LCGC (4). pendantaj en multaj laboratorioj. Por la tria parto de ĉi tiu serio, mi elektis fokusiĝi pri aferoj rilataj al pinta formo aŭ pintaj karakterizaĵoj. Nekredeble, la mura diagramo listigas 44 malsamajn eblajn kaŭzojn de malbona pinta formo! Ni ne povas detale konsideri ĉiujn ĉi tiujn problemojn en unu artikolo, do en ĉi tiu unua parto pri la temo, mi fokusiĝos pri kelkaj el tiuj, kiujn mi vidas plej ofte. Mi esperas, ke junaj kaj maljunaj LC-uzantoj trovos iujn helpemajn konsilojn kaj memorigilojn pri ĉi tiu grava temo.
Mi trovas min pli kaj pli respondanta problemsolvajn demandojn per "ĉio eblas". Ĉi tiu respondo povas ŝajni facila kiam oni konsideras observaĵojn, kiujn malfacilas interpreti, sed mi ofte trovas ĝin taŭga. Kun multaj eblaj kaŭzoj de malbona pintoformo, gravas konservi malferman menson kiam oni konsideras, kia povus esti la problemo, kaj povi prioritatigi eblajn kaŭzojn por komenci niajn problemsolvajn klopodojn, fokusante sur la plej oftaj eblecoj, ĉi tiu punkto estas tre grava.
Ŝlosila paŝo en iu ajn problemsolva ekzerco — sed unu, kiun mi opinias subtaksita — estas rekoni, ke ekzistas problemo, kiun oni devas solvi. Rekoni, ke ekzistas problemo, ofte signifas rekoni, ke tio, kio okazas al la ilo, diferencas de niaj atendoj, kiuj estas formitaj de teorio, empiria scio kaj sperto (5). La "pintformo" menciita ĉi tie fakte rilatas ne nur al la formo de la pinto (simetria, nesimetria, glata, lanuga, fronta rando, postsekva, ktp.), sed ankaŭ al la larĝo. Niaj atendoj pri la fakta pintoformo estas simplaj. Teorio (6) bone subtenas la lernolibran atendon, ke, en la plej multaj kazoj, la kromatografiaj pintoj devus esti simetriaj kaj konformiĝi al la formo de Gaŭsa distribuo, kiel montrite en Figuro 1a. Kion ni atendas de pintaj larĝoj estas pli kompleksa afero, kaj ni diskutos ĉi tiun temon en estonta artikolo. La aliaj pintaj formoj en Figuro 1 montras kelkajn el la aliaj eblecoj, kiujn oni povus observi — alivorte, kelkajn el la manieroj, kiel aferoj povus misfunkcii. En la resto de ĉi tiu parto, ni pasigos tempon diskutante kelkajn specifajn ekzemplojn de situacioj, kiuj povas konduki al ĉi tiuj. formospecoj.
Iafoje pintoj tute ne estas observataj en la kromatogramo, kie oni atendas, ke ili estos eluitaj. La supra mura diagramo indikas, ke la foresto de pinto (supozante, ke la specimeno efektive enhavas la celan analiton je koncentriĝo, kiu devus igi la detektilan respondon sufiĉa por vidi ĝin super la bruo) kutime rilatas al iu instrumenta problemo aŭ malĝustaj kondiĉoj de la mobilfazo (se observitaj entute). pintoj, kutime tro "malfortaj"). Mallonga listo de eblaj problemoj kaj solvoj en ĉi tiu kategorio troveblas en Tabelo I.
Kiel menciite supre, la demando pri kiom da pinta plilarĝiĝo oni devus toleri antaŭ ol atenti kaj provi ripari ĝin estas kompleksa temo, kiun mi diskutos en estonta artikolo. Mia sperto estas, ke signifa pinta plilarĝiĝo ofte akompanas signifan ŝanĝon en la pinta formo, kaj pinta postrestado estas pli ofta ol antaŭ-pinta aŭ disiĝo. Tamen, la nominale simetriaj pintoj ankaŭ estas plilarĝigitaj, kio povas esti kaŭzita de kelkaj malsamaj kialoj:
Ĉiu el ĉi tiuj problemoj estis detale diskutita en antaŭaj numeroj de Troubleshooting LC, kaj legantoj interesataj pri ĉi tiuj temoj povas rilati al ĉi tiuj antaŭaj artikoloj por informoj pri la veraj kaŭzoj kaj eblaj solvoj al ĉi tiuj problemoj. Pliaj detaloj.
Pintpostrestado, pintfrontado, kaj disiĝo povas ĉiuj esti kaŭzitaj de kemiaj aŭ fizikaj fenomenoj, kaj la listo de eblaj solvoj al ĉi tiuj problemoj varias multe, depende de ĉu ni traktas kemian aŭ fizikan problemon. Ofte, komparante la malsamajn pintojn en kromatogramo, vi povas trovi gravajn indicojn pri kiu estas la kulpulo. Se ĉiuj pintoj en kromatogramo montras similajn formojn, la kaŭzo plej verŝajne ne estas fizika. Se nur unu aŭ kelkaj pintoj estas trafitaj, sed la ceteraj aspektas bone, la kaŭzo plej verŝajne estas kemia.
La kemiaj kaŭzoj de pinta postrestado estas tro kompleksaj por diskuti ilin ĉi tie mallonge. La interesita leganto estas plusendita al la lastatempa numero de "LC Troubleshooting" por pli profunda diskuto (10). Tamen, facila afero por provi estas redukti la mason de la injektita analito kaj vidi ĉu la pinta formo pliboniĝas. Se jes, tiam ĉi tio estas bona indico, ke la problemo estas "amasa troŝarĝo". En ĉi tiu kazo, la metodo devas esti limigita al injektado de malgrandaj analitaj masoj, aŭ la kromatografiaj kondiĉoj devas esti ŝanĝitaj por ke bonaj pintaj formoj povu esti akiritaj eĉ kun pli grandaj masoj injektitaj.
Ekzistas ankaŭ multaj eblaj fizikaj kialoj por pinta postrestado. Legantoj interesataj pri detala diskuto pri la eblecoj estas plusendataj al alia lastatempa numero de "LC Troubleshooting" (11). Unu el la pli oftaj fizikaj kaŭzoj de pinta postrestado estas malbona konekto ĉe punkto inter la injektilo kaj detektilo (12). Ekstrema ekzemplo estas montrita en Figuro 1d, akirita en mia laboratorio antaŭ kelkaj semajnoj. En ĉi tiu kazo, ni konstruis sistemon kun nova injekta valvo, kiun ni ne antaŭe uzis, kaj instalis malgrandvolumenan injektan buklon kun ferulo, kiu estis muldita sur rustorezistaŝtalan kapilaron. Post kelkaj komencaj eksperimentoj pri problemosolvado, ni rimarkis, ke la porta profundo en la injekta valva statoro estis multe pli profunda ol ni kutimis, rezultante en granda morta volumeno ĉe la fundo de la porta. Ĉi tiu problemo estas facile solvita anstataŭigante la injektan buklon per alia tubo, ni povas alĝustigi la ferulon al la ĝusta pozicio por forigi la mortan volumenon ĉe la fundo de la porta.
Pintaj frontoj kiel tiuj montritaj en Figuro 1e ankaŭ povas esti kaŭzitaj de fizikaj aŭ kemiaj problemoj. Ofta fizika kaŭzo de la fronta rando estas, ke la partikla lito de la kolono ne estas bone pakita, aŭ ke la partikloj reorganiziĝis laŭlonge de la tempo. Kiel ĉe pinta postrestado kaŭzita de ĉi tiu fizika fenomeno, la plej bona maniero ripari ĉi tion estas anstataŭigi la kolonon kaj daŭrigi. Fundamente, frontrandaj pintaj formoj kun kemia origino ofte ekestas el tio, kion ni nomas "ne-linearaj" retenkondiĉoj. Sub idealaj (linearaj) kondiĉoj, la kvanto de analito retenita de la senmova fazo (tial, la retenfaktoro) estas linie rilata al la koncentriĝo de la analito en la kolono. Kromatografie, ĉi tio signifas, ke kiam la maso de analito injektita en la kolonon pliiĝas, la pinto fariĝas pli alta, sed ne pli larĝa. Ĉi tiu rilato rompiĝas kiam la retenkonduto estas ne-lineara, kaj la pintoj ne nur fariĝas pli altaj sed ankaŭ pli larĝaj kiam pli da maso estas injektita. Krome, ne-linearaj formoj determinas la formon de kromatografiaj pintoj, rezultante en antaŭaj aŭ malantaŭaj randoj. Kiel ĉe masa troŝarĝo, kiu kaŭzas pintan postrestadon (10), pinto antaŭeco kaŭzita de nelineara reteno ankaŭ povas esti diagnozita per redukto de la injektita analitmaso. Se pinta formo pliboniĝas, la metodo devas esti modifita por ne superi la injektokvaliton, kiu kaŭzas la frontan randon, aŭ la kromatografiaj kondiĉoj devas esti ŝanĝitaj por minimumigi ĉi tiun konduton.
Iafoje ni observas tion, kio ŝajnas esti "disfendita" pinto, kiel montrite en Figuro 1f. La unua paŝo por solvi ĉi tiun problemon estas determini ĉu la formo de la pinto ŝuldiĝas al parta kuna eluado (t.e., la ĉeesto de du apartaj sed proksime eluantaj kombinaĵoj). Se efektive estas du malsamaj analitoj eluantaj proksime unu al la alia, tiam temas pri plibonigo de ilia distingivo (ekzemple, per pliigo de selektiveco, reteno aŭ platkalkulo), kaj la ŝajnaj "disfenditaj" pintoj rilatas al fizikaj problemoj. La agado havas nenion komunan kun la kolono mem. Ofte, la plej grava indico por ĉi tiu decido estas ĉu ĉiuj pintoj en la kromatogramo montras disfenditajn formojn, aŭ nur unu aŭ du. Se temas pri nur unu aŭ du, ĝi probable estas problemo de kuna eluado; se ĉiuj pintoj estas disfenditaj, ĝi probable estas fizika problemo, plej verŝajne rilata al la kolono mem.
Dividitaj pintoj rilataj al la fizikaj ecoj de la kolono mem kutime ŝuldiĝas al parte blokitaj eniraj aŭ eliraj fritoj, aŭ reorganizado de partikloj en la kolono, permesante al la movebla fazo flui pli rapide ol la movebla fazo en certaj areoj de la kolona kanala formado en aliaj regionoj (11). Parte ŝtopita frito foje povas esti forigita per inversigo de la fluo tra la kolono; tamen, laŭ mia sperto, ĉi tio kutime estas mallongdaŭra prefere ol longdaŭra solvo. Ĉi tio ofte estas mortiga ĉe modernaj kolonoj se la partikloj rekombiniĝas ene de la kolono. Ĉe ĉi tiu punkto, estas plej bone anstataŭigi la kolonon kaj daŭrigi.
La pinto en Figuro 1g, ankaŭ el lastatempa kazo en mia propra laboratorio, kutime indikas, ke la signalo estas tiel alta, ke ĝi atingis la altan finon de la respondintervalo. Por optikaj absorbaj detektiloj (UV-videbla en ĉi tiu kazo), kiam la analita koncentriĝo estas tre alta, la analito absorbas la plejparton de la lumo pasanta tra la detektila fluoĉelo, lasante tre malmulte da lumo por esti detektita. Sub ĉi tiuj kondiĉoj, la elektra signalo de la fotodetektilo estas forte influita de diversaj fontoj de bruo, kiel ekzemple devaga lumo kaj "malhela kurento", igante la signalon tre "neklara" laŭ aspekto kaj sendependa de la analita koncentriĝo. Kiam tio okazas, la problemo ofte povas esti facile solvita per redukto de la injektovolumeno de la analito - reduktante la injektovolumenon, diluante la specimenon, aŭ ambaŭ.
En kromatografia lernejo, ni uzas la detektilan signalon (t.e., la y-akson en la kromatogramo) kiel indikilon de la analita koncentriĝo en la specimeno. Do ŝajnas strange vidi kromatogramon kun signalo sub nulo, ĉar la simpla interpreto estas, ke tio indikas negativan analitan koncentriĝon - kio kompreneble ne estas fizike ebla. Laŭ mia sperto, negativaj pintoj plej ofte estas observataj kiam oni uzas optikajn absorbajn detektilojn (ekz., UV-videbla).
En ĉi tiu kazo, negativa pinto simple signifas, ke la molekuloj eluantaj el la kolono absorbas malpli da lumo ol la movebla fazo mem tuj antaŭ kaj post la pinto. Tio povas okazi, ekzemple, kiam oni uzas relative malaltajn detektajn ondolongojn (<230 nm) kaj aldonaĵojn de la movebla fazo, kiuj absorbas la plejparton de la lumo ĉe ĉi tiuj ondolongoj. Tiaj aldonaĵoj povas esti solventaj komponantoj de la movebla fazo kiel metanolo aŭ bufrokomponantoj kiel acetato aŭ formiato. Oni povas fakte uzi negativajn pintojn por prepari kalibran kurbon kaj akiri precizajn kvantajn informojn, do ne ekzistas fundamenta kialo eviti ilin per si mem (ĉi tiu metodo foje estas nomata "nerekta UV-detekto") (13). Tamen, se ni vere volas tute eviti negativajn pintojn, en la kazo de absorba detekto, la plej bona solvo estas uzi malsaman detektan ondolongon, por ke la analito absorbu pli ol la movebla fazo, aŭ ŝanĝi la konsiston de la movebla fazo, por ke ili absorbu malpli da lumo ol analitoj.
Negativaj pintoj ankaŭ povas aperi dum uzado de refrakta indico (RI) detekto kiam la refrakta indico de komponantoj krom la analito en la specimeno, kiel ekzemple la solventa matrico, estas malsama ol la refrakta indico de la movebla fazo. Ĉi tio ankaŭ okazas kun UV-videbla detekto, sed ĉi tiu efiko emas esti malfortigita relative al RI-detekto. En ambaŭ kazoj, negativaj pintoj povas esti minimumigitaj per pli proksima kongruigo de la konsisto de la specimena matrico kun tiu de la movebla fazo.
En la tria parto pri la baza temo de LC-problemsolvado, mi diskutis situaciojn en kiuj la observita pinta formo diferencas de la atendata aŭ normala pinta formo. Efika problemsolvado de tiaj problemoj komenciĝas per scio pri atendataj pintaj formoj (bazitaj sur teorio aŭ antaŭa sperto kun ekzistantaj metodoj), do devioj de ĉi tiuj atendoj estas evidentaj. Problemoj pri pinta formo havas multajn malsamajn eblajn kaŭzojn (tro larĝa, postrestanta, antaŭa rando, ktp.). En ĉi tiu parto, mi detale diskutas kelkajn el la kialoj, kiujn mi vidas plej ofte. Scii ĉi tiujn detalojn provizas bonan lokon por komenci problemsolvadon, sed ne kaptas ĉiujn eblecojn. Legantoj interesitaj pri pli detala listo de kaŭzoj kaj solvoj povas rilati al la LCGC "LC-problemsolvada gvidilo" mura diagramo.
(4) Mura diagramo de LCGC "Gvidilo pri LC-solvado de problemoj". https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Datumanalizo kaj Signalprilaborado en Kromatografio (Elsevier, Novjorko, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF kaj Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.